CN1307421C - 克服生物及化学治疗抗性的方法与组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种通过使靶细胞与候选治疗剂接触而鉴定潜在的治疗剂的方法，该治疗剂是该细胞中内源胞内酶的选择性底物，由于生物治疗或化学治疗的选择该酶的表达增强。本发明也提供通过使细胞与一种前体药物接触而选择性杀伤病理细胞的方法及分子实例，该前体药物是一种内源胞内酶的选择性底物。前体药物随后转化为一种细胞毒素。本发明进一步提供一种方法，用于通过对受试者施用一种前体药物治疗该受试者特征为病理性过度增殖细胞的病状，该前体药物是一种超量表达的内源胞内酶的选择性底物，并且在过度增殖细胞中能被该酶转化为一种细胞毒素。

Description

克服生物及化学治疗抗性的方法与组合物
技术领域
本发明涉及药物发现领域，尤其涉及前体药物的设计，该前体药物是决定病理细胞对癌症治疗抗性的胞内酶的底物，并且能被该胞内酶转化为一种细胞毒素。
在本公开内容中，按第一作者和日期、专利号或公开文本号参考了许多发表的文献。在本申请的最后、权利要求书之前能看到每一参考文献的全部文献引文。这些参考文献的公开内容在此引入本公开内容中作为参考，以更完全地描述本发明所属领域的现有技术。
癌细胞的特征在于不受控制的生长、去分化和遗传不稳定性。不稳定性表现为异常的染色体数、超出正常二倍数的染色体缺失、重排、丢失或重复。Wilson，J.D.等人(1991)。这一基因组不稳定性可能是由几种因素引起的。最佳表征的因素之一是肿瘤抑制基因功能丧失后发生的增强的基因组可塑性(例如，Almasan，A.等人(1995))。基因组可塑性有助于肿瘤细胞对其改变的环境的适应性，并可引起更频繁的突变、基因扩增和染色体外元件的形成(Smith，K.A.等人(1995)和Wilson，J.D.等人(1991))。这些特征提供了可导致更有侵占性的恶性肿瘤的机制，因为它使肿瘤快速发展了对天然宿主防御机制、生物治疗(Wilson，J.D.等人(1991)和Shepard，H.M.等人(1988))及化疗药物的抗性。Almasan，A.等人(1995)和Wilson，J.D.等人(1991)。
癌症是世界范围内最常见的致死性人类疾病之一。应用抗癌药的治疗是越来越重要的一种选择，对于全身性恶性肿瘤或已经超过外科治愈可能性状态的转移癌尤其如此。遗憾地，现今可进行有效治疗的人类癌症类型的亚群还相当少(Haskell，C.M.编(1995)，32页)。能治愈人类癌症的药物的开发进展缓慢。恶性肿瘤在遗传学、生物学和生物化学以及对治疗的原发抗性或治疗诱导的抗性方面存在的异质性都减弱了有效治疗。此外，许多抗癌药只显示低水平的选择性，常常引起严重的乃至危及生命的毒副作用，从而阻止了足以杀死所有癌细胞的高剂量的应用。因此，寻找具有对治疗抗性病理性恶性细胞的选择性增加的抗肿瘤剂仍是药物开发的中心任务。另外，对抗生素的普遍抗性正成为一个重要的、世界范围的健康问题。Segovia，M.(1994)和Snydman，D.R.等人(1996)。化疗剂的种类
药剂的主要种类包括：烷化剂、抗肿瘤抗生素、植物生物碱、抗代谢物、激素激动剂和拮抗剂以及多种其它药剂。参见，Haskell，C.M.编，(1995)和Dorr，R.T.和Von Hoff，D.D.(1994)。
传统的烷化剂是高度反应性的化合物，具有用烷基取代某些有机化合物的氢原子的能力。核酸主要是DNA的烷化对于大多数这类化合物来说是关键的细胞毒性作用。它们引起的损伤干扰DNA复制和RNA转录。传统的烷化剂包括：氮芥、苯丁酸氮芥、抗瘤氨酸、环磷酰胺、异环磷酰胺、塞替派和白消安。许多非传统型的烷化剂也损伤DNA和蛋白质，但它们是通过不同且复杂的机制，如甲基化或氯乙基化作用，这不同于传统型的烷化剂。非传统型的烷化剂包括：达卡巴嗪、卡氮芥、洛莫司汀、顺铂、卡铂、甲基苄肼和六甲密胺。
临床有用的抗肿瘤药是土壤真菌链霉菌属不同株的天然产物。它们通过一种或更多的机制产生杀肿瘤作用。所有这些抗生素都能结合DNA，通常通过插入结合，随后是螺旋的解旋。这种变形削弱了DNA充当DNA合成、RNA合成或两者皆有的模板的能力。这些药物也可通过自由基的形成及重要金属离子的螯合而损伤DNA。它们也可作为拓扑异构酶II—一种对于细胞分裂关键的酶—的抑制剂。这类药物包括：阿霉素、柔红霉素、去甲氧柔红霉素、米托蒽醌、博来霉素、更生霉素、丝裂霉素C、普卡霉素和链脲霉素。
植物提供了一些最有用的抗肿瘤剂。三组这类药剂是长春花生物碱(长春花新碱和长春花碱)、表鬼臼毒素(表鬼臼毒吡喃葡糖苷和表鬼臼毒噻吩糖苷)和紫杉醇(太平洋紫杉素)。发现长春花生物碱能与正在分裂的细胞和神经系统中的微管蛋白结合。这种结合改变了有丝分裂纺锤体末端处微管蛋白加入与损失的动力学，最终导致有丝分裂停止。相似的蛋白质组成了神经组织的重要部分；因此，这些药剂是神经毒性的。表鬼臼毒素能抑制拓扑异构酶II，因此对细胞功能具有深远影响。紫杉醇对微管具有复杂的影响。
抗代谢物是细胞功能和复制所需正常代谢物的结构类似物。它们一般通过与细胞酶相互作用而起作用。已经开发并临床测试的多种抗代谢物有氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(FUDR)、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤(6-MP)、6-硫代鸟嘌呤、脱氧助间型霉素、氟达拉滨、2-氯脱氧腺苷和羟基脲。
对于几种类型的肿瘤性疾病，内分泌处理是一种有效的疗法。已经发展了可用于肿瘤学的多种激素和激素拮抗剂。可用的激素药剂的实例有己烯雌酚、三苯氧胺、醋酸甲地孕酮、地塞米松、强的松、氨基导眠能、亮丙瑞林、戈舍瑞林、氟他胺和醋酸奥曲肽。
常用化疗剂的缺点
当前与化疗剂治疗癌症的应用有关的问题有：所需药剂的高剂量；对正常细胞的毒性，即缺乏选择性；免疫抑制；继发恶性肿瘤；以及抗药性。
现今用于癌症化学治疗的大多数药剂通过一种抗增殖机制起作用。然而，大多数人类实体肿瘤没有高比例的快速增殖细胞，因此对这类药剂不是特别敏感。而且，大多数抗肿瘤剂具有陡的剂量反应曲线。由于宿主毒性，不得不在大大低于杀伤所有存活肿瘤细胞所需剂量的剂量水平停止治疗。
与当今治疗有关的另一个副作用是化疗药物对分裂最快的正常宿主组织如骨髓、肠粘膜和淋巴系统细胞的毒性作用。这些药剂也引起多种其它副作用，包括：神经毒性；对性欲和生殖腺功能的负作用；以及心、肺、胰和肝毒性；血管和超敏反应，及皮肤反应。
对于临床实践中使用的多种抗肿瘤药物，血液毒性是最危险的毒性形式。其最常见的形式是中性白细胞减少，伴随有高感染危险，尽管血小板减少和出血也可发生，并且是危及生命的。化学治疗也可诱导多形核白细胞和血小板两者功能的性质缺陷。已经开发  了造血生长因子来克服这些重要的副作用。Wilson，J.D.，等人(1991)及Dorr，R.T.和Von Hoff，D.D.，编(1994)。
大多数常用抗肿瘤剂能够抑制细胞和体液免疫两者。感染通常导致晚期癌症受试者的死亡，免疫力的损伤可能引起这些死亡。慢性迟发型免疫抑制也可由癌症的化学治疗引起。
神经毒性的主要形式是蛛网膜炎、脊髓病或脑脊髓病、慢性脑病和嗜睡综合症、急性脑病、周围神经病以及急性小脑综合症或共济失调。
许多常用抗肿瘤剂是致突变的及致畸形的。其中某些明确地是致癌的，包括甲基苄肼和烷化剂。这种致癌能力首先在用多功能烷化剂和拓扑异构酶II抑制剂如表鬼臼毒吡喃葡糖苷和anthracycline抗生素治疗的受试者中发现，为迟发型急性白血病。化学治疗也与迟发型非何杰金氏淋巴瘤和实体瘤的病例有关。本发明将使这些作用减至最小，因为前体药物只在肿瘤细胞中被激活。
化疗剂的临床实用性由于耐受该药物的恶性肿瘤细胞的出现而被严重限制。多种细胞机制可能与抗药性有关，例如，药物代谢的改变、细胞对活性化合物的不透性或药物从细胞中的加速排出、抑制酶的特异性改变、靶分子的产生增加、细胞毒性损伤修复的增强、或通过另一种生化途径绕过被抑制反应。有些情况中，对一种药物的抗性可赋予对另一种生物化学上不同的药物的抗性。某些基因的扩增与对生物及化学治疗的抗性有关。编码二氢叶酸还原酶的基因的扩增与氨甲蝶呤抗性有关，而编码胸苷酸合成酶的基因的扩增与5-氟嘧啶治疗抗性有关。表1总结了生物及化学治疗抗性中的一些重要酶。
