CN1897959A - 用于治疗和预防脓毒病和粘连形成的组织保护细胞因子 - Google Patents

Abstract

一种在疾病，包括但不限于脓毒病、粘连形成、创伤、器官衰竭、慢性疾病、因感染所致普通炎性疾病、因损伤和切割所致结疤及其组合方面，治疗、预防、延缓促炎细胞因子的发生和/或减少其作用的方法。

Description

用于治疗和预防脓毒病和粘连形成的组织保护细胞因子

                      发明领域

本发明涉及治疗、预防、延缓脓毒病和相关并发症的发作和/或减轻其作用的方法。具体地说，本发明涉及组织保护细胞因子在治疗、预防、延缓和/或减轻与脓毒病、粘连形成和器官衰竭有关的并发症中的用途。此外，也设计了用于治疗、预防、延缓和/或减轻感染引起的普通炎性疾病的并发症的本发明的组织保护细胞因子。

                      发明背景

针对宿主的感染、免疫激发、炎症和创伤，现存在几种对付策略。宿主试图对这些攻击作出反应的一个机理是通过向上调节用作细胞间调节剂的细胞因子、非抗体蛋白。为使宿主摆脱攻击，避免宿主细胞被所述攻击损坏，某些细胞因子，称作促炎细胞因子，通过增强所述疾病来抵抗对宿主的攻击。促炎细胞因子包括，但不限于，白细胞介素(IL)，例如，IL-1、IL-6、IL-8、IL-18和肿瘤坏死因子(TNF)。

释放促炎细胞因子时，其在损伤部位具有以下作用：增加抗体及其补体的释放，激活T和B细胞，使血小板粘连至血管壁，以及淋巴细胞和巨噬细胞的过度血管化(extravascuarization)。这些改变在损伤部位形成局部环境，包括发热、组织损伤、肿瘤坏死、其它细胞因子和免疫调节和细胞凋亡的介导。这些局部反应不仅对宿主的攻击源有毒性作用，而且促炎细胞因子响应的边缘部分(penumbra)的宿主细胞有毒性作用。因此，例如这些作用可在系统水平上发生在宿主无法抵抗的感染或严重创伤期间，许多这类促炎细胞因子对宿主是有害的，产生发热、炎症、组织损坏和(在某些情况下)休克和死亡，这并不令人惊讶。

各种促炎细胞因子作用的代表是TNF。为对炎症、感染和其它环境刺激作出反应，TNF是由许多细胞类型包括巨噬细胞、单核细胞、淋巴样细胞和成纤维细胞生成的促炎细胞因子。TNF引起大量的细胞反应，包括发热、休克、组织损伤、肿瘤坏死、厌食、其它细胞因子和免疫调节分子的介导、细胞增殖、分化和凋亡。释放TNF时，其在损伤部位具有以下作用：增加抗体及其补体的释放，激活T和B细胞，使血小板粘连至血管壁，以及淋巴细胞和巨噬细胞的过度血管化。TNF系统地作用于下丘脑和肝。TNF刺激下丘脑释放促肾上腺皮质激素释放激素，抑制食欲和引起发热。为响应TNF，肝引发急性期反应，引起包括C反应蛋白、凝血因子和补体因子的几种蛋白的合成。TNF还诱导胰岛素抵抗。在损伤或感染的确定区域，必需TNF除去特定的传染剂病使身体免疫应答适应特定的损伤。

然而，在系统水平上，其中的TNF和其它促炎细胞因子可以以较高浓度存在或存在较长的时间，TNF可对身体产生有害作用。于高浓度下，TNF激活IL-1和I1-6级联，这导致恶病质(消瘦)。此外，TNF会导致全身水肿、低蛋白血症和中性白细胞减少症，这可导致弥散性血管外凝血和最终多器官衰竭。在慢性疾病例如癌症中，TNF也可干扰宿主的重要的内源性功能。例如，TNF可干扰内源性红细胞生成素维持宿主红细胞压积的能力，导致称作慢性贫血(ACD)的疾病。用重组红细胞生成素的典型的疗程不会抵销促炎细胞因子的作用，因此，需要给予提高剂量的仅维持宿主的正常的红细胞压积的重组红细胞生成素。除了与增加剂量有关的额外成本，还有增加红细胞生成素剂量带来的不利副作用，例如血栓形成。除了下面详述的病症外，促炎细胞因子，包括但不限于TNF，还与疾病例如慢性炎症、细菌败血症性休克、细菌毒性休克、移植物抗宿主病，以及HIV感染和AIDS有关。

脓毒病

脓毒病是对任何种类的感染，例如，细菌、病毒、寄生虫或真菌感染的身体反应。感染的部位往往是肺、尿路、腹部和骨盆。然而在某些情况下，检测不到实际感染部位。尽管脓毒病一度被认为是系统性炎性反应，但如今认识到脓毒病也包括趋血栓形成体质和受损的纤维蛋白溶解。

脓毒病一旦发作，普遍的炎症和血块遍及全身。鉴于在健康身体内，会释放免疫调节剂对抗感染和医治患脓毒病的身体，免疫调节剂释放过量。促炎细胞因子例如TNF、白细胞介素-1和白细胞介素-18的释放引起内皮表面的炎症、升高核心温度、食欲丧失和贫血。此外，血管内表面的炎症激活血凝固作用。因为脓毒病减少调节血凝固和控制炎症的蛋白质C的身体的自然生成，所以抑制身体破坏已形成的血块的能力。该抑制导致重要的器官、四肢、手指和脚趾中生成血块，这依次导致器官衰竭或坏疽。

脓毒病本身可以不同的程度出现。例如，当器官急性功能障碍或衰竭发生时出现严重脓毒病的情况下，身体的正常防御反应进入过度动员状态，推动可导致在遍及全身的微血管内的广泛的炎症和血凝固的级联活动。当严重脓毒病患者经历心血管系统衰竭时发生败血症性休克。所述衰竭引起血压下降，这依次使重要的器官失去足够的充氧血的供应。败血病是一种血流本身有感染的脓毒病。事实上，败血病可导致局部缺血，即，至少一个器官血液供应不足。例如，当流向肾的血液减少到危险的低水平一定的时间时，可发展为局部缺血性急性肾衰竭(ARF)。受影响器官内的下降的血流也导致坏死或组织死亡。

只要能鉴别脓毒病的来源，许多脓毒病病例会对治疗作出响应。一旦被隔离，就着手对感染病因采取特效的治疗方案。已知的治疗包括采用抗生素、手术切除感染或坏死组织、增加活化蛋白的药物和类固醇(在败血症性休克的情况下)。例如，脓毒病的典型治疗过程包括提供广谱抗生素，直到分析出感染病因为止。然而，在其中的感染病因和/或部位未确定的脓毒病的情况下，脓毒病患者保持较高的死亡率。

根据脓毒病的严重性，在治疗过程中可采用抗感染药物、引流技术、液体、提高平均动脉血压(MAP)的药物例如去甲肾上腺素和脱羟肾上腺素、改善肾功能的药物例如多巴胺、增加氧输送和氧消耗的药物例如多巴酚丁胺和肾上腺素、维持呼吸的机械换气机和肾衰竭透析。此外，已经表明对下述休克和脓毒病的免疫应答产生有益作用的药物还包括ATP-MgCl₂、非抗凝(nonanticoagulant)肝素、钙通道阻滞剂、氯喹、环加氧酶抑制剂、PAF拮抗剂、抗炎细胞因子、长生因子、膳食控制剂(dietary manipulation)、抗-TNF抗体、活化蛋白C(Xigris，Eli Lilly，Indianapolis，Indiana)和性激素。在快速诊断病症和迅速治疗时，脓毒病痊愈是最好的。

针对各种与脓毒病有关的疾病的治疗，最近已经研究以商品名PROCRIT(产自Ortho Biotech公司，Raritan，NJ)、EPOGEN(产自Amgen公司，Thousand Oaks，CA)和NEORECORMON(产自Roche，Basel，瑞士)市售购得的重组红细胞生成素(rhu-EPO)。另外，美国专利出版号2003/0083251一般地公开用rhu-EPO帮助肾管状细胞的再生和防止肾管状细胞的凋亡，以治疗局部缺血的ARF患者。而且，美国专利出版号2002/0061849一般地公开用rhu-EPO帮助治疗一个或多个器官中的非局部缺血性疾病的炎症。然而，由于红细胞生成素的红细胞生成作用-增加红细胞压积、血管收缩、血小板活动过强、促凝血活性和增加血小板的生成-用rhu-EPO治疗引起其它风险，在重要器官、四肢、手指和脚趾中产生与脓毒病有关的普遍的血块。

粘连

除脓毒病外，促炎细胞因子，例如TNF，还与粘连形成、异常纤维性带或器官与身体其它结构之间的连接相关。粘连可以是脓毒病的并发症或与之相关，但也可单独发生。例如，可因手术、创伤、感染、化疗和辐射形成粘连。事实上，粘连几乎是手术不可避免的结果，即，约93％的经历腹部手术的患者患有某种程度的粘连(比较而言，先前未经腹部手术的患者只有10.4％患有粘连形成)。参见D.Menzies和H.Ellis，Intestinal Obstruction from Adhesions-How Big isthe Problem？，ANN.R.COLL.SURG.ENGL.72：60-3(1990)。

粘连形成会引起剧烈疼痛并对患者的器官或其它组织施加不自然的压迫感或紧张感。例如，身体腹部区域的粘连会引起患者的肠受到限制或压缩于身体器官或其它组织之间。某些情况下，会由于附近的粘连导致肠梗阻或明显的阻塞。

身体两部分间的这些反常连接的形成引起宿主其它症状。例如，随着剖腹产手术成为分娩的更加普通的方法，接受此较大腹部手术的妇女可能形成粘连，并从而感受到慢性骨盆痛。此外，涉及女性生殖器官的粘连会引起不孕和交媾困难。

已经研究了与预防和治疗粘连相关的大量药物，例如，右旋糖酐、皮质类固醇、卵磷脂、磷脂酶抑制剂、非类固醇抗炎药、蛋白多糖、肝素和组织型纤溶酶原激活剂。参见，例如，C.L.Kowalczyk和M.P.Diamond，The Management of Adhesive Disease，inPERITONEAL ADHESIONS 315-324(K.H.Treutner和V.Schumpelick编辑，1997)。由于它们对凝血和纤维蛋白溶解的干扰能力，相信部分而不是所有这些药物对粘连的治疗有效。然而，由于出血并发症，这些药物的大部分临床运用受到限制。此外，已表明透明质酸衍生物预防术后粘连，尤其在腹内区域。参见，例如，J.M.Becker等，Prevention of Postoperative Abdominal Adhesions by a SodiumHyaluronate-based Bioresorbable Membrane：A Prospective，Randomized，Double-blind Multicenter Study，in J.AM.COLL.SURG.183 297-306(1996)。此外，已表明，以竞争方式与单核细胞和中性粒细胞的受体高亲合力相连的葡萄糖聚合物β-葡聚糖，对Wistar大鼠的腹内脓毒病之后经实验方法产生的的粘连发生频率有降低的作用。A.Bedirli等，Prevention of Intraperitoneal Adhesion FormationUsing Beta-Glucan After Ileocolic Anastomosis in a Rat BacterialPeritonitis Model，in Am.J.SURG.185339-343(2003)。

