CN1849069A - 用于端粒酶抑制的改性寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了包括共价共轭脂质部分的寡核苷酸部分的化合物。寡核苷酸部分包括与人端粒酶的RNA成分互补的序列。该化合物高效抑制细胞中的端粒酶活性并具有优良的细胞吸收特性。

Description

用于端粒酶抑制的改性寡核苷酸
技术领域
本发明涉及用于端粒酶抑制的化合物。更具体地，本发明提供了靶向端粒酶RNA成分的并具有提高的细胞吸收特性的改性寡核苷酸。
背景
用于治疗应用的寡核苷酸的发展
在核酸的医药用途方面存在很大兴趣。例如，在潜在的治疗应用方面，反义、核糖酶、核糖适体(aptamer)和RNA干扰(RNAI)技术全部得到了发展。核酸尤其是寡核苷酸用于体内传送的设计需要考虑各种因素包括结合强度、目标特异性、血清稳定性、对核酸酶的抗性和细胞吸收。为了生产具有适于体内使用特征的寡核苷酸，已经提出了多种方法，如改性的主链化学(modified backbone chemistry)、传送载体中的配方以及与各种其它部分的共轭。具有适于全身传送特征的疗用寡核苷酸特别有益。
具有改性化学主链的寡核苷酸评述于Micklefield，Backbonemodification of nucleic acids：synthesis，structure and therapeuticapplications，Curr.Med.Chem.，8(10)：1157-79，2001和Lyer等，Modifiedoligonucleotides--synthesis，properties and applications，Curr.Opin.Mol.Ther.，1(3)：344-358，1999。
改性的主链化学的实例包括：
-肽核酸(PNA)(参见Nielsen，Methods Mol.Biol.，208：3-26，2002)，
-封闭的核酸(LNA)(参见Petersen & Wengel，TrendsBiotechnol.，21(2)：74-81，2003)，
-硫代磷酸酯(参见Eckstein，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.，10(2)：117-21，2000)，
-甲基膦酸酯(参见Thiviyanathan等，Biochemistry，41(3)：827-38，2002)
-氨基磷酸酯(参见Gryaznov，Biochem.Biophys.Acta，1489(1)：131-0，1999；Pruzan等，Nucleic Acids Res.，30(2)：559-68，2002)，和
-硫代氨基磷酸酯(参见Gryaznov等，Nucleosides NucleotidesNucleic Acids，20(4-7)：401-10，2001；Herbert等，Oncogene，21(4)：638-42，2002)。
已经报道了这些类型寡核苷酸中每种的优点和缺点。例如，肽核酸(PNA)呈现良好的核酸酶抗性和结合强度，但是在测试培养物中细胞吸收有所降低；硫代磷酸酯展示了良好的核酸酶抗性和可溶性，但是通常作为P-手性混合物合成并显示出几种序列非特异性的生物效应；甲基膦酸酯显示了良好的核酸酶抗性和细胞吸收，但是通常也作为P-手性混合物合成并具有降低的双链体稳定性。N3′→P5′氨基磷酸酯核苷酸间键合显示了良好的结合特性、核酸酶抗性和可溶性(Gryaznov和Letsinger，Nucleic Acids Research，20：3403-3409，1992；Chen等，Nucleic Acids Research，23：2661-2668，1995；Gryaznov等，Proc.Natl.Acad.Sci.，92：5798-5802，1995；Skorski等，Proc.Natl.Acad.Sci.，94：3966-3971，1997)。然而，相对于天然氨基磷酸酯对应物，它们还显示出升高的酸不稳定性(Gryaznov等，Nucleic Acids Research，24：1508-1514，1996)。寡核苷酸的酸稳定性对于理想使用寡核苷酸试剂来作为口服治疗剂是一个重要性质。将硫原子加入N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸主链提供了升高的酸稳定性。
和许多其它疗用化合物一样，寡核苷酸的多阴离子性质会降低化合物穿过脂质膜的能力，限制细胞吸收的效率。已经提出各种解决方法来提高治疗剂的细胞吸收，包括配制于脂质体中(对于评述，参见Pedroso de Lima等，Curr Med Chem，10(14)：1221-1231，2003和Miller，Curr Med Chem.，10(14)：1195-211，2003)以及与亲脂部分共轭。后一方法的实例包括：U.S.专利No.5,411,947(Method of converting a drug to anorally available form by covalently bonding a lipid to the drug)；U.S.专利No.6,448,392(Lipid derivatives of antiviral nucleosides：liposomalincorporation and method of use)；U.S.专利No.5,420,330(Lipo-phosphoramidites)；U.S.专利No.5,763,208(Oligonucleotides andtheir analogs capable of passive cell membrane permeation)；Gryaznov &Lloyd，Nucleic Acids Research，21：5909-5915，1993(Cholesterol-conjugated oligonucleotides)；U.S.专利No.5,416,203(Steroid modified oligonucleotides)；WO90/10448(Covalent conjugatesof lipid and oligonucleotide)；Gerster等，Analytical Biochemistry，262：177-184(1998)(Quantitative analysis of modified antisenseoligonucleotides in biological fluids using cationic nanoparticles forsolid-phase extraction)；Bennett等，Mol.Pharmacol.，41：1023-1033(1992)(Cationic lipids enhance cellular uptake and activity of phophorothioateantisense oligonucleotides)；Manoharan等，Antisense and Nucleic AcidDrug Dev.，12：103-128(2002)(Oligonucleotide conjugates as potentialantisense drugs with improved uptake，biodistribution，targeted deliveryand mechanism of action)；和Fledler等，Langenbeck’s Arch.Surg.，383：269-275(1998)(Growth inhibition of pancreatic tumor cells bymodified antisense oligodeoxynucleotides)。
作为治疗剂目标的端粒酶
端粒酶是催化端粒重复序列添加至染色体末端的核糖蛋白。参见Blackburn，1992，Ann.Rev.Biochem.，61：113-129。存在大量描述端粒、端粒酶、细胞衰老和癌症之间关联的文献(对于综述，参见，Oncogene，21卷，2002年1月，其是聚焦于端粒酶杂志的完整文献)。因此端粒酶已经鉴定为癌症治疗剂的极佳目标(target)(参见Lichsteiner等，Annals New York Acad.Sci.，886：1-11，1999)。
编码人端粒酶的蛋白质和RNA部分的基因已经得到了克隆和测序(各自参见U.S.专利No.6,261,836和5,583,016)并在研究端粒酶抑制剂中花费了许多努力。迄今为止鉴定的端粒酶抑制剂包括小分子化合物和寡核苷酸。各种出版物描述了靶向编码端粒酶蛋白质部分的mRNA(其的人形式称为人端粒酶逆转录酶和hTERT)或端粒酶全酶的RNA部分(其的人形式称为人端粒酶RNA或hTR)，来使用寡核苷酸抑制端粒酶。通常认为靶向hTERT mRNA的寡核苷酸作为常规反义药物，因为它们与mRNA结合，导致mRNA的降解，并因此防止了hTRET蛋白质的产生(参见，例如，U.S.专利No.6,444,650)。设计靶向hTR的特定寡核苷酸来结合存在于端粒酶全酶中的hTR分子，并因此破坏酶的功能(参见，例如，U.S.专利No.6,548,298)。描述设计来降低或消除端粒酶活性的各种寡核苷酸的出版物实例包括：
U.S.专利No.6,444,650(Antisense composition for detecting andinhibiting telomerase reverse transcriptase)；
U.S.专利No.6,331,399(Antisense inhibition of tert expression)；
U.S.专利No.6,548,298(Mammalian telomerase)；
Van Janta-Lipinski等，Nucleosides Nucleotides，18(6-7)：1719-20，1999(Protein and RNA of human telomerase as targets for modifiedoligonucleotides)；
Gryaznov等，Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids，20：401-410，2001(Telomerase inhibitors-oligonucleotide phosphoramidates as potentialtherapeutic agents)；
