CN1187609C - 胆固醇传感器和胆固醇的定量方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种只要将检样送入一次就能对低密度脂蛋白中的胆固醇进行电化学定量的传感器。该传感器具有在绝缘性基板上形成的至少包含作用电极和对应电极的电极系、在包含上述电极系的上述基板上形成的酶层和形成于向上述电极系供给试液的通路中的上述酶层的上游侧的试剂层，上述酶层至少含有氧化还原酶和电子介体且上述试剂层含有与除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白结合、形成水溶性复合体的试剂等可抑制除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的胆固醇与氧化还原酶的反应性的试剂。

Description

胆固醇传感器和胆固醇的定量方法

                          技术领域

本发明涉及对血液、血清、血浆等检样中的低密度脂蛋白所含的胆固醇进行定量的传感器和方法。

                          背景技术

近年来，在诊断高胆固醇血症时，非常重视低密度脂蛋白中的胆固醇浓度。

以往，这种低密度脂蛋白中的胆固醇的定量方法通过使用超离心法的分离操作进行。但该方法存在的问题是，需要使用特殊装置，而且，测定所需的时间长。

而不进行超离心的定量方法通常是，分别求出检样中的所有胆固醇、高密度脂蛋白中的胆固醇和甘油三酯的浓度，由Friedewald之式算出低密度脂蛋白中的胆固醇浓度。然而，该方法在用于甘油三酯值高的检样时在再现性和准确性方面存在着可靠性差的问题。

最近几年，人们提出了新的对低密度脂蛋白中的胆固醇进行定量方法，这些方法不要求有甘油三酯值。

第一种方法是，在硫酸α-环糊精、硫酸葡聚糖、镁离子和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚醚的存在下，用酶仅将低密度脂蛋白中的胆固醇氧化，根据色素的发色程度，对低密度脂蛋白中的胆固醇浓度进行定量(参见Clinical Chemistry第44卷(1998年)第522页)。该方法通过硫酸α-环糊精、硫酸葡聚糖和镁离子来减少酶对检样中的乳糜微粒所含的胆固醇和超低密度脂蛋白中的胆固醇的反应性，并通过聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚醚来减少酶对检样中的高密度脂蛋白所含胆固醇的反应性。

第二种方法是，在两性表面活性剂和具有羧基或磺酸基的脂肪族胺的存在下，用酶仅将低密度脂蛋白中的胆固醇氧化，根据色素的发色程度，对低密度脂蛋白中的胆固醇浓度进行定量(参见日本特许公开公报1998年84997号)。该方法系在两性表面活性剂的存在下，减少酶对低密度脂蛋白以外的脂蛋白中所含的胆固醇的反应性。

第三种方法是，用聚阳离子处理检样并用酶仅将低密度脂蛋白中的胆固醇氧化，根据色素的发色程度，对低密度脂蛋白中的胆固醇浓度进行定量(参见美国专利No.4,185,963)。

第四种方法是，用多孔二氧化硅吸附高密度脂蛋白，并用聚阴离子/二价阳离子形成与乳糜微粒和超低密度脂蛋白的不溶性复合体，将该复合体作为沉淀从溶液中除去后，用酶仅将低密度脂蛋白中的胆固醇氧化，根据色素的发色程度，对低密度脂蛋白中的胆固醇浓度进行定量(参见美国专利No.5,401,466)。

根据上述第一至第四种方法，即使在使用甘油三酯值高的检样的情况下，也能以良好的再现性和准确性进行测定。

但是，上述第一至第四种方法均根据色素的发色程度进行胆固醇值的定量，因此，当检样为最初就着色的血液时无法定量。此外，为了以良好的再现性和准确性进行测定，需要分别准备不含酶的第一试剂和含有酶的第二试剂，先将第一试剂加入到检样中，充分反应之后再加入第二试剂，操作很繁杂。

                          发明的公开

鉴于上述问题，本发明的目的在于提供这样一种传感器：该传感器在检样为血液时也能进行测定，无需在各不同的时间添加二种以上的试剂，只需提供一次检样，就能以良好的再现性准确地测定低密度脂蛋白中的胆固醇。