也可用手术作为粘连的治疗途径。医师一般会进行手术以切断器官或身体其它部分的粘连。然而，假定粘连常常是手术的并发症，除去粘连的手术就往往会导致新的粘连的形成。虽然某些手术步骤涉及与受手术影响的区域相邻的器官之上的套管的放置，从而帮助预防涉及这些器官的粘连，但是这些步骤产生混合的结果。此外，所述器官套管还需要另外的手术去除。

因此，尽管对粘连的了解有所增加，但对治疗方法的研究所取得的成功有限。许多医师不愿或不能专注于粘连的治疗，许多保险公司不愿意赔付最多只在一定程度上成功的治疗。

创伤愈合

愈合是身体复原受损组织完整性的必需过程。往往根据各种原因，例如，外伤、手术、压迫(褥疮)、灼伤、糖尿病等引起的皮肤伤口、溃疡或损害观察该过程。创伤的严重性的特征在于所述创伤对皮肤的穿透程度。I度创伤的特征是红色或变色、热感和肿胀或变硬。II度创伤，部分厚度的创伤，感染皮肤的表皮和表面真皮。III度创伤，全层创伤，感染穿过皮肤真皮，但未穿透分隔皮肤与更深处器官的膜。IV度创伤涉及在下面的肌或骨的损伤。

虽然所有的创伤经相同过程愈合：发炎、上皮形成、血管生成和基质积聚；但创伤愈合的容易程度主要取决于创伤的严重性和受伤个体的健康状态。I度和II度创伤一般经过真皮之下的上皮细胞的再生愈合。但III度和IV度创伤经过结疤愈合。促炎细胞因子，例如，TNF，在创伤愈合中起作用，然而，推测TNF对创伤愈合中的胶原积聚，并最终对所述创伤开始愈合的时间和被修复组织的强度有不利作用。

已经发展有助于身体治愈创伤的几种治疗剂和治疗方法。认为对创伤愈合有治疗效果的几种化合物包括，但不限于，生长因子(表皮生长因子、胰岛素样生长因子、人生长激素、成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、白细胞介素-6和白细胞介素-10)、营养补充剂(精氨酸、谷氨酰胺、维生素C、维生素B5、菠萝蛋白酶、姜黄素、锌、铜)和草药补充剂(库拉索芦荟、积雪草(centella))。此外，已经利用各种治疗方法包括，但不限于，高压氧治疗、旋涡浴治疗、超声波治疗、电刺激和磁疗帮助身体治愈创伤。

如果未完全治愈或未能根本治愈创伤，可引起几种主要介于瘢痕和感染之间的并发症。根据创伤的严重性，在创伤的愈合中身体会生成瘢痕组织。除了对瘢痕的美观考虑之外，根据其严重性，瘢痕还会影响个体的活动。此外，伤口为细菌和其它易传染物进入体内提供机会。根据感染的严重性，它可扩散到全身，引起脓毒病或败血病。

在任意局部缺血性皮瓣的大鼠模型中已经对rhu-EPO可能的治疗作用进行研究。例如，已经表明对于局部缺血性皮瓣创伤，rhu-EPO可减少坏死、减少中性白细胞浸润和预防体温上升。参见M.Buemi等，Recombinant Human Erythropoitein Influences Revsacularization andHealing in a Rat Model of Random Ischaemic Flaps，ACTA DERMVENEREOL，82：411-417(2002)。这一发现表明，受伤初期和后期的rhu-EPO给药，通过减少炎性反应，增加局部缺血性皮瓣中的毛细管密度和使受损区域的尽早恢复，可促进创伤愈合过程。然而，如上所述，因为rhu-EPO具有红细胞生成活性，用rhu-EPO治疗这些病症可能引起比愈合过程已经引发的更大程度的凝固或并发症。

总之，对于脓毒病病例、脓毒病发生、粘连形成、创伤愈合或普通炎性疾病的处理，没有一种药物或治疗方案表现出充分的价值。事实上，与脓毒病和相关疾病有关的死亡率居高不下。每年，约215,000人死于严重脓毒病，每三个发展为严重脓毒病的患者的一位会在一个月内死亡。而且，由于对所述疾病的了解的增加和对诊断的敏感性提高、免疫受损的患者数量增多、侵入性诊断技术的使用、有抵抗力的微生物的数量和老年人口的增长，预期将来脓毒病例会上升。此外，由于缺乏成功的治疗方案，与粘连和普通炎性疾病有关的慢性痛往往不曾治疗。

因此，为限制促炎细胞因子的作用范围(penumbra)并进而确定其系统作用，本领域需要方法和治疗剂以治疗、预防、延缓促炎细胞因子的发生并减少其作用。特别是，在脓毒病、粘连、创伤、慢性病和普通炎性疾病中，需要治疗、预防和延缓促炎细胞因子的发生和减少其作用。此外，提供可以恢复或预防局部缺血性疾病的组织损伤的方法应是有益的。

                    发明概述

本发明涉及通过给予治疗有效量的至少一种组织保护细胞因子来治疗、预防和延缓脓毒病、粘连、普通炎性疾病及其组合的发作和/或减少其作用的方法。此外，本发明涉及用至少一种组织保护细胞因子，预防或减少与创伤和切口有关的瘢痕。至少一种组织保护细胞因子可以是具有组织保护功能的任何组织保护细胞因子。然而，在一个实施方案中，至少一种组织保护细胞因子是经化学修饰的EPO。在另一实施方案中，化学修饰的EPO是氨基甲酰化EPO。

本发明的一个实施方案涉及治疗、预防、延缓哺乳动物中促炎细胞因子的发生或减少其作用的方法。其它实施方案涉及治疗、预防、延缓与促炎细胞因子作用相关的疾病的发作的方法。与促炎细胞因子的作用相关的症状的某些实例包括脓毒病、粘连、创伤、炎症或慢性疾病。这些方法可包括给予治疗有效量的在药用载体中一种或多种组织保护细胞因子的步骤。

此外，本发明还涉及可用于本文所述方法药用组合物。例如，一个实施方案涉及一种药用组合物，它包含一定量的至少一种有效治疗、预防、延缓哺乳动物中促炎细胞因子的发生或减少其作用的组织保护细胞因子。另一实施方案涉及一种药用组合物，它包含一定量的至少一种有效治疗、预防、延缓哺乳动物中与促炎细胞因子有关的疾病发作的组织保护细胞因子。

用于本发明的某些组织保护细胞因子可以是经化学修饰的红细胞生成素或突变的红细胞生成素。

在某些采用经化学修饰过的红细胞生成素的实施方案中，经化学修饰过的红细胞生成素可包括以下的一种或多种：i)缺乏唾液酸部分的红细胞生成素；ii)至少没有唾液酸部分的红细胞生成素；iii)至少没有N-连接或没有O-连接的碳水化合物的红细胞生成素；iv)具有至少一种经用至少一种糖苷酶处理天然红细胞生成素而减少了碳水化合物的量的红细胞生成素；v)含有至少一个或多个氧化的碳水化合物的红细胞生成素；vi)含有至少一个或多个氧化的碳水化合物，且被化学还原的红细胞生成素；vii)含有至少一个或多个经修饰的精氨酸残基的红细胞生成素；viii)含有至少一个或多个经修饰的赖氨酸残基或红细胞生成素分子的N-末端氨基的修饰物的红细胞生成素；ix)含有至少一个经修饰的酪氨酸残基的红细胞生成素；x)含有至少一个经修饰的天冬氨酸或谷氨酸残基的红细胞生成素；xi)含有至少一个经修饰的色氨酸残基的红细胞生成素；xii)具有至少一个离去氨基的红细胞生成素；xiii)红细胞生成素分子中至少一个胱氨酸键的至少一个被打开(opening)的红细胞生成素；或xiv)截短的红细胞生成素。在另一实施方案中，经化学修饰的红细胞生成素缺乏红细胞生成素的红细胞生成作用。经化学修饰的红细胞生成素也可包括氨基甲酰化红细胞生成素。

同样地，在某些实施方案中涉及突变的红细胞生成素，所述突变的红细胞生成素可选自一种或多种下列突变体：C7S、R10I、V11S、L12A、E13A、R14A、R14B、R14E、R14Q、Y15A、Y15F、Y15I、K20A、K20E、E21A、C29S、C29Y、C33S、C33Y、P42N、T44I、K45A、K45D、V46A、N47A、F48A、F48I、Y49A、Y49S、W51F、W51N、Q59N、E62T、L67S、L70A、D96R、K97D、S100R、S100E、S100A、S100T、G101A、G101I、L102A、R103A、S104A、S104I、L105A、T106A、T106I、T107A、T107L、L108K、L108A、S126A、F142I、R143A、S146A、N147K、N147A、F148Y、L149A、R150A、G151A、K152A、L153A、L155A、C160S、I6A、C7A、B13A、N24K、A30N、H32T、N38K、N83K、P42A、D43A、K52A、K97A、K116A、T132A、I133A、T134A、K140A、P148A、R150B、G151A、K152W、K154A、G158A、C161A或R162A。在另一实施方案中，所述突变的红细胞生成素缺乏红细胞生成素的红细胞生成作用。

促炎细胞因子的两个实例是白细胞介素和TNF。促炎细胞因子的一种或多种作用可包括发热、消瘦、嗜眠、贫血、水肿、局部缺血、器官衰竭和胰岛素抵抗。以下更详细地描述本发明的其它特征和优点。

                    图的简述

从结合下述相关附图提供的下列详述，可确定本发明的其它特征和优点：

图1是Sprague Dawley大鼠在盲肠结扎和穿孔(CLP)及用盐水或本发明的组织保护细胞因子后续处理后的存活率的图示；

图2是Sprague Dawley大鼠在CLP和用盐水或本发明的组织保护细胞因子后续处理后的粘连评分的图示；

图3是Sprague Dawley大鼠经CLP和用盐水或本发明的组织保护细胞因子后续处理后的病情评分图示；

图4是Sprague Dawley大鼠经CLP(引入或不引入脓毒病)和用盐水或本发明的组织保护细胞因子后续处理后的粘连评分的图示；和

图5是Sprague Dawley大鼠经CLP(引入或不引入脓毒病)和用盐水或本发明的组织保护细胞因子后续处理后的血清TNF水平的图示。

图6是表示经脂多糖(LPS)诱导的脓毒病24小时后，用盐水或组织保护细胞因子处理Sprague Dawley大鼠的核心体温的图。

图7(a)和(b)是表示LPS诱导的脓毒病后，用盐水或组织保护细胞因子处理的Sprague Dawley大鼠的血清IL-6水平(图7a)或TNF水平(图7b)的图。

