CN1458526A - 具有多个反应区的测试片以及使用和制造该测试片的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于测定生理样品中至少一种被分析物浓度的测试片以及该测试片的制造和使用方法。该测试片具有由一种疏水性屏障界定的多个反应区。在每个反应区中存在的试剂组合物可以相同或者不同。另外，每一个反应区可以有一个单独的液体通道，或者两个或者多个反应区可以具有可合并为一个单一通道的独立通道。使用时，将样品施涂测试片上，然后可以检测到一个信号并通过该信号关联出该样品中被分析物的含量。发明中还提供了应用热转移技术施涂疏水屏障从而制造这种测试片的方法。最后还提供了用于实施本发明中所述方法的试剂盒。

Description

具有多个反应区的测试片以及 使用和制造该测试片的方法

                           技术领域

本发明领域涉及被分析物测定，尤其是血液被分析物的测定，更具体地涉及血液中葡萄糖的测定。

                           背景技术

现今社会生活中，生理样本中的被分析物浓度的测定越来越重要。这样的测定被应用于各种各样的应用背景中，包括实验室的临床测试，家庭测试等等，而测试的结果则在多种疾病症状的诊断和治疗中起到了显著的作用。被分析物包括在糖尿病治疗中的葡萄糖，在心血管疾病监测中的胆固醇等等。由于被分析物浓度特性的重要性的增加，涌现出大量用于临床和家庭中的被分析物浓度特性测定的方法和装置。

其中一种用来测定被分析物浓度的装置是测试片。这种测试片通常借助于过氧化氢的产生并随后对其进行检测。可采用这种测试片进行浓度测试的被分析物包括：胆固醇，甘油三酸酯，葡萄糖，乙醇和乳酸。例如，利用这种测试片方法来测定葡萄糖的方法是：首先使葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖，在测试片的一个反应区上产生葡萄糖酸和过氧化氢，从而实现对葡萄糖的定量测定。生成的过氧化氢结合过氧化酶，导致一个或多个有机基质转化，即指示剂变为有色产物，由此检测出该产物并可关联出原始样本中的葡萄糖浓度。

用来检测被分析物浓度的测试片常常被制成包括不止一个反应区域或面积，这些反应区中包含了一种或多种测定被分析物所需的测试或反应试剂。因此，很明显上述多反应区测试片的各反应区之间应当相互隔离从而避免互相污染，例如被其它反应区的试剂甚至是最后生成物污染，这一点很重要。当各反应区含有不同的试剂或是不同浓度的同种试剂时，这一点变得尤为重要。但是，即使各反应区含有相同浓度的同种试剂时，为了避免交叉污染和提供精确、可靠、可重复性的被分析物测定结果测定，也有必要使反应区之间相互隔离。

Douglas等的第US5843691号专利中公开了一种用来隔离具有多个反应区的测试片中反应区的方法。该专利中所公开的方法是通过压碎一个测试片的膜使得除了反应区外的其他区域都不吸水(但仍亲水)，而反应区可吸水，从而在测试片的膜上形成不吸水区(非吸收性的)和吸水区(吸收性的)两部分。该测试片在与被切掉的膜相邻处有一中间层，用来在每个反应区周围形成物理屏障。该中间层屏障用来防止置于一个反应区中的样品进入到不吸水但是亲水的区域中的另一个反应区，从而避免污染其他反应区。因此，该中间层必须精确地和每一个反应区对准，从而防止上述的污染并能容纳施涂于每个反应区的所需样品数量。这种压缩薄膜从而在一个不吸水区之中形成多个吸水反应区并使这些反应区隔离的方法虽然有效，但因为其中的压缩步骤以及需要把中间层和测试片反应区精确地对准，使得该方法操作复杂并且制作成本昂贵。

由于被分析物测定方法的广泛应用，这个领域中的新装置和方法仍然受到了持续关注。特别值得关注的是那些易于使用、结果精确、制作成本低的装置和方法的发展情况。

                           发明内容

本发明提供一种测定生理样本中至少一种被分析物浓度的测试片以及制造和应用这种测试片的方法。所述测试片具有由一疏水性屏障界定的多个反应区。每个反应区中的试剂组合物可以是相同的也可以是不同的。另外，每个反应区可具有一个单独的流体通道，或者两个或两个以上反应区的单独通道可以合并成一单一通道。使用时，样品被施涂于所述测试片上，即可探测到一个信号并通过这个信号关联出该样品中的被分析物含量。本发明还提供了使用热转移技术施涂疏水性屏障以制作该测试片的方法。最后，本发明提供了用于实现该方法的试剂盒。

                           附图说明

图1表示的是本发明中所述的一种示例性的测试片基体。图1A表示的是本发明中所述的具有将测试试剂施加于平行部分处的示例性基体。图1B表示的是在图1A中所示基体的各个平行部分中具有由疏水性屏障所界定的单个反应区的情况。

图2表示的是一种示例性测试片的底视图，其中包含有部分剖视部分。图2A表示的是大体上与图2中所示测试片相同的另外一个测试片的包括局部剖视部分的底视图，二者的区别只是图2A中所示测试片包括有一个中间层。

图3表示的是一个示例性测试片例如图2中所示测试片3的局部透视图。

图4表示的是本发明中所述一种示例性测试片。

图5表示的是本发明中所述一种示例性测试片。

                         具体实施方式

本发明提供一种测定生理样本中至少一种被分析物浓度的测试片以及制造和使用这种测试片的方法。这种测试片具有由一疏水性屏障界定的多个反应区。每个反应区中的试剂组合物可以是相同的也可以是不同的。另外，每个反应区可具有一个单独的液体通道，或者两个或两个以上反应区的单独通道可以合并成一单一通道。使用时，样品施涂于所述测试片上，即可探测到一个信号并通过这个信号关联出样品中的被分析物含量。本发明还提供了使用热转移技术施涂疏水性屏障以制作这种测试片的方法。最后，本发明提供了用于实施该方法的试剂盒。

