CN1259343C - 透明质酸凝胶、其制造方法以及含有它的医用材料 - Google Patents
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Abstract
把透明质酸和使透明质酸浓度超过5%的水,以及与透明质酸的羧基至少等摩尔的酸共存,保持该状态形成透明质酸凝胶。
Description
技术领域
本发明涉及有透明性的新的透明质酸凝胶及其制造方法,还涉及有良好的生物体适合性的含有它的医用材料。
背景技术
透明质酸是β-D-N乙酰氨基葡萄糖和β-D-葡糖醛酸相互结合的直链状高分子多糖,透明质酸除分布在哺乳动物的结缔组织以外,也存在于鸡的鸡冠和链球菌的夹膜等地方。可用鸡的鸡冠、脐带等做抽取材料,从链球菌的培养物也可以制得精制物。
天然透明质酸的分子量呈多分散性,但它没有物种以及脏器排异性,移植或注入到生物体时也显示优良的生物体适合性(生物相容性)。但是由于在生物体适用透明质酸溶液时因其在生物体内停留时间较短,所以把它的用途向医用材料展开过程中尝试着使用多种多样的化学改性剂交联来提高滞留性。
(I)从关节方面来看,关节液在生物体关节中向关节软骨组织提供营养的同时有其他类没有的润滑功能与减震器功能。已研究出,现已表明其优秀的粘弹性功能主要是由于关节液中的一种主要成分透明质酸。
一般来说,从分析变形性关节症、慢性关节风湿病等各种关节症患者关节液中的透明质酸浓度以及分子量的结果来看,与正常关节液相比,发现有浓度、分子量降低的倾向。可以看出这些与因关节液的润滑作用和关节软骨表面保护作用降低而引起的运动功能障碍或疼痛症状的发生有密切关系。
作为对这些关节病中的变形性膝关节症的有效手段,近年来广泛采用把高分子量透明质酸溶液注入到患病关节部位的方法(Artz:生化学工业制,平均分子量90万;Hyalgan:Fidia制,平均分子量<50万)。这里使用的高纯度纯化的透明质酸是从鸡冠中得到的。
从鸡冠中得到的透明质酸因为本来就是存在于生物体中的物质,所以非常安全,而且可以得到有效的治疗效果。但是为了得到有效的效果必须加入数次至10次。
在把像这样的分子量100万以下的透明质酸注入到兔膝关节腔后的关节腔内中的贮留性试验中,发现透明质酸在1日~3日内从关节腔中消失,从这个结果也可以看出频繁给药的必要性[Blood Coagulation and Fibrinolysis,vol2,173,1991]。
另一方面,认为生物体内存在的透明质酸的分子量本来就可达到数百万~千万,而且可以预计比生物体内分子量稍高的透明质酸可能会得到更好的效果,所以开发了用化学交联剂处理的交联透明质酸作为膝关节治疗药[Hylan:Biomatrix制]。
据报告,这个交联透明质酸在上述通过注入到兔关节腔的贮留性试验中可长期驻留达20日~30日。所以得出了给药3次可得到非常有效的临床试验结果,现在在实践上被作为关节症治疗剂[Joumal of Rheumatology卷20,16,1993]。
(II)下面列举栓塞的例子。现已知道,通过栓塞形成的治疗对像脉管性疾病、动脉瘤以及畸形静脉瘤等各种疾病有效。另外,采用闭塞动脉给肿瘤提供营养的通路的方法来治疗肿瘤也是有效的。
已提出数种实施栓塞形成法的方法。例如,开发了使用一端装有气球的导管的气球栓塞形成法(W.Taki等、Surg.Neurol,卷12,363,1979)。其他已知的还有把2-羟乙基甲基丙烯酸盐(HEMA)单体与聚合催化剂一起通过导管导入气球的方法(W.Taki等、Surg.Neurol.,卷13,140,1980)。
作为癌的栓塞治疗法,已报告的有含有顺铂的壳多糖(田原等,癌与化学疗法,21卷,13号,2225页,1994年),载有顺铂的多(苄基1-谷氨酸脂)微球体(Li C等,Parm.Res.,卷11(12),1792,1994),SMANCS与碘化罂粟油悬浊液中使用明胶海棉作为栓塞材料(中村等、癌与化学疗法,22卷,11号,1390页,1996年)的例子等。也有适合化学疗法剂持续注入与组合的化学栓塞疗法材料多(DL-乳酸)微球体的报告(Flandroy P等,J Control Release,卷44(2/3),153,1997)。根据记载该疗法的反复实施中数天内必须能生物分解。
气球栓塞形成法因为气球瘪掉,所以闭塞期间短,难以得到充分的效果,像HEMA的单体的聚合方法中存在聚合可能在导管内发生等多种问题。还有,用于化学栓塞疗法中的栓塞材料多数是合成材料,所以生物分解性差,生物适合性方面也值得怀疑。关于多(DL-乳酸)微球体,如考虑反复给药,仅由生物分解性不能完全保证其安全性。
透明质酸因有优良的生物体适合性而在安全方面无任何问题,但是仅给予透明质酸不能形成栓塞,且还要提高局部滞留性和贮留性。
(III)现考虑关于软组织方面,因软组织的修复或膨胀而注入种种材料的方法在发明皮下注射针后取得了急速发展。很多物质为矫正软组织或皮肤注入到人体中。其中液体硅树脂的注入曾被广泛进行,但因其长期的残留而引起皮肤溃疡等副作用现在已不大使用。另外采用了胶原注入。所采用的胶原为经交联剂化学交联的纤维状的胶原等。注入交联的固体胶原时必需切开手术,成型性及柔软性方面有问题。美国专利3949073号中有关于整形的纤维状的胶原的记载。
但是,因它的液状成分被吸收而体积减少,所以有补充的必要。而且可以注入的像这种可注射的胶原难以除去像免疫物质等污染物质,成本也高,各种物理性能也不能说是最适合。