表1化学治疗抗性中超量表达的酶
酶     生物或化学治疗 参考文献(实例)
胸苷酸合成酶     基于尿嘧啶的 Lonn，U.等人
基于叶酸的基于喹唑啉的   Kobayashi，H.等人Jackman.A.L.等人
二氢叶酸还原酶 基于叶酸的   Banerjee，D.等人Bertino，J.R.等人
酪氨酸激酶 TNF-α多药抗药性   Hudziak，R.M.等人Stuhlinge,M.等人
MDR相关蛋白质(ABC P-gp蛋白质) 多药抗药性   Simon，S.M.和Schindler，M.Gottesman，M.M.等人
CAD* PALLA**   Smith，K.A.等人Dorr，R.T.和Von Hoff，D.D.编
核糖核苷酸还原酶 羟基脲   Wettergren，Y.等人Yen，Y等人
*CAD＝氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸转氨甲酰酶、二氢乳清酸酶
**PALA＝N-(磷酸乙酰基)-L-天冬氨酸
前体药物作为一种溶液提高化疗剂选择性的应用
早已认识到抗癌剂的选择性不好，并进行了大量努力来提高选择性并使得能施用更大的剂量。一种方法是前体药物的发展。前体药物是毒理学惰性但可被体内转化为活性有毒产物的化合物。在某些情况中，通过由抗体(“ADEPT”或抗体-依赖的酶前体药物治疗(美国专利号4,975,278))或基因寻靶(“GDEPT”或基因依赖的酶-前体药物治疗(Melton，R.G.和Sherwood，R.F.(1996)))向靶细胞输送的非内源性酶的作用发生激活。这些技术在从血液中排出和渗入肿瘤的能力方面具有严格限制。Connors，T.A.和Knox，R.J.(1995)。
因此，需要更高选择性的药剂，其能渗入肿瘤中并抑制增殖和/或杀伤已发展为治疗抗性的癌细胞。本发明满足了这一需要并且也提供了有关优点。
发明概述
本发明提供了一种通过使靶细胞或试验细胞与一种候选治疗剂或前体药物接触而鉴定潜在的治疗剂的方法，该药剂是细胞中一种目标酶的选择性底物。在一种实施方案中，该目标酶是超量表达并赋予生物及化学治疗剂抗性的内源胞内酶。在一种不同的实施方案中，由于肿瘤抑制基因功能的丧失(Smith，K.A.等人(1995)及Li，W.等人(1995))和/或先前进行的化学治疗的筛选作用(Melton，R.G.和Sherwood，R.F.(1996))，肿瘤细胞中该酶的活性大大提高。在一种不同的实施方案中，该目标酶是一种外源基因在细胞中的表达产物，其中该外源基因编码一种目标酶。
细胞与候选前体药物在体外和/或体内接触后，通过观察该药剂是否引起细胞增殖的降低或该药剂是否杀伤细胞来测定药剂效能。在本发明的一方面，通过目标酶从前体药物中释放毒性副产物，使前体药物杀伤细胞或抑制细胞增殖。在本发明的另一方面，能用一种或更多的“目标酶”激活前体药物使其释放毒性副产物。
本发明的另一方面包括用于测定具有在此所述的特性、针对目标酶的新前体药物的试剂盒。该试剂盒包含完成测定及分析结果所必需的试剂和说明书。
本发明也提供通过使细胞与一种前体药物接触而选择性杀伤病理细胞的方法及分子实例，该前体药物是一种目标酶(例如上述内源胞内酶)的选择性底物。该底物可被胞内目标酶特异地转化为一种细胞毒素。在本发明的另一方面，最初预反应的产物随后被一种常见的细胞酶如酰基转移酶、磷酸酶或其它“看家”酶激活(Voet，等人(1995))，而从前体药物释放毒性副产物。
本发明进一步提供一种方法，用于通过对受试者施用一种前体药物治疗该受试者特征为病理性过度增殖细胞的病状，该前体药物是一种目标酶的选择性底物，并且可在过度增殖细胞中被该酶选择性地转化为一种细胞毒素。本发明的前体药物可单独使用，或者与其它化疗药物或抗癌治疗如放射疗法结合使用。
本发明的再一方面为一种药物的制备，该药物用于通过对受试者施用一种前体药物治疗该受试者特征为病理性过度增殖细胞的病状，该前体药物是一种目标酶的选择性底物，并且可在过度增殖细胞中被该酶选择性地转化为一种细胞毒素。
附图简述
图1显示细胞对抗癌方法抗性模式的发展及结果。
图2用示意图显示本发明的前体药物的激活途径。
图3用示意图显示对前体药物的高流通量筛选，该前体药物可被抗药性中重要的胞内酶激活。
图4用示意图显示如何利用TS-阴性的大肠杆菌作为细胞靶标测定先导人胸苷酸合成酶(TS)前体药物。
图5显示一种实例，关于如何利用这种筛选同时优化前体药物对两种目标酶的反应性。
发明详述
利用与癌细胞生物及化学治疗抗性密切相关的一些关键基因组和表型改变来完成本发明。本发明提供一种方法，用于体内选择性地抑制由于接受癌症治疗(包括生物治疗如肿瘤坏死因子(TNF)或化学治疗)而经受筛选的细胞的生长和/或杀伤这些细胞。(参见表1)。结果，某些被突变或基因扩增激活的酶对该药剂的进一步治疗有抗性。与致力于产生更有效的内源胞内酶抑制剂的现有技术治疗不同，本发明利用比正常细胞及组织中活性更高的与治疗抗性疾病细胞及组织有关的酶，而不依赖于对该酶的抑制。一方面，用本发明的前体药物成功治疗的肿瘤细胞特征在于目标酶活性的提高，因此与不超量表达目标酶的正常细胞相比，具有大大提高的将前体药物转化为其毒性形式的能力。在此用术语“目标酶”定义具有一种或多种上述特征的酶。
在此使用时，术语“宿主细胞”、“靶细胞”和“过度增殖细胞”包括特征为被基因突变或胞内酶内源性超量表达激活的各种细胞。在一些实施方案中，酶的超量表达与抗药性或病理表型相关的遗传不稳定性有关。多种细胞机制与抗药性有关，例如，药物代谢的改变、细胞对活性化合物的不透性或药物从细胞中的加速排出、被抑制酶的特异性改变、靶分子的产生增加、细胞毒性损伤修复的增强、或通过另一种生化途径绕过被抑制的反应。激活的或超量表达并与抗药性有关的酶包括但不限于：胸苷酸合成酶(TS)(Lounn，U.等人(1996)；Kobayashi，H.等人(1995)；Jackman.A.L.等人(1995))、二氢叶酸还原酶(Baneriee，D.等人(1995)和Bertino，J.R.等人(1996))、酪氨酸激酶(TNF-α，Hudziak，R.M.等人(1988))和多药抗药性(Steuhlinger，M.等人(1994)；Akdas，A.等人(1996)；及Tannock，I.F.(1996))；及ATP依赖的多药抗药性相关蛋白质(Simon，S.M.和Schindler，M.(1994))。此外，对一种药物的抗性可赋予对其它生物化学上不同的药物的抗性。虽然本申请特别针对癌症，但相似的方法也能应用于人与动物病原体编码的酶，其中这些酶由于抗性的发展而使抑制剂失效。
某些基因的扩增与对化学治疗的抗性有关。二氢叶酸还原酶(DHFR)的扩增与氨甲蝶呤抗性有关，而编码胸苷酸合成酶的基因的扩增与利用5-氟嘧啶的肿瘤治疗抗性有关。利用如Kashani-Sabet等人(1988)或美国专利号5,085,983中所述的改进的聚合酶链反应(PCR)能检测并监测抗药性相关基因的扩增。可通过检测细胞遗传异常监测获得的抗药性，如均匀染色体染色区和双微染色体，这两者都与基因扩增有关。其它的测定法包括与基因扩增有关的直接或间接酶活性测定(例如，Carreras和Santi(1995))、其它方法(例如聚合酶链反应，Houze，T.A.等人(1997)，或免疫组织化学方法(Johnson，P.G.等人(1997))。
此外，靶细胞特征为肿瘤抑制基因功能的失活，例如成视网膜细胞瘤(RB)或p53基因的丢失或失活，已知其增强TS(Li，W.等人(1995))或DHFR(Bertino，等人(1996)和Li，W.等人(1995))的表达。
本发明的前体药物可用于治疗或改善这样的任一疾病，其中疾病相关酶与对化疗药物及某些实施方案中的抗药性有关，其中与正常细胞相比在病理细胞中该酶例如TS酶超量表达、超量积累或被激活。尤其不包括谷胱甘肽-S-转移酶，据显示它在某些人肿瘤中升高。Morgan，A.S.等人(1998)。本发明的前体药物具有选择性，这是基于与正常细胞相比在病理细胞中本发明的目标酶通常超量表达、超量积累或被激活。区别本发明与其它方法的最重要的原则是：