图8(a)和(b)是表示经LPS诱导的脓毒病后，用组织保护细胞因子外周(图8a)或中枢(图8b)处理的Sprague Dawley大鼠的核心体温的图。

图9是经局部缺血性皮瓣试验及随后用盐水或组织保护细胞因子处理后34天龄的Sprague Dawley大鼠的损伤愈合百分率的图示。

                    发明详述

本发明涉及治疗、预防、延缓或减轻促炎细胞因子例如TNF在疾病，包括但不限于脓毒病和与脓毒病相关的疾病、粘连、创伤愈合和慢性疾病中的作用。组织保护细胞因子所针对的促炎细胞因子的作用包括，但不限于，发热、消瘦、嗜眠、贫血、水肿、局部缺血、器官衰竭和胰岛素抵抗。在受到感染的一种或多种器官或组织，例如脑膜炎病例中，本发明的组合物也被设计用于治疗、预防、延缓或减轻炎性疾病的作用。特别是，本发明涉及含有组织保护细胞因子的组合物，所述细胞因子在包括脓毒病、粘连、创伤愈合、慢性疾病和炎症的疾病中成功处理促炎细胞因子的作用。

此外，本发明的组合物用于治疗、预防和/或减少损伤瘢痕的出现。例如，当本发明的组织保护细胞因子用于腹部手术时，可明显减少瘢痕。在一个实施方案中，本发明的组织保护细胞因子用于预防手术切口的瘢痕。

                  本发明的组合物

本发明打算采用表现出组织保护能力的任何细胞因子。本发明的组合物可包括红细胞生成素。例如，本发明的适用的组织保护细胞因子可为EPO分子，它可以各种形式存在，例如，α、β、无唾液酸(asialo)和其它形式。α和β形式有同样的效力、生物活性和分子量，而只在碳水化合物成分方面略有不同，而无唾液酸形式是一种从碳水化合物成分中除去末端唾液酸的α和β形式。

同样，还考虑能够治疗、预防、延缓脓毒病、与脓毒病相关的疾病和普通炎性疾病的发作和/或减少其作用的任何组织保护细胞因子。用于本文的术语“组织保护细胞因子”指衍生自红细胞生成素、具有红细胞生成素的组织保护活性的任何细胞因子。所述组织保护细胞因子优选缺乏至少一种或多种红细胞生成素的红细胞生成作用。所述组织保护细胞因子最优选缺乏红细胞生成素的全部红细胞生成作用。例如，这可以通过用影响其药理学属性(在半衰期中还原)或结合红细胞生成素受体同型二聚体的结构能力的化学或突变方法修饰红细胞生成素来实现。用于本发明的适用的组织保护细胞因子的非限制性实例包括公开于国际公布WO/02053580和美国专利公布号2002/0086816和2003/0072737的组织保护细胞因子，它们通过引用全文结合到本文中。

此外，用于本发明的组织保护细胞因子可包括经至少一种精氨酸、赖氨酸、酪氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基或羧基修饰的EPO分子，它们考虑用作本发明的组织保护细胞因子。可通过胍化、脒化、氨基甲酰化、三硝基苯基化、酰基化(乙酰基化或琥珀酰基化)、硝化或其组合化学修饰这些残基，这些公开于国际公布号WO/02053580中。

因此，本发明的组织保护细胞因子可为氨基甲酰化EPO。在发明背景中讨论过，已经研究rhu-EPO用于为败血病可能的并发症的急性肾衰竭的治疗。然而，因为rhu-EPO有红细胞生成活性，即，维持体内红细胞压积水平和使血小板活动过强的能力，一旦用其给药，红血球细胞增加，血小板活动过强，导致血液增稠，增加血栓形成的风险。因此，rhu-EPO的使用可能会恶化脓毒病所发生的广泛性凝血。

与rhu-EPO和所选择的其它经修饰的EPO分子不同，氨基甲酰化EPO不保留红细胞生成活性，不能与典型的同型二聚体红细胞生成素受体结合，这些纪录于在2004年4月26日提交的PCT申请号PCT/US04/013099中，通过引用全文结合到本文中。然而，氨基甲酰化EPO有利地维持内源性EPO的组织保护功能。相信其通过与PCT申请号PCT/US04/013099所公开的组织保护受体复合物的相互作用，介导所保留的氨基甲酰化EPO的组织保护功能。因此，在包括，但不限于，脓毒病、粘连、创伤愈合、慢性疾病和普通炎性疾病的疾病中，氨基甲酰化EPO可用于治疗、预防、延缓促炎细胞因子例如TNF的攻击和/或减少其作用，不产生与红细胞生成素的给药相关的进一步的凝血的风险。此外，因为本发明氨基甲酰化EPO分子有效防止坏死，本发明的氨基甲酰化EPO分子，特别有益于治疗、预防、延缓易患中风、心肌梗死、智力退化和与老年相关的疾病的患者的脓毒病、粘连和普通炎性疾病的发作，和/或减少其作用。

因此，本发明的组织保护细胞因子可为含至少一个或多个赖氨酸残基或EPO分子的N-末端基的变体的经修饰的EPO，在本申请中这些赖氨酸残基或N-末端氨基也被称为“位点”。所述修饰可导致赖氨酸残基或N-末端氨基与氨基修饰剂的反应。例如，下列通用反应式表示使蛋白例如EPO氨基甲酰化的一种方法：

在另一实施方案中，通过与氰酸盐离子的反应，EPO分子上的一种或多种赖氨酸残基可被氨基甲酰化。例如，可经4-磺基苯基异硫氰酸酯培养以修饰一个或多个赖氨酸残基。在另一实施方案中，EPO分子上的一个或多个赖氨酸残基分别被异氰酸烷基酯、异氰酸芳基酯或硫代异氰酸芳基酯进行烷基-氨基甲酰化、芳基-氨基甲酰化或芳基-硫代氨基甲酰化。在另一个实施方案中，一个或多个赖氨酸残基被易反应的烷基羧酸或芳基羧酸衍生物例如乙酸酐、琥珀酸酐或邻苯二甲酸酐烷基化。经修饰的赖氨酸残基也可被化学还原。

通过使所述残基与三硝基苯磺酸或其盐反应，也可使一种或多种赖氨酸残基氨基甲酰化。在另一实施方案中，可通过与乙二醛或乙二醛衍生物，例如甲基乙二醛或3-脱氧葡糖醛酮反应，修饰一种或多种赖氨酸残基，生成相应的α-羧基烷基衍生物。

氨基甲酰化的其它方法可用于本发明。例如，公开于Plapp等J.BIOL.CHEM.，246：939-945(1971)的方法是制备本发明氨基甲酰化EPO的适用方法。氨基甲酰化的方法的另一实例于Satake等，1990，Biochim.Biophys.Acta 1038：125-9中讨论，其中红细胞生成素中的六个赖氨酸残基被氨基甲酰化。

从而，如上所述，根据本发明可采用任何形式的EPO。因此，作为一个实例：在一个实施方案中，被氨基甲酰化的EPO分子为α形式；在另一实施方案中，被氨基甲酰化的EPO分子为β形式；在又一实施方案中，被氨基甲酰化的EPO分子是无唾液酸(asialic)形式。

氨基甲酰化过程优选发生一段时间，以足够实质上降低或完全消除红细胞生成的活性。在一个实施方案中，氨基甲酰化过程进行充分的时间段，以除去至少约90％的位点。在另一实施方案中，氨基甲酰化过程进行充分的时间段，以除去至少约95％的位点。在又一实施方案中，氨基甲酰化过程进行充分的时间段，以除去100％的位点。作为选择，在一个实施方案中，氨基甲酰化红细胞生成素的时间段可以被看作足以氨基甲酰化至少六个赖氨酸残基，在另一个实施方案中，足以氨基甲酰化至少七个赖氨酸残基，在又一个实施方案中，足以氨基甲酰化至少八个赖氨酸残基。发生充分氨基甲酰化所需的时间可不同。例如，充分氨基甲酰化可发生的时间为至多约6-24小时，至多约10-20小时或至多约16小时。

也可通过公开于Satake等，1990，Biocgim.Biophys.Acta 1038：125-9的分子生物技术的有限的蛋白水解、氨基的除去和/或精氨酸、赖氨酸、酪氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的突变取代，得到用于本发明的组织保护细胞因子，通过引用全文结合到本文中。例如，适用的组织保护细胞因子包括在以下位点具有位点突变的至少一个或多个EPO：C7S、R10I、V11S、L12A、E13A、R14A、R14B、R14E、R14Q、Y15A、Y15F、Y15I、K20A、K20E、E21A、C29S、C29Y、C33S、C33Y、P42N、T44I、K45A、K45D、V46A、N47A、F48A、F48I、Y49A、Y49S、W51F、W51N、Q59N、E62T、L67S、L70A、D96R、K97D、S100R、S100E、S100A、S100T、G101A、G101I、L102A、R103A、S104A、S104I、L105A、T106A、T106I、T107A、T107L、L108K、L108A、S126A、F142I、R143A、S146A、N147K、N147A、F148Y、L149A、R150A、G151A、K152A、L153A、L155A、C160S、I6A、C7A、B13A、N24K、A30N、H32T、N38K、N83K、P42A、D43A、K52A、K97A、K116A、T132A、I133A、T134A、K140A、P148A、R150B、G151A、K152W、K154A、G158A、C161A和/或R162A。上面引用的修饰实例描述于同时待审的美国专利公布号2003/0104988、2002/0086816和2003/0072737中，通过引用全文结合到本文中。在本文所用的突变体蛋白命名法中，先用天然氨基酸的一个字母代码，再用它在EPO分子中的位置，接着用替代氨基酸的一个字母代码描述被改变的氨基酸描述改变的氨基酸。例如，S100E指一种人EPO分子，其中，于氨基酸100处，丝氨酸已被改变为谷氨酸。

在另一实施方案中，所述组织保护细胞因子可包括一种或多种位点突变，前提是所述位点突变不包括I6A、C7A、K20A、P42A、D43A、K45D、K45A、F48A、Y49A、K52A、K49A、S1OOB、R103A、K116A、T132A、I133A、K140A、N147K、N147A、R150A、R150E、G151A、K152A、K154A、G158A、C161A或R162A。

