CN1277922C - 从任意复杂起始材料中分离核酸的制剂和方法以及接下来的染色体组基因分析 - Google Patents

从任意复杂起始材料中分离核酸的制剂和方法以及接下来的染色体组基因分析 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于从任意复杂起始材料和含有溶解/结合缓冲液体系的量通过使核酸与固相结合来分离核酸，特别是DNA的不含有离液序列高的成分的制剂，所述溶解/结合缓冲液体包括至少一种反离液序列高的盐成分，本文公开的固相和洗涤及洗脱缓冲液。所述溶解/结合缓冲液体可以是在反应器中备好待用的水溶液或固体制剂。用于利用离液剂分离的所有载体，优选玻璃纤维簇，玻璃膜，二氧化硅载体，陶瓷，沸石或表现出阴性功能化表面的材料或具有可转化为负电势能的化学修饰表面的材料，可作为固相。本发明还涉及使用据本发明的制剂从任意复杂起始材料中分离核酸，特别是DNA的方法，溶解起始材料，使核酸结合载体，洗涤与载体结合的核酸和洗脱核酸。

Description

从任意复杂起始材料中分离核酸的制剂和方法 以及接下来的染色体组基因分析
本发明的目的是用于将特别是DNA的核酸结合到固相而从任意复杂起始材料(comlex srarting materials)和大量物质中分离核酸的不含有离液序列高的成分的制剂，其包括包含至少一种反离液序列高的(antichaotropic)盐成分的溶解/结合缓冲液体系，本文公开的固相和洗涤和洗脱缓冲液。所述溶解/结合缓冲液体系可以以备好待用的反应器的水溶液或者以固体制剂存在。应用于利用离液剂分离的所有载体，优选玻璃纤维簇，玻璃膜，硅载体，陶瓷，沸石或者具有可以转化为负电势能的阴性功能化或化学改性表面的材料，可以作为固相。
此外，本发明的目的是一种使用根据本发明的制剂从任意的复杂起始材料中分离核酸特别是DNA的方法，其特征在于，溶解起始材料，将核酸结合到载体上，洗涤结合载体的核酸，和洗脱核酸，如果需要，接着扩增选择的序列片段，如果需要，接着就在同一反应室内分析多基因片段。本发明方法的应用领域是所有与DNA分离有关的实验室，例如法医学，食品检验，药物检验，分子生物学，生物化学，遗传工程和所有的其它邻接领域。
在常规的条件下，通过在强变性和还原条件下分解含有核酸的起始材料而从细胞和组织中分离DNA，部分也使用蛋白质降解酶，纯化苯酚/氯仿萃取步骤中得到的核酸级分并且利用透析和乙醇沉淀从水相中获得核酸(Sambrook，J.；Fritsch，E.F.；和Maniatis，T.，1989，CSH，“分子克隆”(Molecular Cloning)。
用于从细胞和特别是组织中分离核酸的“常规方法”是非常费时的(部分超过48小时)，需要对设备付出相当可观的支出，否则在实际条件下不能完成。另外，本发明方法使用化学品苯酚和氯仿的程度不大，因此对健康的危害不大。
从各种生物起始材料分离核酸的各种替代方法，使得避免昂贵且不健康的核酸苯酚/氯仿萃取并缩短耗费的时间。
所有这些方法都以Vogelstein和Gillespie研究出的从琼脂糖凝胶制备和分析纯化DNA片段的方法为基础(美国国家科学院院刊(Proc.Nalt.Acad.Sc.USA)，1979，76，615～619)。该方法包括将含有要分离的DNA泳带的琼脂糖溶解于离液序列高的盐(NaJ)的饱和溶液，并且使DNA结合玻璃颗粒。接着用洗涤溶液(20mM tris HCl[pH 7.2]；200mM NaCl；2mM EDTA；50％v/v乙醇)洗涤固定在玻璃颗粒上的DNA，并且从载体颗粒上解溶下来。
迄今为止，对该方法已经有了几次改进，并且当时用于各种来源的核酸的提取和纯化的各种过程(Marko，M.A.；Chipperfield，R.和Birnboim，H.G.；1982，生物化学年鉴(Anal.Biochem.)，121，382～387)。
另外，今天世界范围内已经存在大量的主要用于纯化琼脂糖凝胶的DNA片段和用于从细菌溶解液分离质粒DNA，还有用于从血液，组织还有细胞培养物分离具有较长链的核酸(基因组DNA，细胞总RNA)的试剂体系。
所有这些商业上可获得的试剂盒都是以在各种公知的离液序列高的盐的溶液的存在下使核酸结合无机载体的原理为基础，使用作为载体研细的玻璃粉末的悬浮液(例如玻璃乳液，BIO101，LaJolla，CA)，硅藻土(Sigma公司)或者还有硅胶(Diagen，DE 41 39 664A1)。
US5,234,809(Boom)公开了分离用于实施多种各种用途的核酸的方法。其中描述了通过将起始材料与离液序列高的缓冲液和结合DNA的固相一起温育而从含有核酸的起始材料中分离核酸的方法。所述离液序列高的缓冲液完成起始材料的溶解以及核酸与固相的结合。该方法也很好地适合从少量材料中分离核酸，特别是在分离病毒核酸领域中应用的实施中。
这些方法的具体改进涉及使用在具体方面应用中有利的新的载体(Invitek GmbH WO-A95/34569)。
然而，以将起始材料与离液序列高的缓冲液和结合DNA的固相一起温育为基础的从复杂起始材料分离核酸的方法的决定性缺陷，事实上，在于通过离液序列高的缓冲液分解细胞不适用于只是十分不充分的所有的材料或工作，并且对于更大量的起始材料高度费时。除此之外，如果例如必须从组织样品中分离DNA则需要机械匀浆方法。此外，总是使用各种浓度的不同的离液序列高的缓冲液来研究各种方面。因此，该方法不普遍适用。
尽管通过多种用于分离核酸(特别是从复杂起始材料分离基因组DNA)的商业上可获得的产物可以解决起始材料可能难以溶解而产生的问题，但是他们最大的缺陷是不再是常规的“单一试管”方法，该方法是在含有蛋白水解酶的常规缓冲液中进行起始材料的溶解的根据该美国专利的方法的特征。完成溶解之后，必须分开向溶解母液加入接下来的例如核酸与离心膜结合所需要的离液序列高的离子。但是它们不能形成溶解缓冲液的一部分，因为蛋白质破坏离液序列高的盐的功能这一点是公知的，并且将当然立即破坏有效溶解需要的蛋白水解酶。