(1)本发明描述了酶如胸苷酸合成酶的底物的合成。超量表达的酶主要在疾病细胞中产生毒素。以前的方法依靠抑制剂。抑制剂导致酶的表达增强，随后是对治疗的抗性(参见，例如Lonn，U.等人(1996))。
(2)本方法也可与其它“底物-前体药物”方法，例如谷胱甘肽-S-转移酶(参见，例如Morgan，A.S.等人(1998))相区别。GST家族的酶应答细胞的毒性损伤而以提高的水平表达。GST家族的酶具有重叠的底物特异性，这使之不可能设计只对癌细胞中增强表达的一种酶有反应性的底物(Morgan，A.S.等人(1998))。因为本发明的每种酶(例如，胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶和胸苷激酶)就结构和底物特异性而言是独特的，所以易于设计独特的底物。在本申请的说明书中提供了胸苷酸合成酶的底物的几种实例。
(3)在某些情况下，编码目标酶(例如，胸苷酸合成酶)的基因可经受突变，以产生对抑制剂的抗性，但仍能与非抑制剂底物进行反应。Barbour，K.W.等人(1992)和Dicken，A.P.等人(1993)。
药物试验
本发明提供了一种方法，用于鉴定对过度增殖性或肿瘤性疾病(如癌症)具有治疗能力的药剂。该方法也能鉴定抑制过度增殖细胞(如癌细胞)的细胞生长或细胞周期的药剂。包括的其它细胞有细菌、酵母和寄生虫细胞，它们由于在受试者中不当的增殖而引起疾病。如果相对于对照样品中的细胞，这些细胞的增殖、复制或细胞周期减低或受抑制，则认为该药剂是一种有效的治疗剂。最优选地，细胞被该药剂杀死。细胞可以是原核的(细菌，如大肠杆菌)或真核的。细胞可以是哺乳动物或非哺乳动物细胞，例如，可致疾病的小鼠细胞、大鼠细胞、人细胞、真菌(例如酵母)或寄生虫(例如，肺囊虫属(Pneumocystis)或利什曼原虫属(Leishmania))。
在此使用时，“过度增殖细胞”是指包括去分化的、无限增殖的、肿瘤、恶性肿瘤、转移或转化的细胞。这类细胞的实例包括但不限于：肉瘤细胞、白血病细胞、癌细胞或腺癌细胞。更具体而言，该细胞可以是乳腺癌细胞、肝细胞瘤细胞、结肠直肠癌细胞、胰癌细胞、食道癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、皮肤癌细胞、肝癌细胞或胃癌细胞。在另一种实施方案中，靶细胞可能对一种药物或化合物有抗性，该药物或化合物可用来防止或杀伤被一种耐受常规抗生素的传染物感染的细胞。传染物包括细菌、酵母和寄生虫，如锥虫。
表1(见前)或表2(见后)中列出了为本发明目的物的目标酶的具体实例。这些酶与对化学治疗的抗性有关，其在特征为癌症治疗抗性并与一种病理或疾病相关的细胞中被内源激活、超量表达或超量积累，包括但不限于下列酶：如酪氨酸激酶超家族的成员或ATP依赖的MDR相关蛋白质、CAD、胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶和核糖核苷酸还原酶。表2提供了在传染病中可由该方法作为靶点的酶的列表。
表2 在传染病中超量表达并引起抗药性的酶
酶                  引起对下列物质的抗性提高：
β-内酰胺酶         青霉素及其它含β-内酰胺的抗生素
氨基糖苷酶或氨基    氨基糖苷类抗生素(例如，链霉素、
糖苷修饰酶          庆大霉素)
氯霉素转乙酰酶      氯霉素
二氢叶酸还原酶      三甲氧苄二氨嘧啶
参考文献：《微生物病机理》(Mechanisms of Microbial Disease)，第二版，M.Schaechter，G.Medloff，B.I.Eisenstein，编辑TS Satterfield.Williams and Wilkins出版，973页(1993)。
用本发明的方法鉴定的潜在的治疗剂是一种前体药物，其为酶的底物并能被细胞内转化为一种胞内毒素。在此使用时，“前体药物”是一种药物活性剂或底物的前体或衍生形式，与药物代谢物相比它对靶细胞或过度增殖细胞细胞毒性低，并且能被酶激活或转化为更具活性的形式(参见Connors，T.A.(1986)和Connors，T.A.(1996))。药剂的毒性针对产生一定量转化酶的细胞，此酶量在疾病细胞中可有效地产生治疗浓度的细胞毒素。
本发明也提供了一种快速且简单的筛选试验，它可利用至少某些希望的特性对化合物进行最初鉴定。对于本发明，图3显示了一种实施方案的总示意图。该附图描述了如何安排该试验，及该方法所必需的材料。如图3所示，该试验需要两种细胞类型，第一种是对照细胞，其中目标酶不表达或以低水平表达，第二种细胞类型是试验细胞，其中目标酶以可检测的水平如高水平表达。例如，不内源表达目标酶TS的原核大肠杆菌是一种合适的宿主细胞或靶细胞。该细胞能有一种对照对应物(缺乏目标酶)，或者在一种不同的实施方案中，有一种经遗传修饰的可差异地表达目标酶，或者多种酶(含有目标酶的合适种)的对应物。能用超过一种的酶分别转导不同的宿主细胞，使得能同时比较候选药物对目标酶的作用与它对另一种酶或对来源于另一个种的相应酶的作用。
在另一种实施方案中，基因工程改造转化的细胞系，如ras-转化的NIH3T3细胞(ATCC，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，，表达量不同，但数量均增加了)，使之从编码目标酶的克隆cDNA中表达可变且越来越高的量的目标酶。应用本领域众所周知的及Chen，L.等人(1996)、Hudziak，R.M.等人(1988)或Carter，p.等人(1992)所述的方法，瞬时转染或者是持久转染。用于cDNA插入的合适载体可从Stratagene，LaJolla，CA及其它供应者处购得。每种转染细胞系中酶的表达水平能通过细胞裂解物的免疫印迹和酶测定来监测，其中使用先前为了免疫检测制备的针对该酶的单克隆或多克隆抗体。参见，例如，如Chen，L.等人(1996)所述。表达量可通过引入细胞中的表达盒的拷贝数或通过不同启动子的应用来调节。也能如Carreras，C.W.和Santi，D.V.(1995)所述进行酶测定。
如上所述，含有希望的遗传缺陷的细胞可从冷泉港农业研究服务培养物收藏所或美国典型培养物保藏中心获得。通过利用Miller(1992)、Sambrook等人(1989)和Spector等人(1997)所述的标准技术将编码目标酶的基因插入细胞中，也能制备合适的菌株。生长测定能用Miller(1992)和Spector等人(1997)所述的标准方法进行。
本领域的技术人员应当理解，图3所示筛选能广泛用于抗生素的发现。例如，来源于酵母的胸苷酸合成酶能替代图4中大肠杆菌的胸苷酸合成酶。这使针对酵母相关病原体的特定抗真菌抗生素的发现成为可能。另外，也能对其它酶进行这一处理。例如，能筛选特异针对传染物如卡氏肺囊虫(Pneumocystis carnii)的二氢叶酸还原酶活性的前体药物。通过使用图3所述筛选试验，以针对目标酶的特异性筛选这些药剂，并且药剂应不激活天然宿主的酶。为了显示仅有正常人酶存在时无毒性，对照细胞构建体中应含有相应的正常人酶。
例如，如图4所示，能将一种外源基因，如编码TS的人基因插入宿主细胞中，使得人TS表达。这种基因工程细胞在图3中被表示为“试验细胞”。“对照细胞”不表达目标酶。在某些实施方案中，对培养基补充目标酶的蛋白质产物可能是必要的。
在一种不同的实施方案中，野生型宿主细胞是缺陷型的或者不表达多于一种的目的酶。如图4所示，宿主细胞不内源产生胸苷激酶(TK-)或胸苷酸合成酶(TS-)。将编码这些酶的人对应物的基因引入宿主细胞中获得希望的表达水平。每种转染细胞系中酶的表达水平能用在此所述的方法监测，例如，通过细胞裂解物的免疫印迹和酶测定，其中使用先前为免疫检测制备的针对该酶的单克隆或多克隆抗体。参见，例如，如Chen，L.等人(1996)所述。也能使用可检测地标记的取代基如氚标记的取代基，如Carreras，C.W.和Santi，D.N.(1995)所述进行酶测定。
