CN1720456A - 自校正流通测定装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于流通测定装置的内部自校正系统。具体地说，本发明采用由测定装置的多孔膜限定出的单个检测/校正区的用途。已经发现，这种内部自校正系统提供了一种准确、廉价和容易控制的确定测试样品中分析物的存在的方法。

Description

自校正流通测定装置
                       发明背景
多种不同的分析方法和设备普遍用于流通测定中，用于确定测试样品中可能存在的分析物的存在和/或浓度。例如，免疫测定法利用免疫系统机制，其中抗体是响应作为有机体的病原或外源的抗原的存在而产生的。这些抗体和抗原即免疫反应物能够彼此结合，借此产生能够用来确定生物样品中特定抗原的存在或浓度的高度特异性反应机制。
有几种公知的免疫测定法，这些方法利用由可检测的成分标记的免疫反应物，从而能够对分析物进行分析检测。例如，“夹心型”测定法一般涉及使测试样品与可检测的探针(例如染色乳胶或放射性同位素)混合，这些探针与分析物的特异性结合部分缀合。缀合探针(conjugated probes)与分析物形成复合物。这些复合物然后到达固定抗体区，在此处抗体与分析物之间发生结合，从而形成三元的“夹心复合物”。夹心复合物位于用于检测分析物的区域。此技术用来获得定量或半定量结果。这些夹心型测定的一些实例在 Grubb等人的U.S.4,168,146和 Tom等人的U.S.4,366,241中有所描述。
另一种技术是“竞争型”测定。在“竞争型”测定中，标记物一般是与样品中存在的任何未标记分析物竞争与抗体结合的标记分析物或分析物类似物。竞争性测定法一般用于检测诸如半抗原之类的分析物，每种半抗原是单价的并且仅能够结合一个抗体分子。竞争性免疫测定装置的实例在 Deutsch等人的U.S.4,235,601、 Liotta的U.S.4,442,204和 Buechler等人的U.S.5,208,535中有所描速。
这些测定法中的许多种类都依赖于校正来提供有效和有意义的结果，特别是对于半定量和定量检测而言。具体地说，通常可采用外部或内部校正系统。在外部校正系统中，由含有一组已知量分析物的标准样品获得标准曲线，然后将从样品获得的结果与标准曲线进行比较，以便求出样品中分析物的存在和/或数量。外部校正方法相对容易设计和简便实施。然而，其经常受到环境和逐批差异的影响，因此是不可靠的。
另一方面，传统的内部校正系统一般采用具有校正区和检测区的膜，在检测区上固定有特异于分析物的捕获试剂。遗憾的是，校正区提供可靠准确的与检测区的比较结果的能力经常受到限制。此外，大多数内部校正区相对昂贵，因此它们对某些应用领域是不实际的。
因此，目前需要一种准确廉价的流通测定的准确校正系统。
                       发明概述
按照本发明的一个实施方案，公开了一种能够检测测试样品中分析物的存在或数量的流通测定装置(例如夹心型、竞争型等)。这种测定装置包括与检测探针和校正探针相通的多孔膜，所述的两种探针能够分别产生检测信号和校正信号。例如，在一些实施方案中，探针选自发色团、催化剂、荧光化合物、化学发光化合物、磷光化合物、放射性化合物、直接目视标记物、脂质体、以及这些物质的组合。在一个特定实施方案中，探针含有胶乳微粒。
多孔膜限定出检测/校正区，在该区域内固定有直接或间接与检测探针、校正探针或它们的组合结合的聚电解质捕获试剂。可采用作为分析物的特异性结合部分(member)的第二捕获试剂。检测/校正区能够产生检测信号和校正信号，从而能够由校正信号校正的检测信号确定分析物的量。
按照本发明的另一个实施方案，公开了一种用于检测测试样品中分析物的存在或数量的方法。该方法包括提供流通测定装置。含有分析物的测试样品与所述装置中存在的检测探针和校正探针接触。在检测/校正区，测定检测信号和校正信号的强度。测试样品内分析物的量与用校正信号强度校正的检测信号强度成正比。
以下更详细地论述本发明的其它特征和方面。
                         附图简述
本发明的全面和可实施的内容，包括其最佳方式，针对本领域的普通技术人员，都参照附图在说明书的剩余部分得到更加具体的阐述，其中：
图1是本发明的流通测定装置的一个实施方案的透视图；
图2图示出抗体与羧基化纳米颗粒共价缀合的一个实施方案；
图3是本发明的流通测定装置的一个实施方案的示意图；
图4是本发明的流通测定装置的另一个实施方案的示意图；
图5是本发明的流通测定装置的又一个实施方案的示意图；
图6是本发明的流通测定装置的另一个实施方案的示意图。
附图标记在本说明书和附图中的重复使用意味着其代表本发明的相同或类似特征或部件。
                   代表性实施方案详述
                          定义
正如本文所用的，术语“分析物”通常是指待检测的物质。例如，分析物可包括抗原性物质、半抗原、抗体以及这些物质的组合。分析物包括但不限于毒素、有机化合物、蛋白质、肽、微生物、氨基酸、核酸、激素、类固醇、维生素、药物(包括那些为了治疗目的而施用的药物和那些为了违法目的而施用的药物)、药物中间体或副产物、细菌、病毒颗粒以及任何上述物质的代谢物或抗体。一些分析物的具体实例包括铁蛋白；肌酸激酶MIB(CK-MB)；地高辛；苯妥英；苯巴比妥；卡马西平；万古霉素；庆大霉素；茶碱；丙戊酸；奎尼定；促黄体生成激素(LH)；促卵泡激素(FSH)；雌二醇、黄体酮；C-反应蛋白；lipocalins；IgE抗体；维生素B2微球蛋白；糖化血红蛋白(Gly、Hb)；氢化可的松；毛地黄毒苷；N-乙酰普鲁卡因酰胺(NAPA)；普鲁卡因酰胺；风疹抗体，例如风疹-IgG和风疹IgM；毒胞质抗体，例如毒胞质IgG(Toxo-IgG)和毒胞质IgM(Toxo-IgM)；睾酮；水杨酸盐；乙酰氨基苯酚；乙肝病毒表面抗原(HBsAg)；乙肝核心抗原的抗体，例如抗-乙肝核心抗原IgG和IgM(抗-HBC)；人免疫缺陷病毒1和2(HIV1和2)；人T-细胞白血病病毒1和2(HTLV)；乙肝e抗原(HBeAg)；乙肝e抗原的抗体(抗-HBe)；促甲状腺素(TSH)；甲状腺素(T4)；全三碘甲状腺原氨酸(全T3)；游离三碘甲状腺原氨酸(游离T3)；癌胚抗原(CEA)；以及α-胎儿蛋白(AFP)。滥用和受控物质的药物包括但不限于麻黄碱；脱氧麻黄碱；巴比妥酸盐，例如异戊巴比妥、司可巴比妥、戊巴比妥、苯巴比妥和巴比妥；苯二氮杂类，例如利眠宁和安定；大麻素类，例如印度大麻和大麻；可卡因；芬太尼；LSD；安眠酮；鸦片制剂，例如海洛因、吗啡、可待因、盐酸二氢吗啡酮、氢可酮、美沙酮、氧可酮、氧吗啡酮和鸦片；苯环利定；和丙氧吩。其它潜在的分析物在Everhart等人的U.S.6,436,651和Tom等人的U.S.4,366,241中有所描述。