这就是为什么使用离液序列高的盐的分离核酸的方法尽管有缺点，但是仍然为世界范围所接受并且利用商业上可获得的产品上百万次使用。这些体系非常容易使用并且总是根据下面的原理：起始材料溶解，接着使核酸与玻璃或载体悬浮液上位于离心柱中的二氧化硅膜的固相结合，洗涤结合的核酸，并且接着用不大离子强度的缓冲液洗脱核酸。
所有这些体系以在离液序列高的盐的存在下核酸与各载体表面结合为基础，即至少一种缓冲液含有离液序列高的盐作为主要成分。这可能已经指溶解缓冲液或者包括蛋白水解酶需要的在起始材料完全溶解之后加入的结合缓冲液的体系的情况。
用于盐析带负电荷，中性或碱性蛋白质溶液的感胶离子序形成离液序列高的盐的基础。因此，离液序列高的盐特征在于将蛋白质变性，提高非极性物质在水中的溶解度并且破坏疏水相互作用。根据本领域值得注意的这些性质的状态，也用离液序列高的盐缓冲体系，破坏含水介质的超级结构，从而使核酸与选择的固相结合。用于分离核酸的最重要的试剂是高氯酸钠，碘化钠，碘化钾，硫氰酸胍和盐酸胍。但是，另一方面，它们都昂贵，另一方面，部分有毒或腐蚀性。
直到今天，非常多的专利申请和授权的专利都是以本领域的这种状态为基础，其中总是涉及该方法的变化，例如使用新的载体或更有效的洗涤缓冲液等，基本原理总是使用用于结合到由二氧化硅材料组成的固相的离液序列高的盐。
在离液序列高的盐的存在下核酸与无机载体结合的物理-化学原理认为是技术人员的知识范围。核酸与无机载体的表面结合干扰含水介质的超级结构，通过所述含水介质核酸被吸附到无机材料特别是玻璃或二氧化硅颗粒的表面。干扰含水介质的超级结构总是要求存在离液序列高的离子。在高浓度离液序列高的盐的情况下，该反应几乎定量进行。根据所述的这些物理-化学发现，专家们进行了下面的操作：所有商业上可获得的用于分离核酸的体系，必须含有具有用于使核酸与结合核酸的固相结合的高离子强度的离液序列高的盐的缓冲液成分。
更出人意料的是根据本发明的发现，即，在溶解/结合缓冲液体系中含有反离液序列高的盐的制剂，同样和更好地适合从任意的特别是复杂起始材料分离核酸。
根据权利要求书实现本发明。这就是为什么本发明主题是用于将特别是DNA的核酸结合到固相，而从任意复杂起始材料中分离核酸的不含有离液序列高的成分的制剂和方法，所述制剂包括包含至少一种反离液序列高的盐成分的溶解/结合缓冲液体系，本文公开的固相和洗涤和洗脱缓冲液。本发明意义上的反离液序列高的成分是铵盐，铯盐，钠盐和/或钾盐，优选氯化铵。
另外，所述溶解/结合缓冲液体系含有已知的去污剂和添加剂，例如tris-HCl，EDTA，聚乙烯吡咯烷酮，CTAB，tritonX-100，N-月桂基肌氨酸，柠檬酸钠，DTT，SDS和/或Tween。实施的一个优选的变化方法中，溶解/结合缓冲液体系含有一种醇，例如乙醇和异丙醇和酶，如果需要，优选降解蛋白质的酶，例如蛋白酶，用于结合固相。
根据本发明，可以利用本领域相关的原理解决分离核酸的具体问题，或者就具体相关参数进行优化和使现存变化方法有效。因此其适合用作完全自动高产率方法。
完全出人意料并且与本领域已知状态不同的是，核酸，特别是基因组DNA，可以根据本发明结合无机载体试剂，溶解/结合缓冲液体系不含有离液序列高的盐成分并且也在常规条件下洗脱。
此外，如果需要，多种完全不同的盐作为溶解/结合缓冲液体系的成分，对于核酸与以玻璃或二氧化硅为基础的常规载体结合来说是足够的。
特别出乎我们意料的是，使用关于迄今为止使用的用于结合核酸的离液序列高的盐表现出绝对对立作用的化学-物理特征的盐可以实现最好的结果。因此，我们可以称这些盐为反离液序列高的盐。
因此，使用一种溶解/结合缓冲液在从各种复杂起始材料(例如血液，组织，植物)提取基因组DNA方面可能至少实现相同量和质量的结果，所述溶解/结合缓冲液的主要成分是例如铵盐，而不是离液序列高的盐(商售提取试剂盒)，保持其它反应成分，载体不变，并且给的已知的离液序列高的离子绝对对立的感胶离子序中的离子。
只是用一种溶解/结合缓冲液中的反离液序列高的盐代替迄今为止使用的离液序列高的盐，所有其它参数不变，则在已知固体载体的表面上至少合适的定量分离核酸是可能的。
这意味着同样有可能通过不将蛋白质变性，并且使其稳定的盐也从复杂起始材料中分离核酸，所述盐不提高非极性物质在水中的溶解度而是减小该溶解度，并且所述盐不破坏疏水性相互作用，而是增强该作用，来纯化核酸并且将它们送至通常的应用。
本发明以核酸与固体，优选无机载体结合的新的另一种机理为基础，提供了一种从复杂起始材料分离核酸的普遍适用的新的方法。
因此，本发明使用另一种化学品作为各试验试剂盒(制剂)的基本成分，通过使用以反离液序列高的盐为基础的溶解/结合缓冲液的新的组合物，以核酸结合各种二氧化硅或通常的玻璃材料为基础，来分离核酸，特别是用于分离基因组核酸。
因此，根据本发明的使用反离液序列高的盐的方法，提供了从试验途径实施已知的分离核酸的方法过程，并且特征在于：
1.溶解起始材料
2.核酸与一种固相结合(离心柱或悬浮液)
3.洗涤结合的核酸
4.用已知的低盐缓冲液洗脱核酸。
本发明提供了高效且快速地从任意的，如果需要，从复杂起始材料，分离核酸，特别是基因组核酸：结合所需要的反离液序列高的离子，可以是溶解/结合缓冲液的成分，甚至包括蛋白水解酶。根据本发明的方法因此容易并且普遍适用。
通过不使用离液序列高的物质通过孵育含有核酸的起始材料，进行明的方法因此容易并且普遍适用。
通过不使用离液序列高的物质通过孵育含有核酸的起始材料，进行从任意的起始材料分离核酸，特别是DNA，将其接触：
-包括含有一种反离液序列高的盐成分，至少一种去污剂，如果需要，添加剂和，如果需要，一种酶的水溶液的溶解/结合缓冲液体系，
-和一种任意的固相，优选玻璃纤维簇，玻璃膜，玻璃，沸石，陶瓷和其它二氧化硅载体。
这样，使起始材料溶解并且接着使DNA与固相结合。接着，根据已知的方法洗涤结合的核酸并且从固相解溶下来。
在特殊提取方案情况下，如果需要，可以向溶解母液中加入另外的去污剂，醇或去污剂/醇的混合物。