本发明的目的还在于提供对上述低密度脂蛋白中的胆固醇进行定量的方法。

本发明涉及这样一种用于定量低密度脂蛋白中的胆固醇的胆固醇传感器：该传感器具有绝缘性基板、在上述基板上形成的包含作用电极和对应电极的电极系、在包含上述电极系的上述基板上形成的酶层和形成于向上述电极系供给试液的通路中的上述酶层的上游侧的试剂层，上述酶层至少含有氧化还原酶和电子介体且上述试剂层含有与除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白结合、形成水溶性复合体的试剂。

本发明还涉及这样一种胆固醇传感器：该传感器具有绝缘性基板、在上述基板上形成的包含作用电极和对应电极的电极系、在包含上述电极系的上述基板上形成的酶层、形成于向上述电极系供给试液的通路中的上述酶层的上游侧的滤器以及加载在上述滤器上或形成于上述试液供给通路中的滤器的上游侧的试剂层，上述酶层至少含有氧化还原酶和电子介体且上述试剂层含有具有能将除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白吸附和/或凝集的功能的试剂。

本发明提供下述对低密度脂蛋白中的胆固醇进行定量的方法，该方法包括以下步骤：

(a)将检样与选自下述(i)、(ii)和(iii)中的任一个试剂或试剂组反应的步骤，

(i)硫酸α-环糊精、硫酸葡聚糖、镁离子和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚醚、

(ii)两性表面活性剂和具有羧基或磺酸基的脂肪族胺、

(iii)聚阳离子；

(b)然后，将上述检样和可与胆固醇特异性反应的氧化还原酶和电子介体反应的步骤；

(c)将通过上述步骤(b)而还原的上述电子介体进行电化学氧化、得到氧化电流值的步骤。

本发明还提供下述对低密度脂蛋白中的胆固醇进行定量的方法，该方法包括以下步骤：

(a)将检样与聚阴离子、二价阳离子和抗高密度脂蛋白的抗体或二氧化硅反应的步骤，

(b)然后，将上述检样和可与胆固醇特异性反应的氧化还原酶和电子介体反应的步骤，

(c)将通过上述步骤(b)而还原的上述电子介体进行电化学氧化、得到氧化电流值的步骤。

                         图面的简单说明

图1是说明用本发明对胆固醇浓度进行定量时的反应原理的框图。

图2是本发明的实施方式1中的胆固醇传感器的垂直剖面示意图。

图3是同一传感器的分解立体图。

图4是实施方式2中的胆固醇传感器的分解立体图。

                      本发明的最佳实施方式

本发明的对低密度脂蛋白中的胆固醇进行定量的方法包括以下步骤：

(a)将检样与特定试剂反应的步骤，

(b)然后，将上述检样和可与胆固醇特异性反应的氧化还原酶和电子介体反应的步骤，

(c)将通过上述步骤(b)而还原的上述电子介体进行电化学氧化、得到氧化电流值的步骤，

由上述电流值对胆固醇进行定量。

首先对步骤(a)进行说明。在步骤(a)中，将检样中所含的除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白与特定试剂反应，抑制除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的胆固醇参与与酶的反应。这里所说的检样，其范围很广，可包括高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、超低密度脂蛋白和乳糜微粒，例如是血液、血清、血浆等。

由于本发明不是根据吸光度，而是用电化学的方法测定胆固醇，因此，即使检样为血液、有混浊的血清或血浆，也能定量低密度脂蛋白中的胆固醇。

上述步骤(a)是将检样中所含的除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白与特定试剂结合、形成水溶性复合体、由此减少除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的胆固醇与酶的反应性的步骤(a-1)或将检样中所含的除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白吸附于特定试剂和/或使上述除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白凝集、由此将它们除去的步骤(a-2)。

