CN1133049A

CN1133049A - 黑素瘤抑制蛋白质

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Publication number: CN1133049A
Application number: CN94192822A
Authority: CN
Inventors: U·波丹; R·布特纳; B·卡卢扎
Original assignee: Mannheim Bollinger AG
Current assignee: Searle Technology LLC
Priority date: 1993-07-20
Filing date: 1994-07-19
Publication date: 1996-10-09
Anticipated expiration: 2014-07-19
Also published as: IL154248A0; EP0947583A2; US5770366A; WO1995003328A3; ATE185152T1; CA2167693C; EP0710248A1; EP0710248B1; IL154248A; WO1995003328A2; CA2167693A1; JP3435163B2; AU7531294A; GR3032212T3; IL110385A; EP0947583A3; CN1056617C; ES2139751T3; JPH09500531A; ZA945278B

Abstract

本发明涉及一种黑素瘤抑制蛋白质、编码该蛋白质的核酸序列，这种蛋白质的分离方法及其在制备治疗剂上的用途。

Description

黑素瘤抑制蛋白质

本发明涉及一种黑素瘤抑制蛋白质(MIA)，编码该蛋白质的核酸，该蛋白质的分离和检测方法，及其在制备治疗剂上的用途。

细胞生长调节被起正调节作用和负调节作用的因子控制。起正调节作用的因子包括已知的生长因子如表皮生长因子(EGF)，血小板衍生的生长因子(PDGF)，胰岛素和促生长因子。具有负调节作用即具有抑制活性的因子除包括能作为生长刺激物及生长抑制剂的TGF-β(Robert et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.82(1985)，119-123)外，还包括来自结肠癌细胞(Levine et al.，CancerResearch 45(1985)，2248-2254)，黑素瘤(Bogdahn et al.，Cancer Research 49(1989)，5358-5363)以及来自鼠乳腺正常上皮细胞(Ethier et al.，J.Cell.Phys，142(1990)，15-20)的内源性肿瘤抑制因子。

这一调节系统的失调例如由于具有正调节作用的生长因子的过度产生或者由于这些生长因子上突变细胞的降低的依赖性(Rodeck etal.，International Journal of Cancer 40(1987)，687-690)能使肿瘤细胞以不受控制的方式增殖，上文提到的来自各种肿瘤组织的肿瘤抑制因子代表可能能够有治疗意义地介入这一损伤的调节系统的令人感兴趣的化合物。大量和以可再现的纯度为这一治疗用途提供这些因子是很可能的。然而对于大多数这些因子来说至今只描述了来自细胞溶胞产物的富集级分，由于它们的复合物和有时的未知的组合物，以及与生产它们的相伴的不可重现性，使它们不适于治疗用途。

本发明基于一种新的黑素瘤抑制蛋白质(以下以MIA蛋白质，或MIA表示，该蛋白质抑制细胞系HTZ 19-dM和ATCC CRL 1424的生长，且该蛋白质

a)由编码成熟蛋白或者有N端前序列的蛋白质的SEQ ID NO 1所示的DNA序列或者由SEQ ID NO 3所示的基因组序列编码，

b)由与SEQ ID NO 1或3所示DNA序列或这些DNA序列在其编码成熟蛋白之DNA区的片段杂交的DNA序列所编码。

生长抑制作用被理解为抗增殖活性。在本方法中向培养基中加入MIA蛋白质大大阻滞细胞的生长。为此合适的浓度是例如0.1μg MIA蛋白质/ml培养基。然而较高或较低的MIA蛋白质浓度也适于生长抑制作用，根据不同的浓度可发现较高或较低的生长抑制作用。

在Cancer Research 49(1989)，5358-5363，CancerResearch 50(1990)，6981-6986，Melanoma Research 2(1992)，327-336中，发明人已描述过这种蛋白质的性质。但在这些出版物中没有陈述可重复的制备该蛋白质的方法。该蛋白质可由人黑素瘤细胞系HTZ 19-dM获得，该细胞系以前是公众不能得到的。该细胞系得自转移的恶性黑素瘤并且在确定成份的无血清培养基(50％Dulbecco极限必需培养基，50％F-12)中在标准培养条件下进行单层培养，所述培养基中含有0.8mmol/1 L-谷氨酰胺，非必需氨基酸，10μg/ml铁传递蛋白，30nmol/l亚硒酸钠和4μg/ml庆大霉素。该细胞系于93年6月23日在Braunschweig的“Deutsche Sammlung fr Mikroorganismen undZellkulturen GmbH”保藏(DSM ACC 2133)。这也是本发明的进一步主题。按照本发明的蛋白质可以通过对具有大约11kD的蛋白级分进行凝胶色谱分离和通过对该级分进行反相高效液相色谱(HPLC)的后续纯化从这种细胞系的培养物上清液中获得。

本发明的蛋白质可由其DNA序列和由其衍生的氨基酸序列限定。该MIA蛋白质可存在各个不同的自然等位变异(例如SEQ ID NO 24)。这样的氨基酸变异通常是氨基酸替代。然而它们也可以是整个序列中氨基酸的缺失，插入或添加。就大小和类型而言，依据其在其中被表达的细胞和细胞类型本发明的MIA蛋白质可以是糖基化的或非糖基化的形式。

根据本发明的蛋白质也可以用重组方法产生。当在原核生物中用重组法产生时得到非糖基化MIA蛋白质。借助本发明提供的核酸序列，在任何所需细胞(例如，除人细胞外，还有其它哺乳动物细胞)的基因组中寻找MIA基因或其变异体、鉴定它们、并分离编码MIA蛋白质的所期望的基因是可能的。这种方法和合适的杂交条件对本领域技术人员来说是公知的，并且在例如J.Sambrook的Molecular cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，1989和B.D.Hames，S.G.Higgins的Nucleic acid hybridisation-a practicalapproach(1985)IRL Press，Oxford，England中有描述。在这种情况下，这些出版物中描述的标准方案通常被用于本实验中。

应用重组DNA技术能生产多种MIA蛋白质衍生物。这种衍生物可以例如在一个或几个氨基酸位置通过取代，缺失或添加来修饰。可以通过例如位点定向诱变的方法来进行衍生作用。这种变异可容易地由本领域技术人员进行(J.Sambrook，B.D.Hames，Loc.Lit.)。只是要确保保留MIA蛋白质的特有的性质(上文提到的细胞系的抑制作用)。

因此本发明还涉及一种MIA蛋白质，该蛋白质

a)是外源DNA的原核生物或真核生物的表达产物，

b)由编码成熟蛋白或带一个N端前序列的蛋白质的SEQ ID NO 1所示的DNA序列或者由SEQ ID NO 3所示的基因组序列编码，

c)由与SEQ ID NO 1或3所示DNA序列或这些DNA序列在其编码成熟蛋白之DNA区的片段杂交的DNA序列所编码，或

d)由假若不存在遗传密码的简并性时将会与b)至c)中定义的序列杂交的并编码具有氨基酸序列的多肽的DNA序列编码。

由SEQ ID NO 1中核苷酸40～432或112至432编码的，或被由于遗传密码简并性而编码具有相同氨基酸序列的多肽的DNA序列所编码的蛋白质是优选的。

来自HTZ 19-dM的MIA蛋白质分子量大约是11kD，是热稳定的(在100℃稳定3分钟)，且对蛋白酶例如胰蛋白酶敏感。

本发明涉及编码MIA蛋白质的核酸，它选自以下组：

a)SEQ ID NO 1和3所示的DNA序列或其互补序列，

b)与a)中序列之一杂交的核酸序列，

c)假若不存在遗传密码的简并性时将会与a)或b)所述序列之一杂交的核酸序列。

本发明进一步涉及来自哺乳动物细胞(如小鼠、大鼠、牛、羊)的黑素瘤抑制蛋白质，该蛋白质能以基本类似的方式抑制细胞系HTZ19-dM和ATCC CRL 1424的生长，如人MIA蛋白质。

通过按本领域技术人员熟悉的方法用含有编码人MIA的序列的杂交样品筛选各个哺乳动物的cDNA文库，进行DNA序列和人及鼠MIA蛋白质序列(SEQ ID NO 1-5)的序列比较，并鉴别编码片段，可获得类似于人MIA蛋白质的这些蛋白质。

本发明一个优选的实施方案是鼠MIA蛋白质及为其编码的核酸序列(SEQ ID NO：4)。该鼠蛋白质由SEQ ID NO 4的核苷酸110-499或179-499编码。

借助于这些核酸可以可重复制备的方式大量获得本发明的蛋白质。为在原核或真核生物体(如原核宿主细胞或真核宿主细胞)中表达，按本领域技术人员熟悉的方法将核酸整合到合适的表达载体中。这种表达载体优选地含有调节型/诱导型启动子。然后为了表达，将这些重组载体导入合适的宿主细胞，例如，大肠杆菌(原核宿主细胞)或酿酒酵母、畸胎瘤细胞系PA-1 sc 9117(Bttner et al.，Mol.Cell.Biol.11(1991)3573-3583)、昆虫细胞、CHO或COS细胞(真核宿主细胞)，并且将被转化的或被转导的宿主细胞在使得异源基因表达的条件下培养。可用公知的方法从宿主细胞或宿主细胞培养物上清液中分离所述蛋白质。这样的方法被例如Ausubel I.，Frederick M.，Current Protocols in Mol.Biol.(1992)，John Wiley and Sons，New York描述。该蛋白质的体外反应活性也可能是必需的。

具有SEQ ID NO 1(cDNA)的核苷酸40-432或112-432(编码序列)的DNA或按照SEQ ID NO 3的基因组DNA优选地用于按照本发明的蛋白质的重组制备中。

另外，本发明涉及一种通过用凝胶色谱分离法分离黑素瘤细胞系HTZ 19-dM的培养物上清液并用反相HPLC纯化相应分子量为约11kD(SDS-PAGE，非还原型)的级分，从而获得MIA蛋白质的方法。用这种方法能获得大约0.2μg/l培养物上清液。

在一优选的实施方案中，天然MIA蛋白质在分离和纯化过程中经酸处理。通过这一步骤可增加MIA活性。使用约为2的pH值是有利的，就酸来说，例如乙酸是合适的。

重组产生MIA蛋白质的被转化或被转导之宿主细胞的检测和所述蛋白质的纯化优选地借助与这种蛋白质结合的抗体来实现。用本发明蛋白质作抗原或免疫原，根据已知方法的简单方式能获得这样的抗体。

