CN1378455A - 用双萜三环氧化物作为抗增生药 - Google Patents

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Abstract

在治疗过度增生性疾病的组合治疗中使用双萜三环氧化物与抗增生药的组合物。感兴趣的抗增生药包括有杀肿瘤细胞活性的药物以及免疫抑制剂,和种种减少靶组织中细胞增殖的其它药物。协同性的组合提供了相当的或改善的治疗效果,同时降低了不利的副作用。

Description

用双萜三环氧化物作为抗增生药
                            背景
尽管开发了新的化疗药物，但是实体瘤的治疗发展缓慢且有偶然性。进行成功的化疗有许多障碍，包括抗药性、对细胞程序死亡的抗性以及肿瘤抑制基因的失活。一些人类癌症在治疗开始前即有抗药性，而其它癌症的抗药性在连续几轮化疗后才出现。
多抗药性是抗药性的一种类型，其特征是功能和结构不相关药物的交叉抗性。受多抗药性影响的一般药物是阿霉素、长春新碱、长春碱、秋水仙素、放线菌素D和其它的药物。至少有一些多抗药性是复合表型，该表型与称为Mdr1蛋白(也称为P-糖蛋白)的细胞膜药物流出转运蛋白的高表达有联系。这种膜“泵”的特异性广，起到将大量的化学上不相关的毒素从细胞中去除的作用。
癌症治疗中的另一因素是靶细胞对细胞程序死亡的敏感性。许多通过在高浓度削弱细胞新陈代谢而将细胞杀死的细胞毒性药物能在非常低的浓度启动敏感细胞的细胞程序死亡。肿瘤细胞可获得对细胞程序死亡的增加的敏感性，这种敏感性是造成恶性转化的遗传改变的副产物，但大多数肿瘤倾向于获得消除这种增加的敏感性的其它遗传损伤。在呈递时或在进行治疗性尝试后，肿瘤细胞对细胞程序死亡的敏感性可能变得比活的正常分裂的细胞小。采用常规的化疗方法一般不能治愈这种肿瘤。虽然减少了药物的摄取、胞内药物定位的改变、解毒的加速和药物靶的改变都是重要的因素，由于缺陷性细胞程序死亡应答的多效抗性也是癌症中抗药性的重要的类别。
一种重要的肿瘤抑制基因是编码细胞蛋白质p53的基因，该蛋白质是控制细胞增殖的53kD的核磷蛋白。p53基因的突变和此基因所在的17p染色体的等位基因的缺失是人恶性肿瘤中最常见的改变之一。p53蛋白在进化中高度保守，并且在大多数正常组织中表达。已显示野生型p53涉及细胞周期、转录调节、DNA复制和细胞程序死亡的诱导的控制。
已知p53等位基因的各种突变体，在这些突变体中，一个碱基取代导致具有不同的生长调节特性的蛋白质的合成，并最终导致恶性肿瘤。实际上，已发现在普通的人癌症中，p53基因是突变最频繁的基因，特别是在与吸烟有关的癌症中。也记录了乳腺癌中p53的超表达。
寻找新的治疗性干预的一个领域是传统的中医。这些传统的药物中有一种得自卫矛科(Celastraceae)的灌木样藤本植物雷公藤(Tripteryguim wilfordii Hook F)。得自这种植物的许多制品已在中国南方使用多年，用来治疗关节炎和其它自身免疫疾病。1978年，通过氯仿甲醇抽提从雷公藤的根部的木质部生产得到一种抽提物，称之为T2。中国文献中的报道描述了使用T2对超过750位患有各种自身免疫疾病的患者的治疗。
中国的经验表明，作为免疫抑制剂，约1mg/kg的日剂量的T2是安全和有效的。在中国，已使用许多动物模型进行了急性和慢性的毒性研究。据报道小鼠中的LD50约为150mg/kg。毒性研究表明，T2具有合理的安全指数，应该可以安全地给予患者服用。
化疗药物的开发与避免抗药性和对细胞程序死亡的抗性的问题的药物的组合对癌症治疗具有极大的利益。相关文献
Gu等人〔(1995)，Int J Immunopharmacol，17(5)：351-6〕报道了雷公藤中免疫抑制性化合物雷公藤内酯和雷公藤羟内酯的分离、纯化和鉴定。Yang等人〔(1998)，Immunopharmacology，40(2)：139-49〕提供了表明免疫抑制剂雷公藤内酯抑制抗原或促分裂原诱导的T细胞增殖、诱导T细胞杂交瘤和外周T细胞的细胞程序死亡的证据。Shamon等人〔(1997)，Cancer Lett，112(1)：113-7〕评估了雷公藤内酯抗肿瘤的潜力。Tengchaisri等人〔(1998)，Cancer Lett.，133(2)：169-75〕评估了雷公藤内酯在体外和仓鼠中抗胆管癌生长的抗肿瘤活性。
Lee等人〔(1999)，J Biol Chem，274：(19)：13451-5〕描述了PG490(雷公藤内酯)与肿瘤坏死因子α相互作用，能诱导肿瘤细胞的细胞程序死亡。Qiu等人〔(1999)，J Biol Chem，274(19)：13443-50〕发现，雷公藤内酯在激活的T细胞的嘌呤-盒(purine-box)/核因子的水平上抑制T细胞白介素-2的表达和NF-κB的转录激活。
                           发明概要
提供双萜三环氧化物与抗增生药的组合物，以及使用该组合物治疗过度增生性疾病的组合治疗方法。该方法和组合物在多抗药性肿瘤细胞的治疗中特别有用。感兴趣的抗增生药包括在有杀肿瘤细胞活性的药物和免疫抑制剂，以及许多减少靶组织中的细胞增殖的其它药物。靶细胞在局部或全身与抗增生药物和双萜三环氧化物(如雷公藤内酯、雷公藤羟内酯等)或在生理条件下转变成这些化合物的前体药物接触。协同性组合物提供了相当的或改进的治疗效果，降低了不利的副作用。
                      附图的简要说明
图1描述了肿瘤细胞中PG490的细胞毒性。
图2描述了PG490诱导的细胞程序死亡的抑制。
图3阐述了PG490-88对预先建立的H23肿瘤的作用。
图4描述了PG490-88对预先建立的Dx5 MDR肿瘤的作用。
图5描述了雷公藤内酯对Mdm2基因表达的抑制。
图6描述了PG490-88和CPT-11用作体内治疗肿瘤的协同性组合物。
                     具体实施方式的详细描述
将双萜三环氧化物和抗增生药一起配制，将其用在治疗过度增生性疾病的组合治疗中。虽然双萜三环氧化物和抗增生药在单独给药时是有效的，但是它们的杀伤剂量所需的浓度可能产生不可接受的副作用。该方法和组合物在多抗药性肿瘤细胞的治疗中特别有用。
感兴趣的抗增生药包括有杀肿瘤细胞活性的药物、免疫抑制剂和许多减少靶组织中细胞增殖的其它药物。靶细胞在局部或全身与抗增生药和双萜三环氧化物(如雷公藤内酯、雷公藤羟内酯等)或在生理条件下转变成这些化合物的前体药物接触。协同性组合物提供了相当的或改进的治疗效果，而降低了不利的副作用。本方法通过新颖的杀细胞途径的导入，提供用于过度增生性疾病的治疗学处理和研究的方法。动物模型，具体是小型哺乳动物(如鼠、兔等)是感兴趣的实验研究对象。
本方法用于预防性或治疗性目的。本文所用术语“治疗”指减少或减轻受试者的症状、预防症状的恶化或发展、抑制或消除病原体，或者预防无疾病受试者患上疾病。例如，癌症患者的治疗可以是肿瘤大小的减少、恶性细胞的消除、肿瘤转移的预防或者已治愈患者的复发的预防。对于患者正在进展的疾病的治疗，稳定或改善其临床症状是特别有益的。这种治疗希望在受累组织的功能完全丧失之前进行。
在本发明的一个方面，靶细胞群是肿瘤细胞群。当靶细胞表达功能性p53蛋白时可获得特别的利益。雷公藤内酯显示出在几种野生型p53肿瘤细胞系中诱导p53蛋白的表达，野生型p53显著地提高雷公藤内酯的细胞毒性。但是，雷公藤内酯诱导的细胞程序死亡不需要功能性p53。
在本发明的一个实施例中，抗增生药是损伤DNA的药物，如核苷酸类似物(如嘌呤类和嘧啶类、烷基化剂等)。特别感兴趣的另一种抗增生药是紫杉醇。
在本发明的另一实施例中，抗增生药是拓扑异构酶抑制剂，如拓扑异构酶I抑制剂或拓扑异构酶II抑制剂。定义
应认为本发明并不限于特殊的方法、方案、细胞系、动物种类或种属、构建物和所述的试剂，这些都可以改变。还应认为本文所用术语仅是为描述特殊的实施例，而不是对本发明的范围所作的限制，本发明的范围仅由所附的权利要求限制。
过度增生性疾病：指相对于一般群体的相同类型的细胞和/或较早期从患者获得的相同类型的细胞，患这种疾病的患者的细胞过度增殖。该术语指恶性和非恶性细胞群。这些疾病的细胞的一种或多种亚群增殖过度，在形态和基因型上常常表现为与周围组织不同。可参考一般的群体和/或特殊的患者(如该患者较早期)来确定过度的细胞增殖。在不同类型的动物和人中均可能产生过度增生性细胞疾病，并根据受累细胞产生不同的身体表现。