本文所用术语“测试样品”通常是指被怀疑含有分析物的材料。测试样品可从源体获得后直接使用，或者进行预处理以改善样品的特性。测试样品可来自任何生物源，例如生理流体，包括血液、唾液、眼晶状体液、脑脊髓液、汗液、尿液、乳液、腹水、raucous、滑液、腹膜液、羊膜液等。测试样品在使用前可预处理，例如用血液制备血浆、稀释粘稠液等。处理方法包括过滤、蒸馏、浓缩、干扰成分的灭活、以及试剂的加入。除了生理流体之外，还可以使用其它液态样品，例如用于环境或食品产生性能测定的水、食品等。此外，被怀疑含有分析物的固体材料也可用作测试样品。在一些情况下，有益的是，改善固体测试材料以形成液态介质或释放分析物。
                         详细描述
现在详细参照本发明的多个不同实施方案，其中的一个或多个实例在以下列出。每个实例都是为了解释本发明，而对本发明没有限定作用。事实上，对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的范围或精髓的情况下能够对本发明作出多种修改和变型。例如，作为实施方案的一部分而阐述或描述的特征可用在另一个实施方案上，从而产生又一个实施方案。于是，本发明意在覆盖这样的修改和变型，即它们在所附的权利要去书及其等同物的范围内。
总体上，本发明涉及一种用于流通测定装置的内部自校正系统。具体地说，本发明利用由测定装置的多孔膜限定出的单个检测/校正区的用途。通过消除环境因素，例如温度、pH和检测信号的仪器不稳定性的影响，同时实施信号检测和内部校正能够大大增加检测的可靠性和重复性。
例如，参照图1，现在更详细地描述按照本发明形成的流通测定装置20的一个实施方案。如图所示，装置20包含任选由刚性材料21支撑着的多孔膜23。通常，多孔膜23可以由测试样品能够通过的任何材料制成。例如，用来形成多孔膜23的材料可包括但不限于天然材料、合成材料、或者天然存在的、被合成改性的材料，例如多糖(诸如纸和纤维素衍生物之类的纤维素材料，例如醋酸纤维素和硝基纤维素)；硅石；均匀分散在多孔聚合物基质中的无机材料，例如去活氧化铝、硅藻土、MgSO4或其它无机细碎材料，其中聚合物为例如氯乙烯、氯乙烯-丙烯共聚物和氯乙烯-醋酸乙烯酯共聚物；布，包括天然存在的(例如棉花)及合成的(例如尼龙或人造纤维)；多孔凝胶，例如硅胶、琼脂糖、右旋糖苷和明胶；聚合物膜，例如聚丙烯酰胺等等。在一个特定实施方案中，多孔膜23是由硝基纤维素和/或聚酯砜材料形成的。应该理解，术语“硝基纤维素”是指纤维素的硝酸酯，其可以是单独的硝基纤维素，或者是硝酸与其它酸(例如具有1-7个碳原子的脂肪族羧酸)的混合酯。
装置20还可以包含芯吸(wicking)垫28。芯吸垫28通常接收已经通过整个多孔膜23迁移的流体。正如本领域内所公知的，芯吸垫28有助于促进毛细作用和通过膜23的流体流动。
为了在测试样品内启动分析物的检测，使用者可直接将测试样品加入到一部分多孔膜23上，然后样品可通过膜23移动到达检测/校正区31(在下面描述)。或者是，测试样品可以先加到与多孔膜23以流体相通的取样垫(未示出)上。可用来形成取样垫的一些适宜材料包括但不限于硝基纤维素、纤维素、多孔聚乙烯垫和玻璃纤维滤纸。如果需要的话，取样垫还可含有扩散地或非扩散地附着到其上的一种或多种测定预处理试剂。
在图示的实施方案中，测试样品从取样垫(未示出)移动到以与取样垫一端相通的方式放置的缀合垫22上。缀合垫22由测试样品能够通过的材料形成。例如，在一个实施方案中，缀合垫22由玻璃纤维形成。虽然仅仅示出一个缀合垫22，但是应该理解，其它缀合垫也可用于本发明。
为了易于准确检测测试样品内分析物的存在或缺乏，将探针施加在装置20的多个不同部位。如以下更详细描述的，探针用于分析物的检测和校正。通常能够产生可目视检测或通过仪器设备检测的信号的任何物质都可以用作探针。各种合适的物质包括发色团；催化剂；荧光化合物；化学发光化合物；磷光化合物；放射性化合物；直接目视标记物，包括胶状金属(例如金)和非金属颗粒、染料颗粒、酶或底物、或有机聚合物胶乳颗粒；脂质体或含有信号生成物的其它囊泡等等。例如，适合用作探针的一些酶公开在Litman等人的U.S.4,275,149中，该文献在此作为参考全部引入本文。酶/底物系统的一个实例是酶碱性磷酸酶和底物硝基蓝四唑-5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐、或者这些物质的衍生物或类似物、或者底物4-甲基伞形基(umbelliferyl)-磷酸盐。其它合适的探针在Jou等人的U.S.5,670,381和Tarcha等人的U.S.5,252,459中有所描述，这些文献在此作为参考全部引入本文。
在一些实施方案中，探针可含有产生可检测信号的荧光化合物。荧光化合物可以是荧光分子、聚合物、树枝状物质、颗粒等等。合适荧光分子的一些实例例如包括但不限于荧光素、铕螯合物、藻胆蛋白质、若丹明以及这些物质的衍生物和类似物。可目视检测的有色化合物也能够用作探针，借此在无需其它信号生成试剂的情况下，提供了样品中分析物的存在或浓度的直接有色读数。