在多孔小平板中培养试验细胞，并用来检测所试前体药物的生物学活性。对于本发明，成功的候选药物将阻断生长或杀伤试验细胞型，但不会使对照细胞型受到损伤。
候选药物能直接加入细胞培养基中，或者先与特异于细胞表面受体的配体结合，然后加入培养基中。用于细胞特异性输送的结合方法在本领域众所周知，参见例如美国专利号5,459,127；5,264,618；和公开的专利说明书WO 91/17424(1991年11月14日公开)。候选前体药物的离去基团例如能用氚可检测地标记。然后测定靶细胞或培养基中从候选前体药物释放的标记物的量。此外，应用Lasic，D.D.(1996)所述的方法将前体药物包装于脂质体中，或者如Lewis，J.G.等人(1996)所述与细胞转染剂结合，可增强细胞摄取。
在一种不同的实施方案中，如上所述鉴定培养的超量表达目的酶(即目标酶)的人肿瘤细胞。在有利于药剂掺入细胞的胞内区室中的条件下，使细胞与有效的治疗剂相接触。然后测定细胞之细胞增殖的抑制或细胞的杀伤。
以下概述可用来激活本发明前体药物的细胞和目标酶。
胸苷酸合成酶
胸苷酸合成酶的超量表达与结肠直肠癌、乳腺癌、胃癌、头颈癌、肝癌和胰癌有关。目前用抗代谢物类药物(基于尿嘧啶、基于叶酸或基于喹唑啉(见表1))治疗这些疾病。在每一种这类情况下，5-氟尿嘧啶治疗可能导致TS活性增强，或筛选该酶的抗药性形式，从而导致疾病复发的抗药性。Lounn，U.等人(1996)报导，在先前接受手术后辅助化疗(环磷酰胺、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶[CMF])的乳腺癌受试者中发生TS基因的扩增。TS正常进行的主要反应是从脱氧尿苷一磷酸(dUMP)和N(5)，N(10)-亚甲基四氢叶酸(THF)合成脱氧胸苷一磷酸(dTMP)和二氢叶酸(DHF)。在一种实施方案中，为表达TS的细胞提供尿嘧啶或THF的衍生物。对于本发明，可互换地并同义地使用“尿嘧啶”(只是碱基)和“尿嘧啶核苷”(碱基和糖)。
衍生物或“前体药物”可被该酶转化为高度细胞毒性的代谢物。正常细胞中表达的低水平TS不产生有毒量的转化毒素。疾病组织中表达的高水平TS产生更多毒素，从而导致细胞增殖的抑制和/或细胞死亡。例如，当前的治疗使用5-氟脱氧尿苷酸抑制TS活性。在与底物的反应过程中，氟原子不可逆地结合TS酶并抑制它。与本发明的一种实施方案相反，前体药物使TS能完成该反应，但产生一种修饰的产物，当该产物掺入DNA时导致毒性效应。酶产物也可阻断其它关键的细胞功能(例如，蛋白质合成或能量代谢)。前体药物的转化也能释放一种代谢物，如对细胞有毒的Br-或I-或CN-。能合成尿嘧啶/dUMP和N(5)(10)-THF的衍生物，它们全部具有在被TS代谢性催化后产生毒性产物的潜力。
5-取代的嘧啶核苷和5-取代的嘧啶核苷一磷酸的合成能通过本领域众所周知的方法来完成。例如，在Li2PdCl4存在下用卤代烷基、卤代乙酸酯或卤代链烯化合物处理5-氯高汞2’-脱氧尿苷，通过形成一种有机钯中间体，得到5-烷基、5-乙酰基或5-链烯基衍生物。Wataya，等人(1979)和Bergstrom，等人(1981)。嘧啶核苷及核苷酸的C5-修饰的另一个实例是，通过用乙酸汞处理未保护的核苷酸，随后在Li2PdCl4的存在下加入苯乙烯或环上取代的苯乙烯，形成C5-反式-苯乙烯基衍生物。Bigge，等人(1980)。通过用乙酸汞在乙酸盐缓冲液中50℃处理3小时，由汞在嘧啶环的5位衍生嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸。Dale，等人(1973)。预期这种处理对于单磷酸的修饰也是有效的；此外，例如通过用碱性磷酸酶受控处理及随后单磷酸的纯化，修饰的三磷酸能被酶转化为修饰的单磷酸。能取代具有类似于汞的分子性质但具有优选的药理性质的其它有机或无机部分。合成取代嘧啶的一般方法，例如，美国专利号4,247,544；4,267,171；和4,948,882；和Bergstrom等人(1981)。上述方法也适用于5-取代的嘧啶核苷及核苷酸衍生物的合成，它们含有除核糖或2’-脱氧核糖之外的糖，例如：2’-3’-双脱氧核糖、阿拉伯糖、呋喃糖、来苏糖、戊糖、己糖、庚糖和吡喃糖。这种取代基的一个实例是卤代乙烯基，例如E-5-(2-溴乙烯基)-2’-脱氧尿苷酸。Barr，P.J.等人(1983)。在该参考文献中作者证明，5-位正常的惰性取代基(溴乙烯基)可转化为一种化学反应基团，这是由于尿嘧啶核苷杂环6-位处的酶介导的亲核攻击，从而导致反应性烷化剂的产生。从本申请的观点看该化合物是无用的，因为它不能被内源胸苷激酶激活，并且其被胸苷酸合成酶转化导致胸苷酸合成酶的失活(Balzarini，J.等人，1987)。然而，将合成改进的取代基，并比较它与TS的反应性及对TS-超量产生的肿瘤细胞的特异细胞毒性。
此外，5-溴脱氧尿苷、5-碘脱氧尿苷及其单磷酸衍生物可从GlenResearch，Sterling，VA(美国)、Sigma-Aldrich公司，St.Louis，MO(美国)、Moravek Biochemicals，Inc.，Brea，CA(美国)、ICN，Costa Mesa，CA(美国)和New England Nuclear，Boston，MA(美国)购得。使用自GlenResearch，Sterling，VA(美国)和ICN，Costa Mesa，CA(美国)购得的试剂，通过激酶的作用，能将购得的5-溴脱氧尿苷和5-碘脱氧尿苷化学地或酶法转化为单磷酸。这些卤素衍生物能与其它取代基结合产生新的且更有效的抗代谢物。
一级序列显示TS是最高度保守的酶之一。Perry，K.等人(1990)。已经确定了几种原核种类一干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)(Hardy，L.W.等人(1987)；Finer-Moore，J.等人(1993))和大肠杆菌(Perry，K.等人(1990))、一种真核生物大型利什曼原虫(Leishmania major)(Knighton，E.R.等人(1994))和T4噬菌体(Finer-Moore，J.S.等人(1994))的TS晶体结构，表明三级结构也是非常保守的。Schiffer，C.A.等人(1995)显示了三维结构已经确定的TS种类的序列对比。从这些氨基酸序列看出，利用本领域技术人员众所周知的方法能推断并分离其DNA序列。Sambrook等人(1989)。此外，如Carreras，C.W.和Santi，D.V.(1995)所述，已经克隆了不同生物的大约29种TS序列，并保藏于DNA数据库中。Takeishi，K.等人(1989)、Davisson，V.J.等人(1989)和Davisson，V.J.等人(1994)提供了人胸苷酸合成酶基因的序列、其克隆、表达和纯化。利用本领域技术人员众所周知的方法构建了编码TS蛋白质并含有必要调节序列的基因。通过电穿孔、转化或转染方法将编码TS的基因引入靶细胞中。Sambrook等人(1989)。此外，如Carreras，C.W.和Santi，D.V.(1995)、Miller(1992)和Spector等人(1997)所述，利用本领域众所周知的方法将该基因插入一种合适的表达载体中。该表达载体再把TS基因插入细胞中。然后在有利于TS蛋白质表达和产生的条件下培养该细胞。
在上述试验中，能用人胃癌细胞系MKN-74、MKN-45、MKN-28和KATO-III以鉴定是TS选择性底物的潜在的治疗剂。MKN-74和MKN-45分别由分化较好及不足的腺癌建立。Osaki，M.等人(1997)和在此引用的参考文献中描述了这些细胞系和培养条件。此外，也可使用如CopuR，S.等人(1995)所述的肿瘤细胞系，它们经过5-FU筛选而超量表达胸苷酸合成酶。
TS的定量能用本领域技术人员众所周知的酶法生化测定来进行。为了定量人肿瘤组织样品中TS蛋白质和TS基因表达的水平，如Johnston，P.G.等人(1991)和Horikoshi，T.等人(1992)所报导的方法提供了敏感性试验。此外，也可用Lounn，U.等人(1996)的PCR方法测定TS基因扩增，并鉴定在此处所述鉴定治疗剂的方法中有用的细胞。
