DE10010280A1 - Verfahren zur Detektion von Cytosin-Methylierung in DNA Proben - Google Patents
Verfahren zur Detektion von Cytosin-Methylierung in DNA ProbenInfo
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Abstract
Beschrieben wird ein Verfahren zum Nachweis von 5-Methylcytosin in genomischen DNA-Proben. Zuerst wird eine genomische DNA aus einer DNA-Probe mit einem Reagenz chemisch umgesetzt, wobei 5-Methylcytosin und Cytosin unterschiedlich reagieren, und anschließend wird die vorbehandelte DNA unter Verwendung einer Polymerase und mindestens einem Primer amplifiziert. Im nächsten Schritt wird die amplifizierte genomische DNA an mindestens ein Oligonukleotid unter Ausbildung einer Duplex hybridisiert und selbiges um mindestens ein Nukleotid verlängert, wobei das Nukleotid eine nachweisbare Markierung trägt und die Verlängerung vom Methylierungsstatus des jeweiligen Cytosins in der genomischen DNA-Probe abhängt. Im nächsten Schritt werden die verlängerten Oligonukleotide auf das Vorhandensein der Markierung untersucht.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von 5-
Methylcytosin in genomischen DNA-Proben. Die vorliegende
Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Detektion des Me
thylierungszustandes genomischer DNA Proben. Das Verfah
ren kann gleichzeitig auch zum Nachweis von Punktmutatio
nen und Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) genutzt
werden.
Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre
in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebe
nen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in
RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe
der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschal
tet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Ge
ne in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist
mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw.
des Genoms korrelierbar. Insofern ist die Annahme nahe
liegend, daß pathogene Zustände sich in einem veränderten
Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms äu
ßern.
5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte
Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt bei
spielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkripti
on, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese.
Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil
genetischer Information ist daher von erheblichem Inter
esse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht
durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methyl
cytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie
Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR-Amplifikation
die epigenetische Information, welche die 5-Methyl
cytosine tragen, vollständig verloren.
Eine relativ neue und die mittlerweile am häufigsten an
gewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-
Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von
Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer
Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem
Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-
Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht
modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewan
delt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein
Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden
werden kann, jetzt durch "normale" molekularbiologische
Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise
durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung
nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen
auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt wird. Der
Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird
durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersu
chende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch
die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit rea
giert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle
Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse
ersetzt (Olek, A. et al., Nucl. Acids. Res. 1996, 24,
5064-5066). Mit dieser Methode können einzelne Zellen un
tersucht werden, was das Potential der Methode veran
schaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regio
nen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine glo
bale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen
Methylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann
auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus
geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese ge
hen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.
Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten,
5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden
Übersichtsartikel entnommen werden: Rein, T., DePamphi
lis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26,
2255.
Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen
(z. B. Zechnigk, M. et al., Eur. J. Hum. Gen. 1997, 5,
94-98) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden
kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer
Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder komplett se
quenziert (Olek, A, und Walter, J., Nat. Genet. 1997, 17,
275-276) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine
"Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo, M. L. und Jones,
P. A., Nucl. Acids Res. 1997, 25, 2529-2531, WO 9500669)
oder einen Enzymschnitt (Xiong, Z. und Laird, P. W.,
Nucl. Acids. Res. 1997, 25, 2532-2534) nachgewiesen. Zu
dem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrie
ben worden (Olek et al., WO 9928498).
Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bi
sulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen
Genen befassen, sind: Xiong, Z. und Laird, P. W. (1997),
Nucl. Acids Res. 25, 2532; Gonzalgo, M. L. und Jones, P.
A. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2529; Grigg, S. und
Clark, S. (1994), Bioassays 16, 431; Zeschnik, M. et al.
(1997), Human Molecular Genetics 6, 387; Teil, R. et al.
(1994), Nucl. Acids Res. 22, 695; Martin, V. et al.
(1995), Gene 157, 261; WO 9746705, WO 9515373 und WO
45560.
Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer
Array Herstellung läßt sich aus einer im Januar 1999 er
schienen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Gene
tics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort
zitierten Literatur entnehmen.
Es existieren verschiedene Verfahren um DNA zu immobili
sieren. Das bekannteste Verfahren ist die Festbindung ei
ner DNA, welche mit Biotin funktionalisiert ist, an eine
Streptavidin-beschichtete Oberfläche (Uhlen, M. et al.