过度增生性细胞疾病包括癌症，血管增生疾病如再狭窄、动脉粥样硬化、植入支撑管性(in-stent)狭窄、血管移植性(vascular graft)再狭窄等，纤维化疾病，牛皮癣，炎症如关节炎等，肾小球肾炎，子宫内膜异位，黄斑变性疾病，良性生长疾病如前列腺肥大和脂瘤以及自身免疫疾病。特别感兴趣的是癌症，包括白血病，淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金病)，肉瘤，黑素瘤，腺瘤，实体组织的癌，低氧性肿瘤，口腔、咽、喉和肺的鳞状细胞癌，泌尿生殖器的癌症如子宫颈癌和膀胱癌，造血器官(hematopoietic)癌症，头颈部癌症，神经系统癌症，良性病灶如乳头状瘤等。
多抗药性细胞：采用本抗增生治疗的特别感兴趣的细胞是多抗药性的。多抗药性常常由靶细胞质膜中的内在糖蛋白P-糖蛋白(多效性糖蛋白，Pgp，MDR1)或相关的同系物(MRP)引起。当MDR1被肿瘤细胞表达时，它排出细胞毒性化疗药，从而使肿瘤细胞即使在使用高剂量药物进行抗肿瘤治疗时也能生存。
可使用各种方法确定具体的肿瘤细胞样品是否具多抗药性。使用分子生物技术(mRNA水平的基因表达)、免疫学技术(P-糖蛋白自身的定量)或功能性方法(测量染料排除)可诊断肿瘤的多抗药性。可获得P-糖蛋白的序列，它的Genbank进入号码为NM 000927〔Chen等人(1986)，Cell，47：381-389〕。
在表达MDR1的细胞中，可通过荧光化合物的细胞积累或摄入的测定显现对细胞毒性药物的摄入的减少，这些荧光化合物有蒽环类抗生素〔Herweijer等人(1989)，Cytometry，10：463-468〕、维拉帕米衍生物(Lelong等人(1991)，Mol.Pharmacol.，40：490-494〕、若丹明123〔Neyfakh(1988)，Exp.Cell Res.，174：168-174〕和Fluo-3〔Wall等人(1993)，Eur.J.Cancer，29：1024-1027〕等。或者，可将细胞样品暴露在钙黄绿素化合物中，测量样品细胞相对对照细胞积累的钙黄绿素化合物的量。相对于对照细胞，样品细胞积累的钙黄绿素减少，这表明生物样品中多抗药性的存在。
双萜三环氧化物敏化剂：用在组合治疗中的感兴趣的化合物包括具有下式结构的化合物：
Figure A0081414100091
其中
X1是OH、＝O或OR1；
X2和X3独立地表示OH、OR1或H；
R1是-C(O)-Y-Z，其中，Y是C1-C6支链或非支链烷基或链烯基；Z是COOR2、NR3R3＇或+NR4R4＇R4″，R2为阳离子，R3和R3＇独立地是H或C1-C6支链或非支链烷基、羟烷基或烷氧基烷基，或者R3与R3＇一起形成5-7元杂环，环原子选自碳、氮、氧和硫，包括2-6个碳原子，或者多个氮原子，可任选地包括一个或以上的氧原子或硫原子，环未被取代，或者被选自R5、OR5、NR5R6、SR5、NO2、CN、C(O)R5、C(O)NR5R6以及卤素(氟、氯、溴或碘)中的一个或多个基团取代，其中R5和R6独立地为氢、低级烷基或低级链烯基，R4、R4＇和R4″独立地是C1-C6支链或非支链烷基、羟烷基或烷氧基烷基。可在国际专利申请WO98/52951和WO97/31921中找到这些分子的例子，本文纳入这两篇文献作为参考。
特别感兴趣的化合物包括雷公藤内酯、雷公藤羟内酯、雷公藤羰内酯、雷公藤红素(tripterinin)、16-羟基雷公藤内酯、雷公藤内酯三醇(triptriolide)和tripchloride，以及雷公藤内酯、16-羟基雷公藤内酯和雷公藤羟内酯(2-羟基雷公藤内酯)一个或多个羟基衍生的衍生物。这些衍生物可以是酯衍生物，所连接的酯取代基可包括一个或多个氨基或羧基。特别感兴趣的前体药物包括雷公藤内酯琥珀酸钠和雷公藤内酯琥珀酸三(羟基-甲基)氨基甲烷。
本发明化合物可从得自中国中草药雷公藤或其它已知来源的根部的木质部的雷公藤内酯、雷公藤羟内酯或16-羟基雷公藤内酯制得。制备雷公藤内酯或相关化合物的方法在本领域中是周知的。
抗增生药：减少细胞增殖的药物在本领域中是周知的，并被广泛地应用。这种药物包括烷基化剂，如氮芥类〔如氮芥、环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥(L-溶肉瘤素)等〕和亚硝基脲类〔如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)、链脲霉素、吡葡亚硝脲等〕。这些药物被用于癌症治疗，也被用作免疫抑制剂和抗炎药。
抗代谢药包括嘧啶类〔如阿糖胞苷(CYTOSAR-U)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脱氧尿苷(FUdR)等〕、嘌呤类〔如硫代鸟嘌呤(6-硫代鸟嘌呤)、巯基嘌呤(6-MP)、喷司他丁、氟尿嘧啶(5-FU)等〕和叶酸类似物〔如氨甲蝶呤、10-炔丙基-5，8-二脱氮叶酸(PDDF，CB3717)、5，8-二脱氮四氢叶酸(DDATHF)、甲酰四氢叶酸等〕。氨甲蝶呤被广泛用作免疫抑制剂，特别是在同种器官移植和其它过度增生性疾病的治疗中。甲酰四氢叶酸被用作抗感染药物。
其它天然产物包括硫唑嘌呤，布乐喹那(brequinar)，生物碱〔如长春新碱、长春花碱、长春瑞宾(vinorelbine)等〕，鬼臼毒素(如依托泊甙、替尼泊甙等)，抗生素〔如蒽环类抗生素、盐酸柔红霉素(道诺霉素、红比霉素、正定霉素(cerubidine))、伊达比星、阿霉素、表阿霉素和吗啉衍生物等〕，phenoxizone双环肽(如放线菌素D)，碱性糖肽(如争光霉素)，蒽醌糖苷(如plicamycin(光神霉素))，蒽二酮类(如米托蒽吡)，氮丙啶并吡咯并(azirinopyrrolo)吲哚二酮类(如丝裂霉素)，大环类免疫抑制剂〔如环孢素、FK-506(他克莫司、prograf)、纳巴霉素等〕等等。
激素调节剂包括肾上腺皮质类固醇(如强的松、地塞米松等)，雌激素和孕激素(如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、雌二醇、克罗米芬、他莫西芬等)，肾上腺皮质抑制剂(如氨鲁米特)。雌激素刺激增殖和分化，因此使用与雌激素受体结合的化合物阻滞这种活性。皮质类固醇可抑制T细胞增殖。
其它化疗药包括金属配合物〔如顺铂(顺式-DDP)、卡铂等〕、脲类(如羟基脲)和肼类(如N-甲肼)。感兴趣的其它抗增生药包括免疫抑制剂〔如霉酚酸、沙利度胺、脱氧精胍菌素、阿扎斯颇灵(azasporine)、乐复轮诺米缔(leflunomide)、米唑日宾(mizoribine)、叠氮螺烷(azaspirane)(SKF 105685)等〕和紫杉醇类(如紫杉醇等)。
类维生素A(如维生素A、13-顺式-维甲酸、反式维甲酸、异维A酸等)、类胡萝卜素(如β-胡萝卜素、维生素D等)。类维生素A调节上皮细胞的分化和增殖，用于上皮过度增生性疾病的治疗和预防。
血管紧张肽酶抑制剂减少血管系膜暴露于刺激血管系膜细胞增生的蛋白质因子，并用于血管增生性疾病。
用于本方法的一种特别感兴趣的药物是伊立替康(CPT-11)，它是一种拓扑异构酶I抑制剂。CPT-11能用作共治疗药物。例如，用于治疗实体瘤如结肠癌、肉瘤、非小细胞肺癌、卵巢和子宫内膜癌、腺癌、间皮瘤等。本方法中感兴趣的其它拓扑异构酶抑制剂包括阿霉素和卡铂，它们抑制II型拓扑异构酶。
药学制剂：可将双萜三环氧化物和抗增生药掺入许多用于治疗的制剂中。可同时给予双萜三环氧化物和抗增生药，或者在短时间内以相同或不同的途径给予。在本发明的一个实施例中，使用了共同给药，两种组分混合在单一的悬浮液中。或者，这两种制剂可分别配制。
总剂量的一部分可以以不同的途径给药。这种给药可以使用引起全身吸收的任何途径，可以是几种已知途径中的任何一种，包括但不限于吸入(即肺部气溶胶给药)、经鼻、舌下给药、口服和注射(如皮下、肌肉内注射)等。