已有把透明质酸作为软组织注入剂使用的试验(Ann.Plast.Surg.,38卷,308,1997)。透明质酸溶液在体内中的吸收快,为提高软组织内的停留性、贮留性,尝试了对透明质酸进行化学交联的各种方法(美国专利第4582865号说明书、特公平6-37575号公报、特开平7-97401号公报、特开昭60-130601公报)。
还有例如海兰(hylan)B凝胶以Hylaform的形式在欧洲销售(The ChemistryBiology and Medical Application of Hyaluronan its Derivatives卷72,278页,PORTLAND PRESS)。
(IV)下面考虑眼球后部特别是与玻璃体接触的视网膜,视网膜形成眼内空间的后部边界,晶状体及睫状体形成全部边界。视网膜由两层构成,与玻璃体液直接接触的受体层有感光细胞,与脉络膜接触的层由色素上皮细胞构成。液体侵入受体层会使视网膜的二层分离而产生视网膜剥离。
视网膜的治疗是采用例如光凝固、冷冻凝固等方法使剥离的视网膜与色素上皮层及脉络膜接触来封闭视网膜。要使它们接触的时候,采用把内方向的弯曲从外侧压向巩膜以及脉络膜,或者注入提高玻璃体液容量的物质用玻璃体液向视网膜加压。
在后一场合,对于像发生不能充分地再吸收的出血或者视网膜剥离中并发的膜向内方向生长等要用手术把玻璃体液完全或者部分除去的病例,尝试了作为代用玻璃体的种种物质。
使用像这样的代用玻璃体的目的是保持眼球的形态,一定期间内在玻璃体腔内把视网膜压向色素上皮并使视网膜复位。
作为代用玻璃体的有生理食盐水、甘油、动物玻璃体、空气、各种气体、聚乙烯醇、胶原凝胶、硅油、透明质酸以及全氟化碳等,现在通用的是空气、六氟化硫等气体,硅油、全氟辛烷或全氟萘烷等全氟化碳液体。
作为代用玻璃体的种种气体是膨胀性气体,直接使用或与空气混合使用,已证明了其有用性[American Journal of Opht hyaluronic acid lmology,卷98,180,1984]。
然而有时引起因气体的膨胀而使眼压上升或瞳孔呆滞的并发症、有时还因与角膜内皮接触而引起角膜混浊,而且手术后患者要长时间保持低头姿势,对患者的负担也很重。
硅油因利用了几乎不被吸收的特点所以比气体在眼内空间保持更长时间,它是促进视网膜附着的有效物质[Retina,卷7,180,1987]。但是,要以得到顶住视网膜的效果后可以除去作为前提条件才能使用。而且已发现它与白内障、青光眼或对眼组织的毒性作用等重大问题有关[眼科,卷7,180,1987]。
全氟化碳液体作为代用玻璃体使用时,发现了增殖性玻璃体视网膜症、白内障以及低眼压等并发症,对是否比硅油或气体有更好的安全性及有效性留有怀疑[新眼科,卷12,1053,1995]。
透明质酸自从Balazs报告[Mod.Probl.Opht透明质酸1mol.,卷10,3,1972]在眼科领域中的应用后被作了很多研究。现在在眼科手术特别是眼内晶状体插入手术中通用。
透明质酸是通常存在于生物体内的物质,不可能引起毒性或者免疫反应。然而,透明质酸注入到玻璃体腔内后不分解,它溶解在眼房水后通过前房、前房角纤维柱网排出到眼外,对在眼内空间的保持效果的持续时间重要的视网膜剥离症治疗效果不充分。
使用透明质酸作为玻璃体注入物时,例如要像特开平5-184663记载的那样,理想的是分子量为90万以上、较佳的160万~200万的透明质酸的(质量)%在1.5以上、较佳为2~2.5(质量)%,但是眼内空间中的贮留性不好[日本眼科纪要,卷38,927,1987],而且往玻璃体内注入这些超过1.5质量%的具有如此分子量的透明质酸溶液对注射器的负荷太大以至不能实用。
从以上例子可看出,提高透明质酸的生物体内贮留性在各种用途中是必要的,已用多种多样的化学改性剂对透明质酸进行了交联(美国专利第4582865号说明书、特开昭60-130601号公报、特开昭63-281660号公报、特公平6-37575号公报、特公平6-69481号公报、特开平7-97401号公报、特开平9-59303号公报)。另外已知的还有通过用紫外线照射可光交联的透明质酸衍生物来制造光交联的透明质酸凝胶(特开平8-143604号公报)。
然而,这种交联的透明质酸已经不是本质上的透明质酸,考虑到除去交联剂的操作、难以完全否定交联剂的残留,不能绝对保证生物体内适用的物质所需的无毒性、无抗原性特性。
本发明者第一次发现了不用交联剂等物质单独用透明质酸制造难溶性透明质酸凝胶的简便方法(PCT/JP98/03536)。然而,凝胶是片状、膜状、破碎状、海绵状、或者是块状等,哪一个也没有透明性。
由于本发明者认为含难溶性且有透明性的透明质酸的材料在各种医疗用途中有用,因此本发明者进行了专心的研究。
为了最大限度地利用透明质酸本身具有的良好的生物体适合性,希望不用化学交联剂或化学改性剂得到难溶的透明的透明质酸凝胶,但是目前为止还没有开发出来。
另一方面,在眼科领域特别是作为代用玻璃体,使用透明质酸凝胶时从效果考虑的话必须透明。而且折射率越接近玻璃体的折射率(1.3345~1.3348;眼科诊疗实践,卷22,234页,1996,文光堂,东京)越好。但是还没有开发出满足这些要求的透明质酸凝胶。
本发明者认为,不使用交联剂单独用透明质酸形成的难水溶性透明质酸凝胶上如果能附加透明性,那么透明质酸凝胶的用途会更广泛。本发明者对这个方面进行了深入的研究,结果发现,如果把透明质酸与使透明质酸浓度至少为5(质量)%的水,以及与透明质酸的羧基至少等摩尔的酸成分共存,那么在保持改共存状态下可以形成透明质酸凝胶,而且本发明得到的透明质酸凝胶有透明性的特点。