因此本发明还涉及具有本发明的黑素瘤抑制活性的蛋白质在产生与该蛋白质结合的抗体上的用途。

为此，用本发明的蛋白质使通常用于此目的的动物如，特别是羊、兔或小鼠免疫，然后按已知方法从免疫过的动物身上分离抗血清，或按Khler和Milstein(Nature 256(1975)，495-497)的方法，使免疫过的动物的脾细胞与无限增殖化细胞(如骨髓瘤细胞)融合。这些产生抗MIA蛋白质的单克隆抗体的细胞选自用这种方法得到的杂交瘤细胞并被克隆。用此方法获得的单克隆或多克隆抗体能结合到支持材料(例如纤维素)上，以进行黑素瘤抑制蛋白质的免疫吸附纯化。并且这种抗体可用于样品(例如被切除的组织或体液)中的MIA蛋白质的检测。

因此本发明进一步涉及抗MIA蛋白质的抗体。这种抗体通过用MIA蛋白质使动物免疫并由免疫过的动物的血清或脾细胞分离这种抗体而获得。

已经发现MIA蛋白质不仅具有对黑素瘤细胞的抑制活性，而且通过抑制DNA合成(3H-thymidine incorporation(Coligan J.E.，Kruisbeek A.M.，Margulies D.H.，Shevach E.M.，StroberW.，Current Protocols Immunology，NIH Monograph，J.Wileyand Sons，New York，1992))，在软琼脂或肿瘤干细胞试验中抑制肿瘤克隆形成(Schlag P.，Hentje D.，Cancer TreatmentRev，11：Suppl.A：131-137，1984)程度稍差地具有对其它肿瘤细胞(例如恶性胶质瘤细胞、神经细胞瘤、小细胞肺癌和神经外胚层肿瘤)的抑制活性。相反正常的未变性细胞的生长不被抑制。这种蛋白质在非常低的浓度(毫微克范围)下就发生作用。因此这种蛋白质适于制备用于肿瘤治疗的治疗剂。这样的治疗剂特别适用于治疗恶性黑素瘤、恶性神经胶质瘤、支气管癌(特别是小细胞支气管癌SCLC)和神经细胞瘤。

另外已经发现黑素瘤抑制蛋白质抑制外周血淋巴细胞的白细胞介素2-依赖和植物血细胞凝集素诱导的增殖作用。也降低了T-淋巴细胞的细胞毒性。因此黑素瘤抑制蛋白质也适于制备用作免疫抑制剂的治疗剂。

因此本发明进一步涉及本发明的蛋白质在制备可用于肿瘤治疗中或用作免疫抑制剂的治疗剂上的用途。

如果需要，本发明蛋白质可以在所述治疗用途的药物制剂中与通常使用的辅助剂，填充剂和/或添加剂一同使用。

因此本发明进一步涉及含有本发明的黑素瘤抑制蛋白质以及如果需要，还可含有通常使用的辅助剂，填充剂和/或添加剂的治疗组合物。

本发明进一步涉及MIA基因序列，优选地是编码具有MIA活性的蛋白质的序列，或5′末翻译区的活化序列在基因治疗中，特别是在制备用于基因治疗的药物中的用途。

通过使用例如逆转录病毒载体，其它病毒载体，或通过非病毒基因转移(为了清楚，参考T.Friedmann，Science 244(1989)1275；Morgan 1993，RAC DATA MANAGEMENT REPORT，June 1993)可实现体细胞的基因治疗。

适合基因治疗的载体体系是，例如，逆转录病毒(Mulligan，R.C.(1991)in Nobel Symposium 8：Ethiology of humandisease at the DNA level(Lindsten，J.and PattersunEditors)，pages 143-189，Raven Press)、腺相关病毒(McLughlin，J.Virol，62(1988)，1963)、牛痘病毒(Moss etal.，Ann.Rev.Immunol.5(1987)305)、牛乳头状瘤病毒(Rasmussen et al.，Methods Enzymol，139(1987)642)或疱疹病毒组病毒，如非洲淋巴细胞瘤病毒(Margolskee et al.，Mol.Cell.Biol.8(1988)2937)或单纯性疱疹病毒。

也有已知的非病毒传送体系，为此通常使用“裸”核酸，优选的是DNA，或与辅助剂(例如转移剂(脂质体，dendromers，聚赖氨酸-转铁蛋白-轭合物(Wagner，1990；Felgner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987)7413))一同使用的核酸。

基因治疗另一种优选的方法以同源重组为基础。在这种方法中，编码MIA蛋白质的基因能以一个或多个拷贝插入到体细胞基因组中，和/或内源性地存在于细胞中的MIA基因能被调整，优选地是被激活。

同源重组方法已有描述，例如Kucherlapati，Proc，in Nucl.Acids Res，和Mol.Biol.36(1989)301；Thomas，等.，Cell 44(1986)419-428；Thomas和Capecchi，Cell 51(1987)503-512；Doetschman等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)8583-8587和Doetschman等Nature 330(1987)576-578。这些方法中，将在基因组的特定位点被整合的DNA片段(MIA的基因片段)结合到靶DNA上。该靶DNA是与基因组DNA区(优选地在MIA基因内或与其邻近)互补(同源)的DNA。当单链DNA(例如靶DNA和基因组DNA)中两个同源部分相互紧邻时，它们将杂交生成双链螺旋结构。然后通过重组将MIA基因片段和靶DNA整合到基因组中。这种同源重组能在体外和体内(患者体内)进行。

优选地使用编码有MIA活性的蛋白质的DNA，抑制MIA表达的片段(失效序列)，或在细胞基因组整合后能激活在细胞内表达具有MIA活性的蛋白质的片段。这样的片段可以是，例如一个启动子和/或增强子区，它与相应的MIA区是异源的，或者在整合到MIA基因中后在转录和/或翻译上激活实际上的沉默的或在很小程度上被表达的MIA基因。

因此，通过这种DNA，新将一个或更多MIA基因引入靶细胞，或以这种方式激活哺乳动物细胞基因组中实质上的转录沉默基因，使哺乳动物细胞能产生内源MIA蛋白质。为实现此目的，通过同源重组将DNA构建体插入基因组中。该DNA构建体包含：一种有效地连接到基因上时能调制，最好是刺激该基因表达的DNA调节元件；一个或多个同源于这一基因组中的一个区的DNA靶片段，所述区在该基因内或邻近该基因。以使调节片段有效地连接到编码具有MIA活性的蛋白质的基因上的方式，将该构建体插入到哺乳动物细胞的基因组中。该构建体最好还包含扩增序列，特别是在编码具有MIA活性的蛋白质的基因被插入到细胞中时。

为将MIA基因导入靶细胞，该构建体包括一个调节元件，一个或多个MIA基因和一个或多个靶片段。以使靶片段与基因组的合适的区杂交，从而在同源重组后，被插入的外源MIA基因被表达的方式选择靶片段。

公知的许多方法能启动同源重组作用，优选地同源重组发生在细胞的DNA复制或有丝分裂期间。这种DNA可以用来制备治疗肿瘤的药剂，或者在一宿主生物中制备同源的或异源的MIA蛋白质。

提供以本发明提供的MIA蛋白质的核酸序列为基础的试验是可能的，它可用来检测编码MIA蛋白质的核酸。这种实验可以例如在细胞或细胞溶胞产物中进行。可以用核酸诊断学的方法来进行这种试验。在这种情况下被检验的样品和与编码MIA蛋白质的核酸序列杂交的探针接触。探针和样品中核酸的杂交表明被表达的MIA蛋白质的存在。这样的方法对本领域技术人员来说是公知的，并且在例如WO89/06698，EP-A0200362，USP2915082，EP-A0063879，EP-A0173251，EP-A0128018中有描述。

在一个本发明优选的实施方案中，在试验前扩增样品中编码MIA蛋白质的核酸，例如通过公知的PCR技术。在核酸诊断学领域通常使用衍生化的(标记的)核酸探针。使该探针与样品中载体结合的变性DNA或RNA接触，并且在这种方法中，选择温度，离子强度，pH值和其它的缓冲液条件，选择的方式是：依据核酸样品的长度和期望的杂交体的形成的解链温度，使标记DNA或RNA能与同源DNA或RNA结合(杂交作用，也参见J.Mol.Biol.98(1975)，503；Proc.Natl.Acad.Sci.USA76(1979)，3683)合适的载体是以硝基纤维素(例如Schleicher和Schll，BA 85，Amersham Hybond，C.)，强化或结合的粉末状硝基纤维素为基质的膜和载体材料，或用各种功能基(例如硝基)衍生的绵纶膜(例如Schleicher和Schll，Nytran NEN，Gene Screen；Amersham Hybond M.；Pall Biodyne)。

通过对载体充分洗涤并饱和以阻止非特异结合后，将载体与抗体或抗体片段一起温育来检测杂交DNA或RNA。所用抗体或抗体片段在衍生化作用中直接针对掺入到核酸探针中的物质。将抗体本身标记，但使用直接标记的DNA是可能的。与抗体一起温育后，再次洗涤以便只检测特异结合的抗体轭合物。然后按已知方法经抗体或抗体片段的标记进行测定。

可以用例如如下的方法进行MIA表达的检测：——使用固定化组织涂片和分离的中期细胞分裂染色体用固定化整细胞原位杂交，——集落杂交(细胞)和噬斑杂交(噬菌体和病毒)，——Northern杂交(RNA检测)，——血清分析(例如通过狭线印迹分析进行的血清细胞的细胞类型分析)，——扩增作用后(例如PCR技术)。

因此本发明包括检测编码MIA蛋白质的核酸的方法，其特征在于被检测样品与选自下组的核酸探针一同温育：a)SEQ ID NO 1和3所示的DNA序列或其互补序列b)与a)中序列之一杂交的核酸，

核酸探针与样品中的核酸一同温育，检测样品中核酸和核酸探针的杂交作用，如果需要，通过进一步的结合配偶体进行检测。

因此，在肿瘤诊断学中(转移、发展)，MIA是有价值的预后性标记。

结合下面的实施例和图示，通过序列表更详细地阐述本发明，在这种情况下SEQ ID NO 1——表示具有前序列的人MIA的cDNASEQ ID NO 2——表示蛋白质SEQ ID NO 3——表示MIA的基因组DNASEQ ID NO 4——表示具有前序列的鼠MIA的cDNASEQ ID NO 5——表示蛋白质SEQ ID NO 6——表示引物SEQ ID NO 7——表示引物SEQ ID NO 8——表示克隆片段

