CN1878793A - 拮抗hmgb1的单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

在不同的实施方案中，本发明关注于结合脊椎动物高迁移率族匣(HMGB)多肽的抗体或其抗原片段，测定和/或鉴定结合HMGB多肽的药剂的方法，对以炎症因子级联放大活性为特征的病人情况给予治疗的方法和测定样本中HMGB多肽的方法。

Description

拮抗HMGB1的单克隆抗体
相关应用
本申请主张2003年11月11日提交的美国临时申请No.60/502568的利益。通过在此引述将上述申请的全部教导都合并于本文。
发明背景
炎症通常是由促炎症细胞因子诱导的，例如肿瘤凋亡因子(TNF)，白细胞介素(IL)-α，IL-1β，IL-6，巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)，和其他化合物。这些促炎症细胞因子是由许多不同类型的细胞产生的，特别是免疫细胞(例如，单核细胞，巨噬细胞和嗜中性粒细胞)，但也有非-免疫细胞如纤维原细胞，造骨细胞，平滑肌细胞，上皮细胞，和神经细胞。这些促炎症细胞因子导致在促炎症细胞因子级联的早期阶段的多种失调。
早期的促炎症细胞因子(例如：TNF，IN-1，等)介导炎症，并导致高迁移率族匣蛋白B1(HMGB1；也称为HMG-1和HMG1)的释放，该蛋白聚集于血清中并介导滞后的致命性及早期促炎症细胞因子的进一步诱导。HMGB1最初被认为是DNA-结合蛋白家族中的一员，定义为高迁移率族匣(HMGB)蛋白，其对于DNA的结构和稳定性是必要的。其被认为是一种普遍存在的非序列特异性结合双链DNA的核蛋白。HMGB1分子具有三个域：两个DNA结合基，定义为HMGB A匣和HMGB B匣，及一个酸性羧基末端。两个HMGB匣是高度保守的80氨基酸，L-型域。HMG匣在其他转录因子中也有表达，包括RNA聚合酶I转录因子，人下游-结合因子和淋巴-特异因子。
最近的证据已经暗示HMG1是一种引发内毒素血症中滞后毁坏性的细胞因子介导者(Andersson，U.，et al.，J.Exp.Med.192(4)：565-570(2000))。该工作显示细菌内毒素(脂多糖(LPS))激活单核细胞/巨噬细胞释放HMG1作为活化作用的随后应答反应，并导致具毒性的血清HMG1水平的升高。即使在早期细胞因子应答反应之后再给予随后的抗体治疗，针对HMG1的抗体仍可以防止内毒素的致命性。与其他促炎症细胞因子类似，HMG1是一种单核细胞的蛋白质催化剂。HMG1在气管内的应用导致急性肺损害，而抗-HMG1抗体可保护内毒素-引发的肺水肿(Abraham，E.，et al.，J.Immunol.165：2950-2954(2000))。血清HMG1水平在脓血病或出血性休克的急性病人中升高，并且其在非生还者中的水平要远高于生还者。
HMG1已经被认为是RAGE的一个配基，它是一种免疫球蛋白超家族的多-配基受体。RAGE在内皮细胞，平滑肌细胞，单核细胞，神经中表达，并且配基交互作用在MAP激酶，P21ras，NF-kB中转换信号。HMG1在内毒素血症中显示的滞后动力学特性使其成为一种潜在的良好治疗目标，但对于HMG1信号传导和毒性的分子基础了解得很少。
因此，基于HMG1蛋白在介导炎症中的重要性，确定用于诊断和治疗的结合HMGB的抗体显得十分有益。
发明概述
在不同的实施方案中，本发明关注于结合脊椎动物高迁移率族匣蛋白(HMGB)多肽的抗体或其抗原-结合片段，检定并且/或者鉴别结合HMGB多肽的药剂的方法，对促炎症细胞因子级联活化作用特征化的病人情况给予治疗的方法和测定样品中HMGB多肽的方法。
在某一实施方案中，本发明指特异地结合脊椎动物HMGBAbox，但并不特异地结合非-A boxHMGB表位的抗体或其抗原-结合片段，结合的抗体或抗原-结合片段可抑制HMGB蛋白处理的脊椎动物细胞中促炎症细胞因子的释放。
在某些实施方案中，本发明指鼠科杂交瘤6E6 HMGB1 mAb，鼠科杂交瘤6H9 HMGB1 mAb，鼠科杂交瘤2G7 HMGB1 mAb，鼠科杂交瘤2E11 HMGB1 mAb，或鼠科杂交瘤10D4 HMGB1mAb产生的抗体。在其他实施方案中，本发明指抗体或其抗原结合片段，其与脊髓动物HMGB1多肽的结合可以被6E6 HMGB1mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb和/或10D4 HMGB1 mAb抑制。在另一方面，本发明指含有6E6HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1mAb和/或10D4 HMGB1 mAB特定表位的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，本发明指抗体或抗原结合片段，其可结合由SEQ ID NO：1中46至63氨基酸残基，SEQ ID NO：1中61至78氨基酸残基和/或SEQ ID NO：1中151至168氨基酸残基组成的多肽。在某一实施方案中，本发明指抗体或抗原结合片段，其可结合由SEQ ID NO：1中46至63氨基酸残基组成的多肽，该结合可被2G7 HMGB1 mAb抑制。在另一实施方案中，本发明指抗体或抗原结合片段，其可结合由SEQ ID NO：1中61至78氨基酸残基组成的多肽，该结合能被6E6 HMGB1 mAb和/或6H9HMGB1 mAb抑制。在另一实施方案中，本发明指抗体或抗原结合片段，其可结合由SEQ ID NO：1中151至168氨基酸残基组成的多肽，该结合能被2E11 HMGB1 mAb抑制。
在某些实施方案中，本发明指从6E6 HMGB1 mAb，6H9HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb和2E11HMGB1 mAb组选取的，包括抗体的CDRs(CDR1，CDR2和CDR3)轻链和CDRs(CDR1，CDR2，CDR3)重链的抗体或抗原结合片段。
在其它实施方案中，本发明指鼠科杂交瘤6E6 HMGB1 mAb，鼠科杂交瘤6H9 HMGB1 mAb，鼠科杂交瘤2G7 HMGB1 mAb，鼠科杂交瘤2E11 HMGB1 mAb，或鼠科杂交瘤10D4 HMGB1mAb。
在另一实施方案中，本发明指一种分离细胞，其可产生特异结合脊髓动物HMGB A box但不特异结合非-A box HMGB表位的抗体或抗原结合片段。在其它实施方案中，本发明指一种分离细胞，可制备6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，2E11 HMGB1 mAb或10D4 HMGB1 mAb。在另一实施方案中，本发明指一种分离细胞，产生抗体或其抗原结合片段，其与脊髓动物HMGB1多肽的结合可被6E6 HMGB1 mAb，6H9HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb和/或10D4HMGB1 mAb抑制。在另一实施方案中，本发明指一种分离细胞，产生有6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，2E11 HMGB1 mAb和/或10D4 HMGB1 mAb特定表位的抗体或其抗原结合片段。
在其他实施方案中，本发明指一种组合物，包括本发明的抗体或抗原结合片段和制药学上可接受的赋形剂。
在另一实施方案中，本发明是一种检测和/或鉴定结合脊髓动物HMGB多肽的，包括结合本发明的抗体或抗原结合片段的制剂的方法，一种检测试剂，以及包括脊髓动物HMGB多肽的组合物。在该方法中，抗体或抗原结合片段与HMGB多肽之间的联合体形式能被检测或测量，并且当与合适的对照相比，联合体形式的减少表示测试药剂结合了HMGB多肽。
在另一实施方案中，本发明指对以促炎症细胞因子级联活化作用为特征的病人情况给予治疗的方法，包括对病人给药本发明的抗体或抗原结合片段。
在某些实施方案中，这种情况指脓血症，关节炎，狼疮。
在另一实施方案中，本发明指在样本中检测脊髓动物HMGB多肽的方法。在该方法中，在适合抗体或抗原结合片段结合样本中HMGB多肽的条件下，样本与本发明的抗体或抗原结合片段相互作用。如果能检测到抗体-HMGB联合体或抗原结合片段-HMGB联合体，则表示在样本中存在HMGB多肽。
在另一实施方案中，本发明指用于检测是否在样本中存在脊髓动物HMGB多肽或其部分的试剂盒。该试剂盒包括本发明的抗体或抗原结合片段，和一种或更多种适合的辅助试剂，检测抗体或抗原结合片段与HMGB多肽之间是否存在联合体。
附图简述
图1是人(Homo sapiens)HMGB1多肽的氨基酸序列(SEQID NO：1)。有下划线的氨基酸残基表示A box，B box和HMGB1多肽的酸性尾巴区域。
图2A是包括人(Homo sapiens)HMGB1 A box的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。有下划线的氨基酸残基表示HMGB1多肽的A box，其在人，大鼠，小鼠中相同。
图2B是包括人(Homo sapiens)HMGB1 B box的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。有下划线的氨基酸残基表示HMGB1多肽的B box，其在人，大鼠，小鼠中相同。
图3A是编码作为免疫原引发单克隆抗体的重组体CBP-鼠HGMB1多肽的核酸序列(SEQ ID NO：4)。
图3B是作为免疫原引发单克隆抗体的重组体CBP-鼠HGMB1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。被凝血酶剪切的CBP亲和标签以小写字体表示，而HMGB1的正常翻译起始氨基酸以下划线标示。
图4A是编码6E6 HMGB1 mAb的VH区域的核酸序列(SEQID NO：6)。
图4B是6E6 HMGB1 mAb的VH区域的氨基酸序列(SEQ IDNO：7)；有下划线的是CDRs。
图4C是编码6E6 HMGB1 mAb的VK区域的核酸序列(SEQID NO：8)。
图4D是6E6 HMGB1 mAb的VK区域的氨基酸序列(SEQ IDNO：9)；有下划线的是CDRs。
图5A是编码2E11 HMGB1 mAb的VH区域的核酸序列(SEQID NO：10)。
图5B是2E11 HMGB1 mAb的VH区域的氨基酸序列(SEQID NO：11)；有下划线的是CDRs。
图5C是编码2E11 HMGB1 mAb的VK区域的核酸序列(SEQID NO：12)。
图5D是2E11 HMGB1 mAb的VK区域的氨基酸序列(SEQID NO：13)；有下划线的是CDRs。
图6A是编码10D4 HMGB1 mAb的VH区域的核酸序列(SEQ ID NO：14)。
图6B是10D4 HMGB1 mAb的VH区域的氨基酸序列(SEQID NO：15)；有下划线的是CDRs。
图6C是编码10D4 HMGB1 mAb的VK区域的核酸序列(SEQ ID NO：16)。
图6D是10D4 HMGB1 mAb的VK区域的氨基酸序列(SEQID NO：17)；有下划线的是CDRs。
图7是一张总结了各种抗-HMGB1单克隆抗体特征的图表。显示了克隆名称，产生单克隆抗体的免疫原(鼠HMGB1-CBP(SEQ ID NO：5(见图3B)或人HMGB1多肽的B box(SEQ ID NO：3(见图2B))，同种型，抗体的结合区域和体内CLP分析结果。
图8是一张描述了抗-HMGB1单克隆抗体对TNF释放阻遏作用的柱状图。用0.1ug/ml的CBP-鼠HMGB1多肽(SEQ ID NO：5)重组体刺激RAW064.7细胞诱导产生鼠TNF。图中显示了，分别加入20ug/ml的6E6 HMGB1 mAb(6E6)，10D4 HMGB1 mAb(10D4)，2E11 HMGB1 mAb(2E11)，9G2 HMGB1 mAb(9G2)，或鼠IgG抗体对照(mIgG)的情况。所有样本重复两次，并且显示错误条。
图9是一张柱状图，描述了各种抗-HMGB1单克隆抗体对TNF释放的阻遏作用。用0.01ug/ml或0.1ug/ml的CBP-鼠HMGB1多肽(SEQ ID NO：5)重组体刺激RAW064.7细胞诱导产生鼠TNF。图中显示了，加入20ug/ml的3G8 HMGB1 mAb(3G8)，1A9 HMGB1 mAb(1A9)，9G2 HMGB1 mAb(9G2)，6E6 HMGB1mAb(6E6)，2E11 HMGB1 mAb(2E11)，10D4 HMGB1 mAb(10D4)，6H9 HMGB1 mAb(6H9)或鼠IgG抗体对照(IgG)的情况。
图10是一张图表，反应了在盲肠结扎穿孔(CLP)一段时间后，各种抗-HMGB1单克隆抗体(6E6 HMGB1 mAb(6E6)，2E11HMGB1 mAb(2E11)，9G2 HMGB1 mAb(9G2))和对照IgG抗体(Ctrl IgG)对鼠存活率的影响。
图11描绘了包含CHO HMGB1或CHO HMGB2和重组体HMGB1-His6(作为CHO HMGB2和rec-HMGB1-His6被标签)样本的一系列分离Western blots，样本的探针为抗-His Tag抗体，抗-HMGB2抗体，抗-HMGB1/2单克隆抗体或特殊的抗-HMGB1单克隆抗体(如，2E11 HMGB1 mAb(CT3-2E11)，
1G3 HMGB1 mAb(CT3-1G3)，6H9 HMGB1 mAb(CT3-6H9)，2G7HMGB1 mAb(CT3-2G7)，2G5 HMGB1 mAb(CT3-2G5)，6E6HMGB1 mAb(CT3-6E6))。
图12是HMGB1多肽的氨基酸序列队列，序列来源于大鼠(SEQ ID NO：18；以“大鼠#P07155”或“大鼠”(GenBank编号No.P07155)作为标签)，小鼠(Mus musculus)(SEQ ID NO：18；作为“小鼠#AAA20508”或“小鼠”(GenBank编号No.AAA20508)被标签)和人(Homo sapiens)(SEQ ID NO：1；以“人#AAA64970”或“人”(GenBank编号No.AAA64970)作为标签)。正如显示的，A box和B box区域以下划线标记。
图13A是一张描绘了对应于人HMGB1特定区域的各个多肽，它们各自的氨基酸序列，分子量，需要产生1mM储液的计算量和可用的数量的表格。
图13B是一张描绘HMGB1多肽结合实验的结果的柱状图。通过ELISA，生物素标记的对应于人HMGB1特定18个氨基酸区域的多肽和对应于人HMGB1的9-85氨基酸残基的更长多肽(图13A中列出)被制备并且分析了与特殊的抗-HMGB1单克隆抗体(如2E11 HMGB1 mAb(2E11)，6E6 HMGB1 mAb(6E6)，6H9HMGB1 mAb(6H9)，2G7 HMGB1 mAb(2G7)的结合情况。
图14是一张描述抗-HMGB1单克隆抗体ELISAs的结果的示意图。在ELISAs实验中，特异的抗-HMGB1单克隆抗体(2E11HMGB1 mAb(2E11)，2G5 HMGB1 mAb(2G5)，2G7 HMGB1mAb(2G7)和6E6 HMGB1 mAb(6E6))作为捕获抗体使用，多克隆HMGB1抗体作为检测抗体使用。
图15是一张描述抗-HMGB1单克隆抗体ELISAs的结果的示意图。在ELISAs实验中，特异的抗-HMGB1单克隆抗体(2F11HMGB1 mAb(2E11)，2G5 HMGB1 mAb(2G5)，2G7 HMGB1mAb(2G7)和6E6 HMGB1 mAb(6E6))作为捕获抗体使用，6E6HMGB1 mAb作为检测抗体使用。
图16是一张描述在盲肠结扎穿孔(CLP)后一段时间内(天)，抗-HMGB1多克隆抗体6E6 HMGB1 mAb(6E6；见标记，分别以1μg/小鼠，10μg/小鼠或100μg/小鼠的剂量)或对照IgG抗体(对照IgG)对于小鼠存活率的剂量效应曲线。
图17是分别在CHO细胞(CHOHMGB1；SEQ ID NO：36)；大鼠(大鼠HMGB1；SEQ IN NO：18)，小鼠(musHMGB1；SEQ IDNO：18)，人(huHMGB1；SEQ ID NO：74)，猪(susHMGB1；SEQ IDNO：37)和牛(bosHMGB1；SEQ ID NO：38)中表达的HMGB1多肽的HMGB1多肽序列阵列。
图18A是编码包括5’6HIS标签的人重组HMGB1多肽核酸序列(rec-HMGB1-His；SEQ ID NO：39)。克隆序列以小写字母显示。
图18B是包括5’6HIS标签的人重组HMGB1多肽的编码氨基酸序列(rec-HMGB1-His；SEQ ID NO：40)。
图19A是编码2G7 HMGB1 mAb的VH区域的核酸序列(SEQID NO：41)。
图19B是2G7 HMGB1 mAb的VH区域的编码氨基酸序列(SEQ ID NO：42)；CDRs以下划线显示。
图19C是编码2G7 HMGB1 mAb的VK区域的核酸序列(SEQID NO：43)。
图19D是2G7 HMGB1 mAb的VK区域的编码氨基酸序列(SEQ ID NO：42)；CDRs以下划线显示。
图20是描述HMGB1多肽结合实验结果的柱状图。对应于HMGB1上46-63或61-78位氨基酸残基的生物素标记的多肽被制备并通过ELISA分析其与2G7 HMGB1 mAb(2G7)的结合情况。
图21是描述HMGB1多肽结合实验结果的柱状图。对应于HMGB1上46-63或151-168位氨基酸残基的生物素标记的多肽被制备并通过ELISA分析其与21E11 HMGB1 mAb(2E11)的结合情况。
图22是描述HMGB1和HMGB2多肽结合实验结果的柱状图。分别对应于人HMGB1上46-63位氨基酸残基(标记为“huHMGB1-46-63-B”)，人HMGB2上46-63位氨基酸残基(标记为“huHMGB2-46-63-B”)，人HMGB1上53-70位氨基酸残基(标记为“huHMGB1-53-70”)，或人HMGB1上61-78位氨基酸残基(标记为“huHMGB1-61-78-B”)的多肽被制备并通过ELISA分析其与2G7 HMGB1 mAb(2G7)或抗生物素蛋白的结合情况。
图23是描述HMGB1和HMGB2多肽结合实验结果的表。表中列出了各种多肽，它们各自的氨基酸序列和该多肽是否结合2G7 HMGB1 mAb的情况。列出的多肽包括：对应人HMGB1上40-57位氨基酸残基(标记为“人HMGB1-40-57”)，人HMGB1上46-63位氨基酸残基(标记为“人HMGB1-46-63-B”)，人HMGB1上53-70位氨基酸残基(标记为“人HMGB1-53-70”)，人HMGB2上46-63位氨基酸残基(标记为“人HMGB1-46-63-B”)和由不规则氨基酸序列组成的多肽，包括人HMGB1上46-63位不规则的氨基酸残基(标记为“人HMGB1 -46-63-scr”)。
图24是描述HMGB1多肽结合实验结果的表。表中列出了各种多肽，它们各自的氨基酸序列和该多肽是否结合6E6HMGB1 mAb的情况。列出的多肽包括：对应人HMGB1上53-70位氨基酸残基(标记为“人HMGB1-53-70”)，人HMGB1上61-78位氨基酸残基(标记为“人HMGB1-61-78-B”)，人HMGB1上67-84位氨基酸残基(标记为“人HMGB1-67-84”)和由不规则氨基酸序列组成的多肽，包括人HMGB1上61-78位不规则的氨基酸残基(标记为“人HMGB1-61-78-scr”)。
图25是描述HMGB1多肽结合实验结果的表。表中列出了各种多肽，它们各自的氨基酸序列和该多肽是否结合2E11HMGB1 mAb的情况。列出的多肽包括：对应人HMGB1上143-160位氨基酸残基(标记为“人HMGB1-143-160”)，人HMGB1上151-168位氨基酸残基(标记为“人HMGB1-151-168-B”)，人HMGB1上157-174位氨基酸残基(标记为“人HMGB1-157-174”)和由不规则氨基酸序列组成的多肽，包括人HMGB1上151-168位不规则的氨基酸残基(标记为“人HMGB1-151-168-scr”)。
图26是一张柱状图，总结了多肽结合实验的结果和描述了被2G7 HMGB1 mAb(2G7)，6E6 HMGB1 mAb(6E6)，2G5HMGB1 mAb(2G5)，6H9 HMGB1 mAb(6H9)，2E11 HMGB1 mAb(2E11)识别的HMGB1表位图。
图27A是完整的，未-裂解的6E6 HMGB1mAb的质谱图。
图27B是经过DTT裂解的6E6 HMGB1mAb的质谱图。
图27C是经过DTT裂解的6E6 HMGB1mAb轻链的质谱图。
图27D是经过DTT裂解的6E6 HMGB1mAb重链的质谱图。
图28是一张描述在盲肠结扎穿孔(CLP)后一段时间内(天)，使用不同剂量的2G7 HMGB1mAb(0.004mg/kg，0.04mg/kg或0.4mg/kg)或对照IgG抗体(0.4mg/kg)对于小鼠存活率的效果图。
图29是一张分别使用不同剂量(如4mg/kg，0.4mg/kg，0.04mg/kg，或0.004mg/kg)的6E6 HMGB1 mAb(6E6)，2G7HMGB1 mAb(2G7)，或对照IgG后，小鼠的CLP存活率百分比示意图。
图30是人(Homo sapiens)HMGB2多肽的氨基酸序列(SEQID NO：54；GenBank Accession No.M83665)。
图31A是人(Homo spaiens)HMGB1多肽的氨基酸序列(SEQID NO：74)。
图31B是人(Homo spaiens)HMGB1多肽的的A匣(SEQ IDNO：75)。
图31C是人(Homo spaiens)HMGB1多肽的的B匣(SEQ IDNO：76)。