优选的起始材料是密集植物材料，例如果实，种子，叶子，针叶等，临床相关样品，例如全血，组织，microbioptates，石蜡包被的材料，ercp-样品，棉签，食品，例如鱼，香肠，罐头，牛奶，法医样品，例如头发根，烟蒂，血迹和其它含有DNA的样品。
本发明意义上的优选离子是感胶离子序中存在的反离液序列高的铵离子，铯离子和钾离子和钠离子或者这些离子的组合，优选氯化铵。对于溶解/结合，以0.1～8M的离子强度使用离子。
对于核酸，特别是DNA与固体载体的结合，优选地小于等于1M的这些盐的低浓度将是足够的，在一些应用中，甚至小于等于0.5M的浓度是优选的，在从较大量的起始材料中定量分离核酸中较高的离子浓度是成功的。
在实施本发明的优选方式中，通过使用反离液序列高的盐，所述盐具有作为溶解缓冲液的基本成分的蛋白质稳定作用，也可以加入蛋白水解酶，例如蛋白酶K用于支持并且更有效地进行溶解过程，因此，也可以加入高离子强度，例如5M的反离液序列高的盐用于必需的细胞降解，这样获得核酸的定量分离。
本领域中含有已知离液序列高的盐的缓冲液体系可能不含有要求的高离子强度的蛋白水解酶，而一般情况下蛋白水解酶是定量分离核酸所必需的。因此，总是接着加入蛋白水解酶用于核酸与固相的结合。
在根据本发明的溶解缓冲液/结合缓冲液中，优选的是阴性，阳性或中性蛋白水解酶，例如SDS，tritonX-100，Tween或CTAB被用作去污剂。
起始材料完全溶解之后，从悬浮液中分离出在快速离心步骤中还没有完全溶解的成分，如果需要，在加入另外的去污剂，醇或者与固相孵育的去污剂/醇混合物之后直接与已经描述过的结合DNA的材料一起孵育。在溶解缓冲液体系中，可能有另外的不大浓度(小于50mM)的EDTA和/或tris-HCl。对于从非常强程度去污过的起始材料中分离DNA，优选向该缓冲液体系中加入2～4％聚乙烯吡咯烷酮或其它已知物质来选择性抑制成分。
例如，已经证明商业上可获得的离心柱中的玻璃纤维簇，硅化合物，例如各种粒度的二氧化硅作为用于要分离的DNA的结合材料是有效的。因此可以使用利用离液序列高的缓冲液分离核酸所用的所有材料。
与DNA结合材料孵育之后通过，通过快速离心步骤从结合材料中分离溶解物。接着，用例如由至少50％的乙醇和，如果需要，低盐浓度的NaCl组成的洗涤缓冲液以已知方法洗涤，干燥载体并且利用已知的低盐缓冲液(tris-HCl；TE；水)洗脱结合的DNA，优选在50～70℃的温度下进行。
实施本发明的另一个变化方法包括加入蛋白水解酶，优选蛋白酶，例如蛋白酶K，用于溶解难于分解的起始材料的溶解，例如密集组织样品，发根，或者用于优化溶解效率和缩短必需的溶解时间。
因此，本发明应用从含有DNA的起始材料以及从任意量的最各种各样的起始材料中分离核酸特别是DNA的普遍适用的方法，以反离液序列高的盐的新的组合物作为溶解缓冲液混合物的基本成分，迄今为止使用的所有载体和它们的变体同样有效使用并且调节迄今为止用于鉴定性用途的核酸的分离。
在应用根据本发明的方法的最一般的变化方法中，利用新的普遍适用的缓冲液体系，可以成功地，极端简单和非常快捷地进行从本领域相应的所有选择的复杂起始材料提取核酸，高效溶解并且接着使核酸与来自下面的材料结合：密集植物材料(例如果实，种子，叶子，针叶等)，临床相关样品(例如全血，组织，microbioptate，石蜡包被的材料，ercp-样品，棉签)，食品(例如鱼，香肠，罐头，牛奶)，法医样品(例如头发根，烟蒂，血迹)和其它起始材料。
本发明方法的另一个优点在于能够从非常小量的起始材料高效分离DNA(例如从1微升全血，小于1毫克的微生物活组织检查样品分离DNA)以及从非常大量的起始材料高效分离DNA，例如50毫升全血，1克组织材料，小于1克的植物材料。
用反离液序列高的盐代替离液序列高的盐的另一个优点在于由于没有离液序列高的化学品，使用的缓冲液不再有毒性或腐蚀作用。
除了实施的最一般的变化方法之外，涉及具体应用的最佳提取方法使得几乎定量分离起始样品中含有的DNA量。令人惊讶的是利用不使用高浓度的离液序列高的离子的根据本发明的方法可以获得高DNA产率，而迄今为止利用商业上可获得的最优提取试剂盒使用根据本领域的结合DNA的高浓度的离液序列高的离子。
利用商业上可获得的实现的各比较结果的选择在实施的实施例中给出。这些结果清楚地证明本发明的效力。
除了从含有DNA的所有复杂起始材料分离DNA之外，应用根据本发明方法的另一个变化方法使得从细菌溶解物高效分离质粒DNA，而不使用根据本领域现有技术使质粒DNA结合无机载体所必需的离液序列高的盐，因此，对于结合质粒DNA不需要通常加入离液序列高的盐酸胍盐。
也用已知方法洗涤结合的质粒DNA并且从载体上洗脱。该方法适合从使用的所有的起始量(小至大)分离质粒DNA。因此，获得的质粒DNA产率与根据传统的商业上可获得的方法分离的产率相同。但是，根据本发明的方法比所有其它已知体系在价格上低廉得多，因为离液序列高的盐非常昂贵。
因此，使用反离液序列高的盐的本发明方法非常适合设计用于分离质粒的自动系统，其中已知价格/制剂是选择的决定性标准。
根据本发明的制剂使得进一步接近一条出人意料的途径，非常引人注目并且提供分离核酸和检测领域中新的应用。
在实施本发明的一个形式中，含有至少一种反离液序列高的盐成分的本发明新的溶解/结合缓冲液体系使核酸与固相结合，所述固相具有带负电荷表面或具有负电势能的表面。
从现有技术得知将核酸有效地结合化学修饰的固相的纯化核酸的方法(美国专利5,523,392；在硅酸铝和磷酸硅酸盐上分离DNA；美国专利5,503,816；用于DNA纯化的硅酸盐化合物；美国专利5,674,997；在改性的硅酸盐上纯化DNA；美国专利5,438,127；使用PCl3改性的玻璃纤维膜通过固相提取纯化DNA；美国专利5,606,046；使用事先用三氟乙酸并且然后用氟离子，氢氧根离子，或BCl3处理过的trifluorimetricacid洗涤过的玻璃纤维膜通过固相提取纯化DNA；美国专利5,610,291：通过用SiCl3，AlCl3，或BCl3处理并且用氢氧化钠洗涤修饰的玻璃纤维膜用作DNA吸附剂；美国专利5,616,701：通过使用氢氧化物洗涤过的玻璃纤维膜的固相提取纯化DNA；美国专利5,650,506：改性的玻璃纤维膜用于通过固相提取的DNA纯化)。