更具体而言，可将本发明化合物与适当的药学上可接受的载体或稀释剂混合，配制成药学组合物，可将该制剂配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，如片剂、胶囊、粉末、粒剂、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球和气溶胶。同样，可以以各种途径给予给化合物，包括口服、经颊(buccal)给药、直肠给药、肠道外给药、腹膜内给药、皮内给药、经皮给药、器官内(intracheal)给药等。活性药物在给药后可以遍布全身，或者经局部给药、壁内(intramural)给药或使用维持该活性剂量在埋植位点的埴入剂存在于局部。
在药物剂型方面，该化合物可以以其药学上可接受的盐的形式给药。它们还可与其它药学上有活性的化合物适当地一起使用。下面的方法和赋形剂仅仅是范例而非用来限制。
对于口服制剂，可将该化合物单独或者与适当的添加剂组合，制成片剂、粉末、粒剂或胶囊，例如，使其与常规的添加剂(如乳糖、甘露醇、谷物淀粉或马铃薯淀粉)、粘合剂(如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、谷物淀粉或明胶)、崩解剂(如谷物淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素纳)、润滑剂(如滑石粉或硬脂酸镁)混合，如果需要，还可以与稀释剂、缓冲剂、增湿剂、防腐剂和增香剂混合。
可在水性或非水性溶剂中溶解、悬浮或乳化该化合物，将其配制成注射用的制剂，这些溶剂包括植物油或其它类似的油、合成的脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸或丙二醇的酯；如果需要，还可加入常规的添加剂如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。
可将该化合物配制成吸入用的气溶胶制剂。可将本发明化合物用加压的可接受的推进剂，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等制成气溶液制剂。
此外，将该化合物可与各种基质(如乳化基质或水溶性基质)混合制成栓剂。本发明化合物可使用栓剂形式经直肠给药。该栓剂可包括赋形剂如可可豆脂、聚乙二醇carbowax和polyethylene glycol，这些赋形剂在体温下熔解，而在室温固化。
可以提供口服或直肠给药的单位剂型，如糖浆、酏剂和悬浮剂，其中，各剂量单位(如一茶匙、一大匙、片剂或栓剂)含有预定量的组合物，该组合物含有本发明的一种或多种化合物。类似地，注射或静脉内给药用的单位剂型可含有溶解在无菌水、生理盐水或其它药学上可接受的载体中的本发明的化合物(以组合物的形式)。
作为缓释制剂的埋植剂在本领域中是周知的。埋植剂可用生物可降解或生物不可降解的聚合物制成微球体、片状等。例如，乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成可被宿主很好耐受的易蚀的聚合物。含有治疗药的埋植剂被放在接近肿瘤的位置，这样活性药物的局部浓度相对身体的其它部分有所增加。
本文所用术语“单位剂型”指适合用作人和动物患者的单一剂量的物理上分离的单位，每单位含有预定量的本发明化合物，这些预定量是以与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂一起可有效产生所需效果的量来计算。本发明单位剂型的规格依赖于所使用的具体化合物、要获得的效果和与宿主中各化合物有关的药效。
公众易于获得药效上可接受的赋形剂，如媒介物、佐剂、载体或稀释剂。此外，公众也易于获得药效上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、渗透压调节剂、稳定剂、润湿剂等。
剂量：双萜三环氧化物与抗增生药的组合使用具有各药物所需剂量低、不同药物药效互补的优点。给予双萜三环氧化物的剂量取决于患者、治疗的病症以及给药途径，通常每天为0.001-5mg/千克体重。此范围宽，因为通常，对不同哺乳动物的治疗效果随剂量变化较大，对人的治疗效果通常小于对大鼠的治疗效果的20、30甚或40倍(每单位体重)。类似地，给药途径对剂量也有大的影响。例如，大鼠的口服剂量可以是注射剂量的10倍。抗增生药的剂量将根据该药的性质，随着化合物而在相当大程度上发生改变。在局部给药途径中可以使用较高的剂量。
典型的药剂可以是适合静脉内给药的溶液、日服用2-6次的片剂或者一次性释放的胶囊或每天一次且含有高比例含量的活性组分的片剂等。可由在不同pH值中溶解的胶囊材料、依靠渗管压缓慢释放的胶囊或者通过任何其他已知的受控释放方法获得时间依赖性的释放效果。
熟练的技术人员将容易地理解，剂量水平可作为具体化合物、病症的严重性以及患者对副作用的敏感性的函数而改变。一些特殊的化合物比其它化合物更有效。本领域熟练技术人员可采用种种方法容易地测定给定化合物的较佳剂量。较佳的方法是测量给定化合物的生理效果。
敏感肿瘤：宿主或患者可以来自所有哺乳动物种类，如灵长类(特别是人)、啮齿动物(包括小鼠、大鼠和仓鼠)、兔、马、牛、犬、猫等。用于实验研究的感兴趣的动物模型给人类疾病的治疗提供了模型。
感兴趣的肿瘤包括癌，如结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、导管癌、子宫内膜癌、胃癌、发育异常性口腔粘膜癌、侵入性口腔癌、非小细胞肺癌、过渡型和鳞状细胞膀胱癌等；神经的恶性肿瘤，如成神经细胞瘤、神经胶质瘤等；血液的恶性肿瘤，如儿童急性白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、皮肤T细胞恶性肿瘤、蕈样真菌病、非MF皮肤T细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、富含T细胞的皮肤淋巴增生、大疱性类天疱疮、盘状红斑狼疮、扁平苔藓等；等等。
特别感兴趣的一些癌症包括非小细胞肺癌。非小细胞肺癌(NSCLC)由肺癌的3种普通亚型组成。表皮样癌(也称为鳞状细胞瘤)常常开始于大支气管中的一根，长得相对缓慢。这些肿瘤的大小可以在非常小到相当大的范围之内。腺癌接近肺外表面的开始生长，大小和生长速率都可以改变。一些缓慢生长的腺癌被描述为肺泡细胞癌。大细胞癌在接近肺的表面开始，生长速度快，并且当诊断到时，它通常长得相当大。肺癌的其它不常见类型是类癌瘤、腺样囊性癌、粘膜表皮样瘤和恶性间皮瘤。
多数乳腺癌是腺癌亚型。原位导管癌(DCIS)是非侵入性乳腺癌最普通的类型。在DCIS中，恶性细胞并未通过管壁转移到乳腺的脂肪组织中。浸润性(侵入性)导管癌(IDC)通过管壁转移并侵入乳腺的脂肪组织中。浸润性(或侵入性)小叶癌(ILC)与IDC类似，其原因在于它具有转移到身体其它部位的可能。约10-15％的侵入性乳腺癌是侵入性小叶癌。
黑素瘤是黑素细胞的恶性肿瘤。虽然大多数黑素瘤出现在皮肤上，但是它们也可出现在粘膜表面或神经嵴细胞会迁往的其他部位。黑素瘤主要在成年人中发生，在这些病例中，有超过一半出现在皮肤的似乎正常的区域。预后受临床因素和组织学因素以及该病灶的解剖学位置影响。黑素瘤的厚度和/或侵入的水平、有丝分裂指数、肿瘤浸润的淋巴细胞和在原发位置的溃疡或出血会影响预后。临床上的分期基于肿瘤是否扩散到区域淋巴结或远处。对于在临床上限制在原发位置的疾病，黑素瘤局部侵入越厚越深，淋巴结转移的机会越高，预后越差。黑素瘤可通过局部延伸(通过淋巴管)而得到扩散，和/或通过血源性途径扩散到远处。转移可能涉及到任何器官，但肺和肝是转移的通常位置。
使用的方法
给予过度增生性疾病患者双萜三环氧化物与抗增生药的组合治疗剂。可以是局部的(topical)、局限的或全身给药，这取决于具体的疾病。这些化合物在合适时间内给予以组合的有效剂量能大量减少细胞增殖，同时使任何副作用减到最小。当靶细胞是肿瘤细胞时，该剂量通常将至少杀死存在的肿瘤细胞的约25％，更通常至少约杀死50％，也可能杀死约90％以上。预期将能获得该组合物并在医生的指导下用于体内。
为了提供组合治疗的协同效果，可一起或分别、同时或在该天中的不同时间给予双萜三环氧化物活性药物。在本发明的一个实施例中，在给予抗增生药之前给予双萜三环氧化物。