在又一实施方案中，所述组织保护细胞因子可包括位点突变的组合，例如K45D/S100E、K97D/S100E、A30N/H32T、K45D/R150E、R103E/L108S、K140A/K52A、K140A/K52A/K45A、K97A/K152A、K97A/K152A/K45A、K97A/K152A/K45A/K52A、K97A/K152A/K45A/K52A/K140A、K97A/K152A/K45A/K52A/K140A/K154A、N24K/N38K/N83K和N24K/Y15A。在另一实施方案中，所述组织保护细胞因子不包括任何上述组合。在另一实施方案中，所述组织保护细胞因子可包括任何上述位点突变，前提是所述位点突变不包括任何下列取代组合：N24K/N38K/N83K和/或A30N/H32T。

某些修饰或修饰的组合可能影响与其受体例如EPO受体或第二种受体结合的突变能力的适应性。这类修饰或修饰的组合的实例包括，但不限于，K152W、R14A/Y15A、I6A、C7A、D43A、P42A、F48A、Y49A、T132A、I133A、T134A、N147A、P148A、R150A、G151A、G158A、C161A和R162A。本领域的普通技术人员知道，人生长激素中的相应突变是有害的。因此，在一个实施方案中，所述组织保护细胞因子不包括一种或多种会影响与其受体结合的突变能力的适应性的修饰或修饰的组合。这类组织保护细胞因子的其它讨论包括在于2003年7月1日提交的、题为“Recombinant TissueProtective Cytokines and Encoding Nucleic Acids Thereof for Protection，Restoration，and Enhancement of Responsive Cells，Tissues，and Organs”的同时待审的美国专利公布号10/612,665(代理人登记号10165-022-999)，所述公开通过引用全文结合到本文中。

而且，适用于本发明的组织保护细胞因子包括长效化学修饰的EPO分子，它们公开于2003年9月9日提交的国际专利申请号US03/028073(代理人登记号20528.0006)中，题目为“Long ActingErythropoietins that Maintain Tissue Protective Activity of EndogeneousErythropoietin”，通过引用全文结合到本文中。例如，适用于本发明的组织保护细胞因子包括经至少一个化学修饰为至少一个N-连接低聚糖链或O-连接的低聚糖链的EPO，其中的化学修饰包括氧化、硫酸化、磷酸化、聚乙二醇化或它们的组合。在一个实施方案中，经化学修饰的EPO分子呈α形式。在另一实施方案中，经化学修饰的EPO分子呈β形式。在又一实施方案中，经化学修饰的EPO分子是无唾液酸形式。在另一实施方案中，经化学修饰的EPO分子可为ARANESP(Amgen，Thousand Oaks，CA)或CERA(Hoffmann-La Roche Inc.，Nutley，NJ)。

可用多种宿主-表达媒介系统制备本发明的组织保护细胞因子。例如，当所述组织保护细胞因子基于EPO分子时，可用多种宿主-表达系统。这类宿主表达系统通过可制备EPO和后续纯化来表示媒介，还通过用可在适当的核苷酸编码序列转化或转染时原位显示修饰的红细胞生成素基因产物表示细胞。这些包括，但不限于，细菌、昆虫、植物、哺乳动物，包括人宿主系统，例如，但不限于，受含EPO编码序列的重组病毒表达媒介物(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；受重组病毒表达媒介物(例如，花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaicvirus，CaMV)；烟草花叶病毒、TMV)感染或被含与红细胞生成素相关的分子编码序列的重组质粒表达媒介物(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或哺乳动物细胞系统，包括人细胞系统，例如，HT1080、COS、CHO、BHK、293、3T3、含有衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子，例如，金属硫蛋白启动子，或衍生自哺乳动物病毒的启动子，例如，腺病毒晚期启动子的含重组表达的构件；牛痘病毒7.5K启动子。

此外，可选择以所需的特定方式调节插入序列的表达或修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白产物的这类修饰和加工对所述蛋白功能可能是重要的。本领域的普通技术人员知道，对于蛋白和基因产物的转译后加工和修饰，不同的宿主细胞有特定的机理。可选择适当的细胞系或宿主系统，以确保恰当修饰和加工所表达的异体蛋白。最终，可以采用拥有适当加工初级转录物、糖基化和磷酸化基因产物的细胞系统的真核宿主细胞。这类哺乳动物宿主细胞，包括人宿主细胞，包括但不限于，HT1080、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3和WI38。

对于重组蛋白的长期、高得率制备，优选稳定表达。例如，可基因改造稳定表达与重组组织保护细胞因子相关的分子基因产物的细胞系。不用含有复制病毒源的表达媒介物，而用适当表达控制元素，例如，启动子、增强子、序列、转译终止子、多腺苷酸化位点等和可选择标记所控制的DNA，可转化宿主细胞。随着外来DNA的引入，允许经基因改造的细胞在浓缩培养基中生长1-2天，再转到选择性培养基。重组质粒中的选择性标记具有对选择的抵抗性，使细胞稳定地将所述质粒整合到其染色体中，生长形成可依次克隆和扩大到为细胞系中的焦点(foci)。该方法可有利地用于基因改造表达与EPO突变体蛋白有关的分子基因产物的细胞系。这类基因改造的细胞系尤其可用于筛选和评价影响与EPO有关的分子基因产物的功能的化合物。

作为选择，可通过将异种DNA调节元件插入稳定细胞系或经克隆的微生物，以使所插入的调节元件有效地与内源性红细胞生成素突变体蛋白基因相连，修饰细胞系或微生物内的内源性EPO突变体蛋白基因的表达特性。例如，通常“转译沉默”的内源性EPO突变体蛋白基因，即，通常在细胞系中不表达或只以极低水平表达的EPO基因，可通过插入能促进在该细胞系或微生物中所表达的基因产物表达的调节元件激活。或者，转译沉默的内源性EPO基因可通过插入跨越细胞类型起作用的混杂调节元件激活。

采用技术，例如本领域的技术人员所熟知的靶向同源重组，所述技术也描述于法国专利号2646438、美国专利号4,215,051和5,578,461和国际公布号WO93/09222和WO91/06667中，全部公开通过引用结合到本文中，可使异种调节元件插入稳定细胞系或经克隆的微生物，以使其有效连接内源性红细胞生成素基因。

                     药用组合物

本发明还涉及含有本发明的组织保护细胞因子的药用组合物。因为本发明的组织保护细胞因子有利地具有缓解促炎细胞因子例如TNF作用的能力，以及保护组织免于细胞死亡的能力，所以，设计了用于治疗还处于各种组织损伤例如中风和心肌梗死风险的个体的脓毒病、粘连、创伤、慢性疾病和炎性疾病的细胞因子。

此外，设计了用于治疗还经受认知能力退化例如早老性痴呆和帕金森病等的个体的脓毒病、粘连、创伤和普通炎性疾病的本发明的组织保护细胞因子。

本发明的药用组合物含有治疗有效量的本发明的组织保护细胞因子(优选为纯化形式)。用于本文的术语“治疗有效量”意指为无毒的，但足以提供所需作用并表现出合理的、任何医学治疗中都存在的利益/风险比的组织保护细胞因子的量。

制剂应与给药方式相配。换名话说，本发明的药用组合物包含一定量的本发明的组织保护细胞因子，以使促炎细胞因子的靶作用，即发热、消瘦、嗜眠、贫血、水肿、局部缺血，器官衰竭和胰岛素抵抗，或与促炎细胞因子相关的疾病，即，脓毒病、粘连、创伤愈合、慢性疾病或炎性疾病为可治疗的，只要采用适当的剂量和方案。那么，下面更详细地讨论，应以无毒剂量传递所述药用组合物。

在一个实施方案中，经化学修饰或突变的红细胞生成素包含于本发明的药用组合物中。在另一个实施方案中，经化学修饰的红细胞生成素是氨基甲酰化EPO。所述氨基甲酰化EPO可为带至少一个或多个经修饰的赖氨酸残基或经修饰的N-末端基的EPO分子。在另一实施方案中，所述突变的红细胞生成素可为S100E。此外，在本发明的药用组合物中，本发明打算采用上述的本发明任何方法制备的组织保护细胞因子的混合物。例如，本发明的药用组合物可在红细胞生成素例如S100E中包含至少一个作为修饰一个或多个赖氨酸残基的结果的氨基甲酰化EPO和至少一个作为修饰氨基的结果的突变EPO。

本发明的药用组合物可包括治疗有效量的组织保护细胞因子和适用量的药学上可接受的载体，以向患者提供适当的给药形式。在特定实施方案中，术语“药学上可接受的”指被联邦管理局或州政府核准或列于美国药典或其它普遍公认的外国药典，用于动物更特别地用于人的可接受的。术语“载体”指所给予治疗剂所用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。

这类药用载体可为无菌液体，例如水和油(包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，例如，花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)中的盐水溶液。当静脉给予供所述药用组合物时，盐水溶液是优选载体。尤其对于可注射溶液，盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体。适用的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。

本发明的药用组合物还含有少量增湿剂或和乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可呈溶液、悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、散剂、缓释制剂等形式。

本发明的化合物可配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与游离氨基所形成的那些盐，例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些盐，和与游离羧基所形成的那些盐，例如衍生自钠、钾、铵、钙、铁的氢氧化物、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些盐。

                   治疗和给药方法

上述组织保护细胞因子和含有所述组织保护细胞因子的药用组合物打算用于治疗或预防性治疗、预防、延缓和减轻促炎细胞因子例如TNF的作用。这些作用包括发热、消瘦、嗜眠、贫血、水肿、局部缺血、器官衰竭和胰岛素抵抗。例如，如下面实施例4中所证实的，本发明的组织保护细胞因子减少与促炎细胞因子释放相关的发热、核心体温上升到正常核心体温以上。如图6所示，组织保护细胞因子、氨基甲酰化红细胞生成素的给药导致对大鼠施加LPS所经受的发热降低大于50％。可给予所述组织保护细胞因子以治疗、预防、延缓或减轻与促炎细胞因子有关的病症，例如脓毒病和与脓毒病相关的疾病例如粘连。

此外，还设计了用于治疗和预防一个或多个器官或组织中的炎性疾病的本发明的组织保护细胞因子。所述器官包括，但不限于，气管和肺、肾和尿道系统和前列腺(prostrate)。用于本文的术语“炎性疾病”指其中机理例如特异性T淋巴细胞或抗体与抗原的反应产生炎性细胞和内源性介质化学物质的补充的疾病。在某些情况下，器官和组织的正常功能会被血管渗透性和/或内脏平滑肌的收缩而改变。

因此，本发明的组织保护细胞因子可用于治疗和/或预防其中器官或组织的正常功能被改变的炎性疾病。这些疾病可包括与局部缺血有关的疾病，和与局部缺血无关的疾病，如变态反应、风湿性疾病和感染包括病毒、真菌和细菌感染。此外，所述创伤或感染可为急性或慢性。在一个实施方案中，设计了用于治疗和/或预防非局部缺血性疾病下的炎性疾病，即，其中所讨论的器官和/或组织有基本正常的血液供应的疾病的本发明的组织保护细胞因子。

