Die vorliegende Erfindung betrifft Kapseln, die feste Teil
chen signalerzeugender Substanzen einkapseln und an ihrer
äußeren Oberfläche Affinitätsmoleküle tragen, die Zielmole
küle in einer Probe spezifisch erkennen und daran binden.
Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung dieser Kapseln
zur Signalerzeugung beim optischen, elektrochemischen oder
chemischen Nachweis von Zielmolekülen. Es wird ein Nach
weisverfahren und ein Kit bereitgestellt.
Bioassays wie Festphasen-Enzym-Immungssays (ELISA), Radio
immungssays (RIA), Fluoreszenz-Immungssays (FIA) oder Im
munagglutinationsassays sind in der Fachwelt bekannt und
spielen eine wichtige Rolle beim Nachweis von Analyten in
der medizinischen Diagnose, bei Umweltanalysen und Lebens
mittelanalysen. Bioassays beruhen auf der Wechselwirkung
eines markierten Biomoleküls mit einem nachzuweisenden Ana
lyten. Die Markierung fungiert als Hilfsmittel, um die
Wechselwirkung sichtbar zu machen. Es sind verschiedene Ar
ten von Markierungen bekannt: Enzyme bei ELISAs, Radioiso
tope bei RIAs, Fluorophore bei FIAs, Liposomen, Latex-Teil
chen bei Immunagglutinationsassays, sowie Farbstoffe, Ver
mittler, Gold-Teilchen und DNA.
Die wichtigsten Anforderungen an Bioassays sind Spezifität
und Empfindlichkeit. Die Spezifität wird durch das Bioer
kennungsmolekül bestimmt, z. B. das Zusammenpassen der Bin
dungsstelle eines Antikörpers mit seinem Antigen (Analyt)
oder die Hybridisierung zweier komplementärer Nucleinsäure-
Stränge. Die Empfindlichkeit eines Bioassays wird ebenfalls
durch das Bioerkennungsmolekül aufgrund der Affinitätskon
stante seiner biologischen Wechselwirkung beeinflußt. Die
Markierung fungiert als Marker für das Biomolekül und läßt
sich mit verschiedenen Techniken messen: i) optisch durch
Messung der Absorption eines Farbstoffs oder des durch
Fluorophore angeregten Fluoreszenzlichts, oder turbidi
metrisch durch die Lichtstreuung agglutinierter Latex-Teil
chen, ii) auf radioaktivem Wege durch Messen von Radio
isotopen, iii) elektrochemisch durch Messen von Vermittlern
oder elektroaktiven Substanzen.
Die Empfindlichkeit von Bioassays wird in erheblichem Maße
durch die Beschaffenheit der Markierung und die zur Messung
der Konzentration der Markierung eingesetzte Nachweistech
nik bestimmt. Die RIA-Technologie, bei der Radioisotope
verwendet werden, ist nach wie vor die empfindlichste Me
thode. Diese überaus leistungsfähige Technik wurde 1959 von
Yalow und Berson eingeführt und wurde zu einem neuen Gebiet
in der analytischen Chemie sowie in der Diagnostik und Me
dizin. Allerdings besteht bei dieser Technik der Nachteil,
daß sich das Risiko gefährlicher Kontaminationen von
Menschen und Umwelt aufgrund der verwendeten radioaktiven
Isotope nicht auf Null reduzieren läßt.
Daher wurden nicht-radioaktive Methoden mit dem Ziel ent
wickelt und verbessert, eine vergleichbare Empfindlichkeit
zu erreichen. Die Bedeutung der auf Fluoreszenz, Lumi
neszenz und Absorptionsspektroskopie beruhenden optischen
Verfahren nahm mit der Zeit zu und ist noch immer im
Ansteigen begriffen.
Bei der ELISA-Technologie werden Enzyme als Marker zur Sig
nalverstärkung verwendet. Nach Durchführung des Bioassays
wird die biologische Wechselwirkung von Analyt und Sonde
durch die Produktion einer großen Zahl von Farbstoffmolekü
len durch ein einziges Enzym-Markermolekül verstärkt. Es
werden Enzyme wie Glucoseoxidase (GOD, EG 1.1.3.4.), al
kalische Phosphatase (AP, EG 3.1.3.1) oder Peroxidase (POD,
EG 1.11.1.7) mit Umsatzzahlen von 2000 Substratmolekülen
pro Sekunde (s-1), 5000 s-1 beziehungsweise 10 000 s-1 verwen
det. Verstärkungsraten von etwa 10 000 bis eine Million
sind mit Substratinkubationszeiten von 10 bis 60 Minuten
möglich. Ein Nachteil der ELISA-Technik ist die große Zahl
der Schritte bei diesem Verfahren und die zusätzliche Zeit,
die für die Substratinkubation erforderlich ist.
Auch Fluoreszenzverfahren werden in der Bioanalytik seit
Jahren eingesetzt und sind von hohem Interesse. Mit allen
auf Fluoreszenz beruhenden Techniken sind eine gute
Empfindlichkeit und niedrige Nachweisgrenzen von 10-8 bis
10-18 M sichergestellt. Mit speziellen Techniken, z. B.
"zeitaufgelöster Fluoreszenz", Chemi- und Biolumineszenz
oder Techniken, die auf der Energieübertragung zwischen ei
nem Farbstoff- und einem Fluorophor-Molekül beruhen, lassen
sich Nachweisgrenzen von 10-15 bis 10-18 M erreichen.
Bei den im Stand der Technik bekannten Fluoreszenz-Immungs
says werden niedermolekulare Fluoreszenz-Markierungen mit
reaktiven funktionellen Linker-Gruppen (Southwick P. L. et
al., Cytometry, 11, S. 418-430, 1990; Mujumdar R. B. et al.,
Bioconjugate Chemistry 4, S. 105-111; 1993, Mujumder R. B.
et al., Cytometry 10, S. 11-19, 1989), fluoreszierende und
mit Farbstoff gefärbte Teilchen (US 4 837 168;
US 6 013 531; WO 95/08772) oder mit Fluorophoren durchsetzte
Dendrimere (DE 197 03 718) verwendet.
Bekannt aus dem Stand der Technik ist auch die Verwendung
Marker tragender Liposomen zur Signalverstärkung bei Immung
assays (US 5 756 362, 4 874 710, 4 703 017). Die Empfind
lichkeit dieser Methoden ist insofern begrenzt, als die
Menge an Marker-Substanzen, die in die Liposomen in löslich
gemachter Form eingebracht werden kann, begrenzt ist. Ein
weiterer Nachteil bei der Verwendung von markierten Liposo
men ist die begrenzte Stabilität der Liposomen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung
eines Nachweisverfahrens für Zielmoleküle in einer Probe,
das im Vergleich zu den im Stand der Technik bekannten Ver
fahren eine sehr gute Empfindlichkeit, niedrige
Nachweisgrenzen und eine Verstärkung des Nachweissignals
bezogen auf die Menge an Zielmolekül sicherstellt.
Vorzugsweise sollte das erfindungsgemäße Verfahren für op
tische Nachweise, insbesondere bei Fluoreszenz-Immungssays
geeignet sein.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung war die Bereitstellung
eines Kits für den optischen, elektrochemischen oder chemi
schen Nachweis von Zielmolekülen.
Ebenfalls Aufgabe der Erfindung war die Bereitstellung mar
kierter Biomoleküle, die sich leicht herstellen lassen und
bei den erfindungsgemäßen Bioassays, vorzugsweise bei Fluo
reszenz-Immungssays anwendbar sind.