1988, Nucleic Acids Res. 16, 3025-3038). Die Bindungs
stärke dieses Systems entspricht der einer kovalenten
chemischen Bindung ohne eine zu sein. Um eine Ziel-DNA
kovalent an eine chemisch vorbereitete Oberfläche binden
zu können, bedarf es einer entsprechenden Funktionalität
der Ziel-DNA. DNA selbst besitzt keine Funktionalisie
rung, die geeignet ist. Es gibt verschiedene Varianten,
in eine Ziel-DNA eine geeignete Funktionalisierung einzu
führen: Zwei leicht zu handhabende Funktionalisierungen
sind primäre, aliphatische Amine und Thiole. Solche Amine
werden quantitativ mit N-Hydroxysuccinimidestern umge
setzt, und Thiole reagieren unter geeigneten Bedingungen
quantitativ mit Alkyliodiden. Eine Schwierigkeit besteht
im Einführen einer solchen Funktionalisierung in eine
DNA. Die einfachste Variante ist die Einführung durch ei
nen Primer einer PCR. Gezeigte Varianten benutzen 5'-
modifizierte Primer (NH2 und SH) und einen bifunktionalen
Linker.
Ein wesentlicher Bestandteil der Immobilisierung auf ei
ner Oberfläche ist ihre Beschaffenheit. Bis jetzt be
schriebene Systeme sind hauptsächlich aus Silizium oder
Metall. Eine weitere Methode zur Bindung einer Ziel-DNA
basiert darauf, eine kurze Erkennungssequenz (z. B. 20
Basen) in der Ziel-DNA zur Hybridisierung an ein oberflä
chenimmobilisiertes Oligonukleotid zu verwenden. Es sind
auch enzymatische Varianten zur Einführung von chemisch
aktivierten Positionen an eine Ziel-DNA beschrieben wor
den. Hier wird an einer Ziel-DNA enzymatisch eine 5'-NH2-
Funktionalisierung durchgeführt.
Für die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind
vielfach fluoreszent markierte Sonden verwendet worden.
Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das
einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH
der jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der
hybridisierten Sonden erfolgt beispielsweise über ein
Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben
vielen anderen, kommerziell erhältlich.
Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer
Array Herstellung läßt sich aus einer im Januar 1999 er
schienenen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Ge
netics Supplement, Volume 21, January 1999), der dort zi
tierten Literatur und dem US-A1 5994065 über Methoden zur
Herstellung von festen Trägern für Zielmoleküle wie Oli
gonukleotide bei vermindertem nichtspezifischem Hinter
grundsignal entnehmen.
Neuere Verfahren zum Nachweis von Mutationen sind im fol
genden aufgeführt:
Als ein Spezialfall der Sequenzierung ist die Einzelba sen-Primer-Erweiterung (Genetic Bit Analysis) erwähnens wert (Head, SR., Rogers, YH., Parikh K., Lan, G., Ander son, S., Goelet, P., Boycejacino MT., Nucleic Acids Rese arch. 25(24): 5065-5071, 1997; Picoult-Newberg, L., Geno me Res. 9(2): 167-174, 1999). Eine kombinierte Amplifika tion und Sequenzierung wird in US-A1 5928906 beschrieben, wo eine basenspezifische Terminierung auf Matrixmolekülen eingesetzt wird. Ein weiteres Verfahren setzt eine Liga se/Polymerasereaktion für die Identifikation von Nukleo tiden ein (US-A1 5952174).
Als ein Spezialfall der Sequenzierung ist die Einzelba sen-Primer-Erweiterung (Genetic Bit Analysis) erwähnens wert (Head, SR., Rogers, YH., Parikh K., Lan, G., Ander son, S., Goelet, P., Boycejacino MT., Nucleic Acids Rese arch. 25(24): 5065-5071, 1997; Picoult-Newberg, L., Geno me Res. 9(2): 167-174, 1999). Eine kombinierte Amplifika tion und Sequenzierung wird in US-A1 5928906 beschrieben, wo eine basenspezifische Terminierung auf Matrixmolekülen eingesetzt wird. Ein weiteres Verfahren setzt eine Liga se/Polymerasereaktion für die Identifikation von Nukleo tiden ein (US-A1 5952174).
Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations-
Massenspektrometrie (MALDI) ist eine sehr leistungsfähige
Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Karas, M.
und Hillenkamp, F. (1988), Laser desorption ionization of
proteins with molecular masses exeeding 10000 daltons.
Anal. Chem. 60 : 2299-2301). Ein Analyt wird in eine
lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen
Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül
so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße
mit Matrixmolekülen wird die Ionisation des Analyten er
reicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in
ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen
Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt.
Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere.