在描述本发明时，应理解为本发明不仅仅局限于所描述的特定实施方案，其形式可以是多样的。同样应理解为这里的术语只是为了描述特定的实施方案，并不是为了对其进行限制，本发明的保护范围由后面权利要求进行限定。

在涉及数值范围时，应理解为对于这个范围内上限和下限之间的每一个插入值和任何其它处于所述范围内的规定值或插入值都包括在本发明中，除非上下文另外有明确规定指出插入值要为下限单位的十分之一。较小范围中的上限和下限可以被独立地包括在较小范围内，这种情况也包括在本发明中，但是这易受到规定范围内任何特别排除性限制的影响。当规定的范围中包括一个或者两个界限值时，排除所述两个界限值中的任何一个界限值的范围也包括在本发明中。

除非另外定义，这里使用的科技用语和本领域的普通技术人员所公知的意思相同。虽然类似或相当于这里描述的方法和材料也可以应用于本发明中，但是这里描述的是优选方法及材料。

必须指出，这里和后面的权利要求中使用的单数形式“一种”和“这种”除非另外明确的说明，都包括多个对象。因此，例如“一种测试片”实际包括了多片这样的测试片，“一种设备”实际指一个或多个设备以及该领域技术人员所公知的等效替换物，等等。

本发明中所提到的公开文献所公开的内容在提及该文献的地方可与本发明进行结合，并用来描述本发明的方法和/或材料。本发明提到的公开文献的内容均在本申请的申请日之前公开。这并不能说明本发明的技术在现有发明中已经采用。另外，本发明中所提及的公开日期可能和实际的公开日期不同，也许需要另外确认。

                             设备

概括来说，所提供的测试片具有分开、隔离的反应区域或者反应面积。特别地，这些测试片一般特征在于具有疏水区结合多孔基体界定的多个反应区。反应区所包含的试剂组合物通常包括例如被分析物氧化信号产生系统等一种或多种信号产生系统组分。

本发明可以采用任何方便的测试系统或者信号产生系统，所采用的特定系统将取决于例如下述各种因素：例如所关心的被分析物、以及所采用的如比色的、电化学的、放射性测量及其它种类的分析系统类型。现在将通过示例对本发明采用的信号产生系统进行描述，但示例并不是对本发明的限制。

如上所述，除了多孔的基体，本发明所述测试片还包括一种信号产生系统的一个或多个成分，该信号产生系统能产生一种与被分析物的存在相对应的可检测产物，而这种可检测产物则可以用于推断分析样品中所包含的被分析物的数量。在本测试片中，信号产生系统的一个或多个成分连接于，例如共价或不共价连接于多孔基体的至少一部分(也就是检测区或者反应区)，而在很多实施方案中则被连接于多孔基体的几乎整个部分。

在特定实施方案中，例如葡萄糖是所关心的被分析物，信号产生系统是一个被分析物氧化信号产生系统。被分析物氧化信号产生系统的意思是，在产生可以推断样品中被分析物浓度的检测信号过程中，被分析物被一合适的酶氧化从而产生一种被分析物的氧化物形式及对应的或者成比例关系的一定数量的过氧化氢。该过氧化氢依次地用于从一个或者多个指示剂化合物产生可检测产物，信号测量系统产生的这些可检测产物量，即所说的信号与初始样品中的被分析物含量有关。这样，本发明中所述测试片实施方案中所采用的被分析物氧化信号产生系统也就可以正确地被认为是以基于过氧化氢的信号产生系统为特征的。

如上所述，这些基于过氧化氢的信号产生系统包括一种可以氧化被分析物并且产生相应数量过氧化氢的酶，而相应数量则是指产生的过氧化氢数量和样品中存在的被分析物量成一定的比例关系。第一种酶的特定性质自然依赖于被分析物的特性，但是一般情况下都是一种氧化酶。这样的话，第一种酶可以是：葡萄糖氧化酶(被分析物是葡萄糖)，胆固醇氧化酶(被分析物是胆固醇)，乙醇氧化酶(被分析物是乙醇)，乳酸盐氧化酶(被分析物是乳酸盐)，等等。本领域的技术人员知道并且也在使用其它一些氧化酶，这些氧化酶会和上面那些感兴趣的被分析物或者其它的被分析物一起使用。在试剂测试片用于检测葡萄糖浓度的那些实施方案中，第一种酶是葡萄糖氧化酶。这种葡萄糖氧化酶可以取自于任何方便的来源，比如说一个自然存在的来源象黑曲霉或者青霉菌，或者是重组生产物。

这个信号产生系统的第二种酶，在过氧化氢存在的条件下对一种或多种指示剂化合物转化为一种可检测产物的过程能够起催化作用，而通过这种反应产生的可检测产物的数量则是和存在的过氧化氢的量成比例。第二种酶一般是过氧物酶，比较合适的过氧物酶包括辣根过氧化物酶(HRP)，大豆过氧化物酶，重组产生的过氧化物酶和具有过氧化活性的人造类似物，等等。可参见例如下述文献：Y.Ci和F.Wang；Analytica Chimica Acta，233(1990)，299-302。

指示剂化合物比如说基质，是过氧化物酶存在的条件下通过过氧化氢的作用形成或者分解得到的，这些指示剂化合物产生一种可以吸收预定波长范围内光的指示剂染料。优选的情况是，指示剂染料所具有的较强吸收能力的波长值不同于样品或者测试试剂所具有的较强吸收能力的波长值。这种指示剂的氧化形式可以是着色的、稍微着色的或者无色的最后产物，它可以用于证明薄膜做测试的一面颜色上的变化。那就是说，测试试剂能够通过一个有色区域漂白或者相反地通过无色区域显色的变化来说明样品中葡萄糖的存在。