可如实验部分所述，通过进行体外实验测定具体的肿瘤细胞对组合治疗杀灭的敏感性。通常，将肿瘤细胞的培养物与不同浓度的抗增生药和双萜三环氧化物的混合物混合一段足以使活性药物诱导细胞杀灭的时间。对于体外实验，可以使用从肿瘤的活检样品中得到的培养细胞。然后计算经处理后留下的活细胞。
剂量将依所使用的具体的抗增生药、治疗的靶细胞类型、患者状态等而改变，以足以大大除去靶细胞群同时维持患者生存的剂量使用。在一些病例中，治疗可以与干细胞替换一起进行，以重新构建患者的造血功能。
应该认为，本发明并不受特殊的方法、治疗方案、细胞系、动物种类或种属以及所述的试剂的限制，这些都可以改变。还应认为，文中所用的术语仅仅是为了描述特殊的实施例，而不是对本发明的范围作出限制，本发明的范围仅由附带的权利要求限制。
除非文中另有明确的说明，否则本文所用单数“一”、“和”和“此(该)”包括复数的事物。因此，例如，“细胞”包括大量的这种细胞，“阵列”包括一个或多个阵列以及本领域中熟练技术人员周知的它们的相等物，等等。除非另有明确的说明，文中所用的所有的技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员所理解的含义一致。
为了描述和公开，本文所提及的所有出版物都被纳入作为参考，例如，在这些出版物中所述的细胞系、构建物和方法可能用于本发明之中。上面讨论的出版物及其整篇文章都在本申请的申请日前公开。它们不能解释为本发明者承认本发明由于这些现有发明在以前公开而不能被授权。
给出下述实施例，以给本领域的熟练技术人员提供怎样制备本发明组合治疗剂和使用这些治疗剂的方法的完整的公开和描述，这些实施例并不是对本发明所认为的范围的限制。已尽力确保所使用的数据(如数量、温度、浓度等)的准确性，但是应该考虑到一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份是重量份，分子量是平均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。
                             实施例实施例1：雷公藤内酯的衍生物的体内抗肿瘤活性材料和方法
细胞和转染：从ATCC购得H23(非小细胞肺癌)和ZR-75(乳腺癌)细胞系。由Fred Hutchinson Cancer Research Center(Seattle，WA)提供Bcl-2表达载体。由Branimir Sikic(Stanford University)提供MES-SA和Dx5细胞系。将细胞培养在含有10％FCS、添加了L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素的适当的培养基中。为了检测Bcl-2对细胞生存的影响，使用脂质转染胺试剂(lipofectamine plus)(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)将Bcl-2载体单独转染Dx5，或者将5∶1的Bcl-2表达载体：β-半乳糖苷酶表达载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)共转染至Dx5细胞中。36小时后，用5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-半乳吡喃糖苷(X-gal)染色。计算双份平皿的90mm2面积中总细胞-蓝色细胞数/总细胞数，得到细胞存活率(cell survival)，以平均值±标准偏差表示。
细胞死亡试剂和测定：如最近Lee等人〔(1999)，J.Biol.Chem.，274：13451-13455〕所述通过MTT测定法测量细胞的生存力。从Alexis Biochemicals(SanDiego，CA)获得z-VAD-氟甲基甲酮(z-VAD.fmk)。通过使用膜联蛋白和碘化丙锭染色，接着根据制造商的说明(Clontech Laboratories，Palo Alto，CA)进行FACS分析，分析z-VAD.fmk对细胞生存力的影响。通过得自第3天肿瘤的石腊切片的载片的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)诱导的d-UTP切口末端标记(TUNEL)染色，对组织切片中的细胞程序死亡进行分析，该肿瘤得自每天用PG490-88或盐水处理2次的第2天处理后24小时的小鼠。根据制造商的说明(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)进行TUNEL染色，然后用甲基绿复染该组织切片。从细胞中分离出DNA，将其用于核小体间DNA序列梯的分析以及接着的琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色。
PG490和PG490-88的纯化：PG490(雷公藤内酯)由白到灰白色的晶体组成，熔点为226-240℃，在薄层层析中产生单一斑点，质子磁共振表明其符合标准雷公藤内酯制品，通过使用乙腈：水：甲醇进行反相HPLC测定，证明纯度为97％，元素分析的结果其偏差在理论值的0.4％之内(66.51％C，6.43％H，理论值为C 66.65％，H 6.71％)。
由PG490半合成地制得的PG490-88(14-琥珀酰雷公藤内酯纳)由白色的无定形粉末组成，熔点为232-250℃，在薄层层析时产生单一斑点，质子磁共振表明其符合标准PG490-88制品，通过使用乙腈：甲醇：0.006M的磷酸钠(pH3.2)进行反相HPLC测定标准PG490-88制品，证明其纯度为98％。PG490-88是PG490的前体药物，室温下在小鼠血清中半衰期＜5分钟。将PG490-88溶解在0.9％NaCl中，并用孔大小为0.2μM的膜(Supor Acrodisc 25，Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)微量过滤进行灭菌，制得PG490-88的储液(1mg/ml)。将PG490-88储液稀释在0.9％NaCl中，用于IP给药。
购得阿霉素(Gensia Laboratories公司，Irvine，CA)，制成200mg/ml储液将其稀释在0.9％NaCl中，用于IP给药。将紫杉醇溶解在乙醇中，加入等体积的Cremophor EL(Sigma，St.Louis，MO)，制得30mg/ml的储液，将其稀释在0.9％NaCl中，用于IP给药。
裸小鼠异种移植模型：从Taconic(Germantown，NY)购得雌性NCr裸小鼠，当使用时一般是20-24克。将小鼠放在顶部装有灭菌过滤器的经高压蒸汽灭菌的微型隔离器的笼子中，可以毫无限制地获得无菌水和无菌食物。笼子保持在提供经过滤的空气的隔离器单元(Lab Products公司，Maywood，New Jersey)。肿瘤细胞生长，并如上面所述收获。给NCr裸小鼠皮内注射5×106个肿瘤细胞。在一些实验中，治疗从肿瘤细胞植入日开始。另外，可检测肿瘤的大小，实验中将小鼠分组，每组形成一个类似的平均肿瘤大小，并开始治疗。小鼠每天IP给药一次进行治疗，每周5天。结果
PG490(雷公藤内酯)在体外诱导肿瘤细胞程序死亡：发现PG490单独对肿瘤细胞系产生细胞毒性，这些细胞系包括H23细胞、带p53突变体的非小细胞肺癌细胞系、Dx5细胞(从MES-SA亲本细胞系和ZR-75细胞(乳腺癌细胞系)得到的MDR子宫肉瘤细胞系〕。Dx5细胞对阿霉素的抗性和对紫杉醇的抗性，分别是MES-SA亲本细胞系对它们的抗性的100倍以上和1000倍以上〔Chen等人(1994)，Cancer Res.，54：4980-4987〕。10ng/ml剂量的PG490降低H23和Dx5细胞系的65-70％的细胞生存力，降低ZR-75细胞系的24％的生存力。20ng/ml的PG490减少所有3种细胞系80％以上的生存力(图1)。
在图1A中，用所示剂量的PG490处理ZR-75(乳腺癌)、H23(非小细胞肺癌)和Dx5(MDR子宫肉瘤)细胞系，48小时后收集这些细胞，通过MTT实验进行细胞生存力的分析。数据是3个实验的平均值±标准偏差。在图1B中，DNA从未经处理的细胞中分离出来，或者于加入PG490后16小时从PG490处理的细胞中分离出来，接着进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色处理。
