CN1151256C - 工业用酶的增强 - Google Patents

工业用酶的增强

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Abstract

增加或提高基于植物的动物饲料中可代谢饮食含量的方法，所述方法包括在微波辐射的影响下使所述饲料与酶反应，使得增加或提高所述饲料中所述可代谢饮食的含量，其中所述酶能够从所述饲料释放可代谢的饮食组分。

Description

工业用酶的增强
技术领域
本发明一般涉及利用微波能提高酶活性的方法。
背景技术
酶是存在于所有活细胞中的蛋白或糖蛋白，它们控制细胞代谢和分解代谢的过程。酶是生物催化剂，能够促进化学反应，而不掺入终产物中。酶的稳定性(寿命)通常有限，其活性可以随时间而降低。
酶在其作用方面是特异性的，通常分解或合成一种特定的化合物或一族化合物。在某些情况下，酶的作用限于它们与其反应的化合物中的特定化学键。酶可以在常压和对于温度和酸度(pH)而言为温和的条件下起作用。许多酶功能的最佳温度为20-70℃，pH值在中性(pH7)附近。
工业用酶由生物来源制备，可以对其进行修饰，以便产生特定任务所需的酶。具有潜在工业用途的酶有范围广泛的应用。
一个主要的用途是有助于动物的消化过程。与消化有关的酶主要是水解酶，因为它们将大分子分解为小分子。然后，这些小分子可以被动物的肠吸收，并用于细胞的维持和生长。
水解酶本身与其底物结合，形成酶-底物复合物。该底物分解为小分子，而该酶没有变化，可以再次作用于新的底物分子。
酶的其它工业应用的实例包括生物洗涤剂；纺织原料，用于服装整理(finishing of garments)和有助于织造过程的退浆；纸浆和纸的生产；食品生产，包括干酪和酸乳酪；和酿酒。
本发明人已经意外地发现，用微波辐射处理，可以提高工业生产中酶的活性。
本发明的说明书
第一方面，本发明包括增强酶催化反应的方法，该方法包括使该酶与该酶的底物在微波辐射的影响下反应，使得增强酶反应。
该酶可以是任何酶，但最好是用于工业生产或应用生产中的工业用酶。特别是，通过本发明，可以提高用于制备食品、饲料、饲料制品的酶的活性。合适酶的实例包括但不限于蛋白酶、肌醇六磷酸酶、磷酸酶、碳水化合物水解酶，包括葡萄糖酸酶(gluconase)和木聚糖酶。
本发明特别适用于生产改进的动物饲料。当饲料被动物消化时，该处理看来提高饲料中可代谢组分的利用度。
底物来源可以是任何植物材料、谷类或谷物制品或组分。实例包括但不限于如小麦和水稻的谷类、麸皮、干草、青贮料、包括米糠的糠、它们的组分和它们的混合物。
本发明利用微波能或辐射，增强酶对其底物的作用。本发明所用的微波频率大约为2.45Ghz。该频率是用于澳大利亚的频率，但其它频率也可以用于本发明。所需能量取决于该底物和酶溶液中存在的含水量。所用的能也取决于该处理的材料类型，因为化合物可能具有不同的介电常数。介电常数高的材料优先吸收能，并因此在介电常数低的化合物之前被加热或作用。然而，其它加热机制可以用来使酶溶液和底物升至微波应用可以施加的酶的激活温度。
以优选形式应用微波能，使得有效地控制反应混合物中的温度。此外，已经发现，最好将微波能以连续方式应用于该混合物。
处理时间也根据该处理的酶、底物和体积而变化。已经发现，约10分钟的微波处理特别适于用木聚糖酶处理米糠。
第二方面，本发明包括增加或提高食料中可代谢饮食组分的方法，该方法包括在微波辐射的影响下使该食料与酶反应，所述酶能够从该食料中释放可代谢的饮食组分，使得增加或提高食料中可代谢饮食的含量。
