CN1942761A - 芯片实验室用基板 - Google Patents

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Abstract

本发明是以树脂作为基材、用高能量线在其表面上共价键合有亲水性聚合物的芯片实验室用基板，特别是蛋白质处理芯片。根据本发明，可以提供在基材表面没有蛋白质的吸附、具有耐洗涤效果、可以长时间使用的芯片实验室用基板。由于检测噪音减少，所以可以进行微量且高精度的蛋白质分析，能够提供具有微通路的聚合物制的蛋白质电泳用芯片。

Description

芯片实验室用基板
技术领域
本发明涉及一种芯片实验室(lab-on-a-chip)用基板，其在用于蛋白质的结构·功能分析以及使用蛋白质的反应的装置·设备内，进行蛋白质溶液的流动或者反应或者分析。
背景技术
目前，含有用于进行各种化学反应的微通路的芯片，从反应效率、速度、各试剂的观点出发，是一项逐渐被受关注的技术。一般来说，关于在已经被称作为“芯片实验室”的数厘米见方的玻璃制芯片上形成的微通路中进行化学反应·分析的新的分析方法的概念已逐渐得到公认。今后，伴随着生物技术的发展，在生物化学领域，微通路的利用也成为不可缺少的技术，人们特别期待微通路应用于蛋白质的结构·功能分析以及使用蛋白质的反应。
在蛋白质溶液流入微通路时，蛋白质在微通路表面上的吸附成为很大的问题，不仅微小蛋白质大大受到因吸附导致的减少以及结构变化的影响，而且在反复使用回路时，吸附的蛋白质有可能阻塞微小的通路。一般地，为了防止蛋白质的吸附，已知例如在基板表面上涂布聚亚烷基二醇等亲水性聚合物的方法。
例如，公开了在用聚乙二醇和/或2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱聚合物涂布通路而成的芯片、和树脂基板上制作微通路，进行蛋白质的合成·检测的技术(专利文献1)。但是，这些技术正是因为在表面涂布了亲水性聚合物，所以有例如在洗涤时亲水性聚合物容易剥离的缺点。另外，已知将亲水性单体分子浸渍在树脂基板上后，通过涂布引发剂进行聚合来抑制蛋白质的吸附的技术(专利文献2)，但是在该情况下，基板与聚合物也不形成共价键，从而导致基板壁面的亲水性聚合物脱落。
作为使亲水性聚合物共价键合在表面上的例子，有通过在聚二甲基硅氧烷的表面照射紫外光而使聚亚烷基二醇与其共价键合的方法(非专利文献1)。但是，为了在硅含量低的聚合物表面共价键合聚亚烷基二醇，进而需要照射高能量线，在该情况下，由于基板变色，所以不适合作为分析用途。进而，聚二甲基硅氧烷很难注射成型，很难加工成具有微通路的芯片，并进行大量生产。另外，至今在芯片的加工中使用的大部分聚合物是硅的含有率低的聚合物，对于这些聚合物，使用现有的照射紫外光的方法将表面进行接枝化在技术上是困难的。
另外，已知通过在聚合物基板表面以静电的方式涂布聚亚烷基二醇，来抑制蛋白质吸附的方法(非专利文献2)。但是，在该方法中聚亚烷基二醇与基板的结合力弱，当用溶剂洗涤时，较多量的聚亚烷基二醇脱落下来。因此，在由聚合物基板构成的具有微通路的芯片的通路壁面上仅以静电的方式涂布聚亚烷基二醇，不能进行蛋白质的分离·泳动。
专利文献1：特开2003-334056号公报
专利文献2：特表2001-500971号公报
非专利文献1：ヒユ一(Hu Shuwen)等5人“通过紫外光聚合物接枝化进行的聚二甲基硅氧烷微通路基板的表面修饰(Surface Modificationof Poly(dimethylsiloxane)Microfluidic Devices by Ultraviolet PolymerGrafting)”アナリテイカル·ケミストリ一(Analytical Chemistry)2002年、74卷、16号、p4117-4123
非专利文献2：シ一(Si Lei)“使用黏蛋白型蛋白质来模拟生物体的生物材料表面(Biomimetic Surfaces of Biomaterials Using Mucin-TypeGlycoproteins)”トレンド·イン·グリコサイエンス·アンド·グリコテクノロジ一(Trends in Glycoscience and Glycotechnology)2000年、12卷、66号、p229-239
发明内容
本发明是一种以硅的含有率按重量比计为10％以下的树脂作为基材、在其表面共价键合了亲水性聚合物的芯片实验室用基板。
附图说明
[图1]具有微通路的蛋白质泳动用芯片的模式图。
[图2]使用没有共价键合聚乙二醇的蛋白质泳动用芯片，使荧光标记泳动时的电泳图。
[图3]使用共价键合了聚乙二醇的蛋白质泳动用芯片，使荧光标记蛋白质泳动时的电泳图。
[图4]将共价键合了聚乙二醇的蛋白质泳动用芯片通路用10当量的盐酸洗涤后，使荧光标记蛋白质泳动时的电泳图。
[图5]将共价键合了聚乙二醇的蛋白质泳动用芯片通路用10当量的氢氧化钠洗涤后，使荧光标记蛋白质泳动时的电泳图。
[图6]使用通过照射5.0kGy的γ射线而共价键合了聚乙二醇的蛋白质泳动用芯片，使荧光标记蛋白质泳动时的电泳图。
[图7]使用通过照射10.0kGy的γ射线而共价键合了聚乙二醇的蛋白质泳动用芯片，使荧光标记蛋白质泳动时的电泳图。
具体实施方式
