CN1142833B

CN1142833B - 聚-β-1→4-N-乙酰基葡糖胺

Info

Publication number: CN1142833B
Application number: CN941949125A
Authority: CN
Inventors: J.N.沃纳吉斯; S.芬基尔斯坦; E.R.帕里泽; M.赫顿
Original assignee: Marine Polymer Technologies Inc
Current assignee: Marine Polymer Technologies Inc
Priority date: 1993-12-01
Filing date: 1994-12-01
Publication date: 2010-06-02
Anticipated expiration: 2014-12-01
Also published as: AU695850B2; WO1995015343A1; IL111825A0; JP2004211101A; EP0731812B1; CA2177823A1; JP2009079223A; ES2219659T3; EP1452546A2; PT731812E; US5622834A; EP0731812A1; JPH09506126A; EP0731812A4; AU1296995A; US5623064A; ATE263785T1; CA2177823C; CN1142833A; DE69433692D1

Abstract

叙述了一类聚-β-1→4-N-乙酰基葡糖胺(p-GlcNAc)聚糖类和它们的衍生物的制备和纯化的方法。通过本法制得的聚糖不含蛋白、基本上不含单个氨基酸和其它有机和无机物杂质。商业上这些p-GlcNAc多糖被生物医学、制药工业和美容工业利用，用于药物缓释系统、细胞胶丸系统和预防术后粘连的治疗等。下图表示100％p-GlcNAc的化学结构，这里“n”大约是4000到150,000的一个整数。

Description

聚-β-1→4-N-乙酰基葡糖胺

1.前言

首先，本发明涉及一个纯的，易制造的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)多糖类。本发明的p-GlcNAc是一个由单糖类糖按β-1→4形式连接成高分子量的多聚物，不含蛋白亦不含单个氨基酸和其它有机无机物的杂质。另外，也叙述了p-GlcNAc的衍生物和再成型物。第二，本发明还涉及以微海藻，优选硅藻为原料的本发明的p-GlcNAc的纯化方法。第三，本发明涉及p-GlcNAc的衍生化和再成型的方法。第四，本发明涉及纯的p-GlcNAc，它们衍生物和/或它的再成型物的应用。

2.发明背景

今天，由p-GlcNAc组成的聚糖类的性质、作用和应用的文献非常丰富。这类物质通常已被归类于如“壳多糖”。脱乙酰基的壳多糖衍生物被归于“脱乙酰壳多糖”。大约在1823年，当这类物质首次被利用时，人们相信壳多糖和脱乙酰壳多糖总是来自大自然，作为一独特的、好下定义的，唯一的和不变的化学种类，壳多糖是完全乙酰化组成和脱乙酰壳多糖是完全脱乙酰化组成。然而，大约一世纪后，在它发现以前壳多糖(chitin)和脱乙酰壳多糖的称呼是很模棱两可的，实际上这些化合物展示非常不同的物理性质和化学性质。这些不同是由于不同的分子量、不同的乙酰化程度和共价杂质的存在，特种蛋白，单氨基酸和无机杂质的存在造成的。即使今天使用壳多糖和脱乙酰壳多糖的名称仍模棱两可。并且，实际上很难给许多不同化合物的混合物下定义。

例如从传统的来源，如甲壳动物的外壳和真菌菌丝体分离到的壳多糖的性质是无法预言它的变化。这些变化不仅是因种类的不同，而且也受到环境、季节的变化的影响，这些因素决定了生产的各种壳多糖的一些生化特性。事实上，原料的不可预测的可变性对壳多糖基础工业的缓慢增长负有重大责任。

今天，在描述从原料分离和制备的科学文献中，没有关于完全乙酰化的p-GlcNAc纯品，即一个或多个产物未被有机或无机杂质污染的报告。当McLachlan等(McLachlan，A.G.et al.，1965，Can.J.Botany 43：707～713)报告了壳多糖的分离，随后的研究工作展示得到了“纯”品，事实上还是含有蛋白和其它杂质。

去乙酰化和部分去乙酰化的壳多糖展示出潜在有益的化学性质，例如，高活性、密集的阳电荷、强的金属螯合力、共价连接蛋白的能力和在许多水溶液中的溶解度。如前所述这些制品的不可预测的可变性严重限止了这些多相化合物的利用。比如，实际结果表明，目前可得到的壳多糖和脱乙酰壳多糖的数据再现性差和难以接受的易变性。另外，可获得的制剂不够均匀或不够纯，特别是在医学上使用的这些制剂的成分再现性不够好。虽然非常希望得到一个真正纯的壳多糖和脱乙酰壳多糖的制剂，这个制剂的性质能高度复演，并且很容易生产，但，目前还不存在。

3.发明概述

首先，本发明涉及一个分离的、易生产的、纯的p-GlcNAc类物质。本发明的p-GlcNAc是一个由许多单糖按β-1→4构型结合的高分子量的多聚物。此多糖不含蛋白，基本上不含其它有机杂质和无机杂质。

本发明的重要性在于这样一个事实，即已克服了无法预测原料可变性的问题。可以通过简单的手段得到，具商业水准、生物医学纯、高分子量和性质一致的p-GlcNAc这是首次。本发明生产的物质是高晶态的，是小心控制微藻(microalgae)，优选硅藻的无菌培养基生产的，并已生长在一个限定的介质中。

本发明进一步叙述了p-GlcNAc的衍生物和再成型物及生产方法。这衍生物可以包括，但不限于聚葡糖胺和它的衍生物，再成型物可以包括，但不限于薄膜、细丝、非编织的纺织品、海绵和三维基质。本发明涉及来源于微藻、优选硅藻及各种来源的本发明的p-GlcNAc的纯化方法。另外，本发明涉及纯的p-GlcNAc、它的衍生物和/或它的再成型物的应用。这是新的商业用途，涉及生物医学、制药和美容等行业。所有这些行业均需要最高纯度的原料。例如，本发明的p-GlcNAc材料可以被配方以显示出可控的生物降解性质，可被用于作为药物缓释系统、细胞胶丸系统和预防术后粘连的治疗的部件。

4.附图简要说明

图1.100％p-GlcNAc的化学结构。n为约4000～150,000的整数，约4000～15,000是优选的。

图2.p-GlcNAc的碳水化合物分析，气相色谱-质谱图谱数据。p-GlcNAc是用化学/生物学方法的酸处理/中和的变异法纯化，叙述于下面5.3.2节。

图3A.纯的p-GlcNAc的固体薄膜的圆二色谱。

图3B.脱乙酰p-GlcNAc薄膜的圆二色谱。纯的p-GlcNAc在211nm和195nm处的最大吸收峰消失指出是完全脱乙酰化。脱乙酰化的条件将在5.4节中叙述。

图4A.上图为通过机械力纯化法制得的纯硅藻p-GlcNAc薄膜的红外光谱图，下图通过化学/生物学纯化法的红外光谱图。

图4B.市售“聚多糖”的二种制剂的红外光谱图。按下面5.5节中详述方法铸膜。

图4C.通过热变性(上图)和化学变性(下图)改变的纯p-GlcNAc的红外光谱图。方法详述于5.4节。

图4D.从硅藻海链藻属的fluviatilis获得的p-GlcNAc薄膜的红外光谱图。用化学/生物学纯化法，详见5.3.2节。

图4E.通过机械力纯化法又高压灭菌制得的p-GlcNAc薄膜的红外光谱图。纯化方法见5.3.1节。

图5A.通过化学/生物学纯化法纯化的p-GlcNAc的NMR分析。图表描述了峰的振幅、面积和参比物的比值，总峰面积比。纯化方法述于5.3.2节。

图5B.用化学/生物学纯化方法纯化的p-GlcNAc的NMR分析。图表描述总峰面积比。纯化方法述于5.3.2节。

图6A-6B.通过机械力纯化法制造的p-GlcNAc薄膜的透射电子显微图(TEM)，纯化方法述于5.3.1节。

放大倍数：6A：4190倍；6B：16,250倍。

图7A-7B.通过HF处理的p-GlcNAc的TEM图。纯化方法见5.3.2节的化学/生物学纯化方法的讨论中。

放大倍数，7A：5270倍，7B：8150倍。

图8A-8B.化学/生物学纯化法的酸处理/中和变异法制备的p-GlcNAcTEM图。纯化方法述于5.3.2节。放大倍数，8A：5270倍，8B：16700倍。

图9A.由化学/生物学纯化法的酸处理/中和变异法制造的p-GlcNAc薄膜的扫描电子显微图(SEM)。纯化方法见5.3.2节。放大倍数：200倍。

图9B.描绘由化学/生物学纯化法的酸处理/中和变异法制造的p-GlcNAc薄膜的SEM图。纯化方法见5.3.2节。放大倍数：1000倍。

图9C.描绘由化学/生物学纯化法的酸处理/中和法变异法制造的p-GlcNAc薄膜的SEM图。纯化方法见5.3.2节。放大倍数：5000倍。

图9D.描绘通过化学/生物学纯化法的酸处理/中和变异法制造的p-GlcNAc薄膜的SEM图。纯化方法见5.3.2节。放大倍数：10,000倍。

图9E.描绘由化学/生物学纯化法变异的酸处理/中和法制造的p-GlcNAc薄膜的SEM图。纯化方法见5.3.2节。放大倍数：20,000倍。

图10A-10B.纯的p-GlcNAc薄膜的SEM图。本品先用细胞溶解/中和纯化法，叙述于5.3节，后来溶在二甲基乙酰胺/氯化锂中，并在水中沉淀成一垫瓶状(方法述于5.5节)制得。放大倍数：10A：1000倍；10B：10000倍。

图11A-11B.脱乙酰化p-GlcNAc垫瓶的SEM图。放大倍数：11A：1000倍；11B：10,000倍。

图12A-12B硅藻照片。注意：p-GlcNAc纤维正从硅藻细胞中伸出。

图13.图解描绘本发明的一些可能的p-GlcNAc和脱乙酰的p-GlcNAc衍生物。(从S.Hirano，“Production and Application of Chitin andChitosan in Japan”改编入“Chitin and Chitosan”，1989，Skjak-Break，Anthonsen and Sanford，eds.Elsevier Science Publishing Co.，pp.37-43)。

图14.在p-GlcNAc存在或缺席下生长的细胞的细胞活力研究。闭环(●)：生长在p-GlcNAc基质上的细胞；开环(○)：生长在无p-GlcNAc基质上的细胞。

图15A-15B.生长在p-GlcNAc薄膜上的已变性的小鼠成纤维细胞的SEM图。放大倍数：15A：1000倍；15B：3000倍。

图16A.按13.1节所述方法制备的胶原对照材料的SEM图。放大100倍。

图16B.按13.1节所述方法制造的胶原/p-GlcNAc杂交材料的SEM图。胶原悬浮剂(浓度为7.5mg/ml)∶p-GlcNAc悬浮剂(浓度为0.07mg/ml)等于3∶1。放大100倍。

图16C.按13.1节所述方法制造的胶原/p-GlcNAc杂交材料的SEM图。胶原悬浮剂(浓度为5.0mg/ml)∶p-GlcNAc悬浮剂(浓度为0.12mg/ml)等于1∶1。放大100倍。

图16D.按13.1节所述方法制造的胶原/p-GlcNAc杂交材料的SEM图。胶原悬浮剂(浓度为10.0mg/ml)∶p-GlcNAc悬浮剂(浓度为0.25mg/ml)等于2∶2。放大100倍。

图16E.按13.1节所述方法制造的胶原/p-GlcNAc杂交材料的SEM图。胶原悬浮剂(浓度为2.5mg/ml)∶p-GlcNAc悬浮剂(浓度为0.25mg/ml)等于1∶3。放大100倍。

图17A.在图16A的胶原对照材料上培养的小鼠3T3成纤维母细胞的SEM图。放大100倍。

图17B.在图16B胶原/p-GlcNAc材料上培养的小鼠3T3成纤维母细胞的SEM图。放大100倍。

图17C.在图16C的胶原/p-GlcNAc材料上培养的小鼠3T3成纤维母细胞的SEM图。放大100倍。

图17D.在图16D的胶原/p-GlcNAc材料上培养的小鼠3T3成纤维母细胞的SEM图。放大100倍。

图18.转化的NMR数据曲线，用以得到每个碳原子的面积，然后计算甲基面积对碳原子面积的比。

图19.典型的p-GlcNAc的C13-NMR谱。单峰代表分子中每个碳的吸收。

图20.转化的NMR数据，计算甲基面积对碳原子面积的比。上图：图解表示；下图：数字表示。

图21A-G.在各种溶剂中制造的三维p-GlcNAc基质的SEM图。图21A，21D：在蒸馏水中制造；图21B：在10％甲醇蒸馏水溶液中制造，图21C：25％甲醇蒸馏水；图21E：10％乙醇蒸馏水；图21F：25％乙醇蒸馏水；图21G：40％乙醇蒸馏水。放大200倍。标尺为200μm。

图22A-G.生长在三维p-GlcNAc基质上的成纤维细胞SEM图。此三维p-GlcNAc基质冷冻干燥p-GlcNAc的蒸馏水溶液制造。放大倍数：100倍(图22A，22E)；500倍(图22B)；1000倍(图22C，22F)；5000倍(图22D，22G)。标尺为5、20、50或200μm。

图23.用18.1节中所述的操作方法得到的典型的标准曲线。亦即18.1节中所述溶菌酶素-壳多糖酶实验使用的标准曲线。

图24.p-GlcNAc溶菌酶的消化数据。本图介绍当p-GlcNAc薄膜为溶菌酶消化时N-乙酰葡糖胺随时间的累积量。本图比较了完全乙酰化p-GlcNAc与部分(50％)去乙酰化p-GlcNAc的降解率。表明，部分去乙酰化p-GlcNAc的降解率高于完全乙酰化p-GlcNAc材料。

图25.p-GlcNAc溶菌酶的消化数据。本图介绍在p-GlcNAc薄膜被溶菌酶消化时N-乙酰葡糖胺随时间的累积量。本图比较了两种部分脱乙酰化p-GlcNAc薄膜(25％和50％脱乙酰p-GlcNAc薄膜)的降解率。本资料说明，当去乙酰化百分率增加时，降解率增加；50％去乙酰化p-GlcNAc薄膜降解率高于25％去乙酰化p-GlcNAc薄膜的降解率。

图26A-26E.p-GlcNAc体内生物降解率。图26A-26C.描绘采用18.1节中所述方法在大鼠腹部植入样品1(完全乙酰化p-GlcNAc)薄膜。图26A.一只大鼠一天中0次植入；图26B.一只大鼠一天植入14次的结果；图26C.一只大鼠一天植入21次后结果；图26D-26E.描绘腹部已植入样品3A(冻干和部分去乙酰化p-GlcNAc薄膜)，方法述于18.1节中；图26D.一只大鼠一天0次种植；图26E.一只大鼠一天种植14次。

图27.本图说明没受到治疗(●)或受到p-GlcNAc乳酸盐/5’-氟尿嘧啶(FU)治疗(○)的动物肿块大小变化的百分率，述于20.1节。

图28.本图说明受到p-GlcNAc乳酸盐治疗(●)或受到p-GlcNAc乳酸盐/5’-氟尿嘧啶(FU)治疗(○)的动物的瘤块增大的百分率，述于20.1节。

图29.本图说明没有受到治疗(●)或用p-GlcNAc乳酸盐/丝裂霉素(mito)治疗(○)的动物瘤块增大的百分率。叙述于20.1节。

图30.本图说明接受p-GlcNAc乳酸盐治疗(●)或受到p-GlcNAc乳酸盐/丝裂霉素治疗(○)的动物肿块增大的百分率，述于20.1节中。

图31.条形图说明治疗动物中，每个动物肿块大小变化平均百分率。条形图1为用p-GlcNAc/5’FU高剂量组；条形图2为用p-GlcNAc/5’FU低剂量组；条形图3为单用p-GlcNAc薄膜；条形图4为空白组。1，2组n＝4；3，4组n＝2。