最好是，该食料是动物食料，更优选为驯养动物食料，甚至更优选为单胃动物食料。
已经发现，本发明特别适用于为家禽提供改进的饮食米糠。
第三方面，本发明包括食料，所述食料是用按照本发明第二方面的方法生产的，其可代谢饮食含量提高。
在本说明书全文中，除非另外说明，否则词“包括(comprise)”或其变化“包括(comprises)”或“包括(comprising)”应理解为是指包括所述的成分、整体(integer)或步骤、或所述组的成分、整体或步骤，但不排除任何其它成分、整体或步骤、或其它组的成分、整体或步骤。
为了更清楚地理解本发明，参考以下实施例和附图描述其优选形式。
附图简述
图1为装置的示意图，所述装置包括管道式加热器(applicator)，用于对酶/底物混合物施加微波辐射；和
图2为装置的示意图，所述装置包括混合转筒式加热器，用于对酶/底物混合物施加微波辐射。
实施本发明的模式
实验1
通过测量糖的利用度或释放，研究微波处理对米糠酶处理的作用。米糠是米精加工的副产物，由种皮、胚的主要部分和种子外层组成。米糠被广泛使用，特别是用于东南亚，用作动物生产的饲料。每年生产大约53亿吨米糠。
米糠含有20-25％的非淀粉多糖(NSP)，所述多糖主要由等量的阿拉伯糖木聚糖和纤维素组成。NSP不被单胃动物消化，通常不被代谢，进入排泄物。当米糠用作动物饲料时，它由此是相对差的能量和营养源。
对于50g米糠，采用加压喷雾瓶，在含有建议剂量的酶A和B的50ml水均匀喷雾。然后，该混合物分别接受特定的微波能5、10、20和30分钟。处理结束时，加强微波处理，以将混合物加热至100℃30秒，以使酶失活。然后于40℃，在强制通风烘炉中干燥样品。每种样品重复8次。
游离糖的测定
游离糖的提取.研磨米糠样品，以通过0.5mm的筛网，并将重大约200mg的样品置于30ml螺旋盖培养管中。然后将5ml 80％乙醇加入残余物中，加热至80℃10分钟。然后该管于2000g离心10分钟。将含有游离糖的上清液转移至8ml小瓶中，并在氮气下于40℃干燥。
水解.用3ml 1M H2SO4，将残余物于100℃水解2小时。将0.4ml等份的水解物转移至30ml培养管，加入0.10ml 28％NH3。加入50μl肌醇(4mg/ml)和50μl阿洛糖(4mg/ml)的等份样品作为内标。混合物于氮气、40℃下干燥。
还原.用硼氢化钠如下还原单糖：
向糖水解物和内标的混合物中，加入水(0.2ml)、无水乙醇(0.2ml)和3M氨水(1滴)。充分混合后，加入新制备的NaBH4(通过将50mg钠溶于每ml 3M NH4OH中而制备的)(0.3ml)。然后给该管盖上盖，并于40℃水浴中温育1小时。
乙酰化.向还原混合物中，加入5-7滴冰醋酸，以分解过量的NaBH4。然后，加入0.5ml 1-甲基咪唑和5ml乙酸酐并混合，于室温下放置10分钟。加入无水乙醇(0.8ml)，混合并于室温下放置10分钟，以实现糖的乙酰化。然后将样品置于冰浴中，向每管加入5ml水，以分解过量的乙酸酐。加入5ml 7.5M KOH，给所述管盖上盖，通过倒转轻轻混合6次。加入另外5ml 7.5M KOH，盖上盖并再次混合。此时，可见透明的乙酸乙酯上层，然后用移液管将该层转移至4ml小瓶中，并在氮气下蒸发至干。然后将样品再溶于0.4ml乙酸乙酯中，用Varian 3400CX气相层析仪，定量测定所述糖。
结果
实验1a.于40℃温育24小时后，酶A和酶B均从米糠释放可忽略量的糖(表1).