本发明是一种以硅的含有率按重量比计为10％以下的树脂作为基材、在其表面共价键合了亲水性聚合物的芯片实验室用基板。
在本发明中，所谓树脂是指聚合物的单一材料、混合材料或它们的改性物，或者在由这些聚合物材料与玻璃、金属、碳材料等的混合或者复合得到的材料中包含的聚合物材料。作为合成聚合物，可以使用热塑性聚合物和热固性聚合物的任意一种。作为合成法，可以列举出各种的方法，在本发明的聚合物材料中，含有利用这些方法中的任何一种方法得到的合成聚合物。可以列举出例如，(1)加聚物：选自烯烃、烯烃以外的乙烯基化合物、亚乙烯基化合物和其他的具有碳-碳双键的化合物中的单体的均聚物或者共聚物、或者这些均聚物或共聚物的混合物或改性物、(2)缩聚物：聚酯、聚酰胺等、或者这些聚合物的混合物或改性物、(3)加成缩合物：酚树脂、脲树脂、三聚氰胺树脂、二甲苯树脂等、或者这些聚合物的混合物或改性物、(4)加聚生成物：聚氨酯、聚脲等、或者这些聚合物的混合物或改性物、(5)开环聚合物：环丙烷、环氧乙烷、1，2-环氧丙烷、内酯、内酰胺等的均聚物或者共聚物、或者这些均聚物或者共聚物的混合物或改性物、(6)环化聚合物：二乙烯基化合物(例如：1，4-戊二烯)或二炔化合物(例如：1，6-庚二炔)等的均聚物或者共聚物、或者这些均聚物或共聚物的混合物或者改性物、(7)异构化聚合物：例如乙烯与异丁烯的交替共聚物等、(8)电解聚合物：吡咯、苯胺、乙炔等的均聚物或共聚物、或者这些均聚物或共聚物的混合物或者改性物、(9)醛或酮的聚合物、(10)聚醚砜、(11)多肽、等。作为天然聚合物，可以列举出纤维素、蛋白质、多糖类等的单一物或混合物、或者它们的改性物等。
在本发明中，作为基材使用的树脂特别优选使用上述的加聚物。对构成加聚物的单体没有特别限定，但是作为烯烃，可以适当使用乙烯、丙烯、1-丁烯、1-戊烯、1-己烯、4-甲基-1-戊烯、1-辛烯等任意的α-烯烃的均聚物或者它们的2种以上的共聚物、或者这些均聚物和/或共聚物的混合物。在本发明中，所谓烯烃以外的乙烯基化合物是指具有乙烯基的化合物，可以列举出例如，氯化乙烯、苯乙烯、丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸或者甲基丙烯酸的酯、乙酸乙烯酯、乙烯醚类、乙烯基咔唑、丙烯腈等。所谓烯烃以外的亚乙烯基化合物是指具有亚乙烯基的化合物，可以列举出例如，1，1-二氯乙烯、1，1-二氟乙烯、异丁烯等。作为除烯烃、乙烯基化合物、亚乙烯基化合物以外的具有碳-碳双键的化合物，可以例举出马来酸酐、均苯四酸酐、2-丁烯酸、四氟乙烯、三氟氯乙烯等，和含有2个以上的双键的化合物，例如，丁二烯、异戊二烯、氯丁二烯等。
在本发明中，作为基材使用的树脂优选是加聚物，所述加聚物可以适当使用这些单体的均聚物或2种以上的单体的共聚物或者这些聚合物的混合物。特别优选聚乙烯、乙烯与其他的α-烯烃的共聚物、聚丙烯、丙烯与其他的α-烯烃的共聚物。作为共聚物，包含无规共聚物、嵌段共聚物。作为除聚烯烃以外的聚合物材料，优选使用选自除烯烃以外的乙烯基化合物、亚乙烯基化合物和其他的具有碳-碳双键的化合物中的至少1种的单体的均聚物或者共聚物，例如，聚甲基丙烯酸酯树脂、聚丙烯酸酯树脂、聚苯乙烯、聚四氟乙烯、乙烯腈共聚物(丙烯酸系纤维和它们的成型物、ABS树脂等)、含有丁二烯的共聚物(合成橡胶)等，以及聚酰胺(包括以尼龙为首的脂肪族聚酰胺和芳香族聚酰胺)、聚酯(包括聚对苯二甲酸乙二酯或脂肪族和全芳香族聚酯)、聚碳酸酯、聚氨酯、聚苯甲酸酯、聚醚砜、聚缩醛、各种合成橡胶等。
其中，作为本发明的基材，特别优选以聚烯烃、聚酰亚胺、聚碳酸酯、多芳基化合物、聚酯、聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯等的聚甲基丙烯酸系树脂、聚酰胺、聚砜系树脂、纤维素系树脂等的聚合物化合物作为主成分的基材，在将其作为基材的芯片中，效果可以得到发挥。其中，特别是在具有聚砜系树脂、聚甲基丙烯酸系树脂、聚丙烯腈、聚酰胺、纤维素系树脂的芯片中，可以特别显著地发挥效果。
在本发明中，对于作为基材使用的树脂，当硅的含有率增高时，树脂变得柔软，芯片的刚性降低，所以在将树脂加工成微通路等时，有时由于压力等的外部的力而导致变形，因此使用硅的含有率为10％以下的树脂。这里所谓的硅的含有率，是指将树脂中的总分子量作为分母，树脂中的硅的总原子量作为分子时的比例。
在本发明中，共价键是指2个原子共有电子而形成的键，是指具有σ键、π键、其他的非定域共价键和/或其他的共价键类型的键。
本发明的共价键合了亲水性聚合物的芯片实验室用基板具有以下那样的效果。
第一，具有耐洗涤效果。作为芯片的成型方法，有注射、反应注射、真空、真空热压、模压(stamping)、压缩、挤出、发泡、吹塑、粉末、浇铸等。当使用这些成型方法时，有可能在微通路上粘附脱模剂、单体、引发剂等的杂质，使得在使用芯片实验室时，需要通过预先洗涤来除去这些杂质。在涂布的情况下，由于洗涤而使涂布在表面上的亲水性聚合物等脱落。但是，在共价键的情况下，即使进行多次的洗涤，表面的亲水性聚合物等也不脱落。