在Dx5细胞系和MES-SA亲本细胞系之间没有观察到它们对PG490的敏感性的显著差异。为了确证PG490诱导的细胞死亡是细胞程序死亡，检测了Dx5细胞中PG490诱导的DNA序列梯的存在，结果发现PG490在第6小时开始诱导Dx5细胞中的DNA序列梯，在第16小时达到最大。
PG490(雷公藤内酯)并未在Dx5和H23细胞中引起生长停滞或显著地影响细胞周期的进程。观察到Bcl-2的超表达将使经PG490处理的Dx5细胞的细胞生存从15％增加到72％(图2)。四肽半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)抑制剂z-VAD.fkm(100μM)也使经PG490处理的Dx5细胞的细胞生存力从15％增加到68％(图2)。将Bcl-2或对照载体瞬时转染到Dx5细胞中，接着加入PG490(20ng/ml)，36小时后用X-gal染色。以总细胞-蓝色细胞/总细胞×100计算细胞生存百分比。在加入PG490(20ng/ml)一小时前加入z-VAD.fmk(100μM)至Dx5细胞中，36小时后采集细胞，进行膜联蛋白和碘化丙锭染色，接着进行FACS分析，分析细胞的生存力。数据表示从两个独立实验中3组平行测试的平均值±标准偏差。
在裸小鼠中PG490-88预防人肿瘤发展：上述报道的结果显示PG490在体外对肿瘤细胞的细胞毒性。为了在使用人肿瘤细胞异种移植物的体内环境扩展这些研究，使用了PG490的水溶性前体药物——更易于给药的PG490-88。给裸小鼠皮内植入H23肿瘤细胞，不处理该动物，或者在植入的同时开始每天IP给予PG490-88一次。5或7周后，5只未处理的小鼠都出现了肿瘤，而用0.25-0.75mg/kg/天的PG490-88处理的小鼠并未产生肿瘤(表1)。第5周后，用PG490-88进行处理的每组小鼠中有3只停止进行处理，而另外两只继续用PG490-88处理2周。在停止使用0.5mg/kg/天或以下的PG490-88的小鼠中，每组各有一只在第6周产生了可见的肿瘤，但在第6周后这些组中没有更多可见的肿瘤出现(表1)。在接受0.75mg/kg/天的PG490-88的小鼠中，在10周的观察中没有发现一只小鼠出现可见的肿瘤。
                               表1
         裸小鼠以PG490-88处理预防人肿瘤异种移植物的形成
      组中患有肿瘤的小鼠数
    第5周     第6周     第10周
    未处理     5/5     5/5     5/5
    PG490-88(mg/kg/天)
    0.25     0/5     1/5     1/5
    0.375     0/5     1/5     1/5
    0.5     0/5     1/5     1/5
    0.75     0/5     0/5     0/5
用H23肿瘤细胞植入裸小鼠(第0天)。不处理小鼠，或者从肿瘤细胞植入的当天起每周连续5天每天给小鼠IP注射PG490-88一次。给予PG490-88五周。未处理组小鼠有5只。各处理组中有3只接受5周的PG490-88处理，每组另外两只多加2周(共7周)。仅仅在第5周后停止处理的小鼠中出现肿瘤。
PG490-88抑制H23人肿瘤细胞已形成的肿瘤的生长，并在与紫杉醇的组合治疗中具有增强的疗效：给裸小鼠皮内植入H23肿瘤细胞。当肿瘤达到约100mm3时，开始每天IP给予PG490-88一次。PG490-88以剂量依赖的方式抑制肿瘤的生长(图3)。图3中的数据表示开始治疗后14天所测得的H23肿瘤体积。如图中所示每天处理接受H23人肿瘤细胞的异种移植物的裸小鼠一次。数据表示肿瘤体积的平均值和平均值的标准误差，以开始处理后第3、6、10和14天测得的各动物的肿瘤体积为第0天的肿瘤体积的百分比表示。每组有5只小鼠。
在第14天，0.25mg/kg/天的PG490-88使肿瘤体积减少到赋形剂对照的21％。0.75mg/kg/天的PG490-88从第3天到第14天逐渐减少平均肿瘤体积，使平均肿瘤体积相对于第0天的原始值减少了61％，相对于第14天的赋形剂对照减少了97％(图3)。紫杉醇在较高剂量(10mg/kg/天)而非较低剂量(5mg/kg/天)减少肿瘤的生长，在第14天的平均肿瘤体积是赋形剂对照的42％(图3)。0.25mg/kg/天的PG490-88加上10mg/kg/天的紫杉醇使肿瘤大小相对于第14天的赋形剂对照体积减少了93％(图3)。因为其毒性而没有使用15mg/kg/天的紫杉醇。
用PG490-88处理3天后的H23肿瘤的组织切片显示，与盐水处理的对照中具有核：胞质比率增加的更同质的纺锤形的细胞相比，许多细胞有丰富的嗜酸性胞质，核固缩，核膜变薄或丧失，染色质凝聚。同样，相对于盐水处理的动物，在PG490-88处理的组中发现了许多TUNEL阳性的细胞。与第3天的盐水处理的对照相比，在开始PG490-88治疗后的第15天，H23肿瘤被带有磷酸钙沉淀的中心区域的纤维瘢痕组织取代，但盐水处理的对照在外观上没有变化。
PG490-88抑制MDR人肿瘤细胞系的已形成的肿瘤的生长：MDR是临床环境中不能达到持久的化疗疗效的一种因素。使用MDR肿瘤细胞系Dx5进行PG490-88的疗效的测试。用Dx5肿瘤细胞皮内给裸小鼠植入，当肿瘤达到约100mm3时开始处理。在小鼠仅接受盐水或2mg/kg/天的阿霉素的组中，平均肿瘤体积从开始处理时起，在14天内增加了10倍以上(图4)。
图4中的数据表示开始处理后第14天所测得的Dx5肿瘤的体积。如图中所示每天处理一次接受Dx5 MDR人肿瘤细胞异种移植物的裸小鼠。数据表示肿瘤体积的平均值和平均值上的标准误差，以开始处理后第3、7、10和14天的肿瘤体积对第0天的肿瘤体积的百分比表示。这些组中有5只小鼠接受盐水或PG490-88加阿霉素，有4只仅接受PG490-88或阿霉素。
0.75mg/kg/天的PG490-88使4只小鼠中的3只的平均肿瘤大小相对于第0天减少了28％。一只小鼠的肿瘤相对于第0天长了2.8倍。在第14天，PG490-88和阿霉素的组合处理使肿瘤体积相对于第0天有34％的减少，相对于第14天的赋形剂对照平均肿瘤体积有94％的减少，所有的肿瘤的大小相对于第0天都有所减少。
在上述体内研究中使用了PG490-88，它是一种在血清中快速转变成雷公藤内酯的前体药物雷公藤内酯琥珀酸盐。以摩尔量计，雷公藤内酯的剂量相对于PG490-88为70μg/小鼠/周，并且它能被很好地耐受。已观察到0.75mg/kg的PG490-88完全阻止了H23肿瘤在所有小鼠中的形成，在PG490-88停止给药后五周小鼠中没有一只出现肿瘤。
PG490-88也显著抑制预先形成的H23肿瘤的生长，并诱导肿瘤细胞的细胞程序死亡。另外，PG490-88(0.25mg/kg)和紫杉醇(10mg/kg)的组合比任何一种单独的药物在预防H23细胞形成肿瘤方面都显得更具有破坏性。对预先从MDR Dx5细胞系形成的肿瘤，PG490显著地抑制肿瘤的生长，并且阿霉素并不干扰PG490-88的杀肿瘤活性。通过测量体重改变、活动的改变或者困难的呼吸，在PG490-88(0.75mg/kg)处理的小鼠中没有可观察到的毒性。
对一些实体瘤的治疗已有进展，但是p53突变体和多抗药性肿瘤的出现以及化疗的毒性限制了长期生存的显著增加。上述结果证明，单独的PG490-88是安全的，并且它是体内有效的抗p53突变体和MDR肿瘤的杀肿瘤药物，PG490-88的杀肿瘤活性通过与化疗药如紫杉醇的组合使用而得到提高。实施例2：雷公藤内酯诱导实体瘤中细胞程序死亡并增强了化疗诱导的细胞程序死亡
p53在雷公藤内酯诱导的肿瘤细胞系的细胞程序死亡中起作用。同样，雷公藤内酯通过p53途径增强了损伤DNA的化疗药诱导的细胞程序死亡。但是，雷公藤内酯介导的p53的增加可导致mdm2和p21Cip1/Waf1转录的抑制。另外，雷公藤内酯处理的细胞中的Mdm2和p21蛋白的水平在加入雷公藤内酯之后很晚下降。感兴趣的是，雷公藤内酯诱导p53的翻译而没有在最初影响p53蛋白的稳定性。这些发现证明，雷公藤内酯诱导的细胞程序死亡和它在p53野生型细胞中增强化疗诱导的细胞程序死亡至少部分是由p53翻译的诱导介导的。材料和方法