探针，诸如如上所述的探针，可单独使用或与微粒(有时称作“珠”或“微珠”)结合使用。例如，可使用天然存在的微粒，例如晶核、支原体、质粒、质体、哺乳动物细胞(例如红细胞血影)、单细胞微生物(例如细菌)、多糖(例如琼脂糖)等等。此外，还可采用合成微粒。例如，在一个实施方案中，采用用荧光染料或有色染料标记的胶乳微粒。虽然任何胶乳微粒都可用于本发明，但是胶乳微粒一般是由以下物质形成的：聚苯乙烯、丁二烯苯乙烯、苯乙烯-丙烯酸-乙烯基三元共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、苯乙烯-马来酐共聚物、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯基吡啶、聚二乙烯基苯、聚对苯二甲酸丁二酯、丙烯腈、氯乙烯-丙烯酸酯等，或者这些物质的酐、羧基、氨基、羟基或酰肼衍生物。其它合适的微粒在Jou等人的U.S.5,670,381和Tarcha等人的U.S.5,252,459中有所描述，这些文献在此作为参考全部引入本文。一些商业上可购得的合适荧光颗粒的实例包括商品名为“FluoSphere”(Red580/605)和“TransfluoSphere”(543/620)、由Molecular Probes，Inc.出售的荧光羧基化微球，以及也是由Molecular Probes，Inc.出售的“Texas Red”和5-及6-羧基四甲基若丹明。商业上可购得的合适有色胶乳微粒的实例包括由Bang’sLaboratory，Inc.出售的羧基化胶乳珠。
当探针是颗粒时，诸如以上所述的颗粒，颗粒的平均直径通常可根据诸如所选颗粒类型、膜的孔径和膜成分之类的因素按需改变。例如，在一些实施方案中，颗粒状标记物的平均直径可为约0.01微米-约1000微米。在一些实施方案中为约0.01微米-约100微米，而在一些实施方案中为约0.01微米-约10微米。在一个特定实施方案中，颗粒具有约0.1微米-约2微米的平均直径。通常，颗粒基本上是球形的，但是包括但不限于板形、杆形、棒形、不规则形状等的其它形状也适用于本发明。正如本领域技术人员所理解的，颗粒的成分、形状、尺寸和/或密度可广泛变化。
在一些情况下，需要用一些方式来给探针改性，以便使探针能够更容易地结合到分析物上。在这样的情况下，探针用某些粘附到其上的特异性结合部分来改性，以形成探针缀合物。特异性结合部分通常是指特异性结合对，即两个不同的分子，其中一个分子化学和/或物理结合到第二个分子上的一员。例如，免疫反应特异性结合部分可包括抗原、半抗原、适体(aptamers)、抗体和这些物质的复合物，包括那些通过DNA重组方法或肽合成而形成的物质。抗体可以是单克隆或多克隆抗体、重组蛋白质或其混合物或片段，以及抗体和其它特异性结合部分的混合物。这些抗体的制备细节和它们用作特异性结合部分的适宜性是本领域技术人员所公知的。其它通常的特异性结合对包括但不限于生物素和亲和素、糖类和凝集素、互补核苷酸序列(包括用于DNA杂交测定中的探针和捕获核酸序列，用于检测靶核酸序列)、互补肽序列(包括用重组方法形成的那些互补肽序列)、效应子和受体分子、激素和激素结合蛋白、酶辅因子和酶、酶抑制剂和酶等。此外，特异性结合对可包括作为原始特异性结合部分类似物的部分。例如，可使用分析物的衍生物或片段，即分析物-类似物，只要它具有至少一个与分析物共同的表位即可。
特异性结合部分一般可利用任何各种公知技术附着到探针上。例如，特异性结合部分对探针(例如微粒)的共价附着，可利用羧基、氨基、醛基、溴乙酰基、碘乙酰基、巯基、环氧基和其它反应性或连接性官能团以及残余的游离基和游离基阳离子来实现，通过这些基团可完成蛋白偶合反应。还可包括作为官能化共聚单体的表面官能团，因为微粒的表面可含有较高表面浓度的极性基团。此外，虽然微粒探针经常在合成之后官能化，在某些情况下例如为聚(苯硫酚)，但是微粒能够与蛋白质直接共价连接，而无需进一步改性。例如，参照图2，该图表示出用于共价缀合探针的本发明的一个实施方案。如图所示，缀合的第一个步骤是，用碳二亚胺活化探针表面上的羧基。在第二个步骤中，活化的羧酸基团与抗体的氨基反应，从而形成酰胺键。活化和/或抗体偶合可发生在缓冲液中，例如磷酸盐缓冲的盐水(PBS)(例如pH为7.2)或2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)(例如pH为5.3)。如图所示，所获得的探针然后可例如用乙醇胺封闭，从而形成探针缀合物。除了共价键合之外，其它附着技术，例如物理吸附，也可用于本发明。
再参照图1，装置20也包括检测/校正区31。检测/校正区31一般提供单个的不同的检测/校正区(例如线、点等)，以便使用者能够在沿装置的一个部位准确确定测试样品内特定分析物的浓度。例如，在图示的实施方案中，采用单线。
而且，此线可位于基本上垂直于通过装置20的测试样品流的方向上。同样，在一些实施方案中，此线位于基本上平行于通过装置20的测试样品流的方向上。
检测/校正区31含有一种或多种能够直接或间接地结合到探针上的固定捕获试剂(即，与探针缀合的特异性结合部分、与探针复合的分析物等)。在一些实施方案中，第一固定捕获试剂被构造为结合到检测探针上，而第二捕获试剂被构造为结合到校正探针上。第一和第二固定捕获试剂可以相同或不同。
一般来说，各种类型的捕获试剂均可固定在检测/校正区31内。例如，在一个实施方案中，捕获试剂可以与作为用来形成探针缀合物的特异性结合部分的同一种类或类别材料(例如抗体、抗原、它们的类似物等)相同或由其形成。这样，在该实施方案中，捕获试剂在结合到分析物上时可用作探针的固定结合位点。具体地说，分析物，例如抗体、抗原等可具有两个结合位点。在到达检测/校正区31并通过缀合垫22之后，这些结合位点之一被缀合到探针上的特异性结合部分所占据。然而，分析物的游离结合位点可结合到固定捕获试剂上。