第二，检测噪音减少。作为使本发明的芯片实验室中的检验样品移动的方法，有利用压力、浓度、电场、磁场的差异，或者梯度的方法、利用表面力的方法、利用惯性力的方法和这些方法的组合。当用这些方法使被检测样品泳动时，在表面上仅是涂布了亲水性聚合物的情况下，亲水性聚合物脱落。因此，当检测蛋白质时，被检测样品以外的物质也作为噪音被检测出来，从而不能进行正确的分析。但是，当亲水性聚合物形成有共价键时，由于亲水性聚合物不脱落，所以可以减少噪音。
第三，具有长时间使用效果。在本发明中，蛋白质分析时间通常优选在5分钟以内，进而优选在3分钟以内，但是没有特别限定，因此根据情况，可以进行长时间，例如30分钟以上的分析。对于涂布亲水性聚合物的情况，长时间的使用会导致表面的亲水性聚合物脱落。但是，对于本发明这样的进行了共价键合的情况，即使长时间使用，表面的亲水性聚合物也不脱落。
在本发明中，所谓亲水性聚合物，是指水溶性聚合物或者不易溶于水但具有亲水性的聚合物。作为具体的例子，可以列举出聚乙烯醇、羧甲基纤维素、乙烯-乙烯醇共聚物、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚α-羟基乙烯醇、聚丙烯酸、聚α-羟基丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇或聚丙二醇等的聚亚烷基二醇、马铃薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉等的淀粉、葡甘露聚糖、绢丝心蛋白、绢丝胶蛋白、琼脂、明胶、蛋清蛋白质和藻酸钠等。另外，也可以使用这些聚合物的磺化物。
作为本发明的亲水性聚合物，优选聚亚烷基二醇。作为聚亚烷基二醇，例如有以聚乙二醇或聚丙二醇为代表的、在主链中含有氧原子的链状聚合物，也可以是聚亚烷基二醇接枝而成的聚合物。对聚亚烷基二醇的分子量没有特别限定，用数均分子量表示为600～4000000，当考虑蛋白质对芯片吸附抑制能时，优选使用数均分子量为10000～1000000程度的聚亚烷基二醇。
对于本发明的芯片实验室用基板，优选用高能量线使亲水性聚合物共价键合在基材的表面而成的基板。
在本发明中，为了用高能量线使亲水性聚合物共价键合在基材的表面，例如，首先使芯片在亲水性聚合物、优选聚亚烷基二醇的溶液中浸渍或者接触后，照射γ射线或电子束等的高能量线。当使用聚亚烷基二醇溶液作为亲水性聚合物时，对聚亚烷基二醇溶液的温度没有特别的限定，优选0℃～30℃，进而优选10℃～25℃。另外，对形成聚亚烷基二醇溶液的溶剂也没有特别限定，作为良溶剂，可以使用水、甲醇、乙醇、丙酮等，从成本方面、安全方面出发，优选使用水。
在本发明中，所谓高能量线是指具有某种恒定能量的能量线，微波、红外线、可见光线、紫外线、X射线、γ射线、电子束、质子束、中子束也包括在高能量线中。其中，γ射线是指其波长为10-12～10-15m的能量线。在本发明中，由于作为基材使用的树脂的硅的含有率为10％以下，所以在这些高能量线中，优选可以将亲水性聚合物直接接枝在树脂基板上的γ射线。
对高能量线的照射量没有特别地限定，只要是在欲赋予蛋白质吸附抑制能的芯片或者微通路表面上将聚亚烷基二醇链固定化的照射量即可，当使用γ射线时，作为吸收能量，通常使用100kGy以下，优选40kGy以下，进而优选树脂基板黄变所导致的对被检测样品检测的影响小的10kGy以下。
在本发明中，所谓芯片实验室，是指对于溶液样品，能够在基板上进行反应、分离、精制、检测等各种科学操作这样的集成化、芯片化了的产物。利用这些技术，可以实现超高灵敏度分析、超微量分析、超多种项目同时分析等。作为一个例子，可以列举出通过微通路将蛋白质合成部、蛋白质精制部、蛋白质检测部连接在一起而成的芯片。另外，在本发明中，所谓芯片实验室用基板，包括芯片实验室自身、只含有一种上述部位的基板、仅有微通路的基板，或者没有微通路仅有基板的基板。
对于本发明的芯片实验室用基板，对在基板上结合亲水性聚合物的部没有特别地限定，但是优选使蛋白质合成部、蛋白质精制部、蛋白质检测部、微通路壁面中的一个以上的部位亲水化。也可以仅仅在蛋白质处理芯片的通路上结合亲水性聚合物。
对于本发明的芯片实验室用基板，蛋白质合成部的深度的范围，是蛋白质合成槽内的反应液充足、可以进行蛋白质合成的深度以上、可以在基板上设置合成槽的深度以下，优选的范围是1μm～1000μm。另外，作为下限，进而优选20μm以上。纵·横尺寸的优选的范围是10μm～5000μm。作为下限，进而优选50μm以上。特别优选的范围是200μm～2000μm。
作为在蛋白质合成槽中加入的反应液，可以使用在众所周知的大肠菌提取物或小麦胚芽提取物、兔网织红细胞提取物(在提取液中，含有蛋白质合成所必须的核糖体、氨酰tRNA合成酶、各种可溶性翻译因子群)中，添加缓冲液、作为蛋白质合成原料的氨基酸、作为能量源的ATP、GTP等而形成的液体。
对蛋白质精制部分的宽度、深度优选的范围没有特别地限定，只要是蛋白质精制用的载体可以进入的大小即可。
对蛋白质精制用的载体的种类没有特别地限定，包括玻璃(包括修饰或功能化了的玻璃)、塑料(包括丙烯基、聚苯乙烯以及苯乙烯与其他的材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、氟树脂等)、多糖类、尼龙或者硝酸纤维素、树脂、二氧化硅或者含有修饰聚硅氧烷的二氧化硅母体材料、碳、金属等。