SEQ ID NO 9——表示引物SEQ ID NO 10——表示引物SEQ ID NO 11——代表衔接子SEQ ID NO 12——表示衔接子SEQ ID NO 13——表示融合蛋白SEQ ID NO 14——表示融合蛋白SEQ ID NO 15——表示引物SEQ ID NO 16——表示引物SEQ ID NO 17——表示引物SEQ ID NO 18——表示在大肠杆菌中表达的融合游离的MIASEQ ID NO 19——表示引物SEQ ID NO 20——表示引物SEQ ID NO 21——表示引物SEQ ID NO 22——表示引物SEQ ID NO 23——表示多接头SEQ ID NO 24——表示MIA的基因组DNA(等位变异体)图1描述了人MIA的发病抑制活性(以％表示的有或没有MIA的细胞的

动物的抑制作用)

B16＋mMIA：用鼠MIA的试验。图2描述了以CD₄+T细胞的％溶解表示的T-细胞介导的细胞毒

活性被MIA抑制的抑制作用。图3描述了LAK-细胞的细胞毒活性被MIA抑制的抑制作用。图4描述植物血细胞凝集素依赖性淋巴细胞扩增被MIA抑制的抑制作

用(MIA的浓度以ng/ml表示)。图5描述IL-2刺激的PBMC增生被MIA抑制的抑制作用(MIA的浓度

以ng/ml表示)。图6表示表达质粒pQE40-MIA的质粒图(实施例5a)。图7表示载体pCMX-PL1的质粒图(实施例7a)。

实施例1从HTZ 19-dM细胞分离黑素瘤抑制蛋白质

在含0.8mmol/1 L-谷氨酰胺(Gibco，U.K.)，非必需氨基酸(Gibco，U.K.)，10μg/ml转铁蛋白(Boehringer MannheimGmbH，Catalogue NO.1073974)，30nmol/(亚硒酸钠(Sigma)和4μg/ml庆大霉素(Merck)的确定成份的无血清组织培养培养基(50％Dulbecco′s极限必需培养基，50％F-12，BoehringerMannheim GmbH)中单层培养HTZ 19-dM细胞。在3至4天之间移出这一培养的细胞培养物上清液并在-70℃保存至纯化。

为了纯化，将细胞培养物上清液滤过0.45μm过滤器(BectonDickinson，Heidelberg)并用带Amicon YM2膜(排阻限2000 D，Amico Danvers Massachusetts，USA)的膜超滤作用浓缩至为初始体积1％的终体积。将所得物用0.1mol/l乙酸透析30小时(透析膜排阻限为1000D，Reichelt，Heidelberg)，紧接着在4℃以100,000g下进行超离心。弃除沉淀，将上清液冻干用于后续步骤。

用1mol/l乙酸溶解冻干的透析物，在Biogel P-10柱(Pharmacia，Uppsala，2.6×100cm；Biogel P-10，200-400目，Biorad Laboratories，Richmond，加利弗尼亚，USA)上进一步用凝胶渗透色谱纯化。用1mol/l乙酸在22℃平衡凝胶材料，透析物以每5ml 1mol/l乙酸中130-145mg的浓度使用。用1mol/l乙酸以12ml/小时的流速洗脱，以每份4ml收集级分。通过抗肿瘤活性测定(参考实施例5)确定三个活性成份样品池，其中再用反相HPLC纯化对应分子量为8000至17000 D的中间的样品池。为此，首先将这些级分冻干一次，然后溶解在1％三氟乙酸(TFA)中。将所得溶液的100μl等分样每一份进行反相HPLC(流速0.5ml/min)。每一份收集750μl级分。有关HPLC分离的进一步数据如下：梯度控制：溶液A：在水中的0.06TFA

溶液B：0.056％TFA，80％乙腈5分钟内2～25％溶液B120分钟内25～50％溶液B5分钟内50～100％溶液B5分钟内再转至2％柱：mino RPC(Pharmacia)HPLC梯度混合器，泵和检测器：Pharmacia

以1.5ml一个级分收集洗脱液。将等份样品冻干并如实施例5所述进行抗肿瘤活性检验。

用这种方法由5l培养物上清液可得到大约1μg黑素瘤抑制蛋白质。

实施例2实施例2a克隆编码人黑素瘤抑制蛋白质的cDNA

纯化蛋白质的Asp-N和胰蛋白酶消化及用这种方法获得的肽片段的再纯化后，在序列仪中测定MIA的氨基酸序列。C-端肽序列和位于邻近N-端的肽序列被选作两个引物合成的基础。该引物是具有增加的限制性酶切位点的简并寡核苷酸。上游引物1(有义)(UP1)(SEQ ID NO 6)

5′TGTGAATTCAGTTIA/TG/CIGCIGAT/CCAA/GGAA/GTG 3′

EcoRI位点

斜线(/)表示这个位置的碱基在斜线前或在斜线后。这种寡核苷酸是32种不同分子量的混合物，因此覆盖了几乎所有可能的密码子。与靶序的G-T错配只能发生在12和13位，不增强杂交物的稳定性但也不降低其稳定性。另外一种EcoRI接头额外地与5′端相连接是为了能通过PCR容易地再克隆可能的产物。还有3个非特定碱基位于在5′终点的这一接头的前面以使限制性酶切位点不是恰好在末端，因为在此位置限制酶不能很好地酶切。下游引物1(反义)(DP1)(SEQ ID NO 7)

5′TGTGTCGACTGTTCGTAGAAA/GTCCCATCTTA/GTC 3′

SalI位点DP1相应于8个C-端氨基酸，是8-倍简并的且含有一个SalI酶切位点。

引物DP1被用于特定的第一链合成的下述混合物中：5μl 10×PCR缓冲液3μl HTZ-19总RNA混合并加热5分钟至65℃。用移液管加入以下成份：1μl 100mM MgCl₂10μl 2.5mM dNTP0.5μl胎盘RNase抑制剂2μl DP1(1μg)1μl反转录酶。在37℃温育1小时后向上述混合物中加入下列成份：1μl UP1(1μg)5μl 10×PCR缓冲液

70.5μl H₂O1μl Taq聚合酶用下面方法进行30轮扩增94℃ 30秒55℃ 30秒72℃ 60秒最后一轮后将混合物在72℃再温育7分钟以使所有产物完全延伸。

用苯酚/氯仿提取并用EtOH沉淀后，所述PCR混合物用EcoRI和SalI在37℃消化2小时。酶激活后，接着在5％PAA凝胶中分离并整夜洗脱320bp片段。洗脱液的一半与100ng EcoRI/SalI消化的pbluescript整夜结合。由细菌(大肠杆菌DH5a)中能采集白色重组体菌落，将其在第二天转化，并在含有Amp和X-Gal/IPTG SOB琼脂平片上培养。

分离质粒后，用购自Pharmacia的T-7Deaza测序试剂盒将再克隆的插入物测序。T-3和T-7引物(Stratagene)作为引物可购得。下图由阅读序列的重叠形成(引物用粗体)：

(SEQ ID NO 8)GAATTC AAG TTT TCG GCG GAT CAG GAG TGC AGC CAC CCT ATC TCC ATGEcoR1 Lys Phe Ser Ala Asp Gln Glu Cys Ser His Pro Ile Ser MetGCT GTG GCC CTT CAG GAC TAC ATG GCC CCC GAC TGC CGA TTC CTG ACCAla Val Ala Leu Gln Asp Tyr Met Ala Pro Asp Cys Arg Phe Leu ThrATT CAC CGG GGC CAA GTG GTG TAT GTC TTC TCC AAG CTG AAG GGC CGTIle His Arg Gly Gln Val Val Tyr Val Phe Ser Lys Leu Lys Gly ArgGGG CGG CTC TTC TGG GGA GGC AGC GTT CAG GGA GAT TAC TAT GGA GATGly Arg Leu Phe Trp Gly Gly Ser Val Gln Gly Asp Tyr Tyr Gly AspCTG GTC GCT CGC CTG GGC TAT TTC CCC AGT AGC ATT GTC CGA GAG GACLeu Val Ala Arg Leu Gly Tyr Phe Pro Ser Ser Ile Val Arg Glu AspCAG ACC CTG AAA CCT GGC AAA GTC GAT GTG AAG ACA GAT AAA TGG GATGln Thr Leu Lys Pro Gly Lys Val Asp Val Lys Thr Asp Lys Trp AspTTC TAC GAA CAGTCGACPhe Tyr Glu SalI

用于克隆由在确定成份的培养基(dM)中生长的HTZ-19黑素瘤细胞的RNA合成的完全cDNA的λgt11 cDNA文库是可获得的。

以8000 pfu涂布共25块平板，每板上置有2个硝基纤维素过滤器，它们与用切口平移标记的纯化的MIA-PCR插入物杂交(50ml杂交溶液，2×10⁶cpm/ml)。经过两天放射自显影后得到几个信号，它们在两个滤器上给出相应的杂交信号。收集相应的噬菌体-噬斑并进行再筛选。为此每个分离的噬斑的四个稀释步骤被制成平板，具有100-300pfu的平板被用于两次进一步的再筛选。

50ml过夜培养后，从由这种方式分离的噬斑可分离λDNA，其40μg用EcoRI消化并在5％PAA凝胶中分离。洗脱插入物，8ng用于与100ng EcorRI-消化的去磷酸化载体(pbluescript，Stratagene)连接。连接混合物的一半用于感受态大肠杆菌DH5a的转化作用，大肠杆菌DH5a涂布在含有IPTG和X-Gal的SOB/Amp平板上以进行兰/白选择。采集重组体克隆，分离质粒DNA，插入物被测序。具有完全编码序列的插入物的序列见SEQ ID NO 1。

用这种方法得到的质粒是pbs L 7MIA，该质粒于93年7月14日在德国Braunschweig的“Deutsche Sammlung frMikroorganismen und Zellkulturen GmbH”(DSM)(DSM 8420)保藏。

用于克隆的所有方法在J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis(1989)，Molecular cloning：a laboratorg manual，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor USA中有详细描述。

