CN86106915A - 对抑制素α或β链编码的核酸以及用此核酸合成多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
分离出了编码早前抑制素α和β链的DNA。此DNA被连接到表达载体并被用于转化宿主细胞以制备抑制素或活性素，还提供了原激素(激素无活性前体)结构或和其它具有治疗或诊断意义的抑制素α和β链衍生物。本文所提供的组成在动物的生殖力的控制方面是有用的。
Description
这是在1986年2月7日申请的美国申请号为827，710的一个连续申请，而那个申请又是在1985年10月3日申请的美国申请号为783，910的连续申请。
本发明涉及从含有抑制素的α或β链的重组细胞培养物中制备蛋白质的方法。具体地说是涉及获得和运用为抑制素编码的DNA的方法以及制备天然动物和人类的抑制素类的氨基酸序列及其自然出现的等位基因不一致的抑制素变异体的方法。
抑制素是在生殖腺中产生的一种蛋白质，它在垂体级起特殊作用，以抑制促卵（滤）泡激素（FSH）的分泌。在1932年（“科学（Science）”76：19-20）中迈克拉夫（Mc Cullagh）第一次假设抑制素的存在。这种促性腺激素分泌的择优调节产生了很大的意义，并且在过去的五十年中促使许多实验的兴起，而试图用各种生物检定从睾丸，精子、睾丸网液体、精液浆和卵巢滤泡液的抽提物中分离出的这物质并确定其特性。尽管文献中已出现许多报道声称纯化了分子量在5，000至100，000道尔顿之间的抑制素类似物，但后来的研究表明这些物质不是抑制素的类似物，不具有人们期望的真正抑素的高效的活性和/或不能显示出如这儿所描述的抑制素的分子性质[德琼，抑制素因素人造物，“分子和细胞内分泌”13：1-10（1979）;谢斯等人，1984，“F.E.B.S.”165（1）11-15;茜德赫等人，1984年，“F.E.B.S.”175（2）：349-355;里尔加等人，1985年3月，“F.E.B.S.”182（1）：181-184;李等人，1985年6月，“美国自然科学院学报”82：4041-4044;茜德赫等人，“F.E.B.S.”167：（1）98-102;以及贝克瑟克等人，1984，“男性生殖器病学国际杂志”7：389-397（de Jong，Inhibin Factor Artifact，“Molecular & Cellular Endocrin.”13：1-10（1979）;Sheth el al.，1984，“F.E.B.S.”165（1）11-15;Seidah et al.，1984，“F.E.B.S.”175（2）：349-355;Lilja et al.，Match 1985，“F.E.B.S.”182（1）：181-184;Li et al.，June 1985，“Proc.Nat.Acad.Sci.USA”82：4041-4044;Seidah et al.，“F.E.B.S.”167（1）98-102;and Beksac et al.，1984，“Intern.J.Andrology”7：389-397）].
一种具有抑制素活性的多肽从牛的或羊的滤泡液中纯化而得[血浆试验（PCT）86/00078，1986年1月3日出版]。据报道，此蛋白质在SDS-PAGE上具有分量56，000±1，000，并且它可被分离成具有表观分子量44，000±3，000和14，000±2，000的两个亚单元。并且对每一个亚单元的氨基末端序列作了描述。
成功地从猪的滤泡液中分离出两种均具有分子量约32，000道尔顿和抑制素活性的蛋白质。猪抑制素的纯化基本上达到同质性的程度，即通过包括肝素-琼脂糖亲和色谱法、凝胶过滤和反相高效液相色谱法（RP-HPLC）的一系列蛋白质分离过程使级分达到蛋白质总重量的90%左右。
从来自猪的材料分离这些蛋白质至基本上同质的程度，并称之为蛋白质A和蛋白质B。每一种蛋白质具有分子量约32，000道尔顿（32 K），且由具有分子量18，000和14，000道尔顿的两种多肽链组成，径二硫化物键合，此两多肽链在激素-活性的蛋白质中连接在一起。两种蛋白质的18，000道尔顿（18 K）氨基末端氨基酸残基序列或α链被确定为Ser-Thr-Ala-Pro-Leu-Pro-Trp-Pro-Trp-Ser-Pro-Ala-Ala-Leu-Arg-Leu-Leu-Gln-Arg-Pro-Pro-Glu-Glu-Pro-Ala-Val.蛋白质A的14，000道尔顿（14 K）的氨基末端氨基酸残基序列或β链被确定为Gly-Leu-Glu-X-Asp-Gly-Lys-Val-Asn-Ile-X-X-Lys-Lys-Gln-Phe-Phe-Val-Ser-Phe-Lys-Asp-Ile-Gly-Trp-Asn-Asp-Trp-Ile-Ile-Ala，并且蛋白质B的14，000道尔顿（14 K）的氨基末端氨基酸残基序列或β链被确定为Gly-Leu-Glu-X-Asp-Gly-Arg-Thr-Asn-Leu-X-X-Arg-Gln-Gln-Phe-Phe-Ile-Asp-Phe-Arg-Leu.蛋白质A和B已被完全特性化（特性已完全确定）。每一种32K蛋白质显示抑制素活性，因为它专一性地抑制FSH基本的分泌但不抑制促黄体生成激素（LH）的分泌。两链不是激素-活性的。
在对此提出专利申请之后，发现抑制素B-链二聚物作为自然出现的物质存在于滤泡液之中，称为活性素，它可以刺激老鼠的前部垂体细胞释放FSH[凡尔等人，1986，“自然”321：776-779和林等人，1986，“自然”321：779-782（Vale et al.，1986，“Nature”321：776-779 and Ling et al.，1986，“Nature”321：779-782）]。
在本文的发明之前，来自人类的抑制素的α和β链的氨基酸序列仍是未知的。和动物抑制素同步地进行研究所需的大量人类滤泡液难以得到，也不能保证人类和动物的抑制素相似得可以用一种平行的程序有效地使两者得到。因此，需要确定人类抑制素的性质和氨基酸序列的方法。
大量制备抑制素的α和β链的经济的方法也是必需的，特别是要彻底和完全没有与此抑制素来自同种异体的蛋白质。此抑制素最好也是生物活性的。
这些和其他目的从本发明整体上来看将显得更为清楚。
现在，核酸已被分离出来并在可复制的载体中进行无性繁殖，它为成熟的猪和人类的抑制素的α和β链以及它们的前体前型和早前型进行编码。抑制素编码c DNA的排列顺序的研究导致成熟的抑制素链的前结构域所在的N-末端的发现，它们相当协调地表达生物活性多肽，当在对监测转化细胞培养物中的早期抑制素的处理或动物调节临床条件或生殖生理学的实验中，前结构域或前结构域免疫原是很有用的。因此，α或β链的核酸被用于从抑制素链的前体型制备前结构域序列，用于为成熟的抑制素α和/或β链的重组表达而转化宿主细胞，以及用于诊断化验中。特别是，在重组细胞培养物中表达抑制素α和/β链区域的方法，此方法包括在一种启动子控制下连接编码此区域的核酸至一种可复制的载体上，通过此载体转化一宿主细胞，培养此宿主细胞并从所培养的细胞中回收前结构域、活性素或抑制素。通过本发明的方法产生的抑制素、活性素和前结构域是完全没有同种异体蛋白质的，并且可以以生物活性形式制备。
本文所发现的核酸为猪的或人类的抑制素的α、βA和βB链编码。重组细胞被转化以表达αβA或αβB抑制素，或表达β-链的杂二聚体或同型二聚体（它们在文献中总称为活性素）。作为重组细胞表示产物的β-链的二聚体没有同种异体的蛋白质，而这种同种异质体通常总是和上述二聚体联系在一起的。
抑制素或活性素和它们的无毒盐与一种药物学上可接受的载体混合以形成一种药物组分后给哺乳动物（包括人类）施用以控制生育能力。施用抑制素能减弱雌性哺乳动物的生殖能力以及减弱雄性哺乳动物的精子生成，而足量施用能导致不育。抑制素对诊断不育力化验也是有用的。文献表明活性素能刺激垂体细胞释放FSH，因此作为生殖力诱发治疗是有用的。
本发明的方法也有利于抑制素、活性素和前结构域变异体的制备，它们具有初级氨基酸序列和/或不同于天然类似物的糖基化作用，尤其是致免疫的肽和抑制素、活性素或前结构域序列的并合物。
图1 A是猪的α-链m RNA。用于序列确定中的重叠c DNA克隆写在m RNA结构图的上方。在λ克隆的3′未端上的黑框（黑盒）表明通过特定的引发（激活）可得到这些克隆。未经转译的序列用一条线表示，密码序列上加框。空的部分表示信号肽和前序列的密码区域。且画有斜阴影线区域表示134氨基酸的α-链。标度是在核苷酸中从最长c DNA克隆的5′未端开始的。
图1 B表示核苷酸和所预期的猪的抑制素α-链的前体的氨基酸序列。核苷酸在左边编号而氨基酸则整个图都编号。在下边加横线的氨基酸序列被用于设计一个长的合成DNA探查物。364氨基酸前体包括一个疏水性的信号序列、一个前区域以及成熟的α-链（氨基酸231-364）。蛋白质水解的处理位点Arg-Arg（黑色粗线条）在成熟的α链的NH2-末端的前面。几个其它公认的存在于前区的二碱基处理位点由空的线条表示。一个可能的N-键合的糖基化位点由画有交叉阴影线的线条表示。在接近于m RNA的3′终端的AATAA单元下加有横线。
图2 A是具有猪的βA和βB的亚单元m RNAS，其密码序列加有方框。βA和βB亚单元（划斜线的）被编码至密码序列的3′末端。3′和5′未经转译的区的长度从m RNA（图3）的大小和其与βAm RNA的显而易见的相似性推断出来。c DNAS的试验性部位在图中用划线表示。图中示出了重叠低-dT激励（引发）的c DNA克隆和任意激励（引发）的克隆（λPINβA5S，λPINβB1S和λPINβB2S）的相对位置标度。在核苷酸中是从4.5KbmRNA的5′末端开始的。
图2 β为猪的抑制素β-亚单元前体的核苷酸序列和推想的氨基酸序列。βB序列与βA序列对准以取得最大的一致性。β-亚单元前体的NH2-末端由括号和箭头表示。半胱氨酸残余物上画有阴影线，可能处理的位点用中空的线条表示，一个可能的糖基化位置用画有交叉阴影线的方框表示。两个序列中，GC-丰富区域3′至终止密码子基因内区序列上下都划有横线。在用于设计低核苷酸探查物的氨基酸序列下画有横线，AATAAA聚腺苷酸信号也一样。在λPIN-βA8和覆盖此区域的其它克隆之间相差一个核苷酸。一个G-A的变化使氨基酸278从一个甘氨酸变为一个丝氨酸。蛋白质水解的加工（处理）位置Arg Arg Arg Arg Arg（黑色粗线条）紧挨在成熟的βA亚单元的NH2末端的前面，前序列则位于前方。只对βA亚单元的氨基酸编了号。
图3是用α、βA和βB亚单元c DNA杂交探头对猪卵巢的m RNA的诺申斑点（Northern blot）分析。a、b、c、d和f行为聚A+m RNA，e和g行为总的RNA。图中示出了28S和18S核糖核蛋白体RNA的位置。a、d和e行与一个α-亚单元c DNA探查物杂交，d、e和g行与一个亚单元专门探头杂交，c行则与一个βB亚单元探头杂交。α-亚单元m RNA约为1.5Kb，βA亚单元m RNA，约为4.5Kb。在a、b和c行中所示的杂交，由具有大致相同的长度和专门的活性探头形成以检验m RNA的相对含量。
图4A是人类β-TGF氨基酸序列和猪的抑制素βA和βB氨基酸序列的比较。将序列在半胱氨酸残余物的附近对准。相同的残余物加上框，同时守恒（保守）的置换处标有星号。
图4B是α-亚单元序列与βA-抑制素序列的比较图。