5.发明详述

首先说明了本发明的纯的p-GlcNAc类、p-GlcNAc衍生物和它们的再成型物的物理特性。第二叙述了从微藻类，优选硅藻，起源物所得的本发明的p-GlcNAc的纯化方法。第三叙述了p-GlcNAc的衍生物和再成型物和它们的生产方法。最后叙述了发明的p-GlcNAc，p-GlcNAc衍生物和/或p-GlcNAc再成型物的应用。

5.1.p-GlcNAc

发明的p-GlcNAc聚糖类物质是一个高分子量的多聚物，分子量范围约800,000～3千万道尔顿，分子量是通过凝胶渗透色谱测定。这样范围的p-GlcNAc是有约4,000～150,000个N-乙酰葡糖胺单糖按β-1→4构型连接，约4,000到15,000个N-乙酰葡糖胺聚合物是优选的(图1)。

发明的p-GlcNAc的可变性是很低的，它的纯度很高，这二点被化学和物理的评判证实。这评判标准是化学组成和非多糖杂质。第一对于两种不同纯化方法制造的，述于5.3节的p-GlcNAc化学组成数据列在表1中。能看到通过两种方法制造的p-GlcNAc的化学组成与p-GlcNAc的分子式一致，在实验误差范围内。第二，在表1中也展示了制造的p-GlcNAc没有检出蛋白质，没有其它如游离氨基酸类的有机杂质和没有如灰分和金属离子类的无机杂质(发明的p-GlcNAc可以含约0.05％以下痕量金属)。第三，发明的p-GlcNAc含有很低百分率的结合水。

表1

化学分析数据(％重量)

纯p-GlcNAc理论值

碳 47.29

氢 6.40

氮 6.89

氧 39.41

蛋白 0.00

p-GlcNAc垫瓶(mats)的实验数据

(各种型号薄膜的实验次数大于30)

¹为计算样品灰份和含水量，原始分析数据已被规格化(normalized)

本发明的纯的p-GlcNAc的碳水化合物分析结果与图2所示相似。本发明的纯的p-GlcNAc的单糖是N-乙酰葡糖胺，第三，本发明的纯的p-GlcNAc不含单糖葡糖胺。本发明的p-GlcNAc的圆二色谱(CD)和红外光谱(IR)见图3A、4A和4D。生产方法见5.3节。这些物理数据证实本发明的p-GlcNAc是高纯的和结晶形的(crystallinity)。用于得到CD和IR数据的实验方法述于第6节。

本发明的纯p-GlcNAc的NMR分析与图5A、5B、18和19相似。这一个NMR样本的数据与本发明的完全乙酰化的多聚物p-GlcNAc的数据一致，而且这p-GlcNAc没有有机杂质。

用在5.3节中叙述的方法制造和在8和9节中所描述过的操作例子证明，本发明的p-GlcNAc的电子显微镜图被描绘于图6A到图9E。

本发明的p-GlcNAc展示了高度的生物相容性。生物相容性可以通过各种手段测定，这些手段包括，但不限于象洗脱实验，肌内植入法或皮内或全身注射进动物体等方法。设计一个洗脱实验(U.S.Pharmacopia XXII，1990，pp.1415-1497；U.S.Pharmacopeia XXII，1991，Supplement 5.，pp 2702-2703)评价实验样本提取物的生物相容性和检验哺乳动物细胞培养系的生物活性，这哺乳动物细胞培养系对可提取的细胞毒素是敏感的(例L929细胞系)。描述于第10节中操作实例证明本发明的p-GlcNAc的高生物相容性。

5.2.p-GlcNAc的微藻源的生产方法

5.2.1.p-GlcNAc的微藻源

可从微藻，优选硅藻制造和纯化p-GlcNAc。几属硅藻和几属中的大量硅藻可被用来作为p-GlcNAc的原料。每一种硅藻p-GlcNAc组成的纤维，p-GlcNAc从它们的细胞体中伸出。这种硅藻的照片看图12A-12B。生产本发明的p-GlcNAc的硅藻原料包括，但不限于圆筛藻属(硅藻)，黑海小环藻属，海链藻属，最好是海链藻属。

在圆筛藻属中，可用来制造本发明的p-GlcNAc硅藻包括，但不限于concinnus和radiatus这两种。在黑海小环藻属中，可用的硅藻包括，但不限于caspia，cyptica和meneghiniana这几种。可用来制造本发明的p-GlcNAc的原料的海链藻属硅藻包括，但不限于nitzschoides，aestivalis，antarctica，deciphens，eccentrica，floridana，fluviatilis，gravida，guillardii，hyalina，minima，nordenskioldii，oceanica，polychorda，pseudonana，rotula，tubifera，tumida和weissflogii等种类，最好是fluviatilis和weissflogii两种。

如上所述的硅藻可从the Bigelow Laboratory for Ocean Sciences，Center for Collection of Marine Phytoplankton(Mckown Point，WestBoothbay Harbor，Maine，0 45 75)的收集中得到。

5.2.2.生长硅藻的方法

在5.2.1.节中所述硅藻中的任一种可通过利用如本节中所述方法来生长。通过在无菌条件下，用一成熟的硅藻培养物接种培养基新的硅藻培养开始。这培养基必须没有所有其它微生物，因此用于制造培养基的所有物质，包括水、有机化合物和无机化合物都必须消毒。在这里所有的操作方法均在严格的无菌条件下进行，即所有的容器，所有的物质从一个容器转移到另一个容器等等均在无菌环境中进行。一次制备培养基的量应不超过一次新的培养所需的量。例如约占1平方英尺空间的Fernbach烧瓶可用作培养硅藻的容器。这样的容器可容纳1立升最适合硅藻生长的培养基。

培养基的制造包括如下操作：

a.海水的获得和加工

b.蒸馏水和去离子水的制造

c.最初的营养液的制造

d.工作中的营养液的制造

e.最后营养液的制造

可从the Marine Biology Laboratory(Woods Hole，Massachusetts)得到滤过的海水。海水的容器应在5℃储藏。当需要时，所需的水可以通过一个具0.45μm孔径的硝化纤维滤膜布氏漏斗(微孔过滤器)。这海水然后被高压灭菌，每升水在121℃经15分钟灭菌。在灭菌过程完成后盖好贮罐，立即冷却，最好转移到一个冷房子，能使溶液冷却到5℃。当使用时，溶液可升至室温。

用标准的装置和方法蒸馏自来水并去离子，收集和保存在经严格灭菌、严密盖好最好为玻璃容器中。

下面列出制造培养基所需营养液的处方。这些处方是作指导用的，意指，支持硅藻生长满足p-GlcNAc制造的培养基的制剂处方的常规改变亦是在本发明范围内。

1.痕量金属的最初营养液(TMPS)

a.39mM CuSO₄·5H₂O(5水合硫酸铜)(9.8g硫酸铜/升)

b.7.5mM ZnSO₄·7H₂O(7水合硫酸锌)(22g硫酸锌/升)

c.42mM CoCl₂·6H₂O(6水合氯化钴)(10g氯化钴/升)

d.91mM MnCl₂·4H₂O(4水合氯化锰)(18g氯化锰/升)

e.26mM NaMoO₄·2H₂O(2水合钼酸钠)(6.3g钼酸钠/升)

f.153.5mM H₂SeO₃(硒酸)(12.9g硒酸/升)

用不大于0.2mm孔径滤器无菌过滤每一营养液。

2.维生素最初营养液(VPS)

a.1mg/ml维他命B₁₂

b.0.1mg/ml维他命H(生物素)

用不大于0.2mm孔径滤器无菌过滤此二个营养液。

3.钠盐工作营养液(SSMS)

a.硝酸钠工作营养液：0.88M(75g NaNO₃/升)

b.1水合磷酸二氢钠工作营养液：36.2mM NaH₂PO₄·H₂O(5gNaH₂PO₄·H₂O/升)

c.9水合硅酸钠工作营养液：0.11mM Na₂SiO₃·9H₂O(30gNa₂SiO₃·9H₂O/升)

用不大于0.2mm孔径滤器无菌过滤每一种SSWS。

4.痕量金属工作营养液(TMWS)

11.7mM Na₂EDTA(4.36g/升)

11.7mM FeCl₃·6H₂O(3.15g/升)

上面所列6个最初营养液各1ml/升，用不超过0.2mm孔经过滤器无菌过滤。注意痕量金属工作营养液必须在配成一个新的培养基时新鲜配制。

5.维生素工作营养液(VWS)

1.0μg/ml生物素(V_H)(1.0ml最初生物素营养液/100ml)

1.0μg/ml维生素B₁₂(0.1ml维生素B₁₂初始营养液/100ml)

20.0mg盐酸硫胺(盐酸硫胺/100ml)用不大于0.2mm孔径的滤器无菌过滤。注意维生素工作营养液应在配成一个新的培养基时新鲜配制。

为了制造培养基和为了培养硅藻的技术在下面叙述。显然，除这些技术外，在此叙述过的处方和/或操作方法的任何常规改变和在这方法下制成的有支持硅藻生长的能力的培养基均在本发明范围内。

培养基可以被制备如下：每升过滤过的和灭菌过的海水可加入1ml NaNO₃工作营养液，1ml NaH₂PO₄·H₂O工作营养液，1ml痕量金属工作营养液和1mlNa₂SiO₃·9H₂O工作营养液。在加入NaSiO₃·9H₂O同时可加入2ml 1N HCl，振摇溶液使之混合。然后加入1.5ml 1N NaOH，溶液再一次振摇混合。最后加入0.5ml维生素工作营养液。

为了生长新的硅藻，可以转移7ml成熟的培养基(细胞密度约为1×10⁵个细胞/ml)到装有100ml灭菌培养基的灭菌容器中，此培养基是按上述方法制得。接好种的培养基孵化8天，条件如下：

温度20℃

持续光照

搅动：每天早晚各转动一次，每次2～3秒。

孵化8天后，在无菌条件下将80ml孵化好的培养基转移到1000ml培养基中，这个培养基可以装在一个2.8升Fernbach烧瓶中，瓶口用一棉团塞住并用干酪布包住。一旦，一个培养基达到所要求的细胞密度，就可收获此培养基中的p-GlcNAc纤维，本发明的p-GlcNAc可以被纯化，使用方法在5.3节叙述。

为了保持培养基的pH值约为7-8，约7.4是优选的，可以在培养基内通CO₂。保持这中性pH的环境大大增加p-GlcNAc的产率，此产率可在每个硅藻培养中得到。

5.3.p-GlcNAc纤维的分离、纯化和集中的方法

可利用本节介绍的方法收获上面5.2节所述的来自硅藻培养基的p-GlcNAc纤维。

下述对于源自微藻，优选硅藻的p-GlcNAc的纯化的方法各自生产很纯的、没有掺杂的、晶形的p-GlcNAc，每一个方法得到p-GlcNAc均有特殊的特性和有益的特征。例如，用在下面5.3.1节介绍的机械力方法纯化产生的本发明的p-GlcNAc薄膜，此膜提供一个使细胞连接到p-GlcNAc的优越培养基。述于5.3.2节的第二个方法，化学/生物学方法，平均产率比机械力方法高得多。另外，叙述于5.3.2节的化学/生物学方法部分的酸处理/中和变异法产生非常长的p-GlcNAc纤维，一些纤维长度超过100μm和高到2～3千万道尔顿的分子量。

5.3.1机械力方法制造纯p-GlcNAc

通过使培养基内容物受到适当机械力可以从硅藻细胞体分离p-GlcNAc纤维。这样一个机械力可以包括，但不只限于通过例如胶质研磨机超声装置或气泡发生器产生的剪切力，或Waring拌合机产生的切割力。

然后分离生成的硅藻细胞体和p-GlcNAc纤维的悬浮物。离心悬浮物使p-GlcNAc纤维与细胞体分离，得到一个清的仅有很少可见的絮状物的上清液。在离心分离基阶段，有一固定转动角度和10℃温度是优选的。离心速度和时间取决于特殊的离心机，但参数的测定显然是本领域的基本技术。

上清液中的p-GlcNAc用本领域技术人员熟知的技术浓集。这技术包括，但不限于吸滤的方法。

最后，浓集的p-GlcNAc纤维用蒸馏的去离子水、HCl和乙醇，或其它适当溶剂洗涤，最好是醇类，可溶解有机和无机物质。

述于第7节的工作实例说明这p-GlcNAc的纯化方法的利用。

5.3.2p-GlcNAc纯化的化学/生物学方法

在此方法中，通过使硅藻细胞体受到化学的或生物的试剂处理，分离出p-GlcNAc，详述于后。

硅藻培养基可以用一化学试剂处理，削弱硅藻细胞壁的能力，导致p-GlcNAc纤维释放而不改变他们的结构。这化学试剂可以包括但不限于氢氟酸(HF)。一个成熟的硅藻培养基可以用可改变生物学过程的生物学试剂处理。此过程可以用于抑制p-GlcNAc纤维的合成，释放纤维。这一试剂可以包括，但不限于polyoxin-D，N-乙酰葡糖胺-P-转化酶抑制剂。

用上述化学或生物学试剂处理硅藻培养基，细胞体和p-GlcNAc纤维得以分离。硅藻培养基的内容物可形成不相混的二层。上层主要含p-GlcNAc纤维，而底层则含细胞体。含p-GlcNAc纤维的上层可用虹吸法分出，留下了含细胞物质的下层。

然后，虹吸出的p-GlcNAc纤维含有层可通过用一个清洁剂处理，进一步纯化除去蛋白和其它不希望有的物质，此清洁剂将不损害此p-GlcNAc纤维。这种清洁剂可以是，但不限于十二烷基硫酸钠(SDS)。

当用酸处理时，如HF处理时，是用于从硅藻体上分离p-GlcNAc纤维，这一步还包括纤维的分散。这一步可以包括，但不限于用机械力使纤维分散，如纤维受到强烈搅拌分散。在进一步用清洁剂处理纯化前，酸处理的悬浮物可以被中和，使悬浮物的pH值从约1.8改变为约7.0，如加入适当体积的1M的Tris(pH 8.0)或适当体积的氢氧化钠(NaOH)。通常，中和得到的纯的p-GlcNAc纤维比在此讨论过的其它纯化方法得到的纤维长。

可用本领域的技术人员都熟知的技术收集纯的p-GlcNAc纤维，如吸滤的方法。最后p-GlcNAc纤维先后用蒸馏的去离子水、HCl和乙醇，或其它适当溶剂，最好乙醇洗，有机和无机物溶解。

第8节工作实例证实了这种纯化方法的成功利用。

5.4p-GlcNAc的衍生物

通过利用各种控制条件和操作方法使本发明的纯的完全乙酰化的p-GlcNAc可以被衍生化，得到大量不同化合物。看图13，图中画出一部分化合物。这些衍生物可以包括但不限于部分的或完全的脱乙酰基p-GlcNAc，这p-GlcNAc的衍生物通过化学的和/或酶作用的手段，在下面进一步详细叙述。另外，p-GlcNAc或它的脱乙酰衍生物可以通过生成硫酸酯、磷酸酯和/或硝酸酯化衍生化。这些衍生物进一步详述如下：O-硫酰基，N-酰基，O-烷基，脱氧卤素(deoxyhalogen)，N-烷烯基和芳烷烯基和其它衍生物，可以从本发明的p-GlcNAc或去乙酰基p-GlcNAc制造。本发明的脱乙酰化p-GlcNAc也可以被用来制造各种有机盐和/或金属螯合物。进一步说，本发明的p-GlcNAc或一个衍生物可以以共价或非共价形式连接到任何一种分子上。更进一步，本发明的p-GlcNAc或其一个衍生物可以在控制水解条件下得到均质的和分子量不连续的独特的多组分子。

本发明的p-GlcNAc的一个或多个的单糖单元可以被水解形成一类聚-β-1→4-N-葡糖胺。本发明的一类聚-β-1→4-N-葡糖胺的每个单糖单元已被脱乙酰化形成分子量大约640,000～24百万道尔顿，其中大约640,000～2.4百万道尔顿是优选的。

具有这样的分子量范围的药有4000～150,000个葡糖胺单体，按β-1→4构型共价连接，约4,000～15,000葡糖胺是优选的。至少这poly-β-1→4-N-葡糖胺类的一个单糖单元可以保留乙酰化，具有25％～75％的乙酰化物是优选的，约30％乙酰化物是最好的。