实施例2b克隆编码人黑素瘤抑制蛋白的基因

将商业上可由Stratagene(Heidelberg)购得的噬菌体λFIXII(Elgin et al.，Serategies 4(1991)8～9)中的人基因组DNA文库根据已建立的方法(Sambrook et al.，MolecularCloning(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press)覆盖在硝基纤维素滤膜上。为了用作杂交样品，按已建立的技术(Sambrook et al.，Molecular Cloning(1989)，Cold SpringHarbor Laboratory Press)放射标记并使用得自实施例2a的编码人MIA的cDNA预杂交(2小时)和杂交(16小时)在60℃下在6×SSC，5×Denhardt′s溶液，100μg/ml鲑鱼精液DNA和0.1％SDS中进行。以1×10⁶cpm/ml浓度向杂交制剂中加入³²P-dCTP-标记的样品。然后在60℃用2×SSC、0.1％SDS洗涤滤膜两次20分钟，再用1×SSC，0.1％SDS洗涤两次20分钟，最后用0.25×SSC，0.1％SDS洗涤两次20分钟。接着将滤膜干燥并暴露于X-射线胶片下24至48小时。经再杂交分离并确认用这种方法产生阳性杂交信号的噬斑。通过使用MIA cDNA样品的Southern杂交作用鉴定这些噬菌体中含有的作为插入物的人基因组DNA。为此目的，噬菌体DNA用限制性内切核酸酶XbaI切割，在0.8％琼脂糖凝胶上分离，然后按照Southern的方法(J.Mol.Biol，98 (1975)503)转移到硝基纤维素上。在上述条件下，将如此得到的滤膜与作为样品的完整的MIAcDNA杂交，由此大约1.4kb和大约2.2kb大小的两个XbaI片段给出阳性信号。将这两个片段中的每一个克隆到适于测序且可由Stratagene(Heidelberg)购得的质粒pbluescriptsk(Short et al.，Nucl.Acids Res.16(1988)7583-7600；Alting-Meese andShort，Nucl.Acids Res.17(1989)9494)上。编码人MIA的完整序列位于四个外显子中，它们与其侧翼序列一起示于SEQ ID NO：3中。由于没有研究MIA外显子位于其上的两个XbaI片段之间是否有一个或甚至几个另外的XbaI片段，因此不能得出内含子2事实上更大的结论。

实施例2c克隆编码鼠黑素瘤抑制蛋白质的cDNA

用实施例2a的方法，将市售的(Novagene，New York)得自13.5日龄的小鼠胚胎在载体λEXlox(Palazzolo et al.，Gene88(1990)25-36)中的cDNA文库转移到膜上。就杂交样品来说，使用来自实施例2a的以放射性标记形式的编码人MIA的cDNA。除杂交和洗涤过程中在这里使用的温度是55℃外，杂交条件与实施例2b中的相同。将如此经再杂交获得并确认的噬斑中存在的cDNA插入物测序。含有鼠MIA的完全编码DNA的插入物序列示于SEQ ID NO：4中。实施例2d克隆编码鼠黑素瘤抑制蛋白质的基因

在这一实施例中，用类似于实施例2b的方式，用来自实施例2c的鼠MIA cDNA为样品研究鼠基因组DNA文库(来自BALB/C成年小鼠的肝脏，在EMBL 3载体(Frischauf et al.，J.Mol.Biol.170(1983)827)中可从Clontech，Palo Alto CA购得)。条件与实施例2b相同。进一步的处理方法也以类似的方式进行。

实施例3

实施例3a测定黑素瘤抑制蛋白质对肿瘤细胞的抗增殖作用

为了测定实施例1得到的黑素瘤抑制蛋白质或蛋白级分对黑素瘤细胞的抗增殖作用，在96孔微量培养板(Costar，Zrich)上培养指数生长的HTZ 19-dM细胞24小时，每板有100μl无血清培养基(见实施例1)，密度为每孔3×10³个细胞(按照Chambard etal.，J.Cell.Physiol.135(1988)，101-107)。然后这些细胞与待测蛋白质级分一起在37℃/5％CO2条件下温育4-5天。向每孔加入1μCi ³H-胸腺嘧啶脱氧核苷(特异性活性23Ci/mmol，Amersham Buchler，Braunschweig，德国)后，在相同条件下将细胞再温育8小时，然后用液体闪烁记数器用常规方法在酸沉淀后测定3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入到细胞DNA中的掺入作用。待测蛋白质级分的活性以与未处理过的对照细胞³H-胸苷掺入作用比较处理过的细胞³H-胸苷掺入作用的百分比表示。通过用不同浓度的纯化的黑素瘤抑制蛋白质，可测定与未处理的对照相比，这种³H-胸苷掺入作用50％被抑制的浓度(IC50值见下面表1)。

表1黑素瘤抑制蛋白质对各种肿瘤细胞的抗增殖作用

肿瘤细胞系	IC50(μg/ml)1)
肿瘤细胞系	IC50(μg/ml)1)	a)黑素瘤细胞株HTZ 19-dMATCC HTB 69HTZ 320HTZ 318ATCC CRL 1424b)神经母细胞瘤Kellyc)成胶质细胞瘤ATCC HTB17d)星形细胞瘤HTZ 243HTZ 209	1.23.71.353.52.1801055

1)使用了第一纯化步骤后得到的蛋白质(过Biogel P10柱后，

比完全纯化后低50-100倍活性)。

实施例3b测定黑素瘤抑制蛋白质对肿瘤细胞转移的抑制作用

为了测定对MIA转移的抑制作用，使用了改良的Boyden ChamberSystem(Albini et al.，Cancer Res.47(1987)3239-3245)。由坚固的Costar得到腔室(Blind Well Chamber No.441200)。为了模拟下腔室中化学引诱剂和上腔室中细胞之间基底类膜屏障，将52μl Matrigel(Becton Dickinson Cat.No.40234)加到聚碳酸酯纤维滤器上(孔大小8μm，Costar No.150446)。下腔室装入210μl成纤维细胞条件培养基作为化学引诱剂。按下述方法获得该培养基：在不加牛胎血清下，将正常人皮肤成纤维细胞保持在DMEM培养基(Gibco)中的第10和第20通道之间24小时。这种条件培养基以不稀释状态作为化学引诱剂使用。向Boyden仪上腔室中加入2×10⁵个待测的在800μl有和没有MIA活性成份的DMEM(Gibco，无牛胎血清)中的肿瘤细胞。用所描述的有关经MIA对其迁移行为的抑制作用的方法能试验人(见实施例3a或实施例8)或动物肿瘤细胞(例如，B16(ATCC CRL 6322))，当不加黑素瘤抑制蛋白时，在约4小时期间内大约10％的肿瘤细胞由上腔室迁移到下腔室中，在那里粘着在Matrigel膜的较低的一边。在那里，将其固定，染色，然后计数。如果将人或鼠黑素瘤抑制蛋白质MIA加到上腔室中，则细胞迁移被大大抑制。图1给出了所得到的抑制值([在下腔室中计数细胞，有MIA的实验]-＼[在下腔室中计数细胞，没有MIA的实验]×100％)。

实施例4测定免疫学活性

实施例4aMIA抑制T细胞介导的细胞毒活性

在标准⁵¹Cr释放试验中特异于MBP肽87-106的CD₄+T细胞系D7.1能溶解存在MBP及肽87-106的靶(靶：Daudi细胞，R.Martin，U.Utz，J.E.Coligan，J.R.Richert，M.Flerlage，E.Robinson，R.Stone，W.E.Biddison，D.E.MacFarlin，H.F.MacFarland Diversity.in fine specificity and T cellreceptor usage of the human CD⁴⁺ cytotoxic T cellresponse specific for the immunodominant myelin basicprotein peptide 87-106，J.Immunol.(1992)，148(5)，1359-1366)。加入MIA后(使用量相当于大约50-100ng/ml纯化的MIA)，肽特异性细胞毒性被抑制大约55％(图2a)，而MBP特异性细胞毒性被抑制大约50％(图2b)。如所期望的，抑制作用稍稍依赖于效应物-靶比值(E∶T)该比值在这种情况下在1∶1或5∶1的非常低的水平，因而抑制作用是高度特异性的(图2)。

实施例4bMIA抑制淋巴因子激活外周血淋巴细胞(LAK细胞)的细胞毒活性

LAK细胞是非克隆扩增的淋巴因子激活的外周血淋巴细胞，占优势地是T淋巴细胞(A.A.Rajncr，E.A.Grimm，M.T.Lotze，E.W.Chu，S.A.Rosenberg，Lymphokine activated killer(LAK)cells：Analysis of factors relevant for immunotherapyof human cancer，Cancer 55(1985)，1327-1333)。它们被用于肿瘤治疗的许多免疫疗法中的标准方法中。在本次实验中，在微细胞毒性测定中检验LAK细胞以HTZ-19黑素瘤细胞为靶的细胞毒性。在效应物-靶比值为1∶1、5∶1和10∶1时，最大细胞毒性(CTX)几乎达40％。加入MTA后(浓度如实施例4a)，该毒性得到了大大抑制，且在低效应物-靶比值时可达最大80％抑制，这一比值很可能预期接近肿瘤本身(图3)。

实施例4cMIA抑制IL-2依赖性和植物血细胞凝集素依赖性淋巴细胞的增殖作用

可用标准化的经典的方法用植物血细胞凝集素(PHA)和白介素-2(IL-2)刺激外周血淋巴细胞(PBMC)(J.E.Coligsn，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，W.Strober，Current protocols in immunology，NIH Monograph，J.WileySons，Now York，1992)。在这一方法中，T细胞几乎单一地由PHA刺激，而IL-2占优势地刺激T淋巴细胞但也刺激具有IL-2受体的B细胞。当它们在所述剂量范围(蛋白质纯度：第一纯化步骤后(Biogel P10柱)其活性比完全纯化后低大约50-100倍)与MIA共同温育时，获得PHA应答的非常强的抑制作用是可能的(图4)。IL-2应答在较高剂量范围内被抑制(图5)。

实施例5MIA作为融合蛋白在大肠杆菌中的重组表达

实施例5a表达载体的构建

为了表达具有适于在大肠杆菌中作为载体的蛋白质的融合蛋白质MIA，可以使用例如市售的载体pQE40(Cat.No.33403，DIAGEN GmbH，Dsseldorf)。编码成熟形式MIA的cDNA片段被插入到载体限制性位点SphI和HindIII(每个位点只出现一次)之间。使用作为模板的克隆MIAcDNA和两个合适的引物(5 ′-GATGCATGC-GGTCCTATGCCCAAGCTG-3′(SEQ ID NO 9)和5′-GATAAGCTTTCA-CTGGCAGTAGAAATC-3′(SEQ ID NO 10)。按现有技术经PCR扩增可很简单地制备这种类型的片段。用SphI和HindIII切割所得的PCR片段并将其连接到用相同方法处理过的载体pQE40上。所得质粒表达DHFR(二氢叶酸盐还原酶作载体)和MIA的融合蛋白。为了从这种融合蛋白质中解脱分裂出游离的MIA，将编码IgA蛋白酶(Ser Arg ProPro/Ser)的识别序列的DNA片段克隆到DHFR和MIA之间。这一过程按以下完成：用BgIII(具有线性化载体后续分离的部分限制性)和SphI切开表达质粒，然后插入衔接子