图5是猪的抑制素的一个代表性的重组表达质粒的结构。
图6表示人类的α-抑制素c DNA的核苷酸序列和推断的氨基酸序列。从假设的信号切开位点给335氨基酸前部的或抑制素的序列编号。信号序列的十六个氨基酸编号从-1到-16。由于它与猪的序列是同类物，因此预计在信号序列中还有12个氨基酸残余物（残基）。在这个和其它图中，公认的二碱基加工位置由中空的线条表示，糖基化位置由画有交叉阴影线的线条表示，且氨基末端成熟的链的加工位置被画成黑色线条。在取（A）附加信号序列下划有横线。半胱氨酸残余物上画有阴影。
图7为人类的和猪的α-抑制素蛋白质序列的比较。其中采用了空白间隔以获得最大的类似性，彼此不同处（不同的位置）用星号表示。序列编号和猪的序列一样，猪比人类短一个氨基酸。
图8表明人类的βA抑制素信号序列（残基-28至-1）的核苷酸和推想的氨基酸序列具有28个氨基酸，前体的长度是378个氨基酸。碱的加工位置由一个黑色线条表示，在前体中一个可能的糖基化位置由一条在序列上面画有交叉阴影线的线条表示。半胱氨酸残余物上画有阴影。
图9描述人类的βB抑制素c DNA的核苷酸和假设的氨基酸序列。序列在一个半胱氨酸残基（位置7）处开始，在βA序列（参见图8）中，它与存在于残基7的半胱氨酸对齐。成熟的βB抑制素的加工位点由一个黑色线条表示，而一个可能的糖基化位点由一个画有交叉阴影线的线条表示。半胱氨酸残基上画有阴影。
本发明的多肽是抑制素的α和β链，以及它们的多体型（活性素和抑制素）、早前型和前结构域，并连同每个链或其型的糖基化和/或氨基酸顺序变异体。人和动物的抑制素（包括等位基因）抑制垂体前叶细胞对卵泡刺激素（而不是对黄体生成素）的基底释放;而活性素的作用与之相反（以下称为“激素活性（的）”活性素或抑制素）。
通常，氨基酸顺序变异体与图1B、2B、6、8和9所示的猪或人体α或β链顺序的相应部分大体上相似。大体上相似系指候补多肽的初级氨基酸顺序进行排列，以使两种蛋白质（另一种为人和猪的相应蛋白质）的氨基酸残基匹配数达到最大值时，所述多肽中大约70%以上的初级氨基酸顺序与猪或人相应的链顺序符合。使残基匹配达到最大值的排列包括移动氨基和/或羧基末端，按需要引入间隙，和/或删除作为嵌入物存在于候补者中的残基。例如可参见图2B和7，图中βA和βB次级单位或人和猪的α-抑制素顺序进行排列，以得到最大的相似。一般，大约90%以上的氨基酸顺序变异体与图1B、2B、6、8和9中所示的天然顺序相符。
非激素-活性的变异体属于本发明的范围，并包括可能（或可能不）与成熟的抑制素链或前结构域程序大致相似的多肽，而且所述的多肽是：1）能与所生成的对付天然对应物的抗体起免疫交叉反应;或2）能与这种天然对应物多肽竞争细胞表面受体结合。激素非活性的变异体由断片，特别是抑制素中隔离的α或β链的重组体或有机合成制备而产生;或者也可通过引入氨基酸顺序变异，以使分子不再显示上述激素活性的方法形成。
免疫或受体交叉反应性系指候补多肽能够竞争性地抑制激素-活性结构类似物与为对付激素活性结构类似物而形成的多细胞系抗血清之结合。这类抗血清通常按下述方法制备：将含有激素-活性的结构类似物或含有衍生物的弗氏完全佐剂注入山羊或免子皮下，然后再用加强剂量的弗氏不完全制剂进行腹膜内或皮下注射。
能与对付激素活性抑制素、活性素或前结构域的抗血清进行交叉反应的非激素活性的变异体有下述用途：（a）作为诊断鉴别天然结构类似物或其抗体用的试剂;（b）当按照已知方法不溶解时，则作为从抗血清中提纯抗-天然结构类似物抗体用的试剂;（c）作为一种抗原，用以形成对付激素-活性结构类似物的抗体。
本发明包括抑制素α或β链前体的前和或早前顺序，或者它们的免疫或生物活性断片，基本上没有相应的成熟抑制素链。有关猪和人体抑制素的这类顺序示于图1B、2B、6、8和9。猪的α次级单元前体的早前顺序是由残基1至大约230所包括的多肽，而βA次级单元的前顺序由残基1至大约308所包括。此处，这些顺序称为包围前结构域顺序。
α和β次级单元前结构域顺序是由几个被蛋白分解点束缚的结构域组成，其中任何一个或被单独合成，或与其他结构域一起合成。主要的猪βA结构域在下列残基范围内：1至大约70之间（结构域Ⅰ），约为70至110之间（结构域Ⅱ），约为110至180之间（结构域Ⅲ），约为180至260之间（结构域Ⅳ），以及约为270至390之间（结构域Ⅴ）。具体来说，猪的βA结构域为：
GHSAAPDCPSCALATLPKDVPNSQPEMVEAV，
HILNMLHLKKRPDVTQPVPKAALLNAI，LHVGKVGENGYVELEDDIG，
AEMNELMEQTSEIITFAEAGRARKTLRFEISKEGSDLSVVERAEIWLFKVPKANRTRTKVSIRLFQQQ，PQGSADAGEEAEDVGFPEEKSEVLISEKVVDA，
STWHIFFVSSSIQRLLDQGKSALDIRTACEQCHETGASLVLLG，
GHSAAPDCPSCALATLPKDVPNSQPEMVEAVKKHILNMLHLKKRPDVTQPVPKAALLNAI.
猪βB结构域包括 RAAHILLHAVRVSGWLNL，以及具有同样顺序的β结构域。猪的α结构域包括：
GPELDRELVLAKVRALFLDALGPPAVTGEGGDPGVGSEPEEEDVSQAILFPATGARCGAEPAAGELAREAEEGLFTYVGRPSQHTHSRQVTSAQLWFHTGLDRQGMAAANSSGPLLDLLALSSRGPVAVPMSLGQAPPRWAVLHLAASALPLLTHPVLVLLLRCPLCSCSARPEATPFLVAHTRARPPSGGERA.
一个典型的组合结构域多肽是βA结构域Ⅱ，后者的C-末端与βA结构域Ⅲ的NH2-末端相联。此外，这些结构域被图1B或2B所示顺序中的蛋白水解点，或被1至4个抗水解的残基多肽并合在一起，或者被直接并合，籍此，在上述三种情况下均产生了组合结构域多肽。
主要的人体α链前结构域大致是残基30-199和1-29，人体βA前结构域大致是残基1-30，32-40，43-59，62-80，83-185和186-230，而人体βB前结构域大致是残基1-13，15-30，32-59，62-145，148-195和198-241（分别参照图6、8和9中的编号系统）。组合前结构域多肽就在此范围内，例如，βA前结构域大约是43-80;而βB前结构域大约是1-30，32-145。较佳的人体α、βA和βB链前结构域分别约为残基1-29，43-80和1-30。
完整的离体早前或前结构域βA、βB或α顺序最好在再组体细胞培养物中合成。单独的亚组元结构域可用普通有机化学方法或重组体细胞培养物合成。然后按照已知的方法用放射性同位素或其他可探测出的基团，如酶或荧光团对其进行标记，并能用于标准竞争负疫测定法中，通过用DNA对转化突变型中包括各个结构域在内的抑制素之早前型或前型，或者它们的前体进行编码，从检出所述前型或早前型的含量。这种测定可用于确定前抑制素的蛋白质水解究竟发生在宿主转化突变型内，还是它们的培养基中。所述的测定也可用于确定重组体合成的限速步骤是将信使核糖核酸转译成早前型，还是把早前型处理为成熟的抑制素。例如，在细胞溶解产物中早前或前抑制素含量较高，而分泌成熟抑制素含量较低时，则意味着宿主细胞正在充分地转录或转译抑制素DNA，但对前体的处理速率不够。因此，在这种情况下，应当选择另一个宿主细胞，例如选择另一个启动子，而不是致力于改善转化质粒的转录或转译效率。前结构域顺序也被认为涉及繁殖周期和繁殖力中的动物生理学的配合调整。
氨基酸顺序变异体是下述任意一个：1）激素-活性，2）与所生成的用以对付成熟抑制素或前结构域α或β链顺序的抗体之交叉反应，或者3）与抑制素/活性素细胞表面受体的交叉反应，但特点在于其初级氨基酸顺序与天然抑制素顺序或前结构域顺序不相同。
这些衍生物通常用下述方法制备：将核苷酸的插入体、缺失体或替代体，引入对被修饰的靶DNA编码的DNA中，以对变异体编码，其后表达重组体细胞培养物中的DNA。含有直至大约100-150残基的多肽也能方便地用体外合成方法制备。这类变异体的特点在于预先确定变异性质，此种特点使其与天然存在的等位或种间变异分开。所述变异体可能显示出与天然存在的结构类似物相同的定量生物活性，或者可能对这类结构类似物起拮抗作用。
虽然引入顺序变异的位点被预先确定，但不必预先确定自身突变。例如，为使某一位点的突变性能最佳，随机诱变可在靶密码子或区域内进行，并对所表达的抑制素突变体进行鉴别，以得到所需活性的最佳组合。在具有已知顺序的DNA的预定位点上实现替代突变的技术是熟知的，例如M13引物诱变形成。
诱变是通过插入大约1至10个氨基酸残基式删除约为1至30个残基而实现的。删除或插入最好从相邻对进行，例如删除或插入两个残基。可将替代、删除、插入或任何次级组合相结合，以得到最终结构。插入包括氨基或羧基-末端并合，例如在羧基末端增加一个疏水延伸体。最好只进行替代诱变。显然，在编码DNA中的突变不应将顺序置于读码外，并最好不造成能产生次级信使核糖核酸结构的互补区域。
编码此处多肽的DNA中，并非所有突变均被表达为最终分泌产物。例如，在一大类DNA替代突变中，一个相异的分泌腱或符号已替代了天然的猪或人体α或β链分泌腱，或者通过腱顺序中的缺失，或被替代体所取代，其中，大部分或全部天然腱被换成多半能被预计的宿主所识别的腱。例如，在构成一个原核表达载体时，猪或人体的α或β链分泌腱被删除，以支持细菌碱性磷酸酶或热稳定性肠毒素Ⅱ腱，而对于酵母，则腱被替代，以支持酵母转化酶、α因子或酸性磷酸酶腱。然而，猪或人体分泌腱为许多较高的异种真核细胞所识别。当分泌腱被宿主识别时，则宿主信号肽酶使一个由腱多肽的C末端与成熟抑制素或前结构域并合而形成的并合体裂开，以导致成熟抑制素或前结构域多肽被分泌。
最终形式不是表达为氨基酸顺序变异的另一大类DNA突变种是在DNA中形成的核苷酸替代体，以增强表达，主要是避免转录信使核糖核酸的5′干和环形结构（参见de Boer et al.，EP75，444 A），或者提供较易被选定宿主转录的密码子，例如所熟知的对大肠杆菌或酵母表达较好的密码子。这些取代体可以，也可以不对取代氨基酸残基编码，但最好不予编码。
插入和缺先的氨基酸顺序变异体是这样一类蛋白质，其中一个或一个以上氨基酸残基被引入，或从下列组元的预定位点除去：即靶抑制素、活性素、前结构域或者抑制素或活性素的前型最普通的是，插入变异体为异种蛋白质或多肽与α或β链、前结构域或其他抑制素衍生物的氨基或羧基末端相并合而形成的并合体。免疫衍生物系通过下列方法制备：将免疫多肽并合到靶顺序中，例如前结构域多肽，或在体外合成，也可通过用编码并合体的DNA转化的重组体细胞培养物。这种免疫最好是诸如trp LE和β-半乳糖苷酶之类的细菌多肽，并连同其免疫断片。其他插入体需要在被分泌的蛋白质NH2-末端的上方插入异种真核（例如疱疹病毒gD信号）或微生物分泌信号，或者蛋白酶处理顺序。半胱氨酸或其他不稳定残基的缺失体也许是最最理想的，例如增加α或β链的氧化稳定性。缺失衍生物将产生α或β链断片。具有生物或免疫活性的这类断片均在此范围内。例如，包含从11至45（从成熟Gly1起编号）的βB或βA残基的断片被列入此范围内。
前结构域多域、抑制素和活性素的免疫接合物易于在重组体细胞培养物中合成，即作为与β-内酰胺酶之类的免疫多肽或诸如疱疹gD蛋白质等的病毒抗原的并合体;或者也可用下述方法合成：先制备末并合形式的多肽（用重组或体外合成法），然后利用一个二价交联剂使之与钥孔 