本发明的p-GlcNAc可以用一个碱处理脱乙酰化得到具游离氨基的葡糖胺。用氢氧化钠或氢氧化钾溶液的水解过程可在提高温度条件下进行。小心控制脱乙酰基的程度和避免聚糖分子的主要碳氢链降解，然而，利用壳多糖脱乙酰酶对p-GlcNAc脱酰化的方法是最好的。这脱乙酰酶的方法是本领域技术人员所熟知的和可被实行，如在(U.S.Patent 5,219,749)中那样。该专利全部并入本发明作为参考文献。

本发明的p-GlcNAc的一个或多个单糖单元可以被衍生为含有至少一个硫酸酯基，或交替地可以被磷酸酯化或硝酸脂化，叙述如下：

其中，在氢原子处的R和/或R₁，和/或R₂可以是一个硫酰基(-SHO₃)，一个磷酰基(-P(OH)₂)或一个硝酰基(-NO₂)。

可以制造这些p-GlcNAc衍生物的方法叙述于下。如本节所述，在实行这些方法之前，首先冷冻干燥，液氮冷却和粉碎p-GlcNAc原料是有利的。

硫酰化p-GlcNAc衍生物可以通过二步产生。第一步可用Tokura等(TokuraS.et al.，1893，Palym.J.15：485)所述的技术，从本发明的p-GlcNAc和/或p-GlcNAc衍生物制造O-羰甲基(Carboxymerhyl)p-GlcNAc。第二步，磺酰化可以用N，N-二甲基甲酰胺-三氧化硫按本领域技术人员熟知的技术，像Schweiger(Schweiger R.G.1972，Carbohydrate Res，21：219)所述那样操作分离出生成物的钠盐。

本发明的磷酸化的p-GlcNAc衍生物，可以用本领域技术人员熟知的技术制造，这技术被Nishi等(Nishi，N.et al.，1986，in“Chiktin in Natureand Technology”，Muzzarelli et al.，eds，Plenum Press，New York，pp.297-299)叙述。简而言之，p-GlcNAc/甲磺酸混合物可以用五氧化二磷(大约0.5～4.0molar equivalent)在0～5℃搅拌处理。大约反应2小时。然后用本领域技术人员熟知的规范技术使生成物沉淀并加以洗涤。例如，样品可用一溶剂如乙醚沉淀，离心分离，用溶剂如乙醚、丙酮或甲醇洗涤和干燥。

p-GlcNAc的硝化衍生物可以用本领域技术人员熟知的技术制备，例如用Schorigin和Halt(Schorigin，R.and Halt，E.，1934，Chem.Ber.67：1712)所述的技术。简而言之，p-GlcNAc和/或一个p-GlcNAc衍生物可用浓硝酸处理，生成稳定的硝酰化产物。

本发明的p-GlcNAc的一个或多个单糖单元可以含一个磺酰基，如下所述：

其中R₃可以是烷基、酰基、烯基或炔基。这样的衍生物可以用Kurita等(Kurita，K.et al.，1990，Polym.Prep[Am.Chem.Soc.，Div.Polym.Chem.]31：624-625)叙述的方法生产。简而言之，一个p-GlcNAc的碱性水溶液可以和甲苯磺酰氯的氯仿溶液反应，本反应可在低温下稳定进行。

本发明的p-GlcNAc或其脱乙酰衍生物的一个或多个单糖单体可以含有一个或多个O-酰基叙述如下：

其中取代氢的R₄和/或R₅，可以是一个烷基、烯基或炔基，R₆可以是一个烷基，烯基或炔基。一个这种衍生物的例子可用熟知的如Komai(Komai，T.et al.，1986，in“Chitin in Nature and Technology”，Muzzarelli et al.，eds.，Plenum Press，New York，pp.497-506)所述的方法生产。简而言之，p-GlcNAc可以和甲磺酸中的许多合适的酰氯中的任何一个反应，得到p-GlcNAc的衍生物，此衍生物包括己酰、辛酰、lanroyl、或苯甲酰基衍生物。

一个或更多的本发明的脱乙酰p-GlcNAc的单糖单元可含有一个N-酰基，叙述如下：

其中R₇可以是一个烷基、烯基、炔基。此衍生物可采用本领域技术人员熟知的技术制得，如Hirano等人所述(Hirano，S.et al.，1976，CarbohydrateResearch 47：315-320)。

脱乙酰基p-GlcNAc可以溶解在许多有机酸水溶液中。把所选的酸酐加入到含p-GlcNAc的甲醇醋酸水溶液，生成N-酰化形式的p-GlcNAc衍生物。

一个或更多的本发明的脱乙酰基p-GlcNAc或它的脱乙酰基衍生物的单糖可以含一个O-烷基，描述如下：

其中R₈可以是一个烷基、烯基或炔基。这样一个化合物可以通过用本领域技术人员所熟知的技术得到。例如，用Maresh等所描述的过程(Maresh，G.et al.，in“Chitin and Chitosan”，Skjak-Brack，G.et al.，eds.，1989，Elsevier Pulelishing Co.，pp.389-395)。简而言之，脱乙酰基p-GlcNAc可以在二甲氧基乙烷(DME)中分散并与过量的环氧丙烷反应。反应时间为24小时，在压热器中于40～90℃反应。把混合物用与水稀释并过滤。DME可通过蒸馏除去。最后，终产物可以经冷冻干燥法分离得到。

本发明的p-GlcNAc的一个或更多个单糖单元可以是一个碱化衍生物，描述如下：

这样一个衍生物可以用本领域技术人员熟知的方法得到。例如，可用Noguchi等所叙述的方法(Noguchi，J.et al.，1969，Kogyo Kagaku Zasshi 72：796-799)。简而言之，p-GlcNAc可在真空下约0℃浸泡在NaOH溶液(最好为43％)中约2小时。然后，过量的NaOH可通过例如篮式离心机和机械压榨等方法除去。

一个或更多的本发明的p-GlcNAc脱乙酰基衍生物的单糖单元可以含有一个N-烷基，叙述如下：

其中R₉可以是烷基、烯基或炔基。此衍生化产物可用如Maresh等描述的操作方法得到(Maresh，G.et al.，in“Chitin and Chitosan”，Skjak-Brack，G.et al.，eds.，1989，Elsevier Publishing Co.，pp.389-395)，此方法与上述O-烷基衍生物的制备方法相同。

一个或更多的本发明的p-GlcNAc的脱乙酰基衍生物的单糖单元可以含有至少一个脱氧卤素衍生物，叙述如下：

其中R₁₀可以是F、Cl、Br或I，其中I为最好。此衍生物可采用本领域技术人员所熟知的技术得到。例如，可以使用Kurita等所叙述的操作方法(Kurita，K.et al.，1990，Polym.Prep.[Am.Chem.Soc.，Div.Polym.Chem.]31：624-625)。简而言之，甲苯磺酰化的p-GlcNAc与卤化钠在二甲亚砜中反应，生成脱氧卤素衍生物。p-GlcNAc的甲苯磺酰化可以通过碱性p-GlcNAc水溶液与甲苯磺酰氯的氯仿溶液的反应进行。这样的反应可在低温下平稳进行。

一个或多个本发明的p-GlcNAc的脱乙酰基衍生物的单糖单元可以形成一个盐，叙述如下：

其中R₁₁可以是一个烷基、烯基或炔基。此衍生物可以用本领域技术人员所熟知的技术制得。例如，可以用Austin和Sennett所叙述的操作方法(Austin，P.R.and Sennett，S.，in“Chitin in Nature and Technology”，1986，Muzzarelli，R.A.A.et al.，eds，Plenum Press，pp.279-286)。简而言之，脱乙酰基p-GlcNAc可以被悬浮在一种有机溶剂中，例如乙酸乙酯或异丙醇。在其中加入一种适当的有机酸，例如甲酸、乙酸、羟乙酸和乳酸。将混合物放置1～3小时。反应和干燥的温度可在12～35℃之间变化，而最适宜的温度是20～25℃。通过过滤把盐分离，并用新鲜溶剂洗涤，然后蒸除溶剂。

一个或多个本发明的p-GlcNAc的脱乙酰基衍生物的单糖单元可以形成一个金属螯合物，叙述如下：

其中R₁₂可以是一个金属离子，尤其是过渡金属离子，X是通过脱乙酰基p-GlcNAc上的取代氨基和氨基的氮原子上存在的弧电子对建立的配位键。

一个或多个本发明的p-GlcNAc脱乙酰基衍生物的单糖单元可以含有一个N-亚烷基或一个N-亚芳基，叙述如下：

其中R₁₃可以是一个烷基、烯基、炔基或者酰基。这种衍生物可以用本领域技术人员所熟知的技术制得。例如，可以用Hirano等叙述的操作方法(Hirano，S.etal.，1981，J.Biomed.Mat.Res.15：903-911)。简而言之，脱乙酰基p-GlcNAc可以和羧酸酐和/或芳醛发生N-取代反应酰的和/或芳叉衍生物。

进一步说，可以控制本发明的p-GlcNAc或其衍生物的水解条件，得到质量均匀的不连续分子量的和具有其它物理性质的多组分子。例如，这样的水解条件可以包括用酶和溶菌酶处理。为控制水解程度，可以使p-GlcNAc和酶的反应控制在不同的作用时间。另外，用溶菌酶处理脱乙酰基的速率是可以控制的。脱乙酰的条件本节前面已叙述过。一个p-GlcNAc分子被脱乙酰化越充分，它将水解越完全。通过水解和/或脱乙酰化处理，除了降低分子量以外，还会引起物理性质的改变。彻底水解会导致p-GlcNAc的液化。以下第9节中的工作实例介绍了水解/脱乙酰基过程的结果。

进一步说，热交性可以改变p-GlcNAc结晶的结构。p-GlcNAc结晶结构的变更可以产生有益的影响，如p-GlcNAc的反应性。

进一步说，各种分子可以通过共价键或非共价键功能性地连接到本发明的p-GlcNAc的脱乙酰基衍生物上。这样的分子可以包括如生长因子这样的多肽，例如神经生长因子，蛋白酶，例如胃蛋白酶，激素或多肽识别序列，例如RGD序列，层粘连蛋白，整合素，细胞粘附分子以及一些相似分子，但不仅限于此。脱乙酰基p-GlcNAc上的暴露的伯胺上的共价附着是通过例如用用作特定长度化学空间起作用的双功能交联试剂而完成的。这种技术为本领域技术人员所熟知，类似于如Davis和Preston(Davis，M.and Preston，J.F.1981，Anal.Biochem.116：404-407)与Staros等(Staros，J.V.et al.，1986，Anal.Biochem.156：220-222)所叙述的方法。简而言之，被粘接到本发明的脱乙酰基或部分脱乙酰基p-GlcNAc上的肽上的羧端残基可以被激活，然后交联到这个p-GlcNAc上。活化作用可以通过将一溶液如碳二亚胺EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)加到肽的磷酸盐缓冲溶液中完成。最好这种溶液另外含一种试剂如硫代-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)以增强耦合力。在高pH缓冲溶液中，例如硫酸盐缓冲液(pH 9.0-9.2)混合后，激活的肽可以被交联到脱乙酰基p-GlcNAc上。

或者，如上所述的这样的分子可以采用本领域技术人员熟知的技术非共价地连接到脱乙酰基p-GlcNAc分子上。例如，在冷冻干燥之前选好一个或多种分子与脱乙酰基p-GlcNAc溶液相混合。

另外，可以形成包含p-GlcNAc和/或p-GlcNAc衍生物的杂交物。除了p-GlcNAc和/或p-GlcNAc衍生物以外，这样的杂交物还可以包括任何天然和/或合成物。例如，p-GlcNAc和/或p-GlcNAc衍生物附加一个或多个细胞外基质(ECM)形成杂交物。这种ECM组分可以包括胶原，fibronectin，葡萄糖胺聚糖和/或肽聚糖，但不仅限于此。杂交物也可以由p-GlcNAc和/或p-GlcNAc衍生物附加一个或多个合成物如聚乙烯而形成。这种p-GlcNAc聚乙烯或p-GlcNAc衍生物/聚乙烯杂交物可以通过加热这种杂交物组分，例如高压消毒制得。

另外，一个碘代-p-GlcNAc衍生物可以被异分子聚合，例如和苯乙烯，以制造新的可塑材料。碘代-p-GlcNAc能用类似于Kurita和Inoue(Kurita，K.and Inoue，S.，1989，in“Chitin and Chitosan”，Skjak-Braek，et al.，eds.，Elsevier Science Publishing Co.，lnc.，p.365)所述的方法制造，发生p-GlcNAc甲磺酰化和碘化。这种p-GlcNAc碘化衍生物能在硝基苯中分散并与苯乙烯发生反应，用氯化锡(SnCl₄)作为催化剂。

简而言之，在胶原/p-GlcNAc杂交物的情况下，一个p-GlcNAc悬浮液和一个胶原悬浮液可以被混合，冷冻干燥和交联，最好是脱氢热交联。这种杂交物的胶原种类可以是天然的或是合成的，可以是人的或是非人的，例如牛的器官。p-GlcNAc/胶原和/或p-GlcNAc衍生物/胶原杂交物显示同一的性质，并形成一种多孔基质，这种基质可以用作，例如，一种细胞可以粘附和生长的有效的三维基质。下面13节所叙述的工作实例阐述了这样一个p-GlcNAc/胶原杂交物的形式、性质和应用。

由脱乙酰基p-GlcNAc和肝素，藻酸钠和酰甲基p-GlcNAc等化合物组成的杂交物可以用这里所述技术形成。这样的组合物可以形成或再形成为薄膜和纤维。

带有多阴离子如聚丙烯酸或具有正电荷和负电荷的果胶与脱乙酰基p-GlcNAc可以形成络合物。这种络合物的形成可按类似于Mireles等描述的方法完成(Mireles，C.et al.，1992，in“Advances in Chitin and Chitosan”Brine，C.J.et al.，eds.，Elsevier Publishers，Ltd.)。脱乙酰基p-GlcNAc和聚丙烯酸，角叉菜或果胶，若分别被溶在盐酸和氯化钠溶液中，和具有相同pH的反应物溶液混合。此操作过程生成有效的絮状分子，通常此分子带有正性和负性的特征，例如，可以用于处理废水。

5.5再成型(Reformulations)

本发明的p-GlcNAc，象在5.4节中所述的它的脱乙酰基衍生物和/或它们的衍生物一样，可以被溶解并再形成各种形状和构造。

用二甲基乙酰胺(DMA)/氯化锂处理可以得到本发明的p-GlcNAc溶液。通过搅拌，p-GlcNAc可以很容易地溶解在含有5％LiCl(与DMA重量比)的DMA溶液中。水溶性的p-GlcNAc衍生物如p-GlcNAc盐，可以溶在水中。至少约75％脱乙酰基的p-GlcNAc可以溶于一个弱酸溶液中，例如1％醋酸溶液。不溶于水的p-GlcNAc衍生物可以溶于一种有机溶剂中。

在带有异氰酸苯酯的DMA∶LiCl溶液中，p-GlcNAc的衍生化作用通常生成苯氨基甲酸盐。在带有对甲苯磺酰氯的DMA∶LiCl溶液中，p-GlcNAc衍生化生成对甲苯磺酸盐。

本发明的p-GlcNAc，它的脱乙酰基衍生物和/或它们在溶液中的衍生物都可以被沉淀，并在一模型中再成型，这些形状，包括但不限于，垫状、带状、绳状、微球体、微有孔小珠、薄膜、纤维、粉末和海绵。可以形成极薄的(即厚度小于1微米)质量均匀的膜。利用纯p-GlcNAc不溶于水、乙醇等溶剂，特别是乙醇的特点可以进行再成型。例如，含DMA/LiCl的p-GlcNAc混合物通过常规手段注入水或醇中，最好是乙醇，此溶液将产生沉淀，不溶的p-GlcNAc再成型。在下面第11节中进行的工作实例说明了这种纯的p-GlcNAc的再成型。水溶性的p-GlcNAc衍生物可以通过在有机溶剂中沉淀再成型，这些有机溶剂如乙酸乙酯或异丙醇。至少有75％脱乙酰基p-GlcNAc可以在一强碱溶液中沉淀并达到再成型。不溶于水的p-GlcNAc衍生物可以通过在水溶液，例如水中再沉淀成型。