(5′-GATCTAGCCGGCCGCCCAGCCCGGCATG-3′(SEQ ID NO 11)和

5′-CCGGGCTGGGCGGCCGGCTA-3′(SEQ ID NO 12)，杂交成双链。所得表达质粒pQE40-MIA编码DHFR和MIA融合蛋白，其IgA蛋白酶酶切位点位于DHFR和MIA之间。该融合蛋白在N-端携带6个组氨酸，它在Ni-螯合凝胶材料的帮助下可用于纯化该融合蛋白。这类方法在EP-A0282042和EP-A0253303在此一并作为参考中有描述。图6示出了表达质粒pQE40-MIA。

通过消除载体蛋白DHFR并用尽可能小且能完成相同功能的肽取代它，可优化MIA内含物。这种合适的肽是，例如，MetArgGlySer-

HisHisHisHisHisHisGlySerSerArgProPro(SEQ ID NO 13)(这种肽可被IgA蛋白酶从紧接着的成熟MIA的氨基酸序列分裂开来，这种方法在WO91/11520中描述。这里一并作为参考)或MetArgGlySerHisHisHisHisHisHisGlySerValAspAspAspAspLys-(SEQ ID NO 14)(这种肽可由肠激酶从紧接着的成熟MIA的氨基酸序列分裂开来)。用下面方法可以制备编码这种MIA肽融合物的表达质粒：用作为模板的MIA cDNA(SEQ ID NO：1)和引物5′-AAAAAGGATCCAGCCGGCCGCCCG-GTCCTATGCCCAAGCTGGC-3′(SEQ ID NO 15)和5′-GGCGAGCAG-CCAGATCTCCATAG-3′(SEQ ID NO 16)的PCR扩增得到用BamHI和BgIII再切割的片段。也用BamHI和BgIII限制性酶切表达载体pQE40-MIA；所得片段的较小片段被弃掉并被所描述PCR片段取代。由此得到一种表达载体，它在诱导后表达融合蛋白MetArgGlySerHisHisHisHis-

HisHisGlySerSerArgProPro-MIA(SEQ ID NO 13)。用引线物5′-AAAAAAGGATCCGTTGATGATGACGATAAAGGTCCTATGCCCAAGCTGGC-3′(SEQ ID NO 17)和5′-GGCGAGCAGCCAGATCTCCATAG-3′(SEQ ID NO 16)以完全类以的方式获得融合蛋白MetArgGlySerHisHisHisHisHisHisGlySerValAspAspAspAspLys-MIA(SEQ ID NO 14)。

用类似方法可制得其它相似的肽和MIA的融合蛋白，并在合适的(特别是强的和诱导型)启动子的控制下，克隆到从大肠杆菌发现的许多质粒中的一个中，并使其表达。在大肠杆菌中引起融合蛋白分泌到周质中，然后分裂并释放MIA的多肽与MIA的融合是另一种可选择的方式。WO88/09373中描述了这种方式，这里一并作为参考。

实施例5b融合蛋白的表达和MIA的回收

表达质粒pQE40-MIA(或例如通过使用基本载体或其它载体蛋白质或载体肽能得到的相似的表达质粒，这些可供选择的方法除在实施例5a中描述外，还在Methods of Enzymology 185(GeneExpression Technology)，ed David V.Goeddel，AcademicPress 1991中有描述)，转染到合适的有足够lac抑制剂表达作用的大肠杆菌菌株中，以便得到MIA融合蛋白的诱导表达。为此目的，有合适的例如菌株大肠杆菌M15[pREP4]，(它可与pQE40(DiagenGmbH，Dsseldorf)一起购得)或其它大肠杆菌菌株，例如UT5600(Earhart et al.，FEMS Microbiology Letters 6 (1979)277-280)，或大肠杆菌BL21(Godborg and Dunn，J.Bacteriol.170(1988)1245-1254)，它们事先已被lac抑制剂表达辅助质粒(如，pUBS520(描述于Brinckmann et al.，Gene 85(1989)109-114或EP-B-0373365中))转染。其次，通过下述方法可得MIA：在LB培养基上培养大肠杆菌M15[pREP4/pQE40-MIA]直至光密度达到0.6(在550nm测量)，然后以1mM的终浓度加入IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，Boehringer MannheimGmbH)，然后再培养4小时。离心分离细胞，置于有300mM NaCl，pH7.5的100mM磷酸钠缓冲液中并经冷冻和解冻三次溶解，然后用超声处理。向经离心澄清的溶胞产物中加入Ni-NTA-琼脂糖(DiagenGmbH)，考虑到制备者所述的最大结合能力，在室温下搅拌温育过夜。用低速离心分离如此载有融合蛋白的凝胶材料，用100mM pH7.5的磷酸盐缓冲液洗涤两次并用pH6.1的磷酸钠缓冲液洗涤两次。此后，经在37℃在100mM pH7.5磷酸钠缓冲液中用IgA蛋白酶(BoehringerMannheim GmbH)的凝胶材料的过夜温育从融合蛋白上分裂出MIA，离心过夜分离凝胶材料，无菌过滤后含MIA的上清液用于实施例3和4所描述的活性试验中。

实施例6非融合MIA在大肠杆菌中的重组表达

以使其在大肠杆菌中有效表达的方式修饰编码MIA的DNA序列。为达到此目的，使用作为模板的人MIA cDNA(SEQ ID NO：1)和引物1(5′-AAAAACATATGGGACCAATGCCAAAATTAGCAGATCGTAAATTATGTG-CAGATCAGGAG-3′(SEQ ID NO 19))和2(5′AAAAAAAGCTTTCAC-TGGCAGTAGAAATC-3′(SEQ ID NO 20))，进行PCR扩增。引物1以在不改变MIA氨基酸序列时，DNA序列和其mRNA序列对大肠杆菌是最适的方式改变N-端区的编码MIA的序列，加入起始密码子met，就在这一位点插入了限制性内切核酸酶Ndel的识别序列，这一序列使得接着将这样修饰的MIA编码片段克隆到了含有(最好是强的和诱导型的)启动子和具有后来置于的Ndel酶切位点的翻译起始序列(ShineDalgarno Sequence)的载体上。引物工作为3′-反向引物起作用并含有HindIII酶切位点，以便使修饰的MIA编码片段作为Ndel HindIII片段插入到载体中。如此修饰的MIA编码序列示于SEQ ID NO 18中。用这种方法制备的一种表达质粒是pH379(DSM9267)，该质粒已于1994年6月29日在Braunschweig的“Deutsche Sammluny vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH”，D-38124保藏。

为了表达，将用于表达未融合MIA的表达质粒转染到合适的大肠杆菌菌株中。在使用lac阻遏物控制下的表达质粒(如表达质粒p11379 )的情况下，这样的菌株是具有足够高lac阻遏物细胞内浓度的菌株。可通过转染第二质粒如pREP4(Diagen GmbH)，pUBS500或pUBS520(Brinckmann et al.，Gene 85(1989)109-114)制备这些类型的菌株。所用大肠杆菌菌株最好具有低的细胞本身的蛋白酶活性，例如，用E.coli UT5600(Earhart et al.，FEMSMicrobiology Letters 6(1979)277-280)，E.coli BL21(Grodberg and Dann，J.Bacteriol 170(1988)1245-1253)或E.coli B就是这种情况。然后以类似于实施例5b的方法进行表达培养。为了回收MIA，可按照EP0241022，EP0364926，EP0219847和DE-A4037196中描述的方法处理作为蛋白质聚集体从大肠杆菌获得的蛋白质。

更详细地，例如用下述方法实现该目的：将来源于大肠杆菌发酵(称作“inclusion bodies”)的含MIA的蛋白质聚集体(所谓“包含体”)溶解在6M盐酸胍，100mM pH8的Tris HCl，1mM EDTA中然后调pH3至4，并在pH3.5下对4M盐酸胍透析。然后在pH8的1M精氨酸，1mM EDTA，5mM GSH(谷胱苷肽，还原态)和0.5mMGSSG(谷胱苷肽，氧化态)中使溶解的蛋白质复性。通过复性制备可得到MIA，例如，加入1.4M硫酸铵后被疏水凝胶基质(如FractogelTSK Butyl(E.Merck，Darmstadt))吸附，然后用20mM pH7的Tris HCl洗脱。

实施例7MIA在真核细胞中的重组表达

实施例7aMIA在哺乳动物细胞中的重组表达

为此，将人(SEQ ID NO：1)或鼠(SEQ ID NO：4)MIAcDNA或其相应基因组DNA片段连接到载体上，以强启动子一增强子系统为基础在所述载体中，所述cDNA和DNA片段被转录到哺乳动物细胞中(在基因组MIA片段的情况下，这一步是必须的，因为MIA本身的启动子只在某些细胞类型，例如黑素瘤中有活性，因此不适于一般重组表达；但通过如实施例9所描述的体外同源重组也可进行表达)。这样的启动子和增强子大多数来自病毒如SV40，hCMV，多形瘤或逆转录病毒。或者也可以使用特异于某些细胞类型或组织类型的启动子-增强子体系，例如WAP-MMTV-或免疫球蛋白启动子，或其它诱导型体系，例如金属硫蛋白启动子。这种载体补充具有RNA加工的供体和受体信号以及poly-A-加成信号的MIA cDNA(如果使用后者)。例如图7所示pCMX-pL1(Umesono et al.，Cell 65(1991)1255-1266)就是这种合适的载体。被提供EcoRI接头的MIA cDNA连接到这一载体的一个位点且只是EcoRI酶切位点上，其中通过借助这种载体(见SEQ ID NO：23)多接头中其它酶切位点的限制性分析，保证MIA cDNA朝CMV启动子的阅读方向取向。当克隆到其它载体(例如pCDNA3(Invitrogen，San Diego/USA)或pSG5(Stratagene，LaJolla/USA)中时使用绝对相似的方法。由大肠杆菌制备由此得到的表达质粒的DNA并使用特定情况下特异于细胞类型的技术(Methodsof Enzymology 185(Gene Expression Technology)，ed.Dayid V.Goeddel，Academic Press 1991，Section V)转染到哺乳动物细胞中。按照已公开的方法(Bttner et al.，Mol.Cell.8iol.13(1993)4174-4185)将表达质粒转染到人畸胎瘤细胞系PA-lsc9177(Bttner et al.，Mol.Cell.Biol.11(1991)3573-3583)中，其中每100mM培养皿的200,000个细胞被5μg DNA转染。转染后在无牛胎血清的MEM(Gibco)中培养细胞，由此，48小时后在细胞培养物上清液中可测定MIA。