血蓝素、STI之类的免疫多肽共价交联。免疫多肽配方中含有疫苗佐剂，如明矾或弗洛因德。在佐剂中配制蛋白质及交联的方法是众所周知的、并为该技术领域的熟练人员所应用;对动物接种疫苗的方法也同样如此。免疫接合物在制备对付前结构区域的抗体是有用的，后者用于监控抑制素制造或体内接种，其目的在于生成能调节动物繁殖周期和繁殖力的生理学抗体。一般，给能繁殖的实验动物或猪施用各种不同剂量的前结构域或其免疫原，然后监控动物的繁殖周期和繁殖力，并同时用常规的竞争或夹片免疫测定法分析血清中抗免疫原或前结构域浓度。
取代衍生物通过使靶密码子中DNA突变的方法产生，以至以后相异的氨基酸由密码子编码，而存在于突变DNA表达的分子中的残基数并未发生伴随变化。例如在用下述方法增加蛋白质的稳定性方面，取代体或缺失体均是有用的，消除蛋白质水解位点，其中，位点范围内或其邻近的残基被取代，或从位点处删除，或者通过用半胱氨酸取代其他残基，以引入附加的二硫化物键。取代体有助于成熟的或前结构域的α或β链的合成或回收。例如，成熟的抑制素顺序内的蛋氨酸残基被取代或删除，早前顺序被删除，在紧接NH2末端的-1位点处，蛋氨酸被插入成熟的NH2末端残基中，以及插入另一顺序的N-末端插入外源蛋氨酸中。这种情况下，抑制素衍生物被表达为具有一个中间甲硫氨酰残基的并合体，而其自身又在所述残基处，按照已知技术被溴化氰切开。从并合体中释放的成熟抑制素衍生物予以回收。
典型的猪抑制素衍生物是[[Asn266→Gln]Inh α（除去公认的糖基化位点）[Cys325或Cys324->△]Inhα，[Cys361or Cys363->△]Inhα，[Lys321or Lys322->△]InhβAor [Lys322->His or Ser]InhβA（使可能存在的蛋白质水解位点失去活性），
[Lys315->Arg;Val316->Thr]InhβA（产生一个βA/βB杂种），[Cys388or Cys390->△]InhβA，[Lys411->Gln]InhβA，[Arg315->Lys，Val316->Thr]InhβB（产生一个βB/βA杂种），[Cys319or Cys320->△]InhβB[Pro381Gly382->Pro Phe Gly]InhβB，and[Arg395->Gln]InhβB
其中，Inh是抑制素的缩略语，而Inh βB的残基号码与相应的Inh βA残基所用号码相同（见图2B）。
作为突变取代体或缺失体（或邻近处，残基可能由此插入）主要后补者的h βA氨基酸位置包括残基293-297，364-376和387-389（图8）。这些顺序内的脯氨酸、半胱氨酸和甘氨酸残基最好不予修饰。势能较之抑制素或活性素大，或用作抑制素或活性素拮抗物的候补者通过鉴别测定予以识别，即用含有常量抑制素或活性素的溶液稀释后补体，然后用鼠垂体细胞测定法分析其组成。在抑制素或活性素的免疫测定中，通过测试对付天然激素的多克隆抗体中的天然激素之标记抑制素或活性素的竞争免疫替位，从鉴别既不对抗又不对付抑制素或活性素之候补体在抑制素或活性素免疫测定法中的效用。设想的（可能的）h βA典型的顺序变异体包括：
Phe302->Ile或Leu;Gln297->Asp或Lys;Trp307->Tyr或Phe;Trp310->Tyr或Phe;Ile311->Phe或Val;Tyr317->Trp或Thr;His318->Lys;Ala319->Ser;Asn320->Gln，Tyr或His;Tyr321->Thr或Asp，Phe340->Tyr（a TGF-β/βA链内杂种）;His353->Asp;His353->Lys（a βA/βB杂种）;Phe356->Tyr;Val364->Phe;Val364->Leu;Tyr375->Thr;Tyr376->Trp;Asn389->Gln，His或Lys;Ile391->Leu或Thr;Met390->Leu或Ser;Val392->Phe，Glu，Thr或Ile。
在人的βB链中作了类似修饰。例如，h βA在位置302处包含一个苯丙氨酰残基;而h βB若如同图4A所示的猪βB的方式排列，则在对应的位置（图9中264）也包含一个苯丙氨酰残基。如上所述，既然β的Phe302残基被异亮氨酸基或亮氨酸基取代，则βB的Phe264亦被相同的残基所取代。
一个证明多肽作为抑制素、活性素或抑制素变异体身份的因素是基本上能消除成熟抑制素或活性素之激素活性的抗血清，亦能大致消除该多肽的激素活性的能力。然而，应认识到免疫特性（同一性）和激素活性不一定同时存在。例如，一个消除抑制素活性的抗体也许不能结合候补蛋白质，其原因在于所述抗体碰巧不是专与抑制素中对其活性至关重要的位点相结合。相反，抗体可能结合一个无害区，并通过位阻产生其灭活效应。因此，在所述无害区突变的候补蛋白质可能不再结合灭活的抗体，但根据其本质上同源性和生物活性，仍为抑制素。
注意到下述现象是重要的：从滤泡液或其他组织中得到的天然或野生型成熟抑制素或活性素的分子量、等电点等特性只能说明天然型。由上述定义所设想的变异体将包括不显示出天然结构类似物所有特性的其他多肽。例如，以上所述的诸如插入突变体、缺失突变体或并合蛋白质之类的抑制系衍生物将导致抑制素划在对相应的天然抑制素所确定的分子量之外，其原因在于具有成熟抑制素的并合蛋白质或前抑制素本身，以及插入突变体的分子量均较天然的成熟抑制素大得多。另一方面，天然的成熟抑制素之缺失突变体分子量较低。最后，异源细胞系中早前抑制素链的转译后处理可能不具备同源宿主细胞所达到的保真度，因此造成α和/或β链中氨基终端的一些变异。当残余前顺序属于成熟蛋白质，或丧失几个被前顺序切开的成熟残基，则可能遇到这种变异。以上情况也适合异源重组体细胞中前蛋白质的处理。
抑制素、活性素或前结构域的共价修饰被列入此范围内，并包括与其他化学等份的共价或复合结合体。共价衍生物是采用该技术领域中已知的方法，将功能度联接到抑制素氨基酸侧链，或者其N-端或C-端的基团而进行制备。例如，这些衍生物包括：羧基末端或诸如天冬氨酰残基之类的含有羧基侧链之残基的脂族脂或酰胺，含有丝氨酰或丙氨酰类残基的羧基O-酰基衍生物;氨基末端氨基酸或含有细胞溶素或精氨酸之类残基的氨基-基团的N-酰基衍生物。酰基选自烷基-部分的基团（包括C3至10的正烷基），由此形成烷基类（alkanoyl）物种;也可选自碳环或杂环化合物，籍此形成芳酰基物种。反应基最好是已知的双功能化合物，从通过侧反应基，使蛋白质交叉联接到不溶性基质上，例如m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯。较佳的衍生位点是在组氨酸残基处。
成熟抑制素、活性素或前结构域顺序的共价或聚集衍生物可用作免疫测定或亲合提纯法的试剂。例如，采用已知的方法，将抑制素或前结构域共价联接到溴化氰-活化琼脂糖中，或者使其吸附在聚烯烃（polyolefin）表面（用或不用戊二醛交联），以成为不溶性物质，进而用作抗-抑制素、抗-前结构域抗体或细胞表面受体之测定或提纯的试剂。抑制素或前结构域顺序也用可探测的基团标记，例如用氯胺T法进行放射性碘的标记，并共价结合到稀土螯合物或共轭结合到其他萤光体，以便用于诊断（鉴别）测定，特别是在竞争型免疫测定法中用于鉴别生物试样的抑制素或前结构域含量。
对抑制素/活性素的全部α和β链编码的脱氧核糖核酸可以用下列方法制备：化学合成，鉴别卵巢中信使核糖核酸的逆转亲本，或鉴别任何细胞的基因组库。直接合成所需的脱氧核糖核酸部分可能较为有效，因为所述的鉴别需要从互补脱氧核糖核酸或基因组库中识别编码α或β链的DNA。合成法的另一优点是在制备DNA时能引入单一限制位点，因而有利于在含有限制位点的载体中使用基因（否则在天然顺序中不存在），并能没法提高从上所述的转译效率，而无需通过诱变或其他类似方法来进一步修饰DNA。编码α或β链的互补DNA没有未转译的间插顺序（内含子），亦无对与其来源相似的其他蛋白质进行编码的侧翼DNA。
编码α和β链的DNA除来自猪或人体外，还可从其他来源得到，所用方法如下：（a）从靶动物的卵巢中获得互补DNA;（b）用对猪或人体α和β链或其断片（一般大于100个碱基对）编码的标记DNA进行萨瑟恩（Southem）分析，以探测互补DNA库中含有同等顺序的克隆;（c）用限制酶分析和核酸顺序分析法，对克隆进行分析，以鉴别全长克隆，如库中不存在这种克隆，则可对各种克隆中的合适断片进行修复，并将它们在克隆共有的限制位点处进行联接，以构成一个对全长分子进行编码的克隆。如以下所表明的，凡库中缺少的任何顺序均可通过将合成的寡脱氧核苷酸的卵巢信使核糖核酸上的3′延伸端补充到鉴别库时所识别的互补DNA上而得到，或者也可从已知动物的互补DNA中取得同等顺序。这在构成前或早前抑制素顺序，将所需物种内的早前抑制素处理为成熟抑制素时特别有用。
最初用经过标记的寡核苷酸探查猪和人体卵巢互补DNA库中的编码抑制素顺序的DNA，其中寡核苷酸的顺序是基于从提纯后的猪抑制素分析所确定的部分氨基酸顺序，或者在人互补DNA的情况下用猪互补DNA探查体进行探查。然而，一旦描述了编码人和猪的抑制素及前结构域的互补DNA后，在该技术领域中熟练人员将会认识到，从所述顺序中可以制备精确的杂交探查体，以容易地得到所需人或猪的基因残余物。
对被识别的猪或人体互补DNA克隆的核苷酸顺序分析，揭示了两种形式抑制素的生物合成前体之结构。有趣的是，这两种抑制素链不是来自单个被处理的前体，而是由各个信使核糖核酸转化而成，然后构成二硫化物交联的双链分子。
图1B、2B、6、8和9描绘了对构成猪和人体早前抑制素和早前活性素的多肽链进行编码的DNA。显然，简并密码子可能取代这些图中所揭示的对应物，其中被编码的是同样的氨基酸。图1B、2B、6、8和9中的DNA已发生了突变，以对上述α和β链的氨基酸变异体进行编码。具体过程如下：早前顺序被删除，然后一个起始密码子的5′立即插入该成熟链中，以使所述的链直接表达在重组体培养物中。对DNA也作了标记，例如用放射性磷，然后用于检查其他物种的卵巢互补DNA库，以识别其他这类物种中对α或β链进行编码的DNA，具体过程均如以上所述。
对DNA的共价标记，系采用已知方法，用诸如荧光基团、放射性原子或化学发光基团之类的可探测物完成的。然后，标记后的DNA被用于普通的杂交测定法中。这类测定方法被用于识别载体和转化突变型（如以下例子所述），或者用于体外诊断，如探测组织中的信使核糖核酸。
长顺序最好在用载体转化的宿主细胞中合成，所述载体含有对其编码的DNA，如抑制素或前结构域顺序。载体用于扩增对链编码的DNA，或用以制备一些作进一步处理（无性繁殖载体）用的DNA，或者用于表达链（表达载体）。表达载体是一种印影DNA结构体，其中编码α或β链的DNA顺序可被联接到控制顺序中，后者能影响其在相应宿主中的表达。无性繁殖载体不需要某种表达控制顺序。这种控制顺序包括转录启动子、控制转录用的任选操纵顺序、对适当的信使核糖核酸核糖体联结点（原核表达）进行编码的顺序、以及控制转录和转译终止用的顺序。载体应包括一个选择基因，以有助于稳定地表达所需的多肽和/或识别转化突变型。然而，维持α和/或β链表达的选择基因在采用真核宿主细胞的并发转化系统中，能由单独的载体供给。