Das der Erfindung zugrundeliegende Problem wird gelöst
durch ein Verfahren zum optischen, elektrochemischen oder
chemischen Nachweis eines oder mehrerer Zielmoleküle in ei
ner Probe unter Nutzung der auf Affinität beruhenden Wech
selwirkungen zwischen dem Zielmolekül und einem Affinitäts
molekül für die spezifische Erkennung des Zielmoleküls, um
fassend die Schritte:
- a) Inkubieren der Zielmoleküle mit Kapseln, die feste
Teilchen signalerzeugender Substanzen einkapseln
und an ihrer äußeren Oberfläche die entsprechenden
Affinitätsmoleküle tragen,
- b) Abtrennen des resultierenden Komplexes aus Ziel-
und Affinitätsmolekül von den Kapseln mit unumge
setzten Affinitätsmolekülen auf deren Oberfläche,
- c) Freisetzen und Lösen der eingekapselten festen
Teilchen der signalerzeugenden Substanzen durch Be
handeln des erhaltenen Ziel/Affinitäts-Komplexes
mit physikalischen oder chemischen Mitteln,
- d) Nachweisen oder Quantifizieren des Signals, das
durch die freigesetzten und gelösten signalerzeu
genden Substanzen erzeugt wird und in direkter oder
indirekter Beziehung zur Menge an Zielmolekülen
steht.
Durch die verwendeten Kapseln, die feste signalerzeugende
Substanzen in hohen Mengen einkapseln, die während des
Nachweisvorgangs freigesetzt und gelöst werden, wird eine
Signalverstärkung erreicht.
Gegenstand der Erfindung sind auch die Kapseln nach den An
sprüchen 1 bis 17.
Erfindungsgemäß tragen die verwendeten Kapseln auf ihrer
äußeren Oberfläche Affinitätsmoleküle, die Zielmoleküle
spezifisch erkennen und daran binden. Mit "Zielmolekül" ist
der nachzuweisende Analyt gemeint bzw. ein Analyt, der mit
einem Molekül verknüpft ist, das an die Affinitätsmoleküle
an der Oberfläche der Kapsel binden kann.
Je nach den nachzuweisenden Zielmolekülen sind die Affini
tätsmoleküle ausgewählt aus der Gruppe der Peptide oder
Proteine, Nucleinsäuren, Kohlenhydrate, Liganden mit nied
rigem Molekulargewicht und molekular aufgedruckten Polyme
ren (MIPs) oder Mischungen derselben. Als Peptide oder Pro
teine können Antikörper, Rezeptoren, Antigene, Lektine,
Avidine, Oligopeptide, Lipoproteine, Glycoproteine, Peptid
hormone und Allergene oder Teile derselben verwendet wer
den. Die Nucleinsäuren, die ebenfalls Affinitätsmoleküle
auf der Kapseloberfläche sein können, sind ausgewählt aus
der Gruppe der einzel- oder doppelsträngigen DNAs, RNAs,
Oligonucleotide, Ribozyme, Aptamere und Teilen derselben.
Auch Kohlenhydrate, ausgewählt aus der Gruppe der Mono-,
Oligo- und Polysaccharide, Glycolipide, Proteopolysaccha
ride und Teilen derselben können Affinitätsmoleküle sein.
Erfindungsgemäß sind Liganden mit niedrigem Molekularge
wicht Biotin oder ein Biotin-Derivat, ein Steroid oder Hor
mon, ein Cofaktor oder Coenzym, ein Aktivator, Inhibitor,
Pseudosubstrat oder eine prosthetische Gruppe eines Enzyms,
ein Arzneimittel, ein Pestizid, ein Allergen oder Digoxin
oder ein Hapten.
Die Affinitätsmoleküle sind z. B. durch Van-der-Waals-
Kräfte, Wasserstoff-Bindungen oder elektrostatische Wech
selwirkungen an die äußere Oberfläche der Kapseln konju
giert, oder sie sind direkt oder über Linker-Moleküle cova
lent an die äußere Oberfläche der Kapseln gebunden, wobei
das Linker-Molekül normalerweise ein Biomolekül, vorzugs
weise Avidin, Streptavidin, Neutravidin, Protein A, Protein
G, Lektin oder ein niedermolekularer Vernetzer ist.
Die Kapseln, welche die festen signalerzeugenden Substanzen
einkapseln, die beim erfindungsgemäßen Nachweisverfahren
verwendet werden, werden hergestellt durch Behandeln von
wenig wasserlöslichen oder wasserunlöslichen ungeladenen
festen signalerzeugenden Substanzen mit einer wäßrigen
Lösung eines ionischen Detergens, wobei die amphiphile Sub
stanz an der Oberfläche der festen signalerzeugenden Sub
stanzen angeordnet wird und diese empfänglich gemacht
werden für die anschließende Beschichtung mit einer Schicht
eines geladenen Polyelektrolyten oder mit einer Mehrfach
schicht, umfassend abwechselnde Schichten entgegengesetzt
geladener Polyelektrolyten.
Die feste signalerzeugende Substanz wird vor Gebrauch zu
feinen Teilchen vermahlen, oder Teilchen geeigneter Größe
werden mit Hilfe anderer Methoden erzeugt, z. B. durch
Sprühtrocknung.
Beim ersten Schritt des Verfahrens werden die ungeladenen
festen signalerzeugenden Teilchen mit einer amphiphilen
Substanz behandelt, die die Oberfläche der Teilchenmateria
lien mit einer elektrischen Ladung versieht. Die Behandlung
der festen signalerzeugenden Teilchen mit dem Tensid ist
auch im Laufe eines Naßmahlverfahrens möglich.
Beim zweiten Schritt werden die mit amphiphiler Substanz
beschichteten Teilchen mit einem Polyelektrolyt beschich
tet, der eine zur Oberfläche der Teilchenmaterialien entge
gengesetzte Ladung aufweist. Zur Bildung von Mehrfach
schichten werden die signalerzeugenden Teilchen anschlie
ßend mit entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten behan
delt, d. h., abwechselnd mit kationischen und anionischen
Polyelektrolyten. Die Polymerschichten fügen sich auf den
vorher geladenen festen Matrizen durch elektrostatische
schichtweise Abscheidung von selbst zusammen und bilden so
eine mehrschichtige polymere Hülle um die festen Kerne.
In einem letzten Schritt wird die Oberfläche der erhaltenen
Polyelektrolyt-Kapseln gemäß dem nachzuweisenden Zielmole
kül mit Affinitätsmolekülen modifiziert (vgl. Fig. 1). Er
findungsgemäß werden die Polyelektrolyt-Kapseln mit den Af
finitätsmolekülen, z. B. mit Immunglobulinen, inkubiert. Bei
einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die Af
finitätsmoleküle durch chemische Reaktion covalent an die
Polyelektrolyt-Kapseln gebunden, z. B. nach EDC/NHS-Aktivie
rung der Teilchen mit einer äußersten Schicht des Polyelek
trolyten Polyacrylsäure.
Es ist auch möglich, die Affinitätsmoleküle mit Linker-Mo
lekülen umzusetzen, die zwei funktionelle Gruppen aufweisen
und an die Polyelektrolyt-Kapsel und das Affinitätsmolekül
binden können, z. B. durch Verwendung eines homo- oder he
terobifunktionellen Vernetzers wie DSS, DTSSP oder SMCC
bzw. MBS.
