DE10038185C2 - Einrichtung zum Erfassen von unterschiedlichen Fluoreszenzsignalen eines mit verschiedenen Anregungswellenlängen ganzflächig beleuchteten Probenträgers - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Einrichtung zum Erfassen von un­ terschiedlichen Fluoreszenzsignalen eines mit verschiedenen Anregungswellenlängen ganzflächig beleuchteten Probenträgers gemäß Patentanspruch 1.

Es sind beispielsweise auf dem Gebiete der Durchführung von quantitativen Fluoreszenzimmunotests Probenträger bekannt, die eine Vielzahl von Elektroden, beispielsweise 10 000 Elek­ troden, besitzen, die selektiv mit einer elektrischen Span­ nung beaufschlagbar sind. Wenn über die Elektroden verschie­ dene Probenflüssigkeiten geleitet werden, können an den Elektroden, je nach Anliegen bestimmter Spannungen, durch Ab­ lagerung verschiedene Proben erzeugt werden. Da diese Proben mit zwei oder mehr Fluoreszenzträgern markiert sind, leuchten sie bei einer Anregung mit verschiedenen Lichtwellenlängen unterschiedlich. Auf diese Weise können biochemische Eigen­ schaften gemessen werden.

In diesem Zusammenhang ist es bekannt, dichroitische, fest eingebaute Spiegel zu verwenden, um eine Trennung der ver­ schiedenen Fluoreszenzwellenlängen zu erreichen, die vom Pro­ benträger ausgesendet werden. Ein Problem besteht dabei dar­ in, dass dichroitische Spiegel nur dann betrieben werden kön­ nen, wenn der Strahlengang an der Position der dichroitischen Spiegel parallel ist. Derartige Spiegel haben zudem keinen 100%igen Wirkungsgrad. Sie benötigen ferner gleichzeitig ein elektrisches Takten der Anregungsquellen.

In der Halbleitertechnik hergestellte Probenträger sind bei­ spielsweise in mehreren Schichten aufgebaut und besitzen eine Vielzahl von zylinderförmigen Platinelektroden, an die die oben genannten Spannungen angelegt werden können. Die Proben­ träger sind in jeweils mit einer Glasschicht abgedeckten Kunststoffbehältern angeordnet, wobei die genannten Proben­ flüssigkeiten den Raum zwischen Glasschicht und Kunststoffbe­ hälter durchströmen und dabei in Kontakt mit den Elektroden gelangen können.

Aus DE 39 26 090 C2 ist ein Zweistrahlphotometer bekannt, bei dem mittels einer drehbaren Spiegeleinrichtung, die in verspiegelte und lichtdurchlässige Sektoren aufgeteilt ist, ein von einer Lichtquelle ausgehendes Lichtbündel in einen Meßstrahl und in einen Referenzstrahl aufgespalten wird. Bei­ de Strahlengänge werden durch dieselbe Spiegeleinrichtung re­ kombiniert, wobei der Meßstrahl die Spiegeleinrichtung durch­ dringt und durch eine zu untersuchende Probe hindurchtritt und der Referenzstrahl an der Spiegeleinrichtung reflektiert wird und somit nicht auf die Probe trifft. Der rekombinierte Strahl wird von einer Detektoreinrichtung erfaßt. Bei geeig­ neter Auswertung der erfaßten Meßsignale kann der Einfluß von Schwankungen hinsichtlich der Lichtquellenhelligkeit oder der Detektorempfindlichkeit eliminiert werden.

Aus DE 197 48 211 A1 ist ein optisches System bekannt, bei dem eine Mehrzahl von in einem Feld angeordneten unterschied­ lichen Proben mittels einer Abbildungsoptik auf ein Detektor­ feld abgebildet werden. Gemäß einer Ausführungsform wird ein im Strahlengang zwischen dem Probenfeld und dem Detektorfeld angeordneter Strahlteiler verwendet, um das Probenfeld mit einer Lichtquelle zu beleuchten.