实施例7bMIA在昆虫细胞中的重组表达

为在昆虫细胞中表达，将编码MIA的DNA片段，尤其是人MIA cDNA(SEQ ID NO：1)插入到得自AcMNPV(苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒)或BmNPV(家蚕核型多角体病毒)的载体中。为此，使MIAcDNA在强启动子控制下首先引入，所述强启动子适于昆虫细胞(D.R.O′Reilly，L.K.Millor and V.A.Luckow，BaculovirusExpression Vectors-A Laboratory Manual(1992)，W.H.Freeman & Co.，New York)，如poIH启动子或p10启动子。为了借助于poIH启动子表达MIA，使用了以下方法：按公知技术，使用MIA cDNA为模板和引物5′-CGTGAATTCAACATGGCCCGGTCCCTGGTGTGC-3′(SEQ ID NO 21)和5′-TATCTGCAGTCACTGGCAGTAGAAATCCCA-3′(SEQ ID NO 22)。通过PCR扩增获得编码MIA并含有限制性内切核酸酶EcoRI(与后MIA转录的5′端相邻)和PstI(与后MIA转录的3′端相邻)酶切位点的DNA片段。用EcoRI和PstI再切割该片段(为了产生相应的粘端)并连接到用相同内切核酸酶限制性酶切的转移载体pVL 1393上(D.R.O′Reilly，L.K.Miller and V.A.Luckow，BaculovirusExpression Vectors-A Laboratory Manual(1992)，W.H.Freeman & Co.，New York)，该转移载体pVL是商业上可购得的(PhorMingen，San Diego，CA或Invitrogen Corporation，SanDiego，CA)。为进行增殖，将所得转移表达质粒pVL 1393-MIA转染到大肠杆菌K12，并按已建立的方法制备质粒DNA。按已建立的方法(O′Reilly et al.(1992)，见上文)，通过同源重组完成在poIH启动子控制下的MIA DNA由转移质粒向杆状病毒载体的转移。为此将0.5μg Baculo Gold DNA(具有致死缺失作用和在poIH启动子控制下的LacZ表达的线性化的AcNPV病毒DNA，可由PharMingen购得，序号21100D)和2μg pVL13-93-MIA混合，室温下温育5分钟，然后与1ml，125mM，pH7.1的Hepes，125mM CaCl₂，140mM NaCl混合。将该混合物加至事先用1ml含有10％牛胎血清的Grace′s培养基铺盖的直径为60mm的培养皿中的2×10⁶SF9昆虫细胞中(Invitrogen，Order No.13825-01)。在4℃温育4小时后，移去含DNA的培养基，细胞在27℃在新鲜培养基中温育4天。接着通过噬斑形成将以这种方式得到的重组杆状病毒纯化两次(O′Reilly et al.(1992)，见上文)，其中通过β-半乳糖苷酶活性的缺失(在5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷存在下因没有蓝色可光学识别)可从使用的野生型病毒(具有致死缺失作用和在poIH启动子控制下的LacZ表达作用的AcNPV，可由Pharmingen购得，序号21100D)中识别通过重组作用已被插入MIA的病毒。按已建立的方法(O′Reilly et al.(1992)，见上文)用如此得到的MIA表达重组杆状病毒浸染SF9细胞(MOI＝20pfu/细胞)，并在无血清培养基(细胞/完全Bac无血清昆虫细胞培养基，Stratagene，序号205120)在27℃再温育至少36小时。接着移去细胞培养物上清液，通过超离心(Beckmann Ti 60 Rotor，30,000rpm)分离包含在上清液中的病毒，然后通过Microcon 100 Filter(Amicon，排阻限100kD)过滤上清液)。如此得到的含MIA的溶液可用于实施例3和4中所述的试验中，或根据实施例1进一步纯化。

实施例8各种细胞中MIA mRNA的检测

一方面，可用已建立的核酸杂交方法(例如Northern杂交，原位杂交，斑点或狭线杂交，和由此衍生的诊断技术。(Sambrook etal.，Molecular Cloning-ALaboratory Manual(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Nucleid AcidHybridisation-A Practical Approach(1985)，eds.B.D.Hames and S.J.Higgins，IRL Press；WO 89/06698，EP-A0200362，USP2,915,082，EP-A0063879，EP-A0173251，EP-A0128018)完成特定细胞中的MIA表达和由此的MIAmRNA存在的检测。另一方面，可以使用来自使用MIA特定引物(PCRProtocols-A Guide to Methods and Applications(1990)，eds.M.A.Innis，D.H.Gelfand，J.J.Sninsky，T.J.White，Academic Press Inc；PCR-A Practical Approach(1991)，eds.M.J.McPherson，P.Quirke，G.R.Taylor(1991)，IRLPress)的多种扩增技术的方法。表2A和2B示出了MIA在各种人肿瘤、肿瘤细胞系和正常细胞中的表达，在这种情况下是用放射性标记的人MIA cDNA(SEQ ID NO：1)的Northern杂交进行测定的。为此目的，从按(homczynski和Sacchi，Anal.Biochem.162(1987)156-159的方法所列的细胞分离RNA。在1％琼脂糖甲醛凝胶上分离20μg总RNA并按标准方法(Sambrook et al.，MolecularCloning-A Laboratory Manual(1989)，Cold Spring HarborLaboratory Press)将其转移到绵纶膜(Amersham，Braunschweig)上。放射标记(Feinberg and Vogelstein，Anal.Biochem，137(1984)266-267)这个完整的人MTA cDNA(SEQ ID NO：1)作为样品。在68℃，在5×SSC，5×Denhardt′s 0.5％SDS，10％硫酸葡聚糖和100μg/ml鲑鱼精液DNA中进行杂交。然后在68℃以1×SSC每小时洗涤膜两次，然后使膜对X-射线胶片曝光。表2A

肿瘤	试验序号	Northern印迹法阳性
肿瘤	试验序号	Northern印迹法阳性	成星形细胞瘤间胶质瘤室管膜瘤成神经细胞瘤成胶质细胞瘤Colon CA恶性黑素瘤CNS转移成神经管细胞瘤乳腺癌支气管癌CNS转移	104341326212	3000016000

表2B

正常细胞	试验序号	Northern印迹法阳性
正常细胞	试验序号	Northern印迹法阳性	胚胎成纤维细胞单核血细胞(三个供血者)	23	00

实施例9MTA编码核酸用于治疗目的的用途

MIA抑制肿瘤细胞的增殖和转移。在动物模型和患者中，不仅可以通过MIA蛋白的内源导入也可以通过DNA片段的插入产生这一效果，所述DNA片段在合适启动子的控制下编码MIA，或含有能通过同源重组在细胞自身MIA基因之前整合到基因组中的合适的启动子。在后一种情况下，该启动子一定是处于在5′-未翻译区以尽可能高的程度与人(或以动物为模型的情况下是动物)MIA基因同源或优选地甚至是相同的序列部分的侧翼(参见例如WO91/09955)。通过这一方法，如果DNA片段被插入到肿瘤细胞本身中，获得肿瘤细胞以增加的程度表达MIA，因而抑制它自身的增生和转移是可能的。然而在很多情况下，相应的基因片段不必特定地和单独地插入到肿瘤细胞本身中，因为在其它体细胞，尤其是与肿瘤相邻的体细胞中的表达会通过增加MIA释放也产生肿瘤细胞的抑制作用，下面的实施例给出了MIA编码DNA片段在动物模型中的治疗效果。

给小鼠C57BL的尾静脉注射鼠B16黑素瘤细胞(ATCC CRL 6322)，然后确定肺转移量，是建立的转移形成的体内模型。在C57BL小鼠眼球后注射黑素瘤细胞系1316的100,000个细胞(第1天：16只动物)。48小时后，对8只动物的每一只在尾静脉注射在与DOTAP转染剂(Leventis and Silvius，Biochim，Biophys.Acta.1023(1990)124-132，由Boehringer Mannheim GmbH购得，Cat.No.1202375)混合的TE(10mM Tris HCl pH8.0 1mM EDTA)中的100μg MIA表达质粒pCMX-PL1-MIA(实施例7a)。给对照组(8只动物)注射相同的质粒，但无MIA序列。13天后，无MIA的对照组8只动物中的6只发展为局部肿瘤；在肺、脾、肾和肝中转移的平均数为7.8。已给予MIA编码质粒的组的8只动物中只有4只发展为局部肿瘤，且转移平均数为2.7。

序列表(1)一般信息：

(i)申请人：

(A)姓名：BOEHRINGER MANNHEIM GMBH

(B)街道：Sandhofer Str.116

(C)城市：Mannheim

(D)州： BW

(E)国家：德国

(F)邮政编码(ZIP)：D-68305

(G)电话：08856/60-3446

(H)光传真：08856/60-3451

(ii)发明名称：黑素瘤抑制蛋白质

(iii)序列数：24

(iv)计算机可读形式：

(A)介质类型：Floppy盘

(B)计算机：IBM PC compatible

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.25(EPO)

(vi)优先申请数据：

(A)申请号：DE P 43 24 247.2

(B)申请日：1993年7月20日(2)SEQ ID NO：1信息：

(i)序列特征：

(A)长度：459个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(ix)特性：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：40..432

(ix)特性：

(A)名称/关键词：sig肽

(B)位置：40..111

(ix)特性：

(A)名称/关键词：mat肽

(B)位置：112..432

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：CCAGCACCCC CTTGCTCACT CTCTTGCTCA CAGTCCACG ATG GCC CGG TCC CTG 54

Met Ala Arg Ser Leu

-24 -20GTG TGC CTT GGT GTC ATC ATC TTG CTG TCT GCC TTC TCC GGA CCT GGT 102Val Cys Leu Gly Val Ile Ile Leu Leu Ser Ala Phe Ser Gly Pro Gly