发明揭示
即,本发明包含以下主要内容:(1)一种制备透明质酸凝胶的方法,其特征在于该方法包括使透明质酸和使透明质酸浓度至少为5(质量)%的水,以及与透明质酸的羧基至少等摩尔的酸成分共存,通过保持该共存状态形成透明质酸凝胶。(2)如(1)所述的制备透明质酸凝胶的方法,其特征在于把透明质酸与使透明质酸浓度至少为5(质量)%的水,以及与透明质酸的羧基至少等摩尔的酸成分共存,使该共存状态保持在-10℃~30℃下,形成透明质酸凝胶。(3)一种制备透明质酸凝胶的方法,其特征在于把透明质酸与使透明质酸浓度至少为5(质量)%的水,以及与透明质酸的羧基至少等摩尔的酸成分共存,在-10℃~30℃下保持该共存状态,形成透明质酸凝胶,用中和溶液处理该凝胶。(4)一种制备透明质酸凝胶的方法,其特征在于,把含有与透明质酸的羧基至少等摩尔的酸成分、透明质酸浓度至少为5(质量)%的透明质酸酸性水溶液保持在-10℃~30℃下,形成透明质酸凝胶,用中和溶液处理该该凝胶。(5)一种制备透明质酸凝胶的方法,其特征在于,把透明质酸和含有与该透明质酸的羧基至少等摩尔的酸成分的酸性水溶液按透明质酸对酸性水溶液浓度至少为5(质量)%的比例混合,将混合后的透明质酸酸性混合物保持在-10℃~30℃下,形成透明质酸凝胶,用中和溶液处理该凝胶。(6)一种透明质酸凝胶的制备方法,其特征在于,在透明质酸中加入含有与该透明质酸的羧基至少等摩尔的酸成分的酸性水溶液,使透明质酸浓度达到至少为5(质量)%,然后在-10℃~30℃下保持,形成透明质酸凝胶,用中和溶液处理该凝胶。(7)一种单独用透明质酸形成的透明质酸凝胶,其特征在于在中性水溶液中难溶且有透明性。(8)如上述(7)所述的透明质酸凝胶,其特征在于在25℃中性水溶液里一天内的溶解率至多为50%。(9)如(7)所述的透明质酸凝胶,其特征在于,在透明质酸的促进酸水解条件下处理透明质酸凝胶,得到的增溶的透明质酸有支化结构,该增溶的透明质酸部分含有支化度至少为0.5的分子量级分。(10)一种含有由透明质酸单独形成的在25℃中性水溶液里一天内溶解率至多为50%且有透明性的透明质酸凝胶的医用材料。(11)一种含有满足下列条件的由透明质酸单独形成的透明凝胶的医用材料,在透明质酸的促进酸水解条件下处理透明质酸凝胶,得到的增溶的透明质酸有支化结构,该增溶的透明质酸部分地含有支化度至少为0.5的分子量级分。(12)一种医用材料,它含有透明的透明质酸凝胶和未凝胶化的透明质酸,其中透明质酸凝胶在25℃中性水溶液里一天内的溶解率至多为50%,在透明质酸的促进酸水解条件下处理透明质酸凝胶得到的增溶的透明质酸有支化结构,该增溶的透明质酸部分地含有支化度至少为0.5的分子量级分。(13)根据(10)-(12)任一项记载的医用材料,其中有透明性的凝胶呈破碎状。(14)如(10)-(13)任一项记载的医用材料,其特征在于,医用材料用作关节症治疗用注入剂。(15)如(10)-(13)任一项记载的医用材料,其特征在于,医用材料是栓塞形成材料。(16)如(10)-(13)任一项记载的医用材料,其特征在于,医用材料是软组织注入剂。(17)如(10)-(13)任一项记载的医用材料,其特征在于,医用材料是代用玻璃体。
根据本发明,可以提供由透明质酸单独形成的难溶于水且有透明性的透明质酸凝胶。这样本发明的透明质酸凝胶由于没有使用交联剂等物质,所以维持着生物体内本来存在的透明质酸的结构,安全性以及生物体适合性方面非常优良,作为关节症治疗剂,栓塞形成剂,软组织注入剂,代用玻璃体等医用材料使用有效。
附图简述
图1是比较实施例10与比较例3的GPC色谱与各级分的分子量的图。图2是把比较例3看作直链状透明质酸的基础上计算的表示实施例10的支化度与分子量关系的图。
实施本发明的最好形态
以下将详细说明本发明。
本发明中使用的透明质酸不论是从动物组织抽取的或者用发酵法制成的都可以安全使用。
发酵法中使用的菌株是可从自然界分离出的链球菌属等可以生产透明质酸的微生物,或者理想的是如特开昭63-123392号公报中记载的马链球菌FM-100(微工研菌寄第9027号)、特开平2-234689号公报中记载的马链球菌FM-300(微工研菌寄第2319号)那样的可以高产率稳定生产透明质酸的突变株。可以使用由上述突变株培养、纯化的物质。
本发明中使用的透明质酸的分子量宜在约1×105~1×107道尔顿范围内。还有,只要透明质酸含有上述分子量范围内的分子量,那么从更高分子量的透明质酸经加水分解等过程得到的低分子量透明质酸同样可以顺利地使用。
还有本发明中提及的透明质酸的概念包括其碱金属盐,例如包含钠、钾、锂盐。
另外,本发明中提及的由透明质酸单独形成的凝胶意味着除透明质酸以外不能使用化学改性剂或化学交联剂,要在没有与阳离子型聚合物形成复合体的情况下形成凝胶,凝胶是自交联的凝胶。
另一方面,制作本发明中所提及的透明质酸凝胶时可以添加与透明质酸的交联构造的导入或透明质酸的不溶化或者难溶化无直接关系的物质。
还有,制造透明质酸凝胶时可以添加药学或生理学活性物质,从而形成含有这些的透明质酸凝胶,没有任何限制。
本发明中提及的透明质酸凝胶是以在中性水溶液中难溶为特征。
这里的“难溶”是指在25℃的中性水溶液中测定溶解性时,12小时内的溶解率为50%以下,较佳为30%以下,更佳为10%以下。
本发明中提及的透明质酸凝胶是有三维网状结构的高分子以及它的膨胀体。三维网状结构是由透明质酸的交联结构形成的。