首先对步骤(a-1)进行说明。

在该步骤中，使用选自下述(i)、(ii)和(iii)中的任一个试剂或试剂组。

(i)硫酸α-环糊精、硫酸葡聚糖、镁离子和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚醚、

(ii)两性表面活性剂和具有羧基或磺酸基的脂肪族胺、

(iii)聚阳离子。

使用聚阳离子作为试剂时，最好在弱离子交换体的存在下使检样与聚阳离子反应。当存在弱离子交换体时，弱离子交换体会吸附样品中的中性脂质，由此，可抑制因中性脂质吸附在电极表面而对电极反应的阻碍。

这里，两性表面活性剂可以是月桂基甜菜碱、椰油脂族酰胺基丙基甜菜碱、月桂酰胺基丙基甜菜碱、2-烷基-N-羧甲基-N-羟乙基咪唑啉甜菜碱、2-烷基-N-羧基乙基-N-羟乙基咪唑啉甜菜碱等。

具有羧基或磺酸基的脂族胺可以是丙氨酸、谷酰胺、谷氨酸、N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸、N，N-二(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸、N-环己基-2-氨基乙磺酸、2-{4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基}乙磺酸、2-吗啉基乙磺酸、哌嗪-1，4-二(2-乙磺酸)、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸、N-环己基-3-氨基丙磺酸、N-环己基-2-羟基-3-氨基丙磺酸、3-{N，N-二(2-羟基乙基)氨基}-2-羟基丙磺酸、3-{4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基}丙磺酸、2-羟基-3-{4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基}丙磺酸、3-吗啉基丙磺酸、2-羟基-3-吗啉基丙磺酸、哌嗪-1，4-二(2-羟基-3-丙磺酸)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸、2-羟基-N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸、N-(2-乙酰胺)亚氨基乙酰醋酸、N，N-二(2-羟基乙基)甘氨酸、N-{三(羟甲基)甲基}甘氨酸等。

从反应性容易调节的角度考虑，上述聚阳离子最好是酰基化聚阳离子或烷基化聚阳离子。

在步骤(a-1)中，检样中所含的除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白与试剂结合，形成水溶性复合体，由此，除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的胆固醇与氧化还原酶的反应性下降。因此，在下面的步骤(b)中，可将参与与氧化还原酶的反应的胆固醇仅限于低密度脂蛋白中的胆固醇。

下面对步骤(a-2)进行说明。

在步骤(a-2)中，将检样中所含的除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白吸附于试剂中和/或使上述除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白凝集，由此将它们除去。

在该步骤中，使用抗高密度脂蛋白的抗体或二氧化硅与聚阴离子和二价阳离子作为试剂。由于高密度脂蛋白特有地含有脱辅基蛋白Apo A-I和Apo A-II，因此，抗高密度脂蛋白的抗体可以是抗Apo A-I和Apo A-II的抗体。此时，检样中的高密度脂蛋白由于抗高密度脂蛋白的抗体而凝集。另一方面，检样中的超低密度脂蛋白和乳糜微粒由于聚阴离子和二价阳离子的作用而凝集。这样，可将高密度脂蛋白、超低密度脂蛋白和乳糜微粒从检样中分离、除去。

使用二氧化硅作为除去高密度脂蛋白的试剂时，检样中的高密度脂蛋白吸附于二氧化硅并由此被分离、除去。

在步骤(a-2)中，为了将凝集的高密度脂蛋白、超低密度脂蛋白和乳糜微粒从检样中分离、除去，可使用滤器等过滤手段。

从不会阻碍酶反应的角度考虑，这里使用的聚阴离子最好是硫酸葡聚糖、肝素、磷钨酸、聚乙烯硫酸中的任一个。

此外，从不会阻碍酶反应的角度考虑，上述二价阳离子最好是钙离子、锰离子、镁离子中的任一个。

在步骤(a-2)中，为了使检样中所含的除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白通过吸附于试剂和/或凝集而除去，在下面的步骤(b)中，可将参与与酶的反应的胆固醇仅限于低密度脂蛋白中的胆固醇。