Das beschriebene Einkapselungsverfahren ermöglicht den Ein
schluß einer breiten Auswahl und hoher Mengen an signaler
zeugenden Substanzen (107 bis 109 Moleküle pro Teilchen, je
nach Größe und Dichte des Teilchens und Molekulargewicht
der Substanz). Je nach gewünschtem Nachweisverfahren können
niedermolekulare Substanzen, ausgewählt aus Fluorophoren,
Luminophoren, Chromophoren, Enzymsubstraten, prosthetischen
Gruppen, oder redoxaktive Substanzen, ausgewählt aus Redox
vermittlern, elektrodenaktiven Substanzen und Metallsalzen
eingekapselt werden. Auch hochmolekulare Substanzen, ausge
wählt aus der Gruppe der Enzyme und ihrer Vorläufer, biolu
minogene und fluorogene Proteine, Nucleinsäuren, Ribozyme
und Aptamere können die signalerzeugenden Substanzen sein,
die eingekapselt werden.
Erfindungsgemäß sind die eingekapselten festen Teilchen aus
signalerzeugenden Substanzen Kristalle, amorphe oder lyo
philisierte Teilchen, sprühgetrocknete Teilchen, gemahlene
Teilchen oder Mischungen derselben. In einer bevorzugten
Ausführungsform der Erfindung haben die eingekapselten fe
sten Teilchen eine Teilchengröße von 10 nm bis 10 µm, vor
zugsweise etwa 100 nm.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Kapseln kann als am
phiphile Substanz jede Substanz verwendet werden, die ioni
sche hydrophile und hydrophobe Gruppen aufweist. Vorzugs
Weise werden ionische Tenside, Phospholipide und/oder am
phiphile Polyelektrolyte verwendet. Amphiphile Polyelek
trolyte beispielsweise sind Polyelektrolyte, die eine gela
dene Gruppe als hydrophile Gruppe und eine hydrophobe
Gruppe, z. B. eine aromatische Gruppe umfassen. Bevorzugt
ist die Verwendung eines kationischen oder/und anionischen
Tensids. Beispiele für geeignete kationische Tenside sind
quartäre Ammonium-Salze (R4N+X-, insbesondere Didodecyldi
methylammoniumbromid (DDDAB), Alkyltrimethylammoniumbromid,
insbesondere Dodecyltrimethylammoniumbromid oder Palmityl
trimethylammoniumbromid oder N-Alkylpyridinium-Salze oder
tertiäre Amine (R3NH+X-), insbesondere Cholesteryl-3β-N-(di
methylaminoethyl)carbamat oder Mischungen derselben, wobei
X- ein Gegenanion wie z. B. ein Halogenid bedeutet. Beispiele
für geeignete anionische Tenside sind Alkylsulfonate
(R-SO3M), insbesondere Dodecylsulfat, z. B. Natriumdodecyl
sulfat (SDS), Laurylsulfat oder Olefinsulfonate (R-SO3M),
insbesondere Natrium-n-dodecylbenzolsulfonat oder Alkylsul
fate (R-OSO3M) oder Fettsäuren (R-COOM), insbesondere Dode
cansäure-Natriumsalz, oder phosphorige Säure oder Cholsäu
ren oder fluororganische Verbindungen, insbesondere Lithi
um-3-[2-(perfluoralkyl)ethylthio]propionat oder Mischungen
derselben. Besonders bevorzugt sind Tenside mit 6 bis 30
Kohlenstoffen in ihren Alkyl- oder Olefin-Gruppen.
Bevorzugt ist weiterhin, eine polymere Substanz als amphi
phile Substanz zu verwenden, die geladene Gruppen und hy
drophobe Stellen bereitstellt. In einer bevorzugten Ausfüh
rungsform wird Polystyrolsulfonat (PSS) verwendet.
Unter Polyelektrolyten sind im allgemeinen Polymere mit io
nisch dissoziierbaren Gruppen zu verstehen, die eine Kompo
nente oder ein Substituent der Polymerkette sein können.
Normalerweise ist die Zahl dieser ionisch dissoziierbaren
Gruppen in Polyelektrolyten so groß, daß die Polymere in
dissoziierter Form (auch Polyionen genannt) wasserlöslich
sind. Der Begriff Polyelektrolyte soll in diesem Zusammen
hang auch Ionomere abdecken, bei denen die Konzentration an
ionischen Gruppen zur Wasserlöslichkeit nicht ausreicht,
die aber genügend Ladungen zum Selbstzusammenfügen aufwei
sen. Vorzugsweise umfaßt die Hülle allerdings "echte" Po
lyelektrolyte, d. h., wasserlösliche Polyelektrolyte. Je
nach Art der dissoziierbaren Gruppe werden Polyelektrolyte
in Polysäuren und Polybasen eingeteilt.
Dissoziierte Polysäuren bilden unter Abspaltung von Proto
nen Polyanionen, die anorganische, organische und Biopoly
mere sein können. Beispiele für Polysäuren sind Polyphos
phorsäure, Polyvinylschwefelsäure, Polyvinylsulfonsäure,
Polyvinylphosphonsäure und Polyacrylsäure. Beispiele für
die entsprechenden Salze, die auch Polysalze genannt wer
den, sind Polyphosphat, Polysulfat, Polysulfonat, Polyphos
phonat und Polyacrylat.
Polybasen enthalten Gruppen, die z. B. durch Reaktion mit
Säuren Protonen aufnehmen können, wobei ein Salz gebildet
wird. Beispiele für Polybasen mit dissoziierbaren Gruppen
in ihrem Gerüst und/oder ihren Seitengruppen sind Polyal
lylamin, Polyethylimin, Polyvinylamin und Polyvinylpyridin.
Durch die Aufnahme von Protonen bilden Polybasen Polykatio
nen.
Geeignete erfindungsgemäße Polyelektrolyte sind auch Biopo
lymere wie etwa Alginsäure, Gummi arabicum, Nucleinsäuren,
Pektine, Proteine und andere, sowie chemisch modifizierte
Biopolymere wie etwa Carboxymethylcellulose und Ligninsul
fonate, sowie synthetische Polymere wie z. B. Polymethacryl
säure, Polyvinylsulfonsäure, Polyvinylphosphonsäure und Po
lyethylenimin.
Es können lineare oder verzweigte Polyelektrolyte verwendet
werden. Die Verwendung von verzweigten Polyelektrolyten
führt zu weniger kompakten Polyelektrolyt-Mehrfachschich
ten, die höhere Wandporosität aufweisen. Zur Erhöhung der
Kapselstabilität können Polyelektrolyt-Moleküle innerhalb
oder/und zwischen den einzelnen Schichten vernetzt sein,
z. B. durch Vernetzen von Amino-Gruppen mit Aldehyden.
Im Grunde bestehen keine Einschränkungen hinsichtlich der
zu verwendenden Polyelektrolyte bzw. Ionomere so lange die
eingesetzten Moleküle ausreichend hohe Ladung aufweisen
oder/und an die Schicht darunter über eine andere Art Wech
selwirkung binden können, z. B. durch Wasserstoff-Bindung
und/oder hydrophobe Wechselwirkungen.