载体包括质粒、病毒（包括噬菌体）和能并合的DNA断片，后者系的用重组方式并入宿主基因组的断片。此处所述的用于真核细胞表达抑制素α和/或β链的载体包含微生物无性繁殖用的质粒顺序，其中质粒自主地从宿主基因组中复制，而DNA被认为在转化时并入真核宿主细胞基因组中。同样，通过在芽孢杆菌属的同等重组进行基因组整合的芽孢杆菌属载体也是有用的。然而，起同等作用，并在该技术领域中已知的（或成为已知的）所有其他载体形式均适合此处应用。
通常，合适的载体包含复制子（复制的起源，用于非整合载体）和控制顺序，后者来自与预期的表达宿主相容的物种。转化宿主细胞系指业已转化或已被载体转染的细胞，其中所述载体含有对抑制素α和/或β链编码的DNA。转化宿主细胞包含无性繁殖的DNA，当其用表达载体转化时，也表达α和/或β链。所表达的多肽将在细胞内沉积，或者被分泌到周质空间或培养物上清液中，这取决于所选择的宿主细胞和在表达蛋白质中合适的处理信号，如同等或不同等的信号顺序存在与否。
若DNA区在功能上彼此有关时，则可成功地将其联结起来。例如，前顺序或分泌腱的DNA若表达为参与多肽分泌的前蛋白质时，则可联结到多肽的DNA上;若启动子控制密码顺序的转录，则其可联结到该顺序中;或者当核糖体结合点的定位能进行转译时，则可将其联结到密码顺序中。通常，上述联结系指被联接的DNA顺序是邻接的，而在分泌腱的情况下，既是邻接的又是同相读码。
合适的宿主细胞是原核体、酵母或较高的真核细胞。原核体包括革兰阴性菌或革兰阳性菌，例如大肠杆菌或杆菌属。较高的真核细胞包括上述哺乳纲起源形成的细胞系。虽然其他的原核体，如大肠杆菌B，大肠杆菌X1776（ATCC31，537），大肠杆菌W3110（ATCC27，325），假单胞菌属物种，或者沙雷菌属粘质赛氏杆菌（Marcesans）也是合适的，但较佳的宿主细胞是大肠杆菌294（ATCC31，466）。
对于宿主细胞的表达载体一般包括复制起源体（此处需要染色体外的扩增，如同无性繁殖中那样，所述起源体是一个细胞起源体），位于抑制素密码顺序上方的启动子，并连同核糖体结合点（核糖体结合或Shine-Dalgarno顺序仅用于原核体表达）。核糖核酸拼接点（当抑制素DNA包括含有1个或一个以上内含子的基因组DNA时），多腺苷化点和转录终止顺序。如已指出的那样，技术熟练的人员将明白上述某些顺序对于在某些宿主中的表达并不需要。用于微生物的表达载体仅需包含能被预期宿主识别的复制起源体、将在宿主内起作用的启动子以及一个表型选择基因，例如给于抗菌素抗性或供给营养必需品的基因密码蛋白质。抑制素DNA一般利用PBR322，即从大肠杆菌物种中得到的质粒，以被克隆到大肠杆菌中（Boliuar，et al.，1977，“Gene”2：95）。PBR322包含对于氨苄青霉素和四环素抗性的基因，因此为识到转化细胞提供了一个方便的手段。
与无性繁殖载体不同的是，表达载体必须含有能被宿主生物体识别的启动子。一般这是一个与预期宿主对应的启动子。在重组体DNA结构中最常用的启动子包括β-内酰胺酶（青霉素酶）和乳糖启动子系统Chang et al.，1978，“Nature”，275：615;and Goeddel et al.，1979，“Nature”281：544），色氨酸（trp）启动子系统（Coeddel et al.，1980，“Nucleic Acids Res.”8：4057 and EPO Appl.Publ.No.36，776）和tac启动子[H.De Boer et al.，1983，“Proc.Nat′1.Acad.Sci.U.S.A.”80：21-25]。除以上列举的最常用启动子外，其他已知的微生物启动子也是适用的。有关它们核苷酸顺序的详细内容业已发表，使技术熟练的人员能切实可行地将它们联接到质粒载体的DNA编码抑制素（Siebenlist et al.，1980，“Cell”20：269）和DNA编码抑制素或其衍生物中。用于原核体表达系统的启动子也将含有一个可以联结到编码抑制素的DNA上的雪-特尔格纳（Shine-Dalagarno）（S.D）顺序，亦即该顺序的定位有助于转译。通常，这意味着启动子和位于细菌结构基因第二密码子上方的S.D顺序取代了位于成熟α和/或β链5′位置的早前抑制素顺序。
除原核体外，酵母培养物之类的真核微生物用抑制素-编码载体转化。在较低的真核宿主微生物中间，最常使用的是酿酒酵母，或普通的制面包的酵母。然而，其他一些菌株通常也可获得，并可在此处使用。酵母载体一般包含下列物质：来自2微米酵母质粒的复制起源体或自主复制顺序（ABS）、启动子、编码α和/或β链的DNA、对于多腺苷化和转录终止的顺序，以及选择基因。对于在酵母中表达的合适质粒是YRp7，（Stinchcomb et al.，1979，“Nature”，282：39;Kingsman et al.，1979，“Gene”，7：141;Tschemper et al.，1980，“Gene”，10：157）。该质粒已包含trp 1基因，后者向缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株提供选择标记，例如ATCC44076号或PEP4-1（Jones，1977，“Genetics”，85：12）然后在酵母宿主细胞基因组中存在的trp 1侵蚀斑对于在无色氨酸条件下生长而探测转化提供了一个有效环境。
在酶母载体中合适的启动顺序包括对于金属硫因、3-磷酸苷油酸激酶、（Hitzeman et al.，1980，“J.Biol.Chem.”，255：2073）或其他糖解酶（Hess et al.，1968，“J.Adv.Enzyme Reg.”，7：149;and Holland et al.，1978，“Biochemistry”，17：4900）如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧化酶、磷酸过糖激酶、葡糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡糖异构酶和葡糖激酶。希兹曼等进一步描述了用于酵母表达的合适载体和启动子（参见R.Hitzeman et al.，EP73，657A）。
具有由生长条件控制转录这一附加优点的其他酵母启动子是对于下列物质的启动子：乙醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解性酶、上面提到的金属硫因和甘油醛-3-磷酸脱氢酶、以及决定麦芽糖和半乳糖利用的酶。在构成合适的表达质量中，与这些基因有关的终止顺序也被联结到抑制素或衍生物密码顺序的表达载体3′上，以提供信使核糖核酸的终止和多腺苷化。
从多细胞体中得到的细胞培养物是此处较佳的宿主细胞，这是因为激素活性抑制素或活性素的表达被认为仅仅发生在这类细胞中，微生物表达至多导致免疫交叉-反应性。原则上，任何较高的真核细胞培养物均可使用，不管其是脊椎动物还是非脊椎动物的培养物。近年来，脊椎动物细胞在自身培养物中繁殖已成为常规操作方法[Tissue Culture，Academic Press，Kruse and Patterson，editors（1973）].
对于在较高真核体中表达α或β链的合适宿主细胞包括：被SV40（COS-7，ATCC CRL1651）转化的猴肾CVI系;幼仓鼠肾细胞（BHK，ATCC CRL10）;中国大田鼠卵巢-细胞-DHFR Urlanb anb Chasin，PNAS（USA）77：4216，[1980]）;鼠塞尔托利细胞（TM4，Mather，J.P.，Biol.Reprod.23：243-251[1980]）;猴肾细胞（CVI ATCCCCL70）;非洲绿猴肾细胞（VERO_76，ATCCCRL_1578）;人体子官颈癌细胞（HELA.ATCC CCL2）;犬肾细胞（MDCK.ATCC CCL34）;水牛鼠肝细胞（BRL3A，ATCC CRL1442）;人体肝细胞（W138 ATCCCCL75）;人体肝细胞（Hep G2，HB 8065）;鼠乳房瘤（MMT 060652，ATCC CCL51）;鼠肝细胞瘤（HTC.M1，54，Baumann，M.，et al.，J.Cell.Biol.85：1-8[1980]）and TRI cells（Mather，J.P.et al.，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68[1982]）。
在脊椎动物细胞表达载体中的转录和转译控制顺序最好从病毒中提供。例如：常用启动子是从多瘤、腺病毒2和猴病毒40（SV40）中得到，其中以后者最佳。SV40的初期和晚期启动子特别有用，因为它们容易从病毒中以断片形式得到，所述断片也包含SV40病毒的复制起源体（Fiers et al.，1978.“Nature”，273：113）.较小或较大的SV40断片也可被利用，但从Hind Ⅲ位点向着位于病毒复制起源体的BglⅠ位点延伸的大约250碱基对顺序需包括在内。而且，也可能利用基因组启动子，以及通常与α或β链相关的控制和/或信号顺序，但这种控制顺序必须与宿主细胞相容，并为后者所识别。
复制起源体可用下述任一方式提供：1）构成的载体使其包括外源起源体，如可从SV40或其他病毒中得到（例如多瘤、腺病毒、VSV或BFV）;2）宿主细胞染色体复制机构。若载体被并合到宿主细胞染色体中，则后者往往是足够的。
哺乳动物细胞用编码选择标记的DNA和编码α和/或β链的DNA并发转化，而不用含有病毒复制起源体的载体。合适的选择标记以二氢叶酸还原酶（DHFR）或胸苷激酶为代表。这类标记是蛋白质，一般为酶，它使转化突变型细胞能被识别，而后者是一种能吸收外源DNA的细胞。所谓识别是以培养基中转化突变型的存活为依据，所述培养基对未转化细胞有毒性，或者若细胞不吸收标记蛋白质，则不能从其得到所需营养。
在选择较佳的宿主哺乳动物细胞，以便用含有对抑制素和二氢叶酸还原酶编码的DNA顺序的载体转染时，宜按照所用的二氢叶酸还原酶蛋白质的种类进行选择。若使用野生型二氢叶酸还原酶时，最好选择缺少所述还原酶的宿主细胞，因而使这种酶的密码顺序能在没有次黄嘌呤、甘氨酸和胸苷（hgt）的所选培养基中成功地用作转染的标记。此处一种合适的宿主细胞是二氢叶酸还原酶活性不足的中国大田鼠卵巢（CHO）细胞素，其制备和繁殖方法均如以下文献所述：Urlaub and Chasin，1980，“Proc.Nat′l.Acad.Sci.”（USA）77：4216。
另一方面，若对与氨甲蝶呤（MTX）结合亲和力低的二氢叶酸还原酶进行编码的DNA被用作控制顺序，则不必使用抗所述还原酶的细胞。因为突变体二氢叶酸还原酶是抗氨甲蝶呤的，倘若宿主细胞本身是对后者敏感的，则含有氨甲蝶呤的培养基能被用作一种选择手段。大多数能吸收氨甲蝶呤的真核细胞似乎对其是敏感的。这类有用的细胞是CHO系，CHO_KI（ATCC No.CCL61）。最好先选择抗新霉素的转化突变型（转染与对抗新霉素基因进行编码的DNA一起进行），然后根据具体情况进行α和/或β链表达的氨甲蝶呤扩增（见Kim et al.，“Cell”42：129-138（1985）and EP160，457 A。
格桑等描述了适应在重组体脊椎动物细胞培养物中合成α和/或β链的其他合适方法（见M-J.Gething et al.，“Nature”293：620-625（1981）;N.Mantei et al.，“Nature”281：40-46：and A.Levinson et al.，EP117.060 A and 117，058 A.