在另一个实施方案中，固定捕获试剂可以是通过离子的相互作用直接或间接结合到探针上的聚电解质。例如，聚电解质可具有净正电或负电荷，以及通常为中性的净电荷。具有净正电荷的聚电解质的一些适宜实例包括但不限于聚赖氨酸(在商业上从Sigma-AldrichChemical Co.，Inc.of St.Louis，Missouri购得)、聚乙烯亚胺；环氧氯丙烷官能化的聚胺和/或聚酰胺型胺类，例如聚(二甲基胺-共-环氧氯丙烷)；聚二烯丙基二甲基-氯化铵；阳离子纤维素衍生物，例如用季铵盐水溶性单体接枝的纤维素共聚物或纤维素衍生物等等。在一个特定实施方案中，可采用作为含有季铵盐水溶性单体的纤维素衍生物的CelQuatSC-230M或H-100(从National Starch&Chemical，Inc.购得)。此外，具有净负电荷的聚电解质的一些适宜实例包括但不限于聚丙烯酸，例如聚(乙烯-共-甲基丙烯酸，钠盐)等等。还应该理解，其它聚电解质也可用于本发明，例如两亲聚电解质(即具有极性和非极性部分)。例如，合适的两亲聚电解质的一些实例包括但不限于聚(苯乙烯基-b-N-甲基2-乙烯基碘化吡啶鎓)和聚(苯乙烯基-b-丙烯酸)，它们可从Polymer Scource，Inc.of Dorval，Canada购得。
虽然通常可使用任何聚电解质，但是为特定应用而选择的聚电解质可根据探针的性质、特异性结合部分、感兴趣的分析物、多孔膜的类型等而变化。尤其是，聚电解质所分布的电荷使其结合到具有相反电荷的物质上。这样，例如，经常较好地配备具有净正电荷的聚电解质，以便与带负电的探针结合，而经常较好地配备具有净负电荷的聚电解质，以便与带正电的探针结合。因此，在这样的情形下，这些分子之间的离子相互作用使所需的结合发生在检测/校正区31内。不过，虽然离子的相互作用主要用来实现所需的结合，但是聚电解质也能够与具有相似电荷的探针结合。
因为聚电解质被设计成与探针结合，所以一般期望聚电解质基本上非扩散地固定在多孔膜23的表面上。这样，聚电解质能以聚电解质基本上不扩散到多孔膜23的基质中的方式施加到多孔膜23上。尤其是，聚电解质一般与多孔膜23的表面上存在的官能团形成离子和/或共价键，以便它们仍然固定在其上。虽然不是必需的，但是期望聚电解质与多孔膜23之间形成共价键，以便将聚电解质更持久地固定在其上。
例如，在一个实施方案中，用来形成聚电解质的单体先形成溶液，然后直接施加到多孔膜23上。各种溶剂(例如有机溶剂、水等)可用来形成该溶液。一旦施加，单体的聚合就用热量、电子束辐射、自由基聚合等来启动。在一些情况中，随着单体聚合，它们与多孔膜23的某些官能团形成共价键，借此将所生成的聚电解质固定在其上。例如，在一个实施方案中，乙烯亚胺单体能够与一些多孔膜(例如硝基纤维素)表面上存在的羧基形成共价键。
在另一个实施方案中，聚电解质能够在施加到多孔膜23上之前形成。如果需要的话，聚电解质可先利用有机溶剂、水等形成溶液。其后，聚电解质溶液直接施加到多孔膜23上，然后进行干燥。干燥之后，聚电解质可如上所述，与多孔膜23表面上存在的具有与聚电解质相反电荷的某些官能团形成离子键。例如，在一个实施方案中，带正电的聚乙烯亚胺可与一些多孔膜(例如硝基纤维素)表面上存在的带负电的羧基形成离子键。
此外，聚电解质还可利用各种公知技术交联到多孔膜23上。例如，在一些实施方案中，环氧氯丙烷官能化的聚胺和/或聚酰胺型胺类可用作能够交联的带正电核的聚电解质。这些材料的实例在 Keim的U.S.3,700,623； Keim的U.S.3,772,076；和 Keim的U.S.4,537,657中有所描述，这些文献在此作为参考全部并入本文，并且据信以KymeneTM为商品名由Hercules，Inc.，Wilmington，Del.出售。例如，KymeneTM450和2064是含有环氧环和季铵盐基团的环氧氯丙烷官能化的聚胺和/或聚酰胺型胺化合物，这些化合物在固化时能够与某些类型的多孔膜(例如硝基纤维素)上存在的羧基形成共价键并与多孔膜的聚合物骨架交联。在一些实施方案中，交联温度可为约50℃-约120℃，交联时间可为约10-约600秒。
虽然上面已经描述了用于将聚电解质非扩散地固定到多孔膜23上的各种技术，但是应该理解，任何其它非扩散地固定聚电解质化合物的技术均可用于本发明。事实上，上述方法仅意在作为可用于本发明的技术的示范性实例。例如，在一些实施方案中，能够基本上抑制这些聚电解质扩散到多孔膜23的基质内的某些成分可加入到聚电解质溶液中。
总之，可按照本发明构建各种流通测定装置。关于这一点，现在更详细地描述本发明的多个不同的实施方案。然而，应该理解，下述实施方案仅仅是示范性的，本发明还包括其它实施方案。例如，参照图3，该图表示出一个特定实施方案，其中探针41用于检测，探针43用于校正。在该实施方案中，检测探针41加入到缀合垫22上，并且在以与测试样品相通的方式放置时，由此能够流过装置20(如方向箭头L所指示的)。检测探针41与分析物A的特异性结合部分90缀合，因此，在探针41与分析物A接触之后就结合到其上，从而形成分析物/探针复合物49。分析物/探针复合物49然后可流过装置20，直到到达检测/校正区31为止。
在检测/校正区31内，固定聚电解质捕获试剂(未示出)，以便通过离子的相互作用结合到校正探针43上。在此实施方案中，在施加测试样品之前，校正探针43固定到聚电解质上。校正探针43可包括例如与特异性结合部分91(例如抗体、抗原等)缀合的胶乳颗粒。在检测/校正区31，分析物/探针复合物49可结合到校正探针43的特异性结合部分91上，从而形成夹心复合物50。任何未结合的探针41将流过检测/校正区31。如果需要的话，可预先确定聚电解质捕获试剂的量，以便检测/校正区31内的校正信号达到其完全预定的信号强度电位。也就是说，预先确定所沉积的探针43的量，因为所采用的聚电解质的量被设定在一个预定的公知水平。
一旦完全展开，探针43的强度水平就可用来校正检测/校正区31处的探针41的强度水平，以确定测试样品中存在的分析物的量。此校正步骤可借助于读取设备目视进行，或利用其它技术进行。例如，在一个实施方案中，探针41和43可以用荧光生成化合物来标记，从而探针41和43的信号强度可以用常规技术来测定。例如，在一个实施方案中，探针41和43用同一外源来激发。在此实施方案中，此外源供应激发波长的辐射，借此使探针41在与探针43发射的波长不同的波长处发光。这使得探针41和43的存在能够单独测定。或者是，探针41和43还可利用分开的外源分别测定。