Geeignete Polyelektrolyte sind somit sowohl niedermolekula
re Polyelektrolyte als auch Polyionen, die z. B. Molekular
gewichte von einigen hundert Dalton aufweisen, bis hin zu
makromolekularen Polyelektrolyten, z. B. Polyelektrolyten
biologischen Ursprungs, die Molekulargewichte von mehreren
tausend bis Millionen Dalton aufweisen.
Weitere Beispiele für ein organisches Polymer als Bioelek
trolyt sind biologisch abbaubare Polymere wie etwa Polygly
colsäure (PGA), Polymilchsäure (PLA), Polyamide, Poly-2-hy
droxybutyrat (PHB), Polycaprolacton (PCL), Polymilch-co
glycolsäure (PLGA), fluoreszenzmarkierte Polymere, leitende
Polymere, Flüssigkristall-Polymere, photoleitende Polymere,
photochrome Polymere und deren Copolymere und/oder Mischun
gen derselben. Beispiele für Biopolymere, die als Polyelek
trolyt bevorzugt sind, sind Polyaminosäuren, insbesondere
Peptide, S-Schichtproteine, Polykohlenhydrate wie etwa Dex
trin, Pektin, Alginat, Glycogen, Amylose, Chitin, Chondro
itin, Hyaluronsäure, Polynucleotide wie etwa DNA, RNA, Oli
gonucleotide oder/und modifizierte Biopolymere wie etwa
Carboxymethylcellulose, Carboxymethyldextran oder Lignin
sulfonate. Bevorzugte Beispiele für anorganische Polymere
als Polyelektrolyt sind Polysilane, Polysilanole, Polyphos
phazene, Polysulfazene, Polysulfide und/oder Polyphosphate.
Möglich ist auch die Abscheidung geladener Nanoteilchen
oder Biomoleküle als Kapselmaterial.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Kapseln wird vorzugs
weise so durchgeführt, daß überschüssiges Material der bei
den einzelnen Schritten verwendeten Ausgangssubstanzen nach
jedem Behandlungsschritt abgetrennt wird. Zum Beispiel wird
zunächst eine wäßrige Dispersion der Matrizenteilchen ge
bildet, die mit einer wäßrigen Lösung der amphiphilen Sub
stanz versetzt wird. Nach Abtrennung etwaiger überschüssi
ger amphiphiler Moleküle wird eine erste Polyelektrolyt-
Spezies zugesetzt, um die erste Polyelektrolyt-Hülle aufzu
bauen. Nach Abtrennung etwaiger überschüssiger Polyelektro
lyt-Moleküle wird die entgegengesetzt geladene Polyelektro
lyt-Spezies, die zum Aufbau der nächsten Schicht verwendet
wird, zugesetzt. Anschließend werden entgegengesetzt gela
dene Schichten aus Polyelektrolyt-Molekülen nacheinander
aufgebracht, wobei für jede Schicht gleicher Ladung identi
sche oder unterschiedliche Polyelektrolyt-Spezies oder Mi
schungen aus Polyelektrolyt-Spezies ausgewählt werden kön
nen und zwischen jedem Inkubationsschritt ein Reinigungs
schritt durchgeführt wird. Die Vorgehensweise beim Be
schichten der Kapseln mit Affinitätsmolekülen ist in Bei
spiel 4 beschrieben. Techniken, die auf direkter Adsorption
oder covalenter Verknüpfung mit niedermolekularen Vernet
zern beruhen, sind versierten Fachleuten wohlbekannt. Er
findungsgemäß wird in bevorzugter Weise das Binden biotiny
lierter Moleküle an Avidin-vorbeschichtete Kapseln ange
wandt.
Erfindungsgemäß sind die wie vorstehend beschrieben herge
stellten Kapseln bei Bioassays zum optischen, elektrochemi
schen oder chemischen Nachweis von Zielmolekülen vorzüglich
einsetzbar. In einem ersten Schritt des erfindungsgemäßen
Nachweisverfahrens werden die Zielmoleküle mit den erfin
dungsgemäßen Kapseln, die an ihrer äußeren Oberfläche Ziel
moleküle spezifisch erkennende Affinitätsmoleküle tragen,
über einen hinreichenden Zeitraum inkubiert, um einen Kom
plex aus Ziel- und Affinitätsmolekül zu ergeben. In einer
bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Zielmo
leküle direkt oder über ein anderes Affinitätsmolekül an
eine feste Phase gebunden, z. B. an eine Mikrotiterplatte
oder eine Nitrocellulose-Unterlage.
Beim zweiten Schritt des Nachweisverfahrens wird der resul
tierende Ziel-/Affinitätsmolekül-Kapsel-Komplex von den un
umgesetzten Affinitätsmolekülen, d. h., von den Kapseln mit
unumgesetzten Affinitätsmolekülen auf ihrer Oberfläche
abgetrennt.
Im nächsten Verfahrensschritt werden die eingekapselten fe
sten Teilchen der signalerzeugenden Substanzen mit Hilfe
physikalischer oder chemischer Mittel aus den Kapseln in
ein Medium freigesetzt. Bei einer Ausführungsform der Er
findung wird die Freisetzung durch Zugabe von Reagenzien
erreicht, die zum Lösen der ungeladenen festen Kernsubstan
zen geeignet sind, z. B. ein organisches Lösungsmittel, in
dem das Material löslich ist, oder ein saures oder alkali
sches Lösungsmittel, in dem das Material ein lösliches Salz
bildet. Erfindungsgemäß kann das Auflösen der Matrizenteil
chen in milder Weise im Laufe einer kurzen Inkubationszeit
vorgenommen werden, z. B. 1 min bis 1 h bei Raumtemperatur.
Die Matrizen zerfallen fast vollständig, da kein Rückstand
an Teilchen mehr nachweisbar ist, selbst wenn man die ver
bleibenden Hüllen mit einem Elektronenmikroskop untersucht.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Kapseln mit
einem organischen Lösungsmittel oder mit einem Enzym oder
Ribozym oder durch Ändern des pH-Werts oder des Werts für
die Ionenstärke behandelt. Die bevorzugten einsetzbaren or
ganischen Lösungsmittel sind ausgewählt aus der Gruppe der
Alkohole, insbesondere Ethanol und Methanol, Ketone, insbe
sondere Aceton, Ester, insbesondere Ethylester, Aromaten,
insbesondere Toluol, Sulfoxide, insbesondere DMSO, sowie
Ether, besonders Dimethylether oder aus Mischungen organi
scher Lösungsmittel mit Wasser.
Das Zerfallen der eingekapselten festen signalerzeugenden
Substanzen läßt sich auch durch physikalische Mittel errei
chen, vorzugsweise durch Ultraschall-Zermahlung, elektri
schen Impuls oder osmotischen Schock.
Der letzte Schritt des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens
umfaßt den Nachweis oder die Messung des Signals, das durch
die freigesetzten und gelösten signalerzeugenden Substanzen
generiert wird und in direkter oder indirekter Beziehung
zur Menge an Zielmolekülen steht.
In einer Ausführungsform der Erfindung läßt sich der Nach
weis eines oder mehrerer Zielmoleküle in einer Probe in ei
nem Fluoreszenz-Immungssay durchführen. In diesem Fall sind
die eingekapselten signalerzeugenden Substanzen Fluoro
phore, z. B. fluoreszierende Substanzen auf der Grundlage
von Cyanin-, Carbocyanin-, Rhodamin-, Xanthen- und Diazo-
Farbstoffen. Eine komprimierte Beschreibung von mehr als
500 Farbstoffen, darunter Fluorophoren, findet sich in: The
Sigma-Aldrich Handbook of Stains, Dyes and Indicators;
Floyd J. Green; Aldrich Chemical Company, Inc., 1991.