在蛋白质检测部中，可以使用蛋白质的电泳等。作为具体的方法，可以使用琼脂糖凝胶电泳、将检测部的微通路作为毛细管来使用的毛细管电泳法、等电点电泳、SDS-PAGE、Native-PAGE、μ-CE、微芯片电泳等。在本发明中，特别优选使用的是SDS-PAGE。具体的方法通过下述操作来实现，即，向从蛋白质合成部、蛋白质精制部在微通路中运送的蛋白质溶液中，加入尿素、SDS(十二烷基磺酸钠)、2-巯基乙醇等，破环蛋白质的立体结构使其变性，进而在微通路中进行PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)。
该检测用电泳，优选利用在与具有蛋白质合成部、蛋白质精制部的芯片为同一芯片上的集成芯片(on-a-chip)电泳法来进行。由此，可以在一个芯片上进行合成、精制、检测的全过程。另外，通过使用集成芯片电泳，能够缩短电泳的时间，可以将合成·检测一连串的操作高生产率化。
微通路可以通过将形成了凹部的板状基材与其他的基材接合来制作。或者也可以利用具有贯穿了的缝隙形状的薄膜和将其夹在中间的至少2个基材来制作。基材可以采用片状、板状、膜状、棒状、管状、涂膜状、圆筒状、其他复杂的形状的成型物，但是并不限定于此。从加工性和操作的容易程度出发，优选片状、板状、膜状。
在本发明中，所谓蛋白质处理芯片，是指具有通过蛋白质的泳动来分析分子量、亲合力、电特性等蛋白质性质的功能的芯片。另外，该芯片也能够用于蛋白质的合成、精制、染色，可以实现吸附抑制效果。另外，蛋白质处理芯片也包括在芯片内含有微通路的芯片。
蛋白质在目前的玻璃制或塑料制蛋白质处理芯片上的吸附经过短时间的接触就可以发生，在低浓度范围(约1ng～100μg/ml)下，其吸附率(在接触了的蛋白质溶液中的蛋白质中，内吸附的蛋白质的比例)最大达到约50％，一次吸附了的蛋白质发生不可逆的结构变化(变性)，变性了的蛋白质诱发二次的蛋白质的吸附，作为结果，形成了蛋白质的多层吸附层。为了防止这种结果，通过用亲水性聚合物特别是聚亚烷基二醇涂布蛋白质溶液接触的表面，降低作为引起蛋白质吸附的最大原因的疏水性相互作用，可以抑制蛋白质的吸附。
在本说明书中，所谓蛋白质是指具有多个氨基酸通过肽键被连接起来的结构的化合物，也包括天然来源物、合成物和短链的肽。作为构成成分，除氨基酸以外，也可以含有糖、核酸、脂质。
在本发明中，作为能够分析的蛋白质，没有特别地限定，可以分析天然来源物、合成物、以及含有氨基酸以外的构成成分的核蛋白质、糖蛋白质、脂蛋白等，但特别优选使用水溶性蛋白质。关于可以测定的分子的大小，通过适当设定标志物，可以分析所有大小的蛋白质。对可以使用本发明的芯片进行分离的蛋白质的分子量范围没有特别限定，优选为10kDa～200kDa，进而优选14kDa～140kDa的范围。另外，膜结合的蛋白质等优选在可溶化后应用于本发明的电泳法。为此而进行的可溶化处理，通过使用盐溶液或EDTA等的鳌合剂进行超声波等的机械处理、或者使用表面活性剂的处理等来实现。
作为在本发明的电泳法中使用的分离用载体，没有特别地限定，可以列举出，在通常的毛细管凝胶电泳或者微芯片型凝胶电泳等中用作蛋白质分子大小分离分析的、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺凝胶、羟丙基纤维素、羟甲基丙基纤维素、羟乙基纤维素、甲基纤维素、β-环糊精、α-环糊精、γ-环糊精等的分离用载体，另外，也可以适用于PCT/JP01/04510记载的含有β-1，3葡聚糖结构的凝胶多糖(Curdlan)、海带多糖或海藻提取物等。作为分离用载体的添加剂，可以列举出十二烷基磺酸钠(SDS)、TritonX-100、ε-氨基己酸、3-[(3-胆酰胺丙基)-二甲基氨基]-1-丙烷、CHAPS、6～8M尿素、四甲基乙二胺(TEMED)、己基三甲基溴化铵(HTAB)、十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)等。
作为泳动用缓冲液，可以列举出例如，Tris-甘氨酸缓冲液、Tris-硼酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、Tris-三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液、Tris-磷酸二氢钠缓冲液等，但一般也可以使用作为蛋白质的电泳用缓冲液来使用的缓冲液、或市售的蛋白质电泳用试剂盒中提供的缓冲液等。上述泳动用缓冲液一般可以按照作为蛋白质的电泳用缓冲液使用时的浓度来使用。
泳动用缓冲液也可以含有上述分离用载体。通过将分离用载体添加到泳动用缓冲液中来使用，可以简便地进行操作，能够以更高的速度进行分析。
从适当的电渗透流和蛋白质的合适的电泳的观点出发，泳动用缓冲液的pH优选为2.0～9.0，更优选为6.8～8.6。
作为样品调制用溶液，可以使用水、SDS溶液、或者在SDS-Tris硼酸溶液等中添加2-巯基乙醇或者二硫苏糖醇而形成的溶液。从峰强度的提高、峰分离度的提高、检测限的提高、测定精度的提高的观点出发，特别优选水。作为水，可以使用超纯水、去离子水、MilliQ水等的、在蛋白质电泳中通常被使用的水，特别优选MilliQ水。
另外，将水作为样品调制用溶液来使用时，从峰强度的增强、检测限的提高的观点出发，优选使蛋白质溶解在水中。