此外，本发明的组织保护细胞因子可用于促进创伤的愈合。这可通过减少愈合所需时间、减少瘢痕的出现或完全消除瘢痕、降低并发症的风险，或改善愈合质量来实现。例如，在切口出现前、期间或之后使用本发明的组织保护细胞因子，切口的瘢痕即使无法完全避免，也会显著地减少。除手术外，本发明的组织保护细胞因子还用于针对来自各种疾病的创伤，包括但不限于，外伤(钝力和切割)、压迫(褥疮)、灼伤和疾病例如糖尿病或血管不足。

而且，本发明的组织保护细胞因子和药用组合物可用于对付促炎细胞因子例如TNF的作用。如图7a和7b所示，为应答创伤或感染物，本发明的组织保护细胞因子可分别减少促炎细胞因子、IL-6和TNF的上调。可以以治疗剂量给予本发明的组织保护细胞因子，以治疗、预防、减少或消除促炎细胞因子的影响，例如发热、消瘦、嗜眠、贫血、水肿、局部缺血、器官衰竭和胰岛素抵抗。如果所述组织保护细胞因子干扰促炎细胞因子的上调，则本发明的组织保护细胞因子也许能恢复被促炎细胞因子中断的内生功能，而不直接影响这些内生功能。另外，对于与促炎细胞因子相关的疾病，也可联合给予本发明的组织保护细胞因子和其它已知的治疗剂，以提供协同效应。例如，针对与癌症有关的贫血或其它慢性疾病的治疗，可包括给予典型的治疗剂量的重组红细胞生成素以恢复患者的红细胞压积，和给予治疗剂量的本发明的组织保护细胞因子以抵消促炎细胞因子的影响。这将允许在这类慢性疾病中使用较低剂量的重组红细胞生成素，从而大大降低血栓形成的风险。

本发明的组织保护细胞因子可用于系统或长期给药、急性治疗和/或间歇给药。在一个实施方案中，长期给予本发明的药用组合物以保护或增强靶细胞、组织或器官。在另一实施方案中，可急性给予本发明的药用组合物，即针对损伤期间的单一治疗。在又一实施方案中，在又一实施方案中，可以循环方式给予本发明的药用组合物。

可在损伤前给予本发明的组合物。同样地，可在手术前给予本发明的组织保护细胞因子，以预防脓毒病、延缓脓毒病的发作和/或减少脓毒病引起的并发症。例如，在腹部手术前可给予患者本发明的组织保护细胞因子。又如上所简述的，在手术前给予本发明的组织保护细胞因子不仅对脓毒病、粘连和普通炎性疾病有作用，而且，它们也可减少手术瘢痕的出现或完全消除瘢痕。

此外，可在创伤时或其后立刻给予本发明的组合物。因此，可在手术时或其后立即给予经受重大腹部手术的患者本发明的组织保护细胞因子，以预防、延缓因脓毒病、粘连或普通炎性疾病引起的并发症的发作或减少并发症。如果创伤期间或之后给予本发明的组织保护细胞因子，也可减少手术瘢痕的出现，或完全消除瘢痕。

例如，本发明的组织保护细胞因子可用于冲洗目的，例如当清理伤口时可给予含有本发明的组织保护细胞因子的盐水溶液，以治疗、预防、延缓因脓毒病、粘连或普通炎性疾病引起的并发症的发作或减少并发症。此外，可给予剖腹产术后的孕妇本发明的组织保护细胞因子，以预防、延缓因脓毒病、粘连或普通炎性疾病引起的并发症的发作或减少并发症。作为另一个实例，给予化疗期间的患者本发明的组织保护细胞因子，以避免脓毒病、粘连或普通炎性疾病。

在一个实施方案中，在损伤时静脉内给予本发明的组织保护细胞因子，其后的预定时间则皮下给予，以预防、延缓滋生于脓毒病、粘连或普通炎性疾病的并发症的发作或减少并发症。例如，损伤时，以约10μg/kg的量静脉内给予本发明组合物，接着按规定时间以10μg/kg皮下给予。

在确诊脓毒病的情况下，可每日给予本发明组合物，以治疗脓毒病、稳定患者和防止脓毒病发展到更严重的阶段，例如，严重脓毒病或败血症性休克。此外，可与已知的抗生素、抗真菌药、抗病毒药等，包括国际公布号WO 2004/004656中所列出的那些药物一起(通过引用全部结合到本文中)给予本发明的组织保护细胞因子。

可通过胃肠道外，即通过不经消化道的方法给予所述组合物。例如，胃肠道外给药可包括静脉注射、腹膜内注射、动脉内、肌内皮层内或皮下给药。也可经吸入或经粘膜给予所述组合物，例如，经口、鼻、直肠、阴道内、舌下、粘膜下层和透皮。此外，例如通过使用灌注液；局部使用，例如手术后与伤口敷料一起；经注射；经导尿管；经栓剂；或经植入物，所述植入物是多孔的、非多孔的或明胶材料，包括膜，例如硅橡胶膜或纤维，可向需要治疗的区域局部地给予本发明的组织保护细胞因子。本发明设计了上述给药方法的组合。

在一个实施方案中，胃肠道外给予本发明药用组合物。可以以约0.01pg-约5mg，优选约1pg-约5mg的剂量进行这样的给药。在一个实施方案中，所述剂量为约500pg-约5mg。在另一实施方案中，所述剂量为约1ng-约5mg。在另一实施方案中，所述剂量为约500ng-约5mg。在又一实施方案中，所述剂量为约1μg-约5mg。例如，所述剂量可为约500μg-约5mg。在另一实施方案中，所述剂量可为约1mg-约5mg。这类组合物可包括含水或不含水的无菌注射液或悬液，它们可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌药和使所述组合物与预定接受者血液基本等渗的溶质。在本发明的这一方面，所述药用组合物也可含有水、醇、多元醇、甘油、植物油及其混合物。

适于胃肠道外给药的药用组合物可以以单位剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿和小瓶呈现，也可贮存于冻干(冷冻干燥)条件下，临用前只需要加入无菌液体载体，例如，无菌盐水注射液。可由无菌散剂、粒剂和片剂制备临时注射液和悬液。在一个实施方案中，可为救护车、急救室和战场环境的紧急使用提供含有本发明的长效EPO的注射液的自动注射器。

静脉内给药

在一个实施方案中，根据常规程序将本发明的药用组合物配制成适于经静脉内给予人的药用组合物。例如，所述药用组合物可呈无菌等渗含水缓冲溶液形式。如需要，所述药用组合物也可含有增溶剂和/或局部麻醉剂例如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。既可分开也可混合在单位剂型中，例如，作为在密封容器例如标明活性药物数量的安瓿或小药囊中的干燥冻干散剂或无水浓缩物一起提供所述成分。当经输液给予本发明药用组合物时，含无菌药用级的水和盐水的输液瓶可用于分配所述组合物。同样，当经注射给予所述药用组合物时，给药前，用有无菌盐水的安瓿混合要混合的成份。

经口给药

本领域的普通技术人员会认可，本发明药用组合物可作为胶囊或片剂；散剂或颗粒剂；溶液、糖浆剂或悬液(在含水或不含水液体中)；可食用水沫或whips；乳剂；或它们的组合适于经口给药。所述口服制剂可包含约10％-约95％重量的活性成分。在一个实施方案中，所述活性成分以约20％-约80％重量的量包含于口服制剂中。在又一实施方案中，口服制剂含有约25％-约75％重量的所述活性成分。

片剂或硬明胶胶囊可含有乳糖、淀粉或其衍生物、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁、硬脂酸或其盐。软明胶胶囊可含有植物油、蜡、脂肪、半固体、液体多元醇或其混合物。溶液和糖浆可含有水、多元醇、糖或其混合物。

而且，打算用于口服的活性剂可用在胃肠道延缓所述活性成分的崩解和/或吸收的材料包衣或可与之混合。例如，所述活性剂可与甘油单硬脂酸酯、甘油双硬脂酸酯或它们的组合混合或用其包衣。因此，活性剂可实现超过多个小时的缓释，如需要，可保护所述活性成分免于在胃中降解。由于特定的pH或酶环境，也可配制口服药用组合物，以促进活性剂在特定胃肠部位释放。

透皮给药

可提供作为要与接受者的表皮在延长的时间内保持密切接触的分散贴剂的适用于透皮给药的药用组合物。此外，可以软膏剂、乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂、油剂、滴眼剂、锭剂、软锭剂和漱口剂及其组合，提供适于局部给药的药用组合物。当要对皮肤、口腔、眼或其它外部组织局部用药时，优选采用局部用软膏剂和乳膏剂。而且，当配制软膏剂时，所述活性成分，即长效EPO可与石蜡或可与水溶混的软膏剂基质一起使用。作为选择，所述活性成分可与水包油基质或油包水基质一起配制于为乳膏剂。当以滴眼剂形式局部给药时，本发明药用组合物优选含有溶解或悬浮于适用载体，例如含水溶剂中的所述活性成分。

经鼻和肺给药

适于经鼻和肺给药的药用组合物可含有固体载体，例如散剂(优选具有特定的约20微米-约500微米的粒径)。从靠近鼻子的装有散剂的容器经鼻快速吸入而给予散剂。在备选实施方案中，打算经鼻给药的本发明药用组合物可含有液体载体，例如鼻喷雾剂或滴鼻剂。优选直接进入鼻腔给予本发明药用组合物。

经吸嘴(mouthpiece)深吸入进入口咽可实现直接肺吸入，其它特别适用的装置包括，但不限于，加压气雾器、喷雾器或吹入器，它们可为提供预定剂量的活性成分而制成。打算肺吸入的药用组合物可含有所述活性成分的水或油溶液。优选经深吸入直接进入口咽给予本发明药用组合物。

直肠和阴道给药

以栓剂或灌肠剂提供适于直肠给药的药用组合物。在一个实施方案中，本发明的栓剂含有约0.5％-10％重量的活性成分。在另一实施方案中，所述栓剂含有约1％-约8％重量的活性成分。在又一实施方案中，所述活性成分以约2％-约6％重量的量存在于所述栓剂中。在本发明的这个方面，本发明药用组合物可含有常规粘合剂和载体，例如甘油三酯。

可以阴道栓剂、卫生栓(tampons)、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫或喷雾制剂提供适于阴道给药的药用组合物。