Der Fluoreszenz-Immungssay ist eine bevorzugte Ausführungs
form der vorliegenden Erfindung. Da es möglich ist, große
Mengen an festen Fluorophor-Teilchen einzukapseln, wird ein
hohes Fluorophor/Affinitätsmolekül-Verhältnis erreicht.
Aufgrund des Lösens in einem Lösungsmittelvolumen wird eine
hohe Quantenausbeute erhalten. Löschungseffekte treten
nicht auf. Wie z. B. aus Beispiel 3 und Fig. 5 der vorlie
genden Beschreibung ersichtlich, ist nach Freisetzung und
Lösen der Fluorophor-Teilchen aus den erfindungsgemäßen
Kapseln eine bemerkenswerte Verstärkung des Fluoreszenzsig
nals nachweisbar.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der
Nachweis eines oder mehrerer Zielmoleküle in einer Probe
auch mit einem sichtbaren Farbstoff durchgeführt werden,
der in den erfindungsgemäßen Polyelektrolyt-Kapseln einge
kapselt ist, vorzugsweise mit Cyanin-, Pyrazolon-, Anthra
chinon-, Anthroloin-, Carbocyanin-, Rhodamin-, Xanthen-,
Carotinoid-, Diazo- und Monoazo-, Oxazin-, indigoiden und
Riboflavin-basierten Farbstoff-Substanzen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der
Nachweis ähnlich wie ein ELISA durchgeführt werden, wobei
ein Enzym, z. B. Meerrettichperoxidase oder Glucoseoxidase
die eingekapselte signalerzeugende Substanz ist. Das ent
sprechende Substrat kann im Aufbrechpuffer enthalten sein,
der für die Zerstörung der Kapseln und zur Freisetzung des
Enzyms verwendet wird.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können Ra
dioimmungssays durchgeführt werden. Die Kapseln tragen eine
radioaktive Substanz, die nach Freisetzung aus den Kapseln
in einem Szintillationszähler gemessen wird.
Erfindungsgemäß ist die Immunagglutination der Kapseln eine
geeignete Möglichkeit, die an einen Analyten gebundenen
Kapseln auszufällen und sie von unumgesetzten Kapseln abzu
trennen, d. h., von Kapseln, die nicht an ein Zielmolekül
oder einen Analyt gebunden sind.
Die vorliegende Erfindung macht auch ein Verfahren zum
Nachweisen oder Quantifizieren eines (oder mehrerer) Analy
ten verfügbar, wobei eine elektroaktive Substanz, ein elek
troinaktives Enzymsubstrat oder ein Enzym als signalerzeu
gende Substanz elektrochemisch nachgewiesen wird.
Die elektrochemische Messung wird mit einem Sensorsystem
durchgeführt, umfassend eine Arbeits-, Bezugs- und Gegen
elektrode sowie eine Elektrolytlösung. Es können Mikro-
oder Makrodickfilm-, Dünnfilm-Elektroden oder herkömmliche
Stabelektroden sein. Beim amperometrischen Ansatz wird ein
Potential angelegt, so daß die elektroaktive Substanz redu
ziert oder oxidiert werden kann. Beim potentiometrischen
Ansatz wird die vorstehend beschriebene elektrochemische
Vorrichtung verwendet, mit der Ausnahme, daß diese eine In
dikator- und Bezugselektrode kombiniert aufweist und die
durch eine elektroaktive Substanz (z. B. Ionen) verursachte
Potentialänderung mißt.
In der Amperometrie können bekannte Vermittler als elektro
aktive Substanzen eingesetzt werden, die bei niedrigem Po
tential oxidiert werden. Je nach Beschaffenheit des Analy
ten trägt die Arbeitselektrode Antikörper oder Antigene,
die mit Hilfe verschiedener Methoden auf der Elektro
denoberfläche oder auf einer Membran immobilisiert sind,
die die Oberfläche der Arbeitselektrode bedeckt.
Beim Nachweis eines hochmolekularen Antigens (zum Beispiel
des Frühinfarkt-Markers fettsäurebindendes Protein, FABP)
sind Fänger-Antikörper gegen das Antigen (FABP) auf der Ar
beitselektrode immobilisiert. Eine Blut- oder Plasmaprobe
(enthaltend das Antigen FABP) wird der Elektrode zusammen
mit Kapseln zugesetzt, die eingekapselte feste elektroak
tive Substanzen enthalten und Detektor-Antikörper gegen das
Antigen (FABP) auf der Kapseloberfläche aufweisen. Die Sub
stanzen bilden ein "Sandwich" auf der Arbeitselektrode:
Fänger-Antikörper/Antigen(FABP)-Detektor-Antikörper/einge
kapselte elektroaktive Substanz. Danach wird das Elektro
densystem mit neutralem Puffer gewaschen, um nichtgebundene
Substanzen und Probenbestandteile auszuwaschen, und es wer
den organische Lösungsmittel (z. B. DMSO oder Ethanol) zuge
setzt, um die Freisetzung und Auflösung der elektroaktiven
Substanz in der Nähe der Elektrodenoberfläche zu erleich
tern. Es wird ein starker Oxidationsstrom erzeugt, der zur
Menge der erzeugten elektroaktiven Substanz proportional
ist. Das Sensorsystem läßt sich vor dem Einsatz mit Hilfe
unterschiedlicher Mengen Antigen und gleichen Mengen
eingekapselter elektroaktiver Substanzen kalibrieren.
Die Empfindlichkeit des Assays läßt sich noch weiter stei
gern, wenn ein Enzym in festem Zustand (zum Beispiel alka
lische Phosphatase, AP) zur Signalerzeugung eingekapselt
ist und ein elektrodeninaktives Substrat (wie etwa p-Amino
phenylphosphat, pAPP) in hoher Konzentration zusammen mit
dem Aufbrechreagens zur Freisetzung des Enzyms zugegeben
wird. Das Produkt (p-Aminophenol) wird enzymatisch gebildet
und anschließend an der Arbeitselektrode oxidiert.
Für niedermolekulare Antigene (Haptene), die keine Bildung
von Sandwich-Anordnungen gestatten, sind die beschriebenen
Systeme anwendbar, sofern ein Konkurrenzprinzip Anwendung
findet. In diesem Fall müssen entweder die Kapseln durch
das Antigen (oder Antigen-Analogon) markiert werden und
müssen um den Analyten konkurrieren, oder das gleiche Anti
gen (oder Antigen-Analogon) wie der nachzuweisende Analyt
muß an die Oberfläche der Arbeitselektrode gebunden sein.
Die Antikörper-markierten Kapseln konkurrieren dann um den
freien (nachzuweisenden) Analyten und das an die Oberfläche
gebundene Antigen. In beiden Fällen ist das Elektrodensig
nal indirekt proportional zur Analyt-Konzentration (ähn
lich wie bei ELISA und RIA).
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung tragen die
Kapseln eine chemische Substanz, die als Katalysator fun
gieren kann (z. B. Dibenzoylperoxid zur Einleitung einer Po
lymerisationsreaktion eines Monomers, z. B. Acrylsäure),
oder ein Edukt für eine chemische Reaktion (z. B. ein Kupp
lungsreagens für Diazonium-Salzbildung, das geeignet ist,
in einer Diazonium-Reaktion unter Bildung eines Farbstoffs
oder eines fluoreszierenden Produkts zu reagieren).