因此，结合核酸的必要条件总是用于结合的膜通过化学修饰反应而带正离子电荷。因此，明显的是，使用的膜的带正电荷表面和核酸的磷酸骨架的阴离子电荷之间发生电荷相互作用而结合。因此，核酸与带正电荷固相结合的原理很多年就已经有了标准应用，例如，用于已知的在带正电荷尼龙过滤膜上的DNA/RNA印迹技术，这都是本领域技术人员充分公知的。
然而，所述的该方法的一个完全基本的缺点在于其不适合从复杂起始材料分离核酸，即，完全不可能从复杂起始材料分离核酸。起始材料总是必须以所述的美国专利说明书中公开的已知方法要分离的已经分离过的核酸。特别是，有一个方面对于本领域技术人员来说看起来还不清楚。所述的结合条件(在生理缓冲液条件下结合)和洗脱条件是相同的。不清楚核酸怎么可以在给定的相同缓冲液条件下再次从膜上溶解用于核酸与带正电荷膜结合。
最后，只是在一个非常窄的途径中可以实际施用代表性方法和各方法。合成制备的寡核苷酸与阳性表面的结合也是已知的。这接着通过利用电荷相互作用来进行，即，以正电荷和负电荷的连接为基础，例如通过修饰的寡核苷酸(与氨基连接体或磷酸连接体键连)。这些变化方法不能从复杂起始材料分离核酸。
根据详细的解释，存在用于纯化带有足够正电荷的膜的结合核酸的另外的形式，其不代表用于分离核酸的方法。以膜的正离子电荷和核酸骨架的负离子电荷之间的相互作用为基础的库仑引力使得核酸结合。因此，该原理看起来可以局部得以解释。
以用根据本发明的反离液序列高的盐从复杂起始材料分离核酸为基础，检测到一种出人意料的现象。因此，证明带负电荷表面或可以转化为负电势的表面也适合使用根据本发明的溶解/结合缓冲液体系结合核酸。一般情况下，我们不能预期由于等电荷势能而发生的不是结合而是推斥的可能性。
根据已知方法产生阴性功能化表面或者带有潜在的阴性修饰的表面。证明例如酰基，羧基或羟基与反应器表面的光化学偶联是合适的。
本发明变化方法完全打开了用于复合核酸分析的新的前景。也就是说，变成明显的是核酸不需要象迄今为止描述的所有的变化方法一样已经被分离用于阴性或潜在阴性表面结合。从溶解反应母液进行结合，即将溶解含有核酸的起始样品并且释放的核酸，将与带负电荷表面(例如微量培养板腔或Eppendorf反应器)结合。
现在，根据本发明的变化方法使得应用完全新的用于从复杂起始材料分离核酸的“单一试管”和一步方法。这样的方法，提供了对于使用者的应用范围非常大的优点(简单，廉价，减少废物，快捷，适合常规应用，自动化等等)。
另外，该变化方法的进一步的应用不只是在反应体中提取核酸，而且还在反应器中接着进行靶物扩增和接着水解，并且如果需要，进行杂交反应，如果需要，或者在固相上测序。
以此为基础，利用本领域技术人员公知的技术，通过带负电荷或潜在阴性官能团改进例如0.5毫升Eppendorf PCR容器。例如酰基，羧基或羟基与反应器表面的光化学偶联适合这样的改进。然后，选择用于分离核酸的样品(例如全血)放在反应器中，并且与含有反离液序列高的盐级分的溶解缓冲液孵育，加入例如氯化铵，去污剂和蛋白水解酶，该容器在70℃下孵育5分钟。
为了使核酸的结合最大化，还可以在起始材料完全溶解之后用吸移管移取去污剂/醇混合物。然后，短时间孵育母液，并且接着从反应器倒出。现在，核酸与反应器的功能化表面结合，接着用醇洗涤缓冲液快速洗涤并且通过在70℃下孵育去除醇。此外，通过向反应器加入低盐缓冲液(例如10mM tris-HCl)，以专业方法进行结合的核酸的洗脱，并且例如在70℃下短时间孵育(例如2分钟)。这样，获得核酸备用。
正如已经显示的，在一个反应器中进行了从复杂起始材料分离核酸的所有的反应，即溶解起始材料，结合核酸，洗涤结合的核酸和洗脱核酸，都在一个反应器中并且用一个反应器完成。
现在世界范围内最常使用的Qiagen公司的提取试剂盒对于溶解，结合，洗涤和洗脱总是需要一个过滤柱和至少4个反应器，另外，包括多个离心步骤。
与此相反，根据本发明的变化方法使得没有一个离心步骤就提取核酸。由此也带来与时间相关的多种好处。这些好处也涉及Boom描述的美国专利5,234,809中所述的核酸提取方法。
但是在不考虑核酸的有效提取的情况下，结合的核酸也可以保留在0.5毫升反应器所述的表面，并且例如接着通过加入完全PCR混合物(引物，核苷酸，聚合酶缓冲液，Taq聚合酶，镁)直接用于PCR应用，即提取，并且接着在相同反应器中进行扩增。
这些实施例详细描述了本发明带来的多种好处和宽的适用性。在一个变化方法中，在一个反应空间内进行通过扩增的样品制备的整个过程，如果需要，还有分析。因此，考虑到改进的反应器(或者还有其它固体表面)和合适的溶解/结合缓冲液，在与分子生物学相关的实验室开发出新的标准，并且主要涉及核酸检测，众所周知，通过应用新的有效溶液大大减小了污染样品问题。
其它的优点以及其它的应用是固定在表面上的核酸将稳定保持固定至少一段较长时间，备用于后面的处理，即PCR不必要在提取之后立即进行。其它应用领域是使用本文描述的携带负电荷或潜在的负电荷的表面(优选合适反应空间的塑料表面，例如微量培养板)完全自动提取核酸，并且如果需要，进行分析。
如果需要，含有蛋白水解酶的用反离液序列高的盐作为主要成分的根据本发明的溶解/结合缓冲液体系也可以以固体制剂提供。为此目的，如果需要，在通常的反应器中将盐和去污剂的混合物，添加剂和酶分成等份，并且在95℃下孵育几小时，并且根据已知方法冻干，从而转化为固体制剂。
用于分离核酸的复合备用反应混合物中这些固体制剂在长期贮存中是稳定的，即在长期贮存期间保持蛋白水解酶成分的生物活性(参见实施例)。因此，不加入已知的保护性添加剂，而只是通过低温冻干，制备溶解缓冲液混合物的稳定制剂。