灌注给药

也可用灌注液给予本发明药用组合物，即，将液体泵入器官或组织(特别通过血管)。在这类实施方案中，所述药用组合物优选含有约0.01pM-约30pM，优选约15pM-约30nM的本发明的组织保护细胞因子。在一个实施方案中，所述灌注溶液是UW器官保存液(University of Wisconsin(UW)solution)(pH约7.4-约7.5，同渗质量摩尔浓度约320mOSm/1)，它含有约1U(10ng)/ml-约25U(250ng)/ml的本发明EPO化合物；5％羟基乙基淀粉(分子量优选从约200,000-约300,000，基本不含乙二醇、2-氯乙醇、氯化钠和丙酮)，25mM KH₂PO₄3mM谷胱甘肽；5mM腺苷；10mM葡萄糖；10mM HEPES缓冲液；5mM葡糖酸镁；1.5mM CaCl₂；105mM葡糖酸钠；200,000单位青霉素；40单位胰岛素；16mg地塞米松；和12mg酚红。所述UW溶液在美国专利号4,798,824中由详细讨论，通过引用全文结合到本文中。

局部给药

可要求向需要治疗的区域局部地给予本发明的药用组合物。可通过手术期间局部输液；局部应用，例如手术后与伤口敷料联合使用；经注射；经导尿管；经栓剂；或经植入物，所述植入物是多孔的、非多孔的或明胶材料，包括膜，例如硅橡胶膜或纤维，实现这类给药。

控释系统

除上面简要讨论透皮给药外，还可用控释系统传递本发明的组织保护细胞因子。例如，用静脉内输液、可植入渗透泵、透皮贴剂、脂质体或其它给药方式，给予所述组织保护细胞因子。这类控释系统可安置在接近治疗目标，即靶细胞、组织或器官的部位，这样只需要全身剂量的一部分。

剂量

根据本领域的普通技术人员所知道的因素，熟练的专业人员将确定用于上述给药方法的优选有效和无毒剂量的选择。这些因素的实例包括组织保护细胞因子的具体形式；所述组织保护细胞因子的药物动力学参数，例如生物利用率、代谢、半衰期等(提供给熟练的专业人员)；要治疗的疾病；在正常个体中要达到的益处；给药方法；给药次数，即长期、急性、间歇给药；联合用药；和影响所给予的药物功效的其它熟知因素。因此，应根据执业医师的判断和具体患者的情况确定准确的剂量。

治疗药剂盒

本发明还提供药物包或药剂盒，其含有充满一种或多种本发明药用组合物的成分的一个或多个容器。在一个实施方案中，有效量的组织保护细胞因子和药学上可接受的载体可包装在单一剂量小瓶或其它容器中。

当本发明药用组合物适于肠胃外给药时，例如，所述组合物可贮存于冻干条件下。因此，所述药剂盒可含有冻干组合物、无菌液体载体和用于注射的注射器。

在一个实施方案中，所述药剂盒包括含有足够几次治疗的冻干原料的安瓿，以便每次治疗期间，投药人会称出特定量的原料，再加入特定量的载体。在另一实施方案中，所述药剂盒可包括各含有特定量的冻干原料的多个安瓿，和各含有特定量载体的多个容器，以便在每次治疗期间，投药人只需将一个安瓿和一个载体容器中的内容物混合，而无须测量或称重。在又一实施方案中，所述药剂盒装有自动注射器，它含有本发明的组织保护细胞因子的注射液。在又一实施方案中，所述药剂盒包括至少一个含有冻干组合物的安瓿、至少一个载体溶液容器、至少一个含有局部麻醉药的容器和至少一个注射器(或类似物)。所述安瓿和容器优选被不漏气地密封。

当经输液给予本发明药用组合物时，所述药剂盒优选包括至少一个带所述药用组合物的安瓿和至少一个带无菌药物级别的水或盐水的输液瓶。

本发明的药剂盒还可包括至少一个吸嘴或特别适于直接吸入肺部的装置例如加压气雾器、雾化吸入器或吹药器。在本发明的这一方面，所述药剂盒可包括含有所述药用组合物或所述装置的直接吸入肺部的装置，和至少一个安瓿的本发明的组织保护细胞因子的水或油溶液。

当本发明的组织保护细胞因子适于经口、透皮、直肠、阴道或经鼻给药时，所述药剂盒优选包括含有所述活性成分的至少一个安瓿和至少一个给药辅助物。给药辅助物的实例包括，但不限于，测量匙(用于口服给药)、无菌清洁垫(用于透皮给药)和鼻吸气器(用于经鼻给药)。这类药剂盒可包括单一剂量的组织保护细胞因子(急性治疗)或多剂量(长期治疗)。

此外，所述药剂盒可配备一种或多种类型的溶液。例如，本发明的组织保护细胞因子可于白蛋白溶液和聚山梨酯溶液中制备。如果所述药剂盒含有聚山梨酯溶液，则标示“无白蛋白”优选显示于容器标签和药剂盒正面。

而且，所述药剂盒还可包括经管理药物或生物制品的生产、使用或销售的政府部门规定格式的说明书，该说明书反映生产、使用或销售的管理部门对人用药的批准。

确定脓毒病/炎症治疗效果的试验

本发明也打算验证确定组织保护细胞因子是否能有效治疗、预防、延缓感染引起的脓毒病、粘连和炎症的发作或减少感染引起的脓毒病、粘连和炎症的并发症。本发明设计了任何试验，包括实验室控制的脓毒病引入、粘连引入或炎性应答介导。

例如，本发明适用的实验可包括盲研究，其中Sprague Dawley大鼠的盲肠被暴露并末梢结扎至回盲瓣，以避免肠梗阻。再刺破盲肠并轻轻挤压，压出少量粪便，然后再放回腹腔。所放出粪便进入器官引起感染，依次引起脓毒病、粘连、炎性疾病或它们的组合。再缝合腹部。优选将大鼠分组，至少一组接收盐水，而另一组接受要试验的组织保护细胞因子。结扎时，优选静脉注射给予各组动物预定量的盐水或所述组织保护细胞因子。在结扎后，可在预定时间进行选定处理，即盐水或所述组织保护细胞因子的皮下给药。此外，所述研究可包括一组已经被切开但未感染的大鼠。

再监测所述动物的粘连和疾病评分。表1提供根据粘连的形成给动物评分的方法。

表1.累积粘连评分等级
			分数	0	无粘连
	+1	一条从网膜到靶器官的粘连带
				+1	一条从网膜到疤痕的粘连带
	+1	一条从网膜到另一处的粘连带
				+1	一条从附件/附睾的脂肪体到靶器官的粘连带
	+1	一条从附件/附睾的脂肪体到疤痕的粘连带
				+1	一条从附件/附睾的脂肪体到另一处的粘连带
	+1	非上述的任何粘连带(例如肝到疤痕)
				+1	靶器官粘连到腹壁
	+1	靶器官粘连到腹部疤痕
				+1	靶器官粘连到肠
	+1	靶器官粘连到肝或脾
				+1	任何其它器官粘连

总分

各种粘连为1分，计算出累积粘连评分。在一个实施方案中，累积粘连评分优选8或更少。在另一实施方案中，累积粘连评分为约5或更少。在又一实施方案中，累积粘连评分为约3或更少。

也可根据各种因素计算每个动物的疾病评分。用于这类评分的因素包括，但不限于，行为因素例如行走姿势、绳悬挂能力、对环境的探查行为、攀爬泡沫垫上墙、身体应答例如毛发竖立和氧合作用和所形成的粘连数量。例如，当大鼠患病时，该动物行走时会弓起背而不会探查它/她的周围环境。此外，患病大鼠的脉搏速率是不准确的，而健康大鼠的脉搏速率一般约为300下/分钟。表2提供各种患病动物的一种评分方法，以评价用于治疗的组织保护细胞因子的效果。

表2.累积疾病评分
		行为试验
+1	竖毛(毛发笔直竖立)
		+1	不动性
+1	失去杠平衡
		+1	不能握或爬
+1	不能用爪
		+1	变成弓背
+1	异常行走
		+1	不探测周围环境
+1	30秒内抓不住细绳
		+1	反射作用减少
+1	食欲不振(食物和饮料)
		+1	体重下降
+1	垂死

+1	异常心率(＜或＞50％正常值)
		+1	自发出血
+1	氧饱和度下降
		总分

综合看来，14或14以上的累积疾病评分预示动物的死亡，而低得多的评分表明动物相对健康。在一个实施方案中，经诱导脓毒病的动物用至少一种本发明的组织保护细胞因子治疗8天后的疾病评分约为5或更少。在另一实施方案中，治疗后动物的疾病评分约为4或更少。在又一实施方案中，治疗后动物的疾病评分约为2或更少。在另一实施方案中，治疗后动物的疾病评分约为1或更少。

                       实施例

下列非限制性实施例只是说明本发明的优选实施方案，并不限制本发明，发明范围由所附权利要求书确定。除非另有说明，份数指重量份。

实施例1：采用大鼠腹部脓毒病模型的盲研究

暴露Sprague Dawley大鼠的盲肠，仅末梢结扎至回盲瓣，以避免肠梗阻，用18号口径针剌破两次，轻轻挤压出少量粪便，再放回腹腔(将粪便引入腹膜，以诱导感染)。用3-0丝缝合线缝合腹部。

将所述动物分成两组：

1组：引入脓毒病，用盐水治疗(n＝8)。结扎时，1组中的动物静脉注射给予100μl盐水。每日皮下给予盐水(100μl)8天或直到死亡。

2组：引入脓毒病，用氨基甲酰化EPO(n＝8)治疗。结扎时，静脉注射给予动物100μl盐水中的10μg/kg氨基甲酰化EPO(以红细胞生成活性被有效去除的方式制备)。每日以100μl盐水中的10μg/kg的剂量皮下治疗8天(或直到死亡)。

发病率和死亡率

如在图1中所图示说明的，在1组中，8天后，少于约50％的动物存活。然而，在2组中，存活率远大于约50％。尤其是，治疗后第一天，与2组中动物约80％存活率相比较，1组中的动物的存活率约为60％。然而，3天后，1组的存活率急剧下降到约25％，而2组动物的存活率远大于约60％。因此，接受本发明氨基甲酰化EPO的动物比接受盐水的动物有高得多的存活率。

累积粘连评分

从腹膜液体和脓肿中取样以用于需氧和厌氧培养。对需氧培养，于37℃将样本在血中用EMB琼脂中培养24小时。对厌氧培养，于37℃将样本置于厌氧血琼脂并于37℃在Gas-Pak广口瓶中培养24小时。用标准的细菌学技术鉴定生长的菌落。

在4小时内对死亡动物尸检，纪录死亡原因。采用本申请中前述表1，计算每个动物受伤后24小时的累积粘连评分，再全组平均(图示于图2中)。特别地，1组的总平均分约为10，而2组的总平均分约为6。总之，接受本发明的氨基甲酰化EPO的动物比接受盐水的动物有更少的粘连。

疾病评分

如本申请的表2中前述计算疾病评分，其结果图示于图3中。尤其是，治疗后的第一天，与2组动物的平均疾病评分约3相比，1组动物的平均疾病评分为约9。5天后，1组动物的平均疾病评分为约12，而2组动物的平均疾病评分为约5或更低。