对于本领域的技术人员而言显然地，也测定不含药物及各自含有一种如以下所例举的参照药物的对照细胞培养系统。前体药物的一种优选实施方案是优选杀伤靶细胞的前体药物，其具有比杀伤正常细胞高大约2倍、优选地约3倍或更高的活性。本发明也提供了用在此所述的方法鉴定的药剂。
另一方面，本发明提供一种通过首先进行上述试验再抑制过度增殖细胞增殖的方法。本试验鉴定的一种前体药物与细胞接触，并在该细胞中被一种如上所述的内源胞内酶转化为一种毒性代谢物。
在一种实施方案中，该内源胞内酶是胸苷酸合成酶，而该细胞选自结肠直肠癌细胞、头颈癌细胞、乳腺癌细胞或胃癌细胞。
另一方面，与超量表达胸苷酸合成酶的细胞接触的前体药物是下列通式的一种L-或D-化合物：
Figure C9880796800201
它可以是其对映异构、非对映异构或立体异构形式中的任一种，包括，例如，D-或L-形式，及例如α域β-端基异构形式。
在以上通式中，R1(位于5-位置)是或者含有一种离去基团，该基团是这样一种化学基团，其具有与被胸苷酸合成酶从嘧啶环中去除相适应的分子大小和亲电性，并且在被胸苷酸合成酶从嘧啶环释放后具有抑制细胞增殖或杀伤细胞的能力。
在一种实施方案中，R1是或者含有一种化学基团，该化学基团选自：-Br、-I、-O-烷基、-O-芳基、O-杂芳基、-S-烷基、-S-芳基、-S-杂芳基、-CN、-OCN、-SCN、-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NHCHO、-NHOH、-NHO-烷基、NH2CONHO-、NHNH2和-N3。R1的另一种实例来源于顺铂：
Figure C9880796800211
在以上L-或D-化合物的通式中，Q是一种化学基团，选自：糖基、硫糖基、碳环基及其衍生物。糖基的实例包括但不限于单糖的环糖基，如来源于环氧丙烷(4元环糖)、呋喃糖(5元环糖)和吡喃糖(6元环糖)的糖基。呋喃糖的实例包括：苏型-呋喃糖基(来源于苏糖，一种四碳糖)、呋喃赤藓糖基(来源于赤藓糖，一种四碳糖)、呋喃核糖基(来源于核糖，一种五碳糖)、呋喃阿拉伯糖基(也常称作阿拉伯呋喃糖基；来源于阿拉伯糖，一种五碳糖)、呋喃木糖基(来源于木糖，一种五碳糖)和呋喃来苏糖基(来源于来苏糖，一种五碳糖)。糖基衍生物的实例包括“脱氧”、“氧代”和“脱氢”衍生物以及取代衍生物。硫糖基的实例包括上述糖基的硫类似物，其中环上氧被一个硫原子取代。碳环基的实例包括C4碳环基、C5碳环基和C6碳环基，它们可能进一步含有一种或更多的取代基，如-OH基。
在一种实施方案中，Q是下列通式的呋喃糖基：
其中R2和R3相同或不同，并且独立地是H或-OH。在一种实施方案中，R2和R3是H。在一种实施方案中，R2是OH而R3是H。在一种实施方案中，R2是H而R3是OH。在一种实施方案中，R2和R3都是OH。
在一种实施方案中，Q下列通式的β-D-呋喃核糖基：
其中R2和R3相同或不同，并且独立地是H或-OH。
在某些实施方案中，羟甲基(例如，β-D-呋喃核糖基的4’-羟甲基)可被磷酸化。
能使用如上所述结合于嘧啶5-位并符合空间限制的通用烷化剂进行修饰(Haskell，C.M.编(1995)，55-58页)。Roberts，D.(1966)和Hashimoto，Y.等人(1987)描述了关于尿嘧啶5-位基团释放的不含细胞或基于细胞的筛选试验。
在R1含有CN-的情况中，高度毒性的CN-部分是有治疗活性的部分。由于CN-的高度非特异性毒性性质，它不能在治疗方式中正常使用。以一种只在超量表达胸苷酸合成酶的细胞中才被明显激活的前体药物的形式输送该毒素，可以解决这一问题。
另外，前体药物能被胞内酶转化为一种毒性代谢物，在某些实施方案中，其能被一种胞内“看家”酶进一步修饰。以下列举了一个实例。
Garrett，C.等人(1979)描述了dUMP和TS的“部分”反应以及有关试验。Barr，P.J.等人(1983)描述了对于其它产物的检测实验，即，其反应完全产物是dUMP溴乙烯衍生物的一种抗代谢物的情况。本发明的前体药物的盐可由无机或有机酸和碱产生。酸的实例包括：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、延胡索酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。其它酸如草酸，尽管其本身不是药学可接受的，但能在盐的制备中使用，用作获得本发明的化合物及其药学可接受的酸加成盐过程中的中间物。碱的实例包括：碱金属(例如钠)氢氧化物、碱土金属(例如镁)氢氧化物、氨和通式NW4 +的化合物，其中W是C1-4烷基。
盐的实例包括：乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、氟代庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、苯丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。盐的其它实例包括与适当阳离子如Na+、NH4 +和NW4 +(其中W是C1-4烷基)化合的本发明化合物的阴离子。
对于治疗应用，本发明的化合物的盐是药学可接受的。然而，药学不可接受的酸和碱的盐也可在例如药学可接受的化合物的制备或纯化中得到应用。
用本发明方法鉴定的前体药物或化合物的酯包括由2’-，3’-和/或5’-羟基的酯化获得的羧酸酯(即，-O-C(＝O)R)，其中R选自：(1)直链或支链烷基(例如，正丙基、叔丁基或正丁基)、烷氧基烷基(例如，甲氧基甲基)、芳烷基(例如苄基)、芳氧基烷基(例如苯氧基甲基)、芳基(例如，任选地被卤素、C1-4烷基或C1-4烷氧基或氨基取代的苯基)；(2)磺酸酯，如烷基磺酰(例如，甲基磺酰)或芳烷基磺酰；(3)氨基酸酯(例如，L-缬氨酰或L-异亮氨酰)；(4)磷酸酯及(5)单-、二-或三磷酸酯。这些磷酸酯可被例如C1-20醇或其反应性衍生物或被2，3-二-(C6-24)酰基甘油进一步酯化。除非另外说明，否则在这些酯中存在的任何烷基部分有利地含有1-18个碳原子，特别是1-6个碳原子，最特别地1-4个碳原子。这些酯中存在的任何环烷基部分有利地含有3-6个碳原子。这些酯中存在的任何芳基部分有利地含有一个苯基。本发明的呋喃来苏糖基前体药物衍生物的实例包括，例如，那些含有化学保护的羟基(例如，含O-乙酰基)的衍生物，如2’-O-乙酰基-呋喃来苏糖基、3’-O-乙酰基-呋喃来苏糖基、5’-O-乙酰基-呋喃来苏糖基、2’，3’-二-O-乙酰基-呋喃来苏糖基和2’，3’，5’-三-O-乙酰基-呋喃来苏糖基。
本发明的化合物的醚包括甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基和仲丁基醚。
在另一种实施方案中，底物可不与嘧啶或叶酸化学相关，而是根据合理药物设计的已知参数合成的。参见，Dunn，W.J.等人(1996)。
对于本领域的技术人员而言显然地，也测定不含药物及各自含有一种如以下所例举的参照药物的对照细胞培养系统。优先杀伤靶细胞、具有比杀伤正常细胞高大约2倍、优选地3倍或更高活性的化合物是优选的。本发明也提供用在此所述的方法鉴定的药剂。
酪氨酸激酶
酪氨酸激酶超家族包括EGF受体(EGFR)、巨噬细胞集落刺激因子(CSF-1)受体(v-fms)和胰岛素受体，它显示与ros癌基因的产物有30-40％的同一性。更具体而言，该超家族的成员包括：v-src、c-src、EGFR、HER2、CSF-1受体、c-fms、v-ros、胰岛素受体和c-mos。参见Burck，K.B.等人编(1988)的图8.5。在多种类型的癌症中已经证明了1型受体酪氨酸激酶超家族成员的超量表达(Eccles，S.A.等人(1994-95))。酪氨酸激酶的超量表达与接触α-癌症生物治疗剂TNF-α(Hudziak，R.M.等人(1988)和Hudziak，R.M.等人(1990))及接受化学治疗(Stuhlinger等人(1994))有关。