Herbert等，Oncogene，21(4)：638-42，2002(Oligonucleotide N3′→P5′phosphoramidates as efficient telomerase inhibitors)；
Pruzan等，Nucleic Acids Research，30(2)：559-568，2002(Allostericinhibitors of telomerase：oligonucleotide N3′-P5′phosphoramidates)；
PCT申请WO011/18015(Oligonucleotide N3′-P5′thiophosphoramidates：their synthesis and use)；和
Asai等，Cancer Research，63：3931-3939，2003(A novel telomerasetemplate antagonist(GRN 163)as a potential anticancer agent)。
发明概述
本发明的组合物和方法涉及端粒酶抑制化合物，包括寡核苷酸和至少一个共价共轭的脂质基团。与未改性的寡核苷酸相比较，本发明的化合物具有优良的细胞吸收特性。这意味着与未改性的形式相比较，使用较小量的共轭寡核苷酸就能获得相等的生物效应。当应用于人的治疗情况时，这可以转换成降低的毒性风险和成本节约。本发明的化合物抑制细胞(包括癌细胞)中的端粒酶，其所得到的效果抑制了细胞的增殖。因此，本发明化合物的主要应用是作为癌症治疗剂，和本发明提供了可以如此使用的化合物的药物制剂。
本发明的化合物可以通过以下通式进行表示：
                    O-(x-L)n
其中O表示寡核苷酸，x是任意的连接物(linker)基团，L表示脂质部分和n是1-5的整数。通常，n＝1或2，但当n＞1时，每个脂质部分L是可独立选择的。脂质部分通常在3′和5′端之一(或如果n＝2，每个)共价连接寡核苷酸，但也可以连接于其它的位点，包括一个或多个碱基。
脂质基团L通常是脂族烃或脂肪酸，包括烃和脂肪酸的衍生物，实例是具有14-20个碳的饱和直链化合物，如肉豆蔻酸(C14，也称为十四酸)、棕榈酸(C16，也称为十六酸)和硬脂酸(C18，也称为十八酸)及其相应的脂族烃形式，十四烷、十六烷和十八烷，以及衍生物如胺和酰胺衍生物。可以使用的其它合适脂质基团的实例是固醇，如胆固醇，和取代的脂肪酸和烃，尤其是这些基团的多-氟化形式。寡核苷酸成分O可以是核糖核酸或脱氧核糖核酸或其改性形式，和连接核酸碱基的键合可以由任何合适的化学物质形成，包括但不限于：磷酸二酯；磷酸三酯；甲基磷酸酯；P3′→N5′氨基磷酸酯；N3′→P5′氨基磷酸酯；N3′→P5′硫代氨基磷酸酯；和硫代磷酸酯连接物。优选N3′→P5′氨基磷酸酯和N3′→P5′硫代氨基磷酸酯。寡核苷酸部分O的序列包括至少一个与端粒酶RNA部分序列的选定“靶向”片段互补(优选精确互补(exactly complementary))的序列片段。在特定实施方案中，寡核苷酸O部分的序列含有与人端粒酶RNA部分，hTR(提供于SEQ IDNO：1中的序列)的以下片段之一中的序列互补的序列片段：46-56，137-196，290-319和350-380。O部分中与hTR片段精确互补的序列长度优选至少为5个碱基，更优选至少8个碱基，甚至更优选至少10个碱基。可以将不与hTR精确互补，却可以提供额外有利功能的额外序列片段加入O部分。
本发明的实例化合物包括以下结构中所示的那些，其中O部分具有N3′→P5′硫代氨基磷酸酯核苷酸间键合且与hTR(SEQ ID NO：1)的碱基42-54精确互补。在第一个实例结构中，L，脂质部分是棕榈酰胺(源自棕榈酸)，通过氨基甘油连接物与寡核苷酸O的5′硫代磷酸酯基团共轭：
Figure A20048002597500101
在第二个实例结构中，L通过寡核苷酸的3′氨基与棕榈酰胺共轭：
与相应的未改性寡核苷酸相比较，本发明的化合物(包括这些实例化合物)显示出具有优良的细胞吸收特性，因此是细胞端粒酶活性的更有效抑制剂。作为这些特性的结果，本发明的化合物是癌细胞增殖的高效抑制剂。
本发明的化合物还可以用于抑制端粒酶酶活性的方法。这样的方法包括使端粒酶与本发明的化合物接触。本发明的化合物还可以用于抑制可表达端粒酶的细胞中的端粒酶，从而抑制这样细胞的增殖。这样的方法包括使具有端粒酶活性的细胞与本发明的化合物接触。如此处理的细胞(可以是体外的细胞或体内的细胞)，通常会使端粒缩短并停止增殖。因为癌细胞需要端粒酶活性来用于长期增殖，因此本发明的化合物对于抑制癌细胞的生长尤其有用，且可以用于治疗应用中来治疗癌症。
因此本发明包括将在此所述的化合物用于医学中，尤其是用于治疗癌症中。
本发明还提供了药物组合物，包括与药物学上可接受的赋形剂一起配制的根据本发明的寡核苷酸轭合物。
附图说明
图1显示了本发明化合物中各种脂质L基团与寡核苷酸连接的实施例。
图2显示了本发明化合物实例合成方法的示意图。图2A、2B和2C显示了用于生产其中脂质部分共轭寡核苷酸3′端的化合物的合成方法。图2C中所示的图解是从脂质醛开始的还原性胺化；这在脂质基团和寡核苷酸之间产生了胺键(以下的参见示意图B)，与图2A中所示的相反，其中起始原料是脂肪酸的羧酸、酸酐或酰基氯形式，导致氨键的形成(参见以下的示意图A)。图2B显示了适于生产3′-硫代氨基磷酸酯键的图解。该实施例中，显示了氨基甘油连接物序列(O-CH2CH2CH2-NHC(O))-，但是将认识到可以使用该合成而不需要这样的连接物，或使用可替换的连接物序列。图2D显示了可以用于产生其中脂质部分通过磷酸酯基团(或硫代磷酸酯基团，当X＝S时)共轭寡核苷酸5′端化合物的合成方法。这些示意图中，寡核苷酸的3＇显示为氨基，与优选的硫代氨基磷酸酯(X＝S)和氨基磷酸酯(X＝O)化学物质的寡核苷酸键一致。图2E显示了脂质基团改性的被护碱基的实例(该情况中，通过共轭十四烷基来改性鸟苷)，其可以用于标准寡核苷酸合成方法中来制备其中一个或多个脂质基团共价连接一个或多个核酸碱基的寡核苷酸。图2中，使用以下缩写：
i＝Cl-C(O)-R″/(i-Pr)2NEt，或HO-C(O)-R″/C.A，或[C(O)-R″]2O/(i-Pr)2NEt
ii＝DMTO-CH2CHO(CEO-P[N(i-Pr)2]-CH2-NHC(O)-R″/Tetr
iii＝寡核苷酸链延伸
iv＝R″-HC＝O+[H]
R＝5′-CPG-支持的P，N-被护的寡核苷酸
R′＝去保护的NP-或NPS-寡核苷酸
R″＝脂质部分，L(如果需要，其可以与连接物共轭，参见R共轭氨基甘油连接物的实例)
R＝-O-CH2(CHOH)CH2-NHC(O)-R″
X＝O、S；Y＝H，或C(O)-R″，Z＝O或NH
图3和4是曲线图，显示了本发明的化合物各自抑制U251和DU145细胞中端粒酶活性的能力(对于全部描述参见实施例3)。在这些和以下的图中，A、B和C是描述于实施例3中并显示于图9中的化合物。
图5是凝胶图像，显示了在人肿瘤异种移植模型小鼠中解剖的人肿瘤细胞上进行的，随后使用或未使用本发明化合物处理后的TRAP测试结果(对于全部描述参见实施例4)。
图6是图表，显示了异种移植后，使用或未使用本发明化合物处理的具有人骨髓瘤小鼠中骨髓瘤蛋白质的血浆含量，(对于全部描述参见实施例5)。
图7和8是图表，显示了使用或未使用本发明的化合物对具有人骨髓瘤异种移植小鼠中的肿瘤体积、端粒酶活性和端粒长度的影响(对于全部描述参见实施例6)。
图9描绘了实施例3-7中所用化合物A、B和C的结构，其中寡核苷酸部分含有硫代氨基磷酸酯连接物。
序列表
附随序列表的SEQ ID NO：1提供了人端粒酶RNA部分(hTR)的序列(还参见Feng等，Sciences 269(5228)：1236-1241，1995，和基因库登录号No.U86046)。通过参照与SEQ ID NO：1中序列位置是互补的这些公开文件来涉及各种其序列与SEQ ID NO：1中所含片段互补的寡核苷酸。
发明详述
A.定义
“烷基”指的是具有1至20个碳的烷基和取代烷基，如甲基、乙基、丙基等等。低级烷基通常指的是C1至C5。典型地，中级烷基指的是C6至C10。“酰基”指的是具有结构RCO的基团，其中R是烷基。低级酰基是其中R是低级烷基的酰基。
“烷基胺”指的是带有连接的氮的烷基，例如，1-甲基1-丁胺(CH3CHNH2CH2CH2CH3)。
“芳基”指的是具有5-20个碳原子的芳族环基团，如苯基、萘基、蒽基或取代的芳基，如烷基-或芳基-取代如甲苯基、乙苯基、二苯基，等。还包括环中具有一个或多个氮、氧或硫原子的杂环芳族环基团。
“寡核苷酸”指的是具有约2至约200个相连亚基的核糖和/或脱氧核糖核苷亚基聚合物。核苷亚基可以通过各种亚基间键合来连接，包括但不限于，磷酸二酯、磷酸三酯、甲基磷酸酯、P3′→N5′氨基磷酸酯、N3′→P5′氨基磷酸酯、N3′→P5′硫代氨基磷酸酯和硫代磷酸酯键合(linkage)。此外，“寡核苷酸”包括本领域技术人员已知的糖(例如，2′取代)、碱基(参见以下“核苷”的定义)以及3′和5′端的改性。在其中寡核苷酸部分包括多个亚基间键合的实施方案中，可以使用相同的化学物质来形成每个键合或可以使用键合化学物质的混合物。如在此所用的术语“多核苷酸”，具有和“寡核苷酸”相同的意思，并与“寡核苷酸”交替使用。
不管什么时候通过字母的序列来表示寡核苷酸，如“ATGUCCTG”，将理解为核苷酸是从左到右5′→3′的次序。如此寡核苷酸碱基序列的表示并不是暗示在寡核苷酸中使用任何特定类型的核苷酸间亚基。
如此处所用的“核苷”包括天然核苷，包括2′-脱氧和2′-羟基形式，例如如Komberg和Baker，DNA Replication，第2版(Freeman，SanFrancisco，1992)中所述的，和类似物。关于核苷的“类似物”包括具有改性核酸碱基部分(参见以下“核酸碱基”的定义)和/或改性糖部分的合成核苷，例如，由Scheit概述的，Nucleotide Analogs(JohnWiley，New York，1980)。这样的类似物包括设计来提高结合特性(如稳定性、特异性等)的合成核苷，如Uhlmann和Peyman所述的(ChemicalReviews，90：543-584，1990)。