抑制素α链在有（或没有）任一β链分子的重组体细胞培养物中表达。同样宿主细胞用对二个成熟的β链中一个或全部进行编码的DNA转化。根据与TGF-β的相似性，成熟β链在重组体培养物中表达时，能够形成同型二聚体或βA/βB杂二聚体。这类结构不是抑制素，此处将称为β链二聚体或活性素。它们对制备活性抑制素是有用的，可作为β链的来源，或用作凝胶电泳标准，以探测在α和β链并发转化突变型中合成的β链向β链二聚体的转换。如在例4将要看到的，这绝不是一个假想的问题。当然，二聚体在上面提到的调整繁殖方面也是有用的。
β-链杂二聚体或同型二聚体可按照下述公知的方法公开：各链在体外展开，然后与α-链生成氧化二硫化物键。然而，在制备成熟抑制素时，重组体宿主最好用对两个α-链和二个β-链之一进行编码的DNA转化。然后，完整的激素活性分子在体内用宿主细胞组合。因此不需要通过体外处理将两个链联结起来。编码α和β-链的DNA最好位于相同载体上，并在相同的启动子控制下，但这并不是必不可少的。
在鉴别过程中被识别的某些β-链氨基酸顺序变异体既不与垂体细胞表面受体结合，从而也不会显示出激素活性。这类变异体，若其在重组体细胞培养物中表达为同型二聚体，且能与天然β-链发生免疫表位交叉反应，则可用于对活性素的免疫测定法中。此外，这类变异体与对激素活性β-链编码的DNA共同表达，产生一个含有天然和变异体β-链的杂种。此处，变异体起稳定天然β-链结构的作用。这种形式的β-链杂二聚体与同型二聚体一样，可用于对活性素的免疫测定法中，它也可起活性素拮抗物的作用。
活性素/抑制素β链也与TGF-β共同表达，以产生β-链/TGF-β杂种。有关TGF-β表达的载体和方法是公知的，例如可参见下述文献：德里克（Derynck）等。“在正常和转化细胞中，人体转化生长因子-β互补DNA顺序和表达”，《Nature》316：701-705（1985）。哺乳动物宿主细胞，连同活性素/抑制素的βA或βB链一起，被含有TGF-β基因（如德里克所描述的）的载体并发转化，将导致一部分β-链/TGF-β杂种二聚体分泌。所述杂种在制备TGF-β/β-链免疫原或在免疫测定中均是有用的。
按照公知技术，可使抑制素、活性素或前结构域顺序从转化细胞中回收。当多肽在重组体细菌中表达为拆射体时，所需的多肽可用普通方法回收和重新拆叠。或者，分泌活性素和抑制素的转化细胞（最好是哺乳动物细胞）的培养物上清液可简单地通过离心分离而与细胞分开。然后，抑制素一般通过下述相继的净化步骤进行提纯，这包括肝素-琼脂糖亲合色谱，凝胶过滤，以及至少一次，但最好多次的反相高压液相色谱分离步骤，并且采用不同的固定相和/或流动相条件。通过体外合成而产生的前结构域顺序用常规方法提纯。
适合此处使用的较佳前结构域多肽从转化后的重组体细胞培养基中回收，所述的转化过程合成了适合所需前结构域的α和/或β链。具体回收过程如下：先在天然电泳凝胶上分离培养基多肽。切除具有预计分子量的（谱）带，然后可用LPLC或反相高压液相色谱法等进一步提纯洗脱的多肽，接着通过氨基酸顺序测定，得到基本上同源分离多肽。提纯后的前结构域多肽以后被用于在兔子等体内产生抗体，当其用于免疫亲合提纯时，可简化前结构域的回收。
在分离猪激素活性抑制素的较佳方法中，转化突变型培养物上层澄清液，或细胞溶解产物首先用肝素-琼脂糖亲合色谱法提纯，然后在赛法克力尔（Sephacryl）S-200凝胶上进行凝胶过滤，接着再用不同的流动相梯度和/或衍生硅胶载体相继进行四次反相高压液相色谱分离。最好使用疏水性较低的固定相，且C3-C8柱较佳;尤以C3-C5和苯基柱最佳。流动相溶质特性最好通过改变有机组分，特别是乙腈的浓度进行调节。虽然单级反相-高压液相色谱分离使其纯度较之凝胶过滤物质大为增加，但一般经肝素-琼脂糖色谱和凝胶过滤相继处理后，需进行两次或两次以上，最好是四次的反相高压液相色谱提纯。业已发明这一方法也适合从重组体细胞培养物提纯人体抑制素。
第一个提纯步骤是肝素-琼脂糖亲合色谱，其中，蛋白质在操作条件下吸附在与琼脂相接合的肝素上，继尔用1M Nacl洗脱，回收被吸附的抑制素物质。这一步大大加快对粗提取液的提纯过程，因为较大量的粗提取液可被相当快速地处理，与此同时回收相当量的蛋白质，其总的抑制素活性至少相当于粗提取液的90%。
为探测各柱级分的抑制素活性，取出一份体积比在0.01%至0.1%范围内的试样，然后加入含有100微克1人体血清白蛋白的100微升水，并在斯比特一范克（Speed-Vac）浓缩器（Savant，Hicksville，N.Y.）上蒸发。再将残渣溶于3毫升1%牛胎血清的HDM EM中，并用米莱克斯-GS（Millex GS）0.22微米过滤器（Millipore公司，Bedford，MA）进行过滤，尔后试样一式两份，进行分析测定。为加快提纯过程中的生物测定，仅仅确定由抑制素活性所产生的促卵泡成熟激素分泌的基本抑制，并在预期抑制素蛋白质将在色谱中发生迁移的区域进行作图。
为进行肝素-琼脂糖亲合色谱提纯，使细胞碎片在贝克曼（Beckman）J2-21离心机（贝克曼仪表有限公同，Palo Alto，CA）中以10，000转/分的速度旋转沉降30分钟，所用的转子为JA-20。然后将一半上层清液移入锥形烧瓶中，并添加含有0.1MNacl，PH为7的0.01M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液，将其稀释10倍体积，同时用两台莱别脱（Rabbit）4-通道蠕动录（Raimin仪表有限公司，Emeryville，CA），以每个柱40毫升/小时的流量，经由硅橡胶管（内径为0.76毫米）送入肝素-琼脂糖（Pharmacia Fine Chemicals，Piscataway，N.J）柱（3.5×9厘米）内。当流体全部被泵输送并通过肝素-琼脂糖柱后，用上述相同浓度和组成的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液，并以同样方式对8个柱同时进行淋洗，以除去具有抑制素活性的被吸附蛋白质，将淋洗流出液收集在各级分中。用上述体外生物测定法监测抑制素活性。上述各柱再用含有2MNaCl，PH为7的0.01M三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液淋洗，尔后用含有0.1M NaCl的上述溶液（其他组成不变）重新平衡，以供剩下萃取液的提纯。
接着，上述物料用凝胶过滤分级，通常按蛋白质分子将其分离。被肝素-琼脂糖柱提取的具有抑制素活性的级分汇集在一只圆筒直径为，28.6毫米的斯派克脱柏（Spectrapor）3号薄膜管中，并渗析过夜，除去氯化钠，相对于30%的乙酸，Mr载止在3，500处（Spectrum Medical Industries，Inc.，Los Angeles，CA）。留下的液体按上述方法进行离心分离，除去白色沉淀，将上层清液分成等份，以供给5×100厘米的塞法克力（Sephacryl）S-200超细柱中（Pharmacia Fine Chemicals，Piscataway，N.J.）。各柱用20毫升30%乙酸洗脱22分钟，并用280毫微米的紫外吸收和生物测定监测柱的级分。
汇集S-200柱流出的生物测定-阳性蛋白质，并予以冷冻干燥。然后将干燥后的物质溶于0.2当量浓度的乙酸（1毫升/1毫升）中，并通过米兰克斯-HA0.45微米过滤器（Millipore Corp.，Bedford.MA.）进行过滤。滤液被直接送入一只充有5微米粒径多孔实心球（Vgdac）的1×25厘米的C4柱（The Seperations Group Hesperia，CA），并用TEAP缓冲剂梯度显谱。在TEAP系统中，缓冲剂A由0.25当量磷酸三乙胺组成，PH为3;而缓冲剂B是含有80%乙腈的缓冲剂A。俟滤液全部流毕，分离柱用缓冲剂A的水溶液淋洗，直至紫外吸收达到基线。显示抑制活性的级分在贝克曼332梯度液相色谱装置（见克曼仪器有限公司，伯克利，CA）中分离，该装置带有757 Spectroflow紫外探测器（Kratos分析仪器公司，Ramsey，N.J.），苏尔脱（Soltec），220记录仪（Soltec公司，Sun Valley，CA和Redirac 2112级分收集器（LKB仪器有限公司，Gathersburg，MD）。抑制素活性区通过生物测定检测。
若有需要，可再采取两步反相高压液相色谱，以进一步提纯含有βB链的抑制素蛋白质，去除含有βA物种的抑制素。第一步采用充有5微米粒径多孔实心球的1×25厘米的C4柱和三氟乙酸（TFA）缓冲体系;第二步使用充有5微米粒径多孔实心球的1×25厘米苯基（Phenyl）柱和TEAP缓冲体系。在TFA体系中，缓冲液A由1毫升三氟乙酸和999毫升水组成;而缓冲液B由1毫升三氟乙酸、199毫升水和800毫升乙腈组成。所述两种抑制素物种分开洗脱。从几批料中积聚的抑制素采用反相高压液相色谱法，在充有10微米粒径Aquapore RF-300的0.46×25厘米的柱（Browmlee实验室，Santa Clara，CA）和TFA缓冲剂体系中进行浓缩。然而，这一净化步骤一般不用于具有只对βA或βB链编码的转化突变型之细胞培养物的上清液。
抑制素、活性素、前结构域顺序或它们的变异体以酸加成盐或金属络合物之类药学上可接受的无毒盐形式施用，其中所述络合物中的金属可为锌、铁或其他同类元素（就此处应用而言，可将这种络合物看作盐）。兹将这类酸加成盐列举如下：氢氯化物、氢溴化物、硫酸盐、磷酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、抗坏血酸盐、酒石酸盐等。此外，在等渗盐水、磷酸盐缓冲液或其他类似液体中的静脉注射是合适的。
此处所述的多肽应在医生指导下施用，通常药剂组成中应含有有效量的多肽，并连同药学上可接受的普通载体。剂量大小取决于施用该蛋白质的具体目的，若抑制素作为男用避孕药经常服用。则所用的剂量水平以每公斤体重计可在0.1至1毫克左右。
抑制素、活性素、前结构域或它们的变异体最好以插入或粘附在皮肤上，且持续释放的物品形式施用。例如可用于上述目的的合适物质包括L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸（U.Sidman等，1983，“Biopolymers”22（1）：547-556），聚（2-羟乙基-异丁稀酸）（R.Langer et al.，1981“J.Biomed.Mater.Res.”15：167-277 and R.Langer，1982，“Chem.Tech.”12：98-105）ethylene vinyl acetate（R.Langer et al.，Id.），or poly-D-（-）-3-Hydroxybutyric acid（EP 133，988 A）.这类物品可插入皮下，或使之与皮肤或粘膜接触。
为简化例子，某些经常出现的方法将用缩略语注明出处。
质粒用小写母p表示，前面和/或后面接大写字母和/或数字。文内所述的起始质粒在市场上可以买到，并可不受限制地公开得到，或者能按照公开的方法，用公开得到的质粒或DNA制成。此外，其他的等效质粒在该技术领域内是熟知的，对普通技术人员将的显而易见的。
DNA的“消化”系指用仅在DNA某些部位起作用的酶催化分裂DNA。这类酶称为限制酶，而酶有特效作用的位点称为限制部位。“部分消化”系指被限制酶不完全消化，亦即选择一定条件，使一给定的限制核酸内切酶仅分裂DNA基质中部分而不是全部位点。此处所用的各种限制酶均可从市场上买到，并采用酶供应商对其所规定的反应条件、辅助因素和其他要求。限制酶通常用下列形式缩写表示，即包括一个大写字母，紧接着其他字母，再后面一般是表示每个限制酶来源的微生物数字。通常各组分配比大致如下∶1微克质粒或DNA断片∶1个单位酶∶20微升缓冲液。与特定的限制酶相匹配的缓冲剂和基质的合适用量由制造商规定。一般情况是在37℃下培养一小时，但按照供应厂商的说明书，可能有所变化。培养后，用苯酚和氯仿萃取，以除去蛋白质。消化后的核酸通过用乙醇沉淀，得以从水相级分中回收。用限制酶消化后，接着往往使末端5′磷酸盐的碱性磷酸酶水解，以防止DNA断片的两个限制裂开端成为圆形或形成一个封闭环路，从而阻碍另一个DNA断片插入限制部位。除非另有说明，质粒消化后并不伴随着5′末端脱磷酸过程。所述脱磷酸过程的方法和试剂与一般的相同（T.Maniatis et al.，1982，Molecular Cloning pp.133-134）.