作为样品溶液中的蛋白质的浓度，没有特别限定，从测定精度的观点出发，优选为0.05～2000ng/μl，更优选为0.1～2000ng/μl，特别优选为0.5～200ng/μl。
作为使用了本发明芯片的电泳法能够被使用的优选的形态，可以列举出毛细管电泳、微芯片型电泳和纳米通道型电泳。
毛细管电泳通常是在内径为1000μm以下的毛细管内填充泳动用缓冲液，在一端侧导入样品后，在两端间外加高电压，从而使被检测的蛋白质在毛细管内展开。
对于在毛细管电泳中使用的毛细管，对其内径、外径、全长、有效长度没有特别地限定，可以使用通常使用大小的毛细管。关于有效长度，从能够高速分析的观点出发，可以使用短的有效长度的毛细管。这里，毛细管的有效长度是指从样品注入口到检测部的距离。
在微芯片型电泳中，使用了一种微芯片，其配备了导入用通路和与该导入用通路交叉的分离用通路，且在该导入用通路的一端配置了样品贮存器，在该导入用通路的另一端配置了出口。
在微芯片型电泳的形式下，本发明的电泳法，具体地可以利用含有下述工序的过程来进行，所述工序为：不使含有蛋白质的样品热变性、向样品贮存器供给样品的工序；将该样品贮存器中的样品导入到分离用通路中的工序；和在分离用通路中使样品泳动的工序。
向样品贮存器供给样品的工序，更具体地，通过在导入用通路的一端的样品贮存器和另一端的出口施加电压来完成。电压的强度根据装置而有所不同，在SV1100(日立电子社制)的情况下，为50～800V，通常施加300V的电压。由此，样品被供给到导入用通路与分离用通路的交叉部。
将样品贮存器中的样品导入到分离用通路中的工序，更具体来说，同时完成了下述2个工序，所述工序为：在导入用通路的一端的样品贮存器和其另一端的出口施加挤压电压(squeezing voltage)，从而将多余的样品排出到样品贮存器和其另一端的出口侧的工序，以及在分离用通路的出口侧和其相反侧上施加分离电压的工序。电压的强度可以根据装置适当选择，例如，在SV1100(日立电子社制)的情况下，前者可以达到130V左右，后者可以达到700～900V。另一方面，PCT/JP01/04510记载的方法也可以适用。
在微芯片型电泳中，微芯片的大小例如为纵向10～120mm、横向10～120mm、厚度500～5000μm。
对微芯片中的导入用通路和分离用通路的各自的形状没有特别限定。另外，也可以使用在1个芯片上设置了3～96条上述通路的、能够同时分析多通路的芯片。多通路的排列方向有并列、辐射状、圆形状等，但对其形状没有特别的限定。
上述微芯片的分离通路的宽度、深度，可以根据微芯片的大小、使用目的等适当设定。具体地，从得到充分的分析灵敏度的观点出发，微通路的宽度为0.1μm以上，优选为10μm以上，从得到充分的分析精度的观点出发，微通路的宽度为1000μm以下，优选为500μm以下。另外，上述微通路的深度可以根据微芯片的大小、使用目的等适当设定。具体地，从得到充分的分析灵敏度的观点出发，该深度为0.1μm以上，优选为10μm以上，从得到充分的分析精度的观点出发，该深度为1000μm以下，优选为500μm以下。进而，上述分离用通路的长度可以根据微芯片的大小、分析对象的化合物来适当选择，但是优选为使有效长度更长。有效长度是指从通路交叉部到聚合物化合物的检测点(配置在分离用通路上)的距离。从得到充分的分离能力的观点出发，该有效长度为0.1mm以上，优选为10mm以上，从高速分离的观点出发，该有效长度为100mm以下，优选为50mm以下。
另外，上述贮存器的大小可以根据样品的容量适当设定。具体地，从样品导入的处理和电极的粗细度的观点出发，贮存器的直径适合为0.05mm以上，优选为4mm以下。
从得到良好的分离能力、缩短泳动时间的观点出发，微芯片型电泳中的泳动电场适合为20V/cm～50kV/cm，优选为50V/cm～20kV/cm，更优选为100V/cm～10kV/cm。
所谓纳米通道型电泳，是指使用形成有下述通路的芯片来进行的电泳，所述通路具有纳米尺寸、1nm～1μm、优选为10～500nm、更优选为50～100nm的通路宽度。其中包括在微米大小的通路中形成上面所述的纳米尺寸的结构体的电泳。对纳米尺寸的结构体的形状没有特别地限定，例如可以使用四方、圆、三角等的形状，对结构体的设置间隔也没有特别的限定。可以使用形成了上述结构体的纳米通道芯片。与毛细管电泳的情况同样，也包括可以同时进行多通路分析的芯片。
对于在纳米通道型电泳中的通路，具有尺寸为纳米这样特征的通路的形状弯折有曲率，可以有蛇行状、曲折状或者它们的组合等各种设计。由此，在微小的尺寸内可以形成很多的通路。另外，由此可以一次处理大量的样品，从而可以实现高生产率化。另外在微米大小的通路中形成有纳米尺寸的结构体的情况下，具有可以自由地改变其形状、其设置间隔也能够自由改变的优点。可以同时进行多个通路的测定。
在纳米通道型电泳中，与微芯片型电泳同样，也含有导入用通路、与该导入用通路交叉的分离用通路、在该导入用通路的一端配置的样品贮存器、在该导入用通路的另一端配置的出口，但是对形状没有特别地限定。
纳米通道型电泳中的纳米通道芯片的大小，可以使用与微芯片同样的大小。例如纵向10～120mm、横向10～120mm、厚度500～5000μm。纳米通道芯片的通路的深度、通路的长度、贮存器的大小等以微芯片为标准。