一般来说，荧光是在某些荧光化合物中发生的三级过程的结果。在第一阶段，能量由外源(例如白炽灯或激光器)来提供，并被荧光化合物所吸收，从而产生激发的电子单态。在第二阶段，激发态存在有限的时间，在该时间，荧光化合物经历构象变化，还经历许多可能的与其分子环境的相互作用。在此期间，激发态的能量被部分消耗，从而产生荧光发生起源的松弛态。第三阶段是能量发出的荧光发射态，使荧光化合物回到其基态。所发出的能量低于其激发能量(光或激光)，并由此具有更长的波长。这种能量或波长的漂移或差别使发射能量被检测到并与激发能量分开。
荧光检测一般采用使发射光子与激发光子分开的滤波，和记录发射光子并产生可记录输出(通常为电信号或摄影图像)的检测器。一般存在四种公认类型的检测器：荧光光度计和微板读数器；荧光显微镜；荧光扫描仪；和流式细胞仪。一种用于本发明的合适荧光检测器是由SPEX Industries，Inc.of Edison，New Jersey出售的FluoroLog IIISpectrofluorometer。
虽然不是必需的，但是特别需要的检测和校正探针对的选择标准包括：(1)无论是吸收光谱还是荧光光谱，都极少有或没有光谱叠加，从而可单独测定发射强度；(2)当检测探针与校正探针开始靠近时，这二者之间没有明显的荧光能量传递，从而它们是独立发射的；以及(3)具有较长的发射波长(例如大于约600nm)，从而生物流体的自身荧光对荧光测定的影响最小。
而且，如果需要的话，一种被称作“时间解析荧光检测”的技术也可用于本发明。将时间解析荧光检测设计成通过利用某些荧光材料(例如铕(Eu(III))和铽(Tb(III))的镧系螯合物)的荧光特征，能够减小来自发射源或来自散射过程(由激发辐射的散射所导致的)的背景信号。这些螯合物能够在明显更短的波长激发之后表现出强烈的红移、窄带、长寿命的发射。典型的是，螯合物由于分子中的发色团靠近镧系元素而拥有强的紫外吸收带。在发色团吸收光之后，激发能量可从所激发的发色团传递到镧系元素。这符合镧系元素的荧光发射特征。利用合并有窄带发射滤波器的脉冲激发和时间门检测，仅能特异性检测来自镧系螯合物的荧光，而拒绝来自样品中存在的其它物种的发射(一般是较短寿命的或具有较短波长的发射)。用于测定荧光的其它时间解析技术在 Davidson的U.S.5,585,279和 Hemmila等人的U.S.5,637,509中有所描速，这些文献在此作为参考并入本文。
不考虑用来测定探针41和43的信号强度的技术，已经发现，单个检测/校正区31的使用能够使检测和校正探针41和43在装置20的同一部位进行测定。这个“单个测定部位”方法为测定装置的使用者，尤其是那些把家庭和护理点应用作为目标的使用者，提供了一种简单的吸引人的方法。
在检测/校正区31，由用校正探针43的信号强度所校正的检测探针41的信号强度确定分析物的量。具体地说，探针43的总量是预先确定和已知的，由此能够用于校正目的。这样，测试样品中分析物的量与Is(探针41的信号强度)成正比，而探针43的信号强度Ic应该保持相对稳定，而不管分析物是否存在。基于此校正值所属的强度范围，可以确定分析物的总体浓度范围。结果，在大致相同的条件下同时进行校正和样品的测试，由此提供了具有提高的灵敏度的可靠定量或半定量结果。
如果需要的话，在已知的分析物浓度范围，作出Is和Ic之比与分析物浓度的曲线，从而产生校正曲线。为了确定未知测试样品中分析物的量，可随后根据校正曲线将信号比转换成分析物的浓度。应该注意，可以作出Is和Ic的替换型数学关系与分析物浓度的曲线，从而产生校正曲线。例如，在一个实施方案中，可以作出Is/(Is+Ic)值与分析物浓度的曲线，从而产生校正曲线。
参照图4，该图表示出另一个实施方案，其中探针41用于检测，探针43用于校正。检测探针41施加到缀合垫22上，并且由此在以与测试样品相通的方式放置时能够流过装置20(如方向箭头L所示)。检测探针41与分析物A的特异性结合部分90缀合，因此在探针41接触分析物A之后就结合到其上，从而形成分析物/探针复合物49。分析物/探针复合物49然后可流过装置20，直到它们到达检测/校正区31为止。校正探针43经聚电解质捕获试剂固定在检测/校正区31内。例如，校正探针43可包括标记微粒、聚合物或通过离子相互作用结合到聚电解质上的分子。此外，特异性结合部分91(例如抗体、抗原等)也单独固定在检测/校正区31内。基于检测探针41的性质，复合物49或未结合的探针41都没有结合到聚电解质捕获试剂上。相反，分析物/探针复合物49结合到特异性结合部分91上，从而形成复合物50，且任何未结合的探针41都流过检测/校正区31。一旦完全展开，就可以确定检测/校正区31上的探针41的强度信号Is，以便计算测试样品中存在的分析物的量。在该实施方案中，测试样品中的分析物的量与Is成正比。此外，校正探针43的强度信号Ic也可用来校正Is。例如，在已知的分析物浓度范围，作出Is和Ic之比与分析物浓度的曲线，从而产生校正曲线。
参照图5，该图表示出又一个实施方案，其中探针41用于检测，探针43用于校正。检测探针41和校正探针43施加到缀合垫22上，并且由此在以与测试样品相通的方式放置时能够流过装置20(如方向箭头L所示)。检测探针41与分析物A的特异性结合部分90缀合，因此在探针41接触分析物A之后就结合到其上，从而形成分析物/探针复合物49。分析物/探针复合物49然后可流过装置20，直到它们到达检测/校正区31为止。聚电解质固定到检测/校正区31内，以便通过离子相互作用与校正探针43(例如标记的微粒、聚合物或分子)选择性结合。具体地说，探针43的尺寸小于探针41的，从而探针43在探针41之前到达检测/校正区31，并占据由聚电解质提供的所有结合位点。或者是，探针41和43的电荷使得仅有探针43结合到聚电解质上。在任何情况下，特异性结合部分91(例如抗体、抗原等)也单独固定在检测/校正区31内。在检测/校正区31，分析物/探针复合物49可结合到特异性结合部分91上，从而形成复合物50。任何未结合的探针41都流过检测/校正区31。一旦完全展开，就可以确定检测/校正区31上的探针41的强度信号Is，以便计算测试样品中存在的分析物的量。在该实施方案中，测试样品中分析物的量与Is成正比。此外，校正探针43的强度信号Ic也可用来校正Is。例如，在已知的分析物浓度范围，作出Is和Ic之比与分析物浓度的曲线，从而产生校正曲线。