与氧化纤维素连接的脱乙酰基p-GlcNAc可以产生p-GlcNAc/纤维素杂交物，杂交物改进了纸制品的湿拉力。类似于棉花，一个氧化棉培养基能被有一扁平带状的脱乙酰基p-GlcNAc链密切接近。这种接近最大限度地增加了范德华力的贡献，这种力促进了吸附作用，增加了杂交的p-GlcNAc-纤维素材料的湿拉力。

按规定的结构控制薄膜或基质的平均孔径可以制成p-GlcNAc薄膜和三维p-GlcNAc基质。在薄膜和基质形成之前，能通过改变所用的p-GlcNAc材料的用量和加入某些溶剂如甲醇或乙醇来控制它们的孔径，乙醇是优选的，大约5-40％的含量。通常使用溶剂的百分数越大，形成的平均孔径将越小。在下面15节中叙述的例子说明了多孔p-GlcNAc的结构特征和合成方法。

5.6用途

本发明的p-GlcNAc及它的脱乙酰基衍生物如在上面5.4中叙述的衍生物，5.5节叙述过的再成型物有各种用途。例如，本发明的分子无毒、无热性、可生物降解、生物兼容的性质。除在此所说的p-GlcNAc和它的衍生物的有利的性质外，它们还可用于另外许多领域，如农业、整容业、生物医学工业、动物营养和健康、食品、化学、摄影和药物工业。

5.6.1p-GlcNAc材料的生物医学用途

5.6.1.1药物的固定/释放

p-GlcNAc材料的生物医学用途可以包括如酶和/或药物的固定位和释放的方法。例如，本发明的p-GlcNAc和它的衍生物可以有如上面5.4所述的以共价键与它们连接的感兴趣的肽(如生长因子)。含p-GlcNAc的肽可以按本领域的技术人员熟知的常规方法给病人用药。方法包括不限于注射、植入、关节镜检查、腹腔镜检查等手段。含p-GlcNAc的肽引入病人体内，本发明的p-GlcNAc生物降解，这样所连接的肽逐渐释放到病人的血液中，这样提供了一个控制药物释放的方法。

可预知脱乙酰基或部分脱乙酰基的p-GlcNAc类生物降解的速度。例如脱乙酰基的百分基率影响p-GlcNAc类的降解率。通常，较高的脱乙酰基百分率将有较快的速率生物降解力和再吸收。这样，p-GlcNAc生物降解程度和在体内再吸收的速率被控制于p-GlcNAc制造过程。这p-GlcNAc材料的生产和特性叙述于后面第18节中。具有可控的生物降解速度的p-GlcNAc材料可以被制成薄膜、凝胶、海绵、微球、纤维等等。这些p-GlcNAc产物粘附于软的和硬的组织上，并对其产生影响，在人体中不需要缝合。这p-GlcNAc材料可以被用在一个一般的或最小侵袭性手术，例腹腔镜检查。

可控制生物降解速率的p-GlcNAc材料是有用的，如促进出血组织、器官和血管的止血，对牙周手术后修复过程中分离软、硬组织提供牙周屏障，提供外科填充剂，促进软组织的增生，特别是减少皮肤皱纹，增强尿括约肌控制尿失禁。在下面19节描述的例子证实使用p-GlcNAc材料可促进止血。

另外，本发明的分子可以作为缓释药物的转运赋形剂，对有兴趣的药物用p-GlcNAc或衍生物做成胶丸。可以生产一个药/p-GlcNAc胶丸。如上面5.3.2节所述的化学/生物学纯化方法的酸处理/中和法变异的改进。不升高p-GlcNAc溶液的pH值至接近中性pH范围(例如7.4)在p-GlcNAc纯化完全后，通过升高pH值到接近9.0可以造成一个碱性环境。当在碱性pH条件下，本发明的p-GlcNAc或它的衍生物超过三维或“开放”构型。当pH较低时，分子的构造转为更紧密。这样感兴趣的药被加到一个高pH条件下，一个p-GlcNAc中，然后这p-GlcNAc/药悬浮剂的pH下降，从而，感兴趣的药进入一个p-GlcNAc基质的“陷阱”或胶丸中。

这样p-GlcNAc胶丸用本领域技术人员熟知的技术给病人用法，结果，当胶丸的p-GlcNAc降解时，胶丸包着的药被慢慢释放到病人体内。

作为治疗药的释放体系p-GlcNAc凝胶和薄膜有多种用法。这些用法包括用作抗肿瘤药释放体系，在此所述的释放体系用于任何抗肿瘤药都是可行的。这些药是为本领域技术人员熟知的，可以配制进入p-GlcNAc凝胶或薄膜中，如将缓释制剂直接放入肿瘤或手术后的瘤腔中。如此恒定的缓释p-GlcNAc药产品能作为术后一个重要的初期防御过程。这样的p-GlcNAc抗肿瘤药缓释系统尤其是用于经手术完全或部分不能达到的肿瘤，例如某些脑肿瘤。另外p-GlcNAc抗肿瘤系统的目标包括(但不限于)皮肤、肠胃道、胰腺、肺、乳房、泌尿系肿瘤和爱滋病病毒有关的卡泼斯肉瘤。

放疗增敏剂的抗癌药是优选的，例如替代手术或手术后被指定放疗处理的药物，这些药物包括5-氟脲嘧啶、丝裂霉素、顺铂和它的衍生物、紫杉醇、阿霉素、放线菌素、博来霉素、正定霉素和间霉素。

抗肿瘤药的剂量范围可较低于、等于或较大于系统治疗病人规定的经典的一天剂量。药物输送到肿瘤局部可以耐受较高剂量。因此，其它组织包括血细胞不易遭受这些药物的影响。这些药物剂量是本领域技术人员熟知的。剂量可用本领域技术人员熟知的规范技术常规测定，例如述于本节结尾处。

此外，本发明中的p-GlcNAc/药物释放系统可用于治疗感染。在应用上，无论是水溶性或水不溶性的抗菌素，均可固定化/配制于含p-GlcNAc为基质的材料中，如胶和膜。抗菌素系为本领域技术人员所熟知的，例如包括青霉素、头孢菌素、四环素、氨苄青霉素、金丝菌素、杆菌肽素、氯霉素、环丝氨酸、红霉素、庆大霉素、短杆菌肽、卡那霉素、新霉素、链霉素、妥布霉素和万古霉素。这些药物的剂量是本领域技术人员所熟知的，可利用所熟知的标准技术常规地测定，例如下面在本节后一部分介绍的那些方法。

该p-GlcNAc抗菌素产物可用于治疗细菌感染，包括既发生于外部的感染，如皮肤、头皮、皮肤溃疡或眼睛，又包括发生于内部的感染，如大脑、肌肉、腹部的局部感染。一种重要的应用是治疗HIV相关的机会致病(opportunistic)感染。

本发明中的p-GlcNAc/药物释放系统可与抗炎药物配制以控制炎症和免疫过程中的机能障碍。例如，p-GlcNAc可与非甾体抗炎药配制，用于减轻由类风湿关节炎、骨关节炎和系统性狼疮等疾病引起的局部疼痛和炎症。利用本发明中的p-GlcNAc胶或膜/药物释放系统局部释放这些非甾体抗炎药，可降低非甾体抗炎药的副作用，包括胃刺激，氮血症、血小板功能失调和肝功异常。非甾体抗炎药系为本领域技术人员所熟知的，包括环氧化酶抑制剂，如阿斯匹林、依托的拉克(etodolac)、苯氧基氢化阿托酸和萘普生。其它抗炎药也可用作为本发明中的p-GlcNAc/药物释放系统的一部分，例如脂质炎症调节剂的抑制剂，如白三烯。这些药物的剂量是本领域技术人员所熟知的，可利用所熟知的标准技术常规地测定，例如下面在本节最后介绍的那些技术。

本发明中的p-GlcNAc药物释放系统，还可用上述描述的技术与抗真菌剂配制，治疗由真菌引起的疾病。抗真菌剂系为本领域技术人员所熟知的，包括如二性霉素、茴香霉素、抗真菌酮(antifungone)、芽生菌素、灰黄霉素和制霉菌素。这些药物的剂量是本领域技术人员所熟知的，可利用所熟知的标准技术常规地测定，例如下面在本节后一部分介绍的那些技术。

本发明中的p-GlcNAc/药物释放系统，利用上面描述的技术，也可与抗原生动物剂配制，治疗原生动物引起的感染。抗原生动物剂系为本领域技术人员所熟知的，例如包括抗阿米巴药、曲古霉素、抗原虫菌素、单霉素和巴龙霉素。这些药物的剂量是本领域技术人员所熟知的，可利用所熟知的标准技术常规地测定，例如下面在本节后一部分介绍的那些技术。

本发明中的p-GlcNAc药物释放系统，利用上面描述的技术，可与杀精子化合物配制，生成有效的避孕药。适宜的杀精子药是本领域技术人员所熟知的。这些杀精子药物的剂量也是本领域技术人员所熟知的，可利用所熟知的标准技术常规地测定，例如下面在本节后一部分介绍的那些技术。

本发明中的p-GlcNAc药物释放系统，可进一步与具有治疗作用的蛋白质药物配制。利用上面描述的技术可获得配方。利用这种p-GlcNAc治疗蛋白质系统，可将特殊的蛋白质直接释放于期望达到的靶位，在该位使蛋白质缓慢释放。可用的蛋白质的实例包括胰岛素，单克隆抗体，乳腺癌免疫毒素，肿瘤坏死因子，干扰素，人生长激素，淋巴因子，克隆刺激因子，白介素和人血清白蛋白，但不限于此。这些治疗作用的蛋白质药物剂量为本领域技术人员所熟知的，可利用所熟知的标准技术常规地测定，例如下面在本节后一部分介绍的那些技术。

因为本发明中的p-GlcNAc材料本身是免疫中性的，它们不能引起人免疫反应，上述描述的p-GlcNAc装置，包括p-GlcNAc膜和包含固定化药物的三维多孔基质和/或胶，该装置能以无免疫反应的方式释放药物。一些其它的材料，例如天然的藻酸盐和合成高分子，在某些情况下也可用来与p-GlcNAc材料组合建造这种装置。

上述描述的任一药物或药剂的有效治疗剂量，连同在此描述的含p-GlcNAc为基质的系统，可用本领域技术人员所熟知的技术，常规地测定。有效治疗剂量系指在此描述的，产生症状过程或疾病得到充分改善所需化合物的量。

药物的毒性和治疗效价，可通过标准的药学方法在细胞培养或实验动物上测定，即测定LD₅₀(对50％群体的致死剂量)和ED₅₀(50％群体的有效治疗剂量)。毒性和治疗作用的剂量之比为治疗指数，可表示为LD₅₀/ED₅₀之比。显示出大的治疗指数的化合物是优选的。而显示出毒副作用的化合物也可使用，必须小心设计释放系统，使这类化合物靶向于受感染的部位，以减少对未感染细胞潜在的伤害，因此减少了副作用。

从细胞培养试验和动物研究获得的数据，可用于配制人用剂量的范围。这些化合物的剂量最好落于微毒或无毒的，包括了ED₅₀的通用浓度中。剂量可变范围依赖于使用的剂型和给药途径。在本发明的方法中所用的任一化合物，其有效治疗剂量开始可从细胞培养试验中估算。在动物模型中可配制剂量，以获得通用的，包括了IC₅₀(即达到症状的最大抑制的一半时，测试化合物的浓度)的血浆浓度范围，其测定方法与细胞培养实验中相同。该方法可用来更准确地测定有用的人用剂量。例如可用高效液相色谱测定血浆水平。

5.6.1.2.p-GlcNAc细胞包囊化用途

可将p-GlcNAc包囊化细胞配制，并通过本领域技术人员所熟知的标准技术让病人服用。例如，见上面5.6.1.2.节描述的服用技术。又可见Aebisher等(Aebisher，P.et al.，in“Fundamentals of Animal Cell Encapsulation andImmobilization”，1993，CRC Press，pp.197-224)。此文献并入本发明作为整体参考文献。可通过或在p-GlcNAc，或部分脱乙酰化的p-GlcNAc膜，三维p-GlcNAc多孔基质，或p-GlcNAc胶内，使细胞包囊化。

三维基质可埋植于细胞内，不需进一步包囊化而用于某种目的。或者，细胞可被包囊于含p-GlcNAc基质的高分子胶制成的中心球或小滴上，例如乳酸化p-GlcNAc高分子电解质聚合物(一种多阳离子型聚合物)。在胶、小滴或中心球内部，细胞埋藏于中。然后再用第二种带相反电荷的高分子电解质(即用多阴离子，例如藻酸盐)覆盖，形成一层外囊，得到免疫隔离的包囊化细胞，由此降低了宿主生物引起的免疫排斥的危险。

此外，细胞包埋于p-GlcNAc胶，三维p-GlcNAc基质或两者之中，可装入热塑型胶囊中，构成另一种配制方法。也可用热塑型胶囊，使埋植于宿主生物的细胞获得免疫保护作用。该热塑型胶囊由诸如羟乙基甲基丙烯酸酯，甲基丙烯酸甲酯(HEMA-MMA)共聚物所制成。例如，通过将HEMA-MMA的聚乙烯乙二醇溶液和含细胞的p-GlcNAc基质和/或胶介质一起挤进一种合适的有机溶剂，例如十六烷中，可制成热塑性微胶囊。例如，可参见Aebisher等描述的方法(Aebisher，P.et al.，in“Fundamentals of Animal Cell Encapsulationand Immobilization”，1993，CRC Press，pp.197-224)。

p-GlcNAc细胞包囊化具有广泛的用途。首先它们可用来释放具有治疗作用的化合物，该合成化合物被埋藏于细胞中，连结并包囊于膜，基质或胶上。例如，p-GlcNAc/细胞包囊化可用于释放胰岛素以治疗糖尿病，释放神经生长因子以治疗阿尔茨海默氏疾病，第八因子和其它凝血因子以治疗血友病，释放多巴胺以治疗帕金森氏疾病，释放通过肾上腺嗜铬细胞的脑啡肽以治疗慢性疼痛，释放抗营养不良药(dystrophin)以治疗肌营养不良，以及释放人生长因子以治疗不正常生长。列举的例子不限于此。

此外，由于本发明中的p-GlcNAc材料本身是免疫中性的，它们不诱发人的免疫反应，因此可设计和建造包括由p-GlcNAc膜，三维多孔p-GlcNAc基质和/或p-GlcNAc胶组成的装置，它包含着连结的多个细胞，能释放含细胞的治疗药，而这些细胞具有免疫隔离性，即不会引起抗细胞的宿主免疫反应。除了p-GlcNAc材料本身以外，某些其它的材料，例如天然的藻酸盐和合成的高分子，也可用来建造这种装置。

p-GlcNAc/细胞包囊化组合物还可用来将细胞释放以促使组织再生。将特殊的细胞类型包囊化后，在受损部位可促进细胞生长，促使组织再生。其应用包括皮肤、软骨、神经、骨、肝和血管，但不限于此。细胞包囊于p-GlcNAc材料中以促使组织再生的这种应用是具有优点的，部分因为p-GlcNAc材料能粘附于受损组织，为人细胞生长提供一种底物，进行生物再吸收，在受损部位组织再生过程中同时伴随着新的健康组织的生长。实例包括皮肤、骨、软骨、肝、腱和韧带组织的再生，但不限于此。

5.6.1.3.用p-GlcNAc材料预防手术后粘连

另外，可利用p-GlcNAc膜作为一种生物可降解的，生物可相容的机械屏障，以防止手术后的粘连。下面的17节中的实例表示了p-GlcNAc的应用之一。配制成膜或纱布中的固态p-GlcNAc或p-GlcNAc衍生物，可用于这一目的。优选的膜是薄的，一般厚度小于1mm。优选的p-GlcNAc衍生物是约50-80％脱乙酰化的。该p-GlcNAc衍生物在植入后约7-21天一般即被再吸收。