结疤

还目测了所述大鼠切口的瘢痕。2组大鼠比1组大鼠有更少的瘢痕。

实施例2：使用大鼠腹部脓毒病模型的盲研究

暴露Sprague Dawley大鼠的盲肠，仅末梢结扎至回盲瓣，以避免肠梗阻，用18号口径针剌破两次，轻轻挤压出少量粪便，再放回腹腔(将粪便引入腹膜，以诱导感染)。用3-0丝缝合线缝合腹部。

所述动物分成三组：

1组：如上述切开，但不诱导脓毒病(n＝6)。

2组：诱导脓毒病，用盐水治疗(n＝8)。结扎时，经静脉注射给予2组中的动物100μl盐水。每日皮下给予盐水(100μl)共8天(或直至死亡)。

3组：诱导脓毒病，用氨基甲酰化EPO治疗(n＝8)。结扎时，经静脉注射给予动物100μl盐水中的10μg/kg氨基甲酰化EPO。每日以100μl盐水中的10μg/kg的剂量皮下治疗8天(或直至死亡)。

累积粘连评分

从腹膜液体和脓肿中取样以用于需氧和厌氧培养。对需氧培养，于37℃样本在血中用EMB琼脂培养24小时。对厌氧培养，于37℃将样本置于血琼脂中并于37℃在Gas-Pak广口瓶中培养24小时。用标准的细菌学技术鉴定生长的菌落。

在4小时内对死亡动物尸检，纪录死亡原因。采用本申请中前述表1，计算每个动物受伤后24小时的累积粘连评分，再全组平均(图示于图4中)。特别地，1、2和3组总平均分分别低于约2、约10和约6。因此，接受本发明的氨基甲酰化EPO的动物比接受盐水的动物有更少的粘连。

肿瘤坏死因子研究

在一段时间后，用得自R&D Systems(#RTA00)的能够检测每组大鼠TNF-α的ELISA测定动物血液中存在的肿瘤坏死因子(TNF)水平，以努力确定氨基甲酰化EPO减少粘连的能力背后的机理。如图5所示，24小时后，三个组之间的TNF量的区别并无明显不同。三小时(最大炎性疾病)后，全部三组的系统中的TNF量下降。这些结果表明，粘连后面公认的机理，即，炎性应答，也许是不准确的机理。事实上，所述TNF研究表明，粘连背后的机理也许应归于细胞死亡，以及，因为本发明的氨基甲酰化EPO有组织保护功能，一旦给药，所述粘连会因细胞坏死减少而减少。

结疤

经目测测，3组的大鼠比1组和2组基本上有更少的瘢痕。

实施例3：用大鼠腹部脓毒病模型的盲研究

暴露Sprague Dawley大鼠的盲肠，仅末梢结扎至回盲瓣，以避免肠梗阻，用18号口径针剌破两次，轻轻挤压出少量粪便，再放回腹腔(将粪便引入腹膜，以诱导感染)。用3-0丝缝合线缝合腹部。

所述动物分成四组：

1组：如上述切开，但不诱导脓毒病(n＝6)。

2组：诱导脓毒病，用盐水治疗(n＝8)。结扎时，经静脉注射给予组2中的动物100μl盐水。每日皮下给予盐水(100μl)8天(或直至死亡)。

3组：诱导脓毒病，用rhu-EPO治疗(n＝8)。结扎时，经静脉注射给予动物100μl盐水中的10μg/kg rhu-EPO。每日以100μl盐水中的10μg/kg的剂量皮下治疗8天(或直至死亡)。

4组：诱导脓毒病，用氨基甲酰化EPO治疗(n＝8)。结扎时，经静脉注射给予动物100μl盐水中的10μg/kg氨基甲酰化EPO。每日以100μl盐水中的10μg/kg的剂量皮下治疗8天(或直至死亡)。

发病率和死亡率

结扎后第一天，1组(假饲(sham))中所有动物存活，而2组中的动物无一存活。与4组中的5只动物相比，3组(rhu-EPO)中只有2只动物存活。因此，接受本发明氨基甲酰化EPO的动物比接受盐水或rhu-EPO的动物有高得多的存活率。

结疤

经目测，4组的大鼠比1-3组基本上有更少的瘢痕。

实施例4：脂多糖诱导的大鼠应答

本实施例的目的是确定氨基甲酰化红细胞生成素对由脂多糖(LPS)诱导的脓毒病样疾病的效果。LPS是一种存在于细菌表面的内毒素，它诱导动物脓毒病样应答(核心温度升高和细胞因子诱导)。腹膜内给予雄性Sprague/Dawley大鼠(300-350g)240ug/kg。再以10ug/kg静脉注射盐水(n＝6)或氨基甲酰化红细胞生成素(n＝6)处理所述动物。然后确定LPS对核心体温的浓度依赖效应。作为选择，给予氨基甲酰化红细胞生成素(2ul中5ug/kg)以直接应用于心室内(Seeley等，(1996)Horm Metab Res.28：664-8.)，以确定应用途径是否不同地改变核心体温。在第一个24小时期间监测核心体温。在某些情况下，取出血液进行后续的细胞因子(例如，TNF、IL-6)分析。Seeley等，(1996)Horm Metab Res.28：664-8。

核心体温

作为LPS诱导的脓毒病样疾病一部分，给予LPS的动物经历两个阶段的发热。第一阶段的发热的特征是，温度明显增加伴以血压的升高和罹患个体的失眠。而第二阶段的发热较不明显，伴以血压正常或血压过低和昏睡和瞌睡。理论上认为，发热阶段表现出身体用于抵抗疾病的策略方面的变化(Romanovsky等，Am.J.Physiol，271：R244-R253，1996)。在本实施例中，如图6中所显示的，给予LPS处理过的动物氨基甲酰化红细胞生成素导致两阶段发热的降低。

TNF和I1-6的血清水平

如图7(a)和图7(b)中所显示的，氨基甲酰化红细胞生成素的调节对LPS的发热应答的能力还与其抑制致热的细胞因子例如TNF和IL-6的出现的能力有关。ELISA用于确定从大鼠取样的血清中的TNF和IL-6的存在。图7(a)和7(b)表明用氨基甲酰化红细胞生成素治疗显著减少促炎细胞因子、IL-6和TNF的存在。

氨基甲酰化红细胞生成素的外周与中枢给药

为排除氨基甲酰化红细胞生成素对下丘脑的直接影响，以上述方式心室内给予所述氨基甲酰化红细胞生成素。如图8(a)和图8(b)所示，外周和中枢给予氨基甲酰化红细胞生成素之间在核心体温的降低方面没有相关性。根据这些结果和氨基甲酰化红细胞生成素对致热细胞因子的作用，表明氨基甲酰化红细胞生成素通过抑制致热细胞因子影响核心体温。这表明组织保护细胞因子，例如氨基甲酰化红细胞生成素，可用于调节、缓解或预防这些细胞因子在慢性病(消瘦、昏睡、贫血等)中的影响。

实施例5：在大鼠损伤中，红细胞生成素类似物对局部缺血性皮瓣的作用

完成局部缺血伤口皮瓣模型以确定氨基甲酰化红细胞生成素对局部缺血性皮瓣创伤恢复的作用。用异氟烷麻醉雄性Sprague/Dawley大鼠(300-350g)。然后在大鼠背上切下9cm长和3cm宽的皮瓣。所述皮瓣包括皮肤、皮下层和肉膜。如在(Buemi，M.，等，(2002)ActaDerm.Venereol.82：411-417；Sarau，A.，等，(2003)Laryngoscope.113：85-89)中所述，在切下后，拿起所述皮瓣，接着立即在其床上再缝合。手术后立即、分析期间的1天、2天、然后每隔一周给予动物红细胞生成素类似物、氨基甲酰化EPO(0.3，μg/kg，s.c.)。每周对动物称重，对伤口照相。Buemi，M.，等，(2002)Acta Derm.Venereol.82：411-417。执行该程序34天，再根据所述动物的照片对愈合创伤面积定量。如图9所示，在同一时间段内接受氨基甲酰化红细胞生成素的大鼠比用盐水处理的那些有更大百分率的愈合创伤。

本文所描述和所要求的本发明并不限制在本文所公开的具体定实施方案的范围内，因为这些实施方案仅被认为是本发明几个方面的示例。特别是，本领域的普通技术人员应该认识到，尽管用氨基甲酰化EPO实现上述实施例，但预期任何本发明的组织保护细胞因子会有同样的结果。任何等同的实施方案均应在本发明的范围内。事实上，从前文的叙述中，除本文所表示和所述的那些外，对本发明的各种修饰对本领域技术人员而言应是显而易见的。这类修饰也打算落入所附的权利要求书的范围内。前文中引用的所有专利和专利申请通过全文引用特别结合到本文中。

Claims (36)

1.一种治疗、预防、延缓哺乳动物中促炎细胞因子的发生，或减轻其作用的方法，它包括给予在药用载体中的治疗有效量的至少一种组织保护细胞因子的步骤。

2.权利要求1的方法，其中所述至少一种组织保护细胞因子包括经化学修饰的红细胞生成素或突变的红细胞生成素。

3.权利要求2的方法，其中所述经化学修饰的红细胞生成素选自：i)缺乏唾液酸部分的红细胞生成素；ii)至少没有唾液酸部分的红细胞生成素；iii)至少没有N-连接或没有O-连接的碳水化合物的红细胞生成素；iv)具有至少一种经用至少一种糖苷酶处理天然红细胞生成素而减少了碳水化合物的量的红细胞生成素；v)含有至少一个或多个氧化的碳水化合物的红细胞生成素；vi)含有至少一个或多个氧化的碳水化合物，且被化学还原的红细胞生成素；vii)含有至少一个或多个经修饰的精氨酸残基的红细胞生成素；viii)含有至少一个或多个经修饰的赖氨酸残基或红细胞生成素分子的N-末端氨基的修饰物的红细胞生成素；ix)含有至少一个经修饰的酪氨酸残基的红细胞生成素；x)含有至少一个经修饰的天冬氨酸或谷氨酸残基的红细胞生成素；xi)含有至少一个经修饰的色氨酸残基的红细胞生成素；xii)具有至少一个离去氨基的红细胞生成素；xiii)红细胞生成素分子中至少一个胱氨酸键的至少一个被打开的红细胞生成素；或xiv)截短的红细胞生成素。