在此广泛使用的术语“脂质”包括溶于有机溶剂，但在水中溶解不足，甚至根本不溶的物质。术语脂质包括但不限于烃、油、脂肪(如脂肪酸、甘油)、固醇、类固醇以及这些化合物的衍生形式。优选的脂质是脂肪酸及其衍生物，烃及其衍生物，和固醇如胆固醇。如在此所用的，术语脂质还包括含有脂质和亲水部分的两性化合物。
脂肪酸通常在直链中含有偶数碳原子(通常为12-24个碳)并可以是饱和的或不饱和的，以及可以含有或可以通过改性来含有各种取代基。为了简单，术语“脂肪酸”还包括脂肪酸衍生物，如通过图2A所示的合成示意图产生的脂肪酰胺(参见例如，图1A-1E中所示的化合物)。
如在此所用的术语“烃”包括仅有氢和碳，通过共价键连接而构成的化合物。术语包括开链(脂族)烃，包括直链和支链烃，和饱和的以及单-和多-不饱和烃。术语还包括含有一个或多个芳环的烃。
术语“取代的”指的是已经通过一个原子交换另一个原子而改性的化合物。尤其是，所用的术语涉及卤代烃和脂肪酸，尤其是其中氟取代了一个或多个氢原子的那些。
如在此所用的“核酸碱基”包括(i)典型的DNA和RNA核酸碱基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶)，(ii)改性的核酸碱基或核酸碱基类似物(例如，5-甲基-胞嘧啶、5-溴尿嘧啶或次黄嘌呤)和(iii)核酸碱基类似物。核酸碱基类似物是分子结构模拟典型DNA或RNA碱基的化学物质。
如在此所用的，“嘧啶”意思是天然核苷中产生的嘧啶，包括胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶及其类似物，如含有氧、甲基、丙基、甲氧基、羟基、氨基、硫、卤素和取代基的那些。如在此所用的术语进一步包括具有连接的保护基团的嘧啶，如N4-苯甲酰胞嘧啶。更多的嘧啶保护基团由Beaucage和Iyer所公开(Tetrahedron 48：223-2311，1992)。
如在此所用的，“嘌呤”意思是天然核苷中产生的嘌呤，包括腺嘌呤和鸟嘌呤和次黄嘌呤及其类似物，如含有氧、甲基、丙基、甲氧基、羟基、氨基、硫、卤素和取代基的那些。如在此所用的术语进一步包括具有连接的保护基团的嘌呤，如N2-苯甲酰鸟嘌呤、N2-异丁酰鸟嘌呤、N6-苯甲酰腺嘌呤，等等。更多的嘌呤保护基团由Beaucage和Iyer所描述(以上所引用的)。
如在此所用的，术语“被护的”作为化学物质名称的部分指的是本领域已知的用于化合物特定部分的保护基团，例如，关于核苷“5′-被护-羟基”包括三苯基甲基(即，三苯甲基)，对茴香基二苯甲基(即，单甲氧基三苯甲基或MMT)，二-对茴香基苯甲基(即，二甲氧基三苯甲基或DMT)，等等。本领域已知的保护基团包括描述于以下参考文献中的那些：Gait，编辑，Oligonucleotide Synthesis：A Pratical Approach(IRL Press，Oxford，1984)；Amarnath和Broom，Chemical Reviews，77：183-217，1977；Pon等，Biotechniques，6：768-775，1988；Ohtsuka等，Nucleic Acids Research，10：6553-6570，1982；Eckstein，编辑，Oligonucleotides and Analogues：A Pratical Approach(IRL Press，Oxford，1991)；Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第二版，(John Wiley & Sons，New York，1991)；Narang，编辑，Synthesis andApplications of DNA and RNA(Academic Press，New York，1987)；Beaucage和Iyer(以上所引用的)，等等参考文献。
术语“卤素”或“卤”以其常规意思来使用，指的是氯、溴、氟或碘取代基。在此所描述和所要求的化合物中，卤素取代基通常是氟、溴或氯，优选氟或氯。
B.本发明化合物的设计
本发明的化合物可以通过通式来表示：
                        O-(x-L)n，
其中O表示寡核苷酸，x是任意的连接物基团，L表示脂质部分和n是1-5的整数。
因此化合物的设计需要两个部分O和L的选择，和这些实体之间结构键合的确定，该键合可以包括任意连接物基团x。
O的选择
寡核苷酸成分O可以认为是化合物的“效应物”部分，因为该部分通过结合端粒酶的RNA部分来影响端粒酶的抑制。因此，选择O的序列使其包括与SEQ ID NO：1中所示的端粒酶RNA序列互补的片段。与端粒酶RNA部分互补的片段在理论上可以靶向端粒酶RNA的任何部分，但端粒酶RNA的特定片段是用于抑制寡核苷酸的优选目标。一个优选的目标片段是跨越SEQ ID NO：1的核苷酸30-67的片段，其包括“模板片段”，跨越SEQ ID NO：1的核苷酸46-56的序列5′-CUAACCCUAAC-3′的11个核苷酸片段。模板片段用来限定端粒酶加入染色体末端的端粒重复序列且对于端粒酶活性是必要的(参见Chen等，Cell 100：503-514，2000；Kim等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA98(14)：7982-7987，2001)。因此特别优选含有包括与模板片段全部或部分互补的序列的寡核苷酸部分的本发明化合物。另一优选目标片段是跨越hTR的核苷酸137-179的片段(参见Pruzan等，Nucl.AcidsResearch，30：559-568，2002)。该片段中，跨越141-153的序列是优选目标。PCT公开WO98/28442描述了使用至少7个核苷酸长的寡核苷酸来抑制端粒酶，其中将寡核苷酸设计成与hTR序列的模板片段外的易接近部分互补，包括hTR的核苷酸137-196，290-319，和350-380。
优选靶向hTR序列的O的片段与相应的hTR序列精确互补。虽然在特定情况中错配是允许的，但期望它们会降低所得到寡核苷酸轭合物的特异性和活性。在特定实施方案中，因此选择寡核苷酸O的碱基序列来包括至少5个与端粒酶RNA精确互补的核苷酸的序列，并且如果使用增加长度的互补序列，如至少8个，至少10个，至少12个，至少13个或至少15个与端粒酶RNA精确互补的核苷酸，那么可以获得增强的端粒酶抑制。在其它实施方案中，寡核苷酸的序列包括至少5至20个，至少8至20个，至少10至20个或至少10至15个与端粒酶RNA序列精确互补的核苷酸的序列。当选择寡核苷酸O的全长与端粒酶RNA互补时，可以获得最佳的端粒酶抑制活性。然而，全长寡核苷酸部分与目标序列的精确互补不是必需的，寡核苷酸序列可以包括与目标序列不互补的片段。例如，可以加入这样的片段来给予化合物其它特性，如有助于纯化的序列。如果寡核苷酸成分O包括与目标序列不互补的片段，通常将这样的片段放置于5′或3′端的一端或两端。在其中精确互补的片段靶向模板片段的情况中，可以用与连接在5′端的端粒酶样(富含G)序列精确互补的短(5-8个核苷酸)片段获得有效的端粒酶抑制。
与人端粒酶RNA互补且可以包括其作为寡核苷酸部分O的一部分或其可以用作整个寡核苷酸部分O的实例序列包括以下：
 寡核苷酸序列   HTR互补序列(SEQ ID NO：1的片段)
 GCTCTAGAATGAACGGTGGAAGGCAGG   137-166
 GTGGAAGGCGGCAGG   137-151
 GGAAGGCGGCAGG   137-149
 GTGGAAGGCGGCA   139-151
 GTGGAAGGCGG   141-151
 CGGTGGAAGGCGG   141-153
 ACGGTGGAAGGCG   142-154
 AACGGTGGAAGGCGGC   143-155
 ATGAACGGTGGAAGGCGG   144-158
 ACATTTTTTGTTTGCTCTAG   160-179
 TAGGGTTAGACAA   42-54
 GTTAGGGTTAG   46-56
  GTTAGGGTTAGAC   44-56
  GTTAGGGTTAGACAA   42-56
  GGGTTAGAC   44-52
  CAGTTAGGG   50-58
  CCCTTCTCAGTT   54-65
  CGCCCTTCTCAG   56-67
用于O部分合成中的核苷酸间键合类型的选择可以由任何可获得的寡核苷酸化学物质构成，包括但不限于，磷酸二酯、磷酸三酯、甲基磷酸酯、P3′→N5′氨基磷酸酯、N3′→P5′氨基磷酸酯、N3′→P5′硫代氨基磷酸酯和硫代磷酸酯键合。
在优选的实施方案中，寡核苷酸部分O具有至少一个N3′→P5′氨基磷酸酯或N3′→P5′硫代磷酸酯键合，该键合可以通过以下结构来表示：
3′-[-NH-P(＝O)(-XR)-O-]5′，其中X是O或S，且R选自氢、烷基或芳基；或其药物学上可接受的盐。
通常，但不是必需的，寡核苷酸O内的所有核苷酸间键合是相同类型的，尽管可以使用不同键合的混合物来合成寡核苷酸部分。其中脂质部分共轭至寡核苷酸的3′端，通过寡核苷酸上的3′氨基极大地有助于轭合物的合成。因此，即使没有选择优选的化学物质之一，3′氨基的加入也是有利的。
L的选择
与没有和脂质部分共轭的寡核苷酸相比，本发明的化合物在细胞中产生端粒酶抑制更有效。可以相信脂质部分L用来提高化合物的细胞吸收，尤其是有助于穿过细胞膜。虽然还没有完全阐明该发生的机理，一个可能性是脂质部分可以帮助化合物以单个分子或聚合体(胶束的)形式与细胞膜结合，随后内在化。然而，使用本发明不需要对准确机理的理解。
脂质部分可以是与未改性寡核苷酸相比较提供升高的细胞吸收的任何脂质或脂质衍生物。优选的脂质是烃、脂肪(例如，甘油、脂肪酸和脂肪酸衍生物，如脂肪酰胺)和固醇。其中脂质部分是烃时，L部分可以是取代或未取代的环烃或脂族直链或支链烃，其可以是饱和的或不饱和的。优选实例是全部饱和或多饱和的直链未分支的烃。烃链的长度为C2-C30，但使用C8-C22的碳链可以获得最佳的端粒酶抑制效果。饱和烃(烷烃)的优选实例如下：
学名                碳链
十四烷              C14H30
十五烷              C15H32
十六烷              C16H34
十七烷              C17H36