液态的p-GlcNAc衍生物也适用于预防手术后粘连。用于这一目的的优选的液态p-GlcNAc衍生物为脱乙酰化的p-GlcNAc盐类衍生物和羧甲基p-GlcNAc衍生物。对于预防手术后粘连特别优选的p-GlcNAc衍生物是p-GlcNAc乳酸酯衍生物，特别是一种p-GlcNAc乳酸酯胶衍生物。按照诸如17.1节描述的方法，利用丙二醇如水，可配制这种p-GlcNAc乳酸酯衍生物。可制成高和低粘度的p-GlcNAc乳酸酯衍生物，使之能够做成用于特殊指征的p-GlcNAc。例如，具有低粘度的p-GlcNAc产品是很有用的，可用注射器或喷雾器来释放。而当适用范围是矫形外科时，具有高粘度的p-GlcNAc产品也合乎需要，它具有更高的润滑性能。

对预防手术后粘连，固态的p-GlcNAc配方适用于创面清晰的位置。该p-GlcNAc配方应该按照外科手术步骤来应用，材料也应完全覆盖于受伤组织。它也既可与一般的外科手术，又可与最小限度侵害性的外科手术(如腹腔镜检查)结合使用。利用本领域技术人员所熟知的标准外科手术步骤和仪器，固态p-GlcNAc配方可被切割使用。

为预防手术后粘连，液态p-GlcNAc配方能用于更大的面积上。例如，p-GlcNAc乳酸酯胶可在手术前使用，可保持另外的润滑作用，这样就减少了受伤组织的量。或者，该液态p-GlcNAc配方，例如p-GlcNAc乳酸酯，可按外科手术要求使用，形成防止手术后粘连的物理屏障。

p-GlcNAc材料可着色，从注射器中喷涂或滴于受伤部位。例如，在腹腔镜检时，低粘度的材料可用标准的抽吸冲洗器释放出来，使高粘度的材料释放至靶部位需要压力。该压力可通过压缩气体动力活塞或注射器之类的装置来获得。

用来防止手术后粘连所需的液态p-GlcNAc配方的量，例如p-GlcNAc乳酸酯胶配方，与受伤组织的程度成正比。所用p-GlcNAc材料应在每平方厘米表面积0.1ml到1.5ml。

5.6.1.4.p-GlcNAc材料的其它生物医学用途

p-GlcNAc材料的其它生物医学用途，包括如利用该材料作为细胞培养的底物。例如，象下面第12节所述的实例，本发明中的p-GlcNAc可作为哺乳类动物细胞培养的一种很有效的底物，更进一步地，三维构型的p-GlcNAc可作为促进三维培养细胞生长的一种中间成分。

本发明中p-GlcNAc能作为细胞培养的底物这种性能也可以用于体内。正如这里所描述的，本发明中的p-GlcNAc或其衍生物，可促进组织的再生(例如，在牙床线附近包含牙齿的连结组织的再生、血管移植物、韧带、腱、软骨、骨、皮肤及神经组织的再生)。因此，本发明中的p-GlcNAc分子，例如在整形外科中，具有广泛的用途。

对于用作为血管移植物的密封剂，脱乙酰化的p-GlcNAc是优选的。作为组织再生剂，脱乙酰化的p-GlcNAc衍生物，例如N-羧甲基和N-羧丁基脱乙酰化p-GlcNAc是优选的。例如，N-羧甲基脱乙酰化p-GlcNAc可移植于角膜以诱导新血管的形成。

本发明中的p-GlcNAc或其衍生物的其它生物医学用途，正如这里所描述的，可涉及到伤口的包裹，伤口愈合用的软膏以及外科缝线，沙布等用途。

这些用途可进一步用于，例如治疗骨关节炎，用于降低血清胆固醇水平，作为抗病毒药，作用抗菌药，作为免疫调节剂，作为抗凝剂，作为透析和超滤膜，作为抗肿瘤药，作为接触透镜材料和作为肾衰病人清除血中的(iremic)毒素的口服吸附剂。例如通过直接注入至关节炎症部位，微晶状p-GlcNAc悬浮剂或水溶性p-GlcNAc衍生物对于治疗关节炎是优选的。

p-GlcNAc还可另用作为人造或供体皮肤的成份。例如，p-GlcNAc，最好是p-GlcNAc无纺膜，可用来使供体皮肤变薄。

与蛋白酶例如胃蛋白酶相联的脱乙酰化p-GlcNAc，可被用于调控与该p-GlcNAc/蛋白酶化合物相关的蛋白酶的消化作用。

对本发明中的p-GlcNAc或其衍生物作某些衍生化，可优选用于特殊目的(衍生化作用参见上述5.4节所描述)。例如，硫酸化、磷酸化和/或硝酸化的p-GlcNAc衍生物，可优选作为抗凝剂，或作为脂蛋白脂酶的激活剂。N-酰化p-GlcNAc衍生物也可优选作为抗凝剂，也可优选作为诸如制备人造血管，抗病毒化合物，抗肿瘤(特别是癌细胞聚集化合物)，透析和超滤膜，以及制造控释药物释放系统。O-烷基化的p-GlcNAc和其脱乙酰化衍生物，也可被优选用作制造控释药物释放系统。N-烷基化的p-GlcNAc衍生物可优选作为抗菌剂。氧化脱氨化衍生物可优选作为抗癌药，特别是用在与癌细胞免疫治疗方面。脱乙酰化的p-GlcNAc衍生物，可优选作为伤口愈合剂。N-亚烷基和N-芳亚烷基p-GlcNAc衍生物，可优选作为酶的固定化。

5.6.2.p-GlcNAc材料在农业上的用途

本发明中的p-GlcNAc或其衍生物，也可用于各种农业目的。该应用包括杀虫剂、杀真菌剂、杀菌剂和杀线虫剂，但不限于此。N-羧甲基脱乙酰化p-GlcNAc衍生物，可优选作为有效的抑菌剂。N-烷基化p-GlcNAc衍生物可优选作为杀真菌剂。该发明的分子可用于各种土壤处理方面，包括肥料组合物，但并不限于此。此外，可按照本节前面所描述的固定化，包囊化和其它方法，使农用化学品包埋起来，达到控释目的。另外，根瘤菌属小结形成因子的类似物和/或固氮诱导物，可通过本发明中的p-GlcNAc和/或其衍生物来固定化或施用。

5.6.3.p-GlcNAc材料在营养/食品工业上用途

这里所描述的本发明中的p-GlcNAc和其衍生物，还应用在动物和人类营养领域。例如，本发明中的分子可用为食物成分。在本节前面所描述的那些技术，可用于生产动物用控释产品。此外，通过对本领域技术人员所熟知的常规的改良技术的引进，上面描述的生物医学用途也能用于动物。

本发明中的p-GlcNAc及其衍生物，在食品工业上的应用，正如在此描述的，可包括抗胆固醇药(即低胆固醇化合物)，结合于脂肪的化合物、乳化剂、载体、防腐剂、调味品、和食用织物(food texturizers)，此外还包括水果覆膜剂和食品包装产品，但不限于此。

5.6.4.p-GlcNAc材料在化妆品中的应用

本发明中的p-GlcNAc在化妆品中的应用，可包括生产头发用和皮肤用产品，但不限于此。例如，皮肤用产品可包括用脱乙酰化p-GlcNAc盐，含羧甲基p-GlcNAc产品生产的化妆品，和含脱乙酰化p-GlcNAc及其衍生物如羟丙基，N-琥珀酰基和季p-GlcNAc衍生物的化妆盒。例如，头发用产品可包括含羧甲基p-GlcNAc产品，以及可成膜的p-GlcNAc衍生物。

5.6.5.p-GlcNAc材料在化工中的应用

本发明中的p-GlcNAc及其衍生物，在化工中具有许多有用的用途。例如，p-GlcNAc可用作为偶联剂，将金属联结于高分子上，由乙二醇p-GlcNAc形成的膜，可用于脱盐化作用，而由其它p-GlcNAc所形成的膜，可用于转运卤离子。其它方面的应用包括生产阻燃产品，制造金属螯合物，和从液体及水溶性工业污染物，如PCBs，除去痕量和重金属离子的化合物。p-GlcNAc和/或其衍生物可用于照像工业中。例如，p-GlcNAc和/或其衍生物具有的螯合金属例如卤化银的能力，通过浸入显影液使其能用于再镶边，例如含p-GlcNAc和/或其衍生物的薄膜的边。

6.实施例：纯p-GlcNAc制剂的物理性质

在本实施例中提出了p-GlcNAc和脱乙酰化p-GlcNAc膜的圆二色谱(CD)和红外光谱(IR)分析。

6.1.材料与方法

p-GlcNAc和商品“壳多糖”制备：

用于CD研究的p-GlcNAc，按5.3.1.节描述的机械力纯化法制备。

商品“壳多糖”购于加拿大Novachem公司(Novachem，Ltd.，PO Box 1030Armdale，Halifax，Nova Scotia，Canada，B3L 4K9)。

用于IR研究的p-GlcNAc膜或按照5.3.1节描述的机械力纯化法制备，或按照5.3.2节介绍的化学/生物纯化法制备。商品“p-GlcNAc”制剂可通过溶于含5％氯化锂的二甲基乙酰胺溶液，再分层浸于去离子蒸馏水中，直至膜沉淀这种方法制成膜。

p-GlcNAc衍生物及处理方法：用于CD和IR研究的脱乙酰化p-GlcNAc，系通过将p-GlcNAc用50％氢氧化钠，于60℃处理2小时的方法制取。用于IR研究的去热p-GlcNAc膜，系通过在0.2mM EDTA中煮沸3分钟使之改变的方法制取。压热p-GlcNAc系由122℃，30分钟压热处理法制取。

CD技术：固态技术基本参照Domard法进行(Domard，A.，1986，Int.J.Macromol.8：243-246)。

6.2结果

6.2.1CD分析

在未经处理的p-GlcNAc(图3A)的CD光谱上，由于p-GlcNAc上的乙酰基上存在羰基，因此观察到所预期的n-π*和π-π*光活电子激发态(220-185nm)。在脱乙酰p-GlcNAc产品上，如图所示，该峰则完全消失。

6.2.2.IR光谱分析

该研究所获的IR光谱，与p-GlcNAc化学结构完全一致。此外，每个IR谱峰的明确归属，表明在p-GlcNAc纤维上存在着有序和规则的(即假晶形体)结构。图4A为由机械力纯化法纯化的p-GlcNAc IR谱；图4B为商品“壳多糖”制剂的IR光谱。

从压热p-GlcNAc材料获得的IR光谱(图4E)与图4A所示红外光谱并无明显差异。该资料表明，通过压热使p-GlcNAc材料消毒，而其原有的高分子结构不会丧失。

7.实施例：用机械力纯化法纯化p-GlcNAc

本节中，利用5.3.1.节描述的机械力技术纯化p-GlcNAc。

7.1材料和方法/结果

硅藻培养条件：硅藻种属为fluviatilis海链藻，按照5.1和5.2节描述的方法，培养生长。

SEM方法：在此使用的SEM技术，与下面12.1节描述的相同。

p-GlcNAc纯化步骤：用5.3.1节描述的机械力技术，从硅藻培养物中纯化p-GlcNAc。特别是，从硅藻细胞体中分离p-GlcNAc纤维，是通过将培养内容物注入含三次间歇高速混合运动的一个搅拌器中进行的。三次间歇运动的总时间约为一秒种。所得悬浮物在Sorvall GS-4型固定角转子上离心20分钟，温度为10℃，转速为3500rpm。倾出上清液，再次于10℃离心20分钟，转速为4000rpm。再一次将上清液倾去，在10℃离心，转速为4000rpm。第三次离心所得上清液是澄清的，或仅为极少的絮状物漂浮于溶液中。将澄清的上清液倒入装有0.8μm孔径的硝基纤维素布氏过滤器中，吸滤，将纤维悬浮物从液体中滤出，收集于膜上。用1升去离子蒸馏水于70℃洗涤。当水排净后，于70℃用1N盐酸1升吸滤洗涤。当大部分酸液排出后，再于70℃，用1升去离子蒸馏水吸滤洗涤。当大部分水排出后，用1升95％乙醇于室温洗涤纤维，以真空抽吸。收集滤膜及其附于该膜上的白色纤维膜，从过滤器中取出，在干燥箱中于20℃干燥20分钟，再置于干燥器中16小时。

按照这一纯化步骤，从1000ml培养物中p-GlcNAc的产率为，每升硅藻培养物得6.85毫克。用该技术收集得p-GlcNAc纤维所制成的膜，其SEM照相如图6A-6B所示。

8.实施例：用生物/化学纯化技术纯化p-GlcNAc

本节利用5.3.2节所描述的化学/生物两种技术纯化p-GlcNAc。笼统地说，第一种技术是用氢氟酸处理纯化p-GlcNAc，另一种技术是通过酸处理/中和来纯化。

8.1材料与方法/结果

硅藻培养条件：硅藻种属为fluviatilis海链藻，按5.1和5.2节描述的方法培养生长。

SEM方法：该研究所使用的技术，系用下面12.1节所描述的方法。

纯化步骤：首先将p-GlcNAc用氢氟酸处理纯化，结果见图7A-7B。具体地，在一通风柜中，于室温将2.42ml 49％(29N)HF溶液加至硅藻培养物中，使每1000ml原培养物体积，得0.07M HF溶液。将混合物激烈振荡约30秒钟，使液体产生持久的泡沫。将内容物静置5-6小时，使重的颗粒沉降。最后形成一层泡沫，而液体本身分为两层：首先为一层窄的，深绿层沉于容器底部，另一层为浅灰绿色的不透明层，约占液体全部体积的85-90％。将泡沫层小心地用一毛细玻管和真空抽吸吸去。再将灰雾状上清液吸去，并转移到另一塑料容器中。注意不要破坏深色的底层，该层主要含沉淀的细胞体。将灰雾状上清液静置16小时。该溶液最初几乎是无色，浅灰的，但不透明。16小时后，液面留有少量的泡沫，少量的绿色物质沉淀于容器的底部。该液体色淡，但仍不透明。将液面的泡沫照前面的方法吸去。再将主要的液体小心地吸出，留下少量绿色物质沉于容器的底部。照此分离的液体，含有大量的p-GlcNAc纤维和一些杂质。

为除去前步从含纤维液体中所带的蛋白质和其它由硅藻释放的无用物质，用十二烷基硫酸钠(SDS)洗涤纤维悬浮液和细胞残留物。具体是，将一定体积的20％SDS溶液，加至溶液中，使最后所得溶液含0.5％SDS。将该溶液密封于容器之中，以水平位置放在振荡器中，于每分钟100次搅动24小时。振荡一开始，大量白色p-GlcNAc纤维絮状物出现于悬浮液中，并有大量的泡沫聚集于容器的上部。洗涤结束后，将内容物转移到装有一个0.8μm滤膜(Gelman产，Supor过滤器)的布氏过滤装置中。将该液体经吸滤过滤，在滤膜上收集所得到的p-GlcNAc纤维。

将收集于滤膜上的p-GlcNAc纤维进一步洗涤。首先，将纤维用相当于原悬浮液体积三倍的热的(70℃)去离子蒸馏水洗涤。利用去离子蒸馏水的水流，将收集于布氏过滤器的滤膜上的白色纤维凝块，转移至搅拌器中，用约10次短的间歇搅动使块状纤维松散。将松散的纤维悬浮液转移至前述的含硝基纤维素滤膜的布氏过滤漏斗中，抽滤除去液体。将收集的纤维用1000ml热的(70℃)1N盐酸溶液洗涤，再进一步用1000ml热的(70℃)去离心蒸馏水洗涤。最后于室温用1000ml95％乙醇洗涤纤维，过滤至干。纤维膜及下面的滤膜于58℃在干燥炉中干燥20分钟。再置于干燥器中16小时。再将纤维膜小心地从滤膜上剥离。