4.权利要求3的方法，其中经化学修饰的红细胞生成素缺乏红细胞生成素的红细胞生成的作用。

5.权利要求4的方法，其中经化学修饰的红细胞生成素包括氨基甲酰化红细胞生成素。

6.权利要求2的方法，其中所述突变的红细胞生成素选自下列突变的一种或多种：C7S、R10I、V11S、L12A、E13A、R14A、R14B、R14E、R14Q、Y15A、Y15F、Y15I、K20A、K20E、E21A、C29S、C29Y、C33S、C33Y、P42N、T44I、K45A、K45D、V46A、N47A、F48A、F48I、Y49A、Y49S、W51F、W51N、Q59N、E62T、L67S、L70A、D96R、K97D、S100R、S100E、S100A、S100T、G101A、G101I、L102A、R103A、S104A、S104I、L105A、T106A、T106I、T107A、T107L、L108K、L108A、S126A、F142I、R143A、S146A、N147K、N147A、F148Y、L149A、R150A、G151A、K152A、L153A、L155A、C160S、I6A、C7A、B13A、N24K、A30N、H32T、N38K、N83K、P42A、D43A、K52A、K97A、K116A、T132A、I133A、T134A、K140A、P148A、R150B、G151A、K152W、K154A、G158A、C161A和/或R162A。

7.权利要求6的方法，其中所述突变的红细胞生成素缺乏红细胞生成素的红细胞生成作用。

8.权利要求1的方法，其中所述促炎细胞因子包括白细胞介素或TNF。

9.权利要求8的方法，其中所述促炎细胞因子是TNF。

10.权利要求1的方法，其中所述促炎细胞因子的作用包括发热、消瘦、嗜眠、贫血、水肿、局部缺血、器官衰竭和胰岛素抵抗。

11.一种治疗、预防、延缓哺乳动物的与促炎细胞因子的作用有关的疾病的发作的方法，它包括给予在药用载体中的治疗有效量的至少一种组织保护细胞因子的步骤。

12.权利要求11的方法，其中所述至少一种组织保护细胞因子包括经化学修饰的红细胞生成素或突变的红细胞生成素。

13.权利要求12的方法，其中经化学修饰的红细胞生成素选自：i)缺乏唾液酸部分的红细胞生成素；ii)至少没有唾液酸部分的红细胞生成素；iii)至少没有N-连接或没有O-连接的碳水化合物的红细胞生成素；iv)具有至少一种经用至少一种糖苷酶处理天然红细胞生成素而减少了碳水化合物的量的红细胞生成素；v)含有至少一个或多个氧化的碳水化合物的红细胞生成素；vi)含有至少一个或多个氧化的碳水化合物，且被化学还原的红细胞生成素；vii)含有至少一个或多个经修饰的精氨酸残基的红细胞生成素；viii)含有至少一个或多个经修饰的赖氨酸残基或红细胞生成素分子的N-末端氨基的修饰物的红细胞生成素；ix)含有至少一个经修饰的酪氨酸残基的红细胞生成素；x)含有至少一个经修饰的天冬氨酸或谷氨酸残基的红细胞生成素；xi)含有至少一个经修饰的色氨酸残基的红细胞生成素；xii)具有至少一个离去氨基的红细胞生成素；xiii)红细胞生成素分子中至少一个胱氨酸键的至少一个被打开的红细胞生成素；或xiv)截短的红细胞生成素。

14.权利要求13的方法，其中经化学修饰的红细胞生成素缺乏红细胞生成素的红细胞生成作用。

15.权利要求14的方法，其中经化学修饰的红细胞生成素包括氨基甲酰化红细胞生成素。

16.权利要求12的方法，其中所述突变的红细胞生成素选自下列突变的一种或多种：C7S、R10I、V11S、L12A、E13A、R14A、R14B、R14E、R14Q、Y15A、Y15F、Y15I、K20A、K20E、E21A、C29S、C29Y、C33S、C33Y、P42N、T44I、K45A、K45D、V46A、N47A、F48A、F48I、Y49A、Y49S、W51F、W51N、Q59N、E62T、L67S、L70A、D96R、K97D、S100R、S100E、S100A、S100T、G101A、G101I、L102A、R103A、S104A、S104I、L105A、T106A、T106I、T107A、T107L、L108K、L108A、S126A、F142I、R143A、S146A、N147K、N147A、F148Y、L149A、R150A、G151A、K152A、L153A、L155A、C160S、I6A、C7A、B13A、N24K、A30N、H32T、N38K、N83K、P42A、D43A、K52A、K97A、K116A、T132A、I133A、T134A、K140A、P148A、R150B、G151A、K152W、K154A、G158A、C161A和/或R162A。

17.权利要求16的方法，其中所述突变的红细胞生成素缺乏红细胞生成素的红细胞生成作用。

18.权利要求11的方法，其中所述与促炎细胞因子的作用有关的疾病包括脓毒病、粘连、创伤、炎症或慢性疾病。

19.一种药用组合物，它含有一定量的有效治疗、预防、延缓哺乳动物的促炎细胞因子的发作或减少其作用的至少一种组织保护细胞因子。

20.权利要求19的药用组合物，其中所述至少一种组织保护细胞因子包括经化学修饰的红细胞生成素或突变的红细胞生成素。

21.权利要求20的药用组合物，其中经化学修饰的红细胞生成素选自：i)缺乏唾液酸部分的红细胞生成素；ii)至少没有唾液酸部分的红细胞生成素；iii)至少没有N-连接或没有O-连接的碳水化合物的红细胞生成素；iv)具有至少一种经用至少一种糖苷酶处理天然红细胞生成素而减少了碳水化合物的量的红细胞生成素；v)含有至少一个或多个氧化的碳水化合物的红细胞生成素；vi)含有至少一个或多个氧化的碳水化合物，且被化学还原的红细胞生成素；vii)含有至少一个或多个经修饰的精氨酸残基的红细胞生成素；viii)含有至少一个或多个经修饰的赖氨酸残基或红细胞生成素分子的N-末端氨基的修饰物的红细胞生成素；ix)含有至少一个经修饰的酪氨酸残基的红细胞生成素；x)含有至少一个经修饰的天冬氨酸或谷氨酸残基的红细胞生成素；xi)含有至少一个经修饰的色氨酸残基的红细胞生成素；xii)具有至少一个离去氨基的红细胞生成素；xiii)红细胞生成素分子中至少一个胱氨酸键的至少一个被打开的红细胞生成素；或xiv)截短的红细胞生成素。

22.权利要求21的药用组合物，其中经化学修饰的红细胞生成素缺乏红细胞生成素的红细胞生成作用。

23.权利要求22的药用组合物，其中经化学修饰的红细胞生成素包括氨基甲酰化红细胞生成素。

24.权利要求20的药用组合物，其中所述突变的红细胞生成素选自下列突变的一种或多种：C7S、R10I、V11S、L12A、E13A、R14A、R14B、R14E、R14Q、Y15A、Y15F、Y15I、K20A、K20E、E21A、C29S、C29Y、C33S、C33Y、P42N、T44I、K45A、K45D、V46A、N47A、F48A、F48I、Y49A、Y49S、W51F、W51N、Q59N、E62T、L67S、L70A、D96R、K97D、S100R、S100E、S100A、S100T、G101A、G101I、L102A、R103A、S104A、S104I、L105A、T106A、T106I、T107A、T107L、L108K、L108A、S126A、F142I、R143A、S146A、N147K、N147A、F148Y、L149A、R150A、G151A、K152A、L153A、L155A、C160S、I6A、C7A、B13A、N24K、A30N、H32T、N38K、N83K、P42A、D43A、K52A、K97A、K116A、T132A、I133A、T134A、K140A、P148A、R150B、G151A、K152W、K154A、G158A、C161A和/或R162A。

25.权利要求24的药用组合物，其中所述突变的红细胞生成素缺乏红细胞生成素的红细胞生成作用。

26.权利要求19的药用组合物，其中所述促炎细胞因子包括白细胞介素或TNF。

27.权利要求26的药用组合物，其中所述促炎细胞因子是TNF。

28.权利要求19的药用组合物，其中所述促炎细胞因子的作用包括发热、消瘦、嗜眠、贫血、水肿、局部缺血、器官衰竭和胰岛素抵抗。

29.一种药用组合物，它含有一定量的有效治疗、预防、延缓哺乳动物的与促炎细胞因子有关的疾病的发作的至少一种组织保护细胞因子。

30.权利要求29的药用组合物，其中所述至少一种组织保护细胞因子包括经化学修饰的红细胞生成素或突变的红细胞生成素。

31.权利要求30的药用组合物，其中经化学修饰的红细胞生成素选自：i)缺乏唾液酸部分的红细胞生成素；ii)至少没有唾液酸部分的红细胞生成素；iii)至少没有N-连接或没有O-连接的碳水化合物的红细胞生成素；iv)具有至少一种经用至少一种糖苷酶处理天然红细胞生成素而减少了碳水化合物的量的红细胞生成素；v)含有至少一个或多个氧化的碳水化合物的红细胞生成素；vi)含有至少一个或多个氧化的碳水化合物，且被化学还原的红细胞生成素；vii)含有至少一个或多个经修饰的精氨酸残基的红细胞生成素；viii)含有至少一个或多个经修饰的赖氨酸残基或红细胞生成素分子的N-末端氨基的修饰物的红细胞生成素；ix)含有至少一个经修饰的酪氨酸残基的红细胞生成素；x)含有至少一个经修饰的天冬氨酸或谷氨酸残基的红细胞生成素；xi)含有至少一个经修饰的色氨酸残基的红细胞生成素；xii)具有至少一个离去氨基的红细胞生成素；xiii)红细胞生成素分子中至少一个胱氨酸键的至少一个被打开的红细胞生成素；或xiv)截短的红细胞生成素。

32.权利要求31的药用组合物，其中经化学修饰的红细胞生成素缺乏红细胞生成素的红细胞生成作用。

33.权利要求32的药用组合物，其中经化学修饰的红细胞生成素包括氨基甲酰化红细胞生成素。

34.权利要求30的药用组合物，其中所述突变的红细胞生成素选自下列突变的一种或多种：C7S、R10I、V11S、L12A、E13A、R14A、R14B、R14E、R14Q、Y15A、Y15F、Y15I、K20A、K20E、E21A、C29S、C29Y、C33S、C33Y、P42N、T44I、K45A、K45D、V46A、N47A、F48A、F48I、Y49A、Y49S、W51F、W51N、Q59N、E62T、L67S、L70A、D96R、K97D、S100R、S100E、S100A、S100T、G101A、G101I、L102A、R103A、S104A、S104I、L105A、T106A、T106I、T107A、T107L、L108K、L108A、S126A、F142I、R143A、S146A、N147K、N147A、F148Y、L149A、R150A、G151A、K152A、L153A、L155A、C160S、I6A、C7A、B13A、N24K、A30N、H32T、N38K、N83K、P42A、D43A、K52A、K97A、K116A、T132A、I133A、T134A、K140A、P148A、R150B、G151A、K152W、K154A、G158A、C161A和/或R162A。

35.权利要求34的药用组合物，其中所述突变的红细胞生成素缺乏红细胞生成素的红细胞生成作用。

36.权利要求29的药用组合物，其中所述与促炎细胞因子的作用有关的疾病包括脓毒病、粘连、创伤、炎症或慢性疾病。

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