图32是一张描述不同抗-HMGB1单克隆抗体对TNF释放的抑制作用柱状图。以0.1μg/ml重组CBP-鼠HMGB1多肽(SEQID NO：5)刺激RAW264.7细胞可介导鼠TNF的释放。介导的同时，加入不同的HMGB1单克隆抗体(培养上清中)，使之终浓度为13％。下列抗体被测试：1A9 HMGB1 mAb(1A9)；2E11HMGB1 mAb(2E11)；2G5 HMGB1 mAb(2G5)；2G7 HMGB1mAb(2G7)；3G8 HMGB1 mAb(3G8)；4H11 HMGB1 mAb(4H11)；3-5A6 HMGB1 mAb(5A6)；6E6 HMGB1 mAb96E6)；9G2 HMGB1mAb(9G2)；4C9 HMGB1mAb(4C9)；和6H9HMGB1mAb(6H9).第一个深色柱表示在缺失任何抗体的条件下TNF的释放情况。
图33是一张描述不同抗-HMGB1单克隆抗体对TNF释放的抑制作用柱状图。以0.1μg/ml重组CBP-鼠HMGB1多肽(SEQID NO：5)刺激RAW264.7细胞可介导鼠TNF的释放。介导的同时，加入不同的HMGB1单克隆抗体(培养上清中)，使之终浓度为13％。下列抗体被测试：7H3 HMGB1 mAb(7H3)；9H3HMGB1 mAb(9H3)；10D4 HMGB1 mAb(10D4)；1C3 HMGB1mAb(1C3)；3E10 HMGB1 mAb(3E10)；4A10 HMGB1 mAb(4A10)；5C12 HMGB1 mAb(5C12)；和7G8 HMGB1 mAb(7G8).第一个深色柱表示在缺失任何抗体的条件下TNF的释放情况。
发明的详细描述
在不同的实施方案中，本发明关注于与脊椎动物高迁移率簇匣(HMGB)多肽结合的抗体或抗原-结合片段，测定并且/或者鉴定结合HMGB多肽的试剂的方法，对以细胞因子级联活性为特性的病人给予治疗的方法及测定样本中HMGB多肽的方法。
抗体和制备抗体的细胞
在某一实施方案中，本发明包括结合HMGB多肽的抗体或抗原-结合片段。本发明的抗体可以是多克隆或单克隆抗体，术语“抗体”包括多克隆或单克隆抗体。术语多克隆和单克隆指所制备抗体的相同程度，而非限定于特定的制备方法。在某一实施方案中，抗体或抗原-结合片段是一个单克隆抗体或其抗原-结合片段。这里使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指仅含有一种能够与本发明中特异多肽表位起免疫反应的抗原结合位点类型的抗体分子群。单克隆抗体组合物特异地显示与其发生免疫反应特异多肽的单一结合亲和力。
这里使用的术语“抗体”也包括抗体的功能片段，包括嵌合，人工，灵长源，镶嵌的或单链抗体的片段。功能片段包括与HMGB多肽(例如，哺乳动物HMGB多肽(如哺乳动物HMGB1多肽))结合的抗原-结合片段。例如，能够结合HMGB多肽或其配基的抗体片段，包括，但不局限于Fv，Fab，Fab’和F(ab’)2片段。这些片段可以通过酶切或重组技术制备。例如，分别用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶酶解可以得到Fab和F(ab’)2片段。其他需要底物特异性的蛋白酶也可以被用于制备Fab和F(ab’)2片段。也可以通过在抗体基因的自然终止位点上游引入一个或多个终止密码子来制备多种抗体缩短形式。例如，编码F(ab’)2重链配基的嵌合基因可以通过设计引入编码CH1区域和重链绞链区的DNA序列。
单链抗体，及嵌合，人工或灵长源(CDR-嵌合)，或嵌合抗体，如嵌合，CDR-嵌合或嵌合单链抗体，包括了来源于不同物种的配基，并且被目前的发明和术语“抗体”所包括。这些抗体的不同配基可以通过常规技术化学性地结合在一起，或可以通过遗传工程技术制备成一种相似的蛋白。见，例如，Cabilly et al.，美国专利号4,816,567；Cabilly et al.，欧洲专利号0,125,023 B1；Boss et al.，美国专利号4,816,397；Boss et al.，欧洲专利号0,120,694 G1；Neuberger，M.S.et al.，WO 86/01533；Neuberger，M.S.et al.，欧洲专利号0,194,276 B1；Winter，美国专利号5,225,539；Winter，欧洲专利号0,239,400 B1；Queen et al.，欧洲专利号10 451 216 B1；and Padian，E.A.et al.，EP0519596 A1。也可见，Newman，R.et al.，BioTechnology，10：1455-1460(1992)，关于灵长源抗体，和Ladner et al.，美国专利号4,946,778，and Bird，R.E.et al.，Science，242：423-426(1988))关于单链抗体。
按照标准方法或其他合适的技术通过合成或重组DNA技术可以制备人源抗体。编码人源可变区域的核酸(例如，cDNA)序列可以通过PCR突变法来构建，改变编码人或人源链的DNA序列，如来源于先前的人源可变区域的DNA模板。(见，Kamman，M.，et al.，Nucl.Acids Res.，17：5404(1989))；Sato，K.，et al.，CancerResearch，53：851-856(1993)；Daugherty，G.L.et al.，Nucleic AcidsRes.，19(9)：2471-2476(1991)；and Lewis，A.P.and S.Crowe，Gene，101：297-302(1991))。利用这些或其他合适的方法，也可以制备可变区。在某一方面，克隆的可变区可以是突变的，从而可以挑选所期望的编码可变区的特异序列(例如，从噬菌体文库中；见，Krebber et al.，U.S.5,514,548；Hoogenboom et al.，WO 93/06213)。
抗体可以是人源抗体，其包括一种或多种免疫球蛋白链(例如，包括非人类来源的CDR(如，从非人类来源的抗体中得到的一种或多种CDRs)的抗体，及来源于人源轻链并且/或者重链的框架区域(如：带有或不带有框架改变的CDR-嵌合抗体))。在某一实施方案中，抗体或其抗原-结合片段包括特定免疫球蛋白的轻链CDRs(CDR1，CDR2，CDR3)和重链CDRs(CDR1，CDR2，CDR3)。在另一实施方案中，抗体或抗原-结合片段进一步包括人类框架区域。
这里所叙述的抗体可以与一种试剂连接。在某一实施方案中，该试剂是一种标签，例如，放射性同位素，表位标签(标签)，亲和标签(如，生物素，抗生物素蛋白)，自旋标记，酶，荧光基团或化学发光基团。该发明中被标记的抗体或抗原-结合片段可以用于，例如，这里叙述的诊断和/或预测方法。在另一实施方案中，抗体与药物、毒素或抗-炎症药剂连接。本发明中药物，毒素或抗-炎症药剂与抗-HMGB抗体和抗原-结合片段的结合可以将这些药剂定位于HMGB表达和/或活跃的位置。该发明中可以与抗体连接的药物和毒素包括，例如，化疗药剂(如，丝裂霉素C，paxlitaxol，氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶，cisplatin，cyclohexamide)，毒素(如，篦麻毒素，gelonin)和其他这里所叙述的药剂(例如，所述的用于联合治疗的药剂)。能够连接的抗-炎症药剂包括，例如，这里所述的那些药剂。
HMGB多肽(例如，哺乳动物HMGB多肽)的特异抗体可以由适当的免疫原引发，如分离的和/或重组HMGB多肽或其配基(包括合成分子，如合成多肽)。抗体也可以通过用表达HMGB多肽的细胞免疫合适的宿主(如小鼠)的方法而产生，这些细胞如GH3细胞垂体后叶，巨噬细胞(例如RAW 246.7细胞，人巨噬细胞)，外周血单核细胞(PBMCs(例如，人PBMCs))，初级T细胞(例如，人初级T细胞)，肾上腺细胞(例如，鼠肾上腺PC-12细胞，人肾上腺细胞)和肾细胞(例如，鼠原初肾细胞，人原初肾细胞)。免疫合适的宿主(如，小鼠)。另外，表达重组HMGB多肽(如，哺乳动物HMGB多肽)的细胞，如转化细胞，可以作为免疫原或筛选与其结合的抗体而运用(见，chuntharapaiet al.，J.Immunol.，152：1783-1789(1994)；Chuntharapai et al.，美国专利号5,440,021)。
免疫抗原，多克隆和单克隆抗体的制备可以通过任何适合的技术完成。许多方法已经被描述(见，Kohler et al.，Nature，256：495-497(1975)and Eur.J.Immunol.6：511-519(1976)；Milstein et al.，Nature 266：550-552(1977)；Koprowski et al.，美国专利号4,172,124；Harlow，E.and D.Lane，1988，antibodies：Alaboratory Manual，(cold spring Harbor Laboratory；Cold SpringHarbor，NY)；current Protocols Inmolecular Biology，Vol.2(Supplement 27，Summer 94).Ausubel，F.M.et al.，Eds.，(John wiley&Sons：New York，NY)，Chapter 11，(1991))。通常，如这里所举例，杂交瘤可以通过将合适的永生细胞系(如，骨髓瘤细胞SP2/0，P3X63A g 8.653或heteromyeloma)与抗体表达细胞融合而制备。抗体表达细胞可以从经目标抗原免疫的人或动物的外周血或，更适宜地从脾或淋巴结中获得。融合细胞(杂交瘤)通过选择性培养基分离，并用有限稀释法克隆。特异表达目标抗体的细胞可以运用合适的方法挑选(例如，ELISA)。
其他合适的制备或分离具备必要特异性的抗体(例如，人类抗体或抗原-结合片段)的方法也可以运用，包括，例如，从文库中(例如，噬菌体显示文库)筛选重组抗体的方法。能够产生全套人类抗体的转基因动物(例如，异种小鼠(Abgenix，Fremont，CA))可以通过合适的方法生产(见，Jakobovits et al.，Proc.Natl.acad.Sci.USA，90：2552-2555(1993)；jakobovits et al.，Nature，362：255-258(1993))。其他合适的生产能够产生全套人类抗体的转基因动物的方法已有叙述(例如，Lonberg et al.，美国专利号5,545,806；Surani et al.，美国专利号5,545,807；Lonberg et al.，WO 97/13852)。
在某一实施方案中，抗体或其抗原-结合片段对于HMGB多肽(例如，哺乳动物HMGB多肽)具有特异性。在另一方面，抗体或其抗原-结合片段对于HMGB1多肽(例如，在SEQ IDNO：1和/或SEQ ID NO：74中叙述的人类HMGB1多肽)具有特异性。在另一实施方案中，抗体或其抗原-结合片段是IgG或IgG的抗原-结合片段。在另一实施方案中，抗体或其抗原-结合片段是IgGl或IgGl的抗原-结合片段。在另一实施方案中，抗体或其抗原-结合片段是IgG2a，IgG2b，IgG3，或任何前述的抗原-结合片段。
在另一实施方案中，抗体或抗原-结合片段可以结合HMGB多肽并抑制(减少或防止)HMGB多肽的异种或多种功能。这些HMGB功能包括，例如，增强炎症反应(见，例如，PCT公开号WO 02/092004)，增加细胞促炎症因子的释放(见，例如PCT公开号WO 02/092004)，结合RAGE，TLR2，化学吸引力(见，例如，Degryse et al.，J，Cell biol.152(6)：1197-1206(2001)；它们的全部教导都通过在这里引述而合并于本文)。
在某一实施方案中，抗体是人类抗体或其抗原-结合片段。在另一实施方案中，抗体是人工类抗体或其抗原-结合片段。而在另一实施方案中，抗体或抗原-结合片段能够抑制多肽(如RAGE，TLR2)与HMGB多肽的结合并且/或抑制一种或多种由结合HMGB多肽或其他多肽引发的功能。
在某些实施方案中，抗体或其抗原-结合片段特异地结合HMGB表位或抗原决定簇(例如，HMGB表位，HMGB A匣表位，HMGB B匣表位)。正如这里所叙述的，抗体或其抗原-结合片段可以根据其抑制促炎症因子释放的能力运用标准方法进行筛选，而不必使用不适当的实验方案。可以抑制细胞中促炎症因子的产生和/或促炎症因子的释放，并且/或者抑制以炎症因子级联活性为特征的状况的抗-HMGB A-匣抗体和抗-HMGB B-匣抗体，也在本发明的范围内。在某一实施方案中，本发明中的抗体或抗原-结合片段可以抑制TNF，IL-1β，和/或IL-6的产生。在另一方面，本发明中的抗体或抗原-结合片段可以抑制TNF的产生(例如，TNF-α)。
正如这里所述，命名为“6E6 HMGB1 mAb”，“2E11 HMGB1mAb”，“6H9 HMGB1 mAb”，“10D4 HMGB1 mAb”，“2G7 HMGB1mAb”的结合HMGB1的单克隆抗体已经被制备。此外，其他命名为“9G2 HMGB1 mAb”，“1A9 HMGB1 mAb”，“3G8 HMGB1mAb”，“2G5 HMGB1 mAb”，“4H11 HMGB1 mAb”，“7H3 HMGB1mAb”，“3-5A6 HMGB1 mAb”，“9G1 HMGB1 mAb”，“4C9 HMGB1mAb”，“9H3 HMGB1 mAb”，“1C3 HMGB1 mAb”，“5C12 HMGB1mAb”，“3E10 HMGB1 mAb”，“7G8 HMGB1 mAb”，“4A10HMGB1 mAb”，的单克隆抗体已经被制备。除了9G2 HMGB1mAb和1A9 HMGB1 mAb之外所有的抗体都能与HMGB1结合。9G2 HMGB1 mAb和1A9 HMGB1 mAb似乎与免疫原的CBP区域(其占免疫原中的一小部分，并未被分割)结合。
6E6 HMGB1 mAb，也称为6E6-7-1-1或6E6，可以由鼠杂交瘤6E6 HMGB1 mAb制备，其于2003年9月3日以CriticalTherapeutics有限公司的名义，675Massachusetts Avenue，14楼，Cambridge，MA02139，美国，被保存于美国典型培养物保存中心，10801学院大道，Manassas，Virginia 20110，美国，保藏号，PTA-5431。本发明涉及鼠杂交瘤6E6 HMGB1 mAb，其表达的抗体及编码该抗体的核酸。
2E11 HMGB1 mAb，也称为2E11-1-1-2或2E11，可以由鼠杂交瘤2E11 HMGB1 mAb制备，其于2003年9月3日以CriticalTherapeutics有限公司的名义，675Massachusetts Avenue，14楼，Cambridge，MA02139，美国，保藏于美国典型培养物保存中心，10801学院大道，Manassas，Virginia 20110，美国，保藏号，PTA-5431。本发明涉及鼠杂交瘤2E11 HMGB1 mAb，其表达的抗体及编码该抗体的核酸。
6H9 HMGB1 mAb，也称为6H9-1-1-2或6H9，可以由鼠杂交瘤6H9 HMGB1 mAb制备，其于2003年9月3日以CriticalTherapeutics有限公司的名义，675Massachusetts Avenue，14楼，Cambridge，MA 02139，美国，保藏于美国典型培养物保存中心，10801学院大道，Manassas，Virginia 20110，美国，保藏号，PTA-5434。本发明涉及鼠杂交瘤6H9 HMGB1 mAb，其表达的抗体及编码该抗体的核酸。
10D4 HMGB1 mAb，也称为10D4-1-1-1-2或10D4，可以由鼠杂交瘤10D4 HMGB1 mAb制备，其于2003年9月3日以Critical Therapeutics有限公司的名义，675 Massachusetts Avenue，14楼，Cambridge，MA 02139，美国，保藏于美国典型培养物保存中心，10801学院大道，Manassas，Virginia 20110，美国，保藏号，PTA-5435。本发明涉及鼠杂交瘤10D4 HMGB1 mAb，其表达的抗体及编码该抗体的核酸。
2G7 HMGB1 mAb，也称为3-2G7-1-1-1或2G7，可以由鼠杂交瘤2G7 HMGB1 mAb制备，其于2003年9月3日以CriticalTherapeutics有限公司的名义，675Massachusetts Avenue，14楼，Cambridge，MA 02139，美国，保藏于美国典型培养物保存中心，10801学院大道，Manassas，Virginia 20110，美国，保藏号，PTA-5432。本发明涉及鼠杂交瘤2G7 HMGB1 mAb，其表达的抗体及编码该抗体的核酸。
培养以上鉴定了的鼠杂交瘤(例如，6E6 HMGB1 mAb，6H9HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2G7HMGB1 mAb)，需要加入DMEM，10％FCS，1％IL-6，1％L-谷氨酸和1％Pen-Strep。
9G2 HMGB1 mAb，也称为9G2-7-1-1-1或9G2，可以由鼠杂交瘤9G2 HMGB1 mAb制备，本发明涉及鼠杂交瘤9G2 HMGB1mAb，其表达的抗体及编码该抗体的核酸。
1A9 HMGB1 mAb，也称为1A9-1-2-1-4或1A9，可以由鼠杂交瘤1A9 HMGB1 mAb制备，本发明涉及鼠杂交瘤1A9 HMGB1mAb，其表达的抗体及编码该抗体的核酸。
3G8 HMGB1 mAb，也称为3G8-7-2-1-5或3G8，可以由鼠杂交瘤3G8 HMGB1 mAb制备，本发明涉及鼠杂交瘤3G8HMGB1 mAb，其表达的抗体及编码该抗体的核酸。
2G5 HMGB1 mAb，也称为3-2G5-4-1-2或2G5，可以由鼠杂交瘤2G5 HMGB1 mAb制备，本发明涉及鼠杂交瘤2G5HMGB1 mAb，其表达的抗体及编码该抗体的核酸。
4H11 HMGB1 mAb，也称为4H11，可以由鼠杂交瘤4H11HMGB1 mAb制备，本发明涉及鼠杂交瘤4H11 HMGB1 mAb，其表达的抗体及编码该抗体的核酸。
7H3 HMGB1 mAb，也称为7H3，可以由鼠杂交瘤7H3HMGB1 mAb制备，本发明涉及鼠杂交瘤7H3 HMGB1 mAb，其表达的抗体及编码该抗体的核酸。
3-5A6 HMGB1 mAb，也称为3-5A6或5A6，可以由鼠杂交瘤3-5A6 HMGB1 mAb制备，本发明涉及鼠杂交瘤3-5A6HMGB1 mAb，其表达的抗体及编码该抗体的核酸。
9G1 HMGB1 mAb，也称为9G1，可以由鼠杂交瘤9G1HMGB1 mAb制备，本发明涉及鼠杂交瘤9G1 HMGB1 mAb，其表达的抗体及编码该抗体的核酸。
4C9 HMGB1 mAb，也称为9G1，可以由鼠杂交瘤9G1HMGB1 mAb制备，本发明涉及鼠杂交瘤9G1 HMGB1 mAb，其表达的抗体及编码该抗体的核酸。
9H3 HMGB1 mAb，也称为9H3，可以由鼠杂交瘤9H3HMGB1 mAb制备，本发明涉及鼠杂交瘤9H3 HMGB1 mAb，其表达的抗体及编码该抗体的核酸。
1C3 HMGB1 mAb，也称为1C31-1-1-1或1C3，可以由鼠杂交瘤1C3 HMGB1 mAb制备，本发明涉及鼠杂交瘤1C3HMGB1 mAb，其表达的抗体及编码该抗体的核酸。
5C12 HMGB1 mAb，也称为5C12-1-1-1-1或5C12，可以由鼠杂交瘤5C12 HMGB1 mAb制备，本发明涉及鼠杂交瘤5C12HMGB1 mAb，其表达的抗体及编码该抗体的核酸。
3E10 HMGB1 mAb，也称为3E10-5-4-1-1或3E10，可以由鼠杂交瘤3E10 HMGB1 mAb制备，本发明涉及鼠杂交瘤3E10HMGB1 mAb，其表达的抗体及编码该抗体的核酸。
7G8 HMGB1 mAb，也称为7G8，可以由鼠杂交瘤7G8HMGB1 mAb制备，本发明涉及鼠杂交瘤7G8 HMGB1 mAb，其表达的抗体及编码该抗体的核酸。
4A10 HMGB1 mAb，也称为4A10-1-3-1-1或4A10，可以由鼠杂交瘤4A10 HMGB1 mAb制备，本发明涉及鼠杂交瘤4A10HMGB1 mAb，其表达的抗体及编码该抗体的核酸。
某一个实施方案中，抗体或其抗原-结合片段是从含有6E6HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb及上述的任何抗原-结合片段的组群中挑选的。
在另一实施方案中，抗体或抗原-结合片段具有与从组群中挑选出的抗体或抗原-结合片段相同或相似的特异表位，该组群包含6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb及上述的任何抗原-结合片段。与6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4HMGB1 mAb，和/或2E11 HMGB1 mAb的表位特异性相同或相似的抗体或抗原-结合片段可以通过多种合适的方法鉴定。例如，与，例如，6E6 HMGB1 mAb的表位特异性相同或相似的抗体或抗原-结合片段，可以基于其与6E6 HMGB1 mAb竞争结合HMGB(例如，哺乳动物HMGB多肽(例如，哺乳动物HMGB1多肽))的能力进行鉴定。在另一个例子中，例如，6E6 HMGB1 mAb的结合，以及具有相同或相似的HMGB多肽表位特异性的抗体的结合，可以被单一的多肽抑制(例如，自然多肽，合成多肽)。在许多方面，多肽可以包括，例如，9到50氨基酸，9到40氨基酸，9到30氨基酸，9到25氨基酸或9到20氨基酸。
如这里所示例，对应于人类HMGB1多肽特异区域的18氨基酸多肽显示其能与多种HMGB1单克隆抗体结合。这里叙述的研究定位了HMGB1中特异结合HMGB1抗体的表位。
例如，2E11 HMGB1 mAb显示其可以结合对应于人类HMGB1 151-168氨基酸(SEQ ID NO：1中151-168位氨基酸；即LKEKYEKDIAAYRAKGKP(SEQ ID NO：30))的多肽。进一步的研究表明2E11 HMGB1 mAb识别HMGB1中带有156-161，155-161，155-162，156-162和/或156-163位氨基酸残基的表位(见例14)。
6E6 HMGB1 mAb和6H9 HMGB1 mAb显示其可以结合对应于人类HMGB 161-78位氨基酸(SEQ ID NO：1中61-78氨基酸；即EDMAKADKARYEREMKTY(SEQ ID NO：24))的多肽。进一步的研究表明6E6 HMGB1 mAb识别HMGB1中带有61-78位氨基酸残基的表位(见例13)。