本发明中提及的透明质酸凝胶可以采用在促进透明质酸酸水解的条件下处理透明质酸凝胶的方法进行分解、溶化。溶化后的透明质酸保持交联结构时,可以作为有分支的透明质酸与聚合物溶液理论的直链透明质酸区别开来。
本发明中提及的透明质酸的酸水解促进条件宜为pH 1.5,温度60℃的水溶液。透明质酸因糖苷键水解而引起的主链切断反应,与中性水溶液中相比,在酸性或碱性条件有显著促进。另外,酸水解反应中反应温度高可以促进反应。
本发明中使用了GPC-MALLS法,在线连续测定了用GPC分离的分子量级分的分子量与支化度。本发明中采用了比较同一流出体积的级分的增溶的透明质酸分子量与作为对照的直链透明质酸的分子量、从而计算支化度的流出体积法测定支化度。支化度就是溶解后的透明质酸的每一个高分子链中存在的支化点个数,然后对溶化后的透明质酸的分子量作图。在PCT/JP98/03536中描述了关于根据使用GPC-MALLS法的流出体积法测定支化度的内容。
溶化后的透明质酸在GPC溶剂(0.2摩尔/升硝酸钠溶液)中稀释来调节浓度,在0.2μm的膜滤器中过滤后用于测定。
本发明中提及的透明质酸凝胶中如果有在透明质酸的酸水解促进条件下也可以稳定存在的交联结构,则可以在高分子溶液理论上确认溶解后的透明质酸中的支化结构。本发明中提及的透明质酸凝胶的支化度至少为0.5。
本发明中提及的有透明性是指把本发明的透明质酸凝胶放入10mm厚的分光光度计用比色杯中,以水的透过率为100%对340nm~800nm范围内的可见光测定透过率时透过率至少50%,较佳的是至少70%,更佳是至少90%。
本发明的透明质酸凝胶是把透明质酸与使透明质酸浓度至少为5(质量)%的水,以及与透明质酸的羧基至少等摩尔的酸成分共存,然后在不冷冻的条件下保持该共存条件而制成的。
本发明中为了调节酸性而加入的酸的量由透明质酸盐的平衡离子种类、透明质酸的分子量、透明质酸浓度、以及生成的凝胶的强度等各个特性来适当决定,但一般来说较佳的是与透明质酸的羧基至少等摩尔的酸成分的量。
决定酸的种类时只要比透明质酸酸性强的酸即可。为了减少酸的使用量,较佳地是用强酸,例如盐酸、硝酸、硫酸等。
还有,在透明质酸的浓度小于5(质量)%时,即使调节成能使透明质酸的羧基充分质子化也不能得到透明质酸凝胶。
本发明中把透明质酸与使透明质酸浓度至少为5%的水,以及与透明质酸的羧基至少等摩尔的酸成分共存后,为了进行凝胶化有维持(保持)其状态的必要。保持这种状态时也可以采用静置一定时间的方法。
保持状态时的温度或时间根据透明质酸盐的平衡离子种类、透明质酸的分子量、透明质酸浓度、与生成的凝胶的强度等各个特性而酌情决定,但是关于温度,最好是为使水分不冷冻而且为抑制透明质酸在酸中的分解,宜取-10℃以上30℃以下。
透明质酸冻结则生成不透明的透明质酸凝胶。
本发明中使用的配制透明质酸浓度至少为5(质量)%的透明质酸水溶液的方法不成问题,可以举出的有透明质酸与酸性水溶液混合的方法、透明质酸中加酸性水溶液的方法、把调制成低浓度的透明质酸酸性水溶液浓缩到所定浓度的方法或在高浓度的透明质酸水溶液中添加酸的方法等。
本发明中使用的透明质酸的形态不成问题,可以举出的有粉末、把透明质酸粉末加压成型后得到的片状成型物、把透明质酸溶解在蒸馏水中形成水溶液后经通风干燥得到的浇注薄膜或冷冻干燥后得到的海绵状透明质酸等形状。采用混合透明质酸与酸性水溶液的方法时可以举出的有透明质酸中添加酸性水溶液后捏合的方法等。
还有,采用透明质酸中浸渍酸性水溶液的方法时,可以举出在透明质酸中浸渍酸性水溶液达到所定浓度的方法等。
采用把调制成低浓度的透明质酸酸性水溶液浓缩到所定浓度的方法时,首先,把透明质酸溶解在蒸馏水后加酸或把透明质酸直接溶解到酸性水溶液,配制出低浓度的透明质酸酸性水溶液。在这里,溶解的透明质酸的形态不成问题。这里提及的低浓度是指比形成透明质酸凝胶的透明质酸目的浓度低的浓度,但是从容易操作的方面来看希望较佳的是透明质酸浓度低于5(质量)%的浓度。可举出的浓缩方法有超离心分离、通风干燥、减压干燥、冷冻干燥等。
采用高浓度透明质酸水溶液中添加酸的方法时,根据把透明质酸和蒸馏水混合的方法或把低浓度透明质酸水溶液浓缩的方法调制出高浓度的酸性水溶液。这时使用的透明质酸的形态不成问题。往得到的高浓度透明质酸水溶液中添加酸的方法可以举出的有在气态酸如氯化氢氛围下暴露的方法或浸在对透明质酸的难溶剂如浸在乙醇盐酸中的方法等。
为了避免透明质酸的酸水解,本发明中得到的透明质酸凝胶需要中和羧基被质子化的酸型透明质酸或者为调节酸性而使用的酸等成分。中和通常用水性溶剂进行。只要不损害透明质酸凝胶的功能,就没有特别限制。例如可以使用磷酸缓冲液、氢氧化钠水溶液等。
这里把这些总称为中和用溶液。
还有,使用中和用溶液处理的方法(中和方法)没有特别的限制,通常采用间歇法、过滤法、液体通过填充柱的方法等。这些中和条件包括中和液量、次数,只要能把酸型透明质酸或为调节酸性使用的酸等成分中和即可,可以根据透明质酸凝胶的形态或用途适当选择。
经过中和用溶液处理后的透明质酸凝胶对应于其使用目的可以在溶剂中浸渍的状态,含溶剂的湿润状态,经过通风干燥、减压干燥或冷冻干燥等处理的干燥状态提供。
透明质酸凝胶的成型加工等处理,在制作时可根据透明质酸以及已配好的透明质酸酸性水溶液的容器或手法的选择制作成所希望形态的片状、膜状、破碎状、海绵状、块状、纤维状以及管状。例如,可以从透明质酸粉末加压成型产物得到块状和片状的形态。制作透明质酸凝胶后的加工例子有由机械性粉碎得到细微的破碎状或由冷冻、解冻得到海绵状,经压延进行成膜、纺丝等。