本发明中使用的指示剂化合物同时还包含了单一成分的产色基质和双成分的产色基质。单一成分的系统包括芳族胺，芳香醇，连氮，联苯胺如四甲基连苯胺-氯化氢。合适的双成分系统中一种成分是MBTH，MBTH的衍生物(例如参见序列号为08/302,575的美国专利申请中所公布的那些衍生物)或者4-氨基安替吡啉，而另一种成分则是芳族胺，芳香醇，共轭胺，共轭醇或者芳香醛或者脂族醛。典型的双成分系统是结合有3-二甲氨基苯甲酸(DMAB)的3-甲基2-苯并三唑酮腙盐酸盐(MBTH)和；结合有3，5-二氯-2-酚磺酸(DCHBS)的MBTH；结合有8-苯氨基-1萘磺酸铵(ANS)的3-甲基2-苯并三唑酮腙N-磺酰基苯磺酸一钠(MBTHSB)。在特定的实施方案中，优选耦合有MBTHSB-ANS的染料。

然而在其它的实施方案中，可以采用生成荧光检测物(或者在荧光背景下可以是可检测的非荧光物质)的信号产生系统，比如象Yosuke Ohkura和KiyoshiZaitsu的文章中所描述的：“用于辣根过氧化物酶的新的荧光底物：快速灵敏地分析过氧化氢和过氧化物酶的方法”，该文章收录于Analytical Biochemistry(1980)109，109-113。

一般对于比色分析来说，样品允许和信号产生系统的成分相作用从而产生一可检测产物，它的量和样品中的初始含量成比例关系。检测产物的量，也就是信号产生系统产生的信号，可以被测定出并由此关联出初始样品中的被分析物含量。如特定实施方案中所描述的，采用自动化仪表即光学仪表执行上述提及的检测过程以及相关步骤。上述的反应、检测和相关步骤以及执行同样功能的仪器在美国专利4734360；4900666；4935346；5059394；5304468；5306623；5418142；5426032；5515170；5526120；5563042；5620863；5753429；5573452；5780304；5789255；5843691；5846486；5968836和5972294中会进一步描述，这些专利公开的内容结合至这里可做参考。

在特定的实施方案中，本测试片甚至是测试试剂组合物可以进一步包括一种用来抑制检测过氧化氢成分的成分，并且可以可选择地再包括一种能够使固体，如红血球，在基体中俘获从而有效去除生物流体中固体的单独成分。现在对每一种这样的双成分进行更详细的描述。

如上所述，这种可选择的抑制成分延迟了过氧化氢和指示剂的反应过程，如通过减少过氧化氢或者通过减少氧化酶指示剂来造成延迟结果。原则上对于一种抑制剂有几种不同的操作模式，第一种：抑制剂和指示剂竞争从而降低了指示剂中颜色变化的速度。第二种：抑制剂可能是非竞争性的，因此在指示剂中任何实质性的颜色变化之前，相当大一部分的指示剂都要被消耗掉。抑制剂还可能呈现其它种类的工作模式。在很多实施方案中，本发明中所采用的抑制剂都是非竞争性的。

2，3，4-三羟基苯甲酸、没食子酸丙酯、3，4二羟基肉桂酸、3，4-二羟基苯甲醛，没食子酸，5，6-二氨基尿嘧啶，抗坏血酸，异抗坏血酸均是合适的抑制剂。然而如果使用了抗坏血酸，它会在溶解状态氧化，因而为了允许在试剂上涂覆必须使它稳定。合适的稳定剂主要是醇，比如像乙基、甲基或者丙基醇，其中最感兴趣的是乙醇，尤其是其浓缩的溶液，即50％或者更高浓度的乙醇溶液。

虽然使用一种各向异性膜可以渗漏掉红血球，同时还能使它们离开基体上用于测试的一侧，但是还是可如上所述选择性的采用一种分离物质。这种分离物质可以从包含红血球的流体中，例如全血中，通过隔离基体中红血球的方法生成一种相对干净、无色的流体。直接用在本发明中的分离物质包含但并不仅限于聚乙二醇，聚(甲基乙烯基醚/马来酸)酐，聚丙二醇，聚苯乙烯基磺酸，聚丙烯酸，聚乙烯醇和pH值大约在0.4-0.8之间的聚乙烯基磺酸。这些基体中的分离物质的存在量还会依据它们电荷数、分子量、基体中的其它成分、基体的pH值、孔的大小以及染色之后基体的残留水分而改变。这些参数由该领域内的技术人员很容易决定。例如，当分离物质(比如来自BASF，Wyandotte，Mich.的PPG-410)采用聚丙二醇时，其重量体积比一般为20-30％(w/v)，优选重量体积比为8-10％w/v。其它分离物质的重量体积比可以为2-30％w/v左右。聚合的分离物质可以浸渗或者埋入基体内，或者在制造时烧铸到膜里面。某些水溶性盐也可以影响血分离。适合用于分离血成分的盐可以是柠檬酸盐，甲酸盐，硫酸盐，也可以是一些特定的酸，如氨基酸，柠檬酸，植酸，苹果酸(例如参见授权于M.C.Fetter的于1971年1月5日颁布的第3552928号美国专利)。包含分离物质的一个优点是：可以大体将例如红血球等固体成分从生物流体中去除掉，这样在测试部位就会产生更少的会使测试试剂所发生的着色变化变模糊的背景颜色。

也可以将其它的成分植入基体中用来增强着色效果，增加试剂条纹的清晰度，同时还可以保持基体的均匀性和整体性。例如，测试试剂可以包含盐或者缓冲剂用来帮助分离基体中的染料。这样的缓冲剂可以包含，如存在于溶液中0.01M左右到1.0M左右的柠檬酸盐，优选约1.0M的。当然也可以使用一些别的缓冲剂。