2G7 HMGB 1mAb显示其可以结合对应于人类HMGB146-63位氨基酸(SEQ ID NO：1中46-63氨基酸；即SERWKTMSAKERGKFEDM(SEQ ID NO：23))的多肽(见例10)。进一步的研究表明2G7 HMGB1 mAb识别HMGB1中带有53-63位氨基酸残基的表位(见例12)。此外，2G7 HMGB1 mAb不结合HMGB246-63为氨基酸残基(SEQ ID NO：48)，尽管在HMGB146-63多肽和HMGB2 46-63多肽间仅有一个氨基酸的差异(见例12)。这样，在某一实施方案中，本发明地抗体或抗原结合片断与HMGB1结合，而不与HMGB2结合。在其它实施方案中，本发明中的抗体或抗原-结合片段与HMGB1或HMGB2都结合。
这些18氨基酸多肽，或其他对应于HMGB1特定区域的多肽，可以用于表位研究，鉴定某抗体或抗原-结合片段是否能抑制某多肽与抗体的结合，而已知该抗体可与该多肽结合(例如，6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb，其他这里叙述的抗体)。这样，例如，抗体或抗原-结合片段的表位特异性可以用，例如，2E11HMGB1 mAb及对应于人类HMGB1(已知可与2E11 HMGB1mAb结合)的151-168氨基酸的多肽进行试验。
在另一个例子中，具有与本发明中的抗体(例如6E6 HMGB1mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，和/或2E11 HMGB1 mAb)相同或相似表位特异性的抗体可以用嵌合HMGB多肽进行鉴定(见，例如，Banks，G.C.，et al.，J.biol.Chem.274(23)：16536-16544(1999))。
在某一实施方案中，抗体或抗原-结合片段可以与6E6HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb和/或上述的任何抗原-结合片段竞争结合HMGB多肽(例如，哺乳动物HMGB多肽(例如哺乳动物HMGB1多肽))。正如这里所述，结合的抑制可以是对相同或相似表位的竞争或位点干涉(例如，在此处抗体结合交迭表位或邻近表位)的结果。6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb和/或上述的任何抗原-结合片段引起的抑制，也可以归因于HMGB多肽结构的变化，该变化是由抗体或抗原-结合片段与HMGB多肽的结合引起的。
在另一实施方案中，抗体或抗原-结合片段是从包括了3G8HMGB1 mAb，2G5 HMGB1 mAb，4H11 HMGB1 mAb，7H3HMGB1 mAb，3-5A6 HMGB1 mAb，9G1 HMGB1 mAb，4C9HMGB1 mAb，9H3 HMGB1 mAb，1C3 HMGB1 mAb，5C12 HMGB1mAb，3E10 HMGB1 mAb，7G8 HMGB1 mAb，4A10 HMGB1 mAb，和上述的任何抗原-结合片段的群组中挑选出的。
在某一实施方案中，具有与群组中挑选出的，抗体或抗原-结合片段相同或相似的表位特异性，该群组包括了3G8 HMGB1mAb，2G5 HMGB1 mAb，4H11 HMGB1 mAb，7H3 HMGB1mAb，3-5A6 HMGB1 mAb，9G1 HMGB1 mAb，4C9 HMGB1mAb，9H3 HMGB1 mAb，1C3 HMGB1 mAb，5C12 HMGB1mAb，3E10 HMGB1 mAb，7G8 HMGB1 mAb，4A10 HMGB1 mAb。如上所述，具有与一个或多个这些抗体或抗原-结合片段相同或相似表位特异性的抗体或抗原-结合片段可以用多种合适的方法鉴定(例如，用这里叙述的和/或此领域中已知的方法)。
在另一实施方案中，抗体或抗原-结合片段可以与3G8HMGB1 mAb，2G5 HMGB1 mAb，4H11 HMGB1 mAb，7H3HMGB1 mAb，3-5A6 HMGB1 mAb，9G1 HMGB1 mAb，4C9HMGB1 mAb，9H3 HMGB1 mAb，1C3 HMGB1 mAb，5C12 HMGB1mAb，3E10 HMGB1 mAb，7G8 HMGB1 mAb，4A10 HMGB1 mAb，和/或上述任何抗原-结合片段竞争结合HMGB多肽(例如，哺乳动物HMGB多肽)。正如这里所述，结合的抑制可以是对相同或相似表位的竞争或位点干涉(例如，在此处抗体结合交迭表位或邻近表位)的结果。抑制也可以归因于HMGB多肽结构的变化，该变化是由抗体或抗原-结合片段与HMGB多肽的结合引起的。
在某一实施方案中，抗体或其抗原-结合片段包括了从含有6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb的群组中挑选出的抗体的6个CDRs(轻链CDRs(CDR1，CDR2，CDR3)和重链CDRs(CDR1，CDR2，CDR3))。在另一实施方案中，抗体是一个人源抗体，其包括从含有6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb的群组中挑选出的抗体的轻链CDRs(CDR1，CDR2，CDR3)和重链CDRs(CDR1，CDR2，CDR3)。在另一实施方案中，抗体或其抗原-结合片段包括任何这里叙述的其他抗体的6个CDRs(轻链CDRs(CDR1，CDR2，CDR3)和重链CDRs(CDR1，CDR2，CDR3))。
在另一实施方案中，抗体或其抗原-结合片段可以包括本发明中的任何抗体(例如6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb)的1到6个轻链和重链CDRs。例如，抗体或其抗原-结合片段可以包括1，2，3，4，5，6个轻链和重链CDRs。另一实施方案中，抗体或其抗原-结合片段包括本发明中某一种抗体的至少一个轻链CDR或重链CDR，及本发明中另一种抗体(例如，6H9 HMGB1mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1mAb)的至少一个轻链CDR或重链CDR。例如，抗体或其抗原-结合片段可以包括一个或多个6E6 HMGB1 mAb的及一个或多个6H9 HMGB1 mAbCDRs。联合了本发明中其他不同抗体的CDRs组合物的抗体或其抗原-结合片段也包括在内。
在另一实施方案中，抗体或其抗原-结合片段包括了从含有3G8 HMGB1 mAb，2G5 HMGB1 mAb，4H11 HMGB1 mAb，7H3HMGB1 mAb，3-5A6 HMGB1 mAb，9G1 HMGB1 mAb，4C9HMGB1 mAb，9H3 HMGB1 mAb，1C3 HMGB1 mAb，5C12 HMGB1mAb，3E10 HMGB1 mAb，7G8 HMGB1 mAb，4A10 HMGB1 mAb的群组中挑选出的抗体的6个CDRs(轻链CDRs(CDR1，CDR2，CDR3)和重链CDRs(CDR1，CDR2，CDR3))。另一方面，抗体或其抗原-结合片段包括上述抗体中一种抗体的1到6个轻链和重链CDRs。
在某些实施方案中，抗体或其抗原-结合片段包括的一种或多种CDRs与本发明中的抗体(例如6E6 HMGB1 mAb，6H9HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11HMGB1 mAb)的CDRs分别至少有80％，或至少90％，或至少95％的一致性。在其它的实施方案中，抗体或其抗原-结合片段包括的一种或多种CDRs与本发明中的抗体的CDRs分别至少有80％，或至少90％，或至少95％的相似性。测定两种多肽序列的一致性和相似性的方法在这里有所叙述，并且/或者在本领域中是熟知的。
本发明也涉及一种双特异性抗体，或其功能片段(如F(ab’)2)，其可以与HMGB多肽及至少其他一种抗原(例如，肿瘤抗原，病毒抗原)结合。在具体的实施方案中，双特异性抗体，或其功能片段，具有与6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb和/或2E11 HMGB1 mAb，及其他至少一种抗体相同或相似的表位特异性。双特异性抗体可以由triomas和hybird杂交瘤分泌。通常，triomas是通过杂交瘤与淋巴细胞(例如，抗体-分泌B细胞)的融合构建而成，而hybrid杂交瘤是通过两种杂交瘤融合构建而成。每一种融合细胞(例如，杂交瘤，淋巴细胞)都分泌单一的抗体。然而，triomas和hybrid杂交瘤可以产生含有识别不同抗原的抗原-结合位点的抗体。triomas和hybrid杂交瘤的培养上清可以通过适合的方法(例如，ELISA)来化验其双特异性抗体，并且双特异性抗体可以用常规的方法纯化(见，例如，美国专利号5,959,084(Ring et al.)，U.S.Patent No.5,141,7369(Iwasa et at.)，U.S.Patent Nos.4,444,878，5,292,668，5,523,210(all to Paulus et al.)和美国专利号5,496,549(Yamazaki et al.))。
在某一实施方案中，本发明涉及一种产生本发明中的抗体或抗原-结合片段的分离的细胞。在特定实施方案中，本发明中分离的抗体-制备细胞是一种永生细胞，如杂交瘤，异种杂交瘤，淋巴母细胞或重组细胞。除了制备抗体，本发明中的抗体-制备细胞还有其他应用。例如，本发明中的抗体-制备细胞可以与其他细胞融合(如合适的药物-标记的人骨髓瘤，鼠骨髓瘤，人-鼠异源骨髓瘤或人异源骨髓瘤细胞)以制备，例如，额外的杂交瘤，这样则提供了编码抗体的基因的转移方法。此外，该细胞可以作为能被分离和表达的抗-HMGB免疫球蛋白链的编码核酸的来源而被应用，(例如，通过运用任何适合的技术转化至其他细胞中(见，例如，Cabilly et al.，U.S.Patent No.4,816,567，Winter，U.S.Patent No.5,225,539))。例如，包括了编码重排抗-HMGB轻和/或重链的序列的克隆可以被分离出来(例如，通过PCR)。此外，cDNA文库可以由合适的细胞系中分离的mRNA制备，从而可以分离编码抗-HMGB免疫球蛋白链的cDNA克隆。这样，可以得到编码抗体，或其配基的重和/或轻链的核酸，并用于在不同宿主细胞或体外转录系统中制备特异的免疫球蛋白，免疫球蛋白链，或其变量形式(例如，人工免疫球蛋白)。例如，包括cDNAs，或编码其派生物如人工免疫球蛋白或免疫球蛋白链等变量形式的核酸，可以被连接入合适的原核或真核载体(例如，表达载体)，并利用适当的方法介导入合适的宿主细胞(例如，转化，转染，电转化，感染)，经改造，该核酸与一种或多种表达调控元件相接(例如，存在于载体上或共同插入宿主细胞基因组中)，以制备重组抗体-制备细胞。这样，在某些实施方案中，本发明是一种核酸，其编码属于该发明的抗体或抗原-结合片段。在其它实施方案中，本发明是一种载体，其包括了编码本发明的抗体或抗原-结合片段的核酸。
HMGB多肽，HMGB A匣和HMGB B匣
如所述，在某一实施方案中，本发明是结合HMGB多肽的抗体或其抗原-结合片段。
这里使用的“HMGB多肽”是一种多肽，其序列与从包括SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：74的群组中挑选的序列有至少60％，优选地，至少70％，75％，80％，85％，或90，或更优选地至少95％的一致性(例如，运用BLAST程序和这里叙述的参数进行测定)。在某一实施方案中，HMGB多肽加强了炎症反应并且/或者增加了细胞中促炎症因子的释放。
术语“多肽”涉及氨基酸的聚合体，并不限定特定的长度；这样，多肽的定义包括了缩氨酸，寡肽和蛋白质。在某一实施方案中，HMGB多肽是一种哺乳动物HMGB多肽，例如，一种哺乳动物HMGB多肽(如，人HMGB多肽)。在另一实施方案中，如述，HMGB多肽包括了B匣DNA结合区域和/或A匣DNA结合区域和/或羧酸基末端。
其他HMGB多肽的例子在genebank编号为AAA64970，AAB08987，P07155，AAA20508，S29857，P09429，NP_002119，CAA31110，S02826，U11431，X67668，NP_005333，NM_016957，J04179中有所叙述。它们的全部教导都通过在这里引述而被合并于本文。HMGB多肽的额外的例子包括，但不局限于，哺乳动物HMG1(例如，在genebank编号U51677中叙述的(HMGB1))，HMG2(例如，在genebank编号M83665中叙述的(HMGB2))，HMG-2A(例如，在genebank编号NM_005342和NP_005333中叙述的(HMGB3，HMG-4))，HMG14(例如，在genebank编号P05114中叙述)，HMG17(例如，在genebank编号X13546中叙述)，HMGI(例如，在genebank编号L17131中叙述)，HMGY(例如，在genebank编号M23618中叙述)，非哺乳动物HMG T1(例如，在genebank编号X02666中叙述)和HMG T2(例如，在genebank编号L32859中叙述)(彩虹鲑鱼)；HMG-X(例如，在genebank编号D30765中叙述)(爪蟾)，HMG D(例如，在genebank编号X71138中叙述)和HMG Z(例如，在genebank编号X71139中叙述)(果蝇)；NHP 10蛋白(HMG蛋白同源物NHP1)(例如，在genebank编号Z48008中叙述)(酵母)；非-组蛋白染色体蛋白(例如，在genebank编号O00479中叙述)(酵母)；HMG1/2类似蛋白(例如，在genebank编号Z11540中叙述)(小麦，玉米，大豆)；上游结合因子(UBF-1)(例如，在genebank编号X53390中叙述)；PMS1蛋白类似物1(例如，在genebank编号U13695中叙述)；单链识别蛋白(SSRP，结构-特异识别蛋白)(例如，在genebank编号M86737中叙述)；HMG类似物TDP-1(例如，在genebank编号M74017中叙述)；哺乳动物性-决定区域Y蛋白(SRY，睾丸-决定因子)(例如，在genebank编号X53772中叙述)；真菌蛋白：mat-1(例如，在genebank编号AB009451中叙述)，stell(例如，在genebank编号X53431中叙述)和Mc 1；SOX14(例如，在genebank编号AF107043中叙述)(如同SOX 1(例如，在genebank编号Y13436中叙述)，SOX 2(例如，在genebank编号Z31560中叙述)，SOX 3(例如，在genebank编号X71135中叙述)，SOX 6(例如，在genebank编号AF309034中叙述)，SOX 8(例如，在genebank编号AF226675中叙述)，SOX 10(例如，在genebank编号AJ001183中叙述)，SOX 12(例如，在genebank编号X73039中叙述)和SOX 21(例如，在genebank编号AF107044中叙述))；淋巴特异因子(LEF-1)(例如，在genebank编号X58636中叙述)；T-细胞特异转录因子(TCF-1)(例如，在genebank编号X59869中叙述)；MTT1(例如，在genebank编号M62810中叙述)；SP100-HMG核心自身抗原(例如，在genebank编号U36501中叙述)。
其他HMGB蛋白的例子是由HMGB核酸序列编码的多肽，这些核酸属于genebank编码NG_000897(HMG1L10)(特别地NG_000897的658-1305位核苷酸)；AF076674(HMG1L1)(特别地AF076674的1-633位核苷酸)；AF076676(HMG1L4)(特别地AF076676的1-564位核苷酸)；AC010149(来源于BAC克隆RP11-395A23的HMG序列)(特别地AC010149的75503-76117位核苷酸)；AF165168(HMG1L9)(特别地AF165168的729-968位核苷酸)；XM_063129(LOC122441)(特别地XM_063129的319-558位核苷酸)；XM_066789(LOC139603)(特别地XM_066789的1-258位核苷酸)；AF165167(HMG1L8)(特别地AF165167的456-666位核苷酸)。
本发明的抗体和抗原-结合片段结合HMGB多肽(例如，一种或多种上述的HMGB多肽)。在某一实施方案中，抗体和抗原-结合片段结合脊椎动物HMGB多肽。在另一实施方案中，抗体和抗原-结合片段结合哺乳动物HMGB多肽(例如，大鼠HMGB，小鼠HMGB，人HMGB)。另一实施方案中，(例如，大鼠HMGB1，小鼠HMGB1，人HMGB1)。在特定的实施方案中，抗体和抗原-结合片段结合人HMGB1多肽(例如，在SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：74中叙述的人HMGB1多肽)。
本发明的组合物和方法也反应了针对高迁移簇B(HMGB)A匣的抗体特征。在某一实施方案中，抗体和其抗原-结合片段结合HMGB A匣但不与HMGB的非-A表位特异结合。在另一实施方案中，抗体和其抗原-结合片段结合脊椎动物HMGB A匣但不与HMGB的非-A表位特异结合。另一方面，抗体和其抗原-结合片段结合哺乳动物(例如，人类，鼠，鼠)HMGB A匣但不与HMGB的非-A表位特异结合。另一实施方案中，抗体和其抗原-结合片段结合HMGB1多肽的A匣(例如，哺乳动物HMGB1多肽(例如，人类HMGB1，大鼠HMGB1，小鼠HMGB1))但不与HMGB1的非-A表位特异结合。
如本文中所使用，“HMGB A匣”，同时也指“A匣”或“HMGA匣”，是一种蛋白质或多肽，其与HMGB A匣(例如，这里所述的HMGB A匣)相比，至少有50％，60％，70％，75％，80％，85％，90，95％的序列一致性。在一个实施方案中，HMGBA匣具有一种或多种下列的生物活性：抑制由HMGB介导的炎症和/或抑制细胞中促炎症因子的释放(见，例如，PCT公开号WO 02/092004，其全部教导都通过在此引述而合并于本文)。在某一实施方案中，HMGB A匣多肽具有上述的一种生物活性。特别地，HMGB A匣多肽皆具上述的两种生物活性。在某一实施方案中，A匣与在图2A(SEQ ID NO：2的9-85残基)或图31B(SEQ ID NO：75)中描述的A匣相比，具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％的序列一致性。在另一实施方案中，A匣包括或由哺乳动物HMGB蛋白中相应区域的氨基酸序列组成。HMGB A匣也可以是与这里描述的A匣氨基酸序列相同的重组-制备多肽。优选地，HMGB A匣是一种脊椎动物HMGB A匣，例如，一种哺乳动物HMGB A匣，更优选地，哺乳动物HMGB1 A匣，例如，人类HMGB1 A匣，而最优选地，HMGB1 A匣包括或由在图2A(SEQ ID NO：2中的9-85残基)或31B(SEQ ID NO：75)中描述的A匣序列组成。
HMGB A匣通常不多于85个氨基酸，并不少于4个氨基酸。在其它实施方案中，HMGB A匣可以包括10-85个氨基酸，20-85个氨基酸，30-85个氨基酸，40-85个氨基酸。具备A匣序列的多肽例子包括，但不局限于上述的HMGB多肽。在这些HMGB多肽中的A匣序列可以通过这里叙述的方法测定并分离，例如，利用这里叙述的与A匣的序列比对，并利用这里叙述的方法测定其生物活性，和/或其他本领域中已知的方法。
HMGB A匣多肽序列的额外例子包括下列序列：PDASVNFSEF SKKCSERWKT MASKEKGKFEDMARKADKARYEREMKTYIPPKGET(人HMGB1；SEQIDNO：55)；
DSSVNFAEFSKKCSERWKTMSAKERSKFEDMAKSDDARYDREMKNYVPPKGDK(人HMGB2；SEQ ID NO：56)；PEVPVNFAEFSKKCSERWKT VSGKEKSKFD EMARKADKVRYDREMKDYGPA KGGK(人HMGB3；SEQ ID NO：57)；PDASVNFSEF SKKCSERWKT MSAKEKGKFE DMAKADKARYEREMKTYIPP KGET(人HMG1L10；SEQ ID NO：58)；SDASVNFSEF SNKCSERWKMSAKEEKGKFE DMAKADKTHYERQMKTYIPP KGET(人HMG1L1；SEQ ID NO；59)；PDASVNFSEF SKKCSERWKA MSAKDKGKFEDMARKVDKADY EREMKTYIPP KGET(HMG1L4；SEQ IDNO：60)；PDASVKFSER LKKCSETWKT IFAKEKGKFEDMARKADKAHY EREMKTYIPP KGEK(来源于BAC克隆RP11-395A23的HMG序列；SEQ ID NO：61)；PDASINFSEFSQKCPETWKT TIAKEKGKFE DMARKADKAHY EREMKTYIPPKGET(HMG1L9；SEQ ID NO：62)；PDASVNSSERSKKCSERWKTMPTKQGKFE DMAKADRAH(HMG1L8；SEQ IDNO：63)；PDASVNFSEF SKKCLVRGKT MSAKEKGQFEAMARADKARY EREMKTYIP PKGET(LOC12244；SEQ IDNO：64)；LDASVSFSEF SNKCSER WKT MSVKEKGKFEDMAKADKACY EREMKIYPYL KGRQ(LOC139603；SEQ IDNO：65)；和GKGDPKKPRG KMSSYAFFVQ TCREEHKKKHPDASVNFSEF SKKCSERWKT MSAKEKGKFE DMAKADKARYEREMKTYIPP KGET(人HMGB1A匣；SEQ ID NO：66).