转化的劳斯肉瘤病毒基因v-src编码一种使蛋白质的酪氨酸残基磷酸化的酶。发现c-src原癌基因位于染色体20上。从具有一种神经表型的神经外胚层来源肿瘤获得的组织和细胞系，表达高水平的c-src，且伴随有高特异性的激酶活性。
几组研究者报导了癌细胞中c-erbB-2/neu(“HER2”)癌基因的超量表达。Brison(1993)指出，erbB原癌基因在人类肿瘤中扩增，在大多数情况中造成超量表达。在人乳癌中(Slamon等人(1987)、van de Vijver等人(1987)、Pupa等人(1993)和Andersen等人(1995))和膀胱癌中(Sauter等人(1993))已经报导了c-erbB-2/neu癌基因的扩增，在每种情况中扩增伴随着超量表达。在卵巢癌组织样品中(Slamon等人(1989)、Meden等人(1994)和Felip等人(1995))和周围神经系统衍生的肿瘤中也报导有c-erbB-2/neu的超量表达。Sukumar和Barbacid(1990)。
为了进行药物筛选试验，测定肿瘤细胞系的癌基因表达，或者改造该细胞系使之表达不同水平的酪氨酸激酶。培养选出的细胞系，并以不同浓度加入候选药物。如Hudziak，R.M.等人(1988)和Hudziak，R.M.等人(1990)所述，测定细胞的细胞杀伤或细胞增殖的抑制。
二氢叶酸还原酶
氨甲蝶呤是细胞内叶酸代谢所必需的酶一二氢叶酸还原酶的一种有效抑制剂。二氢叶酸还原酶的作用为从胸苷酸合成酶反应的一种产物一二氢叶酸再生四氢叶酸(Voet等人编(1995)，813页)。己确定的是，细胞对氨甲蝶呤抗性的一种重要机制是DHFR基因扩增引起的DHFR活性的提高。Banerjee，D.等人(1995)，Schimke，R.T.等人(1988)。Lounn，U.等人(1996)报导，在先前接受手术后辅助化疗(环磷酰胺、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶[CMF])的乳腺癌受试者中发生DHFR基因的扩增。成视网膜细胞瘤(Rb)的缺乏也导致增强的MTX抗性，这是无基因扩增时DHFRmRNA表达活性增强的结果。Li，W.W.等人(1995)。含突变p53的细胞系显示经受基因扩增，并且抗性细胞被化学治疗所选择。Banerjee，D.等人(1995)，Yin，T.等人(1992)和Livingstone，L.R.等人(1992)。为了进行本发明的试验，Schimke，R.T.等人(1988)描述了几种小鼠、仓鼠和人细胞系。此外，也可用Lounn，U.等人(1996)的PCR方法测定DHFR基因扩增，并如在此所述鉴定在鉴定治疗剂的方法中有用的细胞。Masters，J.N.和Attardi，G.(1983)提供了编码人二氢叶酸还原酶的cDNA核苷酸序列，并且能改造细胞使之表达不同水平的在此所述的酶。Dicken，A.P.等人(1993)描述了一种经化学治疗选择的DHFR基因突变体。Nakano，T.等人(1994)描述了DHFR的纯化和与酶功能有关的试验。此外，可将编码DHFR的cDNA转染到NIH 3T3细胞中。以不同的浓度加入候选药物，并测定细胞杀伤和增殖的抑制。
例如通过烷化基与二氢叶酸的N5或C6位点的连接，能合成依赖于二氢叶酸还原酶活性的抗代谢物。DHFR对N5-C6键的还原将引起烷化剂的释放。除了烷化基团之外，被DHFR释放后导致毒素或抗代谢物产生的任何部分都在本发明的实施中有用。
多药抗药性肿瘤
多药抗药性(MDR)是肿瘤细胞用来避免抗癌药之细胞毒性作用的多种策略的通称。MDR的特征在于，肿瘤细胞不仅对化学治疗所用药物而且对既没有结构同源物又没有通用靶标的广谱药物的敏感性均降低。这种多效抗性是成功治疗肿瘤的主要障碍之一。MDR可由质膜上、细胞质、细胞区室或核内的结构或功能改变引起。在解毒及DNA修复途径的改变、药物结合的细胞位点的改变、药-靶亲和力的降低、细胞内特异性药物抑制剂的合成、改变的或不当的蛋白质定向以及药物去除或分泌速度加快等方面，讨论了MDR的分子机制。
与MDR有关的机制之一起因于一种被称作ATP依赖的多药抗药性相关蛋白(MRP)的基因在药物选择的细胞系中的扩增和超量表达。关于MDR机制的综述，参见Gottesman，M.M.等人(1995)和Noder等人(1996)。
为了建立MDR细胞系，如Gottesman，M.M.等人(1995)及Simon，S.M.和Schindler，M.(1994)以及在此引用的参考文献所述，以单一步骤或多个步骤进行药物选择。多种哺乳动物种中编码MDR的DNA序列的分离在Gros，P.等人(1986)、Gudkov，A.V.等人(1987)和Roninson，I.B.等人(1984)中有描述，并在Gottesman，M.M.等人(1995)中综述，并且能如上所述改造细胞使之表达不同水平的这种酶。针对MDR的前体药物基于这种转运蛋白的ATP酶活性。
核糖核苷酸还原酶
核糖核苷酸还原酶将核糖核苷二磷酸还原为相应的脱氧核糖核苷二磷酸。该酶是由两个α-亚基和两个β-亚基组成的四聚体。羟基脲通过与β2-底物复合体的酪氨酰自由基(Tyr-122)相互作用而特异性地阻断这一反应。Voet等人(1995)。该反应的目的在于使得高度细胞毒性的自由基产物O2 -积累。
本发明的技术对其它疾病的应用
尽管本申请的主要针对癌症，但应当认识到，该技术广泛适用于其它疾病，尤其是抗生素抗性的细菌感染。由于β-内酰胺酶的超量表达，β-内酰胺类抗生素在细菌中遇到抗性。Hamilton-Miller，J.M.T.和Smith，J.T.编(1979)，443页。为了进行氨基糖苷类抗生素如卡那霉素治疗，诱导并筛选其它的酶如III型氨基糖苷磷酸转移酶。McKay，G.A.等人(1994)。对于本申请，将制备由已知底物衍生的前体药物底物，它不阻断酶活性，而是利用高酶活性在传染物中产生胞内毒素。
体内施用
在荷有人类肿瘤或被一种抗生素抗性微生物感染的动物模型中进行体内试验，以测定体内效能。
本发明的另一方面是治疗受试者特征为过度增殖细胞的病状的方法，包括对受试者施用一种治疗量的前体药物，该药物在过度增殖细胞中被一种在此所述的内源胞内酶转化为毒素。
当向受试者如小鼠、大鼠或病人施用前体药物时，能将药剂加入药学可接受的载体中，并向受试者全身性或局部性地施用。为了确定能被有效治疗的受试者，从受试者中取出肿瘤样品，并测定细胞的目的酶表达水平。如果其表达高于正常细胞中的表达，并且能施用对杀伤或抑制细胞有效的适量前体药物而没有不希望的副作用，那么该前体药物是一种优选实施方案。治疗量能凭经验确定，并随所治疗的病状、所治疗的受试者及转化的前体药物或细胞毒素的毒性而不同。当对动物施用时，该方法可用于进一步证实前体药物的效能。作为动物模型的一种实例，几组裸鼠(Balb/c NCR nu/nu雌性，Simonsen，Gilroy，CA)每组都皮下接种约105到约109个在此所述的过度增殖的癌细胞或靶细胞。当肿瘤建立后，例如通过在肿瘤周围皮下注射施用前体药物。每周两次用游标卡尺在两个方向进行肿瘤测量，测定肿瘤大小的减小。适当时也可使用其它动物模型。Lovejoy等人(1997)和Clarke，R.(1996)。
在整个治疗过程中，能以一种剂量连续或间歇地完成体内施用。确定最有效的施用手段和剂量的方法对于本领域的技术人员而言是众所周知的，并且随用于治疗的组合物、治疗目的、所治疗的靶细胞及所治疗的受试者而不同。用经治医生选择的剂量水平和方式能进行单次或多次施用。以下可见适当的剂量配方和施用药剂的方法。
本发明的药剂和组合物能在药物制造中使用，并能用来通过按照常规方法的施用治疗人及其它动物，如药物组合物中的一种活性成分。
药物组合物可口服、鼻内、肠胃外施用或通过吸入疗法施用，可采取片剂、糖锭、颗粒、胶囊、丸剂、安瓿、栓剂或气雾剂的形式。也可采取活性成分在水或非水稀释剂、糖浆、颗粒或粉末中的悬液、溶液和乳剂的形式。除本发明的化合物外，药物组合物也可含有其它药物活性化合物或本发明的多种化合物。