也可以使用一些使基体亲水的化合物或者能够充当稳定剂的化合物，如水解蛋白。这样的化合物包括但是并不仅限于，如牛血清白蛋白、多肽和低分子质量的蛋白质，这种蛋白质可以是Crotein SPA(来自纽约州纽约市的CRODA公司)。这些使用的化合物其浓度，可在1mg/mL左右到100mg/mL左右。如果使用Crotein，其浓度优选为30mg/mL左右。

其它的稳定剂和防腐剂也可以包括在基体的涂层中。例如乙二胺四乙酸(EDTA)，二乙撑三胺五乙酸(DTPA)及相关的化合物，其浓度可在约0.01mg/mL到约10mg/mL范围内。防腐剂的目的之一就是用来稳定抑制剂。

一些指示剂可能会有迁移到基体里的不良趋势。当使用这些指示剂时，需要包含一种离子配偶剂用来避免这种迁移。例如市售的Polyquart(H)(Ambler，Pa.的Henkel公司)，其为聚乙二醇衍生物，在促进指示剂和其它基体取代物之间的离子配偶方面非常有用。

当被分析物的存在是通过形成颜色(例如象MBTHSBANS)进行指示时，可以添加一些表面活性剂用来增加颜色的亮度、增强与周围不着色区域的对比度。

在本发明中还可以使用一些有机溶液，如果这些有机溶液能和基体或者测试试剂组合物相容的话，它们还可以包含在基体测试试剂的配制剂中。合适的有机溶液可以包括氯仿、丙酮、醇、二氯甲烷、二乙醚、石油醚、乙腈或者其混合物。在实现本发明时，优选70％的乙醇水溶液。

当本测试片具有由疏水区域界定的多个反应区时，这种反应区可以相同或者不同，而反应区之间的不同会对反应区中的测试系统的浓度即测试系统一个或者多个成分的浓度产生影响，也会对一个反应区内的测试系统的类型即待测定的被分析物(一个或者多个反应区可以决定被分析物的存在与否和被分析物的浓度情况，这就可以用来和其它反应区中的被测被分析物相区别)产生影响，等等。本测试片一般情况下都至少包括两个反应区，在本发明中测试片上反应区的数量常常从2变化到25，通常是2到15，最常用的是2到10。一般而言反应区按照任意方便的习惯放置在测试片上，很多实施方案中它们以一行排列，即沿着测试片的中心一个挨着一个，如图2所示。为了进一步描述本发明，现对本测试片不同的成分和结构做具体描述。

用于本测试片中的基体或膜(这里可以交替使用)是一种惰性的多孔基体，它可以对下面描述的信号产生系统的不同成分提供载体，也可以对信号产生系统即指示剂生成的产色物质或光吸收物质提供载体。惰性的多孔基体可设计成用来给生理样品如血液施涂提供定位，和为检测信号产生系统的指示剂所生成的光吸收产物提供定位。这样，惰性多孔基体可以允许含水流体流过，同时还可以提供足够多的空位用于信号产生系统发生化学反应。很多不同的多孔基体都可用于不同的被分析物检测分析，这些基体可以在材料、孔大小、尺寸等方面有所区别，具有代表性的基体在下述美国专利中均有描述：4734360；4900666；4935346；5059394；5304468；5306623；5418142；5426032；5515170；5526120；5563042；5620863；5753429；5573452；5780304；5789255；5843691；5846486；5968836和5972294，这些专利公开的内容引入在这里可做参考。原则上，多孔基体的特性对本测试片并不是决定性的，因此可以根据其它的因素进行选择，包括根据用来读取测试片仪器的特性或者便利性等因素进行选择。这样基体的尺寸和孔隙将变化很大。典型情况是，一个厚度小于约200微米的基体，其厚度常常在约115到150微米之间，更常采用的厚度是在约130微米到140微米之间，其中基体可以存在孔隙梯度也可以不存在孔隙梯度，比如在样品施涂区域或其周围是大孔，而在检测区则是小孔。在某些实施方案中，典型的基体长度从6mm左右到65mm左右，一般在10mm左右到50mm左右的范围，最常用的是10mm左右到40mm左右的范围，而典型的基体宽度则是从5mm左右到20mm左右，一般是7mm左右到20mm左右的范围，最常用的是7mm左右到15mm左右的范围。制造基体的材料可以变化，它包括但不仅限于聚合物，如聚砜、聚酰胺、纤维素、吸水纸等等，这些材料可被官能化以为信号产生系统的不同成分提供共价或者非共价连接，或者也可以不被功能化。

如上所述，测试片特别是测试片的基体上存在着多反应区。也就是说基体包括多于一个的相同或者不同的反应区，即至少有两个反应区可以是不同的。在本发明的某些实施方案中，测试片中所有反应区中的测试试剂系统是完全相同的，如在多用途测试片中。在另外的实施方案中，如测试片用来同时分析一组或多个不同的被分析物时，在不同的反应区中的试剂组合物是不同的。换句话说，测试片的不同反应区中存在着至少两种不同的试剂组合物，不同试剂组合物的数量可能和测试片的不同反应区的数目一样多。在某些其它实施方案中，试剂组合物在所有的反应区或者基本上所有的反应区中可以是相同的(即反应区分析相同的被分析物)，但是相邻反应区中抑制剂浓度可以逐步增加或者减少。如果葡萄糖浓度足够大以至于可以克服在特定反应区中抑制剂的水平(如果使用的话)时，反应区中的测试试剂和所关心的被分析物如葡萄糖反应会产生一种可检测到的产物。由此，随着抑制剂量的增加，产生可以检测到的产物所需要的样品中葡萄糖的浓度就要更高。进一步的是，一个或者更多的反应区可以包括一种对照溶液来校验测试的完整性。更进一步地，一个或者更多的反应区还可以用做计时器以指示测试试剂和每个反应区中的被分析物的反应时间(例如参见美国专利5843691，该专利公开的内容引入这里可做参考)。