第二种纯化p-GlcNAc的方法，是按照5.3.2节所描述的，用酸处理/中和的方法，具体是，将p-GlcNAc按本节前面所述方法处理，直至用SDS洗涤一步之前，此时加入2.9M Tris溶液，将溶液中和至pH约7.0。用这种方法纯化的p-GlcNAc的产率是，每升硅藻培养物得20.20毫克。平均每升硅藻培养物可获约60毫克产品。纯化过程的SEM显微照片于图8A-8B和9A-9E所示。

9.实施例：p-GlcNAc脱乙酰化

将p-GlcNAc膜悬浮于50％氢氧化钠溶液中，于80℃加热2小时。将所得脱乙酰化膜干燥，按图11A-11B所示扫描电子显微术进行研究。

10.实施例：p-GlcNAc生物相容性

在本实施例中，试验证明未检测出本发明中的p-GlcNAc显示出生物反应性。试验包括洗脱试验、在兔肌内的埋植试验、给兔皮内注射试验以及小鼠全身注射试验。

10.1.材料与方法

10.1.1.洗脱试验

洗脱试验的条件，遵照美国药典XXII版，1990年，第1415至1497页和美国药典XXII版，补编5，1990年，第2702至2703页的规定。

细胞培养：用鼠成纤维细胞L929细胞株(American Type CultureCollection Rockville，MD；ATCC No.CCL1；NCTC colone 929)。在全最小基本介质(MEM)中，将融合单层L929细胞繁殖24小时。

p-GlcNAc：按5.3.1节机械力纯化法制备p-GlcNAc固态膜，并按美国药典XXII II(1990)版的要求，用20ml加血清MEM提取。

对照组：用天然橡胶作为正对照，用硅烷作为负对照。按相同的条件，用p-GlcNAc作为测试项目进行实验。

提取物：于37℃，在24小时内于含5％二氧化碳湿润空气中制备提取物。通过pH的变化评价提取物，调节pH在原介质pH的+/-0.2单位范围内。用盐酸降低提取物的pH，用碳酸氢钠升高提取物的pH。在用于细胞单层之前，将提取物通过0.22微米的滤膜进行过滤消毒。

剂量：用3ml p-GlcNAc或对照提取物，代替细胞培养的介质。所有提取物均重复测试。

评价标准：目测或在显微镜下评价细胞单层的应答。生物活性，即细胞变性和/或畸形，按下面描述的0到4记分，进行评价。如果对于负对照项未观察到细胞反应(评分0)，而正对照项显示比轻度反应(评分2)更高，则试验系统是合适的。如果用测试项(即p-GlcNAc)处理的培养物不显出比轻度反应更高的特性，那么测试项即符合生物相容性试验。

10.1.2.肌内埋植

动物：用健康的，新西兰白兔，雄和雌性(Eastern Rabbit BreedingLaboratory，Taunton，MA)。用悬挂的不锈钢笼子，单独饲养白兔。按照试验的相同条件，收到动物后置于隔离区内8天。用硬木薄片(Sani-Chips^TM，J.P.Murphy Forest Products，Montvale，NJ)作为笼内非接触的栖歇物。动物设施内维持68±3°F，相对湿度30-70％，至少每小时进行10-13次完全的空气交换，用全谱荧光灯提供12小时白昼与黑昼变化。用市售的食物在一定的要求(Agway Prolab，Waverly NY)和市政自来水，饲养动物。在食物、栖歇物或水中不存在可干扰测试结果的已知污染物。从大量的动物中选择所研究的动物。每只兔约重10g，并经耳纹检查。

p-GlcNAc：所用的p-GlcNAc如10.1.1.节所描述。

埋植试验：每个埋植试验使用二只兔。试验当日，剪去动物身上脊柱两侧的毛。每只动物均经麻醉，以防肌肉运动。用消毒的皮针和通管丝，将四条测试的p-GlcNAc(1mm×1mm×10mm)埋植于每只兔脊柱一侧的脊柱旁肌上(即平行于脊柱，离中线2.5到5cm，每条相隔2.5cm)。类似此方式，两条USP负对照的塑料RS(1mm×1mm×10mm)埋植于每只动物相反一侧肌肉上。让动物维持这一状态7天，在观察期结束，将动物称重，并注射巴比妥盐，安乐剂-5(Veterinary Laboratories，Inc.，Lenexa，KS)让其安乐死。保证充足的时间，以便切割组织时不出血。用放大镜检查围绕每个埋植条中心部分的组织区域。用下面的记分方法评定出血，坏死，变色和感染情况：0等于正常，1等于轻微，2等于中度，和3等于重度。如存在包囊化，可通过先量胶囊(即埋植边缘至胶囊边缘的距离)，四舍五入至0.1mm，来评分。包囊化评分如下：

计算p-GlcNAc平均分数与正对照项之间的差别。如果对每只兔，p-GlcNAc每项生物反应的平均分数，与正对照塑料埋植部位的差异不超过1.0，则试验就被认作为负结果的；或者，每个p-GlcNAc项的所有类生物反应的平均得分，与所有正对照塑料埋植部位的平均得分之间的差异不超过1.0，即不超过四条p-GlcNAc之一组，也被认为是负结果。

10.1.3.皮内注射

动物：用新西兰白兔，处理方法同10.1.2节。

p-GlcNAc：按照5.3.1节描述的机械力纯化法制备固态p-GlcNAc膜，并置于一个提取烧瓶中，加入20ml合适的溶媒。加热至70℃进行24小时提取。按照下面的步骤，将提取物冷至室温。在用前激烈振摇每只提取瓶。

皮内试剂：试验当天，剪去动物两边的毛。对每一p-GlcNAc提取物，取其0.2ml皮下注射至每只兔每侧的五个部位。每只兔均使用一次以上的p-GlcNAc提取物。在每只兔另一侧的五个位置，注入0.2ml对照物。于注射后24、48和72小时，观察注射部位红斑，水肿和坏死情况。按照Draize评分法，评定皮肤反应(美国药典XXII II版，1990年，第1497至1500页；美国药典XXII II版，补编5，1991年，第2703至2705页)，见下面表II所示：

表II

评定皮肤反应的Draize计分法

在24，48和72小时，分别计算红斑和水肿得分总数，并用12除(即2只动物乘以3个计分段，再乘以2种记分项)，以测定p-GlcNAc对相应对照组的总平均得分。观察后称重动物，并注射巴比妥盐，安乐剂-5(Veterinary Laboratories，Inc.，Lenexa，KS)使其安乐死。如果p-GlcNAc和对照组平均反应的分数的差别(红斑/水肿)为1.0或更少，试验的结果即满足要求。

10.1.4.全身注射

动物：用Albino Swiss小鼠(Mus musculus)，雌性(Charles RiverBreeding Laboratories Wilmington，MA)。五组小鼠饲养于聚丙烯笼中，装上不锈钢盖子。用硬木薄片(Sani-Chip^TM，J.P.Murphy Forest Products，Montvale，NJ)作为笼中接触性栖歇地。动物设施置于一有限的面积之中，动物房保持68±3°F，相对湿度为30-70％，每小时至少进行10-13次完全空气交换，用全谱荧光灯保持12小时白昼/黑昼。随意用市售食物及市政自来水饲养动物。在食物，栖歇地，或水中不存在可能干扰试验结果的污染物。研究用动物选自大量的动物中。称重小鼠，重量接近于0.1g，并分别在耳边记号以资识别。

p-GlcNAc：所用样品如10.1.1.节所描述。按照10.1.3.节描述的方法制备提取物。

全身注射试验：五组小鼠按下面的途径，以同样的量注射p-GlcNAc提取物，或相应的对照物：

用PEG400制备的p-GlcNAc提取物，以及相应的对照物以0.9％氯化钠稀释，得每毫升含PEG400为200毫克。对静脉注射试验，PEG400以0.9％氯化钠稀释得每毫升含PEG400为120毫克。

于注射后24小时，48小时和72小时，立即观察动物。观察后称重并置于二氧化碳气体中令其安乐死。如果用p-GlcNAc处理的动物不比用对照物处理的动物显示出更大的生物反应性，该试验即满足需要。

10.2.结果

10.2.1.洗脱试验

用目测和显微检查，评价细胞单层对p-GlcNAc试验项目的应答。评价时不使用细胞化学染色。暴露于负对照物或p-GlcNAc48小时后，观察不到细胞生物反应(评分0)。对于正对照物，观察到重度反应(评分4)，如表III所示：

表III

反应等级

因此，本发明中的p-GlcNAc符合生物相容性的洗脱试验的要求，是无细胞毒性的。

10.2.2.肌内埋植

两组受试兔(A和B组)增加了体重，不显示毒性反应。见表IV数据。此外每只兔均无明显的毒性反应。对试验及对照组埋植部位进行肉眼检查，并不显示炎症，包囊化，出血，坏死或变色。结果见表IV。因此，该试验对每只兔，所有p-GlcNAc埋植部位的所有生物反应项目的平均得分，与所有对照埋植部位的所有反应项的平均得分差异，不超过1.0，证明受试的p-GlcNAc不显示生物反应性。

10.2.3.皮内试验

所有动物的体重均增加。见表V数据。对所有的p-GlcNAc或对照项位置，均未观察到红斑或水肿。对所有动物均未观察到明显的毒性反应。由于p-GlcNAc和对照项平均反应得分(红斑/水肿)的差别小于1.0，p-GlcNAc符合皮内试验的要求，结果见表VI。因此，以上试验证实，p-GlcNAc无生物反应性。

10.2.4.全身试验

所有用p-GlcNAc或用对照物提取的小鼠的体重均增加。见表VII内数据。此外，在用p-GlcNAc或对照物的动物身上未观察到明显的毒性反应。见表VI内结果。因此，所有用p-GlcNAc试验的动物与用对照物处理的动物相比，均未显示出更大的生物反应性。

表VII

动物体重与临床观察

*注射后0、4、24、48和72小时观察小结

11.实施例：p-GlcNAc再成型物(Reformulation)

在本节提出的实例中，取p-GlcNAc(16.2毫克)溶于含5％氯化锂的1毫升二甲基乙酰胺溶液中。将含p-GlcNAc的溶液置于一注射器中，再挤入50毫升纯水中，有纤维沉淀出来。将所得纤维按图10A-10B所示用扫描电镜进行研究。

12.实施例：细胞粘附于p-GlcNAc

在本工作实例中，证明p-GlcNAc是细胞粘附和培养生长的一种有效底物。

12.1.材料和方法

细胞：用转型鼠3T3成纤维细胞株，令其生长于添加了胎牛血清(FBS)的DMEM中。

p-GlcNAc膜：按5.3.1和8节描述的方法制备p-GlcNAc。

用一滴水将p-GlcNAc膜粘于带盖的玻璃上，再于121℃压热30分钟。将按此方式制备的膜置于含6块培养板的培养皿中。

细胞计数：计数前先将膜在基质中用新鲜的溶媒(DMEM+10％FBS)清洗，再用胰蛋白酶(10％，37℃，5分钟)处理。然后在介质中直接用血细胞计数器测定细胞数目。

SEM操作条件：用Zeiss 962型仪器，加速电压为10KV，工作距离为15mm。按所述方式，用偏振型55p/n(μ4)进行各种放大观察。样品涂膜：碳膜(100

)和100aupd。

样本的制备：对于首次固定化，将细胞生长培养基用无血清的2％戊二醛伊格尔氏(Eagle’s)DMEM溶液取代。要替换几次，以确保生长培养基完全过渡至固定化。固定化于室温进行，需0.5小时。将滑套(Cover slips)转至另一小瓶中，瓶内含2％戊二醛在0.1M二甲胂酸钠的溶液和0.1M蔗糖溶液，pH值为7.2，将此于室温再固定1.5小时。

脱水，CPD，载片和喷涂：将样品于pH值7.2，用0.1M二甲胂酸钠溶液清洗。将滑套转至一个CPD柄中。在乙醇(30％，50％，75％，85％，95％和3×100％，每次5分钟)中脱水，再将样品在临界点干燥。将滑套在铝钉上载片，用真空蒸发法(@)涂上碳层，并以AuPd喷涂。

12.2.结果

测试p-GlcNAc作为细胞生长培养底物的能力。在有或无p-GlcNAc膜的存在下，使大鼠成纤维细胞生长于培养皿中，每日进行细胞计数以测试培养的可行性。细胞计数的结果见图14。正如所表明的，培养后第五天，仅仅含有p-GlcNAc膜的培养皿能持续维持细胞的生存，表明p-GlcNAc膜能作为培养基中细胞持续生长的有效底物。

此外，图15A-15B中SEM显微照片表明，健康的细胞强有力地粘附于p-GlcNAc膜上。

13.实施例：p-GlcNAc/胶原杂交

本实例介绍p-GlcNAc/胶原杂交材料的形成与表征。

13.1.材料与方法

材料：用I型牛胶原蛋白制备本研究所描述的杂交物。按5.3.2.节所述的机械力方法，制备p-GlcNAc。

杂交物的制备：将胶原蛋白(10毫克/毫升)与p-GlcNAc(0.25毫克/毫升)悬浮物，按不同的比例混合，于液氮(-80℃)中冰冻，于-9℃保温4小时，再冻干。将所得材料于60℃抽真空(约为0.030毫米汞柱)3天，使之热脱水交联。

细胞培养：大鼠3T3成纤维细胞，于胶原/p-GlcNAc杂交物中培养生长。按标准培养步骤进行操作，培养后8天摄制SEM显微照片。

13.2.结果

将胶原蛋白与p-GlcNAc悬浮物按不同的比例(即3∶1、1∶1、2∶2和1∶3)混合，冰冷，冻干与交联。这一步骤可获得胶原：p-GlcNAc片。所得材料的SEM显微照片见图16B-E。图16A代表仅为胶原的对照物。注意杂交物的多孔结构。

本发明中胶原/p-GlcNAc杂交物为细胞的粘附与生长提供了一种有效的结构，如图17A-D SEM显微照片所示。

14.实施例：p-GlcNAc纯制剂的NMR表征

本实施例中提出纯p-GlcNAc制剂的NMR(核磁共振)分析。

14.1.材料与方法

p-GlcNAc制备：用于NMR研究的p-GlcNAc按5.3.2节所述化学纯化法制备，用氢氟酸为化学试剂。

NMR技术：用Bruker 500MH NMR仪，获取固态NMR数据。用计算机显像分析技术处理NMR谱数据，以消除背景干扰和获得正常基线。图18表示这种数据处理的一个例子。如图18所处理后获得的NMR曲线，被用来获取每种碳原子的面积，再以此计算CH₃(面积)与C原子(面积)之比值。该值见图20所示。

14.2.结果

通过测定500毫克p-GlcNAc样品的¹³C-NMR光谱，获得固态NMR数据。典型的NMR谱见图19所示。每个峰代表分子中每个独特的碳原子的谱。通过计算谱图中所有NMR峰的总面积，划分每种碳所产生的峰面积，可以测出分子中每种碳原子所占的相对百分含量。这样，可通过测量一个参照原子来计算分子中每个原子的比例。所有p-GlcNAc分子均由含C1、C2、C3、C4、C5和C6原子的N-乙酰化葡萄糖胺残基所组成。如果高分子聚合物中所有的葡萄糖胺残基均被N-乙酰化，那么，上面N-乙酰基CH₃碳原子的峰面积与任一葡萄糖胺残基中碳原子的峰面积之比，应为1.0。如图20中的数据，可用来获得CH₃(面积)的比值。

图20中的计算的比例值，在实验误差允许范围内，大多数情况下等于或约等于1.0，例如CH₃/C2＝1.097，CH₃/C6＝0.984，CH₃/C5＝1.007，CH₃/C1＝0.886。这些结果与本发明p-GlcNAc材料无污染，且完全被乙酰化这一结论相一致(即基本上100％的葡萄糖胺残基被乙酰化)。

15.特定孔径的三维p-GlcNAc材料的合成与生物学特性

下面描述的是生产具有特定平均孔径的，基于三维p-GlcNAc材料的多孔基质的方法。该基质具有许多重要的用途，例如，特别是作为细胞包囊化的工具。这种细胞包囊化组合物，在基于细胞移植的治疗方面，和细胞与组织工程学方面，如软骨再生，是很有用的。这种很容易改变p-GlcNAc材料的形态和尺度的性能，为扩展本发明中p-GlcNAc材料的潜在的应用，提供了有力的方法。