更具体而言，本发明的通式的化合物，在此也被称作活性成分，可通过任何合适的途径施用用于治疗，包括口服、直肠、鼻、局部(包括穿皮、气雾剂、颊和舌下)、阴道、肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)和肺途径。也应当理解，优选途径随受者的状况和年龄及所治疗的疾病而不同。
一般而言，对于上述每种化合物的合适剂量为，每天每千克受者体重约1mg到约100mg，优选地每天每千克体重约1mg到约50mg，最优选地每天每千克体重约1mg到约25mg。除非另外指出，否则所有的活性成分重量计算为本发明通式的母体化合物，对于其盐或酯，重量将按比例增加。希望的剂量优选地为整个一天中以适当间隔施用的2、3、4、5、6次或更多的亚剂量。这些亚剂量可以以单位剂型施用，例如，每单位剂型含有约1mg到约100mg、优选地约1mg到约25mg以上、最优选地约5mg到约25mg以上的活性成分。应当理解，本发明的化合物和组合物的适当剂量可能取决于疾病的类型、严重程度和疾病阶段，并且随受试者各不相同。确定最佳剂量一般包括使治疗有效水平与本发明治疗的任何危险或有害副作用相平衡。
理想地，应该施用前体药物使得在患病部位达到活性化合物的峰浓度。实现这一点可以通过，例如，任选地溶于盐水中的前体药物的静脉注射，或者例如以含有活性成分的片剂、胶囊或糖浆口服。可通过连续输注维持希望的前体药物血液水平，以在病患组织内提供治疗量的活性成分。有效组合的构思是为了提供治疗组合，该组合需要的每种组成型抗病毒剂的总剂量低于单独使用每种治疗化合物或药物时所需的剂量，从而减少副作用。
尽管对于前体药物成分而言单独施用是可能的，但优选的是使其作为一种药物制剂，至少含有一种如上所述的活性成分，以及一种或多种药学可接受的载体及任选地其它治疗剂。在与制剂其它成分相容的意义上，每种载体必须是“可接受的”，并且对受试者无害。
制剂包括那些适于口、直肠、鼻、局部(包括穿皮、颊和舌下)、阴道、肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)和肺施用的制剂。制剂可便利地作为单位剂型，并且可以通过药学领域众所周知的任何方法制备。这些方法包括使活性成分与组成一种或多种助剂的载体结合的步骤。通常，制剂的制备方法为，使活性成分与液体载体或磨碎的固体载体或此两者均匀且紧密地结合，然后必要时使该产品成形。
适用于口服的本发明的制剂可以是离散的单位，如胶囊、扁囊剂或片剂，每种含有预定量的活性成分；粉末或颗粒；在水或非水液体中的溶液或悬液；或是水包油型液体乳剂或油包水型液体乳剂。活性成分也可以是大丸剂、药糖剂或糊剂。
通过任选地与一种或多种助剂一起挤压或倒模可以制备片剂。挤压片剂的制备方法可以是，在合适的机器中挤压易流动形式如粉末或颗粒状的活性成分，该活性成分任选地与粘合剂(例如，聚烯吡酮、明胶、羟丙甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，淀粉乙醇酸钠、交联的聚烯吡酮、交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合。倒模制片剂的制备方法可以是，在合适的机器中倒模制一种用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物。片剂可任选地包被或划痕，并且可以经配制使其中的活性成分缓慢或可控制地释放，例如，应用不同比例的羟丙甲基纤维素来得到希望的释放曲线。片剂可任选地包有肠溶衣，使之在肠而不在胃的部分中释放。
适于在口中局部施用的制剂包括：在风味基质通常为蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶中含有活性成分的糖锭；在惰性基质如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中含有活性成分的锭剂；在合适的液体载体中含有活性成分的漱口剂。
根据本发明局部施用的药物组合物可配制为软膏、乳膏、悬液、洗液、粉剂、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂或油。此外，制剂可含有一种补片或敷料，如浸有活性成分和任选地一种或多种赋形剂或稀释剂的绷带或膏药。
对于眼睛或其它表面组织如口和皮肤的疾病，优选地为局部软膏或乳膏敷用制剂，其含有的活性成分的量为，例如，约0.075％到约20％w/w，优选地约0.2％到约25％w/w，最优选地约0.5％到约10％w/w。当配制成软膏时，前体药物可与石蜡或水溶性软膏基质一起使用。此外，前体药物成分也可配制于含水包油型乳状基质的乳膏中。
希望时，乳状基质的水相可包括，例如，至少约30％w/w的多元醇，即，含有两个或多个羟基的醇，如丙二醇、1，3-丁二醇、甘露醇、山梨糖醇、甘油和聚乙二醇及其混合物。局部制剂可如希望地包含一种增强前体药物成分通过皮肤或其它患处吸收或渗透的化合物。这类皮肤渗透增强剂的实例包括二甲亚砜及有关类似物。
本发明乳剂的油相可以用已知的方法由已知的成分组成。尽管该相可以只含有一种乳化剂(另外也称作emulgent)，但理想地含有至少一种乳化剂与脂或油或者与脂和油两者的混合物。优选地，同时含有亲水性乳化剂与用作稳定剂的亲脂性乳化剂。同时包含油和脂两种也是优选的。含或不含稳定剂的乳化剂一起组成所谓的乳化蜡，该蜡与油和/或脂一起组成所谓的乳化软膏基质，该基质形成乳膏制剂的油状分散相。
适用于本发明的制剂的乳化剂和乳剂稳定剂包括：吐温60、Span 80、十八醇十六醇混合物、肉豆蔻醇、硬脂酸单甘油酯和月桂基硫酸钠。
选择制剂合适的油或脂是基于达到希望的装饰性质，因为在大多数可能用于药物乳剂的油中，活性化合物的溶解度极低。因此乳膏优选地应该是不含油脂的、未染色的及可洗的产品，其具有适当的稠度以避免从试管或其它容器中漏出。可以使用直链或支链的烷基单酯或酯，如二异己二酸酯、硬脂酸异鲸蜡酯、椰子脂肪酸的丙二醇二酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸癸酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、棕榈酸2-乙基己酯或称作Crodamol CAP的支链酯的混合物，最后三种是优选的酯。它们可根据所需的性质单独或组合使用。此外，也能使用高熔点脂，如白凡士林和/或液体石蜡或其它矿物油。
适于对眼睛局部施用的制剂也包括滴眼剂，其中活性成分溶解或悬浮于一种合适的载体中，尤其是用于前体药物成分的水溶剂中。前体药物成分优选地以约0.5％到约20％、有利地约0.5％到约10％、尤其是约1.5％w/w的浓度存在于这种制剂中。
直肠施用的制剂可以是含有一种包括如可可油或水杨酸酯的合适基质的栓剂。
适于阴道施用的制剂可以是阴道栓剂、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、起泡剂或喷雾剂，它们除前体药物成分之外还含有本领域所知合适的载体。
适于鼻施用、其中载体为固体的制剂包括，具有如约20到约500微米颗粒大小的粗粉，其施用采取吸入的方法，即，从贴近鼻子的粉末容器中通过鼻孔快速吸入。其中载体为液体、适于作为如鼻喷雾剂、滴鼻剂或用喷雾器气雾施用的制剂，包括前体药物成分的水状或油状溶液。
适于肠胃外施用的制剂包括：水及非水等渗无菌注射液，其中可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂与受者血液等渗的溶质；水及非水无菌悬液，其中可含有悬浮剂和增稠剂，以及用来将化合物导向血液成分或一个或多个器官的脂质体或其它微粒系统。这些制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器如安瓿或小瓶中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下贮存，只需在使用前加入无菌液体载体如注射用水。临时注射液及悬液可由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备而成。