调制本发明的透明质酸凝胶时如果注意使用试剂、水、容器可以得到无菌且无内毒素的物质。
这样调制的透明质酸凝胶本身是透明的。另外破碎的透明质酸凝胶在混浊状态下也有可以维持透明状态,可以填充到注射管或袋子中使用。另外,制作本发明的透明质酸凝胶时添加药学或生理学上活性物质,可以制成含有这些的透明质酸凝胶。
例如,可以举出为促进栓塞形成添加的,通过在血液凝固级联反应中把纤维蛋白原变换成纤维蛋白的方法使血液凝固的纤维蛋白酶;以肿瘤动脉闭塞为目的而使用的各种抗肿瘤药等,没有任何限制。
本发明的透明质酸凝胶,与透明质酸溶液相比,在生物体内的停留性、贮留性显著提高,且因为没有使用交联剂,安全性以及生物体适合性优良,所以可以作为医用材料适合用作关节症治疗用注入剂、栓塞形成材料、软组织注入剂、代用玻璃体等。
实施例
以下实施例中将详细说明本发明,但是本发明不局限在这些实施例。
实施例1
将透明质酸钠(从极限粘度换算的分子量:2×106道尔顿)的粉末100毫克在3000N/cm2下加压3分钟,得到8mm×8mm×2mm的长方体成型物。将该成型物放入苯乙烯制的方形容器中,加入1摩尔/升的盐酸570毫克,使透明质酸浓度达到15%,密闭容器,然后在设定为5℃的冷柜中静置保存6日。结果得到了长方体形的透明的透明质酸凝胶。
实施例2
在实施例1中为使透明质酸浓度达到7(质量)%,加入1摩尔/升的盐酸1330毫克。然后进行与实施例1同样的操作,结果得到了长方体形的透明的透明质酸凝胶。
实施例3
在实施例1中使用透明质酸钠(从极限粘度换算的分子量:9×105道尔顿),进行同样的操作,然后在设定为5℃的冷柜中静置保存17日。结果得到了长方体形的透明的透明质酸凝胶。
实施例4
在实施例1中,使用0.45摩尔/升的盐酸进行同样的操作,然后在设定为5℃的冷柜中静置保存17日。其结果得到了长方体形的透明的透明质酸凝胶。
实施例5
进行与实施例1同样的操作,在25℃中静置保存3日,其结果得到了长方体形的透明的透明质酸凝胶。
实施例6
将透明质酸钠(从极限粘度换算的分子量:2×106道尔顿)溶解在蒸馏水中,调制1(质量)%的透明质酸水溶液。使调制好的透明质酸水溶液在80℃下在玻璃板上通风干燥,得到了厚约200微米的浇注薄膜。在实施例1中使用该浇注薄膜进行同样的操作。其结果得到了片状的透明的透明质酸凝胶。
实施例7
将透明质酸钠(从极限粘度换算的分子量:2×106道尔顿)的粉末100毫克放入50毫升的玻璃瓶中,加入1摩尔/升的盐酸900毫克,使透明质酸浓度达到10(质量)%,然后用刮勺混合。然后密闭瓶子,在设定为5℃的冷柜中静置保存8日。其结果得到了透明的透明质酸凝胶。
实施例8
把透明质酸钠(从极限粘度换算的分子量:2×106道尔顿)的粉末溶解在1摩尔/升的盐酸中,配制1(质量)%的透明质酸水溶液。对配制好的透明质酸溶液进行超离心分离处理,然后除去上清,结果透明质酸浓度浓缩到18(质量)%。把该浓缩的透明质酸溶液在设定为5℃的冷柜中静置保存3日。其结果得到了透明的透明质酸凝胶。
超离心分离处理中机器为日立工业制CS120EX,转子为S100AT5,取样管使用4PC管,转数为99000rpm,处理温度是5℃,处理时间是24小时。
比较例1
在实施例1中,用蒸馏水替换1摩尔/升的盐酸进行同样的操作。其结果虽然得到了透明的透明质酸凝胶状溶液,但没有得到透明的透明质酸凝胶。
比较例2
在实施例1中,为使透明质酸浓度达到3(质量)%,加1摩尔/升的盐酸3230毫克。然后进行了与实施例1同样的操作。其结果虽然得到了透明的透明质酸凝胶状溶液,但没有得到透明的透明质酸凝胶。
实施例9透明质酸凝胶的溶解性试验
生理食盐水中加磷酸缓冲液,使其达到50毫摩尔/升的浓度,配制pH7的磷酸缓冲生理盐水。将得到的透明质酸凝胶按含相当于干燥重量为10毫克的透明质酸的透明质酸凝胶对应50毫升磷酸缓冲生理食盐水的比例浸渍到磷酸缓冲生理食盐水中。又将比较例1中的透明质酸凝胶状溶液也按相当于干燥重量为10毫克的溶液浸渍到50毫升磷酸缓冲生理食盐水中。然后在25℃中缓慢搅拌的条件下,从磷酸缓冲生理食盐水的透明质酸浓度求出磷酸缓冲生理食盐水中溶解的透明质酸的比例。
所以,中性25℃水溶液中的透明质酸凝胶的溶解性是按上述试验求出的。
透明质酸浓度的测定
磷酸缓冲生理食盐水中的透明质酸浓度是用GPC从示差折射率检测器的峰面积求得的。
如上所述,实施了具体实施例1~8以及比较例1、2的透明质酸凝胶的溶解性试验。其结果记在表1中。
表1.比较溶解性
实验No | 试样 | 溶解率(%) | 备注 | ||
1日后 | 7日后 | 14日后 | |||
1 | 实施例1的透明HA凝胶 | 0 | 1 | 11 | 实施例 |
2 | 实施例2的透明HA凝胶 | 4 | 10 | 19 | 实施例 |
3 | 实施例3的透明HA凝胶 | 2 | 10 | 25 | 实施例 |
4 | 实施例4的透明HA凝胶 | 4 | 10 | 28 | 实施例 |
5 | 实施例5的透明HA凝胶 | 18 | 44 | 94 | 实施例 |
6 | 实施例6的透明HA凝胶 | 8 | 54 | 100 | 实施例 |
7 | 实施例7的透明HA凝胶 | 22 | 67 | 100 | 实施例 |
8 | 实施例8的透明HA凝胶 | 4 | 24 | 56 | 实施例 |