试剂：从Pharmagenesis(Palo Alto，CA)获得PG490(雷公藤内酯，分子量360)。从ATCC获得A549(非小细胞肺癌)和HT1080(纤维肉瘤)细胞系。从Dr.RonWeigel(Stanford University)获得MCF-7(乳腺癌)细胞系。由Dr.Amato J.Giaccia(Stanford University)提供小鼠胚胎成纤维细胞系(p53+/+和p53-/-)。从SigmaChemicals获得阿霉素、环己酰亚胺和溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑(MTT)。由Dr.Louis Noumovski(Stanford University)获得mdm2启动子-荧光素酶构建物pBP100-GL2，通过将从pBP100CAT载体得到的Bgl II-Hind III片段克隆到pGL2-Basic载体(Promega，Madison，WI)中获得此构建物。使用从LifeTechnologies Inc.获得的脂质转染胺Plus试剂转染MCF-7细胞。根据制造商(Promega Corp.，Madison，WI)的说明收集细胞并制备细胞裂解液，用于荧光素酶检测。从Calbiochem，Inc.，(La Jolla，CA)获得p53、p21WAF1/CIP1、Mdm2、蛋白质磷酸酶-1(PP-1)和Erk-2的抗体，兔的多克隆Bax抗体从UpstateBiotechnology(Lake Placid，NY)获得。
细胞培养和荧光素酶测定：在含有10％FCS、补充了L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素的适当的培养基中培养A549(非小细胞肺癌)、HT-1080(纤维肉瘤)和MCF-7(乳腺癌)细胞。使E1A/Ras转染的p53野生型(+/+)和裸(-/-)小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，在含有15％FCS、添加了L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素的DMEM中生长。使用脂质转染胺Plus试剂在MCF-7细胞上进行转染。转染24小时后，不处理MCF-7细胞，或用雷公藤内酯(20ng/ml)或阿霉素(100nM)处理4、8和16小时，收集细胞，进行荧光素酶测定。用Luminometer(Analytical Luminescence Laboratory，SanDiego，CA)测量等蛋白浓度的样品的荧光素酶活性。
细胞生存力测试：如上述进行溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑(MTT)检测测量细胞的生存力。在指定的时间收集未处理的或用雷公藤内酯和/或阿霉素处理的细胞，接着将MTT加到96孔平板中的细胞中。用0.1N HCl酸化的CH3Cl溶解细胞。在iEMS Labsystems平板读数器上在590nm的波长下计数96孔平板中的细胞数。
RT-PCR：使用从Qiagen Inc.(Valencia，CA)得到的Rneasy Mini Kit从MCF-7细胞中制备RNA。使用M-MLV反转录酶(Gibco)与2μg总RNA制备cDNA。使用1/20的总cDNA进行有限PCR反应(25轮)，在此反应中使用到Taq聚合酶(Gibco)。使用到下面的引物对：p53[SEQ ID NO：1]5＇-AGTCAGATCCTAGCGTCGAG-3＇和5＇-[SEQ IDNO：2]TCTTCTTTGGCTGGGGAGAG-3＇，mdm2，[SEQ ID NO：3]5＇-GTCAATCAGCAGGAATCA TCGG-3＇和[SEQ ID NO：4]5＇-CAATCAGGAACATCAAAGCCCTC-3＇，p21，[SEQ ID NO：5]5＇-AGTGGGGCATCATCAAAAAC-3＇和[SEQ ID NO：6]5＇-GACTCCTTGTTCCGCTGCTAATC-3＇，和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)-[SEQ IDNO：7]5＇-CCCATCACCATCTTCCAG-3＇和[SEQ ID NO：8]5＇-ATGACCTTGCCCACAGCC-3＇。
免疫印迹：用雷公藤内酯和/或阿霉素处理8小时后在指定的时间收集细胞，并用添加了1mM的DTT、1mM的PMSF和蛋白酶抑制剂混合物的HNET缓冲液(50mM HEPES，pH7.5，100mM的NaCl，1mM EGTA和1％Triton X-100)(BoehringerMannheim，Germany)进行裂解。将35μg的蛋白质加到10％SDS-PAGE上，接着将其转移到PVDF膜上。如先前所述，使用从Oncogene Research Products获得的p53小鼠单克隆抗体进行免疫印迹〔Lee等人(1999)，J Biol Chem，274：13451-5〕。
为测量p53的半衰期，在加入雷公藤内酯30分钟后向MCF-7细胞加入环己酰亚胺(30μg/ml)，在所示时间收集，进行p53的免疫印迹分析。如上面所述使用其它抗体进行免疫印迹分析。使用NIH Image 1.62测量带的强度。
MCF-7细胞的亚细胞分离：在用雷公藤内酯(5或20ng/ml)和/或阿霉素(100nM)处理后，如以前所述制备胞质和核的抽提物〔Lee等人(1988)，Gene Anal Tech，5：22-31〕，将每一抽提物50μg用于p53的SDS/PAGE免疫印迹分析。
MCF-7细胞的代谢标记：使细胞长到有80％的铺满，接着在适当的培养基中用雷公藤内酯(20ng/ml)进行预处理6小时。用短时标记的培养基(含有5％经透析的FCS的RPMI，添加了L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素)洗涤细胞两次。为减少细胞内的甲硫氨酸库，在37℃加入短时标记的培养基15分钟，然后用含有0.1mCi/ml[35S]甲硫氨酸的短时标记的培养基(Amersham，Inc.)替换原先的培养基。使细胞在37℃被标记30分钟，然后用冰冷的PBS洗涤两次，收集，将其用于免疫沉淀测定。使用添加了蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解该细胞，并使用琼脂糖偶联的p53 mAb(Ab-6，Oncogene Research Products)进行免疫沉淀，接着进行10％的SDS-PAGE电泳。使用NIH Image 1.62测量标记的p53蛋白质的强度。
结果
雷公藤内酯诱导了实体瘤细胞系的细胞程序死亡，并增强了化疗诱导的细胞程序死亡：为确定肿瘤细胞系是否在雷公藤内酯存在时对化疗药增敏，使用了拓扑异构酶II的抑制剂阿霉素。对A549和HT1080细胞单独使用阿霉素(100nM)仅仅引起细胞生存力的轻微下降，在进行药物处48小时后它们的生存力分别下降了14.3％和6.4％(表1)。但是，在HT-1080细胞中，5ng/ml的雷公藤内酯与阿霉素的组合减少了65％的细胞生存力，而单独的5ng/ml的雷公藤内酯或阿霉素(100nM)仅仅分别减少10％与6％的细胞生存力。在HT1080细胞中，单独的雷公藤内酯(20ng/ml，11.2nM)减少74％的细胞生存力。同样，在A549细胞中，20ng/ml的雷公藤内酯和阿霉素(100nM)的组合减少了67％的细胞生存力，而单独的雷公藤内酯和阿霉素则分别减少35％和15％的细胞生存力。
另外，我们观察到雷公藤内酯提高了A549细胞由另一种拓扑异构酶II抑制剂卡铂诱导的细胞死亡。我们还检测了单用雷公藤内酯(20ng/ml)对含有野生型p53的MCF-7乳腺癌细胞系的影响。我们发现，在MCF-7细胞中，5ng/ml和20ng/ml的雷公藤内酯分别减少了36％和70％的细胞生存力(表2)。我们还发现，雷公藤内酯单独诱导其它实体瘤细胞系中的80％以上的细胞的细胞死亡。因而，单独的雷公藤内酯对肿瘤细胞是有细胞毒性的，并且它与阿霉素一起增强了肿瘤细胞系中的细胞死亡。