Maldi eignet sich ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden
und Proteinen. Die Analyse von Nukleinsäuren ist etwas
schwieriger (Gut, I. G. und Beck, S. (1995), DNA and Ma
trix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrome
try. Molecular Biology: Current Innovations and Future
Trends 1: 147-157.) Für Nukleinsäuren ist die Empfind
lichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide und
nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab.
Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes
Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Ma
trix wesentlich ineffizienter. Für MALDI spielt die Wahl
der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorpti
on von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrices
gefunden worden, die eine sehr feine Kristallisation er
geben. Für DNA gibt es zwar mittlerweile einige anspre
chende Matrices, jedoch wurde dadurch der Empfindlich
keitsunterschied nicht verringert. Der Empfindlichkeits
unterschied kann verringert werden, indem die DNA che
misch so modifiziert wird, dass sie einem Peptid ähnli
cher wird. Phosphorothioatnukleinsäuren, bei denen die
gewöhnlichen Phosphate des Rückgrats durch Thiophosphate
substituiert sind, lassen sich durch einfache Alkylie
rungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut,
I. G. und Beck, S. (1995), A procedure for selective DNA
alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic
Acids Res. 23: 1367-1373). Die Kopplung eines "charge
tags" an diese modifizierte DNA resultiert in der Steige
rung der Empfindlichkeit um den gleichen Betrag, wie er
für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von
"charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse
gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter
Substrate stark erschweren.
Genomische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von
Zell-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen.
Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie
Fritsch und Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laborato
ry Manual, 1989.
Gemeinsamkeiten zwischen Promotoren bestehen nicht nur im
Vorkommen von TATA- oder GC-Boxen sondern auch darin, für
welche Transkriptionsfaktoren sie Bindestellen besitzen
und in welchem Abstand diese sich zueinander befinden.
Die existierenden Bindestellen für ein bestimmtes Protein
stimmen in ihrer Sequenz nicht vollständig überein, es
finden sich aber konservierte Folgen von mindestens 4 Ba
sen, die durch das Einfügen von "Wobbles", d. h. Positio
nen, an denen sich jeweils unterschiedliche Basen befin
den, noch verlängert werden können. Des weiteren liegen
diese Bindestellen in bestimmten Abständen zueinander
vor.
Die Verteilung der DNA im Interphase-Chromatin, das den
größten Teil des nuklearen Volumens einnimmt, unterliegt
jedoch einer ganz speziellen Ordnung. So ist die DNA an
mehreren Stellen an die nukleare Matrix, eine filamentöse
Struktur an der Innenseite der nuklearen Membran, ange
heftet. Diese Regionen bezeichnet man als matrix attach
ment regions (MAR) oder scaffold attachment regions
(SAR). Das Anheften hat wesentlichen Einfluß auf die
Transkription bzw. die Replikation. Diese MAR-Fragmente
weisen keine konservativen Sequenzen auf, bestehen aller
dings zu 70% aus A bzw. T und liegen in der Nähe von cis
agierenden Regionen, die die Transkription allgemein re
gulieren, und Topoisomerase II-Erkennungsstellen.
Neben Promotoren und Enhancern existieren weitere regula
torische Elemente für verschiedene Gene, sogenannte Insu
lators. Diese Insulators können z. B. die Wirkung des En
hancers auf den Promotor inhibieren, wenn sie zwischen
Enhancer und Promotor liegen, oder aber, zwischen Hetero
chromatin und einem Gen gelegen, das aktive Gen vor dem
Einfluß des Heterochromatins schützen. Beispiele für sol
che Insulators sind: 1. sogenannte LCR (locus control re
gions), welche aus mehreren gegenüber DNAase I hypersen
sitiven Stellen besteht; 2. bestimmte Sequenzen wie SCS
(specialized chromatin structures) bzw. SCS', 350 bzw.