9 | 比较例1的凝胶状溶液 | 100 | -- | -- | 比较例 |
10 | 比较例2的凝胶状溶液 | 100 | -- | -- | 比较例 |
(注)HA:透明质酸
例如,现在查阅实验No.1的实施例1中得到的溶解率,经过1日后为5%以下的溶解率,经过7日为1%,经过14后得到了11%的溶解率。即,经过7日后也残留90%以上的透明质酸凝胶。对应这些,实验No.9、10的比较例1、2中得到的透明质酸的溶液的溶解率经过1日后为100%溶解率,完全溶解了。
所以,与比较例1、2(实验No.9、10)中得到的透明质酸凝胶状的溶液在水中的溶解度很快相比,发现用本发明的制造方法得到的透明质酸凝胶(例如,实验No.1~8)在水中的溶解速度极其缓慢。
从这些可知,本发明中得到的透明质酸凝胶在生物体内停留时间长。
实施例10
透明质酸凝胶的溶解实验
把蒸馏水用盐酸调整到pH 1.5。把实施例1中得到的透明质酸凝胶在实施例9中记载的磷酸缓冲生理实验水中浸渍5日后从磷酸缓冲生理食盐水中取出透明质酸凝胶。然后把含相当于干燥重量为15毫克透明质酸的透明质酸凝胶浸渍在pH1.5的盐酸水溶液15毫升中。把该溶液放置在设定为60℃的烘箱中,进行加水分解。
在1小时后,2.5小时后,5小时后分别取样0.5毫升溶液。2.5小时后几乎没有目视可以确认的透明质酸凝胶。
比较例3
把透明质酸钠(从极限粘度换算的分子量:2×106道尔顿)溶解在蒸馏水中,配制成0.1(质量)%的透明质酸水溶液。将该水溶液的pH用1摩尔/升盐酸调节至pH 1.5。将该透明质酸的酸性水溶液15毫升在60℃烘箱中放置4小时,进行直链状透明质酸的酸水解。
实施例11
可溶化透明质酸的分子量与支化度的测定
把实施例10中增溶的透明质酸与比较例2中得到的直链状透明质酸的酸水解产物在GPC溶剂中稀释2.5倍,浓度调至0.04(质量)%,然后通过0.2微米的膜滤器过滤,而后注入0.1毫升进行GPC-MALLS的测定。
用GPC柱(昭和电工社制SB806HQ)、示差折射率检出器(日本分光社制830-RI)、MALLS DAWNDSP-F(Wyatt社制),溶剂为0.2摩尔/升硝酸钠水溶液,测定温度为40℃,流速为0.3毫升/分,取数据间隔为1次/2秒条件下进行测定。散射强度的测定用散射角21.7°~90°的8检出器。数据处理软件用Wyatt社制ASTRA Version 4.10。
如上所述,对实施例10中的增溶的透明质酸与比较例3中得到的直链状透明质酸的酸水解产物进行测定。表2中列出了测定结果。
表2
实验No | 反应时间(时间) | 重均分子量Mw | 分子量分布Mw/Mn | 可溶化率(%) | 备注 |
11 | 1 | 36.8万 | 1.8 | 28 | 实施例10 |
12 | 2.5 | 58.4万 | 2.7 | 84 | 实施例10 |
13 | 6 | 10.7万 | 1.8 | 97 | 实施例10 |
14 | 4 | 35.0万 | 1.7 | -- | 比较例3 |
例如,实验No.11的实施例10中反应时间为1小时的条件下取样时透明质酸凝胶的可溶化率很小。反应时间为6小时的实验No.13中取样时,分子量大幅度下降,支化度测定变得困难。反应时间为2.5小时的实验No.12中取样时,透明质酸的可溶化率也高,反映含有支化点的透明质酸的存在的分子量分布也达到2.7的大数值。
图1以及图2显示了实验No.12的实施例10中反应时间为2.5小时下取样的增溶的透明质酸和实验No.14的比较例3中得到的直链状透明质酸的酸水解物的GPC色谱与支化度的计算结果。
图1是比较实施例10与比较例3的GPC色谱与各级分分子量而制成的图。这里符号1显示实施例10的GPC色谱图,符号2显示比较例3的GPC色谱图,符号3显示实施例10的各级分,符号4显示比较例3的各级分。从图1可知,实施例10的GPC色谱图1与比较例3的GPC色谱图2相比,高分子量侧有台肩(shoulder)。比较同一流出体积的级分的分子量时可知,实施例10在洗脱(流出)体积为8.6毫升以下、分子量约为20万以上的领域里具有与比较例3相比明显大的分子量。
实施例10中因为有支化点,所以与比较例3相比,同一流出体积的级分的分子量变大。
图2是显示把比较例3看作直链状透明质酸的基础上计算的实施例10的支化度与分子量的关系的曲线。即,支化度是把图1的同一流出体积的级分的两者的分子量代入到数学式里计算出的。
从图2中可知,实施例10的支化度在分子量约为20以上的领域中从支化度为0.5以上急速增大。所以可知本发明中得到的透明质酸凝胶中含有在透明质酸的促进酸水解条件下中也能稳定存在的交联结构。
同样,实施例2~8中得到的透明质酸凝胶的支化度都至少为0.5。
实施例12透明凝胶料浆
在实施例1得到的透明的透明质酸凝胶0.8g中加入80毫升的生理食盐水。用微量均化器(Nissei Excel Auto Homogenaizer)进行破碎处理,得到含平均粒径为300微米的破碎状透明质酸凝胶的料浆。
将该透明质酸凝胶料浆填充到Terumo株式会社制的2.5毫升注射器(活塞直径约为12mm),装上Terumo株式会社制的规格为21G的注射针后,测定在25℃附近的室温下以0.1毫升/秒的速度排出时的力(用岛津制作所制Tensilon EZ Test-20N)。排出力约为10N,可以容易地排出。
实施例13透明凝胶组合物