下面对步骤(b)进行说明。

在步骤(b)中，仅检样中的低密度脂蛋白所含的胆固醇被与胆固醇特异性反应的氧化还原酶氧化，与此同时，电子介体被还原。

这里使用的氧化还原酶和电子介体可以是能在胆固醇的电化学定量法中使用的迄今公知的氧化还原酶和电子介体。

下面对步骤(c)进行说明。

在步骤(c)中，将在步骤(b)中还原的上述电子介体进行电化学氧化，得到氧化电流值。并通过该氧化电流值求出低密度脂蛋白中的胆固醇浓度。

由于在本发明中是用电化学方法对胆固醇值进行定量的，因此，即使检样为最初就着色的血液，也可以测定。

这里，用图1对根据本发明进行胆固醇浓度定量时的反应原理进行说明。

检样中所含脂蛋白中的胆固醇的大部分是以与脂肪酸作酯结合的胆固醇酯的形式存在。这里，首先，用胆固醇酯酶4将胆固醇酯1的酯基脱去，形成胆固醇2(过程I)。

然后，用氧化还原酶5将胆固醇2氧化，生成氧化的胆固醇3(过程II)。该氧化反应同时伴随着电子介体(氧化型)6的还原(过程III)。

接着，在作用电极8与对应电极9之间施加使作用电极成为正的电压，使电子介体(还原型)7在作用电极8上氧化(过程IV)。此时通过的电流值取决于电子介体(还原型)7的浓度，而且，电子介体(还原型)7的浓度还取决于胆固醇2的浓度。因此，若要知道胆固醇2的浓度，测定在作用电极8与对应电极9之间通过的电流量即可。

下面结合附图对测定低密度脂蛋白中的胆固醇的传感器及定量方法进行说明。

实施方式1

图2是本发明的传感器的剖面示意图，图3是其分解立体图。11表示电绝缘性的聚对苯二甲酸乙二醇酯基板。在该基板11上丝网印刷银膏并加热干燥，形成2个电极的基底和与这些基底相连的导线12、13。然后，丝网印刷碳糊，形成作用电极14和对应电极15。在该基板上通过丝网印刷，形成绝缘层16，电极系的露出部分取决于该绝缘层。

丝网印刷含有羧甲基纤维素钠(一种水溶性高分子)的涂料，将包含作用电极和对应电极的电极系覆盖，在50℃干燥15分钟，形成水溶性高分子层21。然后，滴流胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶和铁氰化钾的混合水溶液，将水溶性高分子层21覆盖，在50℃干燥15分钟，形成酶层22。

电子介体可以是对苯醌及其衍生物、N-甲基吩嗪鎓硫酸单甲酯盐、亚甲基蓝、二茂铁及其衍生物中的任一个。

另一方面，将具有空气孔20的盖板19和具有隙缝18的隔板17贴合，在形成于隔板的隙缝18的凹部滴加硫酸α-环糊精、硫酸葡聚糖、镁离子和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚醚的混合水溶液之后干燥，形成试剂层23。该试剂层23形成于向电极系供给试液的通路中的酶层的上游侧。

将形成有上述水溶性高分子层21和酶层22的基板11与由形成有试剂层23的盖板19和隔板17组成的盖件接合，组装成生物传感器。在该生物传感器中，在隔板17的隙缝18部分形成的中空部分形成试液供给通路。并且，成为该试液供给通路的开口处的隙缝18的开放端18a部分成为试样供给口。

当血液等试样与该试样供给口接触时，试样会由于试液供给通路的毛细管现象而吸入空气孔20侧。

也可通过将玻璃滤器等载体固定在形成试剂层23的位置上，在该载体上或载体表面滴加上述试剂并干燥来加载试剂。载体可以是滤纸、玻璃滤器、薄层色谱用载体、纤维素纤维、由高分子化合物制成的纤维片、纸、软木等。其中，优选玻璃滤器或纤维素纤维，因为它们较少吸附氧化还原酶。