Aus GB 1 599 349 ist eine Vorrichtung bekannt, bei der zwei Eingangs-Lichtstrahlen mittels einer Anordnung aus zwei rotierenden Scheiben, die jeweils verspiegelte und licht­ durchlässige Bereiche aufweisen, abwechselnd in zwei räumlich getrennte Ausgangs-Lichtstrahlen gelenkt werden.

Aus DE-OS 21 47 142 ist ein photometrischer Analysator be­ kannt, bei dem eine zu untersuchende Lösung, welche sich zwi­ schen zwei rotierenden Scheiben befindet, abwechselnd von ei­ nem ersten und von einem zweiten Lichtstrahl durchdrungen wird. Die beiden Lichtstrahlen unterscheiden sich voneinander hinsichtlich ihrer, Wellenlänge. Jede der beiden rotierenden Scheiben weist zwei lichtdurchlässige Bereiche und zwei re­ flektierende Bereiche mit im Vergleich zur Scheibenoberfläche um 45° geneigten Spiegelflächen auf.

Aus DE-AS 12 91 533 ist eine Vorrichtung zur Trennung und zur Wiedervereinigung von Lichtstrahlen bekannt, bei der ein von einer Lichtquelle emittierter Lichtstrahl mittels einer ersten rotierenden Scheibe, die teilweise verspiegelt und teilweise lichtdurchlässig ist, sequentiell in zwei räumlich getrennte Teilstrahlen aufgespalten wird. Die beiden Teil­ strahlen werden jeweils nach dem Durchtritt durch eine zu un­ tersuchende Probe und nach einer Reflexion an einem Spiegel mittels einer zweiten rotierenden Scheibe, die ebenfalls teilweise verspiegelt und teilweise lichtdurchlässig ist, se­ quentiell in den Strahlengang eines Lichtstrahls gelenkt, der von einem Detektor erfasst wird. Bei geeigneter Synchronisa­ tion der Drehbewegung der beiden Scheiben können somit zwei unterschiedliche Proben hinsichtlich ihres Absorptionsverhal­ tens miteinander verglichen werden.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Einrichtung zum Erfassen von unterschiedlichen Fluoreszenzsi­ gnalen eines mit verschiedenen Anregungswellen beleuchteten Probenträgers zu schaffen, bei der ein Takten der die ver­ schiedenen Anregungswellenlängen erzeugenden Lichtquellen nicht erforderlich ist.

Diese Aufgabe wird durch eine Einrichtung mit den Merkmalen des Patentanspruches 1 gelöst.

Der Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass zur Erfassung von unterschiedlichen Fluoreszenzsignalen eines mit verschiedenen, vorzugsweise zwei, Anregungswellenlängen beleuchteten Probenträgers keine dichroitischen Spiegel ver­ wendet werden müssen, die die oben geschilderten Nachteile aufweisen. Bei der erfindungsgemäßen Einrichtung erfolgt die erforderliche Trennung der Fluoreszenzsignale mit der Hilfe einer im Strahlengang der Anregungs- und Detektionsoptik an­ geordneten drehbaren Spiegelanordnung, die entsprechend der Anzahl der Anregungswellenlängen bereichsweise durchlässig ist. Diese Spiegelanordnung wird so im Strahlengang bewegt, dass jeweils ein Anregungs-Detektionskanal geöffnet ist und die anderen Anregungs-Detektionskanäle geschlossen sind. Be­ sonders bevorzugt handelt es sich bei der Spiegelanordnung um einen drehbaren Spiegel.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung gehen aus den Unteransprüchen hervor. Im folgenden werden die Erfindung und deren Ausgestaltungen im Zusammenhang mit den Figuren nä­ her erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 in schematischer Darstellung eine erste Seitenan­ sicht des Detektionteiles der Einrichtung zum Erfassen von zwei unterschiedlie­ chen Fluoreszenzsignalen eines mit zwei verschiede­ nen Anregungswellen beleuchteten Probenträgers;

Fig. 2 eine Seitenansicht der gesamten Einrichtung der Fig. 1 unter einem um 90° gedrehten Blickwinkel und

Fig. 3 die Aufsicht auf einen drehbaren Spiegel, der für eine Einrichtung zum Erfassen von zwei unterschied­ lichen Fluoreszenzsignalen bei zwei verschiedenen Anregungswellen geeignet ist.