十八烷              C18H38
十九烷              C19H40
二十烷              C20H42
还可以选择单-和多-不饱和形式的烃(烯烃和多烯，如二烯烃和三烯烃)，优选具有一个至三个双键的化合物，尽管可以使用具有多个双键的化合物。也可以使用炔(含有一个或多个三键)和alkenyne(三键和双键)。可以使用的常见单-和多-不饱和烃的实例包括图1M、1L和1O中所示的那些。
本发明的化合物中可以使用取代形式的烃，优选使用在体内和体外为惰性的取代基。特别优选的取代基是氟。多氟代烃的实例通式结构包括：
CF3(CF2)n-(CH2)m-，其中m至少是1，优选至少是2，且n＝1-30，如氟代十三烷：CF3(CF2)9(CH2)3；和
CH3(CH2)a(CF2)b(CH2)c-，其中a、b和c独立地为1-30。
图1W显示了共轭寡核苷酸5′端的多氟代烃的实例。
其它合适的脂质部分包括简单的脂肪酸和脂肪酸衍生物，甘油和更复杂的脂质如固醇，例如胆固醇。脂肪酸及其衍生物可以是全部饱和的或单-和多-不饱和的。碳链的长度为C2-C30，但是用C8-C22的碳链可以获得最佳的端粒酶抑制效果。饱和脂肪酸的优选实例如下：
学名                 俗名                碳链
十四烷酸             肉豆蔻酸            14∶0
十六烷酸             棕榈酸              16∶0
十八烷酸                   硬脂酸            18∶0
二十烷酸                   花生酸            20∶0
还可以使用单-和多-不饱和形式的脂肪酸，优选具有一个至三个双键的化合物，尽管还可以使用具有多个双键的化合物。可以使用的常见单-和多-不饱和脂肪酸的实例包括：
学名                       俗名              碳链
顺-9-十六酸                棕榈油酸          16∶1(n-7)
顺-9-十八酸                岩芹酸            18∶1(n-12)
顺-9-十八酸                油酸              18∶1(n-9)
9，12-十八碳二烯酸         亚油酸            18∶2(n-6)
6，9，12-十八碳三烯酸      γ-亚油酸         18∶3(n-6)
9，12，15-十八碳三烯酸     α-亚油酸         18∶3(n-3)
5，8，11，14-二十碳四烯酸  花生四烯酸        20∶4(n-6)
本发明的化合物中也可以使用碳链中具有一个或多个三键的脂肪酸，以及支链脂肪酸。本发明的化合物中可以使用取代形式的脂肪酸。和烃基团一样，优选体内和体外为惰性的取代基，特别优选氟。适用于本发明的脂肪酸多氟代衍生物的实例通式结构是：
CF3(CF2)n-(CH2)mCO-，其中m至少是1，优选至少是2，且n＝1-30，和
CH3(CH2)a(CF2)b(CH2)cCO-，其中a、b和c独立地为1-30。
本发明具有脂肪酸多氟代衍生物的实例化合物显示于图1U和1V中。
通常一至五个L部分(n＝1-5)与O部分共价连接，任意地通过连接物。更常见使用1或2个L部分。其中多于一个L部分与O部分连接时，每个L部分是可独立选择的。
将认识到描述为具有如L部分的特定烃的本发明化合物和描述为具有特定脂肪酸(与特定烃具有相同数目的碳原子)的本发明化合物是最相关的，区别仅在于连接L部分与寡核苷酸的键的性质，其依次是用来生产化合物的合成方法的结果。例如，和以下更详细描述的，当合成具有共轭寡核苷酸3′-氨基端的L部分的化合物(具有氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯核苷酸间键合)时，使用脂肪酸的醛形式(脂肪醛)作为起始原料，来在脂质链和寡核苷酸之间形成胺键，使得脂质基团看起来像烃。相反，使用相同脂肪酸的羧酸、酸酐或酰基氯形式的衍生物，导致形成酰胺键，使得脂质基团看起来象脂肪酸衍生物，尤其在脂肪酰胺这样的情况中(如以上定义部分所述的，为了简单的缘由，术语“脂肪酸”当描述在此广泛使用的共轭的L基团时包括脂肪酸衍生物，包括脂肪酰胺)。这在以下的示意图(和图2A和2C中)中说明了，其描绘了连接C14脂质部分的氨基磷酸酯寡核苷酸的3′-氨基端。示意图A中，L是十四酸(肉豆蔻酸)，其中L和O基团之间的连接是酰胺。示意图B中，L是十四烷烃，L和O基团之间的连接是胺。
Figure A20048002597500201
                    示意图A
Figure A20048002597500202
                    示意图B
O和L成分的连接
O和L部分之间的键合可以是直接键合，或可以通过任意的连接物部分，x。连接物基团可以用来帮助化合物的化学合成(在以下的合成部分中讨论)。不管连接物基团是否用于介导O和L部分的共轭，寡核苷酸部分O上都会存在多个L部分可以方便共轭的位点。合适的连接位点包括5′和3′端，一个或多个糖环，核苷间主链和寡核苷酸的核酸碱基。通常，L部分连接寡核苷酸的3′或5′端。
如果L部分连接3′端，可以直接连接3′取代基，在氨基磷酸酯和硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的优选情况中是3′氨基(实例显示于图1A-C中)，在其它情况中，如常见的磷酸二酯寡核苷酸是3-羟基。或者，L部分可以通过3′连接的磷酸酯基团来连接(实例显示于图1Z中，其中十四烷烃通过O-烷基连接物连接硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的3’磷酸酯。如果L部分连接5′端，通常通过5′连接的磷酸酯基团来连接(参见图1F，其显示了使用氨基甘油连接物，和图1G，其显示了使用二氨基甘油连接物)。可以通过任何合适的原子连接O部分上的碱基，例如鸟苷的N2氨基(参见图1Q-R)。当n＞1时使得多个脂质部分连接O部分，独立选择的L部分可以连接于任何合适的位点上。例如，一个L基团可以连接每一端，各种L基团可以连接碱基，或两个或多个L基团可以连接于一端(参见图1E、1J、1K)。
可以使用任意的连接物部分x来连接化合物的O和L部分。如果使用连接物，如以上图2图例中所述的将其引入合成方法中。合适连接物基团的实例包括氨基甘油和O-烷基甘油型连接物，其各自可以通过通式结构来图示：
Figure A20048002597500211
其中R′＝H、OH、NH2或SH；Y＝O、S或NR；R＝H或烷基，且n和m独立地为1-18的整数。
合适连接物的特定实例是氨基甘油连接物，其中R′＝OH，Y＝O，且n和m各自为1：
Figure A20048002597500212
二氨基甘油连接物，其中R′＝OH，Y＝NH，且n和m各自为1：
Figure A20048002597500221
和O-烷基甘油连接物，其中R＝H。
Figure A20048002597500222
C.本发明化合物的实例
本发明化合物的实例显示于图1中。为了简单，只显示了寡核苷酸的一个碱基，用图示的通式碱基，B，和R表示寡核苷酸剩余部分的连接点。连接3′端的化合物用3′氮来说明，与优选的硫代氨基磷酸酯和氨基磷酸酯寡核苷酸化学物质一致。图1A-1L说明了具有连接5′或3′端的饱和脂质基团的化合物。图1M-1P说明了具有单-或多-不饱和脂质基团的化合物。图1Q-1R说明了具有通过碱基(该情况中，是鸟苷)共轭寡核苷酸的脂质基团的化合物。图1S和1CC各自说明了3′-和5′-共轭的胆固醇脂质部分。图1U和1V说明了5′-共轭的多氟代脂肪酸衍生物，和图1W说明了5′共轭的多氟代烃。图1X-Z说明了含有氧的脂质部分。在此所用的每个脂质基团的名称说明如下：
图1A：3′-肉豆蔻酰胺
图1B：3′-棕榈胺
图1C：3′-硬脂酰胺
图1D：3′-棕榈酰胺-丙基-硫代磷酸酯
图1E：3′-赖氨酰-二-硬脂酰胺
图1F：5′-棕榈酰胺-氨基甘油-硫代磷酸酯
图1G：5′-棕榈酰胺-二-氨基甘油-硫代磷酸酯
图1H：5′-硬脂酰胺-氨基甘油-硫代磷酸酯
图1I：3′-十二烷基
图1J：3′-二-十二烷基
图1K：3′-二-癸基
图1L：3′-二十烷基酰胺
图1M：3′-油基酰胺
图1N：3′-亚麻酸酰胺
图1O：3′-亚油酸酰胺
图1P：3′-三苯甲基
图1Q：N2-十四烷基鸟苷
图1R：N2-十八烷基鸟苷
图1S：3′-胆固醇酰胺-氨基丙三醇-硫代磷酸酯
图1T：5′-(12-OH)-硬脂酰-硫代磷酸酯
图1U：5′-C11-聚四氟乙烯-硫代磷酸酯
图1V：5′-C13-聚四氟乙烯-硫代磷酸酯
图1W：5′-OH-C10-聚四氟乙烯-硫代磷酸酯
图1X：5′-OH-棕榈酰-硫代磷酸酯
图1Y：5′-十八烷基-硫代磷酸酯
图1Z：3′-十八烷基-硫代磷酸酯
图1AA：3′-棕榈酰胺-氨基甘油-硫代磷酸酯
图1BB：3′-thioctylamide
图1CC：5′-胆固醇酰胺-氨基甘油-硫代磷酸酯
图1DD：5′-(2-OH)-十六醇-硫代磷酸酯
D.本发明化合物的合成
可以使用用于所选化学物质类型的标准实验方案来合成本发明化合物的寡核苷酸部分。具有优选N3′→P5′氨基磷酸酯和N3′→P5′硫代氨基磷酸酯化学物质的寡核苷酸的合成方法各自描述于McCurdy等，(1997)Tetrahedron Letters，38：207-210和Pongracz & Gryaznov，(1999)Tetrahedron Letters，49：7661-7664。
根据所选键合物的性质，包括描述于Mishra等，(1995)Biochemicaet Biophysica Acta，1264：229-237，Shea等，(1990)Nucleic Acids Res.18：3777-3783，和Rump等，(1998)Bioconj.Chem.9：341-349的方法，可以使用各种合成方法来共轭脂质部分和寡核苷酸。其中脂质部分共轭于寡核苷酸5′或3′端的本发明化合物的合成，可以通过在合适的末端使用合适的官能团来实现，最常见为氨基，其可以与羧酸、酸酐和醛以及活性酯反应。硫醇基团也适于作为官能团(参见Kupihar等，(2001)Bioorganic and Medicinal Chemistry 9：1241-1247)。可购得用于寡核苷酸合成的不同链长的氨基-和硫醇-改性剂。具有N3′→P5′氨基磷酸酯和N3′→P5′硫代氨基磷酸酯键合的寡核苷酸含有3′-氨基(而不是最常见寡核苷酸化学物质中发现的3′-羟基)，因此这些寡核苷酸提供了用于共轭脂质基团和寡核苷酸3′-端的独特优势。