      表1.所述酶对释放米糠中的总游离糖的作用
样品        释放的糖          样品        释放的糖
ID           (g/kg)            ID          (g/kg)
全脂米糠                    脱酯米糠
2            8.15              7            4.43
3            8.13              8            9.50
4            6.65              9            10.10
5            5.76             10            5.76
实验1b.通过5分钟微波处理释放的糖量高于用该酶于40℃温育24小时的量。
然而，较长时间(长达30分钟)的处理不导致更多的糖释放(表2)。
表2.不同微波加热时间对从米糠释放游离糖的作用
微波时间    释放的糖    微波时间      释放的糖
(min)        (g/kg)      (min)         (g/kg)
5            34.80         20          30.62
10           26.72         30          27.72
结果证明，用市售聚糖酶将存在于米糠中的NSP(主要是阿拉伯糖木聚糖和纤维素)解聚是不彻底的，这证实了这种观点：在单胃动物中使用酶的益处不是由于NSP的完全分解和随后所释放糖的吸收所引起的，而可能是因所述酶能够部分切割可溶性NSP、并由此去除其对营养消化和吸收的不利于营养的作用而引起的。微波处理增强了该反应，提供潜在的更有营养的原料。
酶需要一定量的能量，以作用于其相应的底物。合适的微波处理频率看来激励所述酶，其净作用是酶活性提高。因此，微波处理释放的糖量显著高于在目前实验中正常处理的糖量。已知处理时间非常短(5-30分钟)，观察到的作用是非常显著的。
表3显示特定糖分析的结果。结果显示，在微波处理下，通过酶水解米糠释放的游离糖增加。
           表3.处理的米糠的特定糖分析
样品  微波       水分    样品       糖与阿洛糖之比g/kg
ID    处理      水平(％)  Wt
                         (mg)
                             Rham Fuc  Ara  Xyl  Man  Gal
1     国内        50     200 0.00 0.00 0.10 0.09 0.17 0.12
      Micro
     (15min)
2     5mins       100    200 0.00 0.00 0.00 0.00 0.24 0.15
3     5mins       75     200 0.00 0.00 0.00 0.00 0.29 0.15
4     5mins       50     200 0.00 0.00 0.00 0.00 0.33 0.00
5     5mins       25     200 0.00 0.00 0.00 0.00 0.33 0.00
6     10mins      100    200 0.00 0.00 0.11 0.10 0.77 0.17
7     10mins      75     200 0.00 0.00 0.14 0.10 0.82 0.18
8     10mins      50     200 0.00 0.00 0.00 0.00 1.14 0.15
9     10mins      25     200 0.00 0.00 0.00 0.00 0.94 0.16
10    15mins      100    200 0.00 0.00 0.17 0.00 0.65 0.18
11    15mins      75     200 0.00 0.00 0.17 0.12 0.64 0.16
12    15mins      50     200 0.00 0.00 0.10 0.00 0.58 0.15
13    15mins      25     200 0.00 0.00 0.00 0.00 0.58 0.14
14    20mins      100    200 0.00 0.00 0.13 0.00 0.70 0.16
15    20mins      75     200 0.00 0.00 0.12 0.00 0.64 0.15
16    20mins      50     200 0.00 0.00 0.24 0.13 0.75 0.29
17    20mins      25     200 0.00 0.00 0.14 0.00 0.74 0.16
18    30mins      100    200 0.00 0.00 0.00 0.00 0.45 0.15