Gemäß den Fig. 1 bis 3, weist eine bevorzugte Einrichtung zum Erfassen von zwei unterschiedlichen Fluoreszenzsignalen bei zwei Anregungswellenlängen, im wesentlichen eine erste Lichtquelle 1, eine zweite Lichtquelle 3, eine erste Anre­ gungsoptik 5, die den ersten Lichtstrahl 7 der ersten Licht­ quelle 1 auf einen Probenträger 9 lenkt, eine zweite Anre­ gungsoptik 11, die den zweiten Lichtstrahl 13 der zweiten Lichtquelle 3 auf den Probenträger 9 lenkt, ein einem ersten Fluoreszenzlicht zugeordnetes erstes Filter 15, ein einem zweiten Fluoreszenzlicht zugeordnetes zweites Filter 17, als Spiegelanordnung einen segmentierten drehbaren Spiegel 19, der gemäß Fig. 3 einen ersten lichtdurchlässigen Bereich 19" und einen zweiten spiegelnden Bereich 19' besitzt, einen ersten festen Spiegel 21, der das erste Fluoreszenzlicht 23 zum Empfänger 25 reflektiert, und einen zweiten festen Spie­ gel 27 auf, der das zweite Fluoreszenzlicht zum drehbaren Spiegel 19 leitet, von dem es zum Empfänger 25 reflektiert wird.

Bei der ersten Lichtquelle 1 und der zweiten Lichtquelle 3 handelt es sich vorzugsweise um Laserquellen, wobei die erste Lichtquelle 1 beispielsweise ein Laserlicht einer Wellenlänge von 532 nm und die zweite Lichtquelle 3 beispielsweise ein Laserlicht einer Wellenlänge von 632 nm erzeugen. Bei den Filtern 15 und 17 handelt es sich vorzugsweise um Steilkant­ filter, die entweder nur das erste oder zweite Fluoeszenz­ licht passieren lassen. Die erste Anregungsoptik 5 umfaßt ei­ ne erste Blende 30, und eine erste Linsenanordnung 31, die aus dem von der ersten Lichtquelle 1 erzeugten ersten Laser­ strahl einen ersten parallelen Lichtstrahl 7 erzeugen, und einen ersten Umlenkspiegel 33, der den parallelen Lichtstrahl 7 derart auf den Probenträger 9 lenkt, dass dieser ganzflächig be­ leuchtet wird.

Entsprechend umfaßt die zweite Anregungsoptik 11 eine zweite Blende 34 und eine zweite Linsenanordnung 35, die aus dem zweiten Laserstrahl der zweiten Lichtquelle 3 einen zweiten parallelen Lichtstrahl 13 erzeugen, und eine zweiten festen Um­ lenkspiegel 37, der den parallelen Lichtstrahl 13 auf den Proben­ träger 9 leitet, um diesen ganzflächig zu beleuchten.

Der drehbare Spiegel 19 ist um eine Drehachse 20 drehbar und weist den spiegelnden Bereich 19' sowie den lichtdurchlässi­ gen Bereich 19" auf, die bei der Verwendung von zwei Licht­ quellen 1, 3 zweier unterschiedlicher Wellenlängen vorzugs­ weise jeweils der Hälfte der Fläche des kreisförmigen drehba­ ren Spiegels 19 entsprechen.

Die Detektionsoptik 42 umfaßt eine dem Probenträger 9 nachge­ schaltete optische Abbildungsanordnung 43, die aus dem vom Probenträger 9 abgegebenen ersten und zweiten Fluoreszenz­ licht 23 bzw. 45 jeweils einen parallelen Strahl erzeugt und eine dem Empfänger 25 vorgeschaltete Abbildungsoptik 48, die die genannten parallelen Strahlen ganzflächig auf den Empfänger 25 abbildet. Das Filter 15 und der feste Spiegel 27 sowie das Filter 17 und der feste Spiegel 21 sind Teil der Detektionsoptik 42.