本发明中的组合物和方法也以针对高迁移率簇B(HMGB)B匣的抗体为特征。在某一实施方案中，抗体或其抗原-结合片段结合HMGB B匣，但不特异结合HMGB的非-B匣表位。在另一实施方案中，抗体或其抗原-结合片段结合脊椎动物HMGB B匣但不特异结合HMGB的非-B匣表位。另一实施方案中，抗体或其抗原-结合片段结合哺乳动物(例如，人，大鼠，小鼠)HMGBB匣但不特异结合HMGB的非-B匣表位。而另一实施方案中，抗体或其抗原-结合片段结合HMGB1多肽(例如，哺乳动物HMGB1多肽(例如，人HMGB1，大鼠HMGB1，小鼠HMGB1))B匣但不特异结合HMGB1的非-B匣表位。
这里使用的术语“HMGB B匣”，也指“B匣”，或“HMG B匣”，是一种与HMGB1多肽(例如，这里叙述的HMGB B匣)相比，具有至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％序列一致性的多肽。在某一实施方案中，HMGB1匣具有以下一种或多种生物学活性：增加炎症和/或增加细胞中炎症细胞因子的释放(见，例如，PCT公开号WO 02/092004)。在某一实施方案中，HMGB B匣多肽具有上述一种生物学活性。特别地，HMGB B匣多肽具有以上一种或多种生物学活性。在某一实施方案中，HMGB B匣与图2B(SEQ ID NO：3)或图31C(SEQ IDNO：76)中描述的B匣相比具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％或95％的序列一致性。在另一实施方案中，B匣包括或包含哺乳动物HMGB蛋白中对应区域的氨基酸序列。HMGB B匣也可以是一种重组方法制备的产物，其氨基酸序列与这里叙述的B匣序列相同。较合适地，HMGB B匣是一种脊椎动物HMGB B匣，例如，哺乳动物HMGB B匣，例如，人类HMGB1 B匣，而更合适地，HMGB1 B匣包括或包含图2B(SEQID NO：3)或图31C(SEQ ID NO：76)中描述的B匣序列。
HMGB B匣通常不多于85个氨基酸并且不少于4个氨基酸。具有B匣序列的多肽例子包括，但不局限于上述的HMGB多肽。在这些多肽中的B匣序列可以通过这里叙述的方面测定和分离，例如，通过与这里叙述的B匣序列比对和测试其生物学活性。
其他的HMGB B匣多肽序列例子包括以下序列：
FKDPNAPKRP PSAFFLFCSE YRPKIKGEHP GLSIGDVAKKLGEMWNNTAA DDKQPYEKKA AKLKEKYEKD IAAY(人HMGB1；SEQ ID NO：67)；KKDPNAPKRP PSAFFLFCSEHRPKIKSEHP GLSIGDTAKK LGEMWSEQSA KDKQPYEQKAAKLKEKYEKD IAAY(人HMGB2；SEQ IDNO：68)；PKDPNAPKRL PSAFFLFCSE YRPKIKGEHPGLSIGDVAKK LGEMWNNTAA DDKQPYEKKA AKLKEKYEKDIAAY(HMG1L10；SEQ ID NO：69)；FKDPNAPKRP PSAFFLFCSEYHPKIKGEHP GLSIGDVAKK LGEMWNNTAA DDKQPGEKKAADLKEKYEKD IAAY(HMG1L1；SEQ ID NO：70)；FKDSNAPKRPPSAFLLFCSE YCPKIKGEHP GLPISDVAKK LVEMWNNTFADDKQLCEKKA AKLKEKYKKD TATY(HMG1L4；SEQ IDNO：71)；FKDPNAPKRP PSAFFLFCSE YRPKIKGEHPGLSIGDVVKK LAGMWNNTAA ADKQFYEKKAAKLKEKYKKD IAAY(来源于BAC克隆RP11-359A23的HMG序列，SEQ ID NO：72)；及FKDPNAPKRP PSAFFLFCSEYRPKIKGEHP GLSIGDVAKK LGEMWNNTAA DDKQPYEKKAAKLKEKYEKD IAAYRAKGKP DAAKKGVVKA EK(人HMGB1匣，SEQ ID NO：73)。
这里叙述的HMGB多肽，HMGB A匣，HMGB B匣，无论其是自然产生或非-自然产生的，包括了与HMGB多肽，HMGB A匣，和/或HMGB B匣具有序列一致性的多肽。这里所使用的，在其氨基酸序列具有至少60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更高的同源性或一致性时，两种多肽(或多肽区域)具有充分的同源性或一致性。通过适合的比较目的进行序列排列(例如，第一个序列中可以插入间隔)可以测定两种氨基酸序列(或两种核酸序列)的一致性百分比。通过比较相应位置的氨基酸或核酸，以相一致位置的数量在该序列中所占比例作为两个序列间的一致性百分比(例如，％一致性＝#一致性位置/全部#位置*100)。在某些实施方案中，HMGB多肽，HMGB A匣多肽，或HMGB B匣多肽的长度，以比较目的进行阵列比对，至少占参考序列的长度的30％，更适合地40％，更适合地60％，更适合地70％，80％，90％，或100％，参考序列的例子为这里叙述的对应于HMGB多肽的序列(例如，SEQ ID NO：1；SEQ ID NO；18，SEQID NO：74)，一种HMGB A匣多肽(例如，SEQ ID NO：29-85位残基，SEQ ID NO：75)或HMGB B匣多肽(例如，SEQ IDNO：3，SEQ ID NO：76)。目前两种序列间的比较可以通过熟知的方法完成，例如，数学运算。Karlin等论述了一种首选的，非-特异性的数学运算的例子(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5877(1993))。如Schaffer等所叙述，这些运算被合并入BLASTN和BLASTX程序(版本2.2)(Nucleic Acids Res，29：2994-3005(2001))。当运用BLAST和Gapped BLAST程序时，各自程序的默认参数(例如，BLASTN；在国家生物技术信息中心的互联网上提供)可以被使用。在某一方面，搜索的数据库是一种非-多于的(NR)数据库，参数和序列比较可以设定为：无过滤；期望值为10；文字大小为3；矩阵为BLOSUM62；缺口的现实值为11，变动范围为1。
另一种非-限制的运用数学运算进行序列比较的例子是Myers和Miller的运算法则，CABIOS(1989)。此运算法则被合并入ALIGN程序(版本2.0)，其是GCG(Acelrys，san Diego，California)序列运算软件包的一部分。当运用ALIGN程序比较氨基酸序列时，PAM120重量残基表，缺口长度罚分为12，及缺口罚分为4等设定值被应用。其他序列分析的运算法则在本领域中是熟知的，包括Torellis和Robotti所述的ADVANCE和ADAM(Comput.Appl.Biosci，10：3-5，1994)；及Pearson和Lipman所述的FASTA(Proc.Natl.Acad.Sci USA，85：2444-2448，1988)。
在另一实施方案中，两个氨基酸序列间一致性百分比可以运用GCG软件包(Acelrys，san Diego，California)中的GAP程序完成，可以使用Blosson63矩阵或PAM250矩阵，缺口重量为12，10，80，6，4，长度量为2，3，4。在另一方面，两个核苷酸序列间一致性百分比可以运用GCG软件包(Acelrys，san Diego，California)中的GAP程序完成，缺口量为50，长度量为3。
抑制促炎症因子的释放和治疗方法
在某一实施方案中，本发明是抑制哺乳动物细胞中促炎症因子释放的方法。在某一实施方案中，该方法包括用本发明的抗体或抗原-结合片段对细胞进行治疗。这里叙述了合适的抗体或抗原-结合片段，包括，例如，6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb，及具有6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb的表位特异性的抗体，及可以与6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb竞争结合脊椎动物高迁移率簇匣(HMGB)多肽的抗体，及上述任何抗体的抗原-结合片段。
这里使用的，“细胞因子”是一种由哺乳动物细胞自然产生的调节免疫反应并介导细胞-细胞交互作用的可溶性的蛋白或多肽。无论在正常或病理情况下，细胞因子可以调节单个细胞和组织的功能活性。促炎症因子是一种可以引发一种或多种与下列炎症或炎症情况相关生理反应的细胞因子：血管舒张，充血，与水肿相关的血管渗透性的增加，粒细胞和单核巨噬细胞的聚集，纤维蛋白的沉淀。某些情况下，促炎症细胞因子也可以导致凋亡。例如，在慢性心脏失调中，已经显示了TNF刺激心肌凋亡(Pulkki，Ann.med.29：339-343(1997)；and Tsutsui，et al.，Immunol.Rev.174：192-209(2000))。非限制性的促炎症细胞因子例子是肿瘤坏死因子(TNF)，白细胞介素(IL)-1α，IL-1β，IL-6，IL-8，IL-18，干扰素γ，HMG-1，血小板-激活因子(PAF)，和巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)。
在另一实施方案中，本发明是一种治疗病人情况的方法，包括给予病人本发明中的抗体或抗原-结合片段以治疗，在这里该情况以炎症因子的级联活性为特征。合适的抗体或抗原-结合片段是这里所叙述的，包括，例如，6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1mAb，具有6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb的表位特异性的抗体，及可以与6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb竞争结合脊椎动物高迁移率簇匣(HMGB)多肽的抗体，及上述任何抗体的抗原-结合片段。
在某一实施方案中，治疗的方法包括给予病人本发明中有效量的抗体或抗原-结合片段。这里使用的，“有效量”或“治疗有效量”是阻止或减少炎症反应，并且/或者改善和/或减短与促炎症因子反应相关的症状时间的足够剂量。在治疗中起效的，阻止或控制特定情况的本发明中组合物的有效量可以被测定，例如，对在此叙述的动物模型和/或在本领域中所熟知的动物模型给予组合物治疗。此外，体外试验可以被使用以帮助测定最佳剂量范围。
在考虑几种对于本领域中的技术所熟知的因素的基础上，本领域的技术人员可以测定合适的有效剂量(例如，通过临床试验)。这些因素包括，例如，情况或被治疗的情况，病人症状的严重程度，选择何种抗体或抗原-结合片段用于治疗，病人的年龄，病人的体质，病人的免疫情况，个别病人的反应，及其他本领域的技术人员所知的因素，以反应所治疗的药物组合物的精确度。
在具体制剂中的精确剂量也可以依赖于治疗的路径，情况的严重程度，并将由研究者的判断和每个病人的情况来决定。有效剂量可以通过体外试验或动物模型试验系统得到的剂量-效应曲线推算出。例如，如这里所示例，运用体外盲肠结扎穿孔(CLP)试验，进行了抗-HMGB1单克隆抗体6E6 HMGB1 mAb的剂量效应试验(剂量1μg/小鼠，101μg/小鼠，或1001μg/小鼠)。
对于抗体而言，以病人的体重计算，给予病人(例如，人类病人)治疗的剂量可以具体地为0.1mg/kg到100mg/kg之间。优选地，给予病人的治疗剂量在0.1mg/kg到20mg/kg之间，更优选地，在1mg/kg到10mg/kg之间。本发明中的某些实施方案中，根据患者体重，剂量至少为1mg/kg，5mg/kg，10mg/kg，50mg/kg，100mg/kg，150mg/kg。通常，由于对外源多肽具有免疫反应，人源或人工抗体比其他物种的抗体在人体内具有更长的半衰期。这样，人源抗体更低的剂量和更少的治疗频率是可能的。例如，可以每天，或每星期，每两星期，每月给予0.01mg/kg到5或10mg/kg之间的抗体的有效剂量的治疗。
测定抗体或抗原-结合片段是否抑制促炎症因子情况的方对本领域技术人员是熟知的。例如，细胞中促炎症因子释放的抑制可以通过本领域中熟知的技术方法被测定。例如，如这里所述和示例，细胞中TNF的释放可以通过标准鼠纤维细胞L929(ATCC，美国典型培养保存中心，Rockville，Maryland)(Bianchi etal.，Journal of Experimental Medicine 183：927-936(1996))，以30pg/ml的最小检出浓度进行细胞毒素生物测定。L929细胞毒素生物测定按以下方案进行。RAW264.7细胞在含有10％胎牛血清(Gemini，Catabases，California)，青霉素和链霉素(LifeTechnologies)的RPMI1640培养基(Life Technologies，GrandIsland，New York)中培养。加入多粘菌素(Sigma，St.Louis，Missouri)使之终浓度为100单位/ml，以抑制任何污染的LPS的活性。细胞与这里所述的抗体共同在Opti-MEM I培养基中培养8小时，上清(含有从细胞中释放的TNF)被收集。从细胞中释放的TNF用标准鼠纤维细胞L929(ATCC)以最小检出值30pg/ml进行细胞毒素生物测定(Bianchi et al.，supra)。重组鼠TNF可以从R&D Systems Inc.(Minneapolis，Minnesota)得到并在此试验中作为对照使用。测定细胞释放的其他因子的方法在本领域中是熟知的。
以这里所述的方法进行治疗的适合的炎症情况可以是具有炎症因子级联活性情况中的一种。在某一实施方案中，炎症因子级联引起系统反应，如内毒素休克。在另一实施方案中，炎症情况是由局部的炎症因子级联介导的，如在类风湿关节炎中。可以用本发明中的抗体和抗原-结合片段进行有效治疗的炎症情况的非限制性例子包括，例如，肠胃和相关组织的疾病(例如肠梗阻，阑尾炎，消化道，胃和十二指肠溃疡，腹膜炎，胰腺炎，溃疡性结肠炎，假膜性，急性和缺血性结肠炎，憩室炎，会厌炎，失弛缓症，胆管炎，胆囊炎，乳糜泄，肝炎，节段性回肠炎，肠炎，和Whipple氏病)；系统或局部炎症疾病和情况(如哮喘，过敏，过敏性休克，免疫组合物疾病，组织缺血，再灌注损伤，器官坏死，花粉热，脓血症，败血病，内毒素休克，恶性溃疡，高烧，嗜酸性肉芽肿，肉芽肿病，肉状瘤病)；泌尿生殖器系统和相关组织的疾病(如感染性流产，附睾炎，阴道炎，前列腺炎，尿道)；呼吸系统和相关组织的疾病(如支气管炎，肺气肿，鼻炎，囊肿性纤维化，肺炎，成人呼吸窘迫综合征，pneumoultramicroscopicsilicovolcanoconiosis，alvealitis，细支气管炎，咽炎，胸膜炎，窦炎)；由不同病毒感染导致的疾病(如流感，呼吸合胞病毒，HIV，乙肝病毒，丙肝病毒，疱疹)，细菌(如弥漫性菌血症，登革热)，真菌(如念珠菌病)和原生动物和多细胞寄生物(如疟原虫，丝虫，阿米巴虫，包虫囊肿)；皮肤的疾病和情况(如烧伤，皮炎，皮肌炎，晒斑，风疹疣，水疱)；心血管系统和相关组织的疾病(如(器官)狭窄，再狭窄，血管炎，血管炎，心内膜炎，动脉炎，动脉硬化症，血栓(性)静脉炎，心包炎，充血性心力衰竭，心肌炎，心肌缺血，结节性动脉周围炎，风湿热)；阿滋海默症，脑膜炎，脑炎，多发性硬化症，脑梗塞，脑栓，guillame-barre综合症，神经炎，神经痛，脊髓损伤，麻痹，眼色素层炎)；骨，关节，肌肉和连接组织的疾病(如多种arthritides和关节痛，骨髓炎，筋膜炎，帕哲氏病，痛风，牙周疾病，风湿性关节炎，关节膜炎)；其他自体免疫的和发炎疾病(如重症肌无力，thryoiditis，全身红斑性狼疮，肺出血-肾炎综合征，白塞氏综合征，同种异体移植物注射，移植物抗宿主病，I型糖尿病，僵直性脊椎炎，Berger’s疾病和Retier’s综合症)；及各种癌，肿瘤和类风湿性疾病(如Hodgkins疾病)；和宿主对于任何原发性病的炎症或免疫应答。
在某一实施方案中，该情况是从一种组群中挑选出的，该组群包括脓血症，移植排斥，关节炎(例如，风湿性关节炎)，哮喘，动脉硬化症，再狭窄，狼疮，成人呼吸窘迫综合征，银屑癣，胰腺炎，腹膜炎，烧伤，心肌缺血，器官缺血，缺血-再灌注，白塞氏病，移植物抗宿主病，Crohn’s疾病，溃疡性结肠炎，肠梗阻，多发性硬化，恶疾。在另一方面，该情况是从含有脓血症，关节炎(例如，风湿性关节炎)，哮喘，狼疮，银屑癣，炎症性肠疾病和Crohn’s疾病的组群中挑选出的。
优选地，足够剂量的抗体和抗原-结合片段被用于病人所需要的治疗，以用于抑制细胞中促炎症因子的释放和/或炎症情况的治疗。在某一实施方案中，运用这里叙述的方法或其他本领域中已知的方法，至少10％，20％，25％，50％，75％，80％，90％，95％的促炎症因子的释放被抑制。
这里使用的术语“治疗”，“治疗的”和“治疗”，指改善疾病或情况相关的症状，例如，炎症疾病或炎症情况，包括阻止或减缓疾病症状的发作，和/或减少疾病或情况的症状的严重程度或发生次数。这里定义的术语“主体”和“个体”包括动物，如哺乳动物，包括但不局限于，灵长类，牛，绵羊，山羊，马，狗，猫，兔，豚鼠，鼠，鼠或其他牛，绵羊，马，犬，猫，啮齿类，或鼠科动物。在某一实施方案中，该动物是人类。
在某一实施方案中，赋形剂可以包含在本发明中的抗体和抗原-结合片段中。赋形剂的选择可以基于治疗应用中运用抗体或抗原-结合片段治疗的期望通道的基础。组合物治疗的通道依赖于所治疗的情况。例如，静脉内注射可以用于系统性紊乱的治疗，如内毒素休克，而口服治疗适合于肠胃紊乱，如胃溃疡。如上所述，用于治疗的抗体或抗原-结合片段的剂量可以由本领域的技术人员决定，而不用进行联合标准剂量-效应研究的试验。根据情况，抗体或抗原-结合片段可以通过口服，注射，鼻内，鞘内，直肠内，舌，舌下，口腔，口腔内，透皮的方式给予病人治疗。
相应地，以口服，舌，舌下，口腔和口腔内方式设计的抗体和抗原-结合片段可以用本领域中已知的方法制备，例如，与惰性稀释剂和/或口服载体联合，而不用进行其他试验。抗体和抗原-结合片段可以装入凝胶胶囊或制备成药片形式。基于口服治疗的目的，本发明中的抗体和抗原-结合片段可以与赋形剂联合并制备成药片，片剂，胶囊，西也剂，悬液，糖浆，薄片，橡皮糖，及其他类似物。
药片，药丸，胶囊，片剂，及其他类似物，也可以含有结合剂，接受剂，分解剂，润滑剂，甜味剂，调味剂。粘结剂的例子包括微晶纤维素，黄蓍胶，凝胶。赋形剂的例子包括淀粉和乳糖。分散剂的例子包括褐藻酸，玉米淀粉，及其类似物。润滑剂的例子包括硬脂酸镁和硬脂酸钾。滑动剂的例子是二氧化硅胶。甜味剂的例子包括蔗糖，糖精，及其类似物。调味剂的例子包括薄荷油，甲基水杨酸盐，橙味调味料，及其类似物。制备这些不同的组合物的材料应当是药物纯和无-内毒素的。
本发明中的抗体和抗原-结合片段可以通过注射途径给药，例如，静脉内，肌肉内，胸腔或皮下注射。注射给药可通过将本发明中的抗体和抗原-结合片段混合入溶液或悬液的方法完成。这些溶液或悬液包括无菌稀释剂，如注射用水，盐溶液，抑菌盐溶液(包含0.9％ mg/ml苯甲醇)，磷酸缓冲盐(这里指PBS)，Hank’s液，Ringer’s乳酸盐，不挥发油，聚乙二醇，甘油，丙二醇，和其他合成溶剂。注射剂也包括抗菌药剂(例如，苯甲醇，甲基对羟基苯甲酸酯)，抗氧化剂(例如，抗坏血酸维生素C，亚硫酸氢钠)，和鳌合剂(例如，EDTA)。也可以加入缓冲液，如醋酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐及调节渗透压的试剂如氯化钠和葡萄糖。注射剂可以装在安瓿瓶，注射器或玻璃或塑料制备的多剂量瓶。
直肠注射包括将抗体和抗原-结合片段注射入直肠或大肠内。这可以通过栓剂或灌肠剂来完成。栓剂的形式可通过该领域已知的方法制备。如，可通过加热甘油至120℃左右，将抗体或抗原-结合片段溶解在甘油中并与加热的甘油混合，然后加入净化的水，最后将热组合物倒入栓剂模具中，来制备栓剂形式。
皮下给药包括通过皮肤抗体或抗原-结合片段的经皮肤的吸收。皮下形式包括贴剂，油膏，乳油，凝胶，药膏等类似物。
本发明的抗体和抗原-结合片段能被通过鼻腔给药进入主体。通过鼻腔给药或鼻腔给药的方法，包括使抗体或抗原-结合片段进入主体鼻腔通路黏液膜或鼻腔。用于鼻腔给药的抗体或抗原-结合片段的药物学组合物，包括治疗性有效剂量的抗体或抗原-结合片段。用于鼻腔给药的众所周知的方法包括，如，鼻腔喷雾，滴鼻，悬浮液，凝胶，药膏，乳油，或粉剂。抗体或抗原-结合片段的给药也可以用鼻腔棉球或鼻腔海绵替代。
正如上面描述的，不同的给药方式包括，如，口服，食疗，局部的，皮下的，直肠的，非肠道的(如，静脉内的，动脉内的，肌肉的，皮下的，皮内的注射)，和吸入(如，支气管内的，鼻内的，口服，鼻内滴入)。正如显示的，给药可以是局部或全身的。给药首选的模式可以根据被用于给药的抗体或抗原-结合片段和被治疗特殊条件(如疾病)而变化，但是口头或非肠道的给药一般是首选的模式。
如果期望，这里描述的抗体或抗原-结合片段可以带着一种或多种额外成分被治疗(如用于治疗发炎条件的成分)。抗体或抗原-结合片段的其中一部分和额外成分能在单独的组合物中出现或作为分离的组合物进行治疗。如果作为分离成分进行治疗，抗体或抗原-结合片段的其中部分和额外成分能被同时或分别治疗。
在某一实施方案中，本发明的抗体或抗原-结合片段与抗-炎症药剂一起被给予治疗。这些药剂对于本领域中的技术人员是熟知的。在某一方面，该试剂是早期脓血症介导因子的拮抗剂。这里使用的，早期脓血症介导因子是由炎症因子级联(例如，暴露于LPS)引发的一种细胞快速分泌(例如，30-60分钟内)的促炎症因子。这些因子的非限制性例子是IL-1α，IL-1β，L-6，PAF，MIF。这些因子的受体(例如，肿瘤坏死因子受体类型1)和产生这些因子所需要的酶(例如，白介-1β转化酶)也可以是早期脓血症介导因子的例子。已知的或今后发现的任何早期脓血症介导因子的拮抗剂，通过进一步抑制炎症因子级联作用而显示其在这些情况下的可用性。
早期脓血症介导因子拮抗剂的非限制性例子是结合早期脓血症介导因子mRNA并抑制其表达的反义链组合物，(见，例如Ojwang et al.，Biochemistry 36：6033-6045(1997)；Pampfer et al.，Biol.Reprod.52：1316-1326(1995)；美国专利号6,228,642；Yahataet al.，antisense Nucleic acid drug Dev.6：55-61(1996)；and Taylor etal.，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.8：199-205(1998))，特异切断早期脓血症介导因子mRNA的核酸酶(见，Leavitt et al.antisenseNucleic acid Drug Dev.10：409-414(2000)；Kisich et al.，J.Immunol.163(4)：2008-2016(1999)；and Hendrix et al.，Biochem.J.314(Pt.2)：655-661(1996))，和结合并抑制早期脓血症介导因子的抗体(见，例如，Kam and Targan，Expert Opin.Pharmacother.1：615-622(2000)；agahira et al.，J.Immunol.ethods 222：83-92(1999)；Lavine et al.，J.Cereb.Blood Flow Metab.18：52-58(1998)；and Holmes et al.，Hybridoma 19：363-367(2000))。已知的或今后发现的早期脓血症介导因子拮抗剂，预计属于本发明范围内。本领域技术人员可以决定抑制任何特定炎症因子级联作用的早期脓血症介导因子的使用量，而不需要进行例常剂量-效应研究试验。
其他可以与本发明中的抗体和抗原-结合片段共同治疗的试剂包括，例如VitaxinTM和其他针对αvβ3粘合素的抗体(见，例如，美国专利号5,753,230，PCT公开号WO 00/78815和WO02/070007，其全部教导都通过在此引述而合并于本文)和抗-IL-9抗体(见，例如，PCT公开号WO 97/08321；其全部教导都通过在此引述而合并于本文)。
在某一实施方案中，本发明中的抗体和抗原-结合片段可与TNF生物学活性抑制剂(例如，TNF-α生物学活性抑制剂)共同治疗。这些TNF生物学活性抑制剂包括，例如，多肽，蛋白，合成分子，如合成有机分子，自然-产生分子，如自然产生的有机分子，核酸分子，及其成分。抑制TNF生物学活性的试剂的首选例子包括infliximab(Remicade；Centocor，Inc.，Malvern，Pennsylvania)，etanercept(Immunex；Seattle，Washington)，adalimumab(D2E7；Abot Laboratories，Abbot Park Illinois)，CDP870(Pharmacia  Corporation；Bridgewater，New  Jersey)CDP571(Celltech Group plc，United Kingdom)，Lenercept(Roche，Switzerland)，和镇静剂。
在某些实施方案中，本发明特指一种组合物，其包括这里所叙述的抗体或抗原-结合片段与药物-可接受的赋形剂。如上所述，该组合物中与抗体或抗原-结合片段联合的赋形剂的选择是基于此成分的期望的治疗通道。合适的药物-可接受赋形剂包括上述的和其他本领域中熟知的那些赋形剂。
在某一实施方案中，本发明特指HMGB的适体(aptamers)(例如，HMGB1的适体)。在本领域中所知，适体是核酸(例如，RNA，DNA)的大分子组合物，其与特定分子目标(例如，HMGB蛋白，HMGB匣(例如HMGB A匣，HMGB B匣)，这里所述的HMGB多肽和/或HMGB表位)紧密结合。一种特定的适体可以是一条线性核酸序列，特定地为15-60核苷酸长度。适体中核苷间的链通过分子内的相互作用使该分子折叠形成三维结构。依据在所有可能的核酸序列中广泛存在的分子形态的特定差别，适体可以从广泛的分子目标队列中获得，包括蛋白和小分子。除了高度特异性，适体对其目标物具有高亲和性(例如，与从皮摩尔到微摩尔蛋白的亲和性)。适体具有化学稳定性，并在煮沸或冻结时也不失去其活性。因其为合成分子，可以进行多种形式的修饰，从而可以优化其功能，以用于特定应用。例如，适体可以被修饰以极大地减少其在血液中对于酶解的敏感性，以利于体内应用。此外，适体可以被修饰以改变其生物分布性或血浆残留时间。
结合HMGB或其片段(例如HMGB1或其片段)的适体的选择方法可以从本领域中已知的方法获得。例如，适体可利用SELEX(配基系统进展指数增长)方法选择(Tuerk，C.，and Gold，L.，Science249：505-510(1990))。在SELEX方法中，大量核酸分子文库(例如，1015种不同的分子)被制备，并且/或者用目标分子进行筛选(例如，HMGB蛋白，HMGB匣(例如HMGB A匣，HMGB B匣)，这里所述的HMGB多肽和/或HMGB表位)。目标分子可以与核酸序列文库共同孵育一段时间。本领域中的多种方法，组合物中的适体目标分子可以与未结合并被丢弃的分子分离从而物理地分离出来。与目标分子具有高度亲和性的适体可以从目标分子上分离纯化并通过酶放大作用制备新的分子文库，其对于可结合目标分子的适体是足够充足的。该充足的文库可以被用于发起新的选择，分离和扩大循环。约5-15次重复的选择，分离和扩大循环后，文库减少为紧密结合目标分子的少数适体。组合物中单独的分子可以被分离出来，其核酸序列可被测定，其结合亲和力和特异性的特征可被测定和比较。分离的适体可以进一步被精制以除去任何对结合目标和/或适体结构无关的核酸，由此制备适体核心结合区域的截短形式。见Jayasena，S.D.Clin.Chem.45：1628-1650(1999)关于适体技术的综述；其全部教导都通过在此引述而合并于本文)。
在特定实施方案中，本发明的适体具有与这里所述的抗体的结合特异性和/或功能活性。这样，例如，在某些实施方案中，本发明是关于适体的，如这里所述，其具有与本发明中的抗体相同或相似的结合特异性(例如，与脊椎动物HMGB多肽，脊椎动物HMGB多肽片段(例如，HMGB A匣，HMGB B匣)，脊椎动物HMGB多肽表位区域(例如，与一种或多种本发明中的抗体结合的HMGB1表位区域)的结合特异性)。在特定实施方案中，本发明中的适体可以结合HMGB多肽或其片段并抑制一种或多种HMGB多肽的功能。如本文所述，HMGB多肽的功能包括，例如，增强炎症反应，增加细胞中促炎症因子的释放，结合RAGE，结合TLR2，化学亲和力。在特定实施方案中，适体具有结合HMGB1(例如，人HMGB1(例如，在SEQ ID NO：1或SEQID NO：74中描述))和其片段(例如，A匣(例如，SEQ ID NO；2，SEQ ID NO：75中的9-85位残基)，B匣(例如，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：76)，这里所述的HMGB1抗体结合表位)及抑制一种或多种HMGB多肽的功能(例如，抑制经HMGB刺激的细胞中的促炎症抑制的释放)。
诊断和/或预测的方法
在另一实施方案中，本发明进一步提供了测定样本中高迁移率簇蛋白匣(HMGB)多肽的诊断和/或预测方法。在本方法的某一实施方案中，在适合于抗体或抗原-结合片段与样本中存在的HMGB多肽相互结合的条件下，样本与本发明中的抗体或抗原-结合片段相结合。此方法进一步包括测定抗体-HMGB组合物或抗原-结合片段-HMGB组合物，抗体-HMGB组合物或抗原-结合片段-HMGB组合物的测定结果显示样本中存在HMGB多肽。此方法中所使用的合适的抗体或抗原-结合片段包括这里所述的，例如，6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，任何上述抗原-结合片段。
在另一实施方案中，抗体或抗原-结合片段包括了可检测的标签。合适的用于测定HMGB多肽(例如，哺乳动物HMGB多肽)和抗体或抗原-结合片段形成的组合物的标签包括，例如，放射性同位元素，表位标签(标记)，亲和标签(例如，生物素，抗生物素蛋白)，自旋标签，酶，荧光簇或化学发光簇。
如本文所述，这里所述的抗体或抗原-结合片段可以用于测定或测量HMGB多肽的表达。例如，本发明中的抗体可以用于测定或测量生物样本(例如，细胞，组织或来源于个体的体液如血液，血清，白血球(例如，活性T淋巴细胞)，支气管肺泡灌洗液，唾液，肠液，滑液，活体组织样本)中的HMGB多肽。在某一实施方案中，该样本是血液或血清。例如，可以从某个体中获得样本(例如，组织和/或体液)并用合适的方法测试HMGB多肽的存在或数量情况。合适的方法包括免疫学或免疫化学方法如流式细胞计数(例如，FACS分析方法)和免疫吸收方法，包括酶联免疫吸收方法(ELISA)，放射免疫试验(RIA)，化学发光试验，免疫印迹(例如，western blot)，免疫细胞化学和免疫组织学。通常，适合于形成HMGB多肽和抗体或抗原-结合片段组合物的条件下，本发明中的样本和抗体或抗原-结合片段相互结合，(通过直接或非直接的方法)这些组合物的构成被评估。在某一实施方案中，诊断和/或预测是运用ELISA和/或western blot方法进行的。
如本领域中所熟知，从个体获得的样本(例如，组织样本)中的HMGB多肽(例如，HMGB1)水平的增高可以作为诊断和/或预测指标，用于预测和监控脓血症相似病例的严重性，而该病人显示了与以炎症因子级联活性为特征的情况相关的症状(见美国专利号6,303,321，其全部教导都在此通过引述而合并于本文)。这样，在某一实施方案中，本发明中的抗体和抗原-结合片段可以用于诊断和预测方法，预测与HMGB表达相关的炎症情况临床相似病例(例如，这里所述的情况)并/或监控其严重性。在某些实施方案中，诊断和/或预测方法包括测试样本的浓度，优选地为血清样本中HMGB的浓度，并将其与类似样本中HMGB正常水平范围的表达标准相比较，在这里高水平的HMGB表明较差的预后性或毒素作用的可能性。诊断方法也可以应用于其他组织或体液，如脑脊髓的液体或尿。
在另一实施方案中，本发明是一种用于测定样本中高迁移率簇匣(HMGB)多肽或其配基的存在情况的检测试剂盒。这些检测试剂盒包括，例如，抗体或抗原-结合片段及一种或多种适合的辅助试剂，用于检测抗体或抗原-结合片段和HMGB多肽或其配基形成的组合物的存在情况。本发明中的抗体或抗原-结合片段可以单独或与特异结合其他表位的附加的抗体联合，以冻干形式提供。标记或非标记的抗体或抗原-结合片段，可以与佐剂成分(例如，缓冲液，如Tris(Tris(羟甲基)氨基甲烷)，磷酸盐和碳酸盐，稳定剂，赋形剂，生物杀灭剂和/或惰性蛋白，例如，牛血清白蛋白)联合包括在试剂盒中。例如，抗体或抗原-结合片段可以与佐剂成分混合的冻干形式提供，或者佐剂成分可以分开提供，由使用者进行混合。通常这些佐剂材料以小于占活性抗体重量的5％的量存在，或其总量小于抗体重量的0.001％。当需要使用可以结合抗-HMGB抗体或抗原-结合片段的二抗或其抗原-结合片段时，这些二抗或其抗原-结合片段可由试剂盒提供，例如，独立包装在瓶内或容器内。这些二抗或其抗原-结合片段，如果存在，是被特异地标记的，并可以由与这里所述的抗体配制方法相似的方式进行配制。抗体，试剂盒中的抗原-结合片段和/或附属试剂可以用合适的容器(如瓶，盒子，封袋，管子)单独或合并包装。当试剂盒包括一系列单独的包装成分，这些单独包装可以包含在一个大的单独的包装形式中(例如，瓶，盒子，封袋，管子)。
筛选的方法
在另一实施方案中，该发明是一种测定或鉴定结合HMGB多肽(例如，哺乳动物HMGB多肽(例如，HMGB1多肽))的试剂的方法。在某一实施方案中，测定或鉴定结合HMGB多肽的方法是一种竞争结合试验，其中被测试试剂对本发明的抗体或抗原-结合片段的抑制能力被检测。例如，抗体或抗原-结合片段可以被这里所述的合适的标记物标记，在此试验中饱和HMGB多肽所需的标记抗体或抗原-结合片段的量可以被测定。例如，在适合于结合和组合物形成的条件下，饱和HMGB多肽所需的标记抗体或抗原-结合片段的量及被测试试剂的不同的量可以与HMGB多肽相联系。在这种测试类型中，标记的抗体或抗原-结合片段和HMGB多肽形成的组合物量的减少表明被测试试剂可以与HMGB多肽结合。在另一实施方案中，HMGB多肽可以被标记。适合的标记抗体，抗原-结合片段和/或HMGB多肽的标记物包括以上所述的示例。
各种不同的试剂，如蛋白质(如抗体)，多肽，虚拟缩氨酸，小组织分子，核酸和其类似物，可以测定其与HMGB多肽(例如，哺乳动物HMGB多肽(例如，HMGB1多肽))的结合情况。根据本发明的方法，试剂可以单独地进行筛选或一种或多种试剂可以同时进行测试。当测试某种组合物时，通过所述的方法进行选择的组合物可以利用合适的方法(例如，测序，色谱)被分离(适当的)和鉴定。被测试样本中的一种或多种混合成分(例如，配基，抑制子，启动子)也可以由这些方法进行检测。
如此所述，可以利用这里所述的或其他合适的方法，通过对分子文库或收集库，如，国家癌症中心化学库，进行筛选，从而对结合HMGB多肽并有益于治疗方法的试剂进行鉴定。由组合化学或其他方法制备的组合物(例如，组织成分，重组或合成多肽，“peptoids”，核酸)的文库，如组合文库，可以被鉴定(见，例如，Zuckerman，R.N et al.，J.Med Chem.，37：2678-2685(1994)及其中引用的参考文献；也可见，Ohlmeyer，M.H.J.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10922-10926(1993)and DeWitt，H.H.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6909-6913(1993)，relating to taggedcompounds；Rutter W.J et al.美国专利号5,010,175；Huebner，V.D.et al.，美国专利号5,182,366；和Geysen，H.M.，美国专利号4,833,092)。当从文库中挑选的组合物带有唯一的标记时，用色谱方法鉴定单独的成分是可行的。
本发明将由以下的例子进行阐明，这些例子并非是限制性的。在此之前还未被清楚地合并于本文的被引用的所有出版物的相关技术，都将在此通过引述而合并于本文。
例1：材料和方法
HMGB1的单克隆抗体的制备