200 bp lang und hoch-resistent gegen Degradierung durch
DNAase I und auf beiden Seiten von hypersensitiven Stel
len flankiert (Abstand je 100 bp). An scs' bindet das
Protein BEAF-32. Diese Insulators können auf beiden Sei
ten des Gens liegen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren
bereitstellen, welches sich zum gleichzeitigen Detektie
ren von Cytosin-Methylierungen und SNPs in genomischen
DNA-Proben besonders eignet. Dabei soll bevorzugt eine
Vielzahl von Fragmenten gleichzeitig untersucht werden
können.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zum
Nachweis von 5-Methylcytosin in genomischen DNA-Proben
gelöst, wobei man die folgenden Schritte ausführt:
- a) man setzt eine genomische DNA aus einer DNA-Probe mit einem Reagenz chemisch um, wobei 5-Methylcytosin und Cytosin unterschiedlich reagieren und diese somit nach der Reaktion ein unterschiedliches Basenpaarungsverhalten in der DNA Duplex zeigen;
- b) man amplifiziert die vorbehandelte DNA unter Verwen dung einer Polymerase und mindestens einem Oligonukleotid (Typ A) als Primer;
- c) man hybridisiert die amplifizierte genomische DNA an mindestens ein Oligonukleotid (Typ B) unter Ausbildung einer Duplex, wobei besagte hybridisierte Oligonukleotide des Typs B mit ihrem 3'-Ende unmittelbar oder im Abstand von bis zu 10 Basen an die Positionen angrenzen, die hin sichtlich ihrer Methylierung in der genomischen DNA-Probe zu untersuchen sind;
- d) man verlängert das Oligonukleotid (Typ B) mit bekann ter Sequenz von n Nukleotiden mittels einer Polymerase mindestens um ein Nukleotid, wobei das Nukleotid eine nachweisbare Markierung trägt und die Verlängerung vom Methylierungsstatus des jeweiligen Cytosins in der geno mischen DNA-Probe abhängt;
- e) man untersucht die verlängerten Oligonukleotide auf das Vorhandensein der Markierung.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es dabei, dass man die Oli
gonukleotide (Typ B) an definierten Stellen an eine Fest
phase bindet oder dass man die Amplifikate an definierten
Stellen an eine Festphase bindet.
Weiterhin ist dabei erfindungsgemäß bevorzugt, dass man
unterschiedliche Oligonukleotidsequenzen auf einer ebenen
Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen
Gitters anordnet. Dabei ist bevorzugt, dass die an den
verlängerten Oligonukleotiden angebrachten Markierungen
an jeder Position der Festphase, an der sich eine Oligo
nukleotidsequenz befindet, identifizierbar sind.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ferner, dass man bei der
Amplifikation mindestens einen Primer (Typ A) an eine
Festphase bindet.
Es ist ferner in bestimmten Fällen bevorzugt, dass man
unterschiedliche Amplifikate auf der Festphase in Form
eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters anordnet.
Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die
Behandlung der DNA vor der Amplifikation mit einer Bisul
fitlösung (= Disulfit, Hydrogensulfit) durchführt.
Es ist erfindungsgemäß ferner bevorzugt, dass die Ampli
fikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) er
folgt.
Außerdem ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass die ver
wendeten Oligonukleotide des Typs A entweder nur die Ba
sen T, A und C oder aber die Basen T, A und G enthalten
und/oder dass die verwendeten Oligonukleotide des Typs B
entweder nur die Basen T, A und C oder aber die Basen T,
A und G enthalten.
Es ist ferner erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Markie
rungen der Nukleotide Fluoreszenzmarkierungen sind.
Dabei ist es besonders bevorzugt, dass die Markierungen
der Nukleotide Radionuklide sind.
Erfindungsgemäß ist es auch bevorzugt, dass die Markie
rungen der Nukleotide ablösbare Massenmarkierungen sind,
die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden.
Es ist weiterhin erfindungsgemäß bevorzugt, dass die ver
längerten Oligonukleotide insgesamt im Massenspektrometer
nachgewiesen werden und somit durch ihre Masse eindeutig
markiert sind.
Bevorzugt ist es auch, dass jeweils ein Fragment der ver
längerten Oligonukleotide im Massenspektrometer nachge
wiesen wird.
Insbesondere bevorzugt ist es erfindungsgemäß, dass man
das Fragment des verlängerten Oligonukleotids durch Ver
dau mit einer oder mehrerer Exo- oder Endonukleasen er
zeugt.
Außerdem ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass zur bes
seren Detektierbarkeit im Massenspektrometer die erzeug
ten Fragmente eine einzelne positive oder negative Netto
ladung aufweisen.
Besonders bevorzugt ist es, dass man die Detektion der
verlängerten Oligonukleotide mittels Matrix assistierter
Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI)
oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI)
durchführt und visualisiert.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch bevorzugt, wenn
die Polymerasen hitzebeständige DNA-Polymerasen sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist ebenfalls bevorzugt,
wenn man zusätzlich zur DNA-Methylierung auch SNPs detek
tiert und visualisiert.
Entsprechend bevorzugt ist das Verfahren auch, wobei die
eingesetzten Nukleotide terminierende (Typ C 2) und/oder
kettenverlängernde Nukleotide (Typ C 1) sind.