优选的单位剂量制剂含有如上所述的前体药物成分的每日剂量或单位、每日亚剂量或其适当部分。
应当理解，除了以上特别提到的成分之外，本发明的制剂可包含本领域的其它常规药剂，这要考虑到所针对制剂的类型，例如，适于口服的制剂可包含另外的药剂如甜味剂、增稠剂和增香剂。
本发明的通式前体药物和组合物也可以以兽医学制剂的形式使用，例如，可通过本领域的常规方法制备。
实施例
下列实施例特别针对目标酶TS。对于本领域的技术人员而言显然地，能修改下列方法，用于发现针对在此所述的目标酶的其它前体药物。
化学及基于细胞的检测试验
根据与胞内胸苷酸合成酶反应，并将毒素释放至培养基中而不使酶失活的能力筛选基于嘧啶的前体药物。在含有人胸苷酸合成酶、含或不含N5N10-亚甲基四氢叶酸以及候选前体药物的反应混合物中筛选候选药物。应用本领域众所周知的方法，例如用氚标记候选前体药物的离去基团(例如位于嘧啶的5位)。在相同反应条件下同样标记对照底物(例如5-3H)dUMP。与Carreras，C.W.和Santi，D.V.(1995)以及在此引用的参考文献中的叙述类似地进行检测试验。能从含有表达的人胸苷酸合成酶的大肠杆菌中纯化人胸苷合成酶。参见Davisson，V.J.等人(1989)和Davisson，V.J.等人(1994)。该方法提供一种能筛选大量候选化合物的可放大的检测试验。
图3、4和5概述了一种鉴定生物学活性化合物的高流通量筛选。该试验的基础是基因操作和大肠杆菌及类似单细胞生物(例如酵母)生长十分便易，参见Miller(1992)和Spector等人(1997)。关键步骤是去除与用于前体药物设计的酶靶相应的内源酶活性。用Miller(1992)、Sambrook(1989)或Spector等人(1997)所述的任何方法都能做到这一点。这些方法包括化学和生物学(例如病毒或转座子插入)诱变，随后是一种适当的筛选方法。TS阴性(TS-)细胞成为前体药物鉴定的阴性对照，当该前体药物被胸苷酸合成酶作用后变为细胞毒素。用其它细胞型如其它细菌、酵母或其它可筛选的单细胞生物，也能进行相似的方法。在该试验中，比较对照和重组生物两者对试验化合物的敏感性。本领域的技术人员应当理解，由该方法也能产生可区别酶的不同种类的前体药物。例如，能用表达人和酵母酶的其它方面相同的细胞来检测只对表达酵母酶的细胞优先有毒性的抗生素类前体药物。这样，能发现新且特异的抗生素。
细胞系实例为ras-转化的NIH 3T3细胞(从ATCC获得)，并改造使之从克隆的cDNA中表达数量增加的人胸苷酸合成酶(HuTS)。以瞬时或持久方式进行转染(参见Chen，L.等人(1996)、Hudziak，R.M.等人(1988)和Carter，P.等人(1992)。NIH-000(ras-转化的亲代细胞系)；NIH-001(HuTS的低度表达子)；NIH-002(HuTS的中度表达子)；NIH-003(HuTS的高度表达子))。使用针对HuTS蛋白质、用于免疫检测的抗体，通过对细胞裂解液的免疫印迹和酶测定监测每一细胞系中TS的表达水平(例如Chen，L.等人(1996)所述)。如Carreras，C.W.和Santi，D.N.(1995)所述进行酶测定。
筛选人结肠直肠及乳腺肿瘤细胞系中HuTS酶的表达。对于NIH 3T3细胞系使如上述表达低、中及高水平HuTS的细胞系接触候选药物。如上所述监测生长抑制和细胞毒性。对于表1列出的每种酶都能进行相似的试验。
体内试验
将ras-转化的NIH-3T3细胞系皮下移植到免疫缺陷鼠中。最初的治疗可以是直接肿瘤内注射。预期结果是，提高的HuTS表达或目标酶水平导致候选药物抗肿瘤活性提高。用表达越来越高水平的HuTS或目标酶的人肿瘤进行相似的研究，证明药物的效能与HuTS表达或目标酶的水平相关。任选地，除了向动物静脉内施用药物以解决与候选药物的效能、毒性和药理生物学相关的问题之外，如上进行实验。
如Harris，M.P.等人(1996)和Antelman，D.等人(1995)所述进行体内研究。
尽管在此参照具体实施方案详述了本发明，但对于本领域的技术人员而言显然地，在不背离本发明的精神与范围的情况下，能对本发明进行多种改变和修改。
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PCT申请WO 91/17474，1991年11月4日公布。

Claims (20)

1.一种鉴定潜在的治疗剂的方法，该治疗剂选择性抑制内源性过量表达胞内胸苷酸合酶之靶细胞的生长，包括：
(a)使该靶细胞与能被胞内过量表达的胸苷酸合酶转化成细胞毒素的前药接触；其中前药是下式的L-或D-化合物，
Figure C988079680002C1
或 或
其中R1选自-Br、-I、-O-烷基、-O-芳基、O-杂芳基、-S-烷基、-S-芳基、-S-杂芳基、-CN、-OCN、-SCN、-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NHCHO、-NHOH、-NHO-烷基、NH2CONHO-、NHNH2和-NH3；且其中Q选自糖基、硫糖基、碳环基及其盐；
(b)测定靶细胞的细胞生长的抑制或死亡，以及
(c)选择抑制或杀死细胞的治疗剂。
2.权利要求1的方法，还包括：
(a)使靶细胞与能被胞内过量表达的胸苷酸合酶转化成细胞毒素的前药接触，其中该前药具有一种可检测地标记的毒性离去基团，且所述接触在有利于前药掺入细胞的条件下进行；及
(b)测定培养基中从治疗剂释放的标记物的量。
3.权利要求1或2的方法，其中靶细胞的特征在于对一种化疗药物有抗性。
4.权利要求1或2的方法，其中作为化学治疗的体内选择结果目标酶被扩增。
5.权利要求1或2的方法，其中胸苷酸合酶的内源过量表达是编码该酶的基因扩增的结果。
6.权利要求1或2的方法，其中靶细胞表达一种编码胸苷酸合酶的外源基因。
7.权利要求1或2的方法，其进一步包括在有利于前药掺入细胞的条件下使对照细胞与前药接触。
8.权利要求7的方法，其中对照细胞不表达胸苷酸合酶或是以低水平表达胸苷酸合酶。
9.权利要求7的方法，其中对照细胞是正常的非赘生性细胞类型，靶细胞是癌症细胞。
10.前药用于制备治疗如下特征的疾病的药物的用途，所述疾病特征在于内源性过量表达胞内胸苷酸合酶的靶细胞，其中前药是下式的L-或D-化合物，
Figure C988079680003C1
或 或
Figure C988079680003C3
其中R1选自-Br、-I、-O-烷基、-O-芳基、O-杂芳基、-S-烷基、-S-芳基、-S-杂芳基、-CN、-OCN、-SCN、-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NHCHO、-NHOH、-NHO-烷基、NH2CONHO-、NHNH2和-NH3；且其中Q选自糖基、硫糖基、碳环基及其盐。
11.权利要求10的用途，其中前药通过如下方法筛选，该方法包括使内源性过量表达胸苷酸合酶的细胞与能被过量表达的胸苷酸合酶激活的前药接触，并测定靶细胞的细胞生长的抑制或死亡。
12.权利要求10的用途，其中靶细胞耐受化疗药物。
13.权利要求10的用途，其中胸苷酸合酶作为事先化疗的体内选择结果被扩增。
14.权利要求12的用途，其中细胞中编码胸苷酸合酶的基因被扩增，籍此赋予对化疗药物的抗性。
15.权利要求10的用途，其中前药为5-溴乙烯尿苷或其类似物、衍生物、代谢物或盐。
16.权利要求10的用途，其中前药为5-溴乙烯尿苷单磷酸。
17.权利要求1或2的方法，其中Q为下式的呋喃糖基，
其中R2和R3相同或不同，且独立地为H或-OH。
18.权利要求1或2的方法，其中Q为下式的β-D-呋喃核糖基，
其中R2和R3相同或不同，且独立地为H或-OH。
19.权利要求10或11的用途，其中Q为下式的呋喃糖基，
其中R2和R3相同或不同，且独立地为H或-OH。
20.权利要求10或11的用途，其中Q为下式的β-D-呋喃核糖基，
Figure C988079680004C4
其中R2和R3相同或不同，且独立地为H或-OH。
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