商业上提供的用于提取核酸的所有试验试剂盒含有各需要的成分，必须只由使用者制备具体的溶液。除此之外，限制了溶液的稳定性。另一个缺点在于使用者必须考虑在当前使用常规试剂盒分离核酸时对于各种溶液进行多个移液步骤。这样就加大了深度污染的危险，特别是在药物诊断领域。此外，例如，由于主要用于分离核酸的常规离心柱的广泛加载的限制，起始材料的量也受到极大限制。这是由于提取所需的溶解和结合缓冲液仍然被加入到起始材料中的事实。
通过提供以反离液序列高的盐为基础的作为在贮存中稳定的混合物的稳定制剂，以完全简单的方法解决了存在的问题。该制剂具有下面的优点：
1.长期贮存准备好待用的溶解缓冲液混合物。
2.在准备好的溶解混合物中稳定蛋白水解酶以及它们长期贮存。
3.以现存离心柱的等规格使用更大量的起始材料(例如起始量的三倍)。
4.通过减少移液步骤和移液溶液而降低污染的危险。
5.也可以在实验室之外在准备好备用的溶解混合物中摄取样品，
并且如果需要，长期贮存。
6.样品稳定装运和冷却。
由如果需要包括蛋白水解酶的各成分组成的准备好的固体的稳定溶解缓冲液混合物容易操作(也可以由不具备专业知识的人操作)，因为通过加入含有要分离的核酸的样品简单起始该反应。除此之外，根据它们所含有的物质，混合物具有至少6个月的寿期，因此在室温下样品的运输不再是问题，以此事实实施本发明。
固体制剂的优点的基础在于只是将含有核酸的样品放入含有贮存稳定的溶解缓冲液的反应器中，用于样品材料所含有的核酸的溶解，并且如果需要，通过加入水，在各反应器中溶解样品。完全减少带来污染的昂贵的多个移液步骤。通过根据本发明的制剂解决给定条件下与收集和制备临床和法医学样品相关的已知问题。
出乎我们意料的是，实际应用还表现出，如果需要，在给定的标准条件下，在加入要溶解的起始材料之后，当加入H2O之后加入固体样品时，固体制剂可以再转化为液相而不带来问题。
总结如下：
本发明的主题是不含有离液序列高的成分的制剂中的反离液序列高的盐，用于从任意复杂起始材料分离核酸特别是DNA的用途，其中所述核酸与固相结合。所述制剂含有溶解/结合缓冲液体系，其含有至少一种反离液序列高的盐成分，本文公开的一种固相和洗涤及洗脱缓冲液。
所述溶解/结合缓冲液体系可以以在反应器中备好待用的水溶液或以固体制剂获得。
所有载体可以作为固相用于分离离液剂，优选玻璃纤维簇，玻璃膜，硅载体和高度分散的硅胶或具有带负电荷表面或化学改性的表现出负电荷势能的表面的载体。
此外，本发明的主题是使用提到的制剂，从任意复杂起始材料分离核酸特别是DNA的方法，其特征在于溶解起始材料，使核酸与载体结合，洗涤与载体结合的核酸和洗脱核酸。
由于获得的DNA的质量，其也很好地适合基因治疗中使用的DNA的制备分离和纯化。
再有，本发明的主题是贮存中稳定的并且备好用于以反离液序列高的盐为基础分离核酸的溶解缓冲液体系的固体制剂，其作为备好在常规反应器中使用的混合物可以获得。通过只是加入样品(在液体样品例如全血，唾液，细胞悬浮液，血清，血浆，体液)活化溶解缓冲液母液的固体制剂，在固体起始材料例如组织，发根，固体表面上的血迹，烟蒂，脱蜡的组织等等的情况下，另外加入水，并且进行起始材料的水解。起始材料完全溶解之后，如果需要，在加入醇溶液或醇/去污剂混合物之后，溶解母液以已知方式和使用的各种结合核酸的固相(悬浮液，离心柱)一起孵育。接着根据本领域已经公开的进行结合的核酸的洗涤和最后的洗脱。
利用这些固体制剂，主要对于核酸检测应用领域提供新的溶液。
应该再一次指出，作为一步方法和“单一试管”方法的本发明变化方法使得从复杂起始材料分离核酸，如果需要，并且扩增，并且，如果需要，接着分析扩增的核酸片段。因此，起始材料不需要是已经分离过的核酸而是含有核酸的复杂起始材料。结合核酸所需表面包含阴性或潜在阴性官能团的溶解/结合缓冲液中实现核酸的结合，带负电荷的核酸结合阴性功能化表面所需离子来自反离液序列高的盐。
因此，实现：
1.用于从复杂起始材料分离核酸的“单一试管”方法
2.用于分离核酸并且接着靶物扩增的“单一试管”方法
3.用于从复杂起始材料分离核酸，接着靶物扩增和接着分析扩增
的核酸片段的“单一试管”方法。
这意味着，在正是同样的反应体中或者如果需要，在一个且相同的反应表面上，进行从含有DNA的最多种起始材料分离核酸，和如果需要，靶物扩增和分析。
根据本发明的制剂和用于从任意含有核酸的起始材料和大量物质中分离，纯化核酸和接下来的染色体组分子分析的普遍适用的方法，代表用于基因分析的整体完全自动化系统开发的新的平台技术，其使得在一个反应体内制备样品，扩增和分析靶物。
下面，通过实施的实施例更详细解释本发明。
1.从各种植物材料分离基因组DNA
总是在液氮下用研钵研碎50～100毫克的起始材料，并且接着转移到1.5毫升Eppendorf反应器中。
加入500微升溶解缓冲液(2％CTAB，2％聚乙烯吡咯烷酮，10mMtris-HCl，20mM EDTA和1.3M氯化铵)，并且在65℃下孵育至少30分钟。
离心没有溶解的成分，并且将上清液与200微升异丙醇混合。
将该溶液转移到带有玻璃过滤膜的离心柱上(micro spin柱，LIDA公司)。
以12000rpm离心2分钟。弃除滤液，并且用洗涤缓冲液(50mMNaCl；10mM tris-HCl，1mM EDTA；70％v/v乙醇)洗涤膜两次。
在短时离心步骤(12000rpm离心2分钟)之后，加入200微升洗脱液(10mM tris-HCl，pH 8.7)，并且通过以10000rpm离心1分钟洗脱DNA。
总是将20微升洗脱出的DNA放在琼脂糖凝胶上，并且在用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁染色之后表现出来(如图1所示)。2.用不普遍适用的缓冲液体系从各种起始材料同时分离基因组DNA
下面的样品用于分离：
1-冷冻的全血：50毫升，2-全血：100微升，3-黄瓜：50毫克；4-西红柿植物叶：100毫克；5-唾液样品：100微升；6-鸡肝；冷冻的食品：5毫克；7-鸡肝；冷冻的食品：20毫克；8-发根，9-火鸡乳酸发酵香肠：50毫克；10-紫杉，针叶：100毫克。