Bevorzugt ist auch ein erfindungsgemäße Verfahren, wobei
man das kettenterminierende Nukleotid (Typ C 2) aus einer
Gruppe auswählt, die entweder die Basen T und C oder aber
die Basen G und A umfasst und/oder wobei man die ketten
verlängernden Nukleotide (Typ C 1) aus einer Gruppe aus
wählt, die entweder die Nukleobasen A, T und C oder aber
die Basen G und A und T umfasst.
Es ist ferner erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die
Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten in einem Reak
tionsgefäß durchführt.
Außerdem ist es bevorzugt, dass das fluoreszenzmarkierte
dCTP-Derivat Cy3-dCTP oder Cy5-dCTP ist.
Besonders bevorzugt ist es, dass die Festphasenoberfläche
aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen,
Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht.
Weiterhin ist ein Verfahren bevorzugt, wobei man die ge
nomische DNA aus einer DNA-Probe erhält, wobei Quellen
für DNA z. B. Zelllinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Ge
hirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin einbettetes Ge
webe, histologische Objektträger und alle möglichen Kom
binationen hiervon umfaßt.
Ganz besonders bevorzugt ist schließlich ein Verfahren
bei dem man Methylierungsanalysen des oberen und unteren
DNA-Stranges gleichzeitig durchführt.
Beschrieben wird ein Verfahren zum Nachweis von Me
thylcytosin in genomischen DNA-Proben:
Die Methode beinhaltet die Amplifikation, Hybridisierung und Verlängerungsreaktion einer gesamten DNA oder eines Fragments hiervon. Die Methode kann benutzt werden zum Nachweis von Methylcytosin und auch gleichzeitig von Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) und Mutationen.
Die Methode beinhaltet die Amplifikation, Hybridisierung und Verlängerungsreaktion einer gesamten DNA oder eines Fragments hiervon. Die Methode kann benutzt werden zum Nachweis von Methylcytosin und auch gleichzeitig von Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) und Mutationen.
Die zu analysierende genomische DNA wird bevorzugt aus
üblichen Quellen für DNA erhalten, wie z. B. Zelllinien,
Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-
Flüssigkeit, in Paraffin einbettetes Gewebe, histologi
sche Objektträger und alle möglichen Kombinationen hier
von.
Im ersten Schritt des Verfahrens wird die eingesetzte DNA
bevorzugt mit Bisulfit, (= Disulfit, Hydrogensulfit) oder
aber einer anderen Chemikalie derart behandelt, dass alle
nicht an der 5-Position der Base methylierten Cytosinba
sen so verändert werden, dass eine hinsichtlich dem Ba
senpaarungsverhalten unterschiedliche Base entsteht, wäh
rend die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert
bleiben. Wird Bisulfit verwendet, so findet an den nicht
methylierten Cytosinbasen eine Addition statt. Die an
schließende alkalische Hydrolyse führt dann zur Umwand
lung von nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in
Uracil. Die eingestzte genomische DNA wird bevorzugt vor
der chemischen Behandlung mit einer Restriktionsendonu
klease fragmentiert.
Im zweiten Schritt des Verfahrens wird die vorbehandelte
DNA bevorzugt unter Verwendung einer hitzebeständigen Po
lymerase und mindestens einem Primer (Typ A) amplifi
ziert. Dieser Primer kann bevorzugt 10-40 Basenpaare ent
halten.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens
wird die Amplifikation mit Primern des Typs A mittels der
Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens wird die
Amplifikation von mehreren DNA-Fragmenten in einem Reak
tionsgefäß durchgeführt. Dies kann entweder eine soge
nannte Multiplex PCR sein, in der verschiedene Primer je
weils definierte Fragmente erzeugen. Es werden verschie
dene definierte Amplifikationen in einem Reaktionsgefäß
durchgeführt. In einer weiteren, besonders bevorzugten
Variante des Verfahrens amplifizieren Primer gezielt und
reproduzierbar jeweils mehrere Fragmente. Dies kann ent
weder dadurch erzielt werden, dass sie beispielsweise an
repetitive Elemente im Genom binden. In einer besonders
bevorzugten Variante des Verfahrens binden die Primer an
Transcription Factor Binding Sites, an Promotoren oder
andere regulatorische Elemente in Genen. In einer beson
ders bevorzugten Variante des Verfahrens findet die
Amplifikation durch Verlängerung von Primers statt, die
an eine Festphase gebunden sind. Eine Multiplex-PCR im
weiteren Sinne kann dadurch ausgeführt werden, dass un
terschiedliche Primer an verschiedenen, definierten Orten
einer Festphase gebunden sind.