若电子介体和氧化还原酶中的至少一个与表面活性剂一起加载，则溶解性提高，由此，可缩短反应时间。

若通过冷冻干燥而形成水溶性高分子层、酶层和试剂层中的至少一个，则溶解性提高，由此，可缩短反应时间。尤其是如图所示，当形成将试液供给通路内部堵塞的试剂层时，最好通过冷冻干燥，作为多孔性层而形成。因为这样可在使试液与试剂层接触时将试液溶解并吸收。

下面说明使用该生物传感器时测定血液中低密度脂蛋白所含胆固醇浓度的例子。首先，将作为检样的血液送入试样供给孔。与血液接触的试剂层首先溶解，然后，酶层和水溶性高分子层溶解。这样，通过试剂层中的硫酸α-环糊精、硫酸葡聚糖和镁离子的协同作用，血液中的超低密度脂蛋白和乳糜微粒形成水溶性复合体，通过聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚醚的作用，血液中的高密度脂蛋白形成水溶性复合体。由此，除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的胆固醇与酶的反应性下降。

这里，若作用的酶是胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶，则仅低密度脂蛋白中的胆固醇发生酶催化反应，由此可测定低密度脂蛋白中的胆固醇浓度。具体地说，根据图3的反应原理，低密度脂蛋白中的酯型胆固醇通过酶层中的胆固醇酯酶而转化成游离型胆固醇。并且，由于胆固醇酯酶而产生的游离型胆固醇和原先存在于低密度脂蛋白中的游离型胆固醇由于胆固醇氧化酶的作用而氧化。与此同时，酶层中的铁氰化钾被还原，生成亚铁氰化钾。从送入血液起的一定时间之后，在作用电极和对应电极之间使作用电极为正，例如，施加500mV电压5秒钟，测定5秒钟后的电流值。将该电流值作为应答值。

本实施方式1的优点是，由于不是根据色素的发色程度进行测定的，因此，即使是血液之类的最初就着色的检样，也能进行胆固醇定量。此外，由于试剂层23与酶层22在空间上是隔开的，因此，将检样送到试剂层23后，检样与试剂层23中的试剂反应，然后，到达酶层22，与酶层22中的氧化还原酶和电子介体等反应。由此，只要将检样送入一次，就能以良好的再现性和准确性对检样中的低密度脂蛋白所含的胆固醇浓度进行定量，而无需将多个试剂在各不相同的时间加入到检样中之类繁杂的操作。

在本实施方式1中，试剂层23中所含的试剂是硫酸α-环糊精、硫酸葡聚糖、镁离子和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚醚的组合，但也可使用两性表面活性剂和具有羧基和磺酸基的脂肪族胺加以代替。此外，作为另一个例子，试剂也可以是聚阳离子。除了聚阳离子之外，最好还加入弱离子交换体。这里，上述聚阳离子最好是酰基化或烷基化聚阳离子。上述聚阳离子最好是聚乙烯亚胺。

可在试剂层23中添加pH缓冲剂。pH缓冲剂可以是3-吗啉基丙磺酸、2-{4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基}乙磺酸、2-吗啉基乙磺酸、哌嗪-1，4-二(2-乙磺酸)等良好缓冲液、磷酸缓冲液等。

实施方式2

图4是本实施方式2的胆固醇传感器的分解立体图。与实施方式1的一个不同地方是，设置了玻璃滤器。

与实施方式1同样，在由作用电极14和对应电极15组成的电极系上使用形成有水溶性高分子层21和酶层22的基板11。在该基板11上安装具有方形透孔38的隔板37、设有空气孔40和试样供给口41的盖板39和滤器43，组装成传感器。

滤器43在形成于隔板37的透孔38处的试液供给通路中位于酶层22的上游侧，吸收从试样供给口41送入的试液，并通过毛细管现象将试液送至电极系侧。在滤器43中浸渗有抗高密度脂蛋白的抗体、硫酸葡聚糖(聚阴离子)和钙离子。