在一些实施方案中，装置20可包含易于检测感兴趣的分析物的附加区。例如，如图6所示，装置20可包含位于检测/校正区31上游的捕获区33。捕获区33含有特异于检测探针或校正探针的第一捕获试剂。例如，在图示的实施方案中，检测探针41施加到缀合垫22上，并且由此在以与测试样品相通的方式放置时能够流过装置20。检测探针41与分析物A的特异性结合部分90缀合，因此在探针41接触分析物A之后就结合到其上，从而形成分析物/探针复合物49。分析物/探针复合物49然后可流过装置20，直到它们到达捕获区33为止。对应于分析物A的特异性结合部分91(例如抗体或抗原)固定到捕获区33内。这样，在捕获区33，分析物/探针复合物49可结合到固定在其上的特异性结合部分91上，从而形成复合物50。
任何未结合的探针41然后流到检测/校正区31。在该实施方案中，能够通过离子相互作用结合到任何未结合的探针41上的第二捕获试剂(例如聚电解质)也固定到检测/校正区31内。而且，校正探针43也可以固定在检测/校正区31内的第二捕获试剂上。例如，校正探针43可包括也通过离子相互作用结合到聚电解质上的胶乳微粒。
一旦完全展开，就可以确定检测/校正区31上探针41的强度信号Is，以便计算测试样品中存在的分析物的量。在该实施方案中，测试样品中的分析物的量与Is成反比。此外，校正探针43的强度信号Ic也可用来校正Is。例如，在已知的分析物浓度范围，作出Is和Ic之比与分析物浓度的曲线，从而产生校正曲线。为了确定未知测试样品中分析物的量，可随后根据校正曲线将信号比转换成分析物的浓度。应该注意，可以作出Is和Ic的替换型数学关系与分析物浓度的曲线，从而产生校正曲线。
虽然上面已经描述了测定结构的多个不同的实施方案，但是应该理解，本发明的测定一般可具有任何所需的结构，并且不必含有上述所有部件。而且，本文没有具体提及的其它公知的测定部件也可用于本发明。例如，多种测定结构在 Lambotte等人的U.S.5,395,754； Jou等人的U.S.5,670,381；和 Malick等人的U.S.6,194,220中有所描述，这些文献在此作为参考全部并入本文。此外，还应该理解，按照本发明也可形成竞争型测定。竞争型测定的技术和结构是本领域技术人员所公知的。
作为实例，能够容易地修改以上所述以及图3所示的装置20，以形成竞争型测定。在该实施方案中，检测探针41可以是分析物或分析物类似物，而校正探针43可包括例如与感兴趣的分析物的特异性结合部分缀合的胶乳微粒。当施加测试样品时，检测探针41就穿过多孔膜23，直到它们到达检测/校正区31为止。在区31，检测探针41及测试样品内的任何分析物A竞争特异性结合部分91(例如抗体、抗原等)。任何未结合的探针41将流过检测/校正区31。在此实施方案中，测试样品中分析物的量与Is(探针41的信号强度)成反比。如果需要的话，在已知的分析物浓度范围，作出Is和Ic(探针43的信号强度)之比与分析物浓度的曲线，从而产生校正曲线。
参照以下实施例可以更好地理解本发明。
                        实施例1
本发明的用来校正夹心型测定的内部检测/校正区的性能得到证实。首先，将HF120多孔膜样品层压在长约30厘米的相应支撑卡上。从Molecular Probes，Inc.获得具有0.2微米粒度和505/515纳米激发/发射波长的荧光珠(校正探针)。珠在浓度为0.28％(重量百分比)的储存缓冲液中进行洗涤和储存。将40微升的荧光珠溶液与10微升的聚赖氨酸溶液混合，并拉丝(striped)到膜上，形成检测/校正线。具有2.36毫克/毫升浓度的单克隆抗体CRP Mab 5804(得自于Biogenesis，Inc.)固定在多孔膜样品上，形成捕获线。然后在37℃将膜样品干燥1小时。将纤维素纤维芯吸垫(Millipore Co.)固定到膜的一端并切成4毫米的条带。
将半粘性样品放入含有荧光珠(检测探针)和不同浓度CRP抗原的混合物的多个微孔内。对于每个混合物荧光珠的量都一样，即为4毫克。如下形成荧光检测珠。首先，提供具有羧基官能团的聚苯乙烯珠(得自于Molecular Probes，Inc.)。这些珠具有0.5微米的粒度和580/605纳米的激发/发射波长。将100微升的聚苯乙烯珠(2％浓度)用MES缓冲液洗涤两次，并离心分离。将造粒珠重新悬浮到100微升的MES缓冲液中并与50微升含有4毫克碳二亚胺(得自于Polysciences，Inc.)的MES缓冲液混合。混合物在室温下于混合器中反应20分钟。活化珠然后用硼酸盐缓冲液洗涤两次。将活化珠重新悬浮到200微升的硼酸盐缓冲液中并与15微升浓度为6.4毫克/毫升的C-反应蛋白的单克隆抗体(得自于Biogenisis，Inc.的CRP Mab5811)混合。反应在室温下于混合器中过夜。所得到的反应混合物然后与100微升的乙醇胺用混合器混合15分钟。弃去上清液，并将珠用PBS缓冲液洗涤两次，在4℃储存在含有0.1M PBS、0.15M NaCl、1％BSA、5％甘油和0.1％NaN3的储存缓冲液中，从而得到浓度为4mg/ml的缀合珠。
然后用Fluorolog III Spectrofluoremeter(SPEX Industries，Inc.，Edison，NJ)以直角的方式在检测/校正线处测定荧光强度。结果如下面的表1所示，其中Is代表检测/校正线处检测探针的信号强度，Ic代表检测/校正线处校正探针的信号强度。
        表1：信号强度的结果
  分析物(ng/ml)   Ic   Is/Ic
  0   400   1258
  33   426   1068
  66   450   971
  189   470   860