作为供给于电泳的蛋白质的检测方法，可以列举出例如，利用由UV波长光引起的吸收、荧光、激光、灯、LED等进行的检测、电化学的检测、化学发光检测等。具体地，在蛋白质或者肽的情况下，可以通过下述方法检测蛋白质或者肽，即，通过测定在200nm下的吸收；使SYPRO Orange与蛋白质或肽反应、在460～550nm使其激发，在550～650nm下测定荧光；使蛋白质与荧光标志物(AgilentTechnologies No.5065-4430)反应，在630～650nm使其激发，在670～700nm下测定荧光；或者使蛋白质与荧光标志物(Molecular Probes Alexa633)反应，在550～650nm使其激发，在640～700nm下测定荧光；或者通过电化学测定、化学发光测定等来检测。
在毛细管电泳中，例如，在毛细管的出口处，可以设置能够发出UV波长光的装置和该UV波长光的检测器，或者也可以设置能够发出荧光波长的装置和能够检测该荧光波长的检测器。
在微芯片型电泳中，例如，可以在配置于分离用通路上的检测点处设置UV波长光的检测器，或者，也可以设置能够发出荧光波长的装置和能够检测该荧光波长的检测器。另外，可以同时检测多个通路。
在纳米通道型电泳中，可以使用与微芯片型电泳的情况同样的检测器、检测方法。进而，在纳米通道型电泳中，当同时进行多个通路的检测时，可以同时检测比微芯片型电泳的情况更多的样品。
在检测时，在进行蛋白质、肽、氨基酸等的鉴定的情况下，可以通过UV吸收、分子量标志物、与标准品的迁移时间的比较、质谱的分析等来进行。
本发明的蛋白质处理芯片，不仅可以是泳动部，也可以是在无细胞系下的蛋白质的生成、精制、染色部。
对于本发明的蛋白质处理芯片，在形成基材的树脂上也可以含有或者涂布黑色物质。这里所谓的黑色，是指在可见光(波长从400nm到800nm)的范围下，黑色部分的光谱反射率不具有特定的光谱图形(特定的峰等)，是一样低的值，且黑色部分的光谱透射比也不具有特定的光谱图形，是一样低的值。
作为该光谱反射率、光谱透射比的值，优选可见光(波长从400nm到800nm)范围的光谱反射率为7％以下，在同波长范围下的光谱透射比为2％以下。另外，这里所谓的光谱反射率，是指在适合JIS Z 8722条件C的照明·受光光学系统中，摄入从基材发出的正反射光时的光谱反射率。
作为变成黑色的方法，可以通过使基材、绝缘材料含有黑色物质来实现。该黑色物质只要是反射光或者难以透射光的物质即可，没有特别地限定，如果列举优选的物质，则可以使用炭黑、石墨、钛黑、苯胺黑、或者Ru、Mn、Ni、Cr、Fe、Co和/或Cu的氧化物、或者Si、Ti、Ta、Zr和/或Cr的碳化物等的黑色物质。
这些黑色物质可以单独含有，另外也可以混合含有2种以上。例如，当基材、绝缘材料为聚对苯二甲酸乙二酯、醋酸纤维素、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、硅树脂等的聚合物时，其中的黑色物质，优选含有炭黑、石墨、钛黑、苯胺黑，特别可以优选使用炭黑。在玻璃、陶瓷的无机材料的情况下，可以优选含有Ru、Mn、Ni、Cr、Fe、Co和/或Cu的氧化物、Si、Ti、Ta、Zr和/或Cr的碳化物。
在本发明中，所谓泳动是指通过利用压力、浓度、电场、磁场的差异或者梯度的方法、利用表面力的方法、利用惯性力的方法和这些方法的组合，而使被检测物质在微通路中迁移的方法。利用该方法，可以分析被检测物质的分子量、亲合性、电特性等的蛋白质的性质。
在本发明中，所谓电渗透流，是指当微通路壁因带电荷的物质例如十二烷基磺酸钠等而带电时，为了保持壁面附近的电中性，溶液中的相反符号的离子例如钠离子等在壁面附近聚集，形成电双层，此时，当在微通路中加入电荷时，通路中的离子与电双层的离子相排斥而产生的流动。通过使本发明的亲水性聚合物共价键合在微通路壁面上，可以抑制微通路内的电渗透流，在微通路内进行电泳。
就本发明的蛋白质处理芯片而言，可以使用下述物质作为被检测材料，所述物质是：作为用于诊断人的疾患的临床检体的咳痰、唾液、尿、粪便、精液、血液、组织、脏器或者其他的体液，或者用于这些体液的分级、微生物污染检查的食品、饮料水、土壤、废水、河川水、海水、擦拭液、擦拭棉。另外，也可以使用菌体的培养液、或在固体培养基上培养的菌体(菌落)。
实施例
通过以下的实施例进而具体地说明本发明，但是本发明的范围不限定于这些实施例。
实施例1
将大小20×60mm、厚度0.2mm的聚甲基丙烯酸甲酯的基板浸渍在分子量500000、2000ppm的聚乙二醇水溶液中。密封浸渍过的聚甲基丙烯酸甲酯板，照射2.5kGy的γ射线，进行接枝化。对γ射线照射过的基板进行干燥，贴附于在透光部位开孔了的荧光板。在贴附的荧光板上，将稀释至10μg/ml的FITC标记BSA蛋白质和IgG蛋白质的水溶液在室温下进行10分钟的固层化，除去溶液后，用磷酸缓冲液(PBS)洗涤，测定荧光强度。
比较例1
对大小20×60mm、厚度0.2mm的聚甲基丙烯酸甲酯的基板不照射γ射线，贴附于在透光部位开孔了的荧光板，将稀释至10μg/ml的FITC标记BSA蛋白质和IgG蛋白质的水溶液在室温下进行10分钟的固层化，除去溶液后，用磷酸缓冲液洗涤，将其作为比较例1。
参考例