Weiterhin macht die Erfindung ein immunchromatographisches
Verfahren (Seitenfließtest) zum Nachweisen oder Quantifi
zieren eines Analyten verfügbar. Als Beispiel wird ein
hochmolekulares Antigen wie FABP ausgewählt, das in einer
Plasmaprobe nachzuweisen ist.
Die Probe wird an einem Ende eines absorbierenden Materials
(zum Beispiel Nitrocellulose) der Testvorrichtung aufgetra
gen. Die Flüssigkeit wandert aufgrund der Kapillarkräfte
zum anderen Ende, die durch ein am anderen Ende befindli
ches Saugkissen verstärkt werden. Die mit Kapseln (enthal
tend die feste signalerzeugende Substanz) markierten Detek
tor-Antikörper sind vorzugsweise in nicht diffusionsfähiger
Form im Überschuß im Kontaktbereich gebunden. Die signaler
zeugende Substanz kann ein fluoreszierender Farbstoff, ein
sichtbarer Farbstoff, ein biolumineszierendes oder chemilu
mineszierendes Material sein.
Das Antigen (FABP) aus der Probe tritt mit den Detektor-An
tikörpern in Wechselwirkung und wandert zum anderen Ende
der Vorrichtung, wobei es die Kapseln mit sich führt. Im
Indikatorbereich (Punkt oder Streifen) in der Nähe des
Saugkissens wird ein Sandwich mit Fänger-Antikörpern gebil
det. Hier sind die Fänger-Antikörper mehr oder weniger fest
an das absorbierende Material gebunden und können daher
nicht wandern. Je mehr Analyt in der Probe vorhanden ist,
desto mehr Sandwich-Strukturen werden gebildet und desto
mehr Kapseln werden im Indikatorbereich gebunden. Die si
gnalerzeugende Substanz kann durch Eintauchen der gesamten
Vorrichtung in ein Lösungsmittel (z. B. Ethanol) oder durch
Auftropfen eines Lösungsmitteltropfens auf den Indikatorbe
reich oder durch Einbringen eines die Kapsel lysierenden
Lösungsmittels in die Vorrichtung freigesetzt werden. Das
Signal kann sofort mit bloßem Auge oder zur Quantifizierung
mit einem optischen Lesegerät erfaßt werden.
Hinter dem Indikatorbereich ist ein Kontrollbereich ange
ordnet. Er zeigt an, ob der Eintauchstreifen richtig arbei
tet und enthält Antikörper (Punkt oder Streifen), die fest
an das absorbierende Material gebunden und gegen die Detek
tor-Antikörper gerichtet sind. In jedem Fall ist ein Teil
der Detektor-Antikörper (die mit Kapseln markiert sind)
nicht im Indikatorbereich gebunden und wandert weiter. Das
Kontrollsignal wird zur gleichen Zeit wie im Indikatorbe
reich erzeugt. Anstelle der Anti-Detektor-Antikörper kann
auch das fest gebundene Antigen (oder Antigen-Analogon) zur
Schaffung der Kontrolle verwendet werden.
Unter Anwendung des Konkurrenzprinzips kann der Eintauch
streifen für niedermolekulare Substanzen modifiziert wer
den. Statt des seitlichen Fließens läßt sich auch eine Vor
richtung mit senkrechtem Fluß konstruieren. Sollen mehrere
Antigene gemessen werden, so sind die geeigneten Antikörper
einzusetzen und dementsprechend müssen unterschiedliche si
gnalerzeugende Substanzen für die verschiedenen Analyten
verwendet werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Kit für den optischen,
elektrochemischen oder chemischen Nachweis von Zielmolekü
len in einer Probe, umfassend Kapseln, die feste Teilchen
signalerzeugender Substanzen einkapseln und an ihrer äuße
ren Oberfläche Affinitätsmoleküle zum spezifischen Erkennen
und Binden an ein Zielmolekül tragen. Die Kapseln können
auch in lyophilisierter Form enthalten sein, deren Wieder
herstellung durch den Anwender mit Wasser problemlos mög
lich ist. Gegebenenfalls kann das Kit auch einen wie vor
stehend beschriebenen Eintauchstreifen enthalten.
In einer weiteren Ausführungsform umfaßt das erfindungsge
mäße Kit
- a) Kapseln, die feste Teilchen signalerzeugender Substan
zen einkapseln und Affinitätsmoleküle binden sollen;
- b) Agenzien zur Modifizierung von Affinitätsmolekülen, so
daß sie zur Bindung an die Oberfläche der Kapseln ge
eignet sind;
- c) Agenzien zur Durchführung der Bindungsreaktion zwischen
den Kapseln und Affinitätsmolekülen.
In einer besonders bevorzugten Variante dieser Ausführungs
form können die Kapseln a) einen Farbstoff enthalten und
sind chemisch präaktiviert, indem sie z. B. N-Succinimid-ak
tivierte Ester an ihrer Oberfläche zur covalenten Bindung
an ein Affinitätsmolekül wie z. B. ein Immunglobulin tragen.
Als Agenzien b) kann das Kit z. B. Biotinylierungsreagenzien
(3-Sulfo-N-hydroxysuccinimidylbiotin) zur Biotinylierung
eines Affinitätsmoleküls enthalten, so daß dieses zur Bin
dung an Avidin-vorbeschichtete Kapseln geeignet ist. Als
Agenzien c) kann das Kit zum Beispiel homo- oder bifunktio
nelle Vernetzer enthalten. Das Kit kann auch einen wie vor
stehend beschrieben Eintauchstreifen enthalten.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und Figu
ren näher erläutert.
Fig. 1 zeigt schematisch die Einkapselung der signalerzeu
genden festen Teilchen in Polyelektrolyt-Schichten. In
Schritt 1 werden die ungeladenen Teilchen durch das Selbst
zusammenfügen geladener Tensidmoleküle beschichtet, so daß
sie wasserdispergierbar werden und somit zugänglich für die
nachfolgende Beschichtung mit Polyelektrolyt-Schichten sind
(Schritt 2). Jede abgeschiedene Polyelektrolyt-Schicht hat
eine zu der bereits adsorbierten entgegengesetzte Ladung.
In Schritt 3 wird ein Affinitätsmolekül, das ein Zielmole
kül spezifisch erkennt, an die äußere Oberfläche der Polye
lektrolyt-Kapsel konjugiert bzw. gebunden.
Fig. 2 zeigt schematisch eine Ausführungsform der Verwen
dung der erfindungsgemäß hergestellten Kapseln bei einem
Bioassay zum Nachweis eines Zielmoleküls (Analyt). In einem
ersten Schritt wird der Analyt über einen Fänger-Antikörper
auf einer festen Phase immobilisiert. Im zweiten Schritt
wird der Analyt mit den erfindungsgemäß hergestellten Kap
seln inkubiert. Der resultierende Komplex wird mit physika
lischen oder chemischen Mitteln behandelt (Schritt 3), so
daß die signalerzeugenden Teilchen in die Lösung freige
setzt und gelöst und im letzten Schritt nachgewiesen wer
den.