某一DNA断片从限制消化液中“回收”和“分离”系指下列各步骤：消化液在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离;通过将有关断片的迁移率与已知分子量的标记DNA断片的迁移率进行比较，以对其识别;移出含有所需断片的凝胶部分以及从DNA中分离凝胶。这一方法广为人知，例如可参见下述文献：R.Lawn et al.，1981，“Nuceleic Acids Res.”9：6103-6114，and D.Goeddel et al.，1980，“Nucleic Acids Res.”8：4057.
所谓“萨瑟恩分析”系指下述这种方法：即在消化液或含有DNA的成分中DNA顺序的存在与否是通过杂交到已知的标记低聚核苷酸或DNA断片上而予以证实。对于此处应用来说除非另有说明，萨瑟恩分析将意味着按下列文献所描述的方法而进行的下列操作：在1%琼脂糖中分离消化液，变性作用，以及移入硝化纤维素中E.Southern，1975，“J.Mol.Biol.”98：503-517，and hybridization as described by T.Maniatis et al.，1978，“Cell”15：687-701）。
“转化”系指将DNA引入生物体中，以使DNA能进行复制，或作为一个染色体外成份，或作为染色体组分。除非另有规定，此处用于转化大肠杆菌的方法是氯化钙法（Mandel et al.，1970，“J.Mol.Biol.”53：154）。
“联接”系指在两个双线核酸断片之间形成磷酸二酯键（T.Maniatia等，Id.，P.146）。除非另有规定，使用已知缓冲剂和在下述组分用量条件下可完成联接：即每0.5微克近似等摩尔量的欲被联接之DNA断片，T4 DNA连接酶（“酶”）的用量为10个单位。
从转化突变型中制备DNA意味着从生物培养物中分离质粒DNA。除非另有规定，可采用碱性/SDS方法（Maniatis等，Id.P.90）。
“低聚核苷酸”是长度较短的单线或双线聚脱氧核苷酸，系用已知方法进行化学合成，然后在聚丙烯酰胺凝胶上提纯。
所有引用处均清楚地列有参考文献。
例1
克隆抑制素α-亚单位c DNAs的分离
对含有猪抑制素亚单位的编码顺序的克隆的识别方法，是以“长探针”方法为基础的，这方面有几个成功的例子（Anderson et al，1983，“Proc.Nat.Acad.Sci.USA”80：6836-6842及Ullrich et al，1984，“Nature”309：418-425）。概括地说，一个高度复杂的c DNA库是通过一条与猪抑制素α-链的N-终端氨基酸顺序相对的单一64个碱基长的合成的寡脱氧核苷酸来筛选，该c DNA库是通过Oligo-dt-Primed c DNA合成作用在λgt10中构成的以及从猪卵巢RNA得到的。由于抑制素链m RNA显得很不稳定，故而该c DNA库须从新鲜的卵巢组织取得。2，000个空斑中大约有1个与这探针杂交，几个杂交的克隆的c DNAs的分析证实了探针识别的正确性。该分析揭示了，在特征c DNAs中没有一个具有充足的顺序信息以预言α-链前体蛋白的全部结构。宁可不对来自同一个c DNA库的克隆进行分析，而是通过在与一个顺序区编码的α前体残基60-64互补的合成寡脱氧核苷酸的卵巢m RNA上的3′伸展蛋白（3′extension）建成第二个库。（图1A）。该基因库是用从预先分析过的c DNA得到的合适的限制性片段来筛选，并获得几个分离物，它们列入为α-前体的N-终端编码区的DNA顺序的残余物。编码顺序的完整性是从一个决定猪α-链肽顺序的长的读码的存在来判断的，该长读码是以一个前有一个在框架终止密码子后有一个产生信号肽的标记的疏水顺序的甲硫氨酸密码子为开端的。前体蛋白的全部顺序及其c DNA如图1B所示。含有信号肽的完善的蛋白有一个由364氨基酸构成的-40K的Mr，其中C末端的134（Mr-14.5K）构成猪抑制素的α-链。前体的前区有若干Arg-Arg顺序，其中之一直接位于α-亚单位的前面。我们相信较后的这对残基为蛋白质水解释放α肽的加工位点。经推断的前体顺序预示有两个N-连接的糖基化位点，一个在α链本身之内。
除编码区外，c DNA顺序含有一个包括典型的AATAAA聚腺嘌呤核苷酸信号的167核苷酸的3′-不转录顺序和一个目前还不知其长度的5′不转录区。
具体的方法如下所述：
聚腺嘌呤核苷酸的m RNA是从新鲜冷冻的猪卵巢来制备（Kaplan et al，“J.Biochem”.183：181-184）。入gt10中的-6×106克隆的oligo-dt-primed c DNA库（Huynh et al，1984，DNACloning Techniques，Ed.D.Clover）是用5μg Poly A+mRNA来制备，如Wood等所述，“Nature”312：330-337（1984），此外所采用的EcoRI接合体具有5′-AATTCACTCGAGACGC-3′3′-GTGAGCTCTGCG-5′P.顺序。
大约1×106未放大c DNA克隆是用以图1B中划线的氨基酸顺序为基础的5α-亚单位寡核苷酸
5′-ACCGCCCCTTTGCCTTGGCCTTGGTCCCCTGCTGCTCTGAGACTGCTGCAGAGACCTCCTGAGG-3′
来筛选。在37℃下，在5×SSC，40%甲酰胺条件下，用磷酸化32P-标记探针进行杂交。在50℃下用1×SSC0.1%SDS洗涤滤器。大约可得到500个杂交正克隆，对其中十二个进行提纯并检测插入尺寸。这五个EcoR1插入物（λPIN-α2、-α5A-α5-α9-α10）进行亚克隆至M13衍生物之中（Messing et al，1981“Nucl.Acids Res，”9：309-321）并用Sanger等的双脱氧链终止法测定顺序。“Proc.Nat.Acad.Sci.USA”74：5463-5467（1977）.用寡核苷酸5′-CCCCACAGCATGTCTT-3′（与核苷酸248-263互补）引导5μg的Poly A+mRNA以制备一种特别地引导的基因库，然后克隆至λgt10之中。所得到的1×106个克隆中大约有1×105个克隆是用从λPIN-α2制得的5′100bp Eco RI-BamHI片段进行筛选。所得到的170个杂交正克隆中有十二个被提纯，两个（λPIN-S12s，-S4s）用双脱氧方法测定顺序。α-亚单位c DNAs的全部核苷酸顺序是通过将不同的λ提出物中各种不同的限制性片段亚克隆至M13噬菌体衍生物之中而获得。浓缩物是通过利用与大肠杆菌单股结合的蛋白（Pharmacia）结合的脱氧肌苷来溶解。
克隆抑制素β亚单位c DNAS的分离
为抑制素β亚单位前体的编码c DNA顺序是从用于α亚单位的同一个c DNA库得到。重叠c DNA克隆是通过首先利用基于两个N-终端β亚单位顺序的单一长的合成寡核苷酸探针来筛选，然后再用来自特征的c DNA的合适的限制性片段作为在5′及3′方向“行走”的探针来筛选进行分离的（图2A）。
具体地说，基于残基321-339的氨基酸顺序的5′末端标记的βA寡核苷酸
5′-AAGAAGCAGTTCTTTGTGTCCTTCAAGGACATTGGCTGGAATGACTGGATCATTGC-3′
用于筛选大约2×105的Oligo-dt Primed卵巢c DNA克隆。获得五个杂交正物（链），其中三个证明含有βA编码顺序（λPIN-βA2-βA4-βA8）。从λPINβA2得到的一个5′末端154bp EcoRⅠ-Hind Ⅲ（核苷酸158-297）片段及一个3′末端213bp EcoRⅠ-Pst片段（核苷酸1679-1892）用于从α-链特别地引导的库中将2×106oligo-dt primed c DNA克隆及2×105克隆筛选出来。详细分析的十六个克隆中发现有两个具有较长的5′末端（λPIN-βA5s，-βA22），一个克隆λPIN-βA2）含有完整的3′不转录区。猪抑制素βB亚单位c DNA克隆是通过利用基于NH2-末端顺序（如图1A所示）的βB寡核苷酸
5′-GGCCTGGAGTGTGATGGGAGAACCAACCTGTCCTGCCGCCAGGAATTTTTCATCGATTTCAGGCT-3
从特别引导的库中将2×105克隆筛师出来，从而被分离。正克隆进一步通过寡核苷酸肌苷探针 
（顺序中“Ⅰ”代表肌苷）来筛选，该探针覆盖了氨基酸顺序QQFFIDF的不转录链的所有可能位点。两个克隆（λPINβB-1s，-2s）被分离并检测顺序，发现是为βB亚单位编码的。一个230bp EcoRI-Sma（核苷酸21-251）片段被从λPINβB-Ⅰ中分离出来，并作为杂交探针以筛选2×106oligo-dt primed c DNA.克隆。获得两个杂交正物（λPINβB-3，4）。这些重叠克隆的核苷酸顺序用于组建所示顺序。所有顺序是通过将特定的片段亚克隆至M13噬菌体载体之中而获得（Messing et al，opcit.）上述的Eco RI限制部位都包含在c DNA转接体片段中，并非指存在于c DNA的顺序。
我们指出，oligo-dt-pimed库（2×105中4个）的克隆中只有很少几个克隆能够与抑制素A的β-亚单位的合成探针相杂交。尽管DNA顺序分析证明其中大部分是正确的，但是根据在它们的3′末端缺乏Poly A同聚物判断，不含有完整的3′不转录区域。缺乏Poly A尾巴表明在这种m RNA和/或结构区域中有一个非常长的3′一不转录区，经证明难以通过用于库构成的聚合酶来复制。在通过对α-亚单位m RNA的特定引导而制得的c DNA库中，出乎预料地发现一个抑制素βA亚单位编码顺序含量较高（10倍）。该库是按照随后被驳倒的α前体m RNA可能为β亚单位编码的理论采用抑制素Aβ-链的合成探针筛选的。该库中的抑制素βAc DNA的高含量，后来查出是与特定α链引物与相应的m RNA的3′不转录部分的一个区域偶然互补性有关。
所有库中只发现有四个为抑制素B的β亚单位编码克隆c DNAs。从这些克隆所获得的顺序信息，不能揭示相应的前体蛋白及其c DNA的全部结构。图2B对c DNAs顺序及推断的β亚单位前体蛋白结构进行比较。抑制素βA亚单位c DNA的核苷酸顺序有3.6Kb长，含有一个425氨基酸蛋白质的开放读码，其C末端的116个残基代表β亚单位本身（Mr-13K）。这一读码是以一个甲硫氨酸密码子开头随后为一段特征信号肽编码的顺序，其真实长度为29个残基。编码的β亚单位有一串5个精氨酸引导，它在此处通过蛋白分解从前体断开。与α亚单位前体相似，该β-亚单位含有几对附加的残基，在此迄今其生物活性还不清楚的肽被释放。在前区（Asn，残基165）也还包括一个N-联结糖基化的位点。
抑制B的β亚单位的推测的蛋白顺序显示与βA亚单位顺序有很高的同源性。71个氨基酸是相同的，自然情况下变化不大。在两个β亚单位的前区中，也发现有同源性，尽管程度不高。有趣的是，在编码中极罕见的但存在于为抑制素βA前体编码的c DNA之中的富含嘌呤顺序可以产生出独特的氨基酸顺序，但是它在为同源的βB前体编码的c DNA中则末曾被发现。当两种蛋白顺序为最大的同源性联合时，这就导致了抑制素的βB前体中有22个氨基酸残基的空缺。这样的联合也可在两者前体的半胱氨酸部位造成完好的匹配（参阅图2B）。
α及β链前体m RNAS的Northern分析
卵巢的整体和聚腺苷酸化了的RNAS是通过Northern方法，利用顺序已测定的c DNAS为探针，以确定为异种二聚体抑制素分子的肽亚单位α，β及βB编码的m RNA的相关含量及大小来进行分析。聚腺苷酸化了的m RNA（2μg：栏a，b，c及f;8μg栏d）和总的RNA（10μg：栏e及g）甲醛1.2%琼脂糖凝胶中电泳，并涂沫到硝化纤维素滤片上。接着将32P标记的c DNA片段在严格的条件下，用作杂交探针。栏a：240bp EcoRI-SmaⅠ（核苷酸134-371）来自α亚单位c DNA;b：154pb EcoRI-Hind Ⅲ（核苷酸158-297）来自βA亚单位c DNA;C：230bp EcoRI-Sma（核苷酸21-251）来自βB亚单位c DNA;d和e：λPIN-α2的ECo RI插入;f和g：λPIN-βA5的ECo RI插入物。滤器用3批0.1×SSC，0.1%SDS在60℃下洗涤2小时。如通过c DNA克隆所得的结果表明那样，分析表明（图3）α和βm RNAs在大小和含量上是不一样的。从它们的各自带强度估计，α一前体m RNA含量至少为βA前体m RNA含量的10倍，大约为βB前体m RNA的20倍。