Bei dem Empfänger 25 handelt es sich vorzugsweise um eine CCD-Anordnung, die entsprechend der Anzahl der Proben des Probenträgers 9 lichtempfindliche Elemente aufweisen, die entsprechend ihrer Beleuchtung mit dem ersten oder zweiten Fluorenszenzlicht 23 bzw. 45 jeweils ein erstes oder zweites elektrisches Fluoreszenzsignal erzeugen. Diese Fluoreszenzsi­ gnale werden zu einer nicht näher dargestellten Auswertelek­ tronik geleitet.

Beispielsweise weisen der Probenträger 9 und der Empfänger 25 Proben bzw. optische Sensorelemente in sich entsprechenden Rasterkonfigurationen in einer Anzahl von Proben bzw. Sensor­ elementen in der Größenordnung von 10 000 auf.

Im folgenden wird die Funktion der vorliegenden Einrichtung zum Trennen von zwei Fluoreszenzsignalen näher erläutert.

Dabei wird davon ausgegangen, dass sich der spiegelnde Be­ reich 19' in einer Phase in Fig. 1 links von der Drehachse 20 und der lichtdurchlässige Bereich 19" rechts von der Drehachse 20 befinden. Dies hat zur Folge, dass der von der ersten Lichtquelle 1 erzeugte Lichtstrahl 7, im Folgenden als Laserstrahl 7 bezeichnet durch den lichtdurch­ lässigen Bereich 19" hindurchtritt und durch die Abbildungs­ optik 5 zum Probenträger 9 geleitet wird (Fig. 2), um diesen ganzflächig zu beleuchten. Das vom Probenträger 9 infolge der Wellenlänge des ersten Laserstrahles 7 ausgesendete erste Fluoreszenzlicht 23 wird an dem spiegelnden Bereich 19' ge­ spiegelt und auf das Filter 17 gelenkt, tritt durch dieses hindurch, wird am festen Spiegel 21 reflektiert, tritt durch den lichtdurchlässigen Bereich 19" des Spiegels 19 hindurch ( Fig. 1) und wird durch die Abbildungsöptik 48 auf den Empfän­ ger 25 gelenkt, der an seinen einzelnen lichtempfindlichen Sensorelementen entsprechende Fluoreszenzsignale erzeugt. Während dieser Phase wird der von der zweiten Lichtquelle 3 ausgesendete Lichtstrahl 13, im Folgenden als Laserstrahl 13 bezeichnet, am spiegelnden Bereich 19' re­ flektiert, so dass er nicht zum zweiten Umlenkspiegel 37 und nicht zum Probenträger 9 gelangen kann (Fig. 2).

In der anderen Phase, in der sich der spiegelnde Bereich 19' rechts von der Drehachse 20 und der lichtdurchlässige Bereich 19" links von der Drehachse 20 befinden, tritt der zweite Laser­ strahl 13 der Lichtquelle 3 durch den lichtdurchlässigen Bereich 19" hindurch und wird durch den zweiten Umlenkspiegel 37 auf den Probenträger 9 gerichtet (Fig. 2 mit vertauschten Berei­ chen 19', 19"). Das dabei erzeugte zweite Fluoreszenzlicht 45 tritt durch den lichtdurchlässigen Bereich 19" hindurch, pas­ siert das Filter 15, wird durch den festen Spiegel 27 zum spiegelnden Bereich 19' des drehbaren Spiegels 19 reflektiert und wird an diesem gespiegelt und zur Abbildungsöptik 48 ge­ lenkt (Fig. 1 gepunktete Linien). Von dieser wird das zweite Fluoreszenzlicht 45 auf den Empfänger 25 abgebildet. Die ein­ zelnen optischen Sensorelemente des Empfängers 25 erzeugen dann entsprechende zweite Fluoreszenzsignale. In dieser Phase wird der von der ersten Lichtquelle 1 erzeugte erste Laser­ strahl an dem spiegelnden Bereich 19' reflektiert, so dass er nicht zum ersten Umlenkspiegel 33 und auch nicht zum Proben­ träger 9 gelangen kann.