所有的样品在500微升溶解缓冲液(2％CTAB，2％聚乙烯吡咯烷酮，10mM tris-HCl，20mM EDTA和1.5M氯化铵)中孵育，除了所有的植物样品在65℃下加入20微升蛋白酶K(20毫克/毫升)。
接着向溶解液加入200微升异丙醇，并且转移到带有玻璃过滤膜的离心柱上(micro spin柱，LIDA公司)。
以12000rpm离心2分钟。弃除滤液并且用洗涤缓冲液(50mM NaCl；10mM tris-HCl，1mM EDTA；70％v/v乙醇)洗涤膜两次。在短时离心步骤(12000rpm离心2分钟)弃除乙醇之后，加入50～200微升洗脱缓冲液(10mM tris-HCl，pH 8.7)，并且通过以10000rpm离心1分钟洗脱DNA。
总是将1/5的洗脱出的DNA加载在琼脂糖凝胶上，并且在用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁染色之后表现出来(图2)。
3.从口腔粘膜的擦拭棉签分离基因组DNA
如下文所述，从口腔粘膜的擦拭棉签分离DNA。
总是将400微升溶解缓冲液(CTAB，聚乙烯吡咯烷酮，氯化铵，tris，EDTA)转移到1.5毫升Eppendorf反应器中。将棉签中的材料挤出并且向悬浮液加入20微升的蛋白水解酶(20毫克/毫升)。接着母液在70℃下孵育10分钟。溶解之后加入200微升去污剂/异丙醇混合物，短时振荡样品，接着转移到商业上可获得的离心柱(LIDA公司；玻璃膜)，并且以12000rpm离心1分钟。
然后，用含有乙醇的洗涤缓冲液(NaCl；tris-HCl，EDTA，乙醇)洗涤柱子两次(以12000rpm离心1分钟)，并且在短时离心步骤中干燥膜。通过加入200微升洗脱缓冲液(10mM tris-HCl)，在短时离心步骤(以10000rpm离心1分钟)中将结合的DNA从过滤膜上洗脱出来。
总是将从两个提取过程中分离的20微升DNA放置在0.7％TAE琼脂糖凝胶上用于分析，并且在用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁染色之后分析(图3)。
4.将根据本发明从全血样品(200微升)提取DNA的情况，与以在离液序列高的盐的存在下结合核酸为基础的商售试剂盒相比较
利用根据本发明方法的基因组DNA的分离，与使用用于结合核酸的离液序列高的盐分离基因组DNA的商业上可获得的传统应用方法相比较。以调节控制应用为基础进行利用对比方法的基因组DNA的提取。
下文描述利用根据本发明方法的DNA的分离。
总是将200微升全血样品(用EDTA处理过的新鲜样品)转移到1.5毫升Eppendorf反应器中。
加入350微升溶解缓冲液(CTAB，聚乙烯吡咯烷酮，氯化铵，tris，EDTA)和20微升的蛋白酶K(20毫克/毫升)，在70℃下孵育10分钟，以溶解起始材料。
溶解之后，加入180微升去污剂/异丙醇混合物，短时振荡样品，接着转移到商业上可获得的离心柱(LIDA公司；玻璃膜)，并且以12000rpm离心2分钟。
然后，用含有乙醇的洗涤缓冲液(NaCl；tris-HCl，EDTA，乙醇)洗涤柱子两次(以12000rpm离心1分钟)，并且在短时离心步骤中干燥膜。通过加入200微升洗脱缓冲液(10mM tris-HCl)，在短时离心步骤(以10000rpm离心1分钟)中将结合的DNA从过滤膜上洗脱出来。
总是将从两个提取过程中分离的10微升DNA放置在0.7％TAE琼脂糖凝胶上，并且在用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁染色之后分析。
比较基因组DNA的产率，它们的整合性(没有低分子量不清晰的成片电泳条带的清晰的各电泳条带)和提取方法的再现性。可以看到，利用根据本发明的方法可以获得比对比方法更好的结果(图4)。
5.将根据本发明从全血样品(5微升)提取DNA的情况，与利用以在离液序列高的盐的存在下结合核酸为基础的商售试剂盒相比较
利用根据本发明方法的基因组DNA的分离，与使用用于结合核酸的离液序列高的盐的商业上可获得的传统应用方法的基因组DNA分离相比较。以调节控制应用为基础根据对比方法提取基因组DNA。
下文描述利用根据本发明方法的DNA的分离。
总是将5微升全血样品(用EDTA处理过的新鲜样品)转移到1.5毫升Eppendorf反应器中。
通过加入195微升的1XPBS缓冲液而将样品填充到200微升的体积，并且加入350微升溶解缓冲液(CTAB，聚乙烯吡咯烷酮，氯化铵，tris，EDTA)和20微升的蛋白酶K(20毫克/毫升)之后，在70℃下孵育10分钟以溶解起始材料。
溶解之后，加入180微升去污剂/异丙醇混合物，短时振荡样品，接着转移到商业上可获得的离心柱(LIDA公司；玻璃膜)，并且以12000rpm离心2分钟。
然后，用洗涤缓冲液(NaCl；tris-HCl，EDTA，乙醇)洗涤柱子两次(以12000rpm离心1分钟)，并且在短时离心步骤中干燥膜。通过加入200微升洗脱缓冲液(10mM tris-HCl)，在短时离心步骤(以10000rpm离心1分钟)中将结合的DNA从过滤膜上洗脱出来。
总是将从两个提取过程中分离的20微升DNA放置在0.7％TAE琼脂糖凝胶上，并且在用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁染色之后分析。
检测并且比较从非常小量的起始材料分离基因组DNA的可能性和提取方法的再现性。可以看到，利用根据本发明的方法可以获得比对比方法更好的结果(图5)。
6.将根据本发明从各种类型动物组织样品和各种量的起始材料提取DNA的情况，与利用以在离液序列高的盐的存在下结合核酸为基础的商售试剂盒相比较
利用根据本发明方法的基因组DNA的分离，与使用用于结合核酸的离液序列高的盐的商业上可获得的传统应用方法的基因组DNA的分离相比较。以调节控制应用为基础根据对比方法提取基因组DNA。
下文描述利用根据本发明方法的DNA的分离。