-15 -10 -5GTC AGG GGT GGT CCT ATG CCC AAG CTG GCT GAC CGG AAG CTG TGT GCG 150Val Arg Gly Gly Pro Met Pro Lys Leu Ala Asp Arg Lys Leu Cys Ala

1 5 10GAC CAG GAG TGC AGC CAC CCT ATC TCC ATG GCT GTG GCC CTT CAG GAC 198Asp Gln Glu Cys Ser His Pro Ile Ser Met Ala Val Ala Leu Gln Asp

15 20 25TAC ATG GCC CCC GAC TGC CGA TTC CTG ACC ATT CAC CGG GGC CAA GTG 246Tyr Met Ala Pro Asp Cys Arg Phe Leu Thr Ile His Arg Gly Gln Val30 35 40 45GTG TAT GTC TTC TCC AAG CTG AAG GGC CGT GGG CGG CTC TTC TGG GGA 294Val Tyr Val Phe Ser Lys Leu Lys Gly Arg Gly Arg Leu Phe Trp Gly

50 55 60

GGC AGC GTT CAG GGA GAT TAC TAT GGA GAT CTG GCT GCT CGC CTG GGC 342Gly Ser Val Gln Gly Asp Tyr Tyr Gly Asp Leu Ala Ala Arg Leu Gly

65 70 75TAT TTC CCC AGT AGC ATT GTC CGA GAG GAC CAG ACC CTG AAA CCT GGC 390Tyr Phe Pro Ser Ser Ile Val Arg Glu Asp Gln Thr Leu Lys Pro Gly

80 85 90AAA GTC GAT GTG AAG ACA GAC AAA TGG GAT TTC TAC TGC CAG 432Lys Val Asp Val Lys Thr Asp Lys Trp Asp Phe Tyr Cys Gln

95 100 105TGAGCTCAGC CTACCGCTGG CCCTGCC 459

(2)SEQ ID NO：2信息：

(i)序列特征：

(A)长度：131氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Ala Arg Ser Leu Val Cys Leu Gly Val Ile Ile Leu Leu Ser Ala-24 -20 -15 -10Phe Ser Gly Pro Gly Val Arg Gly Gly Pro Met Pro Lys Leu Ala Asp

-5 1 5Arg Lys Leu Cys Ala Asp Gln Glu Cys Ser His Pro Ile Ser Met Ala

10 15 20Val Ala Leu Gln Asp Tyr Met Ala Pro Asp Cys Arg Phe Leu Thr Ile25 30 35 40His Arg Gly Gln Val Val Tyr Val Phe Ser Lys Leu Lys Gly Arg Gly

45 50 55Arg Leu Phe Trp Gly Gly Ser Val Gln Gly Asp Tyr Tyr Gly Asp Leu

60 65 70Ala Ala Arg Leu Gly Tyr Phe Pro Ser Ser Ile Val Arg Glu Asp Gln

75 80 85

Thr Leu Lys Pro Gly Lys Val Asp Val Lys Thr Asp Lys Trp Asp Phe

90 95 100Tyr Cys Gln105(2)SEQ ID NO：3信息：

(i)序列特征：

(A)长度：3565碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特性：

(A)名称/关键词：sig肽

(B)位置：1378..1449

(ix)特性：

(A)名称/关键词：外显子

(B)位置：1378..1504

(ix)特性：

(A)名称/关键词：外显子

(B)位置：1586..1719

(ix)特性：

(A)名称/关键词：外显子

(B)位置：2804..2914

(ix)特性：

(A)名称/关键词：外显子

(B)位置：3232..3252

(ix)特性：

(A)名称/关键词：-

(B)位置：(2216)中之一

(D)其它信息：/注＝“在位置2216的N表示核苷酸不确

定的数目和序列”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：TCTAGACANA TAAAAATAAA AGAAATCATC CAAGAATGGT GACTTGCCTA CTATTCTACT 60CGAGAGGCTG AGAGGGGAGG ATTTCTTGAC CCCGGNAGTT TAAGGATGCA GTGAGCTATG 120ATCACATCAC TGTACTTCAG CCTGAGCAAC AGCAAGATCC TGTCTCTAAA AATTAAATAA 180GGCTGGGCTT GGTGGCTCAT GCTGTAATCC CAGCACTTTG GAAGGCCATG GTGGGCAGAT 240TGCTTGAGCC CAGGAGTTTG AGACGAGGCT GGGCAACATG ACGAAACCCC GGCTCTACCA 300AAAAATACAA AAAATTAACT GGGCATAATG GTACATGTCT GTGGTCCCAG CTACTCGGTA 360GGCTGAGGTG GGAGGAATGC TTGAGCCCAG GAAATAGGGG CTACAGTGAA CCAGGATGAT 420GCCAGTGCAC TCCAACCTGG GCAACAGAGC AAGACTCTAC CTCAAAATAA TTTAAAAAAA 480TGGATTAATT GGGCATAGGT GGCTTGTGCC TGTAGTCCCA GTTACTCAGG AGCCTGAGGT 540GGGAGGATTG CCTGAGTCTA GGAGGTTGAG GCTGCAGTGA GCCGGGATGG CACCATTGCA 600CTCCACCTGG GCAACAGGGT GAGACCCTGT CTCAAAAAAG AAAAAAAAGG GAGGGGTTAT 660AATCACTCCT CCTGACATGA TACAGAGTAT CCATTTGAGT TCATAACATA AATATGTACT 720TGGTGAATGC TCTGTAACTA TTGGTGAATG CTCTGTAACT ATTGGCTTTT TTATTGTTCC 780CATTTTACAT ATAAGGAAGC TGAGGCTTTG TGAGGAGAAA TAGCTTAGCC CAGGTCATCC 840AGTGGGAAGC GTCTGGTGCA GAGGAATAGT GATCAGGGTG GGACTTTGCC TAGCCTAAGG 900

TTCAGCATAC AATATTCAGT CAGTACTCAA GGGCTGGGCT GTTTCTGGTA ATCAAAGGGC 960CTGCCTTGTC CTCCTCCCCC ACAGCAGGAA ATTCCAAGGT GGTTTTCTTT ACAGGCTCCT 1020CCGCTTCTGT GGCCAGAGGG GACAGCGGAG GACCCCAGGT ACCTAAGCCA ACTCAAGAGA 1080AGATGGAATT GAATATTTCA ACCACCTTAT CTAGGCCTCT GTGATTGTTG AGGAGGGGGC 1140TGTCACTGGG AAAGTTGTGA GCTGCTTTGG ACCTTATCTG GGAATTTCCT TGGGCCTTAC 1200AGCTTTACCC TATCCTTGAA ATGGTTCTGG TTTCATAGCA ACTTCTAGGT GGTGTGGGCG 1260AAGTTTGGGA CTGGTTTAGG GCGGGGACAA GACCAAGAAC ACAAGTTTCC TTGTACGGGA 1320GAGAGGAAAT TGGAGACCCC AGCACCCCCT TGCTCACTCT CTTGCTCACA GTCCACGATG 1380GCCCGGTCCC TGGTGTGCCT TGGTGTCATC ATCTTGCTGT CTGCCTTCTC CGGACCTGGT 1440GTCAGGGGTG GTCCTATGCC CAAGCTGGCT GACCGGAAGC TGTGTGCGGA CCAGGAGTGC 1500AGCCGTAAGA ATGGGGAGGG GTAGAATTGG GCTTGGGTGT TAGCCTGTGT GGATGTGCTG 1560CATTCCCCTT CTATTCCTTC CCTAGACCCT ATCTCCATGG CTGTGGCCCT TCAGGACTAC 1620ATGGCCCCCG ACTGCCGATT CCTGACCATT CACCGGGGCC AAGTGGTGTA TGTCTTCTCC 1680AAGCTGAAGG GCCGTGGGCG GCTCTTCTGG GGAGGCAGCG TGCGTCTTGG GAGAGTGAAA 1740GAGGGAAGGG TACAGAGCTG GGGTAGACTC ATTATCCCCA TGAAGGGAAG ATTTGAGGGG 1800GGTGAACTGA AATAGACATT GTGGGGGGAT ATTGTTACTT ACTTTATTTT ATTTGCTTAT 1860TATTTTTTAA TTTTTTCCGA GACAGAGTCT TGCTCTGTCA CCCAGGCTGG ATGCAATGGC 1920ACGATCTCGG CTCACTGTAA CCTCCACCTC TTGGGTTTAA GCGATTCTCC AGCCTCAGCC 1980TCCCAAGTAC CTGGGATTAC AGGCATGCAC CACCACACCT NNTAATTTTT GTATTTTTAG 2040TAGAGACAGG GTTTTACCAT ATTGGCCAGG CTGGTCTTGA ACTCCTGACC TCATGATCTG 2100CCCGCCTTGG CTCCCGGAGT GCTGGGATTA CAGGTGTGAG CCACTGGCCC CCCAGCCTAT 2160TTTCACTTTA TTTACCAATT TTAGGACCTG ATATGGTCCC ANNNTCTGTT CTAGANTCTA 2220GACACCAAGA TACAACAACA AATGATCCTT TTTATTCTAA TGGAGGGAAA TGAACAAAAA 2280GCAAGGCATA AAAAATAGCA GCAGCCGGGC ACAGTAGCTC ACACCTGTAA TCCCAAGTAA 2340GGCCAAGTNN GGAGGATAGC TTGAGCCCAG GAGTTCGAGA CCAGCCTGGG CAACATAGCA 2400AGACCCCCAT CTCTATAAAA AAAAATTTAA AATTAACTGG GCATCATGGC ATGTGTCTGT 2460