In einer wiederum bevorzugten Variante des zweiten Ver
fahrensschrittes ist die Festphase eben, wobei die unter
schiedlichen Oligonukleotidsequenzen in Form eines recht
winkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind. Das
hat zur Folge, dass auch die unterschiedlichen Amplifika
te auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder
hexagonalen Gitters angeordnet sind. Wie bereits oben be
schrieben, werden in diesem Fall mehrere Amplifikate di
rekt auf der Festphase erzeugt.
Die Festphasenoberfläche besteht bevorzugt aus Silizium,
Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nic
kel, Silber oder Gold.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens
enthalten die Oligonukleotide des Typs A entweder nur die
Basen T, A und C oder nur die Basen T, A und G.
Im dritten Verfahrensschritt wird die amplifizierte geno
mische DNA an mindestens einen Primer (Typ B) unter Aus
bildung einer Duplex hybridisiert. Das Oligonukleotid Typ
B enthält bevorzugt 10-35 Basenpaare. Die hybridisierten
Oligonukleotide des Typs B grenzen mit ihrem 3'-Ende un
mittelbar oder im Abstand von bis zu 10 Basen an die Po
sitionen an, die hinsichtlich ihrer Methylierung in der
genomischen DNA-Probe zu untersuchen sind.
Die an die Amplifikate hybridisierten Oligonukleotide
können mit ihrem 5'-Ende oder an einer anderen Base oder
über ihr Rückgrat mit einer Festphase verbunden sein,
nicht aber über ihr 3'-Ende. Bevorzugt erfolgt eine Bin
dung über das 5'-Ende. In einer bevorzugten Variante ist
die Festphase eben, wobei die unterschiedlichen Oligonu
kleotidsequenzen (Typ B) in Form eines rechtwinkligen
oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.
Die Festphasenoberfläche besteht bevorzugt aus Silizium,
Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nic
kel, Silber oder Gold.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens
enthalten die Oligonukleotide des Typs B entweder nur die
Basen T, A und C oder nur die Basen T, A und G.
Im vierten Verfahrensschritt wird das entstandene Oligo
nukleotid mit einer hitzebeständigen Polymerase um minde
stens ein bis maximal zehn Nukleotide verlängert, wobei
zumindest ein Nukleotid eine nachweisbare Markierung
trägt. Die Art der Verlängerung hängt dabei vom Methylie
rungsstatus des jeweiligen Cytosins in der genomischen
DNA-Probe ab, oder aber von eventuell vorhandenen SNPs,
Punktmutationen oder Deletionen, Insertionen und Inver
sionen.
Bei unmittelbarem Angrenzen des Oligonukleotids des Typs
B an die zu untersuchende Position sind nur terminierende
Oligonuleotide (Typ C2) erforderlich. Je nach Sequenz
können jedoch auch kettenverlängernde Oligonukleotide
verwendet werden, sofern es im jeweiligen Sequenzkontext
möglich ist.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens sind die
eingesetzten Nukleotide terminierende (Typ C2) und/oder
kettenverlängernde Nukleotide (Typ C1). Dabei ist das
terminierende Nukleotid (Typ C2) ein 2',3'-Didesoxy
nukleotid und das kettenverlängernde Nukleotid ein 2'-
Desoxynukleotid. In einer besonders bevorzugten Variante
des Verfahrens werden die Nukleobasen des Typs C1 aus ei
ner Gruppe ausgewählt, die die Basen T, A und C oder aber
die Basen T, A und G enthält. In einer weiteren, beson
ders bevorzugten Variante des Verfahrens werden die Nu
kleobasen des Typs C2 aus einer Gruppe ausgewählt, die
entweder die Basen T und C oder aber die Basen G und A
enthält.
Die Markierung der verlängerten Oligonukleotide des Typs
B erfolgt bevorzugt über absorbierende Farbstoffe
und/oder über Chemilumineszenz und/oder über radioaktive
Isotope und/oder über Fluoreszenzmarkierungen, die über
die im vierten Verfahrensschritt angefügten Nukleotide
eingeführt werden. Bevorzugt ist ebenfalls die Markierung
über die Molekülmasse des verlängerten Oligonukleotids.
Vorzugsweise wird der Fluoreszenzmarker durch ein fluo
reszenzmarkiertes Nukleotid wie z. B. Cy5-dCTP einge
führt.