                               表2
以雷公藤内酯处理后的人肿瘤细胞系的细胞生存力检测
                                          生存百分比a
             处理
                                 MCF-7       A549       HT-1080雷公藤内酯(5ng/ml)                   63.9±8.1   91.1±3.8  90.4±6.2雷公藤内酯(20ng/ml)                  30.5±7.6   64.0±8.2  26.0±5.2阿霉素(100nM)                        NDb        85.7±9.6  93.6±4.3雷公藤内酯(5ng/ml)+100nM阿霉素       ND          76.5±9.9  35.8±6.7雷公藤内酯(20ng/ml)+100nM阿霉素      ND          33.6±11.4 15.5±1.4
a如材料和方法部分所述，在处48小时后进行MTT检测，测得细胞生存力。
b没有测定。
雷公藤内酯增加p53的表达：p53能介导对细胞毒性刺激(如组织缺氧、辐射和DNA损伤性化疗药)细胞死亡反应。由于单独的雷公藤内酯是有细胞的毒性的，并且它与阿霉素一起使用，因此假设雷公藤内酯诱导的细胞程序死亡可能由p53介导。在保留了野生型p53的MCF-7和A549细胞中，雷公藤内酯以剂量依赖性和时间依赖的方式增加p53稳态蛋白质水平2-4倍。在MCF-7细胞中，阿霉素诱导p53蛋白增加两倍，雷公藤内酯诱导p53蛋白增加了4倍以上。在A549细胞中，雷公藤内酯(20ng/ml)与阿霉素(100nM)的组合，在处理24小时时显示出p53的最大增加(增加12倍以上)。雷公藤内酯(5ng/ml)与阿霉素的组合同样显著地增加了HT1080细胞中的p53。我们接着检测p53蛋白水平的增加是否是因为p53mRNA的增加。p53 mRNA的水平并不因对雷公藤内酯的响应而增加，而实际上，在用雷公藤内酯处理16小时的MCF-7细胞中的p53 mRNA有轻微的减少(图5A)。
在图5所示的实验中，使用从MCF-7细胞抽提得到的总RNA 2μg进行RT-PCR。用雷公藤内酯(20ng/ml)或阿霉素(100nM)处理细胞，在8小时和16小时后收集。用GADPH作加样对照。将在mdm2启动子上含有p53结合位点的质粒pBP100-GL2瞬时转染到MCF-7细胞中，使用细胞裂解液进行荧光素酶检测。所得的值是3个实验的平均值±标准偏差。总而言之，这些数据表明在由于雷公藤内酯诱导而发生细胞死亡的细胞中其p53的增加是在转录后发生。
功能性p53提高了雷公藤内酯诱导的细胞死亡：许多化疗药物或放疗的结果依赖于肿瘤抑制基因p53基因的功能状态。为了确定功能性p53的存在是否对雷公藤内酯诱导的细胞死亡有贡献，我们使用了带有野生型(+/+)或裸(-/-)p53基因的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。5ng/ml或10ng/ml的雷公藤内酯分别减少了p53+/+MEF细胞生存力的48％和73％、p53(-/-)细胞减少了15％和50％的细胞生存力(表3)。在带有野生型p53的MEF细胞中，阿霉素诱导的细胞死亡比那些不带有功能性p53的细胞多35％。同样，雷公藤内酯和阿霉素的组合减少了p53(+/+)细胞88％的生存力，但仅减少p53(-/-)细胞55％的生存力。因此，功能性p53在介导雷公藤内酯诱导的细胞死亡中起作用。
Mdm2和p21的表达在经雷公藤内酯处理的细胞中被下调：p53介导的细胞程序死亡的一个模型是，在细胞应激(如DNA损伤)时，p53是稳定的，这增加了mdm2、bax、p21Cip/Waf1和gadd45基因的表达。Mdm2通过直接的蛋白质结合和/或泛素/蛋白体降解介导核的输出，从而包负向调节p53的稳定性。在DNA损伤(如γ辐射)时，由DNA-PK或ATM产生的p53的15位和392位丝氨酸的磷酸化干扰了Mdm2结合于p53以及靶向p53以进行降解的能力。
为了确定雷公藤内酯诱导的细胞程序死亡中是否存在类似的机制，检测了位于p53反式激活的下游的几种基因的水平。当用阿霉素(100nM)处理MCF-7细胞时，Mdm2 mRNA和蛋白质约有1.5-2倍的增加。Mdm2的这种增加与p53水平的增加平行，它也导致了bax和p21 mRNA的增加。
但是，在用雷公藤内酯处理的细胞中，mdm2 mRNA有一时间依赖性的降低。为了测量雷公藤内酯对mdm2基因表达的影响，使用荧光素酶载体，该载体含有从来自mdm2启动子的共有序列p53结合的位点。尽管在雷公藤内酯处理的MCF-7细胞中p53的水平高，但是在雷公藤内酯的存在下该报道基因构建物的反式激活有约30％的减少。但是，阿霉素经过16小时增加了Mdm2 15％的反式激活。由雷公藤内酯产生的依赖p53的基因的抑制不是普遍的影响，因为同样由p53诱导的gadd45和延伸因子1-α(EF-1α)并未受到影响。因而，雷公藤内酯诱导了p53，但抑制了一些依赖p53的基因的表达。
为了确定经雷公藤内酯处理的细胞中p53靶基因没有增加是否是因为缺乏p53易位，在用雷公藤内酯处理后检测了p53易位至核中的情况。用阿霉素处理的细胞中有大量的p53易位至核中，与之相比，用雷公藤内酯(20ng/ml)处理的细胞中也有大量的p53易位至核中。
在用5ng/ml雷公藤内酯处理8或24小时的MCF-7细胞中Mdm2蛋白质的水平并没有显著的改变，此剂量的雷公藤内酯仅仅减少了10％的细胞生存能力。在用20ng/ml雷公藤内酯处理8小时的MCF-7细胞中Mdm2有大约1.5倍的增加，但是到24小时Mdm2蛋白质几乎完全损失(图4)。同样，在雷公藤内酯处理的MCF-7细胞中p21蛋白质的水平有3倍的降低，但Bax的水平并未有显著的变化。
雷公藤内酯诱导p53的翻译：为了确定雷公藤内酯诱导p53的机制，我们检测了雷公藤内酯对p53蛋白质稳定性和翻译的影响。为了检测对稳定性的影响，我们检测了MCF-7细胞中p53在环己酰亚胺(30μg/ml，阻滞翻译的剂量)的存在下的水平。当在加入环己酰亚胺前用雷公藤内酯预处理细胞0.5小时时，p53的稳定性在30分钟时有轻微的增加，但在60分钟时与未处理的细胞没有显著的差异。这些数据表明p53蛋白对雷公藤内酯的响应而增加的稳态水平并不是p53蛋白半衰期增加的结果。然后，我们通过体内MCF-7细胞的[35S]甲硫氨酸代谢标记检测雷公藤内酯是否诱导p53的翻译。我们发现，令人感兴趣的是，雷公藤内酯诱导p53翻译增加了4.9倍(图5B)。因而，雷公藤内酯诱导的p53积聚是由p53翻译的增加介导的。
雷公藤内酯诱导MCF-7细胞几乎70％的细胞死亡并提高A549和HT1080细胞由化疗诱导的细胞死亡：为了描述雷公藤内酯介导细胞程序死亡的可能的机制，研究了p53肿瘤抑制基因的作用。雷公藤内酯在几种野生型p53肿瘤细胞系中诱导了p53蛋白的表达，野生型p53明显地提高了雷公藤内酯的毒性。有趣的是，雷公藤内酯诱导突变体p53肺癌细胞系中80％以上的细胞的细胞死亡，这样在雷公藤内酯诱导的细胞程序死亡中不需要功能性的p53。这里给出的数据表明，雷公藤内酯单独以及与损伤DNA药物一起介导了带有野生型p53的肿瘤细胞依赖p53的细胞程序死亡途径。观察到雷公藤内酯在转录后水平增加了p53的水平。这由p53五倍的增加所介导。
雷公藤内酯处理的细胞中Mdm2蛋白的后期减少提供了p53增加的另外一种机制，以及雷公藤内酯在损伤DNA的药物的存在下怎样维持p53的诱导的可能机制。雷公藤内酯介导的下游p53基因的抑制可能抑制生存因子(如MAP4和IGF1受体)的表达。由于雷公藤内酯与损伤DNA的药物的组合提高了细胞毒性，因此它还有可能干扰了DNA修补。但是，如彗星实验(comet assay)所揭示的，雷公藤内酯并没有诱导DNA链的断裂。