Auf diese Weise kann durch die Drehbewegung des drehbaren Spiegels 19 zwischen den beiden Laserstrahlen 7 und 13, die gleichzeitig erzeugt werden, um jeweils den Probenträger 9 ganzflächig beleuchten zu können, hin- und hergeschaltet wer­ den, so dass jeweils nur ein Laserstrahl den Probenträger 9 beleuchtet und ein Fluoreszenzlicht erzeugt wird, das zum Empfänger 25 gleitet wird, während der jeweils andere Laser­ strahl am spiegelnden Bereich 19' des drehbaren Spiegels 19 reflektiert wird, so dass er nicht zum Empfänger 25 gelangen kann. In aufeinanderfolgender Reihenfolge werden daher an dem Empfänger 25 die unterschiedlichen Fluoreszenzsignale empfan­ gen und, wenn es sich beim Empfänger 25 um eine CCD-Anordnung handelt, zu einer Auswerteelektronik abgetaktet.

Es wird darauf hingewiesen, dass der drehbare Spiegel 19 zur Trennung von mehr als zwei Fluoreszenzsignalen auch mehrere lichtdurchlässige und spiegelnde Bereiche besitzen kann, so dass sichergestellt wird, dass in verschiedenen Phasen immer nur ein Fluoreszenzlicht durch einen Laserstrahl angeregt und zum Empfänger geleitet wird, während die jeweils anderen La­ serstrahlen an spiegelnden Bereichen gespiegelt werden, so dass sie kein Fluoreszenzlicht anregen können.

An der Stelle des erläuterten drehbaren Spiegels 19 können auch andere bewegbare Spiegelanordnung verwendet werden. Bei­ spielsweise kann eine lichtdurchlässige und spiegelnde Berei­ che nebeneinander in einer Reihe aufweisende Platte in der Richtung der Reihe hin- und herbewegt werden.

Claims (14)

1. Einrichtung zum Erfassen von unterschiedlichen Fluores­ zenzsignalen eines mit verschiedenen Anregungswellenlängen ganzflächig beleuchteten Probenträgers, der eine Mehrzahl von mit verschiedenen Lichtwellenlängen zur Abgabe von unter­ schiedlichem Fluoreszenzlicht anregbaren Proben aufweist, bei der Lichtquellen (1, 3) zur Erzeugung von Lichtstrahlen jeweils verschiedener Anregungswellenlängen vorgesehen sind, . die jeweils über eine Anregungsoptik (5, 11) ganzflächig zum Probenträger (9) lenkbar sind,
bei der das jeweils vom Probenträger (9) ausgesendete Fluo­ reszenzlicht (23, 45) derart zum entsprechende Fluoreszenzsi­ gnale erzeugenden Empfänger (25) lenkbar ist, dass jede Probe auf ein der jeweiligen Probe entsprechendes lichtempfindli­ ches Element des Empfängers (25) abgebildet wird, und
bei der zwischen den verschiedenen Lichtquellen (1, 3) und dem Probenträger (9) eine Spiegelanordnung mit spiegelnden Bereichen (19') und lichtdurchlässigen Bereichen (19") ge­ schaltet und so bewegbar ist, dass der Lichtstrahl jeweils einer Lichtquelle (1) durch einen lichtdurchlässigen Bereich (19") zum Probenträger (9) hindurchtritt, während die Strah­ len aller anderen Lichtquellen durch die spiegelnden Bereiche (19") so reflektiert werden, dass sie nicht zum Probenträger (9) gelangen, und daß auf den Empfänger (25) nur das von der jeweils einen Lichtquelle (1) in den Proben erzeugte und von diesen ausgesandte Fluoreszenzlicht gelangt und von diesem ausschließlich erfasst wird.

2. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Spiegelanordnung ein um eine Drehachse (20) drehbarer Spiegel mit spiegelnden Bereichen (19') und lichtdurchlässi­ gen Bereichen (19") ist.

3. Einrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich­ net, dass eine erste Lichtquelle (1) und eine zweite Licht­ quelle (3) vorgesehen sind, die die Lichtstrahlen (7, 13) un­ terschiedlicher Lichtwellenlängen erzeugen, dass die Spiegel­ anordnung einen lichtdurchlässigen Bereich (19") und einen spiegelnden Bereich (19') aufweist, wobei der erste Licht­ strahl der ersten Lichtquelle (1) durch den lichtdurchlässi­ gen Bereich (19") zum Probenträger (9) hindurchtritt und der zweite Lichtstrahl (13) der zweiten Lichtquelle (3) vom spie­ gelnden Bereich (19') so reflektiert wird, dass er den Pro­ benträger (19) nicht erreicht, und umgekehrt.

4. Einrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Lichtstrahl (7) der ersten Lichtquelle (1) von ei­ ner ersten Anregungsoptik (5) zum Probenträger (9) lenkbar ist, um diesen ganzflächig zu beleuchten.

5. Einrichtung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeich­ net, dass der zweite Lichtstrahl (13) der zweiten Lichtquelle (3) durch eine zweite Anregungsoptik (11) zum Probenträger (9) lenkbar ist, um diesen ganzflächig zu beleuchten.

6. Einrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch ge­ kennzeichnet, dass das vom ersten Lichtstrahl (7) der ersten Lichtquelle (1) erzeugte erste Fluoreszenzlicht (23) zum spiegelnden Bereich (19") ausgesendet wird, der ihn zu einem ersten festen Spiegel (21) reflektiert und dass der erste fe­ ste Spiegel (21) das erste Fluoreszenzlicht (23) durch den lichtdurchlässigen Bereich (19") zum Empfänger (25) reflek­ tiert.

7. Einrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch ge­ kennzeichnet, dass das vom zweiten Lichtstrahl (13) erzeugte zweite Fluoreszenzlicht (45) vom Probenträger (9) durch den lichtdurchlässigen Bereich (19") des Spiegels (19) hindurch­ tritt und von einem zweiten festen Spiegel (27) auf den spie­ gelnden Bereich (19') des Spiegels (19) reflektiert wird und von dem spiegelnden Bereich (19') des Spiegels (19) zum Emp­ fänger (25) reflektiert wird.

8. Einrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch ge­ kennzeichnet, dass der drehbare Spiegel (19) kreisförmig aus­ gebildet ist und einen halbkreisförmigen lichtdurchlässigen Bereich (19') und einen halbkreisförmigen spiegelnden Bereich (19") aufweist.

9. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch ge­ kennzeichnet, dass die erste Anregungsoptik (5) einen ersten Umlenkspiegel (33) aufweist, der den ersten Lichtstrahl (7) zum Probenträger (9) lenkt.

10. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch ge­ kennzeichnet, dass die zweite Anregungsoptik (11) einen zwei­ ten Umlenkspiegel (37) aufweist, der den zweiten Lichtstrahl (13) zum Probenträger (9) lenkt.

11. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem Probenträger (9) und dem Empfänger (25) im Strahlengang des ersten Fluoreszenzlichtes (23) ein erstes Filter (17) vorgesehen ist, das nur das erste Fluoreszenzlicht (23) passieren läßt.

12. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass im Strahlengang des zweiten Fluoreszenz­ lichtes (45) zwischen dem Probenträger (9) und dem Empfänger (25) ein zweites Filter (15) vorgesehen ist, das nur das zweite Fluoreszenzlicht passieren läßt.

13. Einrichtung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekenn­ zeichnet, dass das erste Filter (17) und/oder das zweite Fil­ ter (15) ein Steilkantfilter ist.

14. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Empfänger (25) eine CCD-Anordnung ist, die zur Erzeugung elektrischer Fluoreszenzsignale aus dem empfangenen ersten oder zweiten Fluoreszenzlicht (23, 45) optische Sensorelemente aufweist, die entsprechend den Proben des Probenträgers (9) angeordnet sind, wobei die an den Sen­ sorelementen während der Beleuchtung mit dem einen Fluores­ zenzlicht erzeugten elektrischen Fluoreszenzsignale vor der Beleuchtung mit dem anderen Fluoreszenzlicht zu einer Auswer­ teelektronik abgetaktet werden.