对大小20×60mm、厚度0.2mm的聚甲基丙烯酸甲酯的基板不照射γ射线，贴附于在透光部位开孔了的荧光板，将1mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)磷酸缓冲溶液在室温下进行1小时的固层化，用磷酸缓冲液洗涤后，将稀释至10μg/ml的FITC标记BSA蛋白质和IgG蛋白质的水溶液在室温下进行10分钟的固层化，除去溶液后，用磷酸缓冲液洗涤，将其作为参考例。该参考例是涂布亲水性聚合物的方法，由于亲水性聚合物脱落，所以作为芯片实验室是不实用的，但是可以将其作为能够抑制蛋白质吸附的现有的方法，与本发明比较。
实施例1、比较例1、参考例中残留在芯片中的蛋白质的测定结果示于表1。表中的数值为荧光强度，数值越小，表示蛋白质的吸附越少。
对于用γ射线使聚乙二醇共价键合在树脂基板上的实施例1，与没有用γ射线进行共价键合处理的比较例1相比，蛋白质的吸附可以抑制为1/4～1/6。从该结果可以确认，本发明与作为参考例的现有的方法相比，具有同等程度的蛋白质的吸附抑制效果。
[表1]
  蛋白质吸附量(荧光强度)
  荧光标记BSA  荧光标记IgG
  实施例1   1.489   1.245
  比较例1   5.889   9.637
  参考例1   1.408   1.218
将这些材料加工成通路直径0.04×0.1mm、长度10cm的微通路，蛋白质通过时的蛋白质的回收率示于表2。表中的数值越大，表示蛋白质吸附被抑制的程度越大，回收量就越高。
对于用γ射线使聚乙二醇共价键合在树脂基板上的实施例1，与没有用γ射线进行共价键合处理的比较例1相比，蛋白质在微通路内的荧光标记BSA蛋白质的回收率约提高20％，荧光标记IgG蛋白质的回收率约提高30％。
[表2]
  蛋白质回收率(％)
  荧光标记BSA  荧光标记IgG
  实施例1   0.923   0.936
  比较例1   0.729   0.596
  参考例1   0.927   0.937
实施例2
在具有宽度100μm×深度60μm×长度50cm的微通路的聚甲基丙烯酸酯基板的微通路中，填充分子量为500000、2000ppm的聚乙二醇水溶液，照射2.5kGy的γ射线，进行接枝化。照射后，取出微通路中的聚乙二醇水溶液，用精制水洗涤。在微通路中注入来自大肠菌的无细胞蛋白质合成反应液后，在30℃下放置1小时，来合成氯霉素乙酰基转移酶(CAT)，氯霉素乙酰基转移酶是将乙酰基从乙酰CoA转移至氯霉素的3’-羟基、分子量为26000的酶。回收在微通路中合成的CAT蛋白质，用ELISA法进行定量，作为实施例2。
比较例2
用精制水将具有宽度100μm×深度60μm×长度50cm的微通路的聚甲基丙烯酸酯基板的微通路进行洗涤。将来自大肠菌的无细胞蛋白质合成反应液注入微通路后，在30℃下放置1小时，来合成CAT蛋白质。回收在微通路中合成的CAT蛋白质，用ELISA法进行定量，作为比较例2。
比较在实施例2、比较例2中合成的蛋白质的量，结果示于表3。
对于用γ射线使聚乙二醇共价键合在树脂基板上的实施例2，与没有用γ射线进行共价键合处理的比较例2相比，蛋白质的合成量变为大约2倍。
[表3]
 实施例2  比较例2
  CAT合成量  264ng  133ng
在以下实施例3、参考例3、实施例4～7中使用的、以聚甲基丙烯酸甲酯为原料、具有直径为100μm的微通路的蛋白质电泳用芯片的模式图示于图1。
实施例3
将以聚甲基丙烯酸甲酯为原料、具有直径为100μm的通路的电泳用芯片浸渍在分子量500000、2000ppm的聚乙二醇水溶液中。密封浸渍过的电泳用芯片，照射2.5kGy的γ射线，进行接枝化。除去通路内的聚乙二醇，填充5％聚丙烯酰胺(分子量60万～100万)0.1M Tris-天冬氨酸(pH8)溶液，在图3的A、B、C部分中加入5％聚丙烯酰胺(分子量60万～100万)0.1M Tris-天冬氨酸(pH8)溶液，在D部分中加入荧光标记胰蛋白酶抑制剂和荧光标记BSA的含有1％SDS的0.05MTris-HCl(pH8)溶液。在填充了聚丙烯酰胺、蛋白质溶液的电泳用芯片的A、B、C、D部分中插入电极，对B施加350V的电压1分钟。之后对C施加500V，对B、D施加150V的电压，进行泳动，作为实施例3。
比较例3
在以聚甲基丙烯酸甲酯为原料、具有直径为100μm的通路的电泳用芯片中填充5％聚丙烯酰胺(分子量60万～100万)0.1MTris-天冬氨酸(pH8)溶液，在图3的A、B、C部分中加入5％聚丙烯酰胺(分子量60万～100万)0.1MTris-天冬氨酸(pH8)溶液，在D部分中加入荧光标记胰蛋白酶抑制剂和荧光标记BSA的含有1％SDS的0.05MTris-HCl(pH8)溶液。在填充了聚丙烯酰胺、蛋白质溶液的电泳用芯片的A、B、C、D部分中插入电极，对B施加350V的电压1分钟。之后对C施加500V，对B、D施加150V的电压，进行泳动，作为比较例3。
将实施例3、比较例3中泳动了的蛋白质的观察结果示于图2、3。对于没有用γ射线将聚乙二醇处理到树脂基板上的比较例3，蛋白质没有泳动(图2)，与此相对，对于用γ射线进行了共价键合的实施例2，蛋白质形成谱带而被检测，并分离·泳动。
实施例4