可以使用各种方法，用优选的N3′→P5′氨基磷酸酯和N3′→P5′硫代氨基磷酸酯化学物质来连接脂质基团和寡核苷酸的末端。产生本发明轭合化合物的合成示意图的实例显示于图2中。为了连接3′端，通过使全部被护的固体载体束缚的寡核苷酸的游离3′-氨基与相应的酸酐反应，接着用氨去保护并纯化来合成轭合化合物。或者，使用偶合剂(如碳化二亚胺)偶合脂质的羧酸和载体束缚(support bound)的寡核苷酸的3′-氨基，HBTU或2-氯-1-甲基吡啶碘可以用于共轭脂质基团。这两种方法将在脂质和寡核苷酸之间形成酰胺键。还可以使用链延伸过程中连接寡核苷酸的脂质的氨基磷酸酯衍生物将脂质连接寡核苷酸链。该方法产生了连接脂质和寡核苷酸的氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯键合(通过丙基-棕榈酰基和2-羟基-丙基-棕榈酰基化合物来示例)。再一方法包括全部被护的载体束缚的寡核苷酸的游离3′-氨基和合适的脂质醛反应，接着用氰基硼酸钠还原，其产生胺键。
为了连接5′端，使用改性的、含有脂质的固体载体来合成寡核苷酸，接着以5′-至3′的方向合成寡核苷酸，如Pongracz & Gryaznov(1999)中所述的。改性载体的实例提供于以下的示意图C中。在其中n＝14的情况中，脂肪酸是棕榈酸：3′-氨基-1，2-丙二醇和棕榈酰氯反应，接着二甲氧基三苯甲基化和琥珀酰基化提供了用于偶合固体载体的中间产物。R是长链烷基胺控制的多孔玻璃。
                    示意图c
Figure A20048002597500251
E.端粒酶抑制测试
本发明的轭合物可以用于抑制或降低端粒酶的酶活性和/或具有端粒酶活性的细胞增殖。这些内容中，酶活性或细胞增殖的抑制或降低指的是比其中酶或细胞没有用轭合物处理的对照实验所测量的活性水平低。特定实施方案中，所测量活性的抑制或降低至少为10％的降低或抑制。本领域技术人员将认识到对于特定应用优选测量活性的降低或抑制为至少20％、50％、75％、90％或100％。可以在无细胞测试(称为生化测试)和细胞中测定本发明化合物抑制端粒酶活性的能力。
测量端粒酶活性的方法，以及使用这样的方法来测定化合物的端粒酶抑制活性是公知的。例如，TRAP测试是用于测量细胞提取物系统中端粒酶活性的标准测试方法并已经广泛用于端粒酶抑制化合物的研究中(Kim等，Science 266：2011，1997；Weinrich等，Nature Genetics17：498，1997)。TRAP测试测量了引入延伸产物(多核苷酸)中的放射性核苷酸含量，该延伸产物是通过将核苷酸添加至端粒酶底物或引物而形成的。可以通过检测屏(例如，Phosphorimager屏)上，曝光于分离放射性产物的凝胶的条带强度来测量引入的放射性。TRAP测试还详细地描述于U.S.专利No.5,629,154，5,837,453和5,863,726中，其在测试端粒酶抑制化合物活性中的用途描述于各种出版物中，包括WO01/18015。此外，对于测量端粒酶活性的研究目的，以下所试剂盒是可购得的：TRAPezeXK端粒酶检测试剂盒(Cat.s7707；Intergen Co.，Purchase NY)；和Telo TAGGG端粒酶PCR ELISA阳性(Cat.2，013，89；Roche Diagnostics，Indianapolis IN)。
测量生化测试中化合物抑制端粒酶能力的优选实验方案是直接的(非基于PCR的)无细胞端粒酶测试，称为“Flashplate测试”，描述于Asai等，Cancer Research，63：3931-3939(2003)中。
可以用表达端粒酶的细胞在限定的时间段培养化合物，然后测定细胞提取物中的端粒酶活性来测定本发明化合物在细胞中抑制端粒酶的能力。基于细胞测试的优选实验方案是描述于Asai等(2003)中的细胞基端粒酶测试。适于这样测试的表达端粒酶的肿瘤细胞系包括HME50-5E人乳房上皮细胞(由Dr.Jerry Shay提供，University of TexasSouthwestern Medical Center)、卵巢肿瘤细胞系OVCAR-5(MIISB，Millan)和SK-OV-3(美国典型培养物保藏中心，ATCC)、人肾癌Caki-1细胞(日本生物来源研究中心，JCRB)、人肺癌1549细胞(ATCC)、人表皮样癌A431细胞(JCRB)和人前列腺癌DU145细胞(ATCC)。
F.细胞增殖测试
本发明化合物的关键治疗应用是抑制表达端粒酶的细胞尤其是肿瘤细胞的生长。抑制细胞中端粒酶活性的本发明化合物将和其他已知的抑制端粒酶的化合物一样，诱导端粒酶阳性细胞的骤退，从而导致细胞生长停止并死亡。然而，重要地，在没有表达端粒酶的正常人细胞中，如成纤维来源的BJ细胞，没有由本发明化合物处理而诱导的骤退或其它毒性。可以使用体外肿瘤细胞系或在体内的异种移植动物模型中测试化合物特异性抑制肿瘤细胞生长的能力。
用于这样生长曲线测试的优选实验方案是描述于Asai等(2003)中的短期细胞生活力测试。选择用于治疗应用的本发明化合物中，优选化合物在低于约10μM的浓度下在没有表达端粒酶的正常细胞中没有产生显著的细胞毒性效应。
可以使用建立的人肿瘤异种移植模型来证实本发明化合物体内抑制肿瘤细胞生长的能力，其中将测试化合物直接给药于肿瘤部位或全身给药，接着通过物理测量肿瘤的生长。期望用本发明化合物治疗的动物在开始给药时会平均增长一段时间，但随着继续治疗，肿瘤块开始缩小。相反，未治疗的对照小鼠如预料地，肿瘤块会继续增长。合适的体内肿瘤移植测试的优选实例描述于Asai等(2003)中。其它实例描述于Scorski等，Proc.Natl.Sci.USA，94：3966-3971(1997)和Damm等，EMBO J.，20：6958-6968(2001)中。
G.本发明化合物的配制
本发明提供了可以特定地并有效地抑制端粒酶活性的化合物，因此其可以用于抑制端粒酶阳性细胞如肿瘤细胞的增殖。很多种类癌细胞已经显示为端粒酶阳性，包括皮肤癌、结缔组织、脂肪、乳房、肺、胃、胰腺、卵巢、子宫颈、子宫、肾、膀胱、结肠、前列腺、中枢神经系统(CNS)、视网膜和血液肿瘤(如骨髓瘤、白血病和淋巴瘤)的细胞。
因此，在此提供的化合物可以广泛用于治疗多种恶性肿瘤中。更重要地，本发明的化合物有效将区分恶性和正常细胞的治疗提升了一个高度，避免了依靠不区分地杀灭分裂细胞试剂的最常用化疗方案存在的许多有害副作用。此外，本发明的化合物比等量的未轭合寡核苷酸更有效，这意味着可以以较低量给药，提供提高的安全性和明显降低的治疗成本。因此本发明的一个方面是治疗患者癌症的方法，包括将治疗有效量的本发明化合物给药于患者。包括本发明的化合物的端粒酶抑制剂可以结合其它癌症治疗方法(包括原发肿瘤的手术切除、化疗剂和放射治疗)来进行使用。
为了治疗应用，将本发明的化合物以治疗有效量和药物学上可接受的载体配制。任何给定的制剂中可以包括一种或多种(例如，具有不同的L或O部分)本发明的化合物。药物学上可接受的载体可以是固体或液体的。液体载体可以用于溶液、乳浊液、悬浮液和加压组合物的制备中。将化合物溶解或悬浮于药物学上可接受的液体赋形剂中。用于寡核苷酸制剂非肠道给药的液体载体的合适实例包括水(其可以含有添加剂，例如，纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠溶液)、磷酸盐缓冲的盐溶液(PBS)、醇(包括单氢醇和多氢醇，例如甘油)及其衍生物，和油(例如，分馏的可可脂和花生油)。液体载体可以含有其它合适的药物学添加剂，包括但不限于以下：增溶剂、悬浮剂、乳化剂、缓冲剂、增稠剂、色素、粘度调节剂、防腐剂、稳定剂和渗透压调节剂。
为了化合物的非肠道给药，载体还可以是油脂如乙基油酸酯和异丙基肉豆蔻酯。无菌载体可以用于非肠道给药的无菌液体形式组合物中。
可以通过例如腹膜内注射、皮下注射，静脉内或局部地来使用无菌液体药物组合物、溶液或悬浮液。还可以通过血管内或通过血管斯滕特固定模给药寡核苷酸。
用于加压组合物的液体载体可以是卤代烃或其它药物学上可接受的推进剂。这样的加压组合物还可以是脂质密封的来用于通过吸入的传送。为了通过鼻内或支气管内吸入或吹入给药，可以将寡核苷酸配制于水溶液或部分水溶液中，然后可以用于气物剂形式中。
可以通过与含有活性化合物的药物学上可接受的载体进行配制，以溶液、霜剂或洗剂来局部给药化合物。
本发明的药物组合物可以以任何可接受的剂型口服给药，包括但不限于，胶囊制剂、片剂、粉末或颗粒，和作为水或非水介质中的悬浮液或溶液。包括本发明寡核苷酸的药物组合物和/或制剂可以包括载体、润滑剂、稀释剂、增稠剂、调味剂、乳化剂、分散助剂或结合剂。在口服使用片剂的情况中，通常使用的载体包括乳糖和淀粉糖浆。通常还加入润滑剂，如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服，有用的稀释剂包括乳糖和干淀粉糖浆。当口服使用需要含水悬浮液时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂结合。如果需要，还可以加入特定的甜味剂、调味剂或色素。
虽然本发明的化合物对于细胞和组织渗透具有优良的特征，但将它们配制于例如脂质体载体中会提供更大的益处。使用脂质体来帮助细胞吸收描述于例如U.S.专利No.4,897,355和U.S.专利No.4,394,448中。多种出版物描述了脂质体的制剂和制备。还可以通过混合其他的渗透促进剂来配制化合物，如上述未轭合形式的脂质部分，包括脂肪酸及其衍生物。实例包括油酸、月桂酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、recinleate、甘油一油酸酯(又名1-单油酰基-rac-丙三醇)、甘油二月桂酸酯、辛酸、arichidonic acid、甘油1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-单、酰基肉毒碱、酰基胆碱、单-和二-甘油酯及其药物学上可接受的盐(即，油酸盐、月桂酸盐、癸酸盐、肉豆蔻酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、亚油酸盐等)。