19    30mins      75     200 0.00 0.00 1.14 0.08 0.19 0.13
20    30mins      50     200 0.00 0.00 0.10 0.00 0.59 0.15
21    30mins      25     200 0.00 0.00 0.00 0.00 0.58 0.14
                表3.处理的米糠的特定糖分析(接上页)
样品   微波                 糖与阿洛糖之比g/kg
ID     处理                       TOTAL
               Glu  Rha  Fuc  Ara  Xyl  Man  Gal  Glu  游离
                    III                                 糖
1     国内     1.88 0.00 0.00 0.72 0.70 1.29 0.85 14.09 17.67
      Micro
     (15min)
2     5mins    2.09 0.00 0.00 0.00 0.00 1.81 1.10 15.65 18.56
3     5mins    2.21 0.00 0.00 0.00 0.00 2.16 1.10 18.55 19.81
4     5mins    1.76 0.00 0.00 0.00 0.00 2.45 0.00 13.18 15.62
5     5mins    1.94 0.00 0.00 0.00 0.00 2.50 0.00 14.54 17.04
6     10mins   4.12 0.00 0.00 0.83 0.11 5.79 1.30 30.92 38.84
7     10mins   4.33 0.00 0.00 1.07 0.75 6.17 1.38 32.44 41.81
8     10mins   5.18 0.00 0.00 0.00 0.00 8.55 1.12 38.82 48.49
9     10mins   5.14 0.00 0.00 0.00 0.00 7.03 1.16 38.57 46.76
10    15mins   4.15 0.00 0.00 1.27 0.00 4.91 1.35 31.11 38.64
11    15mins   3.84 0.00 0.00 1.30 0.92 4.82 1.19 28.80 37.03
12    15mins   0.60 0.00 0.00 0.77 0.00 4.41 1.13 27.04 33.34
13    15mins   3.98 0.00 0.00 0.00 0.00 4.34 1.07 29.88 35.29
14    20mins   4.51 0.00 0.00 0.98 0.00 5.25 1.17 33.85 41.25
15    20mins   4.00 0.00 0.00 0.93 0.00 4.83 1.14 29.97 36.88
16    20mins   4.55 0.00 0.00 1.77 1.00 5.66 2.16 34.11 44.70
17    20mins   4.64 0.00 0.00 1.08 0.00 5.56 1.23 34.83 42.71
18    30mins   3.62 0.00 0.00 0.00 0.00 3.35 1.12 27.13 31.00
19    30mins   2.86 0.00 0.00 8.58 0.63 1.44 0.96 21.45 33.05
20    30mins   3.60 0.00 0.00 0.77 0.00 4.41 1.13 27.04 33.34
21    30mins   3.98 0.00 0.00 0.00 0.00 4.34 1.07 29.88 35.29
实验2
以下详细描述概述本发明效力的实验。选择一种饲料制品-米糠作为基本制品。
方法
从当地饲料供应商得到米糠，并如下处理：
(a)处理1.米糠(7kg)+7 L水，于25℃连续搅拌48小时。然后，于45℃干燥米糠，并将其锤磨(hammer-mill)以通过1mm筛网。该产物命名为RB+s。
(b)处理2.米糠(7kg)+酶(Biofeed Plus)+7L水，于25℃连续搅拌48小时。然后，于45℃干燥混合物，并将其锤磨(hammer-mill)以通过1mm筛网。该产物命名为RB+E+s。
(c)处理3.米糠+酶(Biofeed Plus)+微波。该产物命名为RB+E+MV。
(d)处理4.米糠(30％)+酶(Biofeed Plus)+7L水，于25℃连续搅拌48小时，然后进行微波处理。然后，混合物于45℃干燥，并将其锤磨(hammer-mill)以通过1mm筛网。该产物命名为RB+E+MV+s。