Im fünften Verfahrensschritt werden die verlängerten Oli
gonukleotide auf das Vorhandensein einer Markierung un
tersucht. Wird eine ebene Festphase verwendet, so erfolgt
eine Analyse an jedem Ort auf der Festphase, an dem ur
sprünglich ein Oligonukleotid immobilisiert wurde.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens
erfolgt der Nachweis der verlängerten Oligonukleotide
über ihre Fluoreszenz. Dabei haben bevorzugt unterschied
liche Verlängerungsprodukte unterschiedliche Fluoreszenz
eigenschaften, was beispielsweise durch mit unterschied
lichen Farbstoffen markierte eingebaute Nukleotide er
zielt werden kann.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens werden Frag
mente des verlängerten Oligonukleotids durch Verdau mit
einer oder mehrerer Exo- oder Endonukleasen erzeugt.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens
sind die Markierungen der Nukleotide ablösbare Massenmar
kierungen, die in einem Massenspektrometer nachweisbar
sind.
Ablösbare Massenmarkierungen, die verlängerten Oligonu
kleotide insgesamt oder Fragmente hiervon werden in einer
besonders bevorzugten Variante des Verfahrens mittels Ma
trix-assistierter Laser-Desorptions/Ionisations-
Massenspektrometrie (MALDI-MS) oder mittels Elektronen
spray-Massenspektrometrie (ESI) anhand ihrer eindeutigen
Masse nachgewiesen und visualisiert.
Vorzugsweise weisen die im Massenspektrometer detektier
ten Fragmente eine einzelne positive oder negative Netto
ladung auf.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens
werden SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) und Cyto
sin-Methylierungen in einem Experiment analysiert.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens
werden der untere und der obere Strang der DNA-Probe nach
der chemischen Vorbehandlung in einem Experiment analy
siert, um eine interne experimentelle Kontrolle sicherzu
stellen.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Kit, das Chemi
kalien und Hilfsmittel zur Durchführung der Bisulfit-
Reaktion und/oder der Amplifikation, der Hybridisierung,
der Verlängerungsreaktion und/oder Polymerasen und/oder
die Dokumentation zur Durchführung des Verfahrens ent
hält.
Als Sequenzbeispiel ist ein Fragment von Exon 23 des Fak
tor VIII-Gens angegeben.
Im ersten Schritt wird das Fragment durch Primer des Typs
A amplifiziert und zwar durch
ATTATGTTGGAGTAGTAGAGTTTAAATGGTT und
ACTTAACACTTACTATTTAAATCACAACCCAT. Die amplifizierte DNA
wird an ein Oligonukleotid des Typs B (beispielsweise
ATGTTGGATGTTGTTGAG) hybridisiert. Anschliessend wird die
Verlängerungsreaktion mit 2',3'-Didesoxycytidintriphos
phat (ddCTP, als Typ C1), 2',3'-Didesoxythymidintriphos
phat (ddTTP, als Typ C1) und 2'-Desoxyadenosintriphosphat
(dATP, als Typ C2) durchgeführt. Es entsteht, wenn ein
methyliertes Cytosin vorlag, das Verlängerungsprodukt
ATGTTGGATGTTGTTGAGAAAC, während bei Vorliegen eines nicht
methylierten Cytosins in der zu untersuchenden Sequenz
das Verlängerungsprodukt ATGTTGGATGTTGTTGAGAAAT entsteht.
Somit entstehen unterschiedliche Verlängerungen, die vom
Methylierungsstatus des jeweiligen Cytosins abhängen.
Die terminierenden Triphosphate des Typs C2 können bei
spielsweise mit zwei unterschiedlichen Farbstoffen gela
belt sein. Dies macht die Verlängeurngsprodukte unter
scheidbar. Diese unterschiedlichen Label können bei
spielsweise absorbierende Farbstoffe wie Megaprime™ für
ddTTP oder Rediprime II™ für ddCTP sein.
Claims (29)
1. Verfahren zum Nachweis von 5-Methylcytosin in genomi
schen DNA-Proben, dadurch gekennzeichnet, dass man
die folgenden Schritte ausführt:
- a) man setzt eine genomische DNA aus einer DNA-Probe mit einem Reagenz chemisch um, wobei 5-Methylcytosin und Cytosin unterschiedlich reagieren und diese somit nach der Reaktion ein unterschiedliches Basenpaa rungsverhalten in der DNA Duplex zeigen;
- b) man amplifiziert die vorbehandelte DNA unter Ver wendung einer Polymerase und mindestens einem Oligo nukleotid (Typ A) als Primer;
- c) man hybridisiert die amplifizierte genomische DNA an mindestens ein Oligonukleotid (Typ B) unter Aus bildung einer Duplex, wobei besagte hybridisierte Oligonukleotide des Typs B mit ihrem 3'-Ende unmit telbar oder im Abstand von bis zu 10 Basen an die Po sitionen angrenzen, die hinsichtlich ihrer Methylie rung in der genomischen DNA-Probe zu untersuchen sind;
- d) man verlängert das Oligonukleotid (Typ B) mit be kannter Sequenz von n Nukleotiden mittels einer Poly merase mindestens um ein Nukleotid, wobei das Nukleo tid eine nachweisbare Markierung trägt und die Ver längerung vom Methylierungsstatus des jeweiligen Cytosins in der genomischen DNA-Probe abhängt;
- e) man untersucht die verlängerten Oligonukleotide auf das Vorhandensein der Markierung.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass man die Oligonukleotide (Typ B) an definierten
Stellen an eine Festphase bindet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass man die Amplifikate an definierten Stellen an
eine Festphase bindet.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
dass man unterschiedliche Oligonukleotidsequenzen auf
einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen
oder hexagonalen Gitters anordnet.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
dass die an den verlängerten Oligonukleotiden ange
brachten Markierungen an jeder Position der Festpha
se, an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet,
identifizierbar sind.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass man bei der Amplifikation mindestens einen Pri
mer (Typ A) an eine Festphase bindet.