可使用滤纸、纤维素纤维、由高分子化合物制成的纤维片、薄膜滤器、网筛、棉等作为滤器。滤器的孔径最好为0.05-0.5μm。

下面就使用该传感器测定血液中低密度脂蛋白所含胆固醇浓度的方法进行说明。

首先，将作为检样的血液从试样供给口41送至滤器43上。血液中的血球被滤器43滤去，血浆成分到达空气孔40侧。同时，血液中的高密度脂蛋白由于滤器内的抗高密度脂蛋白的抗体而凝集。凝集的脂蛋白被滤器的筛孔扣住，不能到达酶层22。此外，血液中的乳糜微粒和超低密度脂蛋白由于滤器内的硫酸葡聚糖和钙离子而凝集。凝集的脂蛋白被滤器的筛孔扣住，不能到达酶层。由此，在到达酶层的血浆成分里，脂蛋白中只剩下低密度脂蛋白了。

在酶层22中，胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶作用于低密度脂蛋白，低密度脂蛋白中的胆固醇发生酶催化反应。如此，与实施方式1同样，可测定低密度脂蛋白中的胆固醇浓度。

在上述方法中，可用吸附高密度脂蛋白的二氧化硅代替用作使高密度脂蛋白凝集的试剂的抗高密度脂蛋白的抗体。由于二氧化硅将检样中的高密度脂蛋白吸附，因此，高密度脂蛋白不能到达酶层。在到达酶层的成分里，脂蛋白中只剩下低密度脂蛋白了。另外，可在滤器43中添加pH缓冲剂。

在本实施方式2中，与实施方式1同样，由于不是根据色素的发色程度进行测定的，因此，即使是血液之类的最初就着色的检样，也能进行胆固醇定量。此外，由于试剂加载在滤器43上，与酶层22在空间上是隔开的，因此，将检样送到滤器上后，检样与滤器中的试剂反应，通过滤器后，到达酶层22，与酶层中的氧化还原酶和电子介体等反应。由此，只要将检样送入一次，就能以良好的再现性和准确性对检样中的低密度脂蛋白所含的胆固醇浓度进行定量，而无需将多个试剂在各不相同的时间加入到检样中之类繁杂的操作。

在图示的例中，试剂加载在滤器43上，但也可将滤器和试剂分别设置。例如，在酶层22上形成膜状滤器，在滤器43的位置形成试剂层或设置加载了试剂的载体。将滤器与试剂分离时，在向电极系供给试液的通路中，将试剂设置在滤器的上游侧。

在上述例中，使用硫酸葡聚糖作为滤器43中所含试剂的聚阳离子，但也可用肝素、磷钨酸或聚乙烯硫酸等代替。此外，在上述例中使用钙离子作为二价离子，但也可用锰离子或镁离子等代替。

作为滤器43中所含的试剂，使用了抗高密度脂蛋白的抗体、聚阴离子和二价阳离子的组合，但也可用二氧化硅、聚阴离子和二价阳离子的组合代替。此时，当检样与滤器43接触后，检样中的高密度脂蛋白被二氧化硅吸附，不能到达酶层22。此外，检样中的超低密度脂蛋白和乳糜微粒与前述同样地凝集，被滤器43滤去，从而不能到达酶层22。

在实施方式1和2中，使用聚对苯二甲酸乙二醇酯作为基板11，但对基板11的材质无特别限制，只要具有电绝缘性和一定程度的刚性即可。例如，可使用聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺、饱和聚酯等热塑性树脂、尿素树脂、密胺树脂、酚醛树脂、环氧树脂、不饱和聚酯树脂等热固性树脂等。

电极通过在基板11上丝网印刷碳糊而形成，但也可用在基板11上蒸镀或溅射钯等金属而形成。

在上述例中，使用胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶作为氧化还原酶，使用铁氰化钾作为电子介体，但对氧化还原酶和电子介体无特别限制，可以是迄今公知的其他氧化还原酶和电子介体。例如，可用胆固醇脱氢酶等代替胆固醇氧化酶作为氧化还原酶，或用对苯醌等作为电子介体。