可以使用含有一种或多种渗透促进剂的复合制剂。例如，可以结合脂肪酸使用胆汁盐来制得复合制剂。示例性混合物包括与癸酸钠或月桂酸钠(通常以约0.5至2％的浓度使用)结合的鹅脱氧胆酸(CDCA)(通常以约0.5至5％的浓度使用)。
含有本发明寡核苷酸的药物组合物和/或制剂还可以包括螯合剂、表面活性剂和非表面活性剂。螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(例如，水杨酸钠，5-甲氧基水杨酸盐和homovanilate)、胶原的N-酰基衍生物、月桂-9和β-双酮的N-氨基酰基衍生物(烯胺)。表面活性剂包括，例如，月桂酸磺基酸钠、多氧乙烯-9-月桂酰酯和多氧乙烯-20-十八烷基酯；和多氟代化学乳化剂，如FC-43。非表面活性剂包括，例如，不饱和环脲、1-烷基-和1-烯基氮杂环-烷酮衍生物，和非固醇消炎剂如二氯苯胺苯乙酸钠、消炎痛和苯丁唑酮。
因此，本发明的另一方面提供了配制药物组合物的方法，该方法包括提供在此所述的化合物，并将化合物与药物学上可接受的赋形剂结合。优选以下述药物学纯度提供化合物。该方法进一步包括在加入赋形剂之前或之后，将渗透促进剂加入化合物中。
典型地，药物组合物遵守药物纯度标准。对于用作药物制剂中的活性成分，通常纯化本发明的化合物，使其与存在于制备它们的混合物中的其它反应性的或潜在的免疫原性成分中分离。典型地，为了获得其中核酸碱基化合物是活性成分的药物学纯度，以通过功能测试、色谱或凝胶电泳测定的至少约50％的均一性，更优选60％、70％、80％或90％的均一性来提供活性成分。然后将根据通常使用的制备药物制剂的方法将活性成分混入药物中。因此，本发明提供在药物学纯度方面化合物需要提供至少约50％均一性，更优选至少80％或90％的均一性的化合物。
典型地，还将药物组合物等分并以单剂量或多剂量单位进行包装。寡核苷酸化合物治疗需要的剂量随所用的特定组合物、给药途径、现有症状的严重程度、化合物的形式和待治疗的特定患者而改变。
可以以有效获得临床理想结果的制剂和含量将本发明的药物组合物给药于患者。对于癌症的治疗，理想的结果包括肿瘤块的缩小(通过触诊或图像测定的：例如通过放射线照相、放射核苷酸扫描、CAT扫描或MTI)、肿瘤生长率的降低、转移瘤形成的降低(如通过活体解剖样本的组织化学分析测定的)生化标记的降低(包括一般标记如ESR，和肿瘤特异性标记如血清PSA)和生命质量的改善(如通过临床测试测定的，例如，Karnofsky分值)、进展的延长时间、无疾病生存和全部存活。
得到这些效果所需的每剂中化合物的含量和剂量将根据许多因素而改变，包括疾病迹象、待治疗患者的特征和给药方式。典型地，给药的剂型和途径提供了疾病部位1μM至1nM化合物的局部浓度。
通常，以给予有效结果而没有导致任何有害或不利副作用的浓度给药化合物。可以通过给药单个单位剂量或通过整天以合适间隔给药分成方便的亚单位剂量来得到这样浓度。
实施例
以下实施例说明了本发明化合物的合成和活性，其中使用优选的硫代氨基磷酸酯或氨基磷酸酯化学物质合成寡核苷酸部分O。特定实施例中，脂质部分共轭3′或5′端，或两端，使用或未用连接物。这些化合物的通式结构可以表示为：
Figure A20048002597500301
其中R1和R2独立地为H或脂质部分(L)，Y是O(氨基磷酸酯寡核苷酸)或S(硫代氨基磷酸酯寡核苷酸)，n是整数，通常为4至49，和B表示碱基(对每个核苷亚基为可独立选择的)。该结构中没有描绘任意的连接物。
实施例1化合物的合成
A.一般方法
在ABI 394合成仪上使用amidite转移反应以1μmol的规模合成寡核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯(NP)和硫代氨基磷酸酯(NPS)，各自根据McCurdy等(1997)Tetrahedron Letters，38：207-210和Pongracz &Gryaznov，(1999)Tetrahedron Letters，49：7661-7664所述的方法。全部被护的单体结构阻断(blocks)是3′-氨基三苯甲基-核苷酸-5′-(2-氰基乙基-N，N-二异丙基氨基)核苷氨基磷酸酯，尤其是3′-脱氧-胸苷，2′，3′-二脱氧-N2-异丁酰-鸟苷，2′，3′-二脱氧-N6-苯甲酰-腺苷，和2′3′-二脱氧-N4-苯甲酰-胞苷，从Transgenomic，Inc.购买的(Omaha，Nebraska)。3′-氨基三苯甲基-5′-琥珀酰-核苷与含有氨基的长链控制多孔玻璃(LCAA-CPG)偶合并用作固体载体。以5′到3′的方向进行合成。使用标准1μM(ABI Perkin Elmer)方法用碘/H2O氧化步骤合成具有NP主链的寡核苷酸，而使用硫实验方案制备具有NPS主链的寡核苷酸，其中乙腈∶2，6-二甲基吡啶为1∶1混合物的0.1M苯乙酰二硫化物(PADS)溶液用作硫化剂。用于制备两种类型主链的偶合时间为25秒。THF∶异丁酸酐∶2，6-二甲基吡啶的18∶1∶1混合物用作封端剂。使用三种方法来结合脂质部分和寡核苷酸：方法(i)在合成仪上使用氨基磷酸酯试剂将脂质部分引入3′端进行偶合；方法(ii)使用改性的固体载体(示例于上述的示意图C中)，在产生5′轭合物的延伸合成开始之前将脂质基团共轭于其上；和方法(iii)游离3′-氨基的反应，并且随后在固体载体上去保护。以下提供了这些方法的更多详细内容。对于连接于3′端或核酸碱基的脂质基团，用浓缩的氨，或对于连接于5′端的脂质基团，用1∶1的乙醇∶浓缩氨的混合物，将寡核苷酸去保护，在55℃进行6-8小时。在Pharmacia NAP-25凝胶过滤柱上将粗制产物脱盐或用乙醇从1M氯化钠中沉淀粗制产物，然后真空冻干。
随后使用Beckman Ultrasphere C18(5μ)250×10mm柱通过反相HPLC将寡核苷酸产物纯化。用线性梯度的50mM三乙胺醋酸盐中的乙腈以2ml/分钟的流速洗脱产物并用纯净的冷乙醇将其从1M氯化钠中沉淀出来，转化成钠盐。通过使用上述溶剂系统的分析RP HPLC和通过来测定PAGE化合物的纯度。记录VARIAN Unity Plus 400MHz设备上的1H和31P质谱并使用WATERS Micromass ZMD质谱仪获得电喷雾离子质谱(EMI MS)。
B.脂质基团和寡核苷酸的共轭
如上所述，可以使用各种方法来共轭脂质部分和寡核苷酸。特定方法的详细内容如下：
方法(i)在该方法中，在寡核苷酸合成过程中作为3′核苷加入含有共轭的脂质基团的氨基磷酸酯试剂，致使脂质基团与寡核苷酸的3′端共轭。该方法举例说明了含有两个脂肪酸的氨基磷酸酯的合成和随后的偶合。
(i/a)3-棕榈酰氨基-丙烷-1-O-(2-氰基乙基-N，N-二异丙基氨基磷酸酯)的合成和偶合。
向溶解于1∶4的乙腈-二氯甲烷混合物中的1.0g(13.3mmol)3-氨基-丙醇中，加入10ml的二异丙基乙胺和4.06ml(13.3mmol)的棕榈酰氯。搅拌反应过夜后，加入更多的二氯甲烷，然后依次用饱和的碳酸氢钠、盐水和水洗涤混合物。通过硫酸钠干燥有机相并蒸发至干。将获得的500mg(1.6mmol)白色固体通过与干乙腈共蒸发来进行共沸，并溶解于50ml二氯甲烷中。在加入1.1ml二异丙基乙胺(4eq.)后，逐滴加入390μl(1.7mmol)的2-氰乙基二异丙基氯代氨基磷酸酯。将反应混合物搅拌1小时来得到澄清的溶液。依次用饱和的碳酸氢钠和盐水洗涤反应混合物，通过硫酸钠干燥并蒸发至干。通过硅胶色谱使用45∶45∶10v/v的乙酸乙酯∶二氯甲烷∶三乙胺溶剂系统来纯化产物。在用于DNA合成仪之前，通过干燥器中的P2O5来干燥0.7g(90％)蜡状固体。31P NMR(CDCl3)148.45ppm，ES MS(MH+)514。为了在DNA合成仪上进行偶合，在无水乙腈-二氯甲烷9∶1的混合物中制备0.1M的溶液。该合成形成用于生产图1D中所示轭合寡核苷酸的反应物。
(i/b)3-棕榈酰氨基-1-羟基-丙烷-2-O-(2-氰基乙基-N，N-二异丙基氨基磷酸酯)的合成和偶合
将1g(10.97mmol)3-氨基-丙二醇悬浮于10ml的吡啶中，逐滴加入3.017g(10.97mmol)棕榈酰氯的2ml DMF溶液并强烈搅拌。搅拌15分钟后，将凝胶过滤并空气干燥。从热乙醇和热2-丙醇中以白色粉末再结晶固体。将白色固体与吡啶共蒸发，然后溶解于30ml干吡啶中。加入2.89g(8.55mmol)DMT-氯化物并将反应混合物搅拌30分钟，反应后进行TLC。用甲醇淬火后，将吡啶蒸发并由二氯甲烷-饱和碳酸氢钠逐步进行反应。使用4∶1的己烷/乙酸乙酯作为洗脱剂，将所得到的油通过硅胶柱色谱纯化。用吡啶共沸所得到的2.4g(3.64mmol)黄色油，溶于100ml二氯甲烷和4eq二异丙基乙胺(2.5ml)中。向搅拌的溶液中逐滴加入920μl(4mmol)2-氰乙基二异丙基氯代氨基硫酸酯。反应后进行TLC并发现2小时后完成并如上逐步进行。使用45∶45∶10的乙酸乙酯∶二氯甲烷∶三乙胺溶剂系统，通过硅胶色谱纯化产物。在用于DNA合成仪上之前在干燥器中干燥获得的固体(0.1M乙腈溶液)。31P NMR(CDCl3)149.9，150.2ppm，ES MS(MNa+)854.57。该合成形成用于生产图1AA中所示轭合寡核苷酸的反应物。
方法(ii)在该方法中，共轭脂质部分的改性固体载体用作寡核苷酸5′至3′合成的起始点，形成5′轭合物。该方法举例说明了两种改性固体载体的合成和使用。
(ii/a)3-棕榈酰氨基-1-二甲氧基三苯甲基氧-2-琥珀酰氧-丙烷的合成
将1g(10.97mmol)3-氨基-1，2-丙二醇悬浮于10ml吡啶中。并逐滴加入3.017g(10.97mmol)棕榈酰氯的2ml DMF溶液并强烈搅拌。搅拌15分钟后，将凝胶过滤并空气干燥。从热乙醇和热2-丙醇中以白色粉末再结晶固体。将白色固体与吡啶共蒸发，然后溶解于30ml干吡啶中。加入3.2g(9.46mmol)DMT-氯化物并将反应混合物搅拌30分钟，反应后进行TCL。用甲醇淬火后，将吡啶蒸发并由二氯甲烷-饱和碳酸氢钠逐步进行反应。将所得到的油通过硅胶柱色谱纯化，使用4∶1的己烷/乙酸乙酯作为洗脱剂。用吡啶共沸所得到的2.5g(3.65mmol)黄色油，然后加入475mg琥珀酸酐和483mg二甲基氨基吡啶并将反应混合物搅拌1小时。通过TLC监控反应，且如果需要加入更多的琥珀酸酐。用冷的柠檬酸钠缓冲液(pH＝4)来洗涤二氯甲烷溶液并通过硫酸钠干燥有机相，然后蒸发至干。获得的终产物为2.0g(24.9％)。