制备各种米糠材料后，以2×3因子设计(2种处理：±浸泡；3种饮食：对照、酶、酶+微波)，在每种饮食中配制30％固定水平米糠的6种实验类型的饮食。
实验由对144只21日龄肉用鸡的实验组成。该实验由6种饮食变化组成，所述饮食为：
饮食1        正常米糠-无微波处理(对照)
饮食2        于无酶的水中浸泡48小时的米糠
饮食3        米糠+酶-无浸泡
饮食4        米糠+水+酶浸泡48小时
饮食5        米糠+酶+微波处理
饮食6        米糠+酶+微波处理+浸泡48分钟
饮食
准确称量所有组分，并在旋转混合器中充分混合。将酶(11.2L)在300ml水中稀释，并在饲料混合期间，用加压喷雾瓶喷雾到组分中。将饮食冷沉淀。将144只21日龄的肉用鸡转移至滑门式(slide-in)笼中，重复6次，每次4只鸡。将这些鸡分成毛重相等的数组。前3天，使这些鸡适应所述饲料。在以后4天期间，每日收集所有排泄物，将其于80℃干燥过夜，并合并用于总体测定。在最后7天期间，测量饲料的摄入。实验结束时，记录鸡的重量，并计算饲料转化率(FCR)。也记录排泄物收集期间消耗的饲料量。
所有浸泡处理均在25℃进行48小时。饮食3(米糠+酶)采用68℃10分钟。所有微波均为于2.45Ghz、68℃10分钟。每种饮食实验由6次重复，每次4只鸡组成。该酶由木聚糖酶组成，并稀释为300ml水中11.2ml的推荐浓度，用于应用。测量4个标准：表观可代谢能(AME)、饲料转化率(FCR)、增重(WG)和饲料摄入(FI)。
该实验的结果示于表4。
                表4.喂养实验结果
饮食      AME        FCR        WG        FI
        (Mj/kg)   (饲料谷物)  (g/d/b)   (g/d/b)
饮食1    11.89      2.392      32.1      79.5
饮食2    11.87      2.135      39.7      83.5
饮食3    13.01      2.324      33.9      78.3
饮食4    11.82      2.294      37.5      84.0
饮食5    13.61      2.331      39.0      89.5
饮食6    12.66      2.178      43.4      92.4
恰好相当的结果是饮食3和饮食5的结果，其中唯一的差异是能源。在饮食3中，热源为常规实验室烘箱，而饮食5包含相同处理时间的微波能。这清楚地证明AME提高4.61％。
在提高其它高NSP饲料组分(诸如小麦细麸皮、麦麸和豆粒(grainlegume)的AME方面，本发明具有直接应用的潜力。然而，人们会认识到，本发明不限于这些潜在的应用，可以用于其它工业应用中，在所述应用中期望提高该酶的效应和/或减少达到所需效应所花费的时间。
装置
图1显示装置的示意图，所述装置适用于实施按照本发明的方法。该装置包括微波加热器10和能量波导向装置12、13、14和15。将微波能施加至上述装置中的酶/底物混合物。管道式加热器17配备入口11，底物与酶的混合物通过该入口进入该加热器。管道式加热器17也配备出口16，酶处理的产物通过该出口离开加热器10。
示于图1的该装置适于大体积连续加工应用。
图2显示适于实施按照本发明的方法的其它装置。该装置包括混合转筒式加热器20，其中通过搅拌器24进行混合或搅拌。通过能量波导向装置22施加微波能。微波能可以以上述方式施加于酶/底物混合物。该装置包括一个入口21，底物与酶的混合物通过该入口加入该装置。该装置包括一个出口23，酶处理的产物通过该出口离开该装置。
本领域技术人员会认识到，可以如具体实施方案所示，对本发明进行许多变化和修改，而不偏离广泛描述的本发明的精神或范围。因此，认为本发明的实施方案在所有方面都是说明性的，不是限制性的。

Claims (9)

1.增加或提高基于植物的动物饲料中可代谢饮食含量的方法，所述方法包括：
a)将能够从基于植物的动物饲料释放可代谢饮食组分的酶加入所述饲料中，形成饲料/酶混合物，
b)用至少100MHz的微波能对所述饲料/酶混合物进行辐射，以增加或提高所述饲料中可代谢饮食的含量。
2.按照权利要求1的方法，其中所述饲料选自谷类、麸皮、干草、青贮料、糠、它们的组分和它们的混合物。
3.按照权利要求2的方法，其中所述饲料为米糠。
4.按照权利要求1的方法，其中所述酶选自蛋白酶、肌醇六磷酸酶、磷酸酶、碳水化合物水解酶、木聚糖酶和它们的混合物。
5.按照权利要求4的方法，其中所述酶为木聚糖酶。
6.按照权利要求1的方法，其中微波能频率为2.45GHz。
7.按照权利要求6的方法，其中所述微波能辐射进行10分钟。
8.按照权利要求1的方法，其中所述微波能辐射于常压下进行。
9.按照权利要求1的方法，其中消耗之前基本上未发生酶修饰或所述饲料的催化。
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