如上所述，不考虑反应区是否相同的情况下，基体还包含了一种疏水组合物或者是疏水屏障，此时放置在基体上的疏水组合物是用来界定反应区也就是界定反应区的面积的。具体而言，沉积在基体上，反应区受到由疏水组合物所形成的屏障的约束，即在每一个反应区周围都有一个疏水屏障。更进一步是，这些反应区是亲水性和吸水的，而在围绕在反应区周围的基体部分则是疏水性的。在很多实施方案中，除反应区外的基体上的其他表面都是疏水性的。疏水区域可以是基体表面的一层或者是疏水组合物涂层，或者可以合并到疏水组合物区中的基体内。

可以使用不同的疏水组合物在基体上建立疏水区，同时合适的成分也不会反过来干扰反应区中被分析物的测定反应。比如，示范性的疏水组合物包括但也不仅限于疏水性墨，如日本东京Alps Electric公司提供的市售疏水性墨。在疏水组合物为一层或者一涂层的实施方案中，疏水组合物的厚度通常为从1mm左右变化到20mm左右，一般情况下是3mm左右到15mm左右，最常用的是5mm左右到11mm左右。在很多实施方案中，是通过热转移技术将疏水组合物沉积在基体表面上，下面将会对其作详细的描述。

除了包含试剂的基体，本发明的测试片还包括一个支持基体的底层。底层可以用足够刚性的材料制成，在插入仪表时不会弯曲或者扭转。在很多实施方案中，这种载体或者底部成分是用如聚烯烃这样的材料制成的，比如是聚乙烯、聚丙烯或者例如Film 9962等可从3M，St.Paul.MN.获得的聚酯。该底层厚度一般为0.05mm左右到0.2mm。在特定的实施方案中，为了促进样品的转移，底层的一个表面可以是亲水性的，即为了促进样品进入到反应区，至少面对基体的那个表面是亲水性的，当然，该表面也可以不是亲水性的。

底层一般具有一个或者多个孔，通过这些孔可以将样品涂敷到基体的第一侧或样品侧并由此将样品配送到反应区。在某些实施方案中，每一个反应区对应着一个样品孔，而在其它的实施方案中，是通过一个样品孔把样品施涂到各个反应区中去的。如果底层通常是不透明的话，那么需要在距离样品孔一个合适距离的地方放置一个或者多个透明窗部件，从这些窗中可以观测到样品以保证足够多的样品施涂于测试片上。底层也可以包括出气孔，这些出气孔和分析区域对准以便于均匀地填充分析区。

在本发明的某些实施方案中，可以设置一个放置在底层和基体中间可选择的粘在其间的中间层，即中间层的两侧有粘合剂或者类似的东西。中间层通常为一热塑性塑料片，一般是一聚酯片。在一个实施方案中，该中间层上有切掉部分可以用来引导样品进入每个反应区。在中间层上的通道和反应区对准，这样每一个反应区都会被中间层的壁完全包围。在另一个使用中间层的实施方案中，中间层有一个延长的狭小通道可以用来引导样品通过基体表面进入到反应区中。

为了完成这种测试片，可以提供一个可选的顶层或者上面层，即可以在基体的测试侧覆盖一层，而在这样的顶层上可以有一些和反应区对准的孔。这些孔可以让颜色变化可以被看见，同时也可以允许氧气进入反应区。顶层可以用足够刚性的材料制成，以致在插入仪表时不会引起不当的弯曲或者扭转。在很多实施方案中，这种载体是用如聚烯烃这样的材料制成的，比如是聚乙烯、聚丙烯或者聚酯。该顶层厚度一般在约0.05mm到0.2mm的范围内。

这样的测试片可以进一步包括一种粘合剂从而使得测试片的成分保持在一种适当的结构。例如，粘合剂可以放置在底层和基体之间和/或者基体和顶层之间。当然为了不干扰测量反应的被分析物，粘合剂仅限于非反应区。

下面根据附图进行描述，其中同样的数字代表同样的特性或者成分。图1表示的是本发明中所述基体2的一个示例。基体2包括一个用于施涂生理流体的样品侧12和一个用于采用例如通过光学检测颜色变化的方法或者通过光学测量方法来测量被分析物的测试测14，其中所述光学测量指的是测量光线吸收情况。如上所述，典型的基体2包括多孔(没有画出)，这些孔可以有一梯度变化如在样品侧12的孔相对比较大而在测试侧14孔尺寸则减小。

图1中表示出了5个被灰色阴影表示的由疏水屏障所界定的反应区20-24，其中反应区可以包含上面所述的同一的或者不同的测试试剂。例如上面指出的，在某些实施方案中，每一个反应区可以包含比其前面部分更多的抑制剂，同时一个或者多个反应区可以包括一种对照溶液，还有一个或者多个反应区可以适合用来测量不同于其它一个或者多个反应区中被分析物的被分析物。因此，测试试剂可以施用于基体的整体区域或者也可以单独施用于反应区。例如，可以将基体浸入测试试剂中或者将试剂涂在在测试片的特定区域。在本发明的某些实施方案中，测试试剂组合物可以施用于平行部分，比如图1A中所示的a、b、c、d和e平行部分。这样的话，一个单独的测试区可以位于每一个平行带中，每个反应区由疏水性屏障也即一种疏水组合物(所示阴影)界定，如图1B所示。