(ii/b)3-硬脂酰氨基-1-二甲氧基三苯甲基氧-2-琥珀酰氧-丙烷的合成
将1g(10.97mmol)3-氨基-丙二醇悬浮于10ml吡啶中，并逐滴加入3.32g(10.97mmol)硬脂酰氯的10ml DMF溶液并强烈搅拌。搅拌15分钟后，将凝胶过滤并空气干燥。从热乙醇和热2-丙醇中以白色粉末再结晶固体。将白色固体与吡啶共蒸发，然后溶解于30ml干吡啶中。加入2.89g(8.55mmol)DMT-氯化物并将反应混合物搅拌30分钟，反应后进行TLC。用甲醇淬火后，将吡啶蒸发并由二氯甲烷-饱和碳酸氢钠逐步进行反应。将所得到的油通过硅胶柱色谱纯化，使用4∶1的己烷/乙酸乙酯作为洗脱剂。将所得到的2.4g(3.64mmol)黄色油溶解于30ml二氯甲烷中，然后加入475mg琥珀酸酐和483mg二甲基氨基吡啶并将反应混合物搅拌1小时。通过TLC监控反应，且如果需要加入更多的琥珀酸酐。用冷的柠檬酸钠缓冲液(pH＝4)来洗涤二氯甲烷溶液并通过硫酸钠干燥有机相，然后蒸发至干。获得的终产物为1.2g(14.4％)。
然后将(ii/a)和(ii/b)中合成的产物共轭长链氨基控制的多孔玻璃(LCAA-CPG)来产生改性的固体载体，如下：
在100ml肽合成容器中，用干二甲基甲酰胺洗涤20g的LCAA-CPG(Transgenomic，Inc.，～200mmol/g-HN2装载)。在分开的烧瓶中，将上述(ii/a)和(ii/b)中所述的5.55mmol产品溶解于40ml氯仿、3ml二异丙基乙胺中，并加入2.13g(8.3mmol)2-氯-1-甲基吡啶碘。将该悬浮液倒过肽合成容器(具有活塞开口)中的干CPG直至通过CPG吸收约一半的溶液。然后关闭活塞和上端盖子将容器摇晃直至溶液完全覆盖CPG。(如果需要可以加入更多的氯仿，但是体积必需保持最小)。然后将容器放置于摇床上使反应在室温下过夜进行。过滤CPG，然后用二氯甲烷、甲醇和乙腈洗涤。使用18∶1∶1THF-2，6-二甲基吡啶-异丁酸酐和Cap B的1∶1(N-甲基咪唑/THF)溶液在摇床上于室温下1小时将未反应的氨基封端。进一步过滤后，用甲醇、二氯甲烷和乙腈洗涤珠子。通过测量使用甲醇高氯酸去封闭的样品在498nm的二甲氧基三苯甲基阳离子吸收的标准方法确定装载并发现为50-60μmol/g。
一旦产生改性的固体载体，将它们用于上述的寡核苷酸合成中。该方法产生的寡核苷酸轭合物的实例显示于图1F、1G和1H中。
方法(iii)在该方法中，完成寡核苷酸的合成而且其保持全部被护并束缚固体载体，3′端与脂质基团的酸酐(iii/a)、酸酐(iii/b)、酸(iii/c)或醛(iii/d)形式进行反应，如下。
(iii/a)将含有游离3′-氨基的固体载体束缚的全部被护的寡核苷酸(4μmol)真空干燥并悬浮于3ml无水氯仿中。加入140μl(0.8mmol)二异丙基乙胺和0.4mmol合适的酰基氯(例如122μl棕榈酰氯)后，混合物振荡2分钟并快速过滤，然后用氯仿、甲醇和乙腈洗涤。将干珠子悬浮于1-2ml浓缩的氢氧化铵中并在55℃下加热5小时。然后将冷却的氢氧化铵溶液过滤并蒸发。通过HPLC分离脂质轭合产物。使用上述条件将产物洗脱约40分钟。蒸发后，将产物从1M氯化钠和乙醇中沉淀出来来获得钠盐。
(iii/b)向干的固体载体束缚的全部被护的寡核苷酸(1μmol)中，加入0.1mmol合适的酐和170μl溶解于2ml氯仿中的二异丙基乙胺，并将含有混合物的小瓶放置于摇床上过夜。过滤后，如上用氯仿、甲醇和乙腈洗涤珠子，并将共轭的寡核苷酸去封闭并纯化。
(iii/c)在摇床上将1μmol固体载体束缚的全部被护的寡核苷酸和0.1mmol合适酸的溶液、25mg 2-氯-1-甲基吡啶碘(0.1mmol)和2ml氯仿中的170μl二异丙基乙胺反应过夜。如上所述的进行洗涤、去封闭和纯化。
(iii/d)将0.3mmol所需酐的溶液、31.5mg氰基硼酸钠和100μl0.5M醋酸钠的2ml四氢呋喃加入到1μmol固体载体束缚的全部被护的寡核苷酸中并放置于摇床上30分钟。如上所述进行洗涤、去封闭和纯化。
方法(iv)在该方法中，不将脂质基团共轭寡核苷酸的末端，而是共轭链上的核酸碱基，例如鸟苷。使用常规寡核苷酸链延伸实验方案合成这些化合物，如上所述，但是引入用共价轭合脂质基团改性的碱基，如图2E中所示的，其中脂质基团共轭核酸碱基的化合物实例显示于图1Q和R中。
实施例2化合物在生化和细胞基测试中的活性
在生化Flashplate测试和细胞基测试中测试如在此所述的轭合寡核苷酸抑制端粒酶的能力，如上所述和Asai等(2003)中所述的。结果显示于下表中。该表中，使用以下的缩写：
寡核苷酸序列：
1＝TAGGGTTAGACAA，与hTR，SEQ ID NO：1的碱基42-54互补
2＝CAGTTAGGGTTAG，与hTR，SEQ ID NO：1的碱基38-50互补
化学物质：
NP表示具有氨基磷酸酯核苷酸间键合的寡核苷酸
NPS表示具有硫代氨基磷酸酯核苷酸间键合的寡核苷酸
轭合物：
5′表示脂质部分共轭寡核苷酸的5′端
3′表示脂质部分共轭寡核苷酸的3′端
人癌细胞类型(所有都来自ATCC)：
HT-3和A431：宫颈癌
U-251：多形性胶质母细胞瘤
DU145和LNCaP：前列腺癌
Caki：肾透明细胞癌
NCIH522：肺腺癌
Ovcar：卵巢癌
Hep3B：肝细胞癌
  寡核苷酸序列   化学物质   共轭的脂质基团(参照图1)   生化测试中的IC50(nM)  细胞测试中的IC50(μM)(细胞类型)
  1   NPS   无   0.15   1.6(HT-3)
  0.79(A431)6.3(U-251)1.4(DU145)2.99(Caki)6.5(Hep3B)
  1   NPS   3’-肉豆蔻酰胺(1A)   0.8(+/-0.2)   0.35(Caki)0.21(HT-3)
  1   NPS   3’-棕榈酰胺(1B)   2.9(+/-2.2)   0.21(A431)0.37(HT-3)0.19(LNCaP)0.2(NCl-H522)0.65，0.49(U-251)2.84(Hep3B)1.97(Ovcar5)
  1   NPS   3’-硬脂酰胺(1C)   11.9(+/-10.5)   0.13，0.28(HT-3)0.2(NCl-H522)
  1   NPS   3’-棕榈酰胺-丙基-硫代磷酸酯(1D)   0.48(+/-0.3)   0.27(HT-3)
  1   NPS   3’-硫代辛基酰胺(1BB)   1.19(+/-0.7)   N/D
  1   NPS   3′-赖氨酰-二-硬脂酰胺(1E)   2.45(+/-0.7)   2.98(HT-3)
  1   NPS   3′-油酰胺(1M)   5.2(+/-0.8)   1.16(HT-3)
  1   NPS   3′-亚油酸酰胺(1O)   3.9   1.25(HT-3)
  1   NPS   3′-二-癸基(1K)   36.5(+/-8.9)   N/D
  1   NPS   3′-二-十二烷基(1J)   ＞100   N/D
  1   NPS   3′-棕榈酰胺-氨基甘油-硫代磷酸酯(1AA)   0.4(+/-0.14)   0.5(HT-3)
  1   NPS   3′-三苯甲基   0.9(+/-0.01)   ＞10(HT-3)
  1   NPS   5′-棕榈酰胺-氨基甘油-硫代磷酸酯(1F)   5.01(+/-3.37)   0.36，0.22(HT-3)0.15(DU145)0.16(U-251)3.02(Hep3B)0.92(Ovcar5)
  1   NPS   5′-OH-棕榈酰-硫代磷酸酯(1X)   3.6
  1   NPS   5′-硬脂酰胺-氨基甘油-硫代磷酸酯(1H)   5.2(+/-4.1)   N/D
  1   NPS   5′-胆甾醇酰胺-氨基甘油-硫代磷酸酯(1CC)   2.6(+/-0.14)   0.25(HT-3)
  1   NPS   5′-棕榈酰胺-氨基甘油-硫代磷酸酯(1G)   4.65(+/-0.35)   0.55(HT-3)
  1   NPS   5′-C11-聚四氟乙烯-硫代磷酸酯(1U)   4.15(+/-1.91)   0.14(HT-3)
  1   NPS   5′-C13-聚四氟乙烯-硫代磷酸酯(1V)   0.23(HT-3)
  1   NPS   5′-十八烷基-硫代磷酸酯(1Y)   0.59(HT-3)
  1   NPS   5′，3′-二-棕榈酰胺-甘油硫代磷酸酯(图中未显示)   0.3(+/-0.14)   0.34(HT-3)
  1   NPS   3′-棕榈酰胺-氨基甘油-硫代磷酸酯(1AA)   0.4(+/-0.14)   0.52
  1   NP   无   0.8   30
  1   NP   3′-棕榈酰胺(1B)   2.85(+/-1.06)   N/D
  1   NP   3′-十二烷基(1I)   3.2(+/-0.57)   N/D
  1   NP   3′-二十二烷基(1J)   ＞100   N/D
  1   NP   3′-二癸基(1K)   ＞100   N/D
  1   NP   3′-胆固醇酰胺-氨基甘油-硫代磷酸酯(1S)   ＞10   3.6(HT-3)
  1   NP   5′-棕榈酰胺-氨基甘油-硫代磷酸酯(1F)   6.25(+/-2.33)   6.5(HT-3)
  1   NP   5′-硬脂酰胺-氨基甘油-硫代磷酸酯(1H)   2.4(+/-1.13)   3.02(HT-3)
  1   NP   5′-胆固醇酰胺-氨基甘油-硫代磷酸酯(1CC)   ＞10   0.8(HT-3)
  1   NP   3′-赖氨酰-二-硬脂酰胺(1E)   50
实施例3比较效用和生物利用率研究
选择本发明的两种化合物，和非轭合寡核苷酸一起，分别进行详细研究。所选的化合物，图示于图9中，如下：