Fig. 3 zeigt die elektrophoretische Mobilitätsmessung von
FDA/DPPC/(PSS/PAH)4-Kapseln mit ζ-Potentialen als Funktion
der Polyelektrolyt-Schichtzahl der FDA/DPPC/(PSS/PAH)4-Kap
seln. Die FDA-Teilchen wurden vor der ersten PSS-Abschei
dung mit einer DPPC-Schicht vorbeschichtet. Die geraden
Schichtzahlen entsprechen der PSS-Adsorption und die unge
raden Schichtzahlen (außer der ersten) der PAH-Adsorption.
Fig. 4 zeigt das SEM-Bild der FDA/DPPC/(PSS/PAH)4-Kapseln.
Die Größe der gemahlenen und in DPPC-Lösung suspendierten
FDA-Teilchen lag im Bereich von 1~3 µm. Nach Zusammenfügen
mit 4 Doppelschichten PSS/PAH zeigen die Teilchen wenig Ag
gregation.
Fig. 5 zeigt den Fluoreszenz-Immungssay für den Nachweis
von Ziege-Antimaus-IgG unter Verwendung von Maus-IgG-konju
gierten FDA/DPPC/(PSS/PAH)4-Kapseln als Markierung. Vor der
Zugabe von DMSO/NaOH waren die Fluoreszenz-Signale vernach
lässigbar. Nach der Zugabe von DMSO/NaOH waren die Fluores
zenzsignale auf mehr als das 200fache verstärkt.
Beispiele
Beispiel 1
Herstellung von Polyelektrolyt-Kapseln, die feste FDA-Teil
chen als signalerzeugende Substanz einkapseln
Fluoresceindiacetat-Teilchen (FDA; von Sigma) wurden wie
folgt eingekapselt: 50 mg fein gemahlenes FDA wurden gründ
lich mit 12 ml einer 0.4% Lösung von DL-α-Dipalmitoylphos
phatidylcholin (DPPC, von Sigma) oder Natrium-dodecylsulfat
(SDS) gemischt. Die Suspension wurde 15 min lang stehenge
lassen, um die großen Teilchen abzusetzen. Der trübe weiße
Überstand wurde extrahiert, durch Zentrifugieren auf 2 ml
eingeengt und einmal mit Wasser gewaschen. Die resultieren
den FDA-Teilchen durchliefen dann den Prozeß des schicht
weisen Zusammenfügens wechselweise mit den Polyelektrolyten
PSS und PAH. Das Polykation, Poly(allylamin-hydrochlorid)
(PAH), M. G. 15 000, wie auch das Polyanion, Poly(natrium-4-
styrolsulfonat) (PSS), M. G. 70 000, wurden von Aldrich
käuflich erworben. Das PSS wurde vor Gebrauch gegen Milli-
Q-Wasser (M. G.-Schnitt 14 000) dialysiert und lyophili
siert. Das bei allen Experimenten verwendete Wasser wurde
in einem Reinigungssystem Millipore Milli-Q Plus 185 vorbe
reitet und hatte einen spezifischen Widerstand von mehr als
18,2 MΩ.cm. Alle verwendeten Reagenzien (außer PSS) wurden
wie vom Hersteller erhalten eingesetzt.
Typischerweise wurde 1 ml PSS-Lösung (enthaltend 5 mg/ml
PSS und 0,5 M NaCl) zu 0,5 ml einer DPPC-vorbehandelten
FDA-Teilchensuspension gegeben. Die Suspension wurde in re
gelmäßigen Abständen geschüttelt. Nach 15 min Belassen zur
maximalen Adsorption wurde die Suspension 3 min lang bei
5000 U/min zentrifugiert. Dann wurde der Überstand abge
trennt und der Niederschlag mit Wasser gewaschen, um über
schüssigen, nicht adsorbierten Polyelektrolyt zu entfernen.
Dann wurde 1 ml PAH-Lösung (enthaltend 5 mg/ml PAH und
0,5 M NaCl) zugesetzt, um eine nachfolgende Schicht auf der
Kapseloberfläche zu bilden. Die Zentrifugations-/Wasch
schritte und die daraus folgende Adsorption entgegengesetzt
geladener Polyelektrolyte wurden wiederholt. Die erhaltenen
Kapseln wurden dann als FDA/DPPC/(PSS/PAH)n bezeichnet, ins
besondere mit n = 4.
Die elektrophoretische Mobilität beschichteter FDA-Kri
stalle wurde mit einem Malvern Zetasizer 4 gemessen, wobei
der Durchschnitt aus 5 Messungen im stationären Zustand ge
nommen wurde. Die ζ-Potentiale wurden erhalten aus der Be
ziehung ζ = uη/ε, worin η und ε die Viskosität bzw. die Di
elektrizitätskonstante der Testlösung sind (vgl. Fig. 3).
Die Rasterelektronenmikroskopie(SEM)-Messungen wurden mit
einem Instrument durchgeführt, das mit einer Beschleuni
gungsspannung von 5 kV betrieben wurde. Die SEM-Proben (auf
Deckglas-Objektträgern) wurden mit etwa 20 nm Au zerstäu
bungsbeschichtet (vgl. Fig. 4).
Beispiel 2
Antikörper-Konjugation an die äußere Oberfläche der in Bei
spiel 1 erhaltenen Kapseln
Die covalente Konjugation von Maus-IgG an die Kapseln von
Beispiel 1 wurde wie folgt durchgeführt: 1 mg Maus-Immun
globulin G (mIgG, von Sigma-Aldrich) wurde durch Reaktion
mit 2-Iminothiolan (von Pierce) in 0,1 M PBS-Puffer (ent
haltend 10 mM EDTA) aktiviert. Der Komplex wurde durch Gel
filtration an einer Sephadex G 25-Säule gereinigt. Die
FDA/DPPC/(PSS/PAH)n-Kapseln wurden durch Reaktion mit
Succinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat
(SMCC) von Pierce in 0,05 M Natriumcarbonat-Puffer, pH 9,5,
aktiviert und durch Zentrifugation und wiederholtes Waschen
aus dem überschüssigen SMCC ausgewaschen. Der 2-Iminothio
lan-modifizierte Antikörper und die Maleinimid-aktivierten
FDA-Kapseln wurden dann gemischt und 1 h lang bei 37°C
inkubiert. Überschüssiger, nicht konjugierter Antikörper
wurde durch Zentrifugation und Waschen mit PBS-Puffer in
mehreren Durchgängen ausgewaschen.
Beispiel 3
Fluoreszenz-Immungssay zum Nachweis von Ziege-Antimaus-IgG
mit den Antikörper-konjugierten Kapseln von Beispiel 2
Eine Polystyrol-Mikroplatte mit 96 Vertiefungen (Nunc)
wurde mit Ziege-Antimaus-IgG (gaMIgG, von Sigma-Aldrich))
in Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,6, bei 4°C über Nacht
beschichtet. Die Konzentration an gaMIgG variierte von
12 ng/ml bis 5 µg/ml. Nach dem Waschen wurde die Platte mit
1% Rinderserumalbumin (BSA) (Fraktion V, erhalten von
Sigma-Aldrich) bei 37°C 1 h lang blockiert. Die Platte wurde
dreimal gewaschen, und es wurde eine 1 : 300-Verdünnung der
Suspension aus Antikörper-konjugierten Kapseln zugesetzt.
Nach 1stündiger Inkubation bei 37°C wurde die Platte dreimal
gewaschen und mit Hilfe eines Fluoreszenz-Mikroplattenle
sers (Bio-Rad) untersucht. Es wurden keine signifikanten
Fluoreszenzsignale gemessen.