7. Verfahren nach Anspruch 1, 3 oder 6, dadurch gekenn
zeichnet, dass man unterschiedliche Amplifikate auf
der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder
hexagonalen Gitters anordnet.
8. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass man die Behandlung der
DNA vor der Amplifikation mit einer Bisulfitlösung
(= Disulfit, Hydrogensulfit) durchführt.
9. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mit
tels der Polymerasekettenreaktion (PCR) erfolgt.
10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, da
durch gekennzeichnet, dass die verwendeten Oligonu
kleotide des Typs A entweder nur die Basen T, A und C
oder aber die Basen T, A und G enthalten.
11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, da
durch gekennzeichnet, dass die verwendeten Oligonu
kleotide des Typs B entweder nur die Basen T, A und C
oder aber die Basen T, A und G enthalten.
12. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen der Nu
kleotide Fluoreszenzmarkierungen sind.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch
gekennzeichnet, dass die Markierungen der Nukleotide
Radionuklide sind.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch
gekennzeichnet, dass die Markierungen der Nukleotide
ablösbare Massenmarkierungen sind, die in einem Mas
senspektrometer nachgewiesen werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch
gekennzeichnet, dass die verlängerten Oligonukleotide
insgesamt im Massenspektrometer nachgewiesen werden
und somit durch ihre Masse eindeutig markiert sind.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch
gekennzeichnet, dass jeweils ein Fragment der verlän
gerten Oligonukleotide im Massenspektrometer nachge
wiesen wird.
17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet,
dass man das Fragment des verlängerten Oligonukleo
tids durch Verdau mit einer oder mehrerer Exo- oder
Endonukleasen erzeugt.
18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet,
dass zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektro
meter die erzeugten Fragmente eine einzelne positive
oder negative Nettoladung aufweisen.
19. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass man die Detektion der
verlängerten Oligonukleotide mittels Matrix assi
stierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektro
metrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspek
trometrie (ESI) durchführt und visualisiert.
20. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche,
wobei die Polymerasen hitzebeständige DNA-Polymerasen
sind.
21. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche,
wobei man zusätzlich zur DNA-Methylierung auch SNPs
detektiert und visualisiert.
22. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche,
wobei die eingesetzten Nukleotide terminierende (Typ
C 2) und/oder kettenverlängernde Nukleotide (Typ C 1)
sind.
23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei man das kettenter
minierende Nukleotid (Typ C 2) aus einer Gruppe aus
wählt, die entweder die Basen T und C oder aber die
Basen G und A umfasst.
24. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, wobei man die
kettenverlängernden Nukleotide (Typ C 1) aus einer
Gruppe auswählt, die entweder die Nukleobasen A, T
und C oder aber die Basen G und A und T umfasst.
25. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, da
durch gekennzeichnet, dass man die Amplifikation von
mehreren DNA-Abschnitten in einem Reaktionsgefäß
durchführt.
26. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet,
dass das fluoreszenzmarkierte dCTP-Derivat Cy3-dCTP
oder Cy5-dCTP ist.
27. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekenn
zeichnet, dass die Festphasenoberfläche aus Silizium,
Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer,
Nickel, Silber oder Gold besteht.
28. Verfahren nach Anspruch 1, wobei man die genomische
DNA aus einer DNA-Probe erhält, wobei Quellen für DNA
z. B. Zelllinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-
Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin einbettetes Ge
webe, histologische Objektträger und alle möglichen
Kombinationen hiervon umfaßt.
29. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dass man Methylierungsanalysen des oberen und unteren
DNA-Stranges gleichzeitig durchführt.
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