以核糖体RNAs为大小的标准，单一种的α前体m RNA，长度为1500核苷酸，大小非常符合克隆的c DNA顺序（图1B）。βA前体m RNA顺序是由两种主要种类代表，其长度分别为-4.5Kb和-7.2Kb。这两个种类在聚腺苷酸化了的RNA的强度较总的RNA的强度高，表明4.5Kb种不代表与c DNA探针杂交的28SRNA。因此，图2B所示的β前体c DNA顺序被认为代表4.5Kbm RNA，这表明βAm RNA的5′不转录区长度大约为900核苷酸。βB前体是在大约4.5Kb长的m RNA上编码的，大小大约为两种βAm RNA的一半。由于两种βm RNA是密切相关的，因而可以断定两者m RNAs都具有相似的结构，因此推测βBm RNA具有一段长的5′及3′不转录区域，与βAm RNA显示的相当。不同的聚腺苷酸信号的选择可以解释7.2Kb种类的存在。
转化生长因子-β的同源性
成熟的α及β抑制素亚单位分别含有7个及9个半胱氨酸残基。在半胱氨酸残基的联合上，很明显两个亚单位具有相似的半胱氨酸分布。在这些残基附近存在着顺序的同源性（图4），这就表明两种类型的亚单位来自同一个祖先基因。令人感到惊奇的是，β链与最近测定的人类TGF-β的一级结构之间发现存在明显的同源性。如图4中划线部分所示，两个肽段具有几乎相等的长度（抑制素βA亚单位，116;βB亚单位115;TGFS，116残基），它们的九个半胱氨酸残基的分布也极为相似。通过采用半胱氨酸“骨架”（SKeleton）联合βA和TGF-β顺序，在相同位置上都有31个附加残基，在九个同源位置上变化不显著。对βB与β-TGF进行比较，可以看到相似的高的同源性。引入一些空隙以更好地联合（图4）。总的同源性为35%，但在某些部分（cf.猪抑制素βA链残基11-45及TGF残基15-49）达到60%，这对于不同种的情况同源性是很高的。有趣的是，这一同源性延伸到超过各自c DNAs中蛋白合成的终止密码子范围。因而，在这一区域，TGF-β和两者抑制素β两个亚单位的c DNAs都含有一段高度富含G和C的顺序，并且它们还具有异常长的5′及3′不转录区域。
由于人类β-TGF与鼠的β-TGF之间几乎是绝对同源的，因而人们可能怀疑这样的推想，即抑制素的β亚单位是人类TGF-β的猪等同物。这些发现清楚地表明两种抑制素亚单位和TGF-β具有同一个祖先，并且属于同一个基因家族。所有这三种肽都是来自大小相近的前体（Mr-40K），在其中它们占据了C末端110左右的残基，并且通过在精氨酸对蛋白分解而被释放出来。它们形成同源二聚体或异种二聚体，生物学活性的复合体的亚单元是通过二硫桥联结的。然而，在它们前体的前部中TGF-β及β亚单位顺序之间只有很低程度的顺序同源性，尽管含有位于β亚单位及TGF肽之前的额外残基之间显示出有限的而有意义的顺序相关性。
例2
猪抑制素重组体合成
用于猪抑制素重组体合成的质粒为pSVE-PαBAInh-DHFR组建这一质粒的步骤示于图5。质粒的组建如下所述：
pHBS348-E（EP 0073656A）用Eco RI部分消化，用E.coli DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）及四种d NTP钝化（blunt），经过联结后联结混合物被转化进E.coli in 294（ATCC 31446）。将转化了的培养物置于氨苄青霉素培养基平板上并选择具有抗性菌落。将SV40早启动区前不存在Eco RI位点的质粒筛选出来。缺失了位点的质粒称为pHBS348-EII.。
pHBS348-EII 用EcoRI消化ECORI产生两个片段，片段Ⅰ含有SV40早启动区，pm L-Ampr顺序及HBs Ag3′不转录区和片段Ⅱ含有HBs Ag（乙型肝炎抗原）编码顺序。
含有猪抑制素βA亚单位的编码区的λPINβA5S用EcoRI及SmaⅠ消化，含有βA编码区的1335bp片段（片段3）用聚丙烯酰胺凝胶电源回收。用琼脂糖凝胶电泳得到回收的片段Ⅰ与片段3联结，联结的混合物转化进E.coli294（ATCC31446）。将转化了的培养物置于氨苄青霉素培养基平板上培养，并选择抗性菌落。质粒DNA由转化体制得，并用限制性分析检测以了解正确的DNA片段是否存在。该质粒称为pSVE-pβAInh.。
pHBS348-E（EP 0073656A）用EcoRI部分消化，用E.coliDNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）及四种d NTPs钝化（blunt），并联结至含有SalⅠ识别部位的合成寡核苷酸5′-GGTCGACC-3′上。将这种转化了的培养物置于氨苄青霉素培养基平板上培养并选择抗性菌落。选择含有超（extra）SalⅠ限制性位点的质粒。从这一结构（pHBS348-ESalI）制备质粒PNA。
λPINα-12s及λPINα-2用EcoRI及BamHI.消化。回收来自包含5′编码区的λPINα-12s的104bpEcoRI-BamHI一个片段和来自包含中间及3′编码区域的λPINα-2的一个1246 bp EcoRI-BamHI片段，并且联结在一起。联结混合物再用EcoRI消化，该酶受热变性，然后再与经EcoRI消化的p UC9（BRL）相联结。选择重组体，通过限制性分析来确认。DNA是由正确的质粒（pPINα）制备的。
包含猪α抑制素完全编码区的pPINα，用NcoⅠ及EcoRI消化，在4种dNTP′s存在下，加入Pol（I）K，通过凝胶电泳回收1280bp片段（片段4）。pHBS348-ESalⅠ用SstⅡ及HindⅢ消化，在四种d NTP′s存在的情况下加入Pol（I）K包含PML-Ampγ区，SV40早启动区及HBsAg 3′不转录区的片段5通过凝胶电泳回收。片段4与片段5联结一起后，联结混合物用于转化E.coli 294（ATCC 31446）。重组体是通过在氨苄青霉素培养平板上生长来选择。该重组体称为pSVE-PαInh。
pHBS348-ESalⅠ用SalⅠ及HindⅢ消化，包含有pML-Ampγ及SV40早启动区的片段6是通过凝胶电泳回收。
pFD Ⅱ（EP 117，060A）用SalⅠ及HindⅢ消化，回收的片段7含有与HBsAg3′不转录区域融合的正常小鼠DHFR基因。片段6及7联合之后，联结混合物被用于转化E.coli strain 294（ATCC 31446）。将转化了的培养物置于氨苄青霉素培养基平板上培养，并选择抗性菌落。质粒DNA是由转化体制备，并用限制性分析测定以了解是否存在正确DNA片段。这一结构称为pFDⅡ-SalⅠ。
pSVE-PαInh用SalⅠ消化，回收的片段8含有SV40早启动区及与HBsAg3′-不转录区融合的α-抑制素编码区pFDⅡ-SalⅠ用SalⅠ消化，回收含有SV40早启动区及与HBsAg3′-不转录区域相连的小鼠DHFR编码区的片段9。pSVE-βAInh用SalⅠ消化使之线性化，通过三部分联结与片段8及片段9相结合。联结混合物转化为E.Coli 294（ATCC 31446）将转化了的培养物置于氨苄青霉素培养基平板上培养选择抗性菌落。选择以正确定位存在在片段8及片段9的转化体，以便从三个SV40早启动区的转录可以在同一个方向进行。这种最终质粒称为pSVE-PαβAInh-DHFR。
pSVE-PαβAInh-DHFR质粒转染进DHFR缺乏CHO细胞（Urlaub and Chasin，1980，PNAS77，4216-4220）。然而任何DHFR-脯乳类动物宿主细胞都适于采用此质粒。换而言之，当宿主细胞是用为新霉素抗性编码的质粒共转化时，任何哺乳动物宿主细胞是可用的，转化体是通过检测其在含新霉素的培养基上的生长能力来确认。
将转染CHO细胞是通过在15HGT-培养基中培养来进行选择。让细胞在直径为15厘米的平板上生长。到密集成群收获前，细胞在无血清培养基上培养48小时。在加入100毫克人血清白蛋白之后，将500毫升培养基上清液冻干。残余物在HDMEM中（GIBCO Laboratories，Santa Clara，CA）重新溶解于3m11%牛胎血清，用Millex-GS0.22mM滤器（Millipore COrp.，Bedford，MA）过滤后，进行重复测定。
转化体上清液中的抑制素激素活性是通过在体外用大鼠前垂体单层细胞培养物进行生物测定，Vale，W，et al.Endocrinology，91，562-572（1972）。概括地说，在HDMEM（GIBCO Laboratories，Santa Clara，CA），第一天将收集的生长21天的雌性大鼠的前垂体用酶促分散之后，置于在HDMEM中的10%牛胎血清中，然后置于24-well组织培养板上（Falcon Plastic，Oxnard，CA）。
第二天，将培养基转入在HDMEM中1%牛胎血清，并加入转化突变型培养基样品。继续保温培养48小时。然后收获单层细胞培养基，并利用由The Pituitary Hormone Program of NIADDKD提供的材料进行放射免疫测定（RIA），以确定LH及FSH的含量。在这种生物测定中，与单单取自于保温培养基培养的对照垂体细胞相比较，含有抑制素的CHO细胞培养物抑制FSH的释放但不抑制LH释放。在转化突变型上清液中的猪抑制素数量，经测定为20mg/ml，它显示的剂量反应曲线与纯的猪卵抑制素所得到的曲线相平行。
用夹层式放射免疫测定法检测免疫交叉反应性。通过用掺和Freund完全佐剂的猪抑制素对兔进行二次免疫接种（S.Cimmunization）引起兔产生抗血清来对付猪滤泡抑制素。对抗血清中抗抑制素的存在是利用传统的技术如凝胶过滤进行检测，即将抗血清与纯的猪抑制素一起保温，然后再检测免疫复合物的形成。将一份抗血清加在预先已加在聚苯乙烯试管的山羊抗兔IgG上。然后再将用磷酸缓冲液稀释的转化体培养物上清液或抽提物加入该试管之中，保温过夜并洗涤。将另一份兔抗血清加入试管，保温并洗涤。放射碘化的山羊抗兔IgG加入试管，进行保温后洗去非结合的山羊抗血清。重组方法所产生的抑制素与兔抗血清产生交叉反应是通过在试管上结合的数量超过与未转化宿生细胞的培养基或提取物一起保温的对照组的数量来证明。抑制素与兔抗血清之间发生交叉反应。
例3
人类抑制素载体的组建及人类抑制素
在重组体细胞培养物Ⅰ中的表达，由于发现成熟的猪的βA链和人类βA链是相同的，这就促进了人类抑制素αβA的表达。因而用于表达人类抑制素的载体的组建，可以从例1的质粒pSVE-βA-Inh着手，该质粒含有猪βA编码c DNA。
用放射磷酸标记的猪c DNA编码的α，βA及βB链，对从10μg卵巢mRNA制得的人类卵巢c DNA的λgt10库进行Southern分析。λHINα-2被确认含有人类α抑制素链的编码区。人类α抑制素的杂交克隆优势明显地低于猪α抑制素，以100，000克隆中有1个克隆的比例与α Inh的猪c DNA的685 bp SmaⅠ片段杂交。β链也是稀少的，对于βB克隆大约为βA的3倍（分别为，每1，000，000克隆中1及3）。所有β链克隆都没有完整的长度。它们要补充一个引导（primed）的c DNA库，一般要按照上述的用于猪cDNA的方式装配。通过EcoRI消化回收λ插入物。