化合物A(未轭合)：序列TAGGGTTAGACAA的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸(该序列与hTR，SEQ ID NO：1的碱基42-54互补)(图9A)。
化合物B：共轭3′棕榈酰胺的化合物A的寡核苷酸(图9B)
化合物C：共轭5′棕榈酰胺-甘油-硫代磷酸酯的化合物A的寡核苷酸(图9C)
这个和以下的实施例中记载了对这些化合物的研究。
下表显示了当与配对的RNA相结合时，这三种化合物中每种的熔化温度(使用标准方法测定)，使用生化测试所测定的端粒酶抑制的IC50值，使用细胞基(使用HT-3细胞)的测试所测定的端粒酶抑制的IC50，如上所述。
  化合物   双链体Tm(℃)   IC50(nM)生化测试  IC50(μM)细胞基测试
  A   70   0.15  1.6
  B   66.5   1.7  0.16
  C   65.5   0.9  0.11
如表中所示的，未轭合寡核苷酸A对其目标显示出非常高的亲和性，熔化温度为70℃，生化测试中端粒酶抑制的IC50为0.15nM(其中细胞吸收不是问题)。尽管化合物A具有良好的完整细胞吸收，以及在多个不同的肿瘤细胞系中(该实验HT-3细胞中1.6μM)具有端粒酶抑制的低微摩尔IC50，这反映了相对于生化效能，在完整细胞中约有10,000倍的效用丢失。脂质基团加入寡核苷酸的5′或3′端(各自化合物C和B)适度地降低了Tm，其在65.5-66.5℃下仍然保持非常高，并与未轭合化合物A相比较降低了生化效用6至11倍。然而，非常重要的是，与这些化合物的生化效用相比较，脂质缀合化合物B和C在完整细胞中的效用仅降低～100倍。更强细胞吸收的结果是，与未轭合寡核苷酸(化合物A)相比较，化合物B和C证明了HT-3细胞中效用至少提高了10倍。
用其它类型的人癌细胞观察到相似的结果。图3和4，显示了用化合物A、B和C各自在完整U251(人多形性胶质母细胞瘤)细胞和DU145(人前列腺癌)细胞中获得的数据。在U251细胞中化合物C(5′-脂质化形式)的IC50比化合物A的约低10倍，在DU145细胞中约低38倍，证实了化合物C治疗效率的提高。
实施例4动物模型的人肿瘤中端粒酶活性的抑制
以下的实验中比较了非轭合寡核苷酸化合物A和脂质轭合的寡核苷酸化合物C抑制动物肿瘤生长中端粒酶的能力。在两侧用DU-145肿瘤细胞接种无胸腺(nu/nu)小鼠。当肿瘤达到50-100mm3大小时(两个肿瘤/小鼠)，小鼠接受单尾静脉注射PBS、FITC-标记的化合物A，或FITL-标记的化合物C(以40mg/kg给药两种化合物)。IV注射后24小时小鼠牺牲；收集一个肿瘤用于荧光显像和另一个肿瘤用于通过TRAP测试的端粒酶活性分析。
两个治疗组中的荧光水平是可比较的。然而，如图5中所示，化合物C导致高于化合物A的端粒酶活性抑制。泳道中对应于0.75ug肿瘤溶解产物的垂直箭头表示这些样品含有可比较含量的内标(通过水平箭头来表示)。血液含有血色素和其它非特异性标记聚合物抑制剂(用于端粒酶产物的PCR扩增中)，如通过凝胶左边泳道中内标丢失来表示。然而，可以通过连续稀释将这些非特异性抑制剂稀释(降低反应混合物中的肿瘤溶解产物)。在肿瘤溶解产物的最低浓度(右边的三个泳道)，其中在全部三个处理条件下内标是可比较的，清楚的是化合物C抑制端粒酶活性的程度比可比较剂量的化合物A高。
实施例5动物模型中骨髓瘤蛋白含量的降低
骨髓瘤患者的血浆含有特有的高含量(检测为“骨髓瘤峰值”或M-蛋白)癌细胞产生的抗体。M-蛋白含量的降低与疾病的缓解一致。该实验中，比较非轭合寡核苷酸化合物A和脂质共轭的寡核苷酸化合物C注射入骨髓瘤细胞的动物中后降低M-蛋白含量的能力。照射的NOD/SCID小鼠注射106CAG骨髓细胞然后通过腹膜内(IP)注射PBS，化合物A的PBS或化合物C的PBS来进行治疗。化合物A的剂量为25mg/kg/天(175mg/kg周×5周)；化合物C的剂量为头2周25mg/kg/天，第三周停止，然后剂量为每周三天25mg/kg/天，持续两周(五周内平均剂量为100mg/kg/周)。治疗的最后(培养后35天)，小鼠牺牲，并收集每组中的血浆(4-5只小鼠/组)用于测定骨髓瘤蛋白。如图6中所示的，尽管化合物C的剂量低40％(累积剂量为500mg对化合物A的875mg)，化合物C组证明了较低含量的骨髓瘤蛋白(将每只小鼠的值规格化)。
实施例6动物模型中人肿瘤生长的抑制
以下实验中比较了非轭合寡核苷酸化合物A和轭合脂质的寡核苷酸化合物C抑制动物中肿瘤生长的能力。照射的NOD/SCID小鼠皮下接种CAG骨髓瘤细胞，肿瘤生长14天后用IP注射PBS、化合物A(25mg/kg/天M-F，或125mg/kg/周)或化合物C(25mg/kg MWF，或75mg/kg/周)。如图7所示，尽管剂量低40％，但化合物C证明了比化合物A高的抗肿瘤效率。(该研究中，以之前该模型中与抗肿瘤效率相关的剂量低30％的剂量来给药化合物A，175mg/kg/周)。
作为该研究的一部分，牺牲后研究了两侧CAG骨髓瘤，并分析端粒酶活性(通过TRAP测试)和通过DNA印迹分析TRF长度。如图8中所示的，尽管以低40％的剂量给药，但化合物C证明了肿瘤细胞中明显更高的抑制端粒酶活性(降低83％)和端粒缩短的诱导(2.85Kb平均TRF)。较高剂量的化合物A给予了较低的端粒酶抑制(41％)，并且随着研究过程的流逝并没有致使明显的端粒缩短。
          *   *   *   *   *   *   *   *   *   *
上述公开文本中提供的主题可以作为常规最佳化的主题来进行改变，而没有脱离本发明的精神或所附权利要求的范围。
                              序列表
SEQ ID NO：1
ggguugcgga gggugggccu gggaggggug guggccauuu uuugucuaac ccuaacugag aagggcguag  70
gcgccgugcu uuugcucccc gcgcgcuguu uuucucgcug acuuucagcg ggcggaaaag ccucggccug 140
ccgccuucca ccguucauuc uagagcaaac aaaaaauguc agcugcuggc ccguucgccc cucccgggga 210
ccugcggcgg gucgccugcc cagcccccga accccgccug gaggccgcgg ucggcccggg gcuucuccgg 280
aggcacccac ugccaccgcg aagaguuggg cucugucagc cgcgggucuc ucgggggcga gggcgagguu 350
caggccuuuc aggccgcagg aagaggaacg gagcgagucc ccgcgcgcgg cgcgauuccc ugagcugugg 420
gacgugcacc caggacucgg cucacacaug c                                           451

Claims (25)

1.一种化合物，包括结构：
                     O-(x-L)n，
其中：
O是包括至少5个与人端粒酶RNA序列(SEQ ID NO：1)互补的碱基的寡核苷酸；
x是任意的连接物；
L是脂质部分；
且n是1-5的整数，其中如果n＞1，每个(x-L)成分是可独立选择的。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中O包括至少10个与人端粒酶RNA序列(SEQ ID NO：1)互补的碱基。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中L是选自取代的或未取代的脂肪酸或固醇的脂质。
4.根据权利要求3所述的化合物，其中L是氟取代的脂肪酸。
5.根据权利要求2所述的化合物，其中L是取代的或未取代的烃。
6.根据权利要求5所述的化合物，其中L是氟取代的烃。
7.根据权利要求1所述的化合物，其中n＝1且x-L部分共价共轭寡核苷酸O的5′端。
8.根据权利要求1所述的化合物，其中n＝1且(x-L)部分共价共轭寡核苷酸O的3′端。
9.根据权利要求1所述的化合物，其中n＝2，一个独立选择的(x-L)部分共价共轭5′端以及一个独立选择的(x-L)部分共价共轭3′端。
10.根据权利要求1所述的化合物，其中n＝1且(x-L)部分共价共轭寡核苷酸O的核酸碱基。
11.根据权利要求1所述的化合物，其中寡核苷酸的核苷酸间键合是N3′→P5′氨基磷酸酯键合。
12.根据权利要求1所述的化合物，其中寡核苷酸的核苷酸间键合是N3′→P5′硫代氨基磷酸酯键合。
13.根据权利要求1所述的化合物，其中寡核苷酸O包括至少10个与人端粒酶RNA序列(SEQ ID NO：1)互补的碱基。
14.根据权利要求1所述的化合物，其中
寡核苷酸的核苷酸间键合是N3′→P5′硫代氨基磷酸酯键合；O的序列包括至少12个与人端粒酶RNA序列(SEQ ID NO：1)互补的碱基；
n＝1；
(x-L)共价共轭O的5′或3′端；和
L是脂肪酸。
15.根据权利要求14所述的化合物，其中x是甘油或氨基甘油连接物。
16.根据权利要求15所述的化合物，其中化合物的结构是：
Figure A2004800259750003C1
17.根据权利要求14所述的化合物，其中L通过酰胺键直接连接寡核苷酸L的3′端。
18.根据权利要求17所述的化合物，其中化合物的结构是：
19.一种抑制端粒酶酶活性的方法，该方法包括使端粒酶与根据权利要求1所述的化合物接触。
20.一种抑制细胞中端粒酶酶活性的方法，该方法包括使细胞与根据权利要求1所述的化合物接触。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
22.一种抑制癌细胞增殖的方法，该方法包括使细胞与根据权利要求1所述的化合物接触。
23.一种药物组合物，包括配制于药物学上可接受的赋形剂中的根据权利要求1所述的化合物。
24.根据权利要求1所述的化合物在医学中的用途。
25.根据权利要求1所述的化合物用于治疗癌症的用途。
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