总是将5毫克或20毫克的猪肾，猪心和猪肝的组织样品转移到1.5毫升Eppendorf反应器中。
向样品加入400微升溶解缓冲液(CTAB，聚乙烯吡咯烷酮，氯化铵，tris，EDTA)和40微升的蛋白酶K(20毫克/毫升)。
通过在52℃下孵育进行起始材料的溶解。
在短时离心步骤(以14000rpm离心1分钟)中离心出没有溶解溶解成分，并且将上清液加入含有200微升去污剂/异丙醇混合物的新的反应器中之后，短时振荡样品，接着转移到商业上可获得的离心柱(LIDA公司；玻璃膜)，并且以12000rpm离心2分钟。
然后，用含有乙醇的洗涤缓冲液(NaCl；tris-HCl，EDTA，乙醇)洗涤柱子两次(以12000rpm离心1分钟)，并且在短时离心步骤中干燥膜。通过加入200微升洗脱缓冲液(10mM tris-HCl)，在短时离心步骤(以10000rpm离心1分钟)中将结合的DNA从过滤膜上洗脱出来。
总是将从两个提取过程中分离的10微升DNA放置在0.7％TAE琼脂糖凝胶上，并且在用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁染色之后分析。
检测并且比较从各种组织样品和各种量的起始材料分离基因组DNA的可能性，基因组DNA的产率，它们的整合性(没有低分子量不清晰的成片电泳条带的清晰的各电泳条带)和提取方法的再现性。
可以看到，利用根据本发明的方法可以获得比对比方法更好的结果(图6)。
7.利用根据本发明的方法从全血样品(200微升)提取DNA，并且使用离液序列高的盐为介体使核酸与用于结合的各种载体相结合
给出利用根据本发明的方法从200微升全血样品分离基因组DNA，并且使用离液序列高的盐使核酸与用于分离核酸的各种载体(柱子膜和悬浮液)相结合。
用代替LIDA公司的玻璃过滤膜的各种载体如实施例4所述进行DNA的提取。
总是将20微升的分离的DNA放置在0.7％TAE琼脂糖凝胶上，并且在用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁染色之后分析。
如图7所示，根据本发明的方法实现了核酸与迄今为止已知的离液序列高的方法中使用的各种载体的结合。
8.制备含有蛋白水解酶的贮存中稳定的溶解缓冲液体系(缓冲混合物
1)和使用该溶解缓冲液体系来从各种起始材料中分离基因组DNA
制备含有3M氯化钾，2％CTAB，18.2mM tris-HCl(pH8.3)，12.5mMEDTA 2.8％聚乙烯吡咯烷酮的溶解缓冲贮存溶液。在1.5毫升Eppendorf反应器中分成400微升的等份，并且加入40微升的蛋白酶K(20毫克/毫升)。
在冻干室将溶解缓冲液混合物冻干(α2；Christ公司)。
接着在密封反应器中在室温下将溶解缓冲液混合物贮存6个月。
从下面的材料中提取基因组DNA：
A：500微升全血
B：400微升唾液样品
C：脱蜡组织材料。
1.从全血提取DNA
向溶解缓冲液的固体制剂加入500微升全血，并且在70℃下孵育10分钟。加入200微升异丙醇，并且将该悬浮液加入离心柱(玻璃纤维簇)。
以最大离心速度离心1分钟，并且弃除离心液。
加入600微升洗涤缓冲液(70％乙醇，氯化钠，tris，EDTA)，以最大离心速度离心1分钟，并且弃除离心液。重复洗涤步骤。接着通过以最大离心速度离心2分钟将膜干燥。
通过加入200微升洗脱缓冲液(70℃)，并且以最大离心速度离心1分钟从膜上洗脱出DNA。
2.从唾液样品提取DNA
向溶解缓冲液的固体制剂加入500微升唾液样品，并且在70℃下孵育10分钟。加入200微升异丙醇，并且将该悬浮液加入离心柱(玻璃纤维簇)。
以最大离心速度离心2分钟，并且弃除离心液。加入600微升洗涤缓冲液(70％乙醇，氯化钠，tris，EDTA)，以最大离心速度离心1分钟，并且弃除离心液。重复洗涤步骤。接着通过以最大离心速度离心2分钟将膜干燥。
通过加入200微升洗脱缓冲液(70℃)，并且以最大离心速度离心1分钟从膜上洗脱出DNA。
3.从脱蜡组织提取DNA
向溶解缓冲液的固体制剂加入脱蜡组织碎屑。加入500微升ddH2O，并且在52℃下孵育30分钟。
加入200微升异丙醇，并且将该悬浮液加入离心柱(玻璃纤维簇)。
以最大离心速度离心2分钟，并且弃除离心液。加入600微升洗涤缓冲液(70％乙醇，氯化钠，tris，EDTA)，以最大离心速度离心1分钟，并且弃除离心液。重复洗涤步骤。接着通过以最大离心速度离心2分钟将膜干燥。
通过加入200微升洗脱缓冲液(70℃)，并且以最大离心速度离心1分钟从膜上洗脱出DNA。
接着对提取的DNA进行凝胶电泳分析。
为此目的，总是使用1/10的全DNA洗脱液(图8)。
9.制备含有蛋白酶K的贮存中稳定的溶解缓冲液体系(缓冲混合物2)和使用该溶解缓冲液体系来从8个各血液样品(100微升)中分离基因组DNA
制备含有3M氯化铵，2％聚乙烯吡咯烷酮，16.7mM EDTA，60mMtris-HCl，1.6％CTAB，20微升蛋白酶K(20毫克/毫升)的溶解缓冲贮存溶液。
在1.5毫升Eppendorf反应器中分成400微升的等份，并且将开口的Eppendorf反应器置于95℃下的热混合器中孵育，直至其完全干结。接着密封反应器，并且在室温下贮存12个月。
从全血中提取DNA
向溶解缓冲液的固体制剂加入100微升全血，并且在70℃下孵育10分钟。在硅基上加入20微升无机载体悬浮液并短时混合。将母液孵育1分钟。短时离心使载体沉积。用800微升洗涤缓冲液(70％乙醇，氯化钠，tris，EDTA)洗涤载体沉积物，并且通过在70℃下孵育而去除剩余的乙醇。通过加入加热至70℃的200微升洗脱缓冲液(10mM tris-HCl；pH8.69)从载体上洗脱出DNA，并且以最大离心速度离心1分钟从载体中分离核酸，并且将核酸转移到新的反应器。接着对提取的DNA进行凝胶电泳分析。为此目的，总是使用1/10的全DNA洗脱液(图9)。
10.通过与微量培养板的功能化表面直接结合而从外周血淋巴细胞分离基因组DNA