质粒pHINα-2用NcoⅠ及SmaⅠ消化，并且通过凝胶电泳回收1049 bp 15片段（片段10）。pPina（例2）用EcoRI及PvuⅡ消化。通过凝胶电泳重回收98bp片段（片段11）。片段10及11与转接体Ⅰ5′CTGCTCCTCTTGCTGTTGGCCCCACGGAGTGGGCATGGCTGCCAGGGCCCGGAGCTGGACC-3′相联结，并与作为转接体Ⅰ的补体的转接体Ⅱ联合。所产生的1208bp片段（片段12）是用Pol（Ⅰ）的Klenow片段及4种dNTP′s处理，然后联结到预先按照例1所述的方式用HindⅢ及SacⅡ限制并端点钝化（blunt-ended）的pHBS348-ESalI上。另一方面，p Pinα用EcoRⅠ及HpaⅡ消化，回收为HpaⅡ部位（即猪的顺序的前21个残基）上游部分编码的片段。此方法中采用的转接体为：
5′CGGAGCTCGACC3′
3′CTCGAGCTGG5′
通过对转化突变型的顺序分析，鉴定含有的片段12的正确取向的质粒pSVE-HαInh。因此这结物（pSVE-HαInh）包含猪的信号顺序的前24个残基以及作为早期人类抑制素的残余部分。质粒pSVE-HαInh用SalI消化。含有SV40启动区及人体抑制素顺序的片段与片段9及用SalⅠ消化的pSVE-βAInh（例2）相联结。最终的质粒称为pSVE-HαβAInh-DHFR1，转染至DHFR缺乏的CHO细胞，并通过例2描述的方式进行选择。培养物的上清液含有具有激素活性的人类抑制素。
例4
人类抑制素载体的组建及人类抑制素在重组体细胞培养物Ⅱ中的表达
这一实例是与例3相似，所不同的是以人类抑制素βB的前顺序用于代替猪的βB前区域。
例3的λgt10库产生了如例3所述的λHTNα2，以及λHINβA-5和-14。后两种噬菌体通过将λHINβA-5的311bp 3Eco R1-Hind Ⅲ片段（片段13）与λHINβA-14的1101bp HindⅢ-HpaⅠ片段（片段14）相联结，然后再将这种混合转联结到用EcoR1-SmaI水解的mp18载体（Biolabs）上，用于组建完整长度的βA编码的cDNA。为合适大小的插入物选择并筛选克隆。含有正确的插入物的mp18载体用DNA聚合酶（Ⅰ）及四种dNTP处理以赋于双链，然后用XbaⅠ（它在mp18聚联结子顺序中裂开）消化，用DNA聚合酶Ⅰ及四种dNTP钝化（blunt），再用EcoR1消化。一个1320bp片段（片段15）与例2中EcoR1-EcoRV片段1相联结。这种联结混合物用于转化E.coli294细胞。克隆用Southern杂交作用来筛选，并通过限制性分析来确证。含有h Inh βA编码顺序的克隆称为pSVE-hum βAInh。一个含有人类βA编码顺序和人类α-抑制素顺序及DHFR基因的质粒，如前概述，是由质粒pSVE-HumβAInh pSVE-HαInh及pFDⅡSalⅠ组建的。来自pSVE-HαInh的SalⅠ片段及包含人类α抑制素的pFDⅡSalⅠ及DHFR基因与用SalⅠ消化的pSVE-HumβAInh相联结，并且对含有这三种基因的克隆进行鉴定。这种质粒称为pSVE-HumαβAInh-DHFR2，被转染至DHFR-CHO细胞中，并通过在ght-培养基上进行培养而被选择。检出24个克隆，在对CHO细胞来说为传统条件下，在ght-培养基中培养2天，让它生长到密集成群，又经过两天，然后采用如上所述的大鼠垂体细胞测定法，测定培养基的抑制素及活性素（Activin）活性。结果发现四个克隆分泌出相当水平的人类αβA抑制素（hαβA-8，12，14及18）。在每个克隆的培养中分泌水平分别为125、125、200及250ng/ml。另一个克隆（hαβA-11），产生了βAβA同源两聚体的活性素（Activin），但是通过生物活性测定检测不到有抑制素，对这种克隆来说培养基中缺乏α链免疫反应活性。克隆hαβA-16仅仅分泌α链，缺乏活性素（activin）及抑制素活性。
例5
人类活性素（Activin）的重组体表达
如Vale等（Id）及Ling等.（Id），所报导，β链A及/或B的同源二聚体及杂二聚体具有对垂体产生与抑制素相反的作用，引起，而不是抑制FSH的分泌。这些统称为活性素的蛋白质是由例4所述的α及β链的共转化突变型产生的。然而，如果最初的转染是通过一个或几个不含α链基因的载体进行的，那么对于合适的转化体的筛选稍微简单一些。通过切去α链基因很容易从上述的载体构成合适的载体。例4中的质粒pSVE-HumβAInh用SalⅠ消化并与含有DHFR基因的片段9（例2）相联结。联合混合物用于转染E.coli294细胞，能够与β链DNA杂交但不能与α链顺序杂交是克隆选择的判断基础。鉴定一个克隆pSVE-HumβAInh-DHFR从它除去α链DNA。如上所述，这一克隆转染至DHFR-CHO细胞。经鉴定证明，转化突变型向培养基分泌活性素（activin）。同样，一个含有β编码顺序（通过将为人类βA的前34个氨基酸编码的DNA与人类βB链的剩下的编码顺序相联结而重新构成）的表达载体很容易组建，然后再用pSVE-HumβAInh-DHFR共转染，以产生杂二聚体。重构成的人类βB基因同样也能用于剩下的质粒以产生αβB抑制素，这种αβB抑制素在体外生物测定中，与αβA形式的抑制素具有相同的生物效力。
尽管本发明仅对发明人目前所知的构成最佳模式的最佳实施例进行描述，但必须明白对于熟悉本领域的人所作的显而易见的各种改变及改进并不超出权利要求书中陈述的本发明的范围。
Claims (42)
1、一种包括(a)构成含有核酸编码的抑制素α链或抑制素β链的载体(b)用此载体转化宿主细胞以及(c)培养转化了的细胞的方法。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的核酸编码的抑制素α链或β链被实用地联接至一个由宿主细胞识别的启动子，并且包括从培养物培养基进一步回收抑制素或β链二聚体。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的细胞是原核生物细胞。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的载体包括为抑制素α链和抑制素β链两者的原始形式编码的核酸。
5、根据权利要求2所述的方法，其特征在于其中所述的细胞是来自多细胞生物的细胞，而且所述的抑制素有激素活性。
6、根据权利要求2所述的方法，其特征在于其中所述的启动子是病毒启动子。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于其中所述的启动子是SV40启动子。
8、根据权利要求3所述的方法，其特征在于其中所述的经回收的抑制素是成熟的猪的或人类的抑制素。
9、根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的载体包括为抑制素β链原始形式编码的核酸，而且成熟的β-链二聚体被回收而无α-链。
10、根据权利要求5所述的方法，其特征在于其中所述的β链是βA链，而且所述的抑制素存在于浓度大于约20毫微克/毫升的培养物培养基中。
11、根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的载体为抑制素原始的α和β链两者编码。
12、根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的核酸为所述的抑制素α或β链的氨基酸序列变异体编码。
13、一种包含完全无未鉴定的人类的或猪的蛋白质的人类的或猪的抑制素的组成。
14、一种包含与天然糖基化无联系的α或βB抑制素前区域的组成。
15、一种包含成熟的抑制素βA或βB链的同型二聚体的组成，此组成无抑制素α链。
16、一种包含具有成熟抑制素βB的成熟的抑制素βA的杂二聚体的组成，此组成无抑制素α链。
17、非染色体DNA编码的抑制素α或抑制素β链。
18、根据权利要求17所述的DNA，其特征在于它无插入的未经翻译的顺序。
19、根据权利要求17所述的DNA，其特征在于它为猪的或人类的抑制素α或β链编码。
20、根据权利要求17所述的DNA，其特征在于它标记了一个可探的部分。
21、根据权利要求17所述的DNA，其特征在于它为所述的α或β链的氨基酸序列变异体编码。
22、一种包含为抑制素α或β链编码的DNA的可复制的载体。
23、根据权利要求22所述的载体，其特征在于其中DNA为猪的或人类的抑制素的α或β链编码。
24、根据权利要求23所述的载体，其特征在于它包括与为抑制素α或β链编码的DNA相联系的病毒启动子。
25、根据权利要求22所述的载体，其特征在于它包括为抑制素α和抑制素β链两者编码的DNA。
26、根据权利要求22所述的载体，其特征在于它包括为抑制β链而不为抑制α链编码的DNA。
27、用包含为抑制素α或抑制素β链编码的可复制的载体来转化的一种宿主细胞。
28、根据权利要求27所述的细胞，其特征在于它是真核细胞。
29、根据权利要求27所述的细胞，其特征在于其中所述的DNA为猪的或人类的抑制素α或β链编码。
30、一种包括抑制素α链前区域序列的无细胞组成无成熟的α链序列。
31、一种无细胞组成包括下列
a）包含抑制素βA链前区域序列
HSAAPDCPSCALAACPKDVPNSQPEMVEAVKKHILNMLHL，PDVTQPVPKAALLNAIRKLHVGKVGENGYVEIEDDIG，
AEMNELMEQTSEIITFAESGTARKTLHFEISKEGJDLSVVERAEVWLFLKVPKANRTRT-KVTIRLFQQQKHPQGSLDTGEEAEEVGCKGERSELLLSEKVVDA，STWHVFPVSSSIQRLLDQGKSSLDVRIACEQCQESGASLVLLG，
或其天然产生的哺乳动物氨基酸序列变异体的多肽，
b）包含抑制素βB链前区域顺序
CTSCGGFRRPEELGRVDGDFLEAV，
JHILSRLQMRGRPNITHAVPKAAMVTALRKLHAGKVREDGRVEIPHLDGHASPGADGQE-RVSEIISFAETDGLASSRVRLYFFISNEGNQNLFVVQASLWLYLKLLPYVLEKGS，VRVKVYFQEQGHGDRWDMVEKRVDLKRSGWHTFPLTEAIQALFERGE，LNLDVQCDSCQELAVVPVFVDPGEESHRPFVVVQARLGDSRHRI，
或其天然产生的哺乳动物氨基酸序列变异体的多肽，
c）包含抑制素α链关区域顺序
KVRALFLDALGPPAVTREGGDPGV，HALGGFTHRGSEPEEEEDVSQAILFPATDAS-CEDKSARGLAREAEEGLFRYMFRPSQHTRSRQVTSAQLWFHTGLDRQGTAASNSSGPLL-GLLALSPQGPVAVPMSLGHAPPHWAVLHLATSALSLLTHPVLVLLLRCPLCTCSARPE-ATPFLVAHTRTRPPSGGERA，
或其天然产生的哺乳动物氨基酸序列变异体的无成熟的α链氨基酸序列的多肽。
32、一种包含抑制β链前区域序列的无细胞组成。
33、根据权利要求32所述的组成，其特征在于其中所述的β链是βA链，且所述的组成无成熟的βA链顺序。
34、根据权利要求32所述的组成，其特征在于其中所述的β链是βB链，且所述的组成无成熟的βB链顺序。
35、根据权利要求31所述的组成，其特征在于其中所述的变异体是相应的猪的氨基酸顺序。
36、根据权利要求31所述的组成，其特征在于其中所述的多肽不伴随着天然的糖基化作用。
37、根据权利要求31所述的组成，其特征在于它是无菌的，且其中所述的多肽还包括免疫原的多肽。
38、一种可与权利要求31的预先确定的多肽结合的抗体。
39、根据权利要求31所述的组成，其特征在于其中所述的多肽是与可探测出的基团相轭合的。
40、根据权利要求39所述的组成，其特征在于其中所述的基团是一种酶、荧光团或放射性同位素。
41、根据权利要求31所述的组成，其特征在于它通过非共价的吸附或与共价交联不能溶解到水不溶的载体。
42、根据权利要求31所述的组成，其特征在于它还包括生理学上可接受的可植入的基质，以控制多肽释放进入动物的组织内。
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