在实施例1得到的透明的透明质酸凝胶0.8g中加入40毫升生理食盐水。用微量均化器(Nissei Excel Auto Homogenaizer)进行破碎处理,得到含平均粒径为300微米的破碎状透明质酸凝胶的料浆。往这个料浆里添加透明质酸浓度为1(质量)%的透明质酸生理食盐水40毫升,得到透明质酸凝胶组合物。
将该透明质酸凝胶组合物按实施例10中记载的方法测定排出力,结果排出力约为12N,可以容易排出。
比较例4透明质酸凝胶料浆
按PCT/JP98/03536中记载的制备方法配制透明质酸凝胶,进一步制成透明质酸凝胶。
把透明质酸钠(从极限粘度换算的分子量:2×106道尔顿)溶解在蒸馏水中,配制成1.0(质量)%的透明质酸水溶液。将该水溶液的pH用1N硝酸调至pH 1.5,得到透明质酸酸性水溶液。
把50毫升的该透明质酸酸性水溶液倒入金属容器中,放入设定为-20℃的冷柜中。120小时后取出,在25℃中解冻得到透明质酸凝胶。
然后用蒸馏水充分透析,除掉过剩的酸以及氯化钠。继而用pH7的25毫摩尔/升的磷酸缓冲生理食盐水中充分透析中和,再用蒸馏水充分透析,然后经过冷冻干燥得到片状的透明质酸凝胶。
把100毫克的透明质酸凝胶放入10毫升的25毫摩尔/升磷酸缓冲生理食盐水中,在微量均化器(Polytoron,Kinematica AG制)中破碎,得到透明质酸凝胶料浆。
实施例14透明性试验
把实施例1~8、12以及13得到的透明质酸凝胶以及比较例4得到的透明质酸凝胶料浆放入厚10nm的分光光度计用比色杯中,以水的透过率为100%,测定对340nm~800nm范围的可见光的透过率(用贝克曼制DU-64分光光度计)。其结果列在表3中。表3的透过率表示上述测定范围中的透过率范围。另外,用1(质量)%的透明质酸磷酸缓冲生理食盐水溶液作为对照。
表3透明性比较
实验No | 试样 | 透过率(%)(最大~最小) | 备注 |
15 | 实施例1的透明性HA凝胶 | 92~95 | 实施例 |
16 | 实施例2的透明性HA凝胶 | 95~98 | 实施例 |
17 | 实施例3的透明性HA凝胶 | 93~95 | 实施例 |
18 | 实施例4的透明性HA凝胶 | 90~96 | 实施例 |
19 | 实施例5的透明性HA凝胶 | 92~98 | 实施例 |
20 | 实施例6的透明性HA凝胶 | 91~95 | 实施例 |
21 | 实施例7的透明性HA凝胶 | 92~95 | 实施例 |
22 | 实施例8的透明性HA凝胶 | 92~97 | 实施例 |
23 | 实施例12的透明性HA凝胶 | 93~98 | 实施例 |
24 | 实施例13的透明性HA凝胶 | 95~100 | 实施例 |
25 | 比较例4的HA凝胶料浆 | 6~8 | 比较例 |
26 | 1%浓度的HA溶液 | 99~100 | 比较对象 |
根据表3可知,实施例1~8、12、以及13中得到的试样是透明的。
实施例15兔关节腔中的贮留性比较
选取体重2.5千克~3.0千克的成熟健康的新西兰兔种雄兔,该兔的两膝关节周围用电推子把毛减掉,消毒后把实施例12得到的透明凝胶料浆、实施例13得到的透明凝胶组合物或是透明质酸(从极限粘度换算的分子量:2×106道尔顿)1(质量)%的生理食盐水溶液,按0.1毫升/千克体重的用量给予左膝关节腔中。作为对照,把生理食盐水按0.1毫升/千克体重的用量给予同一个体的右膝关节腔中。给药后隔天回收两膝关节液,用GPC定量测定关节液中的透明质酸浓度。
另外,残存率由下式计算得出,内在性透明质酸量是指从给予生理食盐水的关节腔中提取的关节液中的透明质酸量。
残存率(%)=(回收量-内在性透明质酸量)/给药量×100
表4中列出了其结果。
表4贮留性比较
实验No | 试样 | HA残存率(%)n=3的平均值 | 备注 | ||||||
2日 | 4日 | 6日 | 8日 | 10日 | 12日 | 14日 | |||
27 | 实施例12的透明性HA凝胶料浆 | 91 | 70 | 33 | 15 | 7 | 2 | 0 | 实施例 |
28 | 实施例13的透明性HA凝胶组合物 | 92 | 79 | 40 | 21 | 12 | 4 | 0 | 实施例 |
29 | 1%浓度的HA溶液 | 45 | 6 | 0 | NT | NT | NT | NT | 比较例 |
(注)NT表示未进行实验。
根据表4可知,破碎的难水溶性透明质酸凝胶与透明质酸溶液相比在生物体内的贮留性显著提高。
实施例16缓激肽疼痛抑制作用
往体重10千克左右的雌性猎犬后腿膝关节腔中注入事先制好的实施例12得到的透明凝胶料浆(0.3毫升/千克体重),实施例13得到的透明凝胶组合物(0.3毫升/千克体重)、透明质酸溶液(从极限粘度换算的分子量:2×106道尔顿,1(质量)%生理食盐水按0.3毫升/千克体重标准注入)或者是作为对照的按0.3毫升/千克体重标准注入生理食盐水。注入2日、4日、7日后再给予引发疼痛的物质缓激肽生理食盐水溶液(把BK:0.2微克/毫升按0.05/毫升体重标准给予),以1~2分钟,3~4分钟,5~6分钟的疼痛腿上的体重负荷率为指标测定疼痛抑制作用。表5中列出了结果。
表5关节疼痛抑制效果比较
实验No | 试样 | 体重负荷率(%)n=10的平均值 | 备注 | ||
2日后 | 4日后 | 7日后 | |||
30 | 实施例12的透明性HA凝胶料浆 | 70 | 68 | 46 | 实施例 |
31 | 实施例13的透明性HA凝胶组合物 | 73 | 71 | 55 | 实施例 |