Dann wurden einer jeden Vertiefung 50 µl DMSO und 50 µl
0,5 M NaOH zugesetzt, und die Platte wurde wieder mit Hilfe
des Fluoreszenz-Mikroplattenlesers untersucht. Die Fluores
zenzsignale wurden auf mehr als das 200fache verstärkt
(vgl. Fig. 5).
Beispiel 4
Alternative Konjugationsstrategien zur Bindung biointerak
tiver Moleküle, z. B. Immunglobulin G an die Kapseloberflä
che
- 1. 4.1 Direkte Adsorption von IgG
1 ml der Fluorophorteilchen-Suspension (5% Gew./Vol.) wurde
mit 100 µl monoklonalen Anti-FABP-Antikörpern (2 mg/ml) 2
Stunden lang bei Raumtemperatur und 12 Stunden lang bei 4°C
inkubiert. Der Überschuß an Antikörpern wurde durch wieder
holte Zentrifugations- und Waschdurchgänge entfernt, und
die Markierung wurde schließlich in PBS wieder suspendiert.
- 2. 4.2 Beschichten von IgG über Neutravidin - ein Verfahren,
das bei Verwendung der Kapseln in einem Kit anwendbar
ist
- a) Biotinylierung des Antikörpers:
0,2 mg Biotin-X-NHS (Pierce, USA) in 100 µl Beschich
tungspuffer wurden einer Lösung von 1 mg monoklonalem
Anti-hCG-beta-Antikörper (Clone ME 106, Dunn Labortech
nik, Asbach) in 1 ml Beschichtungspuffer zugesetzt. Die
Mischung wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur inku
biert. Unumgesetztes Biotin wurde durch wiederholte
Zentrifugationsschritte in einer Centricon-Trenneinheit
(30 kd, Centricon, USA) vom Antikörper abgetrennt. Der
Puffer wurde zu 1 ml PBS geändert, 1% BSA wurde zur La
gerung zugesetzt. - b) Beschichten der Fluorophor-Teilchen mit Neutravidin:
1 ml der Fluorophorteilchen-Suspension (5% Gew./Vol.,
mit einer äußeren Schicht aus Polyacrylsäure, PAA)
wurde in PBS-Puffer, enthaltend 10 mM N-Hydroxysuccin
imid (NHS) und 20 mM 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]-
carbodiimid-hydrochlorid (EDC), resuspendiert, und die
Mischung wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inku
biert. Unumgesetztes EDC/NHS wurde durch einen Zentri
fugations- und Waschdurchgang entfernt. Es wurde 1 ml
einer Lösung von 2 mg Neutravidin (Pierce, USA) in
Carbonat-Puffer (pH 8,5) verwendet, um die Teilchen
wieder zu suspendieren. Die Suspension wurde 3 Stunden
lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nicht aufbeschich
tetes Neutravidin wurde durch einen Zentrifugations-
und Waschdurchgang entfernt, und die Teilchen wurden
schließlich in 1 ml PBS mit 1% BSA resuspendiert. - c) Beschichten von Fluorophor-Teilchen mit biotinyliertem
Antikörper:
1 ml der Fluorophorteilchen-Suspension (5% Gew./Vol.)
wurde mit 100 µl des biotinylierten Antikörpers Anti-
hCG-b-Antikörper (1 mg/ml) 2 Stunden lang bei Raumtem
peratur inkubiert. Der Überschuß an Antikörper wurde
durch wiederholte Zentrifugations- und Waschdurchgänge
entfernt, und die beschichteten Kapseln wurden schließ
lich in PBS resuspendiert. Nach Zugabe von 1% BSA sind
die Kapseln gebrauchs- bzw. lagerfähig.
Beispiel 5
Verwendung der mit Affinitätsmolekülen beschichteten Kap
seln in Bioassays
- 1. Festphasen-Immungssay auf Humanchoriongonadotropin
(hCG)
- 1. Beschichten: 100 µl einer Lösung von 25 µg/ml Anti-hCG-
Antikörper (Clone ME 107, Dunn Labortechnik, Asbach) in
Carbonat-Puffer (100 mM, pH 9,6) pro Vertiefung wurden
in einer Multititerplatte mit 96 Vertiefungen (Costar
Maxi Sorb Polystyrol-Platte) 3 Stunden lang inkubiert.
Die Platte wurde mit Wasser gewaschen und mit 300 µl
einer 1% BSA-Lösung in PBS pro Vertiefung 1 Stunde lang
blockiert.
- 2. Probeninkubation: 200 µl der hCG-Proben (Sigma) mit
Verdünnungen von 0,1 µE bis 100 µE pro ml wurden 2
Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte
wurde zweimal mit Wasser gewaschen.
- 3. Markierungsinkubation: Die Fluorophorteilchen-Suspen
sion (5% Gew./Vol.) mit dem über Neutravidin konjugier
ten, biotinylierten Anti-hCG-b-Antikörper wurde mit ei
nem 1% BSA enthaltenden PBS-Puffer auf 1 : 1000 verdünnt.
200 µl Verdünnung pro Vertiefung wurden 2 Stunden lang
bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde zweimal
mit Wasser gewaschen, 300 µl Ethanol (96%) wurden zuge
setzt, und es wurde unter Schütteln 2 Minuten lang in
kubiert.
- 4. Fluoreszenzmessung: Der Gehalt an freigesetztem Fluoro
phor aus den Markierungskapseln wurde mit einem Fluo
reszenz-ELISA-Plattenlesegerät gemessen. Die Werte der
Proben (B) wurden mit den ohne Probe gemessen Werten
(B0) in Beziehung gesetzt.
- 2. Reagensglastest auf fettsäurebindendes Protein (FABP)
- 1. Beschichten: 400 µl einer Lösung von 1 mg/ml Anti-FABP-
Antikörper in Carbonat-Puffer (100 mM, pH 9,6) wurden
in einem Costar Maxi Sorb 5 ml-Polystyrol-Röhrchen 3
Stunden lang inkubiert (nur der erste Zentimeter des
unteren Teils stand in Kontakt mit der Lösung). Das
Reagensglas wurde mit Wasser gewaschen und mit 2 ml ei
ner 1% BSA-Lösung in PBS 1 Stunde lang blockiert (die
gesamte Innenwandung des Röhrchens wurde blockiert).
- 2. Probeninkubation: 200 µl der FABP-Proben mit Verdünnun
gen von 0,1 µg bis 50 µg pro ml wurden 2 Stunden lang
im Reagensglas bei Raumtemperatur inkubiert. Die Röhr
chen wurden zweimal mit Wasser gewaschen.
- 3. Markierungsinkubation: Die Fluorophorteilchen-Suspen
sion (5% Gew./Vol.) mit dem direkt adsorbierten mono
klonalen Anti-FABP-Antikörper wurde mit einem 1% BSA
enthaltenden PBS-Puffer auf 1 : 1000 verdünnt. 300 µl
Verdünnung wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur im
Reagensglas inkubiert. Das Reagensglas wurde zweimal
mit Wasser gewaschen, 500 µl Ethanol (96%) wurden zuge
setzt, und es wurde unter Schütteln 2 Minuten lang in
kubiert.
- 4. Fluoreszenzmessung: Der Gehalt an freigesetztem Fluoro
phor aus den Markierungskapseln wurde mit einem Spek
trofluorimeter gemessen. Die Werte der Proben (B) wur
den mit den ohne Probe gemessen Werten (B0) in Beziehung
gesetzt.