每间隔2星期用20μg与Freund’s佐剂混合的重组CBP-鼠HMGB1(小鼠HMGB11-215位氨基酸联接了CBP；CBP-鼠HMGB1的核酸序列被描述为SEQ ID NO：4而氨基酸序列被描述为SEQ ID NO：5(见图3A和3B))腹膜内免疫BALB/c小鼠，为期6周。8周后用溶解在PBS中的10μgCBP-鼠HMGB1腹膜内免疫BALB/c小鼠作为最后一次加强免疫。最后一次加强免疫后4天，小鼠的脾细胞被分离并用于融合。根据标准杂交技术进行融合。脾脏通过细胞滤网的轻缓挤压，得到单细胞悬液。充分洗涤后，脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合。缓慢加入聚乙二醇(PEG)，孵育5分钟。细胞经过洗涤并重新悬浮在含有20％FCS和HAT的DMEM中，转移至96孔板并在37℃，10％CO2条件下培养10-14天。
在另一试验中，人HMGB1 B匣多肽(SEQ ID NO：3；图2B)作为免疫原被使用。每间隔3周用10μg/混合了Freund’s佐剂的注射用HMGB1 B匣对5只雌性BALB/c小鼠进行腹膜内免疫。每次加强免疫后1周进行采血。第三次加强免疫后3周，给予最后一次小鼠HMGB1 B匣的腹膜内注射免疫(10μg/小鼠)。最后加强免疫的72小时后，如上所述进行杂交瘤融合试验。杂交瘤在含有20％FBS，HAT，CondiMed和1％pen/strep的DMEM中培养。通过光学读数并鉴定那些5被高于背景值的克隆，从而对阳性克隆进行鉴定。
CBP-大鼠HMGB1和人HMGB1 B匣的抗体可通过有限稀释和ELISA筛选。ELISA板用3μg/ml的重组HMGB1包被过夜，并用含有1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲盐(PBS)封闭。ELISA板中加入杂交瘤上清，室温孵育30分钟。板经洗涤后加入连接了辣根过氧化酶的抗-鼠Ig。室温孵育30分钟后，板经洗涤并显影。从阳性细胞中得到的细胞被转入到24孔板并通过有限稀释进行克隆。
HMGB1刺激TNF的释放
小鼠巨噬细胞系RAW 264.7(可从美国典型培养中心(ATCC)获得，Manassas，VA)与不同浓度的HMGB1在无血清的Opti-MEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)中于37℃共同培养4小时。收集上清并用ELISA试剂盒(R&D系统，Minneapolis，NM)测试TNF水平。此方法也可以运用于肝素处理的全血。在这种情况下，HMGB1用Opti-MEM稀释，加入100全血使终浓度至200μl，移至U-形底96孔板。将板置于37℃4小时并收集血浆用于ELISA试验。
为了筛选抑制HMGB1的mAbs，纯化的mAbs用Opti-MEM稀释并与鼠HMGB1在室温下混合。5分钟后，该组合物被转移至含有RAW 264.7细胞的组织培养孔中。将板置于37℃4小时并收集血浆用于ELISA试验。
HMGB1单克隆抗体的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，WesternBlot分析和筛选
为了测定HMGB1 mAbs和HMGB1，样本与4XNuPAGE LDS样本缓冲液混合，10X NuPAGE样本浓缩试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)。样本在沸水中加热5分钟，立即置于冰上并上样至SDS-聚丙烯酰胺凝胶。利用标准技术可进行Western Blot分析。
对于测定HMGB1单克隆抗体的选择性的试验(例如，对于HMGB1和/或HMGB2的选择性)，Western Blot分析可用于以下样本，如来源于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的含有非-重组(例如，自然的)HMGB1的样本(图11；标记为CHO HMGB1；SEQID NO：36)或来源于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的含有非-重组(例如，自然的)HMGB2的样本及一些可测定的重组人HMGB1-His6(图11；标记为CHO HMGB2，rec-HMGB1-His6)。图18A和18B显示了带有5’HIS标签的人重组HMGB1多肽的核酸和编码的氨基酸序列(rec-HMGB1-His6；SEQ ID Nos：39和40)。
对于含有CHO HMGB1的样本，含有～2.5-5ng/μl非-重组(如，自然的)HMGB1的来源于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的样本。20μl的样本(例如，～50-100ng HMGB1)被上样至凝胶并进行SDS-PAGE。为了分离CHO HMGB1多肽，CHO细胞经裂解后离心分离上清。运用离子交换色谱和肝磷脂-亲和色谱，具有HMGB1免疫反应但无可检测到HMGB2免疫反应的峰区域被收集并作为CHO HMGB1来源。
对于来源于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的含有非-重组(例如，自然的)HMGB2和一些可检测的重组HMGB1-His6的样本(图11；标记为CHO HMGB2，HMGB1-His6)，转染重组HMGB1-His6-表达质粒的CHO细胞可以被利用。为了分离CHO HMGB2多肽，CHO细胞被裂解并经离心分离上清。运用离子交换色谱和肝磷脂-亲和色谱，具有HMGB2免疫反应，但无可检测到自然HMGB1免疫反应的峰区域被收集并作为CHO HMGB2来源。在一些情况下，收集的CHO HMGB2部分含有可测出量的重组HMGB-1-His6多肽，然而在SDS-PAGE中，基于其较慢的迁移率(并显示了更高分子量)重组HMGB-1-His6多肽很容易与HMGB2相区分。如图11，运用凝胶系统进行的Western blots示，非-重组CHO HMGB2的分子量显示为～27000，非-重组CHOHMGB1的分子量显示为～29000，重组HMGB-1-His6的分子量显示为31000。对于CHO HMGB2，rec-HMGB1-His6样本，20μ1的样本(例如，～10-20ng HMGB2)被上样至凝胶并进行SDS-PAGE。
对于图11中描述的Western blots，可以使用抗-His标签抗体(Santa Cruz，CA；2μg/ml)，抗-HMGB2抗体(Pharmingen，SanDiego，CA；2μg/ml)，抗-HMGB1/2mAb(MBL International，Watertown，MA；2μg/ml)或特异抗-HMGB1单克隆抗体(例如，2E11 HMGB1 mAb(CT3-2E11)，1G3 HMGB1 mAb(CT3-1G3)，6H9 HMGB1 mAb(CT3-6H9)，2G7 HMGB1 mAb(CT3-2G7)，2G5HMGB1 mAb(CT3-2G5)和6E6 HMGB1 mAb(CT3-6E6)；每种2μg/ml)。
单克隆抗体的测序
根据试剂盒的程序，运用Rneasy MiniKit(Qiagen，Valencia，CA)从杂交瘤细胞中提取全部RNA。根据试剂盒程序，运用ProtoScript first Strand cDNA Synthesis Kit(New England biolabs，Catalog#E6500S)合成第一条cDNA链。在PCR反应体系中加入5μgcDNA(如鼠Ig-引物设计程序中描述，Catalog#69831-3，Novagen，Madison，WI)，该体系还含有25pmol适当的5’引物(如Novagen Ig-引物设计程序中描述，重链引物MuIgGVH5’-A，MuIgGVH5’-B，MuIgGVH5’-C，MuIgGVH5’-D，MuIgGVH5’-E，MuIgGVL5’-A，MuIgGVL5’-B，MuIgGVL5’-C，MuIgGVL5’-D，MuIgGVL5’-E)和3’引物(如Novagen Ig-引物设计程序中描述，重链引物MuIgGVH3’-2和轻链引物MuIgGVL3’-2)。PCR反应条件为94℃ 1分钟，50℃ 1分钟，72℃ 2分钟共35个循环，随后72℃延长6分钟。PCR产物克隆入TOPO(Invitrogen，San Diego，CA)。用Genaissance Pharmaceuticals(New Haven，CT)进行DNA序列分析。
HMGB1多肽结合试验
结合抗-结合链霉亲和素-包被板(Pierce，rockford，IL，目录号#15501)的生物素化多肽和结合聚-D-赖氨酸包被ELISA板的非-生物素化多肽被用于抗-多肽ELISAs。对应于人HMGB1特定的18个氨基酸区域的生物素化多肽，及对应于人HMGB1特定的9-85个氨基酸区域的更长的多肽，被制备，并用ELISA分析其结合特异抗-HMGB1单克隆抗体的情况。这些多肽，及其相应序列，在图13A中已有描述。通过加入60-100μg/孔的0.1mg/ml聚-D-赖氨酸水溶液制备聚-D-赖氨酸包被ELISA板。板置于室温5分钟并水漂洗除去溶液。
简要地，运用相应多肽的分子量，可用无-热源-水制备1mM多肽溶液并稀释入1X磷酸盐缓冲液中。并在指定孔中加入100μl不同量的多肽溶液。板子覆盖后在室温放置60分钟。然后用大于100μl的含有0.05％聚氧乙烯山梨聚糖(这里指Tween20TM)的PBS洗3遍，每孔加入200μl封闭剂(溶于PBS的5％脱脂奶粉，0.05％Tween20TM)。板子覆盖后在室温放置60分钟。用大于100μl的含有0.05％Tween20TM的PBS洗3遍。
在指定孔中加入100μl一抗体(例如，2E11 HMGB1 mAb，6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，以2μg/ml溶解在封闭液中)，板子覆盖后在室温放置30分钟。用大于100μl的含有0.05％Tween20TM的PBS洗3遍。
每孔中加入100μl羊-抗鼠辣根过氧化酶(HRP)-连接的二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA，目录号115-035-071；1∶2000稀释使用)。板子覆盖后在室温放置30分钟，随后用大于100μl的含有0.05％Tween20TM的PBS洗3遍。每孔中加入50μl 1X TMB(Sigma，St.Louis，MO)，
在室温放置10分钟，用icroplate/Manager软件和BioRad680型读板仪在655nm处测量吸收值。平均背景值均从每个样本值中减去。
盲肠结扎穿孔
盲肠结扎穿孔(CLP)按上述方法进行(Fink and Heard，J.Surg.Res.49：186-196(1990)；Wichmann et al.，Crit.Care Med.26：2078-2086(1998)；and Remick et al.，Shock 4：89-95(1995))。简要地，BALB/c小鼠按75mg/kg克他命(Fort Dodge，Fort Dodge，Iowa)和20mg/kg甲苯噻嗪(Bohringer Ingelheim，St.Joseph，MO)肌肉内注射麻醉。按中线进行切口，分离出盲肠。在远离回盲阀方向的盲肠端5mm处用6-0聚丙烯纺织纤维缝合绷带结扎。
结扎的盲肠末端用22-规格针头刺孔，不需直接挤出粪便。盲肠被放回入正常的腹腔位置。腹部用6-0聚丙烯纺织纤维进行双层连续缝合缝合，腹膜和绷带应分离以防止流液渗漏。所有的动物以20ml/kg体重皮下注射正常盐溶液使之复苏。复苏后30分钟，每只小鼠皮下注射imipenem(0.5mg/小鼠)(Primaxin，Merck & Co.，Inc.，West Point，PA)。动物随之复原。一星期后记录死亡率；存活者接着观察2星期以确保无死亡发生。
从进行CLP的第二天开始，用100μg特异的抗-HMGB1单克隆抗体(例如，6E6 HMGB1 mAb(Mab(6E6))；2E11 HMGB1mAb(Mab(2E11))；9G2 HMGB1 mAb(Mab(9G2))；和对照IgG抗体每1天或2天对小鼠进行腹腔内注射，共5次。图16的数据显示，不同剂量(1μg/小鼠，10μg/小鼠，100μg/小鼠)6E6HMGB1 mAb或对照IgG抗体进行了腹腔内注射。
HMGB1 ELISA
用不同的HMGB1单克隆抗体进行两种ELISA方法。
用单克隆(捕获)+多克隆(测定)抗体对进行HMGB1 ELISA
在第一种方法中，ELISA板包被了许多纯化的抗-HMGB1mAbs(例如，2E11 HMGB1 mAb，2G5 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，6E6 HMGB1 mAb)，4℃孵育过夜。板子用含1％BSA的PBS置37℃封闭1小时。冲洗后，加入指示浓度的重组鼠HMGB1，板子置37℃1小时。板子冲洗后与2μg/ml兔抗HMGB1多克隆抗体孵育(见美国专利号6,303,321，6,448,223和6,468,533)。室温1小时后，板子冲洗后与用PBS 1∶1000稀释的羊抗-兔Ig-HPR(Jackson ImmunoResearch Laboratories，WestGrove，PA)孵育30分钟。冲洗后，板子用TMB显色(Invitrogen，San Diego，CA)并用读板机在655nm处测定吸收值。
用单克隆抗体对进行HMGB1 ELISA(用6E6 HMGB1 mAb测定)
ELISA板经覆盖和封闭，按上述随后加入重组鼠HMGB1。洗去非结合的HMGB1多肽后，加入2μg/ml生物素标记的6E6HMGB1 mAb并在室温下孵育1小时。链霉素亲和素-HRP被用于测定结合的6E6 HMGB1 mAb，板子按上述方法用TMB显色。
例如2：鉴定和描述抗-HMGB1单克隆抗体
用重组全长大鼠HMGB1(SEQ ID NO：4；图3A和3B)或人HMGB1 B-匣多肽(SEQ ID NO：3；图2B)免疫，已经分离和纯化出许多新的抗-HMGB1单克隆抗体。图7显示了描述这些抗体特征的表格(克隆名称，免疫原，同型，纯化抗体结合区域，体内CLP试验结果)。
例3：测定抗-HMGB1单克隆抗体的选择性
测定HMGB1单克隆抗体选择性的试验(例如，ELISA，Western blot试验)显示了特异的抗-HMGB1单克隆抗体可以结合HMGB1 A匣区域，HMGB1 B匣区域和/或完整的HMGB1蛋白。例如，图7显示，经鉴定抗-HMGB1单克隆抗体可以结合HMGB1 A匣(例如，6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，10D4HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，2G5HMGB1 mAb，4H11 HMGB1 mAb，7H3 HMGB1 mAb，9H3HMGB1 mAb)。其他单克隆抗体经鉴定可以结合HMGB1 B匣(例如，2E11 HMGB1 mAb，3G8 HMGB1 mAb，3-5A6 HMGB1 mAb，9G1 HMGB1 mAb，4C9 HMGB1 mAb，1C3 HMGB1 mAb，5C12HMGB1 mAb，3E10 HMGB1 mAb，7G8 HMGB1 mAb，4A10HMGB1 mAb)。
例4：测定抗-HMGB1单克隆抗体的核酸和氨基酸序列
对于特异的HMGB1单克隆抗体(6E6 HMGB1 mAb，2E11HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb)，也可以得到VH区域和VK区域包括CDRs的核酸和氨基酸序列(图。4A-4D，5A-5D，6A-6D，19A-19D)。
例5：利用抗-HMGB1单克隆抗体抑制TNF的释放
特异的HMGB1单克隆抗体抑制TNF的释放的能力被测试。图8和9显示了此项研究的结果，柱状图显示了分别运用HMGB1，HMGB1加上特异HMGB1单克隆抗体，或对照IgG抗体对RAW 264.7细胞作用后TNF释放的情况。图8显示了6E6HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb，9G2 HMGB1 mAb，和对照IgG抗体引发的对HMGB1-介导的TNF释放的抑制结果。图9显示了3G8 HMGB1 mAb，1A9 HMGB1mAb，9G2 HMGB1 mAb，6E6 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，和对照IgG抗体等引发的对HMGB1-介导的TNF释放的抑制结果。如图8和9所示，特异的HMGB1单克隆抗体(例如，6E6 HMGB1 mAb，10D4HMGB1 mAb)抑制TNF释放，显示这些抗体可以用于调节一种或多种HMGB的功能(例如，如此所述)。例如，这些阻抑抗体可以用于综合HMGB1的生物学活性(例如，HMGB1-介导的细胞因子级联效应)。
例6：用抗-HMGB1单克隆抗体对脓血症小鼠进行治疗增加小鼠的存活率
一种由外科手术-创造的盲肠支囊脓血症特定模型，并导致多微生物腹膜炎和脓血症(Fink and Heard，supra；Wichmann et al.，Supra；and Remick et al.，supra)的盲肠结扎穿孔(CLP)实施于小鼠后，以特异抗-HMGB1单克隆抗体(6E6 HMGB1 mAb，2E11mAb或9G2 HMGB1)或对照IgG抗体(以100μl抗体每天两次)进行治疗。存活率被监视7天。图10显示了此研究的结果，柱状图表示脓血症小鼠在经对照抗体或特异抗-HMGB1单克隆抗体治疗后的存活率。结果显示在盲肠穿孔后24小时后，与对照IgG抗体治疗相比，抗-HMGB1单克隆抗体进行治疗可减少动物的死亡率。对于6E6 HMGB1 mAb，第7天的存活率仍非常显著(与对照相比p＜0.03，Fisher的准确试验)。
6E6 HMGB1 mAb对脓血症小鼠进行治疗的剂量效应曲线也被实践。图16显示，1，10和100μg剂量的6E6 HMGB1 mAb作用于小鼠。结果显示经10μg剂量的6E6 HMGB1 mAb治疗的脓血症小鼠具有最大的存活率。
例7：抗-HGB1单克隆抗体的选择性
如上所述，特异抗-HMGB1单克隆抗体可以进行western blot分析。图11显示了含有CHO或CHO HMGB2或者重组HMGB1-His6(标记CHO HMGB2，rec-HMGB1-His6)的样本的western blot，这些样本用抗-His标记抗体，抗-HMGB1抗体，抗-HMGB1/1单克隆抗体，或特异抗-HMGB1单克隆抗体(例如，2E11 HMGB1 mAb，1G3 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7HMGB1 mAb，2G5 HMGB1 mAb，6E6 HMGB1 mAb)作为探针。试验结果显示2G7 HMGB1 mAb可结合HMGB1但不与HMGB2结合，而2E11 HMGB1 mAb，1G3 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1mAb可检测HMGB2及HMGB1。
例8：HMGB1多肽结合试验
对应于人HGMB1特异18个氨基酸区域的生物素标记多肽及更长的对应于人HGMB1 9-85位氨基酸残基的多肽被制备并通过ELISA试验分析其特异抗-HMGB1单克隆抗体的结合。图13A显示了这些多肽和其对应序列。
图13B显示了这些多肽结合试验结果。如图13B显示，2E11HMGB1 mAb结合对应于人HMGB1 151-168氨基酸残基的多肽(例如，氨基酸残基151-168 SEQ ID NO：1)。6E6 HMGB1 mAb和6H9 HMGB1 mAb结合对应于人HMGB1 61-78氨基酸残基的多肽(例如，氨基酸残基61-78 SEQ ID NO：1)。2G7 HMGB1 mAb结合对应于人HMGB1 46-63氨基酸残基的多肽(例如，氨基酸残基46-63 SEQ ID NO：1)。此外，2G7 HMGB1 mAb和6E6HMGB1 mAb也可以结合更长的对应于人HGMB1 9-85位氨基酸残基的多肽。这些试验显示特异的抗-HMGB1单克隆抗体识别HMGB1多肽上的不同表位。例如，6E6 HMGB1 mAb，其了结合包含于HMGB1 61-78位氨基酸的表位并显示了对HMGB1-介导的TNF释放抑制。HMGB1特定区域中阻抑表位的发现可以用于额外的阻抑药剂的筛选(例如，抑制HMGB1功能(例如，HMGB1-介导的细胞级联活性)的药剂)。
例9：HMGB1 ELISA
如图S14和15显示，两种不同的ELISA方法被用于测试特异抗-HMGB1单克隆抗体的特性。在某一方法中，HMGB1单克隆抗体2E11 HMGB1 mAb，2G5 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，6E6 HMGB1 mAb作为捕获抗体使用，而HMGB1多克隆抗体作为检测抗体使用。在另一种ELISA方法中，，HMGB1单克隆抗体2E11 HMGB1 mAb，2G5 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，6E6HMGB1 mAb作为捕获抗体使用，而6E6 HMGB1 mAb作为检测抗体使用。两种ELISA方法的结果都显示单克隆HMGB1抗体可以检测HMGB1并适用于这里所述的诊断和/或预兆方法。
例10：2G7 HMGB1 mAb与HMGB1的结合被对应于HMGB146-63位氨基酸残基的多肽抑制
用2G7 HMGB1 mAb进行HMGB1多肽结合试验。如述，对应于人HMGB1 46-63位氨基酸残基或人HMGB1 61-78位氨基酸残基的生物素标记合成多肽被制备并用ELISA分析其与2G7HMGB1 mAb(2G7)的结合情况。简要地，2μg/m2G7 HMGB1mAb 1的被加入到含有指示浓度(0，0.33，1，3，9，27，81，243μM多肽)的HMGB1 46-63多肽或HMGB1 61-78多肽的孔中，置于25℃1小时以制备抗体-多肽样本。ELISA板子用10μg/ml重组鼠HMGB1包被，4℃孵育过夜。板子用再造奶粉封闭，置37℃1小时。加入以上所列浓度的抗体-多肽样本并于室温孵育1小时。板子经洗涤并用辣根过氧化物酶-HRP孵育。洗涤后，板子用TMB显色(Invitrogen，San Siego，CA)并用读板仪在655nm出测量吸收值。
图20显示最大信号百分比的结果(y-轴)。如图20显示，任何浓度的HMGB1 46-63多肽抑制了2G7 HMGB1 mAb同HMGB1的结合(以最大信号减少量百分比显示)。相反，HMGB161-78多肽不抑制2G7 HMGB1 mAb同HMGB1的结合。这些试验进一步验证2G7 HMGB1 mAb与位于HMGB1 46-63位氨基酸的表位相结合。
例11：与HMGB1的结合被高浓度的对应于HMGB1 151-168位氨基酸残基的多肽抑制
如本文所述，用2E11 HMGB1 mAb和对应于人HMGB146-63位氨基酸残基(SEQ ID NO：23)或人HMGB1 151-168位氨基酸残基(SEQ ID NO：30)的生物素标记的合成多肽进行HMGB1多肽结合试验。图21显示了这些试验的结果(最大信号百分比的结果(y-轴))。图21显示，9或更高浓度的HMGB1 151-168多肽显著地抑制2E11 HMGB1 mAb同HMGB1的结合。3μM或更低浓度的HMGB1 151-168多肽不能显著地抑制2E11 HMGB1mAb同HMGB1的结合(图21)。此外，HMGB1 46-63多肽不能抑制2E11 HMGB1 mAb同HMGB1的结合。这些试验验证2E11HMGB1 mAb与位于HMGB1 151-168位氨基酸的表位相结合。
例12：2G7 HMGB1 mAb识别位于HMGB1 53-63位氨基酸的表位
不同的合成多肽被制备。这些合成多肽包括对应于人HMGB1 46-63位氨基酸残基的生物素标记多肽(SEQ ID NO：23；标记为“huHMGB1-46-63-B”或“Human HMGB1-46-63-B”)，对应于人HMGB2 46-63位氨基酸残基的生物素标记多肽(SEQ IDNO：48；标记为“huHMGB2-46-63-B”或“HumanHMGB2-46-63-B”)，对应于人HMGB1 53-70位氨基酸残基的非-生物素标记多肽(SEQ ID NO：47；标记为“huHMGB1-53-70”或“Human HMGB1-53-70”)，对应于人HMGB1 61-78位氨基酸残基的生物素标记多肽(SEQ ID NO：24；标记为“huHMGB1-61-78-B”)，对应于人HMGB1 40-57位氨基酸残基的非-生物素标记多肽(SEQ ID NO：46；标记为“HumanHMGB1-40-57”)及由混杂的氨基酸序列组成的生物素标记多肽，其中的混杂的氨基酸残基属于人HMGB1 46-63位氨基酸残基(SEQ ID NO：45；标记为“Human HMGB-46-63-scr”)。如此所述，运用ELISA，通过分析2G7 HMGB1 mAb与这些交迭多肽的结合情况进一步特定地确定HMGB1中结合2G7 HMGB1 mAb的表位。图23显示了这些多肽和其对应序列。
图22和23显示了多肽结合试验的结果。如图22和23显示，2G7 HMGB1 mAb结合HMGB1 46-63多肽(例如，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：23中的46-63位氨基酸残基)但不结合人HMGB2对应区域(例如，HMGB2 46-63多肽，SEQ ID NO：54或SEQ IDNO：48中46-63位氨基酸残基)。此外，2G7 HMGB1 mAb结合HMGB1 53-70多肽但不结合HMGB1 40-57多肽。2G7 HMGB1mAb也不结合由HMGB1 46-63位氨基酸残基混杂序列组成的多肽。除了显示2G7 HMGB1 mAb与不同合成多肽的结合情况，图22还显示了抗生物素蛋白与这些合成多肽的结合情况。
在例8中，具显示2G7 HMGB1 mAb结合包含HMGB1 46-63氨基酸残基的表位。已知2G7 HMGB1 mAb结合HMGB1 46-63为多肽和HMGB1 53-70位多肽，这些试验显示识别位于由HMGB1 53-63氨基酸残基构成的氨基酸区域的表位。这些试验进一步表明2G7 HMGB1 mAb不结合HMGB2 46-63多肽，尽管在HMGB1 46-63多肽和HMGB2 46-63多肽间仅有一个氨基酸的差别。同样地，HMGB1的第58位甘氨酸残基((Gly-58)，其对应于HMGB2中的丝氨酸残基，在2G7 HMGB1 mAb识别的HMGB1表位中是一个重要的氨基酸残基(图23)。
例13：6E6 HMGB1 mAb识别位于HMGB1 67-78位氨基酸的表位
不同的合成多肽被制备。这些合成多肽包括对应于人HMGB1 53-70位氨基酸残基的非-生物素标记多肽(SEQ IDNO：47；标记为“Human HMGB1-53-70-B”；如上述)，对应于人HMGB1 67-84位氨基酸残基的非-生物素标记多肽(SEQ IDNO：50；标记为“Human HMGB1-67-84”；如上述)，对应于人HMGB1 61-78位氨基酸残基的生物素标记多肽(SEQ ID NO：24；标记为“Human HMGB1-61-78-B”；如上述)及由混杂的氨基酸序列组成的非-生物素标记多肽，其中的混杂的氨基酸残基属于人HMGB1 61-78位氨基酸残基(SEQ ID NO：49；标记为“HumanHMGB-61-78_ser”)。如此所述，运用ELISA，通过分析6E6HMGB1 mAb与这些交迭多肽的结合情况进一步特定地确定HMGB1中结合6E6 HMGB1 mAb的表位。这些多肽和其对应序列及结合6E6 HMGB1 mAb的多肽多肽显示在图24中。
图24显示了多肽结合试验的结果。如图24显示，6E6 HMGB1mAb结合HMGB1 61-78多肽(SEQ ID NO：24)。此外，6E6HMGB1 mAb结合HMGB1 67-84多肽(SEQ ID NO：50)但不结合HMGB1 53-70多肽(SEQ ID NO：47)。6E6 HMGB1 mAb也不结合由HMGB1 61-78位氨基酸残基混杂序列组成的多肽(SEQID NO：49)(图24)。在例8中，显示6E6 HMGB1 mAb结合包含HMGB1 61-78位氨基酸残基的表位。根据6E6 HMGB1 mAb结合HMGB1 61-78位多肽和HMGB1 67-84为多肽，这些试验显示6E6 HMGB1 mAb识别存在于HMGB1 67-78为氨基酸残基构成的氨基酸区域的表位。
例14：2E11 HMGB1 mAb的HMGB1多肽结合试验
不同的合成多肽被制备。这些合成多肽包括对应于人HMGB1 151-168位氨基酸残基的生物素标记多肽(SEQ IDNO：30；标记为“Human HMGB1-151-168-B”)，对应于人HMGB1143-160位氨基酸残基的非-生物素标记多肽(SEQ ID NO：52；标记为“Human HMGB1-143-160”)，对应于人HMGB1 157-174位氨基酸残基的生物素标记多肽(SEQ ID NO：53；标记为“HumanHMGB1-157-174”)及由混杂的氨基酸序列组成的非-生物素标记多肽，其中的混杂的氨基酸残基属于人HMGB1 151-168位氨基酸残基(SEQ ID NO：51；标记为“Human HMGB-151-168 ser”)。如此所述，运用ELISA，通过分析2E11 HMGB1 mAb与这些交迭多肽的结合情况进一步特定地确定HMGB1中结合2E11HMGB1 mAb的表位。这些多肽和其对应序列及结2E11 HMGB1mAb的多肽显示在图25中。
如图25显示，2E11 HMGB1 mAb结合HMGB1 151-168多肽(SEQ ID NO：30)，但不结合HMGB1 143-160多肽(SEQ IDNO：52)或HMGB1 157-174多肽(SEQ ID NO：53)。在本领域中所熟知，存在两种类型的表位或抗原决定簇：线性的，连续的或持续的及非-线性的，构象的或非连续的表位。典型的抗体表位常常由6个氨基酸残基构成，但也可能为不同大小。这些试验显示2E11 HMGB1 mAb识别的表位可能包含HMGB1的156-161位氨基酸残基。然而，2E11 HMGB1 mAb也可识别包括此区域侧翼氨基酸的表位，例如，HMGB1 155-161，155-162，156-162和/或156-163位氨基酸残基。
图26显示：多肽结合结果概要显示了图示的HMGB1表位，其可被不同HMGB1 mAbs(例如，2G7 HMGB1 mAb，6E6 HMGB1mAb，2G5 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb)识别。
例15：6E6 HMGB1 mAb的质谱分析
6E6 HMGB1 mAb的质量通过质谱分析测定。6E6 HMGB1mAb被送至Novatia，LLC(Princeton，NJ)进行LC/MS分析。简要地，抗体，无论是原始的或经DTT处理(分离重链和轻链)，用RLRP-s 4000A反相HPLC柱(HPLC/ESI-MS系统)和质谱分析(Rinnigan TSQ7000质谱分析)进行分析。蛋白的质量精确性通常为±0.01％，此精确性可通过测定6E6轻链质量进行(例如，2Da/23917 Da*100％＝0.008％)。
图27A-27D显示了这项分析的结果，其显示了质谱图。6E6HMGB1 mAb的总质量为146.5kDa(土27A；显示原始6E6HMGB1 mAb的质谱)。6E6 HMGB1 mAb轻链和重链的质量经测定分别为23.9kDa(土27B和27C)及4934kDa(图27B和27D)。根据氨基酸分子量计算的轻链和重链的质量预测值，分别为23.9kDa和47.9kDa。
例16：单剂量2G7 HMGB1 mAb治疗增加了脓血症小鼠的存活率
如上述进行小鼠的盲肠结扎穿孔手术(CLP)。在一项试验中，手术后24小时，小鼠按0.004mg/kg，0.04mg/kg，0.4mg/kg的2G7 HMGB1 mAb每天进行腹腔内注射治疗。在第二中试验中，手术后24小时，小鼠按0.04mg/kg的2G7 HMGB1 mAb或0.4mg/kg对照IgG(IgG对照)每天进行腹腔内注射治疗。两组试验小鼠的存活率均监视14天。两组试验的合并和结果显示在图28中。以0.4mg/kg的2G7 HMGB1 mAb治疗的小鼠在CLP14天后的存活率约为85％，而相对以IgG对照治疗的小鼠其在CLP14天后的存活率约为40％(图28)。此外，图28显示，分别以0.04mg/kg和0.004mg/kg 2G7 HMGB1 mAb治疗其CLP14天后的存活率分别约为60％和50％。
图29是用不同剂量(4mg/kg，0.4mg/kg，0.04mg/kg，0.004mg/kg)，或对照IgG治疗小鼠，其CLP存活百分率的比较图表。如图29所示，小鼠一日内进行四次腹腔内注射。结果显示以0.4mg/kg6E6 HMGB1 mAb或2G7 HMGB1 mAb治疗，CLP14天后脓血症小鼠的存活率大于80％，相比较，以对照IgG治疗的小鼠CLP14天后脓血症小鼠的存活率仅为40％。
例17：抗-HMGB1单克隆抗体已知TNF的释放
如例5，特异HMGB1单克隆抗体抑制TNF释放的能力被测试。图32和33显示了此研究的结果，柱状图标示RAW 24607细胞经HMGB1(黑柱)，或HMGB1加上特异HMGB1单克隆抗体处理后TNF的释放情况。图32显示了1A9 HMGB1 mAb(1A9)；2E11 HMGB1 mAb(2E11)；2G5 HMGB1 mAb(2G5)；2G7HMGB1 mAb(2G7)；3G8 HMGB1 mAb(3G8)；4H11 HMGB1mAb(4H11)；5A6 HMGB1 mAb(5A6)；6E6 HMGB1 mAb(6E6)；9G2 HMGB1 mAb(9G2)；4C9 HMGB1 mAb(4C9)和6H9 HMGB1mAb(6H9)对HMGB1-介导的TNF释放的抑制结果。图33显示了7H3 HMGB1 mAb(7H3)；9H3 HMGB1 mAb(9H3)；10D4HMGB1 mAb(10D4)；1C3 HMGB1 mAb(1C3)；3E10 HMGB1mAb(3E10)；4A10 HMGB1 mAb(4A10)；5C12 HMGB1mAb(5C12)；HMGB1 mAb(7G8)对HMGB1-介导的TNF释放的抑制结果。
如图32和33所示，以及例5中所示的结果，特异HMGB1单克隆抗体(例如2E11 HMGB1 mAb，4H11 HMGB1 mAb，6H9HMGB1 mAb和10D4 HMGB1 mAb)抑制TNF的释放，表明这些抗体可以用于调节HMGB1的一种或多种功能(例如，如此所述)。例如，这些阻抑抗体可以中和HMGB1的生物学活性(例如，HMGB1-介导的细胞因子级联活性)。
虽然本发明已经参考最佳实施方案被具体地显示和描述，但本领域技术人员应该可以理解的是，在不超出权利要求书的发明范围的条件下，可以进行形式和细节方面的不同的变化。
                              序列表
<110>鉴定医疗有限公司
     沃特·纽曼
     秦世欣
     特丽萨·奥基夫
     罗伯特·奥巴
<120>拮抗HMGB1的单克隆抗体
130>3258.1033-003
<140>PCT/US2004/029527
<141>2004-09-10
<150>60/502,568
<151>2003-09-11
<160>76
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>216
<212>PRT
<213>智人
<400>1
Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Thr Gly Lys Met Ser Ser Tyr
 1               5                  10                  15
Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro
             20                  25                  30
Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg
        35                  40                  45
Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala
    50                  55                  60
Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro
65                  70                  75                  80
Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys
                85                  90                  95
Arg Leu Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys
            100                 105                 110
Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys
        115                 120                 125
Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr
    130                 135                 140
Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala
145                 150                 155                 160
Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val
                165                 170                 175
Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu
            180                 185                 190
Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Asp
        195                 200                 205
Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu
    210                 215
<210>2
<211>85
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Thr Gly Lys Met Ser Ser Tyr
 1               5                  10                  15
Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro
            20                  25                  30
Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg
        35                  40                  45
Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala
    50                  55                  60
Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro
65                  70                  75                  80
Pro Lys Gly Glu Thr
                85
<210>3
<211>74
<212>PRT
<213>智人
<400>3
Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Leu Pro Ser Ala Phe Phe Leu
 1               5                  10                  15
Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu
            20                  25                  30
Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr
        35                  40                  45
Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys
    50                  55                  60
Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr
65                  70
<210>4
<211>755
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>69
<223>n＝A，T，C or G
<223>CBP-Rat HMGB1
<400>4
atgaagcgac gatggaaaaa gaatttcata gccgtctcag cagccaaccg ctttaagaaa  60
atctcatcnt ccggggcact tctggttccg cgtggatcca tcgagggaag gatgggcaaa  120
ggagatccta agaagccgag aggcaaaatg tcctcatatg cattctttgt gcaaacctgc  180
cgggaggagc acaagaagaa gcacccggat gcttctgtca acttctcaga gttctccaag  240
aagtgctcag agaggtggaa gaccatgtct gctaaagaaa aggggaaatt tgaagatatg  300
gcaaaggctg acaaggctcg ttatgaaaga gaaatgaaaa cctacatccc ccccaaaggg  360
gagaccaaaa agaagttcaa ggaccccaat gcccccaaga ggcctccttc ggccttcttc  420
ttgttctgtt ctgagtaccg cccaaaaatc aaaggcgagc atcctggctt atccattggt  480
gatgttgcga agaaactagg agagatgtgg aacaacactg ctgcggatga caagcagccc  540
tatgaaaaga aggccgccaa gctgaaggag aagtatgaga aggatattgc tgcctacaga  600
gctaaaggaa aacctgatgc agcgaaaaag ggggtggtca aggctgagaa gagcaagaaa  660
aagaaggaag aggaagacga cgaggaggat gaagaggatg aggaagagga ggaagaagag  720
gaagatgaag atgaagaaga agatgatgat gatga                             755
<210>5
<211>252
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CBP-Rat HMGB1
<400>5
Met Lys Arg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala Ala Asn
 1               5                  10                  15
Arg Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gly Ala Leu Leu Val Pro Arg Gly
            20                  25                  30
Ser Ile Glu Gly Arg Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly
        35                  40                  45
Lys Met Ser Ser Tyr Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His
    50                  55                  60
Lys Lys Lys His Pro Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys
65                  70                  75                  80
Lys Cys Ser Glu Arg Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys
                85                  90                  95
Phe Glu Asp Met Ala Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met
            100                 105                 110
Lys Thr Tyr Ile Pro Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp
        115                 120                 125
Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser
    130                     135                 140
Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly
145                 150                 155                 160
Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp
                165                 170                 175
Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr
            180                 185                 190
Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala
        195                 200                 205
Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu
    210                 215                 220
Glu Asp Asp Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
225                 230                 235                 240
Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu
                245                 250
<210>6
<211>336
<212>DNA
<213>Mouse
<400>6
gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg  60
tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgcactgggt gaagcagagg  120
cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtaa tactaaatat  180
gacccgaagt tccagggcaa ggccactata acagcagaca catcctccaa cacagcctac  240
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tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgca                            336
<210>7
<211>112
<212>PRT
<213>Mouse
<400>7
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
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Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
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Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
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<210>8
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<212>DNA
<213>Mouse
<400>8
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc  60
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cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccattc  300
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<210>9
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<212>PRT
<213>Mouse
<400>9
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
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Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
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Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
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Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<210>10
<211>345
<212>DNA
<213>Mouse
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<400>11
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Gly Gln Ile Phe Pro Ala Ser Asp Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Met Phe
    50                  55                  60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Ile His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Asp Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>12
<211>321
<212>DNA
<213>Mouse
<400>12
gatattcaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc  60
gtcagttgca gtgcaagtcg gggcattaac aattatttaa actggtatca gcagaaacca  120
gatggaactg ttaaattcct gatctattac acatcaagtt tacactcagg agtcccatca  180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccatcagcaa cctggaacct  240
gaagatattg ccacttacta ttgtcagcag tatagtaagc ttccttggac gttcggtgga  300
ggcaccaagc tggaattcaa a                                            321
<210>13
<211>107
<212>PRT
<213>Mouse
<400>13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Val Ser Cys Ser Ala Ser Arg Gly Ile Asn Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Phe Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Phe Lys
            100                 105
<210>14
<211>354
<212>DNA
<213>Mouse
<400>14
gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc cgtgaagatg  60
tcctgcaagg cttctggcta cagctttacc agctactgga tgcactgggt aaaacagagg  120
cctggacagg gtctagaatg gattggtgct atttatcctg gaaatcgtga tgctagctac  180
aatcagaagt tcaagggcaa ggccaaactg actgcagtca catccgccag cactgcctac  240
ttggagctca gcagcctgac aaatgaggac tctgcggtct attactgtac aagggactac  300
ggtagtttct actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca        354
<210>15
<211>118
<212>PRT
<213>Mouse
<400>15
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Arg Asp Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Arg Asp Tyr Gly Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
        115
<210>16
<211>321
<212>DNA
<213>Mouse
<400>16
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc  60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca  120
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca  180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa  240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtggac gttcggtgga  300
ggcaccaagc tggaaatcaa a                                            321
<210>17
<211>107
<212>PRT
<213>Mouse
<400>17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>18
<211>215
<212>PRT
<213>Mouse/Rat
<400>18
Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr
 1               5                  10                  15
Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro
            20                  25                  30
Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg
        35                  40                  45
Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala
    50                  55                  60
Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro
65                  70                  75                  80
Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys
                85                  90                  95
Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys
            100                 105                 110
Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys
        115                 120                 125
Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr
    130                 135                 140
Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala
145                 150                 155                 160
Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val
                165                 170                 175
Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu
            180                 185                 190
Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu
        195                 200                 205
Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu
    210                 215
<210>19
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>19
Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr
 1               5                  10                  15
Ala Phe
<210>20
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>20
Tyr Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His
 1               5                  10                  15
Pro Asp
<210>21
<211>17
<212>PRT
<213>智人
<400>21
Lys Lys Lys His Pro Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys
 1               5                  10                  15
Lys
<210>22
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>22
His Pro Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser
 1               5                  10                  15
Glu Arg
<210>23
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>23
Ser Glu Arg Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu
 1               5                  10                  15
Asp Met
<210>24
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>24
Glu Asp Met Ala Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys
 1               5                  10                  15
Thr Tyr
<210>25
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>25
Lys Thr Tyr Ile Pro Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp
 1               5                  10                  15
Pro Asn
<210>26
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>26
Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys
 1               5                  10                  15
Ser Glu
<210>27
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>27
Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser
 1               5                  10                  15
Ile Gly
<210>28
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>28
Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr
 1               5                  10                  15
Ala Ala
<210>29
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>29
Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu
 1               5                  10                  15
Lys Glu
<210>30
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>30
Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg Ala Lys Gly
 1               5                  10                  15
Lys Pro
<210>31
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>31
Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser
 1               5                  10                  15
Lys Lys
<210>32
<211>7
<212>PRT
<213>智人
<400>32
Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys
 1               5
<210>33
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>33
Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Asp
 1               5                  10                  15
Glu Glu
<210>34
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>34
Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Asp
 1               5                  10                  15
Asp Asp Asp Glu
            20
<210>35
<211>77
<212>PRT
<213>智人
<400>35
Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg
 1               5                  10                  15
Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu
            20                  25                  30
Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu
        35                  40                  45
Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu
    50                  55                  60
Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro Pro Lys Gly Glu Thr
65                  70                  75
<210>36
<211>180
<212>PRT
<213>Chinese hamster ovary
<400>36
Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg Trp Lys Thr
 1               5                  10                  15
Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala Lys Ala Asp
            20                  25                  30
Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro Pro Lys Gly
        35                  40                  45
Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro
    50                  55                  60
Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly
65                  70                  75                  80
Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu
                85                  90                  95
Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys
            100                 105                 110
Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg
        115                 120                 125
Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu
    130                 135                 140
Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu Asp Glu Glu
145                 150                 155                 160
Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Asp
                165                 170                 175
Asp Asp Asp Glu
            180
<210>37
<211>215
<212>PRT
<213>Pig
<400>37
Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr
 1               5                  10                  15
Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro
            20                  25                  30
Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg
        35                  40                  45
Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala
    50                  55                  60
Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro
65                  70                  75                  80
Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys
                85                  90                  95
Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys
            100                 105                 110
Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys
        115                 120                 125
Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys His Pro Tyr
    130                 135                 140
Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala
145                 150                 155                 160
Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val
                165                 170                 175
Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu
            180                 185                 190
Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu
        195                 200                 205
Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu
    210                 215
<210>38
<211>215
<212>PRT
<213>Cow
<400>38
Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr
 1               5                  10                  15
Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro
            20                  25                  30
Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg
        35                  40                  45
Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala
    50                  55                  60
Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro
65                  70                  75                  80
Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys
                85                  90                  95
Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys
            100                 105                 110
Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys
        115                 120                 125
Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr
    130                 135                 140
Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala
145                 150                 155                 160
Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val
                165                 170                 175
Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu
            180                 185                 190
Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu
        195                 200                 205
Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu
    210                 215
<210>39
<211>690
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>rec-HMGB1-His6
<400>39
ccggaattcc tcaccatgca ccatcatcac catcacggca aaggagatcc taagaagccg  60
agaggcaaaa tgtcatcata tgcatttttt gtgcaaactt gtcgggagga gcataagaag  120
aagcacccag atgcttcagt caacttctca gagttttcta agaagtgctc agagaggtgg  180
aagaccatgt ctgctaaaga gaaaggaaaa tttgaagata tggcaaaagc ggacaaggcc  240
cgttatgaaa gagaaatgaa aacctatatc cctcccaaag gggagacaaa aaagaagttc  300
aaggatccca atgcacccaa gaggcctcct tcggccttct tcctcttctg ctctgagtat  360
cgcccaaaaa tcaaaggaga acatcctggc ctgtccattg gtgatgttgc gaagaaactg  420
ggagagatgt ggaataacac tgctgcagat gacaagcagc cttatgaaaa gaaggctgcg  480
aagctgaagg aaaaatacga aaaggatata gctgcatatc gagctaaagg aaagcctgat  540
gcagcaaaaa agggagttgt caaggctgaa aaaagcaaga aaaagaagga agaggaggaa  600
gatgaggaag atgaagagga tgaggaggag gaggaagatg aagaagatga agatgaagaa  660
gaagatgatg atgatgaata atctagagca                                   690
<210>40
<211>221
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>rec-HMGB1-His6
<400>40
Met His His His His His His Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg
 1               5                  10                  15
Gly Lys Met Ser Ser Tyr Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu
            20                  25                  30
His Lys Lys Lys His Pro Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser
        35                  40                  45
Lys Lys Cys Ser Glu Arg Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly
    50                  55                  60
Lys Phe Glu Asp Met Ala Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu
65                  70                  75                  80
Met Lys Thr Tyr Ile Pro Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys
                85                  90                  95
Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile
        115                 120                 125
Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala
    130                 135                 140
Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys
145                 150                 155                 160
Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala
                165                 170                 175
Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu
            180                 185                 190
Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp
        195                 200                 205
Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu
    210                 215                 220
<210>41
<211>363
<212>DNA
<213>Mouse
<400>41
caggttcagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt  60
tcctgcaagg cttctggcta tgcattcagt agctactgga tgaactgggt gaagcagagg  120
cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttatcctg gagatggtga tactaactac  180
aatggaaagt tcaagggtaa agccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac  240
atgcagctca gcagcctaac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagaagggag  300
ccttatggta gctacgtggg gtttggtttc tggggccaag ggactctggt cactgtctct  360
gca                                                                363
<210>42
<211>121
<212>PRT
<213>Mouse
<400>42
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Arg Glu Pro Tyr Gly Ser Tyr Val Gly Phe Gly Phe Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
        115                120
<210>43
<211>318
<212>DNA
<213>Mouse
<400>43
gaaaatgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga aaaggtcacc  60
atgacctgca gtgccagttc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca aaagtcaagc  120
acctccccca aactctggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt cccaggtcgc  180
ttcagtggca gtgggtctgg aaactcttac tctctcacga tcagcagcat ggaggctgaa  240
gatgttgcca cttattactg ttttcagggg agtgggtacc cacccacgtt cggagggggg  300
accaagctgg aaataaaa                                                318
<210>44
<211>106
<212>PRT
<213>Mouse
<400>44
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Ser Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Pro Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>45
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Human HMGB1-46-63-scr
<400>45
Arg Met Lys Glu Glu Ser Ser Ala Lys Asp Gly Trp Phe Thr Glu Met
 1               5                  10                  15
Lys Lys
<210>46
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>46
Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys
 1               5                  10                  15
Glu Lys
<210>47
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>47
Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala Lys Ala Asp Lys
 1               5                  10                  15
Ala Arg
<210>48
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>48
Ser Glu Arg Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Ser Lys Phe Glu
 1               5                  10                  15
Asp Met
<210>49
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Human HMGB1-61-78_scr
<400>49
Ala Lys Asp Tyr Met Glu Ala Arg Lys Asp Thr Glu Tyr Lys Met Ala
 1               5                  10                  15
Arg Glu
<210>50
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>50
Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro Pro Lys
 1               5                  10                  15
Gly Glu
<210>51
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Human HMGB1-151-168_scr
<400>51
Lys Glu Tyr Arg Glu Pro Lys Tyr Ala Ile Lys Ala Lys Lys Gly Leu
 1               5                  10                  15
Asp Ala
<210>52
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>52
Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp
 1               5                  10                  15
Ile Ala
<210>53
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>53
Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys
 1               5                  10                  15
Lys Gly
<210>54
<211>209
<212>PRT
<213>智人
<400>54
Met Gly Lys Gly Asp Pro Asn Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr
 1               5                  10                  15
Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro
            20                  25                  30
Asp Ser Ser Val Asn Phe Ala Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg
        35                  40                  45
Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Ser Lys Phe Glu Asp Met Ala
    50                  55                  60
Lys Ser Asp Lys Ala Arg Tyr Asp Arg Glu Met Lys Asn Tyr Val Pro
65                  70                  75                  80
Pro Lys Gly Asp Lys Lys Gly Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys
                85                  90                  95
Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu His Arg Pro Lys
            100                 105                 110
Ile Lys Ser Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Thr Ala Lys Lys
        115                 120                 125
Leu Gly Glu Met Trp Ser Glu Gln Ser Ala Lys Asp Lys Gln Pro Tyr
    130                 135                 140
Glu Gln Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala
145                 150                 155                 160
Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Ser Glu Ala Gly Lys Lys Gly Pro Gly
                165                 170                 175
Arg Pro Thr Gly Ser Lys Lys Lys Asn Glu Pro Glu Asp Glu Glu Glu
            180                 185                 190
Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu
        195                 200                 205
Glu
<210>55
<211>54
<212>PRT
<213>智人
<400>55
Pro Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu
 1               5                  10                  15
Arg Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met
            20                  25                  30
Ala Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Gly Glu Thr
    50
<210>56
<211>53
<212>PRT
<213>智人
<400>56
Asp Ser Ser Val Asn Phe Ala Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg
 1               5                  10                  15
Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys 5er Lys Phe Glu Asp Met Ala
            20                  25                  30
Lys Ser Asp Lys Ala Arg Tyr Asp Arg Glu Met Lys Asn Tyr Val Pro
        35                  40                  45
Pro Lys Gly Asp Lys
    50
<210>57
<211>54
<212>PRT
<213>智人
<400>57
Pro Glu Val Pro Val Asn Phe Ala Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu
 1               5                  10                  15
Arg Trp Lys Thr Val Ser Gly Lys Glu Lys Ser Lys Phe Asp Glu Met
            20                  25                  30
Ala Lys Ala Asp Lys Val Arg Tyr Asp Arg Glu Met Lys Asp Tyr Gly
        35                  40                  45
Pro Ala Lys Gly Gly Lys
    50
<210>58
<211>54
<212>PRT
<213>智人
<400>58
Pro Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu
 1               5                  10                  15
Arg Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met
            20                  25                  30
Ala Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Gly Glu Thr
    50
<210>59
<211>53
<212>PRT
<213>智人
<400>59
Ser Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Asn Lys Cys Ser Glu
 1               5                  10                  15
Arg Trp Lys Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala
            20                  25                  30
Lys Ala Asp Lys Thr His Tyr Glu Arg Gln Met Lys Thr Tyr Ile Pro
        35                  40                  45
Pro Lys Gly Glu Thr
    50
<210>60
<211>54
<212>PRT
<213>智人
<400>60
Pro Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu
 1               5                  10                  15
Arg Trp Lys Ala Met Ser Ala Lys Asp Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met
            20                  25                  30
Ala Lys Val Asp Lys Ala Asp Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Gly Glu Thr
    50
<210>61
<211>54
<212>PRT
<213>智人
<400>61
Pro Asp Ala Ser Val Lys Phe Ser Glu Phe Leu Lys Lys Cys Ser Glu
 1               5                  10                  15
Thr Trp Lys Thr Ile Phe Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met
            20                  25                  30
Ala Lys Ala Asp Lys Ala His Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Gly Glu Lys
    50
<210>62
<211>54
<212>PRT
<213>智人
<400>62
Pro Asp Ala Ser Ile Asn Phe Ser Glu Phe Ser Gln Lys Cys Pro Glu
 1               5                  10                  15
Thr Trp Lys Thr Thr Ile Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met
            20                  25                  30
Ala Lys Ala Asp Lys Ala His Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Gly Glu Thr
    50
<210>63
<211>38
<212>PRT
<213>智人
<400>63
Pro Asp Ala Ser Val Asn Ser Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu
 1               5                  10                  15
Arg Trp Lys Thr Met Pro Thr Lys Gln Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala
            20                  25                  30
Lys Ala Asp Arg Ala His
        35
<210>64
<211>54
<212>PRT
<213>智人
<400>64
Pro Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Leu Val
 1               5                  10                  15
Arg Gly Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Gln Phe Glu Ala Met
            20                  25                  30
Ala Arg Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Gly Glu Thr
    50
<210>65
<211>54
<212>PRT
<213>智人
<400>65
Leu Asp Ala Ser Val Ser Phe Ser Glu Phe Ser Asn Lys Cys Ser Glu
 1               5                  10                  15
Arg Trp Lys Thr Met Ser Val Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met
            20                  25                  30
Ala Lys Ala Asp Lys Ala Cys Tyr Glu Arg Glu Met Lys Ile Tyr Pro
        35                  40                  45
Tyr Leu Lys Gly Arg Gln
    50
<210>66
<211>84
<212>PRT
<213>智人
<400>66
Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr Ala
 1               5                  10                  15
Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro Asp
            20                  25                  30
Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg Trp
        35                  40                  45
Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala Lys
    50                  55                  60
Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro Pro
65                  70                  75                  80
Lys Gly Glu Thr
<210>67
<211>74
<212>PRT
<213>智人
<400>67
Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu
 1               5                  10                  15
Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu
            20                  25                  30
Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr
        35                  40                  45
Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys
    50                  55                  60
Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr
65                  70
<210>68
<211>74
<212>PRT
<213>智人
<400>68
Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu
 1               5                  10                  15
Phe Cys Ser Glu His Arg Pro Lys Ile Lys Ser Glu His Pro Gly Leu
            20                  25                  30
Ser Ile Gly Asp Thr Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Ser Glu Gln
        35                  40                  45
Ser Ala Lys Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Gln Lys Ala Ala Lys Leu Lys
    50                  55                  60
Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr
65                  70
<210>69
<211>74
<212>PRT
<213>智人
<400>69
Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Leu Pro Ser Ala Phe Phe Leu
 1               5                  10                  15
Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu
            20                  25                  30
Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr
        35                  40                  45
Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys
    50                  55                  60
Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr
65                  70
<210>70
<211>74
<212>PRT
<213>智人
<400>70
Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu
 1               5                  10                  15
Phe Cys Ser Glu Tyr His Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu
            20                  25                  30
Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr
        35                  40                  45
Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Gly Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys
    50                  55                  60
Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr
65                  70
<210>71
<211>74
<212>PRT
<213>智人
<400>71
Phe Lys Asp Ser Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Leu Leu
 1               5                  10                  15
Phe Cys Ser Glu Tyr Cys Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu
            20                  25                  30
Pro Ile Ser Asp Val Ala Lys Lys Leu Val Glu Met Trp Asn Asn Thr
        35                  40                  45
Phe Ala Asp Asp Lys Gln Leu Cys Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys
    50                  55                  60
Glu Lys Tyr Lys Lys Asp Thr Ala Thr Tyr
65                  70
<210>72
<211>74
<212>PRT
<213>智人
<400>72
Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu
 1               5                  10                  15
Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu
            20                  25                  30
Ser Ile Gly Asp Val Val Lys Lys Leu Ala Gly Met Trp Asn Asn Thr
        35                  40                  45
Ala Ala Ala Asp Lys Gln Phe Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys
    50                  55                  60
Glu Lys Tyr Lys Lys Asp Ile Ala Ala Tyr
65                  70
<210>73
<211>92
<212>PRT
<213>智人
<400>73
Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu
 1               5                  10                  15
Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu
            20                  25                  30
Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr
        35                  40                  45
Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys
    50                  55                  60
Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Lys Lys Gl y Val Val Lys Ala Glu Lys
                85                   90
<210>74
<211>215
<212>PRT
<213>智人
<400>74
Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr
 1               5                  10                  15
Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro
            20                  25                  30
Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg
        35                  40                  45
Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala
    50                  55                  60
Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro
65                  70                  75                  80
Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys
                85                  90                  95
Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys
            100                 105                 110
Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys
        115                 120                 125
Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr
    130                 135                 140
Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala
145                 150                 155                 160
Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val
                165                 170                 175
Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu
            180                 185                 190
Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Asp Glu
        195                 200                 205
Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu
    210                 215
<210>75
<211>77
<212>PRT
<213>智人
<400>75
Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg
 1               5                  10                  15
Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu
            20                  25                  30
Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu
        35                  40                  45
Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu
    50                  55                  60
Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro Pro Lys Gly Glu Thr
65                  70                  75
<210>76
<211>74
<212>PRT
<213>智人
<400>76
Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu
 1               5                  10                  15
Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu
            20                  25                  30
Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr
        35                  40                  45
Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys
    50                  55                  60
Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr
65                  70

Claims (79)

1.一种特异地结合脊椎动物高迁移率族匣(HMGB)A匣，但并不特异地结合非-A匣HMGB表位的抗体或其抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段抑制经高迁移率族蛋白处理的脊椎动物细胞中促炎症细胞因子的释放。
2.根据权利要求1的抗体或抗原-结合片段，其中所述的脊椎动物高迁移率族匣(HMGB)A匣是一种哺乳动物HMGB A匣。
3.根据权利要求2的抗体或抗原-结合片段，其中所述的哺乳动物高迁移率族匣(HMGB)A box是一种人HMGB A box。
4.根据权利要求2的抗体或抗原-结合片段，这里所述的哺乳动物高迁移率族匣(HMGB)A匣是一种HMGB1 A匣。
5.根据权利要求4的抗体或抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段是从包括Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段和Fv片段的组中选择的抗原-结合片段。
6.根据权利要求4的抗体或抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段是单克隆抗体或其抗原-结合片段。
7.根据权利要求4的抗体或抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段是从6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb和10D4 HMGB1 mAb组中选择的。
8.根据权利要求4的抗体或抗原-结合片段，其中所述的结合高迁移率族匣(HMGB)A匣的抗体或抗原-结合片段能被从6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb和10D4 HMGB1 mAb组中选择的抗体抑制。
9.根据权利要求4的抗体或抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段具有6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb和/或4 HMGB1 mAb的特定表位。
10.根据权利要求4的抗体或抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段具有6H9 HMGB1 mAb的特定表位。
11.由鼠杂交瘤6E6 HMGB1 mAb制备的抗体或抗原-结合片段，保存于ATCC，编码号PTA-5433。
12.由鼠杂交瘤6H9 HMGB1 mAb制备的抗体或抗原-结合片段，保存于ATCC，编码号PTA-5434。
13.由鼠杂交瘤10D4 HMGB1 mAb制备的抗体或抗原-结合片段，保存于ATCC，编码号PTA-5435。
14.鼠杂交瘤6E6 HMGB1 mAb，保存于ATCC，编码号PTA-5433。
15.鼠杂交瘤6H9 HMGB1 mAb，保存于ATCC，编码号PTA-5434。
16.鼠杂交瘤10D4 HMGB1 mAb，保存于ATCC，编码号PTA-5435。
17.根据权利要求4的抗体或抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段是从人抗体，人源抗体，嵌合抗体和任何抗原-结合片段的组中选择的。
18.一种分离的细胞，其产生特异结合脊椎动物高迁移率族匣(HMGB)A匣，但并不特异地结合非-A匣HMGB表位的抗体或其抗原-结合片段。
19.根据权利要求18的分离细胞，其中所述的脊椎动物高迁移率族匣(HMGB)A匣是一种哺乳动物HMGB A匣。
20.根据权利要求19的分离细胞，其中所述的哺乳动物高迁移率族匣(HMGB)A匣是一种人HMGB A匣。
21.根据权利要求19的分离细胞，其中所述的哺乳动物高迁移率族匣(HMGB)A匣是一种哺乳动物HMGB1 A匣。
22.根据权利要求18的分离细胞，其中所述的分离细胞是从包括永生B细胞，杂交瘤和包括一种或更多编码所述抗体或其抗原-结合片段的外源核酸的重组细胞组中选择的。
23.根据权利要求18的分离细胞，其中所述的抗体或抗原-结合片段是单克隆抗体或其抗原-结合片段。
24.根据权利要求18的分离细胞，其中所述的抗体或抗原-结合片段是从6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb和10D4HMGB1 mAb组中选择的。
25.根据权利要求18的分离细胞，其产生抗体或其抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段与高迁移率族匣(HMGB)A匣的结合能被从6E6H MGB1 mAb，6H9 HMGB1mAb和10D4 HMGB1 mAb组中选择的抗体抑制。
26.根据权利要求18的分离细胞，其产生抗体或其抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段有从6E6 HMGB1mAb，6H9 HMGB1 mAb和10D4 HMGB1 mAb组中选择的抗体的特定表位。
27.由鼠杂交瘤2E11 HMGB 1mAb产生的抗体或其抗原-结合片段，保存于ATCC，编码号PTA-5431。
28.一种抗体或其抗原-结合片段，其中所述的结合高迁移率族匣(HMGB)蛋白的抗体或抗原-结合片段能被2E11 HMGB1mAb抑印制。
  29.一种抗体或其抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段有2E11 HMGB1 mAb的特定表位。
30.鼠杂交瘤2E11 HMGB1 mAb，保存于ATCC，编码号PTA-5431。
31.一种分离的细胞，其产生2E11 HMGB1 mAb。
32.根据权利要求31的分离细胞，其中所述的分离细胞是从包括永生B细胞，杂交瘤和包括一种或更多编码所述抗体或其抗原-结合片段的外源核酸的重组细胞组中选择的。
33.一种分离的细胞，其产生抗体或其抗原-结合片段，其中所述的结合高迁移率族匣(HMGB)蛋白的抗体或抗原-结合片段能被2E11 HMGB1 mAb抑制。
34.根据权利要求33的分离细胞，其中所述的分离细胞是从包括一种永生B细胞，一种杂交瘤和包括一种或更多编码所述抗体或其抗原-结合片段的外源核酸的重组细胞组中选择的。
35.一种分离细胞，其产生抗体或其抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段有2E11 HMGNB1 mAb的特定表位。
36.根据权利要求35的分离细胞，其中所述的分离细胞是从包括一种永生B细胞，一种杂交瘤和包括一种或更多编码所述抗体或其抗原-结合片段的外源核酸的重组细胞组中选择的。
37.由鼠杂交瘤2G7 HMGB1 mAb产生的抗体或其抗原-结合片段，保存于ATCC，编码号PTA-5432。
38.一种抗体或其抗原-结合片段，这里所述的结合高迁移率族匣(HMGB)蛋白的抗体或抗原-结合片段能被抑制。
39.一种抗体或其抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段有2G7 HMGB1 mAb的特定表位。
40.鼠杂交瘤2G7 HMGB1 mAb，保存于ATCC，编码号PTA-5432。
41.一种分离细胞，其产生2G7 HMGB1 mAb。
42.根据权利要求41的分离细胞，其中所述的分离细胞是从包括一种永生B细胞，一种杂交瘤和包括一种或更多编码所述抗体或其抗原-结合片段的外源核酸的重组细胞组中选择的。
43.一种分离细胞，其产生抗体或其抗原-结合片段，其中所述的结合高迁移率族匣(HMGB)蛋白的抗体或抗原-结合片段能被2G7 HMGB1 mAb抑制。
44.根据权利要求43的分离细胞，其中所述的分离细胞是从包括一种永生B细胞，一种杂交瘤和包括一种或更多编码所述抗体或其抗原-结合片段的外源核酸的重组细胞组中选择的。
45.一种分离细胞，其产生抗体或其抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段有2G7 HMGB1 mAb的特定表位。
46.根据权利要求45的分离细胞，其中所述的分离细胞是从包括一种永生B细胞，一种杂交瘤和包括一种或更多编码所述抗体或其抗原-结合片段的外源核酸的重组细胞组中选择的。
47.一种抗体或抗原-结合片段，其结合SEQ ID NO：1的151-168氨基酸残基。
48.根据权利要求47的抗体或抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段是一种单克隆抗体或其抗原-结合片段。
49.一种抗体或抗原-结合片段，其结合SEQ ID NO：1的156-161氨基酸残基。
50.一种抗体或抗原-结合片段，其结合的多肽从下列组中选择：
SEQ ID NO：1的155-161氨基酸残基；
SEQ ID NO：1的155-162氨基酸残基；
SEQ ID NO：1的156-162氨基酸残基；
SEQ ID NO：1的156-163氨基酸残基。
51.一种抗体或抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段结合SEQ ID NO：1的151-168氨基酸残基能被2E11HMGB1 mAb抑制。
52.一种抗体或抗原-结合片段，其结合SEQ ID NO：1的61-78氨基酸残基。
53.根据权利要求52的抗体或抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段是单克隆抗体或抗原-结合片段。
54.一种抗体或抗原-结合片段，其结合SEQ ID NO：1的67-78氨基酸残基。
55.一种抗体或抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段与SEQ ID NO：1的61-78氨基酸残基的结合能被从6E6HMGB1 mAb和6H9 HMGB1 mAb组中选择的抗体抑制。
56.一种抗体或抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段与SEQ ID NO：1的67-78氨基酸残基结合能被6E6HMGB1 mAb抑制。
57.一种抗体或抗原-结合片段，其结合SEQ ID NO：1的46-63氨基酸残基。
58.根据权利要求57的抗体或抗原-结合片段，其中所述的抗体不结合SEQ ID NO：54的46-63氨基酸残基。
59.根据权利要求57的抗体或抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段是单克隆抗体或抗原-结合片段。
60.一种抗体或抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段与SEQ ID NO：1的46-63氨基酸残基的结合能被2G7HMGB1 mAb抑制。
61.一种抗体或抗原-结合片段，其中所述的抗体或片段包括从6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，10D4 HMGB1 mAb和2G7 HMGB1 mAb组中选择的抗体的轻链CDRs(CDR1，CDR2，CDR3)和重链CDRs(CDR1，CDR2，CDR3)。
62.根据权利要求61的抗体或抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段进一步包括一种人框架区。
63.根据权利要求1的抗体或抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段是从包括Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段和Fv片段组中选择的抗原-结合片段。
64.一种组合物，其包括权利要求1的抗体或抗原-结合片段和制药学上可接受的赋形剂。
65.一种组合物，其包括抗体或其抗原-结合片段和制药学上可接受的赋形剂，其中所述的抗体或其抗原-结合片段是从6E6HMGB 1mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb和任何抗原-结合片段的组中选择的。
66.根据权利要求1的抗体或抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段是从人抗体，人源抗体，嵌合抗体和任何抗原-结合片段的组中选择的。
67.一种抗体或其抗原-结合片段，其中所述的抗体或其抗原-结合片段是从下列组中选择的：
a)6E6 HMGB1 mAb；
b)6H9 HMGB1 mAb；
c)2G7 HMGB1 mAb；
d)10D4 HMGB1 mAb；
e)2E11 HMGB1 mAb；
f)有6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb的表位特异性的抗体；
g)能与6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb竞争与脊椎动物高迁移率族匣(HMGB)多肽结合的抗体；
h)一种a)，b)，c)，d)，e)，f)，或g)的抗原-结合片段。
68.根据权利要求67的抗体或抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段是从包括人抗体，人源抗体，嵌合抗体和任何抗原-结合片段的组中选择的。
69.一种检测和/或鉴定结合脊椎动物高迁移率族匣(HMGB)多肽试剂的方法，该方法包括，结合：
i)能结合HMGB的抗体或抗原-结合片段；
ii)测试试剂；和
iii)包括脊椎动物HMGB多肽的组合物；
和检测或测定在所述的抗体或抗原-结合片段和所述的HMGB多肽之间的组合物构成，其中相对于合适对照的所述组合物构成的减少，表示所述的试剂结合所述的HMGB多肽，其中所述的抗体或抗原-结合片段是从下列组中选择的：
a)6E6 HMGB1 mAb；
b)6H9 HMGB1 mAb；
c)2G7 HMGB1 mAb；
d)10D4 HMGB1 mAb；
e)2E11 HMGB1 mAb；
f)有6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb的表位特异性的抗体；
g)能与6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb竞争同脊椎动物高迁移率族匣(HMGB)多肽相结合的抗体；
h)一种a)，b)，c)，d)，e)，f)或g)的抗原-结合片段。
70.一种治疗病人情况的方法，该情况以炎症因子的级联活性为特征，包括给予病人抗体或抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段是从下列组中选择的：
a)6E6 HMGB1 mAb；
b)6H9 HMGB1 mAb；
c)2G7 HMGB1 mAb；
d)10D4 HMGB1 mAb；
e)2E11 HMGB1 mAb；
f)有6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，10D4H MGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb的表位特异性的抗体；
g)能与6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb竞争同脊椎动物高迁移率族匣(HMGB)多肽相结合的抗体；
h)一种a)，b)，c)，d)，e)，f)或g)的抗原-结合片段。
71.根据权利要求70的方法，这里所述的情况是从包括脓血症，同种异体移植物抑制，关节炎，哮喘，狼疮，成人呼吸窘迫综合征，银屑癣，胰腺炎，腹膜炎，烧伤，缺血，Behcet’s疾病，移植物抗宿主病，炎症性肠疾病，多重硬化症和恶疾的组中选择的。
72.一种治疗病人脓血症的方法，包括给予病人抗体或抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段是从下列组中选择的：
a)6E6 HMGB1 mAb；
b)6H9 HMGB1 mAb；
c)2G7 HMGB1 mAb；
d)10D4 HMGB1 mAb；
e)2E11 HMGB1 mAb；
f)有6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb的表位特异生的抗体；
g)能与6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb竞争结合脊椎动物高迁移率族匣(HMGB)多肽的抗体；
h)一种a)，b)，c)，d)，e)，f)或g)的抗原-结合片段。
73.一种治疗病人关节炎的方法，包括给予病人抗体或抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段是从下列组中选择的：
a)6E6 HMGB1 mAb；
b)6H9 HMGB1 mAb；
c)2G7 HMGB1 mAb；
d)10D4 HMGB1 mAb；
e)2E11 HMGB1 mAb；
f)有6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb的表位特异性的抗体；
g)能与6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb竞争结合脊椎动物高迁移率族匣(HMGB)多肽的抗体；
h)一种a)，b)，c)，d)，e)，f)或g)的抗原-结合片段。
74.一种治疗病人狼疮的方法，包括给予病人抗体或抗原-结合片段，其中所述的抗体或抗原-结合片段是从下列组中选择的：
a)6E6 HMGB1 mAb；
b)6H9 HMGB1 mAb；
c)2G7 HMGB1 mAb；
d)10D4 HMGB1 mAb；
e)2E11 HMGB1 mAb；
f)有6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb的表位特异性的抗体；
g)能与6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb竞争结合脊椎动物高迁移率族匣(HMGB)多肽的抗体；
h)一种a)，b)，c)，d)，e)，f)或g)的抗原-结合片段。
75.一种检测样本中脊髓动物高迁移率族匣(HMGB)多肽的方法，包括：
a)将样本与权利要求62的抗体或抗原-结合片段接触，在合适的条件下，使所述的抗体或抗原-结合片段与所述样本中的所述的HMGB多肽结合；
b)检测抗体-HMGB组合物或抗原-结合片段-HMGB复合物，其中检测到所述的抗体-HMGB复合物或抗原-结合片段-HMGB复合物即表示所述样本中存在HMGB多肽。
76.根据权利要求75的方法，其中所述的抗体或其抗原-结合片段是从包括6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb和任何上述抗原-结合片段的组中选择的。
77.根据权利要求75的方法，其中所述的抗体或抗原-结合片段包括可检测的标签。
78.根据权利要求75的方法，其中所述的抗体-HMGB复合物或抗原-结合片段-HMGB复合物的检测是通过免疫测定进行的。
79.根据权利要求78的方法，其中所述的免疫测定是ELISA。
80.一种试剂盒，用于检测样本中脊髓动物高迁移率族匣(HMGB)多肽或其蛋白是否存在，包括：
a)权利要求62的抗体或抗原-结合片段；
b)一种或更多种适合检测在所述的抗体或抗原-结合片段与所述HMGB多肽或其蛋白质之间的复合物是否存在的辅助试剂。
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