  378   450   822
  756   470   564
由以上结果可见，当样品中不存在分析物时，检测探针就穿过捕获线并捕获在检测/校正线上。当样品中存在分析物时，检测探针就与分析物复合并捕获在捕获线上，而任何剩余的检测探针捕获在检测/校正线处。因此，检测/校正线上检测探针的强度(Is)与分析物的浓度成反比，而检测/校正线处校正探针的强度(Ic)对于不同的分析物浓度都保持相对稳定，即约444±27。Ic的偏差据信是由于环境变化、测定条件和仪器的不稳定性导致的。然而，预期此偏差对Is具有类似的作用。因此，Is/Ic据信在这种情况下可提供更准确的结果。
                         实施例2
本发明的用来校正夹心型测定的内部检测/校正区的性能得到证实。首先，将HF120多孔膜样品层压在长约30厘米的相应支撑卡上。然后如下形成荧光聚合物(校正探针)。首先，将0.5克的聚丙烯酸(MW＝450,000，D.P.＝6250)溶解在20毫升的甲醇中。将1毫升甲醇中的3.8毫克二环己基碳二亚胺(DCC)加入到该溶液中，以便激活聚丙烯酸聚合物。将所得到的溶液搅拌30分钟。通过将10毫克5-(和-6-)-((N-(5-氨基戊基)氨基)-羰基)四甲基若丹明(544/590纳米的激发/发射波长，Molecular Probes，Inc.)溶解在1毫升的甲醇溶液中而制成荧光染料溶液。将该染料溶液加入到活化聚丙烯酸溶液中并搅拌。反应在室温下持续24小时，此时铝箔包裹在溶液周围。反应终止后，加入乙醚以形成沉淀。对沉淀进行离心并浸在乙醇中，以除去任何未反应的荧光染料。在除去乙醇溶液之后，将剩余的红色凝胶在空气中干燥。
然后将上述的荧光聚合物(校正探针)溶解在水中并与CelQuat100-H(从National Starch&Chemical，Inc.购得的纤维素聚电解质衍生物)混合。将该混合物拉丝到膜上，形成检测/校正线。将具有6.4毫克/毫升浓度的单克隆抗体CRP Mab 5811(得自于Biogenesis，Inc.)固定在多孔膜样品上，形成捕获线。然后在37℃将膜样品干燥1小时。将纤维素纤维芯吸垫(Millipore Co.)固定到膜的一端并切成4毫米的条带。
将半粘性样品放入含有荧光珠(检测探针)和不同浓度CRP抗原的混合物的多个微孔内。对于每个混合物荧光珠(检测探针)的量都一样，即为4微克。如下形成荧光检测珠(检测探针)。首先，提供具有羧基官能团的聚苯乙烯珠(得自于Molecular Probes，Inc.)。这些珠具有0.2微米的粒度和505/515纳米的激发/发射波长。将100微升的聚苯乙烯珠(2％浓度)用MES缓冲液洗涤两次，并离心分离。将造粒珠重新悬浮到200微升的MES缓冲液中并与20微升含有4.8毫克碳二亚胺(得自于Polysciences，Inc.)的MES缓冲液混合。混合物在室温下于混合器中反应20分钟。活化珠然后用硼酸盐缓冲液洗涤两次。将活化珠重新悬浮到200微升的硼酸盐缓冲液中并与90微升浓度为2.36毫克/毫升的C-反应蛋白的单克隆抗体(得自于Biogenisis，Inc.的CRP Mab 5804)混合。反应在室温下于混合器中过夜。所得到的反应混合物然后与100微升的乙醇胺用混合器混合15分钟。弃去上清液，并将珠用PBS缓冲液洗涤两次，然后在4℃储存在含有0.1M PBS、0.15M NaCl、1％BSA、5％甘油和0.1％NaN3的储存缓冲液中，从而得到浓度为4mg/ml的缀合珠。
然后用Fluorolog II Spectrofluoremeter(SPEX Industries，Inc.，Edison，NJ)以直角方式在检测/校正线处测定荧光强度。结果如下面的表2所示，其中Is代表检测/校正线处检测探针的信号强度，Ic代表检测/校正线处校正探针的信号强度。
       表2：信号强度的结果
  分析物(ng/ml)   Ic   Is/Ic
  0   37   16622
  5   42   13714
  25   36   15111
  50   34   14971
  250   34   9529
  500   33   7152
  2500   34   1765
由以上结果可见，当样品中不存在分析物时，检测探针就穿过捕获线并捕获在检测/校正线上。当样品中存在分析物时，检测探针就与分析物复合并捕获在捕获线上，而任何剩余的检测探针捕获在检测/校正线处。因此，检测/校正线上检测探针的强度(Is)与分析物的浓度成反比，而检测/校正线处校正探针的强度(Ic)对于不同的分析物浓度都保持相对稳定，即约36±6。Ic的偏差据信是由于环境变化、测定条件和仪器的不稳定性导致的。然而，预期此偏差对Is具有类似的作用。因此，Is/Ic据信在这种情况下可提供更准确的结果。
虽然已经就本发明的具体实施方案详细描述了本发明，但是本领域的技术人员应该理解，在领会上述内容之后，容易构思这些实施方案的替换形式、变型和等同物。因此，本发明的范围应该由所附的权利要求书及其等同物来确定。

Claims (40)

1、一种能够检测测试样品中分析物的存在或数量的流通测定装置，所述流通测定装置包括多孔膜，所述多孔膜与能够产生检测信号的检测探针和能够产生校正信号的校正探针相通，所述多孔膜限定出检测/校正区，在所述检测/校正区内，固定有被构造为直接或间接与所述检测探针、所述校正探针或它们的组合结合的聚电解质捕获试剂，其中在所述检测/校正区内，所述检测探针能够产生检测信号，所述校正探针能够产生校正信号，并且所述分析物的量能够由所述校正信号校正的所述检测信号来确定。
2、如权利要求1所述的流通测定装置，其中所述检测探针和所述校正探针选自发色团、催化剂、荧光化合物、化学发光化合物、磷光化合物、放射性化合物、直接目视标记物、脂质体、以及这些物质的组合。
3、如权利要求2所述的流通测定装置，其中所述检测探针和所述校正探针是荧光化合物。
4、如权利要求1所述的流通测定装置，其中所述检测探针、所述校正探针或它们的组合含有微粒。