15.1.材料与方法

p-GlcNAc原料：按5.3.2节所描述的化学纯化法，以氢氟酸为化学试剂，制备p-GlcNAc。

基质的形成：在冻干前，按下面15.2节所列的溶剂，制备含有20毫克p-GlcNAc样品的悬浮液(5毫升)。再将样品倒入组织培养皿中，于-20℃冷冻。将冷冻的样品冻干，再移出所得的具有三维结构的基质。

自旋电子显微技术：所用的方法按12.1节描述的方法。图21A-G所示的是基质材料经200倍放大的图像，每个图中的一个刻度代表200微米。

15.2.结果

按15.1节所述，从下列各溶剂中，制备p-GlcNAc样品：

A.蒸馏水

B.含10％甲醇的蒸馏水

C.含25％甲醇的蒸馏水

D.仅为蒸馏水

E.含10％乙醇的蒸馏水

F.含25％乙醇的蒸馏水

G.含40％乙醇的蒸馏水

用上述溶剂制备的基质样品，分别进行扫描，电子显微镜(SEM)分析，如图21A-G所示。这些图示结果揭示，随着每种悬浮液中甲醇或乙醇比例的增加，基质的平均孔径减小。

特别是，在两种水悬浮液中(图21A和21D)，孔径平均接近于200微米。图21C和21F(分别含25％甲醇和25％乙醇)中样品的孔径平均在30和50微米之间。

此结果说明，乙醇和甲醇都可成功地用来控制p-GlcNAc孔径的大小，而在控制孔径的大小方面，乙醇可能比甲醇更为有效。

16.实施例：在三维多孔p-GlcNAc基质上细胞的生长

本节所描述的结果证明三维p-GlcNAc多孔材料作为基质在细胞培养中成功的应用。

16.1.材料和方法

p-GlcNAc原料：用5.3.2.节描述的化学纯化法制备p-GlcNAc，用氢氟酸为化学试剂。

基质的形成：通过冻干在水、水-乙醇或水-甲醇混合物中的p-GlcNAc悬浮液，制备三维p-GlcNAc基质。

在下列溶剂中配制含有200mg p-GlcNAc的悬浮液(5ml)，并将其冷冻干燥：

1.蒸馏水

2.蒸馏水配制的10％甲醇

3.蒸馏水配制的25％甲醇

4.蒸馏水

5.蒸馏水配制的10％乙醇

6.蒸馏水配制的25％乙醇

7.蒸馏水配制的40％乙醇

将样品倒入塑料组织培养皿的圆孔中，在-20℃冷冻。将冷冻样品冷冻干燥，取出所得到的三维基质，并对每个基质中的样品进行扫描电镜(SEM)分析。

细胞：使用由ATCC得到的小鼠胚胎BALBC/3T3成纤维细胞(克隆A31)，在三维多孔p-GlcNAc基质上进行培养。

培养条件：将1cm²多孔基质样品置于组织培养孔中，在上面覆盖标准组织培养基。在每个孔中放入样品，置于CO₂培养箱(5％CO₂)中于37℃培养6天。

SEM程序：将基质样品固定，依照12.1所叙述的方法进行SEM分析。所用的基质是冷冻干燥的蒸馏水配制的p-GlcNAc。如图22A-G所示，图像放大100倍至5000倍。

16.2.结果

图22A-G是粘附有小鼠成纤维细胞的p-GlcNAc基质的SEM照片。照片表明：这些三维p-GlcNAc基质中含有小鼠成纤维细胞，在这些细胞和p-GlcNAc基质之间存在密切的相互作用和联系。用此方法培养的细胞成活率高于95％，而且具有圆形的三维结构，而直接在塑料培养皿中培养出的细胞则是扁平伸展的。

17.实例：p-GlcNAc成功地防止术后伤口粘连

本实例表明：使用p-GlcNAc材料，尤其是p-GlcNAc薄膜和凝胶，可以成功地防止一系列动物模型术后伤口粘连的形成。

17.1.材料和方法

p-GlcNAc乳酸盐的合成：以氢氟酸作为化学试剂，用5.3.2中所叙述的方法制备p-GlcNAc薄膜。

用下述方法将p-GlcNAc转化为脱乙酰基p-GlcNAc(应当指出，制备1gp-GlcNAc乳酸盐大约需要1.4g p-GlcNAc，脱乙酰化反应约有15％的质量损失)：将200mg p-GlcNAc薄膜材料与200ml 60％的氢氧化钠剧烈混合，剧烈振荡以使p-GlcNAc薄膜材料尽可能分散。所用的氢氧化钠溶液至少要在使用前12小时配制。将样品置于80℃的水浴加热6小时，不时加以振荡以分散和湿润p-GlcNAc。6小时后，将样品移出水浴并迅速分离氢氧化钠溶液。室温下用重水洗涤薄膜至pH为7，将薄膜在聚四氟乙烯薄板上晾干。

取2mg此时的样品做碳、氢、氮的元素分析，以确定脱乙酰化的程度；测定样品在1％乙酸溶液中的溶解度，如果溶解度为1mg/ml，则表明p-GlcNAc脱乙酰化程度适宜。

用下述方法将部分脱乙酰基p-GlcNAc转化为p-GlcNAc乳酸盐：在250ml锥形烧瓶中放入1g部分脱乙酰基p-GlcNAc，加入足量的2-丙醇(含水10％)，将其润湿并使其能够被搅拌起来(大约需要30ml 2-丙醇)。所用的2-丙醇必须是试剂级，而且必须在每次反应前新鲜制备。在搅拌的同时1.1ml...50％乳酸水溶液。所用的乳酸应该是试剂级，必须分析测定其确切的有效浓度(即没有被酯化的部分)，分析的方法是：用0.1N的氢氧化钠滴定，以酚酞指示终点(pH 7.0)。每次反应所用的乳酸的浓度必须保持恒定，即，必须+/-1％。混合物搅拌至少2小时，可以低温加热以加快反应速率。为了使反应进行完全，可以延长反应时间或者增加50％乳酸水溶液的用量。搅拌后，将烧瓶内的混合物倾入铺有无灰滤纸的布氏漏斗，用15ml无水2-丙醇洗涤后，在通风橱中干燥2小时，置于40℃的烘箱中过夜。每1g部分脱乙酰基p-GlcNAc可以制得大约1.4g p-GlcNAc乳酸盐(即质量增加40％)。

p-GlcNAc乳酸盐凝胶的形成：用下述方法使p-GlcNAc乳酸盐形成凝胶：将p-GlcNAc乳酸盐溶于去离子重水，配成浓度为0.1-4.0％的溶液，加入试剂级的丙二醇，使丙二醇的最终浓度为1-10％。在一些情况下，需要加入防腐剂以防止微生物和/或真菌对产品的污染。通常制得的p-GlcNAc乳酸盐溶液的浓度为0.1-4.0％，随着p-GlcNAc乳酸盐百分比含量的增加，溶液的粘度急剧增大，这样就有0.5％或者更多的p-GlcNAc乳酸盐以凝胶的形式存在。

动物模型：

Sprague-Dawley大鼠：在本模型中，通过摩擦或者刺激盲肠的浆膜表皮并将其置于周边腹膜的某一位置来产生粘连。据报道，在对照动物中用本法产生粘连的成功率平均为80％。

使大鼠产生术后伤口粘连的手术过程如下所述：动物采用背卧式并做好无菌手术的准备。沿中线切开腹腔，小心地切除左腹腔壁一块约0.5cm×1.0cm的腹膜，连带切除一小薄层肌肉。

抬高并分离盲肠，用干纱布在盲肠近端侧表面的一块约0.5cm×1.0cm的区域摩擦十次，并用手术刀刃轻刮，使其产生细小的瘀血点。将盲肠的擦伤和腹膜的切口露置15分钟。

15分钟后，在盲肠的伤处使用测试物(即p-GlcNAc材料)或者对照物，用Allis组织钳将盲肠的擦伤与腹膜的伤口钳在一起15分钟。

将盲肠移回腹腔，保持其擦伤部位与腹膜伤口的邻接。缝合腹部切口，将动物从麻醉中唤醒。

术后14天，将动物无痛致死，诊察擦伤部位是否形成术后伤口粘连。如果存在粘连，将粘连所涉及到的整个部位(即体壁，测试物或对照物以及体内的器官)从动物身上切除。

根据以下标准评估粘连涉及的程度和坚韧程度：

涉及程度的得分：

0没有粘连

1粘连面积＜＝25％

2粘连面积＜＝50％

3粘连面积＜＝75％

4粘连面积＞75％

坚韧程度的得分：

0没有粘连

1粘连可被钝性的切割分离

2粘连可被积极的切割分离

3粘连需用锋利的切割分离

其它动物模型：使用大动物猪和马的肠模型来评价p-GlcNAc防止腹膜粘连的作用。

手术过程：动物采用背卧式并做好无菌手术的准备。沿中线切开腹腔，抬高小肠并造成一片2cm×2cm的区域大面积损伤(用手术刀刺大约200次)，晾干10分钟。在损伤部位使用测试物(即p-GlcNAc材料)或者对照物，并将损伤部位移回腹腔。在这样的肠模型上，六个相邻四英寸的伤口使粘连极易形成。完成最后一个伤口后，缝合腹部切口，将动物从麻醉中唤醒。

腹膜粘连的分析：术后21天，将动物无痛致死，诊察损伤部位，用与Sprague-Dawley大鼠盲肠模型相同的方法来评价伤口粘连的形成。

17.2.结果

一旦有伤口出现，身体就会通过一系列复杂的反应来修复损伤部位。在痊愈的最后阶段，受伤部位形成结缔组织以使身体结构得以再生，并保护已损伤的部位不再受到伤害。在一些情况下，这种级联反应不能正常进行，进而威胁到生命。

例如，在一个内脏器官的术后恢复过程中，在手术过程中产生的血纤维蛋白凝块可能会侵入到相邻器官的表皮，形成允许成纤维细胞迁移的连接。这种迁移导致了胶原沉积和组织生长，从而引起器官与器官之间的相互粘接。

这种粘连被叫做术后伤口粘连。它可以通过扭曲这个器官或者其它涉及到的器官而引起疼痛、梗死和功能紊乱。关节僵硬、肠道梗死和不育症通常也与术后伤口粘连有关。此外，术后伤口粘连会造成周围部分的手术过程复杂化，时间延长。这一点对于开心手术和剖腹产等需要附加手术的过程来说十分重要。在腹腔、心血管和整形外科等手术后，伤口粘连的形成十分普遍。

当粘连成为一种病理状态并且严重地影响到器官的功能时，一般采用手术的方法来消除粘连(使用谨慎的外科技术切开粘连)。1991年，大约实施了500,000例这样的粘连分离手术。但是，这种手术后，粘连形成的再现率高达90％，而且没有任何技术或者混合物能够保证在手术后不形成新的伤口粘连。

因此，我们得到的实验结果十分重要，因为它表明p-GlcNAc材料可以有效地防止术后伤口粘连。特别是它还表明，在大鼠和大动物模型中，p-GlcNAc的固体和溶液形式均能有效地成为术后伤口粘连形成的屏障。

其中一个用来研究粘连形成的动物模型使用了Sprague-Dawley大鼠腹腔周边腹膜的粘连。与不经治疗和经interCEED^TM(Johnson & Johnson)-目前市场上唯一可买到的此方面的产品-治疗的对照模型相比，用部分脱乙酰基p-GlcNAc薄膜和p-GlcNAc乳酸盐凝胶治疗均可防止和/或大幅度减少粘连形成的发生。

在p-GlcNAc乳酸盐凝胶实验中一共用了18只大鼠。12只用作对照，其中6只不经治疗，6只用interCEED^TM治疗；另外6只用含有0.25％p-GlcNAc乳酸盐，10％丙二醇和水的凝胶治疗。如表VIII所示，用p-GlcNAc乳酸盐凝胶治疗的动物，其术后伤口粘连的出现比对照动物有明显的减少。

表VIII

	涉及程度	坚韧程度
	涉及程度	坚韧程度	对照(不经治疗)	1+/-2.1	1+/-1.5
ihterCEED<sup>TM</sup>	1+/-1.8	1+/-1.5	对照(不经治疗)	1+/-2.1	1+/-1.5
ihterCEED<sup>TM</sup>	1+/-1.8	1+/-1.5	p-GlcNAc乳酸盐凝胶	0+/-0.8	1+/-1.2

同样，用大鼠模型来测试部分脱乙酰基p-GlcNAc薄膜防止术后伤口粘连出现的能力。研究一共用了22只大鼠。12只用作对照，其中6只不经治疗，6只用ihterCEED^TM治疗；另外10只分别用1cm×1cm大小的约60％脱乙酰基p-GlcNAc薄膜治疗。如表9所示，用部分脱乙酰基p-GlcNAc薄膜治疗的动物其术后伤口粘连的出现比对照动物有明显的减少。

表IX

	涉及程度	坚韧程度
	涉及程度	坚韧程度	对照(不经治疗)	3+/-1.8	1+/-0.6
ihterCEED<sup>TM</sup>	3+/-1.6	1+/-0.4	对照(不经治疗)	3+/-1.8	1+/-0.6

	涉及程度	坚韧程度
	涉及程度	坚韧程度	p-GlcNAc薄膜	1+/-0.8	1+/-0.3

大动物的肠模型也用来测试p-GlcNAc组合物防止腹膜粘连的能力。用6头猪和1匹马对部分脱乙酰基p-GlcNAc薄膜和p-GlcNAc乳酸盐凝胶进行了研究。所用的部分脱乙酰基p-GlcNAc薄膜由2cm×2cm的60％脱乙酰基p-GlcNAc薄膜组成，p-GlcNAc乳酸盐凝胶由0.25％p-GlcNAc乳酸盐，10％丙二醇和水组成。对照动物的受伤部位不经任何治疗。

对这些大动物的研究结果表明：对照动物的伤处形成多重粘连，并波及到周围组织。使用p-GlcNAc薄膜和凝胶则可以有效地防止粘连的形成。

对照部位和治疗部位的样品用SEM进行分析，结果表明对照部位的纤维化数量比治疗部位有所增加。

18.实例：p-GlcNAc材料的生物降解性

本实例表明：我们可以制备p-GlcNAc材料，并控制其在体外和体内的生物降解性和再吸收速率。

18.1材料和方法

p-GlcNAc材料：用5.3.2中所叙述的方法，以氢氟酸作为化学试剂制得样品1。样品1为100％乙酰化的p-GlcNAc。

样品3A中的p-GlcNAc原料用5.3.2中所叙述的方法，以氢氟酸作为化学试剂制得。用5.4中所叙述的方法将p-GlcNAc脱乙酰基。把p-GlcNAc用40％的氢氧化钠在60℃处理30分钟，得到30％脱乙酰基的样品3A。

样品4中的p-GlcNAc原料用5.3.2中所叙述的方法，以氢氟酸作为化学试剂制得。把p-GlcNAc用40％的氢氧化钠溶液在60℃处理30分钟，使其脱乙酰化，然后将其制成蒸馏水中的悬浮液，在-20℃冷冻，并将冷冻物冷冻干燥。经确定，样品4也是30％脱乙酰基的p-GlcNAc。

腹腔移植模型：研究腹腔移植模型所用的是Sprague-Dawley白鼠。将动物麻醉，并做好手术准备，切开腹部的皮肤和肌肉，找到并取出盲肠，将一块1cm×1cm的p-GlcNAc薄膜置于盲肠上，用尼龙将切口缝合。对照动物的盲肠不经p-GlcNAc处理。

移植14-21天后将动物重新开腹，图23A-E是移植和体外培植过程的照片。在体外培植过程之后，此盲肠样品即可做组织病理学实验。

p-GlcNAc的体外乙酰基壳多糖溶菌酶降解实验：本实验是一个N-乙酰基氨基葡萄糖的比色实验，具体方法如下所述：用吸量管将150μl反应样品移入13×100mm的一次性玻璃试管，备份。在每个试管中加入25μl 0.25M磷酸钾缓冲液(pH 7.1)，然后再加入35μl 0.8M硼酸钾溶液(pH 9.8)。立即将试管浸入冰浴中至少2分钟。将试管移出冰浴，加入1ml新制备的二甲基氨基苯甲醛(DMAB)试剂，旋转样品，并在37℃培养20分钟。DMAB试剂是在8g对二甲基氨基苯甲醛中加入70ml冰醋酸和10ml 11.6N的盐酸制得。