酶层22最好含有胆固醇酯酶。此外，为了使脂蛋白中的胆固醇容易溶解，也可在酶层22中加入表面活性剂。

在电极系的上部设置了用于保护电极的水溶性高分子层，但这不是必不可少的。

在实施方式1中的试剂层23的情况下和在实施方式2中将试剂与滤器43分开的情况下，最好使用加载了试剂的载体。由此，检样通过试剂层的时间增加，这样，可使检样中所含的除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白与试剂层中的试剂在检样在到达酶层22之前能充分反应。对上述载体无特别限制，只要其能加载试剂成分即可，例如，可以是玻璃滤器、滤纸、薄膜滤器、网筛、棉等。此时，加载的试剂可以是干燥的固体状态，也可以是溶液状态或凝胶状态。

                       产业上利用的可能性

在本发明中，由于不是根据色素的发色程度进行测定的，因此，即使是血液之类的最初就着色的检样，也能对低密度脂蛋白中所含的胆固醇进行定量。此外，只要将检样送入一次，就能以良好的再现性和准确性对低密度脂蛋白中所含的胆固醇进行定量。由于本发明不需要繁杂的操作，因此，适合在家庭中使用的用于测定低密度脂蛋白中的胆固醇的试剂盒。

Claims (8)

1.用于对低密度脂蛋白中的胆固醇进行定量的胆固醇传感器，其特征在于，它具有绝缘性基板、在上述基板上形成的至少包含作用电极和对应电极的电极系、在包含上述电极系的上述基板上形成的酶层和形成于向上述电极系供给试液的通路中的上述酶层的上游侧的试剂层，上述酶层至少含有氧化还原酶和电子介体且上述试剂层含有与除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白结合、形成水溶性复合体的试剂。

2.如权利要求1所述的胆固醇传感器，其特征在于，所述试剂层含有硫酸α-环糊精、硫酸葡聚糖、镁离子和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚醚。

3.如权利要求1所述的胆固醇传感器，其特征在于，所述试剂层含有两性表面活性剂和具有羧基或磺酸基的脂肪族胺。

4.如权利要求1所述的胆固醇传感器，其特征在于，所述试剂层含有聚阳离子。

5.用于对低密度脂蛋白中的胆固醇进行定量的胆固醇传感器，其特征在于，它具有绝缘性基板、在上述基板上形成的至少包含作用电极和对应电极的电极系、在包含上述电极系的上述基板上形成的酶层、形成于向上述电极系供给试液的通路中的上述酶层的上游侧的滤器以及加载在上述滤器上或形成于上述试液供给通路中的滤器的上游侧的试剂层，上述酶层至少含有氧化还原酶和电子介体且上述试剂层含有具有能将除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白吸附和/或凝集的功能的试剂。

6.如权利要求5所述的胆固醇传感器，其特征在于，所述试剂层含有聚阴离子、二价阳离子和抗高密度脂蛋白的抗体或二氧化硅。

7.对低密度脂蛋白中的胆固醇进行定量的方法，该方法包括以下步骤：

(a)将检样与选自下述(i)、(ii)和(iii)中的任一个所包含的试剂或试剂组反应的步骤，

(i)硫酸α-环糊精、硫酸葡聚糖、镁离子和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共

   聚醚、

(ii)两性表面活性剂和具有羧基或磺酸基的脂肪族胺、

(iii)聚阳离子；

(b)然后，将上述检样和可与胆固醇特异性反应的氧化还原酶和电子介体反应的步骤；

(c)将通过上述步骤(b)而还原的上述电子介体进行电化学氧化、得到氧化电流值的步骤。

8.对低密度脂蛋白中的胆固醇进行定量的方法，该方法包括以下步骤：

(a)将检样与聚阴离子、二价阳离子和抗高密度脂蛋白的抗体或二氧化硅反应的步骤，

(b)然后，将上述检样和可与胆固醇特异性反应的氧化还原酶和电子介体反应的步骤，

(c)将通过上述步骤(b)而还原的上述电子介体进行电化学氧化、得到氧化电流值的步骤。

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