无论测试试剂是否包括整个基体或者试剂只在基体的特殊区域，如上所述的基体还包括了一种上面描述的疏水组合物，如图中阴影部分所示。参见图1，疏水组合物位于基体反应区周围，从而可以在反应区周围建立一个疏水屏障。也即，疏水屏障覆盖了基体即基体的样品侧，实际上是除了反应区以外的基体的每个部分。在特定的实施方案中，疏水组合物位于上面所述基体上的除了用来将样品输送到反应区中去的一个区域外的其它区域。换句话说，可以用疏水组合物建立一样品或流体通道用于向基体中的反应区输送样品。在其他特定实施方案中(图中没有示出)，疏水组合物可以不完全是除反应区以外基体上的所有地方，而可以只是在邻近反应区的那部分区域，以界定反应区。

图2表示的是一种示例性测试片3的底视图，其中包含有部分剖视部分，图中描述了基体2的样品侧12和覆盖在底层30上面的可选择吸收层16和18。如上所述，一个包括在基体的测试侧的顶层或者上面层(图中没有示出)可以用来支持基体和吸收层。典型的可选择吸收层16和18位于基体的边缘处以用于吸收过量的生理流体。图2表示了6个亲水区或者是没有疏水组合物的区域，分别用反应区20-24和计时器T表示，这个计时器T完全和美国专利5843691中公布的计时器相同，该专利所公开的内容引入这里可做参考。底层30也包括样品孔S，图示其在底层的中心但是也可以设置在其它地方。样品通过样品孔S引入并被引导到反应区和可选择的计时器，过多的样品会被可选择的吸收层16和18吸收。如上所述，可以存在多于一个的样品孔，例如可以在每个反应区有一个样品孔。可以通过底层的一个亲水表面来促进样品的输送。

如上所述，样品还可以沿着一个通道如基体或者其它的亲水通道(图中没有示出)导入，同时可以通过一个底层(如果不关心大样品尺寸的话，毛细管状通道可以被忽略)的亲水表面来促进样品的导入。在本发明的某些实施方案中，每一个反应区都要有它自己单独的通道。这样的话，在这些实施方案中不同通道的数目和测试片中不同反应区的数目相等。在其它的实施方案中，在从测试片出口之前的两个或者多个通道可合并到一个单独的通道中，这样的话流体可以从一个单独的样品进口孔或者端口中被导入到两个或者多个不同的反应区中。换句话说，一个单独的通道可以分支为两个或者更多的进入测试片中不同反应区中去的子通道。这种通道可以通过不存在疏水组合物和或在基体中包括物理凹槽而形成。换句话说，样品可以通过下面的一种或多种方式引入到一个或者多个反应区中：亲水性样品表面即底层表面、在中间层中被切掉部分、基体中和/或底层表面有凹槽或基体本身的亲水通道，而这些通道则可以通过不存在疏水组合物或加疏水物质而形成。

图2A表示的是大体上与图2中所示测试片3相同的另外一个测试片的包含局部剖视部分的底视图，二者的区别只是图2A中的测试片有一个位于底层30和基体2之间的中间层500。中间层500中有一些用来适配反应区通道口的切掉部分，同时还有一个通道502用来引导样品进入到反应区中。在这个特定的实施方案中，基体2具有位于通道502中的疏水组合物，但是所述基体的区域也可以不具有疏水组合物。更进一步来说，底层12的表面可以是亲水性的(图中没有示出)，且可以用来促进样品的导入。

底层30进一步还包括了一个或者多个可选的透明窗口(图中没有示出)，由此可以核实反应区中已经施涂了足够量的样品。

图3是一个本发明中所述的例如图2中所示的测试片3的局部放大透视图，它通过底层30描述了反应区20，21和22的部分，这些反应区被中间层500的指状物所分隔。可选的粘合层500a把中间层500和底层30、基体2连接起来。为了促进样品导入到反应区中，底层30正对着基体的面可以是亲水性的。如上所述，基体2包括了由与基体相结合的疏水组合物所界定的三个反应区20，21和22。如图所示，由疏水组合物界定了反应区，而包含测试试剂的反应区是亲水性的，而除了反应区以外的基体部分则是疏水性的。如上所述，出气孔13和17有助于样品流入测试片。图3中的测试片3还包括了可选的顶层40，该顶层可以进一步包括一个或者更多的孔如孔42，这些孔和反应区成一直线以便观察亲水反应区中的颜色变化，同时这些孔也可以提供变色反应所需要的氧气。可选的粘合层40a用于把顶层40粘贴到基体的测试侧，粘合剂的设置应该不会干扰反应区的反应过程。如上所述，可以通过眼睛观察或自动仪器如光度计检测测试试剂和我们所关心的被分析物的生成物，并通过该生成物的量推导出被分析物的量。

                           使用方法

本发明还提供了检测生理样品中某种被分析物是否存在和/或被分析物浓度或被分析物组的方法。通过本方法可以检测各种不同的被分析物，其中典型的被分析物有葡萄糖、胆固醇、乳酸盐、酒精等。在很多实施方案中，本方法被用于判断生理样品中葡萄糖的浓度。虽然原则上本方法可以用来判断各种不同生理样品如尿、眼泪、唾液等中被分析物的存在与否或者被分析物的浓度情况，但是该方法特别适于检测间质流体、血或者血级分中被分析物是否存在或被分析物的浓度情况，更适合应用于全血测试中。

在进行该方法的操作时，第一步是把一定量的生理流体引入到上面所述测试片的至少一个反应区中。因此，样品不被疏水组合物即基体的疏水区域吸收或者不被充分吸收，而是直接进入反应区并且被反应区吸收。在很多实施方案中，样品同时施涂在测试片的所有反应区上。然而对于多用测试片即可以多次使用的测试片，样品可以在不同的时间施涂在各个反应区上。样品还可以通过底层的亲水面和/或者一个或多个通道进行导入或者转移，这种情况下这些通道是不包括疏水组合物的。