用下述方法制得标准曲线：用0.010M的醋酸钠缓冲液(pH 4.5)将GlcNAc原料液稀释到0.1mg/ml，分别将0μl，20μl，30μl，90μl或120μl稀释的GlcNAc溶液加入到一组试管中，再在试管中分别加入150μl，130μl，120μl，60μl或30μl 0.010M的醋酸钠缓冲液(pH 4.5)。然后在每个试管中加入25μl 0.25M磷酸钾缓冲液(pH 7.1)和35μl 0.8M硼酸钾缓冲液(pH 9.8)。用相同的方法制得一组备份试液。

将试管盖上，在100℃煮沸3分钟后，置于冰浴冷却。将试管从冰浴中取出，在每个试管中加入1ml新制备的DMAB试剂-制备方法如本节上文所述-在37℃培养20分钟。在585nm测定每个试管内容物的吸光度，其数值要尽快读取。将标准曲线画在座标纸上，以此来确定反应样品中N-乙酰基氨基葡萄糖的浓度。图23是一个典型的标准曲线。

18.2结果

我们试验了p-GlcNAc薄膜材料被溶菌酶降解的相对敏感性，以此来研究p-GlcNAc材料的体外生物降解性。将p-GlcNAc薄膜与过量的溶菌酶置于10mM醋酸缓冲液中，用18.1中所描述的实验来确定随后释放出的N-乙酰基氨基葡萄糖的浓度。

实验结果表明：部分脱乙酰基薄膜对于溶菌酶的消化更加敏感(见图24)，而且，被溶菌酶降解的速率与脱乙酰化的程度直接相关(图25比较了50％-25％脱乙酰基p-GlcNAc薄膜的降解速率)。

另外，我们还测试了p-GlcNAc材料在体内的生物降解性。这些实验使用腹腔移植模型，测试了以下三种p-GlcNAc材料：

测试的p-GlcNAc材料：

1)全部乙酰化的p-GlcNAc(样品1)

2)部分脱乙酰基p-GlcNAc薄膜(样品3A)

3)冷冻干燥的部分脱乙酰基p-GlcNAc薄膜(样品4)

图26A-C表明，全部乙酰化的p-GlcNAc(样品1)在21天内被再吸收。图26D-E表明，部分脱乙酰基p-GlcNAc薄膜(样品3A)在14天内完全被再吸收。冷冻干燥的部分脱乙酰基p-GlcNAc薄膜(样品4)在移植21天后仍未被完全再吸收。

组织病理学分析表明：p-GlcNAc被再吸收后，在对照动物和治疗动物的组织样品中，没有发现组织病理差异。

19.实例：p-GlcNAc的止血研究

本实验研究了p-GlcNAc材料控制出血的有效性，并将其控制出血的效果与市场上可买到的止血产品进行了比较。

19.1材料和方法

p-GlcNAc和对照材料：以氢氟酸为化学试剂，用5.3.2中所叙述的分离技术和5.4中所叙述的技术制备部分脱乙酰基(约70％)p-GlcNAc薄膜。所用的薄膜为2cm×1cm。用17.1中的方法制得p-GlcNAc乳酸盐凝胶(4％的p-GlcNAc乳酸盐，在丙二醇和水中形成)。脾脏和肝脏出血研究的对照材料是明胶海绵^TM(Upjoin Company)；小血管出血研究的对照材料是明胶海绵TM和阿维烯^TM(Medchem Products，Inc.)。

受试动物：使用新西兰白兔。在3只动物的脾脏造成两处伤口，肝脏造成一处伤口。在4只动物的末端肠系膜动脉系统的5条大小相同的血管上造成5处手术伤口。

手术准备：用盐酸克他命和赛拉嗪将动物麻醉。动物采用背卧式，除去腹部的体毛，用聚维酮碘和70％异丙醇涂擦并覆盖以做无菌手术。

肝脏/脾脏的手术过程：沿中线切开腹部，将肝脏或脾脏取出，并用湿海绵将其覆盖。用一个直径3-4mm的穿孔器在脾脏的一端造成一个深约2mm的圆形伤口。当脾组织被去除时，用一块事先称重的4″×4″的海绵纱布吸收伤口的出血约1分钟。将海绵再次称重以确定这个伤口的出血量。用治疗材料中的一种治疗受试动物的伤口。记录下止血时间和止血前的出血量。

第一个伤口止血后，用相同的方法造成脾脏的第二个伤口和肝脏的一个伤口。

小血管的手术过程：沿中线切开腹部，将小肠取出并使末端肠系膜动脉系统暴露。用湿海绵将小肠覆盖并确认5条大小相同的血管。用手术刀在其中一条血管上造成一个深约1mm的伤口。用一块事先称重的4″×4″的海绵纱布吸收伤口的出血约1分钟。将海绵再次称重以确定这个伤口的出血量。用治疗材料中的一种治疗受试动物的伤口。记录下止血时间和止血前的出血量。

第一个伤口止血后，用相同的方法造成另外四处伤口。

19.2结果

在大鼠模型的脾脏和肝脏测试了p-GlcNAc材料控制出血的能力。被测试的p-GlcNAc材料是：1)部分脱乙酰基(约70％)p-GlcNAc和2)p-GlcNAc乳酸盐凝胶(4％的p-GlcNAc乳酸盐，在丙二醇和水中形成)。把这些p-GlcNAc材料的有效性与明胶海绵^TM(Upjohn Company)进行了比较。

每种材料测试3次(脾脏两次，肝脏一次)。与明胶海绵^TM相比，两种p-GlcNAc材料均在使用后1分钟内有效地控制了出血。

p-GlcNAc材料还有其它的优点。特别是在作用过程中，p-GlcNAc材料不需要使用外力将其控制在作用点，它可以留在体内，在2～3周内被再吸收(明胶海绵^TM没有这种性质)，并与普通和最小侵入的手术过程相容。

另外还研究了p-GlcNAc材料控制小血管出血的有效性，并与市场上可买到的止血产品进行了比较。

每种材料测试5次(两次在一只动物上，在另三只动物上各一次)。p-GlcNAc薄膜和凝胶都非常容易作用于受伤部位，并在2分钟内控制住了出血。明胶海绵^TM和p-GlcNAc材料一样，也在2分钟内控制了出血，但它必须使用外力将其控制在受伤部位。而胶原纤维材料阿维烯TM则很难使用，并需要超过5分钟的时间才能控制住出血。

因此，实验结果表明：所测试的p-GlcNAc材料是一种方便有效的止血剂。

20.实例：p-GlcNAc药物运送系统

本研究表明：p-GlcNAc材料可以成功地将抗肿瘤药物运送到恶性皮肤癌和结肠癌的作用部位，以使其发挥对肿瘤的治疗作用。

20.1材料和方法

p-GlcNAc乳酸盐药物运送混合物：5’-氟尿嘧啶(5’-FU)和p-GlcNAc乳酸盐的混合物按下述方法制得：将0.5ml 5’-FU(50mg/ml)与0.5ml丙二醇混合，再加入2.0ml 4％的p-GlcNAc乳酸盐，三者混合。所使用的p-GlcNAc乳酸盐用17.1节中所叙述的技术制得。尽管经过剧烈混合，5’-FU仍不能完全溶解在p-GlcNAc乳酸盐凝胶中。假定其完全混合，最后得到的5’-FU的浓度为6.25mg/ml。

丝裂霉素(Mito)和p-GlcNAc乳酸盐的混合物按下述方法制得：把0.5mgMito(冷冻干燥的粉末)溶于5ml丙二醇中。将0.5ml Mito溶液与0.5ml MPT的4％p-GlcNAc乳酸盐制剂相混合，使得Mito的最终浓度为0.2mg/ml，p-GlcNAc乳酸盐的最后浓度为2％。由于Mito很容易溶解在p-GlcNAc乳酸盐凝胶中，所以这两种材料具有相容性。

p-GlcNAc薄膜5’-FU运送组合物：将5’-FU样品固定在用5.3.2中所叙述的化学分离法并以氢氟酸作为化学试剂制得p-GlcNAc薄膜的圆盘上。每个圆盘的直径为1.5cm。

将0.64ml浓度为50mg/ml的5’-FU溶液与含有8mg纯p-GlcNAc的悬浮液相混合，得到高剂量(HD)的圆盘。将混合物放置几个小时，以促进p-GlcNAc对5’-FU的吸收，然后在55℃干燥3.5小时。最后得到的HD圆盘共含有32mg 5’-FU，相当于平常对癌症病人14天给药总剂量的两倍。

用相同方法制得含有低剂量(LD)5’-FU的p-GlcNAc圆盘，不同的是其中含5’-FU 17mg。相当于平常对癌症病人14天给药的总剂量。而且依据人每公斤体重的5’-FU给药剂量，此剂量符合给试验小鼠给药的标准。

受试动物：为了进行5’-FU的研究，在SCID(严重的联合免疫缺乏)小鼠的肋腹皮下注射用标准组织培养法得到的HT-29结肠癌细胞(ATCC；每管接种物中含1×10⁵个细胞)，从产生HT-29结肠癌肿瘤。这种注射可以在14～21天后得到可触知的肿瘤。切下肿瘤并切除周围的腐败组织。将HT-29结肠癌肿瘤切成3×3×3mm的小块。

腹腔注射标准剂量的三溴乙醇将受试的SCID小鼠麻醉，把一块HT-29结肠癌肿瘤块移植到每只小鼠的盲肠：打开小鼠的腹腔并找到盲肠，在盲肠上用手术刀造成一个小切口，用5.0丝缝合线将一块3×3×3mm的肿瘤块缝合到切口上。用Clay Adams纤维缝合腹部。

所有的小鼠被单独喂养两周。两周后，所有小鼠都很健康，均没有出现结肠阻塞。

第14天，将每只小鼠麻醉，重新打开腹腔，测量生长肿瘤的长度和平展尺寸。用p-GlcNAc/抗肿瘤药物治疗肿瘤，或把肿瘤当作对照物。

6只小鼠用作p-GlcNAc乳酸盐5’-FU的研究，15只用作p-GlcNAc薄膜5’-FU的研究。

为了进行丝裂霉素的研究，在9只SCID小鼠的皮下注射接种A431被鳞细胞皮肤癌细胞(ATCC；每管接种物中含1×10⁵个细胞)，14天内在所有小鼠身上得到肿瘤。

治疗方法：为进行p-GlcNAc乳酸盐5’-FU的研究，每天在动物的肿瘤处涂擦含有5’-FU的p-GlcNAc凝胶混合物，并每天测量肿瘤的大小。对照动物包括只用p-GlcNAc而不用5’-FU治疗和不接受任何治疗的动物。

为进行p-GlcNAc薄膜5’-FU的研究，当HT-29结肠肿瘤在SCID小鼠的结肠生长14天后，将含有药物的p-GlcNAc薄膜移植到肿瘤表面。移植14天后，将小鼠杀死。在移植含有药物的p-GlcNAc薄膜前当天即第0天和第14天移植实验结束时测量肿瘤的体积。对照动物包括只用p-GlcNAc薄膜而不用5’-FU治疗和不接受任何治疗的动物。另外，还有两只动物每天全身注射相当于HD和LD剂量的5’-FU。

为进行p-GlcNAc乳酸盐Mito的研究，与在p-GlcNAc乳酸盐5’-FU的研究中一样，有3只动物使用含有Mito的混合物进行治疗。另外，3只动物只用p-GlcNAc而不用Mito治疗，2只动物不接受任何治疗，1只动物用丙二醇治疗。

20.2结果

20.2.1p-GlcNAc乳酸盐5’-FU

如20.1中所述，我们进行了p-GlcNAc乳酸盐5’-FU药物转运系统对肿瘤大小的影响的实验。

我们测量了每个肿瘤最大的长、宽尺寸，并用这些尺寸计算了最具代表性的面积，其数值见表X

表X

p-GlcNAc乳酸盐5’-FU治疗的动物与对照动物进行比较的数据见图27-28。表X和图27-28所归纳的数据表明：与对照相比，用含有5’-FU的p-GlcNAc乳酸盐凝胶治疗小鼠HT-29皮下肿瘤，可以显著地延缓其生长速度。肿瘤的生长比p-GlcNAc乳酸盐凝胶对照延缓了2.5倍，比不经治疗的对照延缓了4倍。

20.2.2p-GlcNAc乳酸盐Mito

如20.1中所述，我们进行了p-GlcNAc乳酸盐Mito药物运送系统对肿瘤大小的影响的实验。

我们测量了每个肿瘤最大的长、宽尺寸，并用这些尺寸计算了最具代表性的面积，其数值见表XI。

表XI

p-GlcNAc乳酸盐Mito治疗的动物与对照动物进行比较的数据见图29-30。表XI和图29-30所归纳的数据清楚表明：用含有Mito的p-GlcNAc乳酸盐凝胶治疗小鼠肿瘤，可以显著地延缓其生长速度。肿瘤的生长比p-GlcNAc乳酸盐对照延缓了4倍，比不经治疗的对照延缓了4倍。

20.2.3p-GlcNAc薄膜5’-FU

另外，如20.1中所述，我们还进行了p-GlcNAc薄膜5’-FU药物运送系统对皮肤癌肿瘤大小的影响的实验。

表12归纳了研究中所得到的肿瘤体积的数据，包括使用不同的治疗方法引起的体积变化百分比。假设肿瘤为圆柱形，它的体积由所测定的长和宽决定，并用公式V＝πr²l计算得出。其中半径r为0.5倍的宽，l为长。

表XII p-GlcNAc薄膜+5’-氟尿嘧啶的动物数据

图31中归纳了表XII中的一部分数据，这些数据有力地说明，用高剂量(HD)的含有5’-FU的p-GlcNAc薄膜治疗的肿瘤不仅停止了生长，而且在所有病例中都有显著的减小。用低剂量(LD)聚合体材料治疗则使病情稳定，并使肿瘤略微减小。相对而言，对照动物的肿瘤则继续迅速增大。有一点值得注意，3只通过全身注射5’-FU治疗的对照动物中，有2只在研究中死亡。这表明：通过p-GlcNAc聚合体选择性运送5’-FU到作用部位可以有效地使动物免除疾病，而全身运送相同剂量的5’-FU则是致命的。

20.3结论

本节显示的数据有力地说明，抗肿瘤药物的选择性运送可以积极有效地延缓和逆转肿瘤的生长。我们用制得的有p-GlcNAc乳酸盐和p-GlcNAc薄膜两种形式的p-GlcNAc药物运送组合物，并用了两种不同的抗肿瘤药-5’-FU和Mito，从而得到了以上成功的结果。因此，本发明的p-GlcNAc药物运送系统具有抗肿瘤活性。例如，它可以用于选择性地运送药物到肿瘤细胞的作用部位。

很明显，这里提出的本发明的许多修正和变化并没有离开本发明的精神和范围。以上所叙述的具体实施方案只以实例的形式给出，而本发明则由所附权利要求书的条款所限定。

Claims

1.分离聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺的方法，该聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺含有4,000到150,000个通过β-1→4构型共价连接的N-乙酰葡糖胺单糖，不含蛋白质，基本不含其它的有机杂质，基本不含无机杂质，并且其分子量为800,000至3千万道尔顿，该方法包括：

(a)培养含有细胞体和聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺纤维的微藻，从而得到微藻细胞培养物；

(b)用酸在不破坏细胞体的浓度下，处理步骤(a)得到的微藻培养物足够的时间，使聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺纤维从未破坏的细胞体中释放出来；

(c)将聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺纤维从细胞体中分离出来；和

(d)从分离的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺纤维中除去全部蛋白质，基本上全部其它的有机杂质，基本上全部无机杂质。

2.权利要求1的方法，其中所述酸是氢氟酸。