使用商业上可获得的带有COO-基团包被的平板作为微量培养板。
总是将平板的带有官能团的一栏(8个孔)和作为阴性对照的不带COO-基团的一栏用于分离。
所有的孔中加有30微升1XPBS缓冲液中的外周血淋巴细胞，并且加入180微升溶解缓冲液(氯化铵，CTAB，聚乙烯吡咯烷酮，tris-HCl，EDTA，蛋白酶K)，并且在70℃下孵育5分钟。接着加入80微升去污剂/异丙醇混合物。将母液短时振荡，并且孵育5分钟。接着将溶液倒出孔外。随即，用含有乙醇的洗脱缓冲液将各个孔洗涤两次，并且通过在70℃下短时孵育而去除剩余的乙醇。
通过加入25微升10mM的tris-HCl进行核酸的洗脱，并且孵育2分钟。
随即，在0.7％琼脂糖凝胶上评价洗脱液(图10)。

Claims (29)

1.用于分离与固相结合的核酸的、没有离液序列高的成分的制剂，包括：
--一个含有至少一种反离液序列高的盐成分的溶解/结合缓冲液组合物，
--一个固相，该固相为通过酰基，羧基或羟基修饰而具有阴性功能化表面或者可以转化为负电荷势能的功能化表面的所有载体，
--洗涤和洗脱缓冲液。
2.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于所述核酸是DNA。
3.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于所述反离液序列高的成分是铵，铯，钠和/或钾盐。
4.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于所述反离液序列高的成分是氯化铵。
5.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述溶解/结合缓冲液组合物含有去污剂和添加剂。
6.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于去污剂和添加剂是tris-HCl，乙二胺四乙酸，聚乙烯吡咯烷酮，溴化十六烷基三甲铵，tritonX-100，正-月桂基肌氨酸，柠檬酸钠，二硫苏糖醇，十二烷基硫酸钠和/或吐温。
7.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于溶解/结合缓冲液组合物含有用于与固相结合的醇。
8.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于溶解/结合缓冲液组合物含有酶。
9.根据权利要求8所述的制剂，其特征在于溶解/结合缓冲液组合物含降解蛋白质的降解酶。
10.根据权利要求8所述的制剂，其特征在于溶解/结合缓冲液组合物是水溶液。
11.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于溶解/结合缓冲液组合物是在备好待用的反应器中在贮存中稳定的固体制剂。
12.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于所有载体作为用于利用离液剂分离的固相。
13.根据权利要求12所述的制剂，其特征在于所有载体为玻璃纤维簇，玻璃膜，玻璃，沸石，陶瓷，二氧化硅载体。
14.权利要求1所述的制剂用于从含有核酸的起始材料分离核酸的用途，其特征在于
溶解起始材料，
使核酸结合固相，
洗涤与载体结合的核酸并且进行核酸的洗脱。
15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于所述核酸是DNA。
16.根据权利要求14所述的用途，其特征在于含有DNA的材料
--接触包括含有一种反离液序列高的盐成分，至少一种去污剂，添加剂和，一种蛋白水解酶的水溶液的溶解/结合缓冲液组合物，
--接触一种固相，该固相中加入乙醇，
--接着洗涤并且将核酸从固相解溶下来。
17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于所述含有DNA的材料是包括果实、种子、叶子、针叶在内的密集植物材料，包括全血、组织、生物组织取样法所用最小样品、石蜡包被的材料、内镜逆行胰胆管造影样品、棉签在内的临床相关样品，包括鱼、香肠、罐头、牛奶在内的食品，包括头发根、烟蒂、血迹在内的法医样品，以及其它含有DNA的样品。
18.根据权利要求14所述的用途，其特征在于用于溶解/结合的反离液序列高的盐的离子强度在0.1和8M之间。
19.根据权利要求14所述的用途，其特征在于
--起始材料于“单一试管”中或者化学修饰的一步方法中，用阴性功能化表面或可以转化为负电荷势能的表面接触起始材料并溶解，
--进行核酸对表面的结合，
--洗涤结合的核酸，洗脱。
20.根据权利要求19所述的用途，其特征在于阴性功能化表面是如此修饰的平面表面，过滤膜，传统的塑料容器或微量培养板。
21.根据权利要求19所述的用途，其特征在于接着使核酸在相同的反应母液中进行选择的序列片段的扩增反应。
22.根据权利要求21所述的用途，其特征在于，在扩增反应后，接着分析基因序列。
23.根据权利要求19所述的用途，其特征在于接着使核酸在相同的反应母液中杂交和/或测序。
24.根据权利要求14所述的用途，其特征在于使用溶解/结合缓冲液组合物中反离液序列高的成分，使核酸结合固相的分离和纯化核酸的用途。
25.根据权利要求24所述的用途，其特征在于反离液序列高的成分是铵，铯，钠和/或钾盐。
26.根据权利要求24所述的用途，其特征在于对于溶解/结合使用离子强度在0.1和8M之间的反离液序列高的盐。
27.根据权利要求24所述的用途，其特征在于溶解/结合缓冲液组合物以水溶液使用。
28.根据权利要求24所述的用途，其特征在于溶解/结合缓冲液组合物以贮存中稳定的稳定制剂存在。
29.根据权利要求24所述的用途，其特征在于用于在基因治疗中应用的制备分离和纯化DNA。
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