导入测试片中的生理样品的数量比如说血可以发生变化，但是一般是从5毫升左右到25毫升左右，通常是10毫升左右到15毫升左右，同时进入到反应区中的样品量也可以变化，但是一般是从1毫升左右到5毫升左右，通常是2毫升左右到3毫升左右。可以通过任何方便的方式把样品导入反应区，比如样品可以注入到反应区也可以通过毛细管导入反应区等等，只要方便即可。

随后样品在一个或多个反应区中与信号产生系统的成分发生反应，产生一种和样品中被分析物初始含量成一定比例关系的可检测产物。然后可以检测这种可检测产物的量即信号产生系统产生的信号，并把这种产物的量和初始样品中的被分析物量相联系。这个检测和联系过程可以通过眼睛观察或者仪表测量完成，所述仪表在下述序号的美国专利申请中均有描述：4734360；4900666；4935346；5059394；5304468；5306623；5418142；5426032；5515170；5526120；5563042；5620863；5753429；5573452；5780304；5789255；5843691；5846486；5968836和5972294，这些专利公开的内容引入这里可做参考。

在特定实施方案中测试片的反应区可用于不同分析，每一个反应区可以从测试片的剩余部分中分离出来，例如在使用之后及在使用下一个反应区之前从测试片中切下使用过的那个反应区。该过程如附图4和图5所示，图中在使用下一个反应区之前通过切口52将使用过的反应区去掉。

                           制造方法

本发明还提供了本发明测试片的制造方法，该测试片具备一个基体，基体上包括了由疏水屏障或者疏水区界定的反应区。也即所述的疏水区包围了测试片的反应区周围。由此，本发明可以提供在测试片基体上沉积或者施涂例如疏水性墨等疏水组合物的方法，这种基体已经在上面描述过，这里就不再重复了。本方法的一个特性是按预先确定的图案，使用热头把疏水组合物沉积在基体的一个表面上，这种图案包括没有疏水组合物的区域比如一个或者多个反应区或把样品引入反应区中的通道。

在本方法的特定实施方案中，以预先确定的图案，采用热转移技术如热转移打印机，把疏水组合物如疏水墨输送到基体之上，即在基体上建立反应区，这些热转移打印机是常规印刷和文档制作领域所熟知的。这些技术领域中众所周知的是，典型的热转移打印机至少包括下列元件：(a)一个热头，(b)一条墨带，(c)一种转移工具，比如一条中间转移带等(c)一个鼓或压力辊，和(d)一个或者多个加热器。热转移打印机和它们的生产方法以及使用方法在下述美国专利中均有描述：4544291；4568210；4725853；4743920；4770554；4772144；4780729；4831387；4887923；4928134；4981381；5030967；5476330和5820284，这些专利中公开内容引入这里可做参考。

适用于本发明的热转移打印机一般有以下特性。典型的热头一般有一个在200dpi左右到600dpi左右之间的线头。而带子一般包括一个厚度在3微米左右到5微米左右的作为带基薄膜的PET薄膜，还有两个位于带基薄膜之上的层，如作为释放层的蜡层和疏水组合物层。在本方法中采用多种疏水组合物，用来在基体上建立疏水区，这里合适的疏水组合物不会反过来干扰反应区中被分析物的检测反应。例如，示例性的疏水组合物包括但不限于疏水墨如日本东京AlpsElectric公司生产的市售疏水墨。典型的疏水组合物层的厚度在1mm左右到20mm左右的范围内，一般是在3mm左右到15mm左右，最常用的是在5mm左右到11mm左右的范围，该层可以采用任何一种颜色或者多种颜色，但是典型的是用单色或者金属光泽(即采用金属材料如铝的色染料)。

在热头里，当一个信号选择性地施加在一个或者多个加热元件上，把疏水组合物转移到转移工具上时，来自于带子的疏水组合物会被产生的热融化。一个或者多个加热元件往往能够达到至少40℃左右的温度，一般情况下是至少50℃左右，最常见的是55℃左右，同时加热元件可承受的温度可以高达70℃或者更高的温度。包括MD100型热打印机在内的(可以从日本东京的Alps Electric公司获得)多种热转移打印机均可从市场上获得。

在实施本发明中所述的通过热转移打印机把疏水组合物沉积于基体上的方法时，打开电源，电流就会通过加热器来加热中间转移滚筒等和鼓。预先确定的脉冲也会间断地施加到打印头的每一个加热元件上，用来提高热头的温度。典型的情况是打印头、转移工具和鼓都被控制在同一温度左右，这个温度一般是在40℃到70℃左右的范围，常用的是50℃左右到60℃左右，最常用的是在55℃左右到58℃左右。

接下来，疏水组合物的带子有效地与欲施涂疏水墨的测试片基体对准。热头压在中间转移滚筒上，墨带位于两者之间。几乎在同一时刻，鼓压在中间转移滚筒上。在这个时候，热头的压力是150g/cm²左右到200g/cm²左右，而鼓的压力则是1Kg/cm²左右到10Kg/cm²左右。

当加压过程完成后，中间转移滚筒由马达驱动旋转而同一时刻疏水组合物依靠中间转移滚筒和墨带之间的摩擦力移去。鼓依靠鼓和中间转移滚筒之间的摩擦力和鼓和基体之间的摩擦力旋转，或者也可以依靠鼓产生的摩擦力。在打印操作中，疏水组合物带子通过马达单独缠绕。

预先确定的打印脉冲施加在与每部分旋转同步的热头的加热元件上，而带子的疏水组合物就被融化并且依靠每一个加热元件产生的热量按照打印信号进行转移。这种熔融状态的被转移的疏水组合物进一步地旋转，同时依靠转移工具的热量保持熔融或者半熔融状态。