将以聚甲基丙烯酸甲酯为原料、具有直径为100μm的通路的电泳用芯片浸渍在分子量500000、2000ppm的聚乙二醇水溶液中。将浸渍过的电泳用芯片密封，照射2.5kGy的γ射线，进行接枝化。除去通路内的聚乙二醇，用10当量的盐酸洗涤通路。洗涤后，填充5％聚丙烯酰胺(分子量60万～100万)0.1MTris-天冬氨酸(pH8)溶液，在图3的A、B、C部分中加入5％聚丙烯酰胺(分子量60万～100万)0.1MTris-天冬氨酸(pH8)溶液，在D部分中加入荧光标记胰蛋白酶抑制剂和荧光标记BSA的含有1％SDS的0.05MTris-HCl(pH8)溶液。在填充了聚丙烯酰胺、蛋白质溶液的电泳用芯片的A、B、C、D部分中插入电极，对B施加350V的电压1分钟。之后对C施加500V，对B、D施加150V的电压，进行泳动，作为实施例4。
实施例5
将以聚甲基丙烯酸甲酯为原料、具有直径为100μm的通路的电泳用芯片浸渍在分子量500000、2000ppm的聚乙二醇水溶液中。将浸渍过的电泳用芯片密封，照射2.5kGy的γ射线，进行接枝化。除去通路内的聚乙二醇，用10当量的氢氧化钠水溶液洗涤通路。洗涤后，填充5％聚丙烯酰胺(分子量60万～100万)0.1MTris-天冬氨酸(pH8)溶液，在图3的A、B、C部分中加入5％聚丙烯酰胺(分子量60万～100万)0.1MTris-天冬氨酸(pH8)溶液，在D部分中加入荧光标记胰蛋白酶抑制剂和荧光标记BSA的含有1％SDS的0.05MTris-HCl(pH8)溶液。在填充了聚丙烯酰胺、蛋白质溶液的电泳用芯片的A、B、C、D部分中插入电极，对B施加350V的电压1分钟。之后对C施加500V、对B、D施加150V的电压，进行泳动，作为实施例5。
观察实施例4、实施例5中泳动了的蛋白质。结果示于图4、5。可以确认，即使用强酸、强碱基洗涤通路，在用γ射线在树脂基板上共价键合有聚乙二醇的芯片中，蛋白质也可以分离·泳动。
实施例6
将以聚甲基丙烯酸甲酯为原料、具有直径为100μm的通路的电泳用芯片浸渍在分子量500000、2000ppm的聚乙二醇水溶液中。密封浸渍过的电泳用芯片，照射5.0kGy的γ射线，进行接枝化。除去通路内的聚乙二醇，用10当量的氢氧化钠水溶液洗涤通路。洗涤后，填充5％聚丙烯酰胺(分子量60万～100万)0.1MTris-天冬氨酸(pH8)溶液，在图3的A、B、C部分中加入5％聚丙烯酰胺(分子量60万～100万)0.1MTris-天冬氨酸(pH8)溶液，在D部分中加入荧光标记胰蛋白酶抑制剂和荧光标记BSA的含有1％SDS的0.05MTris-HCl(pH8)溶液。在填充了聚丙烯酰胺、蛋白质溶液的电泳用芯片的A、B、C、D部分中插入电极，对B施加350V的电压1分钟。之后对C施加500V、对B、D施加150V的电压，进行泳动，作为实施例6。
实施例7
将以聚甲基丙烯酸甲酯为原料、具有直径为100μm的通路的电泳用芯片浸渍在分子量500000、2000ppm的聚乙二醇水溶液中。将浸渍过的电泳用芯片密封，照射10.0kGy的γ射线，进行接枝化。除去通路内的聚乙二醇，用10当量的氢氧化钠水溶液洗涤通路。洗涤后，填充5％聚丙烯酰胺(分子量60万～100万)0.1MTris-天冬氨酸(pH8)溶液，在图3的A、B、C部分中加入5％聚丙烯酰胺(分子量60万～100万)0.1MTris-天冬氨酸(pH8)溶液，在D部分中加入荧光标记胰蛋白酶抑制剂和荧光标记BSA的含有1％SDS的0.05MTris-HCl(pH8)溶液。在填充了聚丙烯酰胺、蛋白质溶液的电泳用芯片的A、B、C、D部分中插入电极，对B施加350V的电压1分钟。之后对C施加500V、对B、D施加150V的电压，进行泳动，作为实施例7。
观察实施例6、实施例7中泳动了的蛋白质。结果示于图6、7。在γ射线的照射量为5kGy、10kGy时，没有因树脂基板黄变导致的对被检测样品检测的影响，可以对蛋白质进行检测。
工业可利用性
根据本发明，可以提供在基材表面没有蛋白质的吸附、具有耐洗涤效果、可以长时间使用的芯片实验室用基板。由于检测噪音减少，所以可以进行微量且高精度的蛋白质分析，能够提供具有微通路的聚合物制的蛋白质电泳用芯片。

Claims (11)

1.一种芯片实验室用基板，以按重量比计硅的含有率为10％以下的树脂作为基材，在其表面共价键合有亲水性聚合物。
2.如权利要求1所述的芯片实验室用基板，在基材的表面上用高能量线共价键合有亲水性聚合物。
3.如权利要求1所述的芯片实验室用基板，所说的高能量线是γ射线。
4.如权利要求3所述的芯片实验室用基板，其特征在于，γ射线的吸收能量为10kGy以下。
5.如权利要求1所述的芯片实验室用基板，亲水性聚合物是聚亚烷基二醇。
6.如权利要求1所述的芯片实验室用基板，以选自聚砜系树脂、聚甲基丙烯酸系树脂、聚酰胺系树脂、聚丙烯腈中的至少一种树脂作为基材。
7.如权利要求1所述的芯片实验室用基板，是一种蛋白质处理芯片。
8.如权利要求7所述的蛋白质处理芯片，仅在蛋白质处理芯片的通路中用高能量线共价键合有聚亚烷基二醇。
9.如权利要求7所述的蛋白质处理芯片，是用于蛋白质泳动的。
10.如权利要求7所述的蛋白质处理芯片，是用于蛋白质电泳的。
11.如权利要求7所述的蛋白质处理芯片，其特征在于，在上述电泳中抑制电渗透流。
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