32 | 1%浓度的HA溶液 | 60 | 39 | 26 | 比较例 |
33 | 对照(生理食盐水) | 27 | 25 | 29 | 比较例 |
根据表5,透明质酸溶液在7日后下降到与对照同一水平,与之相比,透明凝胶料浆以及透明凝胶组合物在7日后仍持续保持疼痛抑制作用。
实施例17含有纤维蛋白酶的透明凝胶料浆的配制
在实施例12得到的透明凝胶料浆中以每100毫克投入相当于0.5NIH单位的量的纤维蛋白酶溶液的标准添加纤维蛋白酶溶液,配制成含有纤维蛋白酶的流动性透明质酸凝胶。
实施例18栓塞形成试验
把实施例17中得到的含有纤维蛋白酶的透明凝胶料浆吸入注射器,往体重约2.5千克的兔子(新西兰白兔)耳廓动脉中注入约0.1毫升。注入的凝胶很快就形成了凝块,用肉眼可以确认闭塞状态。
经过一个月的观察没有发现形态变化,最终观察后用解剖试验进行栓塞的组织学研究,确认是充分的闭塞状态。
另外,作为比较而进行的1.0(质量)%的透明质酸溶液中没有形成栓塞。
实施例19豚鼠的注入试验
麻醉20只350~400g的雌马兜铃系豚鼠,把实施例12得到的透明凝胶料浆、实施例13中得到的透明凝胶组合物以及透明质酸钠(从极限粘度换算的分子量:2×106道尔顿)的1(质量)%的生理食盐水溶液注射到其皮下。皮内给予量是0.05毫升,每个动物注入10个部位。0,1,2,3以及4周后分别取一只对各个部位组织取样。制作固定包埋的组织的切片,进行苏木精嗜红染色和爱尔新染料染色。另外,在显微镜下观察组织反应。
结果是,实施例12以及实施例13的试样在4周后也保持刚给药后的皮肤状态,皮肤组织中存在透明质酸。另一方面,透明质酸的1(质量)%的生理食盐水溶液在4周后透明质酸全部被吸收。另外,任何一个中均没有发现细胞浸出物,表明没有炎症反应。
实施例20折射率测定
把实施例12中得到的透明凝胶料浆以及实施例13中得到的透明凝胶组合物用Abbe折光仪(株式会社Atago制)在20℃下测定折光率。实施例12以及实施例13的折光率分别是1.334和1.335,接近玻璃体的折光率。
实施例21对家兔的视网膜剥离的效果
麻醉15只体重2.5~3.0千克的白色家兔(新西兰种)的眼睛。滴入0.5%消炎痛以及5%盐酸苯肾上腺素,使瞳孔扩散,球后麻醉用2%盐酸利多卡因。
进行洗眼以及眼周围的消毒后,把家兔固定在手术用显微镜下,切开结膜及角膜。切开巩膜后插入灌注龙头,然后为了穿入玻璃体切除刀以及光导向设备切开巩膜,插入玻璃体切除刀以及光导向设备。
用玻璃体切除刀吸引玻璃体并切除后,拔出玻璃体刀插入顶端弯曲的21G针。把21G针穿入到上耳侧的视网膜下,注入0.1毫升的灭菌空气,剥离了部分视网膜。剥离后再次穿入玻璃体切除刀,切开一部分剥离视网膜,制作裂孔。
在灌流液与空气交换后,在玻璃体腔内注入实施例12得到的透明凝胶料浆以及实施例13中得到的透明凝胶组合物,与空气交换使视网膜复位。玻璃体腔内插入激光眼内光凝固装置的传感器后进行眼内凝固,然后用8-0尼龙纤维缝合巩膜伤口以及结膜伤口。
其结果是,实施例12以及实施例13中配制的试样在一个月后的检查镜观察中没有发现再剥离等异常现象,光凝固部位的瘢痕状态良好。用裂隙灯检查没有发现玻璃体混浊和炎症反应。
Claims (13)
1.一种制备透明质酸凝胶的方法,其特征在于,该方法包括使透明质酸和使透明质酸浓度至少为5质量%的水,以及与透明质酸的羧基至少等摩尔的酸成分共存,通过保持该共存状态形成透明质酸凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备透明质酸凝胶的方法,其特征在于,把透明质酸与使透明质酸浓度至少为5质量%的水,以及与透明质酸的羧基至少等摩尔的酸成分共存,使该共存状态保持在-10℃~30℃下,形成透明质酸凝胶。
3.根据权利要求2所述的制备透明质酸凝胶的方法,其特征在于,把透明质酸与使透明质酸浓度至少为5质量%的水,以及与透明质酸的羧基至少等摩尔的酸成分共存,在-10℃~30℃下保持该共存状态,形成透明质酸凝胶,用中和溶液处理该凝胶。
4.一种权利要求1所述的方法制得的透明质酸凝胶,其特征在于,它在中性水溶液中难溶且有透明性。
5.根据权利要求4所述的透明质酸凝胶,其特征在于,在25℃中性水溶液里一天内的溶解率至多为50%。
6.根据权利要求4所述的透明质酸凝胶,其特征在于,在透明质酸的促进酸水解条件下处理透明质酸凝胶,得到的增溶的透明质酸有支化结构,该增溶的透明质酸部分含有支化度至少为0.5的分子量级分。
7.一种含有满足下列条件的用权利要求1所述的方法制得的透明凝胶的医用材料,该材料在25℃中性水溶液里一天内溶解率至多为50%且有透明性,在透明质酸的促进酸水解条件下处理透明质酸凝胶,得到的增溶的透明质酸有支化结构,该增溶的透明质酸部分含有支化度至少为0.5的分子量级分。
8.根据权利要求7所述的医用材料,它还含有未凝胶化的透明质酸。
9.根据权利要求7或8所述的医用材料,其中有透明性的凝胶呈破碎状。
10.根据权利要求7-9任一项所述的医用材料,其特征在于,医用材料用作关节症治疗用注入剂。
11.根据权利要求7-9任一项所述的医用材料,其特征在于,医用材料是栓塞形成材料。
12.根据权利要求7-9任一项所述的医用材料,其特征在于,医用材料是软组织注入剂。
13.根据权利要求7-9任一项所述的医用材料,其特征在于,医用材料是代用玻璃体。
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