上述结果证明，雷公藤内酯诱导了p53，而该功能性p53增强了雷公藤内酯诱导的细胞程序死亡。还显示雷公藤内酯提高了损伤DNA的药物的细胞毒性。雷公藤内酯单独的细胞毒性活性及其与其它细胞毒药物协作的能力代表了一种新颖的于体内增加实体瘤细胞裂解的方法。实施例3：与CPT-11的协同组合方法和材料小鼠
从Taconic(Germantown，NY)购得雌性NCr裸小鼠，当使用时通常为20-24克。将小鼠放在顶部装有灭菌过滤器的经高压蒸汽灭菌的微型隔离器小笼子中，可以毫无限制地获得无菌水和无菌食物。笼子保持中在提供经过滤的空气的隔离器单元(Lab Products公司，Maywood，New Jersey)。
裸小鼠异种移植物模型
使HT1080肿瘤细胞在组织培养瓶中生长，使用EDTA和胰蛋白酶收集。将细胞离心，适当地调整有活力的细胞的浓度。每只雌性NCr裸小鼠皮内注射五百万个HT1080肿瘤细胞。在细胞植入后通过测量肿瘤的宽度、长度和厚度检测肿瘤的大小，并使用公式计算其体积。当达到适当的肿瘤体积时，将小鼠分组，使实验中每组小鼠的平均肿瘤大小类似，然后开始处理。不处理对照小鼠。PG490-88处理的小鼠在第0-5和第7-11天IP注射PG490-88的磷酸缓冲盐溶液(0.75mg/kg)。CPT-11处理的小鼠在第1、5和9天IV注射CPT-11的磷酸盐缓冲盐溶液(11mg/kg)。组合治疗的小鼠接受PG490-88和CPT-11处理。
结果显示在图6和表3中。在对数正态分布的原始期望的基础上对数据进行分析，这种分析是许多生物度量的预期行为，并以正比于信号的大小的标准偏差表征。生物系统中的联合作用常常被定义为倍增的模型，而非简单的加和模型。这是因为，除其它原因外，对于许多现象，包括肿瘤体积度量，存在着零的下界。
这些数据的统计学分析证实组合是协同性的，在此，协同作用定义为对(对数变换空间中的)加和性所得模型的任何偏离。对加和性的偏差由最小二乘方线性模型中的统计学上的显著的相互作用项(term)指示。本实验的数据显示相互作用项的统计学显著性随时间而持续增加，并且这些数据与其结果由治疗而非随机的影响所产生的机制性预期一致。
                                                    表3
概要   第0天   第4天   第7天   第10天   第14天
  TV平均值 SE  TV平均值 SE  TV平均值 SE  TV平均值 SE  TV平均值 SE
 对照   103   15   293   49   536  69   616 164   980  380
 PG490-88，0.75IP，5X/wk   107   20   167   14   208  18   247 21   532  55
 CPT-11，11，每4天一次IV   107   36   157   60   209  65   268 72   495  112
 PG490-88(0.75)，IP+CPT-11(11)，IV   107   31   106   22   35  7   12 3   1  0
其中TV是肿瘤体积。

Claims (19)

1.一种治疗过度增生性疾病的方法，该方法包括：
使抗增生药和具有下式结构的双萜三环氧化物的组合物以能大量减少靶细胞群数量的有效的组合剂量与靶细胞群接触：其中
X1是OH、＝O或OR1；
X2和X3独立地表示OH、OR1或H；
R1是-C(O)-Y-Z，其中，Y是C1-C6支链或非支链烷基或链烯基；Z是COOR2、NR3R3＇或+NR4R4＇R4″，R2为阳离子，R3和R3＇独立地是H或C1-C6支链或非支链烷基、羟烷基或烷氧基烷基，或者R3与R3＇一起形成5-7元杂环，环原子选自碳、氮、氧和硫，包括2-6个碳原子，或者多个氮原子，可任选地包括一个以上的氧原子或硫原子，环未被取代，或者被选自R5、OR5、NR5R6、SR5、NO2、CN、C(O)R5、C(O)NR5R6以及卤素(氟、氯、溴或碘)中的一个或多个基团取代，其中R5和R6独立地为氢、低级烷基或低级链烯基，R4、R4＇和R4″独立地表示C1-C6支链或非支链烷基、羟烷基或烷氧基烷基。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，双萜三环氧化物选自雷公藤内酯、雷公藤羟内酯、16-羟基雷公藤内酯、雷公藤内酯琥珀酸酯、雷公藤内酯的酯衍生物、雷公藤羟内酯的酯衍生物和16-羟基雷公藤内酯的酯衍生物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过度增生性疾病选自癌症、再狭窄、动脉粥样硬化、植入支撑管性狭窄、血管移植性再狭窄、纤维化疾病、牛皮癣、炎症、关节炎、肾小球肾炎、子宫内膜异位、黄斑变性疾病和自身免疫疾病。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过度增生性疾病是癌症。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是人肿瘤。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是实体瘤。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是癌瘤。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述癌症具多抗药性。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述癌症表达功能性p53蛋白。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗增生药是损伤DNA的化合物。
11.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗增生药是紫杉醇。
12.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗增生药是拓扑异构酶的抑制剂。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述拓扑异构酶抑制剂选自伊立替康、阿霉素和卡铂。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述双萜三环氧化物和抗增生药配制在同一药剂中给药。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分别配制所述双萜三环氧化物和抗增生药。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗增生药和双萜三环氧化物的组合物产生协同反应。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗增生药是损伤DNA的化合物。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述抗增生药是紫杉醇。
19.一种治疗过度增生性疾病的组合物，该组合物包含：
以能大量地减少靶细胞群数量的有效的组合剂量的抗增生药和具有下式结构的双萜三环氧化物：其中
X1是OH、＝O或OR1；
X2和X3独立地表示OH、OR1或H；
R1是-C(O)-Y-Z，其中，Y是C1-C6支链或非支链烷基或链烯基；Z是COOR2、NR3R3＇或+NR4R4＇R4″，R2为阳离子，R3和R3＇独立地是H或C1-C6支链或非支链烷基、羟烷基或烷氧基烷基，或者R3与R3＇一起形成5-7元杂环，环原子选自碳、氮、氧和硫，包括2-6个碳原子，或者多个氮原子，可任选地包括一个以上的氧原子或硫原子，环未被取代，或者被选自R5、OR5、NR5R6、SR5、NO2、CN、C(O)R5、C(O)NR5R6以及卤素(氟、氯、溴或碘)中的一个或多个基团取代，其中R5和R6独立地为氢、低级烷基或低级链烯基，R4、R4＇和R4″独立地表示C1-C6支链或非支链烷基、羟烷基或烷氧基烷基。
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