5、如权利要求1所述的流通测定装置，其中所述检测探针、所述校正探针或它们的组合与分析物的特异性结合部分缀合。
6、如权利要求5所述的流通测定装置，其中作为分析物的特异性结合部分的第二捕获试剂固定在所述检测/校正区内的所述多孔膜上。
7、如权利要求6所述的流通测定装置，其中所述第二捕获试剂被构造成当与所述检测探针接触时，直接或间接地结合到所述检测探针上。
8、如权利要求1所述的流通测定装置，其中所述聚电解质具有净正电荷。
9、如权利要求8所述的流通测定装置，其中所述聚电解质选自聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、环氧氯丙烷官能化的聚胺或聚酰胺型胺类、聚二烯丙基二甲基-氯化铵、阳离子纤维素衍生物及其组合。
10、如权利要求1所述的流通测定装置，其中所述聚电解质具有净负电荷。
11、如权利要求10所述的流通测定装置，其中所述聚电解质是两亲的。
12、如权利要求1所述的流通测定装置，其中所述聚电解质捕获试剂被构造成直接或间接结合到所述校正探针上。
13、如权利要求1所述的流通测定装置，其中所述聚电解质捕获试剂被构造成直接或间接结合到所述检测探针上。
14、如权利要求1所述的流通测定装置，其中所述多孔膜还限定出位于所述检测/校正区上游的捕获区，一种或多种捕获试剂固定在所述捕获区内，所述捕获试剂被构造成直接或间接结合到所述检测探针上。
15、如权利要求14所述的流通测定装置，其中所述捕获区的所述捕获试剂是分析物的特异性结合部分。
16、如权利要求1所述的流通测定装置，其中测试样品内分析物的量与检测信号强度和校正信号强度之比成正比。
17、如权利要求1所述的流通测定装置，其中所述装置是夹心型测定装置。
18、如权利要求1所述的流通测定装置，其中所述装置是竞争型测定装置。
19、一种能够检测测试样品中分析物的存在或数量的流通测定装置，所述流通测定装置包括多孔膜，所述多孔膜与能够产生检测信号的检测探针和能够产生校正信号的校正探针相通，所述检测探针与分析物的特异性结合部分缀合，所述多孔膜限定出检测/校正区，在所述检测/校正区内，非扩散地固定有被构造为直接或间接与所述校正探针、所述检测探针或它们的组合结合的聚电解质捕获试剂，其中在所述检测/校正区内，所述检测探针能够产生检测信号，所述校正探针能够产生校正信号，并且所述分析物的量能够由所述校正信号校正的所述检测信号来确定。
20、如权利要求19所述的流通测定装置，其中所述检测探针和所述校正探针选自发色团、催化剂、荧光化合物、化学发光化合物、磷光化合物、放射性化合物、直接目视标记物、脂质体、以及这些物质的组合。
21、如权利要求19所述的流通测定装置，其中所述检测探针和所述校正探针是荧光化合物。
22、如权利要求19所述的流通测定装置，其中所述检测探针、所述校正探针或它们的组合含有微粒。
23、如权利要求19所述的流通测定装置，其中所述校正探针与分析物的特异性结合部分缀合。
24、如权利要求19所述的流通测定装置，其中作为分析物的特异性结合部分的附加捕获试剂固定在所述检测/校正区内的所述多孔膜上。
25、如权利要求24所述的流通测定装置，其中所述附加捕获试剂被构造成当与所述检测探针接触时，直接或间接地结合到所述检测探针上。
26、如权利要求19所述的流通测定装置，其中所述多孔膜还限定出位于所述检测/校正区上游的捕获区，一种或多种捕获试剂固定在所述捕获区内，所述捕获试剂被构造成直接或间接结合到所述检测探针上。
27、如权利要求26所述的流通测定装置，其中所述捕获区的所述捕获试剂是分析物的特异性结合部分。
28、如权利要求19所述的流通测定装置，其中所述装置是夹心型测定装置。
29、如权利要求19所述的流通测定装置，其中所述装置是竞争型测定装置。
30、一种用于检测测试样品中分析物的存在或数量的方法，所述方法包括：
i)提供流通测定装置，所述流通测定装置包括多孔膜，所述多孔膜与能够产生检测信号的检测探针和能够产生校正信号的校正探针相通，所述多孔膜限定出检测/校正区，在所述检测/校正区内，固定有被构造为直接或间接结合到所述检测探针、所述校正探针或它们的组合上的聚电解质捕获试剂，其中在所述检测/校正区内，所述检测探针能够产生检测信号，所述校正探针能够产生校正信号；
ii)使含有分析物的测试样品与所述检测探针和所述校正探针接触；
iii)测定在所述检测/校正区内产生的检测信号强度和校正信号强度；
iv)用校正信号校正检测信号的强度，其中由所述校正信号校正的所述检测信号来确定测试样品内分析物的量。
31、如权利要求30所述的方法，其中所述检测探针和所述校正探针选自发色团、催化剂、荧光化合物、化学发光化合物、磷光化合物、放射性化合物、直接目视标记物、脂质体、以及这些物质的组合。
32、如权利要求31所述的方法，其中所述检测探针和所述校正探针是荧光化合物。
33、如权利要求32所述的方法，其还包括激发所述检测/校正区内的所述检测探针和所述校正探针，其中所述激发导致所述检测探针发出检测信号，所述校正探针发出校正信号。
34、如权利要求30所述的方法，其中所述检测探针、所述校正探针或它们的组合与分析物的特异性结合部分缀合。
35、如权利要求34所述的方法，其中作为分析物的特异性结合部分的第二捕获试剂固定在所述检测/校正区内。
36、如权利要求35所述的方法，其中所述第二捕获试剂被构造成当与所述检测探针接触时，直接或间接地结合到所述检测探针上。
37、如权利要求30所述的方法，其中所述聚电解质捕获试剂被构造成直接或间接结合到所述校正探针上。
38、如权利要求30所述的方法，其中所述聚电解质捕获试剂被构造成直接或间接结合到所述检测探针上。
39、如权利要求30所述的方法，其中所述多孔膜还限定出位于所述检测/校正区上游的捕获区，一种或多种捕获试剂固定在所述捕获区内，所述捕获试剂被构造成直接或间接结合到所述检测探针上。
40、如权利要求30所述的方法，其还包括通过针对多个预定的分析物浓度绘制由校正信号强度校正的检测信号强度来产生校正曲线。
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