在压力下，这种熔融状态的被转移的疏水组合物通过中间转移滚筒和鼓之间的接触、鼓和中间转移滚筒的热效应及其它们的绝缘效应被再次转移到位于两者之间的基体。

以预先确定图案，当疏水组合物被转移到基体上后，即被转移形成没有疏水组合物的反应区(即由疏水组合物形成的屏障所界定的反应区)，热头和鼓沿一定方向移动以释放压力，同时具有由所沉积的疏水组合物界定的反应区的基体也和鼓分离。

如上所述，根据与热打印机有效结合的一个软件程序，疏水组合物以预先确定的图案被沉积在基体上，这些图案至少包括反应区，当然也可以包括别的特性比如通道等，这些图案的沉积采用的是传统印刷技术和文档制作领域所熟悉的技术。换句话说，这些疏水组合物如疏水墨以图案方式被沉积在基体表面，这样的话在基体上就有一些特定区域或者预先确定的不具有疏水组合物的区域，如上述的反应区。更确切的说，反应区的边界是由沉积在基体表面的疏水组合物所形成的。

在本发明的某些实施方案中，疏水组合物被沉积在遍涂测试试剂的基体上。例如，整个基体可以包括测试试剂，但是疏水组合物可以沉积在测试试剂上的一部分上从而确定出一个较小的特殊的测试试剂区，即一个反应区。在其他实施方案中，沉积疏水组合物的区域将不包括测试试剂。在该实施方案中，测试试剂可以在疏水组合物沉积在基体上之前或者之后施涂于基体之上，甚至也可以在同一时候沉积，比如通过上面所述的热转移施用方法。

                           试剂盒

本发明还提供了用于实施本方法的试剂盒。本发明的试剂盒至少包括一个如上所述的测试片。试剂盒还可以包括多个这样的测试片。该试剂盒进一步还包括一个用来获得生理样品的工具。例如生理样品是血液，本试剂盒还可包括一种用来采集血液样品的工具如用来戳手指的小刀，一个矛形作用工具等。另外，该试剂盒可以包括一种对照溶液，如一种保持标准葡萄糖浓度的葡萄糖对照溶液。在某些实施方案中，该试剂盒还包括一个上述的可以用来检测信号产生系统所产生信号的仪器，而该仪器则是用来在样品施涂后把检测到的信号和样品中的被分析物量联系起来。最后，所述试剂盒还可以包括一些可以使用测试片来检测生理样品中至少一种被分析物存在情况及其浓度的指令。这些指令可以打印在衬底如纸或塑料以及其它材料上。还可以将指令做成插入包贴在试剂盒上的容器或其中的部件上(即置于包装或子包装中)等方式。在其它的实施方案中，这些指令作为电子存储数据文件储存于如光盘、磁盘等计算机可读的存储介质上。

从上面的描述和论述中很明显知道，上述的发明提供了一种具有多个反应区的测试片，其中反应区的污染可以被最小化或者消除。上述的发明具有很多优点，包括方便使用、精确度高、准确度高、可再现、制造方便和成本低廉。本发明对本领域技术具有显著贡献。

本说明书中引用的所有出版物和专利文献均以参考文献的方式结合到本发明中，其中每一篇出版物及专利文献也均以具体的形式结合到本发明中以作为参考文献。引用在申请日之前的出版文献只是为了借助其公开的内容来说明本发明，但这并不表示它们已公开了本发明的实质性内容。

为了清楚地理解本发明，在前面的叙述中已经通过附图和举例方式对本发明的细节进行了描述，但显而易见的是本领域的普通技术人员在本发明的提示下可以对本发明进行一定的改动和更正，但这些都不会脱离本发明的实质或下述权利要求的范围。

Claims (12)

1.一种用来检测生理样品中至少一种被分析物浓度的测试片，所述测试片包括：

(a)多个反应区，其中每个所述的反应区由疏水屏障界定，和

(b)一种置于每个所述反应区中的试剂组合物。

2.如权利要求1所述的测试片，其特征在于所述疏水屏障包括疏水墨。

3.如权利要求1或2所述的测试片，其特征在于每一个所述反应区包含相同的试剂组合物。

4.如权利要求1或2所述的测试片，其特征在于至少两个所述的反应区包含不同的试剂组合物。

5.如权利要求1至4所述的测试片，其特征在于至少两个所述的反应区可以用来分析相同的被分析物，其中所述的至少两个反应区所包含的测试试剂组合物中的至少一种组分具有不同的浓度。

6.如权利要求1至5所述的测试片，其特征在于至少一种所述的试剂组合物包含至少一种可利用基于被分析物氧化的信号产生系统的成分。

7.如权利要求1至6所述的测试片，其特征在于所述测试片以一种仪表的形式出现。

8.如权利要求1至7所述的测试片，其特征在于各个所述的反应区都具有自己的用于所述反应区与外部环境之间的流体连通的流体通道。

9.如权利要求1至7所述的测试片，其特征在于至少两个所述反应区具有可合并成为一个单一通道的流体通道，以提供所述反应区与所述测试片外部环境之间的流体连通。

10.一种用来检测生理样品中至少一种被分析物浓度的方法，所述方法包括：

(a)将所述的生理样品施涂于权利要求1至9中任一权利要求所述的测试片上；

(b)检测所述试剂组合物与所述生理样品反应所产生的信号，和

(c)通过所述检测到的信号关联出所述生理样品中所述的至少一种被分析物的量。

11.一种用于制造测试片上的多个反应区的方法，所述方法包括：

(a)将热头与测试片基体对准放置；

(b)以一种足以将一定量的疏水组合物转移到所述基体上的方式起动所述热头；

由此所述疏水组合物被沉积在所述基体上以生成一种包含多个反应区的测试片，其中各个反应区由所述的疏水组合物所界定。

12.一个用于检测生理样品中至少一种被分析物的浓度的试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)至少如权利要求1至9中所述的至少一种测试片；和

(b)用于利用所述测试片来检测生理样品中至少一种被分析物浓度的指令。

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