GGTCCCGGCT ACTCGGGAGG CTGAGGTGGG AGGATTGCTT GATCCCAGAA GTTGAGGCTG 2520CAGTGAGCCG TGATCATGCT ACTGCACCTC AACCTGGCCG ACACAATGAG ACCCTGTTTC 2580CAAAATAATA ATAATAAAAG CAAATATGCG CTGCTGTGAG AATTAACAGA GACTTACTTG 2640GGTGTTCAGA AAGGGCCTCT GAACAGGTGG CATTTAAGCT GAGATTCATA TGACAAGGAT 2700GGAGCAGTTA TGTGGAGATC AGGGAGAGGG GAGAATGCAA AGGCCTTCAG CAGGCACAAG 2760CTTGCCATCT TCCAGACCCT AGCTTTTAAC TCCTCTTCCC CAGGTTCAGG GAGATTACTA 2820TGGAGATCTG GCTGCTCGCC TGGGCTATTT CCCCAGTAGC ATTGTCCGAG AGGACCAGAC 2880CCTGAAACCT GGCAAAGTCG ATGTGAAGAC AGACGTGAGT GTCATGGGGG CTGGCAAGAA 2940ATGTGGGGGG AGGACCCTTA GGTTGTGGGG ATGGGCAAAA ATGCTCCCAC ACTTGGCTCC 3000CTGGCCGCCT AGGTATGTGC GCTGGGAGAA ATTCTTTCCC TGCCTCAATT TTCTCACCAG 3060TAAAATGGGT CCAGTTGGGA GGTGCAAAGA TTAGAGGGCT CTAGGCTAAT TTGCATAGCA 3120NNTGTGTGGC CAGACCTGGG CCCTGCAGCT GCAGCCTTTG CTAAAACCAC TAGATCCTTT 3180GTGGTGTGAC CGCTGGTTTT CTTTCCACTG TTTCCCCTTT CTCTTTTTCA GAAATGGGAT 3240TTCTACTGCC AGTGAGCTCA GCCTACCGCT GGCCCTGCCG TTTCCCCTCC TTGGGTTTAT 3300GCAAATACAA TCAGCCCAGT GCAAACGGCT CGTCTCCGTG GTCTTTGGGG TGGGGTAGGG 3360TAGGGTGGGG ACTGTACAAA TGAAATGTTT CTCTAGGTTG CTGAATCTAA CCAATTAACC 3420CGCTGCCTGT GGTAACGTCA GTGGTTGCTA GGCAGAGTTT CGCTGATGAA AGCCCTGTGC 3480AGTAGGAGCG CTCCTAAGCT TAGGTTTCGA CACAAGCAAA GAAAACCTAA GCAGCCCAAC 3540TAGCGATTGT AGTGTCCTCT CTAGA 3565

(2)SEQ ID NO：4信息：

(i)序列特征：

(A)长度：581碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(ix)特性：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：110..499

(ix)特性：

(A)名称/关键词：sig肽

(B)位置：110..178

(ix)特性：

(A)名称/关键词：mat肽

(B)位置：179..499

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：AAGCGGCGGA GACAGGATCG AGAACACAGG TTTCCTTGAT ATTCAGCCTG GAAGGAGGGC 60AGGAGGAGCC CAGAGACCTC GTTCTTCACT TGGTCATTCT CAGTCCATG ATG GTG 115

Met Val

-23TGG TCC CCA GTG CTC CTT GGC ATC GTC GTC TTG TCT GTT TTT TCA GGG 163Trp Ser Pro Val Leu Leu Gly Ile Val Val Leu Ser Val Phe Ser Gly

-20 -15 -10CCT AGC AGG GCT GAT CGA GCT ATG CCC AAG CTG GCT GAC TGG AAG CTG 211Pro Ser Arg Ala Asp Arg Ala Met Pro Lys Leu Ala Asp Trp Lys Leu-5 1 5 10TGT GCG GAC GAG GAA TGC AGC CAT CCT ATC TCC ATG GCT GTG GCC CTC 259Cys Ala Asp Glu Glu Cys Ser His Pro Ile Ser Met Ala Val Ala Leu

15 20 25CAG GAC TAC GTG GCC CCT GAT TGC CGC TTC TTG ACT ATA TAT AGG GGC 307Gln Asp Tyr Val Ala Pro Asp Cys Arg Phe Leu Thr Ile Tyr Arg Gly

30 35 40CAA GTG GTG TAT GTC TTC TCC AAG TTG AAG GGC CGT GGG CGC CTT TTC 355Gln Val Val Tyr Val Phe Ser Lys Leu Lys Gly Arg Gly Arg Leu Phe

45 50 55TGG GGA GGC AGT GTT CAG GGA GGT TAC TAT GGA GAC CTG GCA GCC CGC 403Trp Gly Gly Ser Val Gln Gly Gly Tyr Tyr Gly Asp Leu Ala Ala Arg60 65 70 75

CTG GGC TAT TTC CCC AGT AGC ATT GTC CGG GAG GAC CTG AAC TCG AAA 451Leu Gly Tyr Phe Pro Ser Ser Ile Val Arg Glu Asp Leu Asn Ser Lys

80 85 90CCT GGC AAA ATT GAT ATG AAG ACC GAT CAA TGG GAT TTC TAC TGC CAG 499Pro Gly Lys Ile Asp Met Lys Thr Asp Gln Trp Asp Phe Tyr Cys Gln

95 100 105TGAGCTCAGC CTACCGCTAT CCCTGCAGTT ACCTTCCGGC TCTATGCAAA TACAGCAGCC 559AATGGCAAAA AAAAAAAAAA AA 581

(2)SEQ ID NO：5信息：

(i)序列特征：

(A)长度：130氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：Met Val Trp Ser Pro Val Leu Leu Gly Ile Val Val Leu Ser Val Phe-23 -20 -15 -10Ser Gly Pro Ser Arg Ala Asp Arg Ala Met Pro Lys Leu Ala Asp Trp

-5 1 5Lys Leu Cys Ala Asp Glu Glu Cys Ser His Pro Ile Ser Met Ala Val10 15 20 25Ala Leu Gln Asp Tyr Val Ala Pro Asp Cys Arg Phe Leu Thr Ile Tyr

30 35 40Arg Gly Gln Val Val Tyr Val Phe Ser Lys Leu Lys Gly Arg Gly Arg

45 50 55Leu Phe Trp Gly Gly Ser Val Gln Gly Gly Tyr Tyr Gly Asp Leu Ala

60 65 70Ala Arg Leu Gly Tyr Phe Pro Ser Ser Ile Val Arg Glu Asp Leu Asn

75 80 85Ser Lys Pro Gly Lys Ile Asp Met Lys Thr Asp Gln Trp Asp Phe Tyr90 95 100 105Cys Gln

(2)SEQ ID NO：6信息：

(i)序列特征：

(A)长度：31碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(ix)特性：

(A)名称/关键词：-

(B)位置：one-of(14，17，20)

(D)其它信息：/标记＝N

/注＝“N表示I(肌苷)”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：TGTGAATTCA GTTNWSNGCN GAYCARGART G 31(2)SEQ ID NO：7信息：

(i)序列特征：

(A)长度：33碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：TGTGTCGACT GTTCGTAGAA RTCCCATCTT RTC 33(2)SEQ ID NO：8信息：

(i)序列特征：

(A)长度：305碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(ix)特性：

(A)名称/关键词：misc_RNA

(B)位置：(1..29，277..305)联合

(D)其它信息：/功能＝“引物”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：GAATTCAAGT TTTCGGCGGA TCAGGAGTGC AGCCACCCTA TCTCCATGGC TGTGGCCCTT 60CAGGACTACA TGGCCCCCGA CTGCCGATTC CTGACCATTC ACCGGGGCCA AGTGGTGTAT 120GTCTTCTCCA AGCTGAAGGG CCGTGGGCGG CTCTTCTGGG GAGGCAGCGT TCAGGGAGAT 180TACTATGGAG ATCTGGTCGC TCGCCTGGGC TATTTCCCCA GTAGCATTGT CCGAGAGGAC 240CAGACCCTGA AACCTGGCAA AGTCGATGTG AAGACAGATA AATGGGATTT CTACGAACAG 300TCGAC 305

(2)SEQ ID NO：9信息：

(i)序列特征：

(A)长度：27碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：

GATGCATGCG GTCCTATGCC CAAGCTG 27

(2)SEQ ID NO：10信息：

(i)序列特征：

(A)长度：27碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：GATAAGCTTT CACTGGCAGT AGAAATC 27(2)SEQ ID NO：11信息：

(i)序列特征：

(A)长度：28碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：GATCTAGCCG GCCGCCCAGC CCGGCATG 28(2)SEQ ID NO：12信息：

(i)序列特征：

(A)长度：20碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：CCGGGCTGGG CGGCCGGCTA 20(2)SEQ ID NO：13信息：

(i)序列特征：

(A)长度：16氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ser Arg Pro Pro1 5 10 15(2)SEQ ID NO：14信息：

(i)序列特征：

(A)长度：18氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Val Asp Asp Asp1 5 10 15Asp Lys(2)SEQ ID NO：15信息：

(i)序列特征：

(A)长度：43碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：AAAAAGGATC CAGCCGGCCG CCCGGTCCTA TGCCCAAGCT GGC 43(2)SEQ ID NO：16信息：

(i)序列特征：

(A)长度：23碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：GGCGAGCAGC CAGATCTCCA TAG 23(2)SEQ ID NO：17信息：

(i)序列特征：

(A)长度：50碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：AAAAAAGGAT CCGTTGATGA TGACGATAAA GGTCCTATGC CCAAGCTGGC 50

(2)SEQ ID NO：18信息：

(i)序列特征：

(A)长度：330碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(ix)特性：

(A)名称/关键词：mat肽

(B)位置：7..327

(ix)特性：

(A)名称/关键词：misc_RNA

(B)位置：4..6

(D)其它信息：/功能＝“起始密码子”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：CATATGGGAC CAATGCCAAA ATTAGCAGAT CGTAAATTAT GTGCAGATCA GGAGTGCAGC 60CACCCTATCT CCATGGCTGT GGCCCTTCAG GACTACATGG CCCCCGACTG CCGATTCCTG 120ACCATTCACC GGGGCCAAGT GGTGTATGTC TTCTCCAAGC TGAAGGGCCG TGGGCGGCTC 180TTCTGGGGAG GCAGCGTTCA GGGAGATTAC TATGGAGATC TGGCTGCTCG CCTGGGCTAT 240TTCCCCAGTA GCATTGTCCG AGAGGACCAG ACCCTGAAAC CTGGCAAAGT CGATGTGAAG 300ACAGACAAAT GGGATTTCTA CTGCCAGTGA 330(2)SEQ ID NO：19信息：

(i)序列特征：

(A)长度：59碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：AAAAACATAT GGGACCAATG CCAAAATTAG CAGATCGTAA ATTATGTGCA GATCAGGAG 59(2)SEQ ID NO：20信息：

(i)序列特征：

(A)长度：29碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：AAAAAAAGCT TTCACTGGCA GTAGAAATC 29(2)SEQ ID NO：21信息：

(i)序列特征：

(A)长度：33碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：CGTGAATTCA ACATGGCCCG GTCCCTGGTG TGC 33(2)SEQ ID NO：22信息：

(i)序列特征：

(A)长度：30碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：TATCTGCAGT CACTGGCAGT AGAAATCCCA 30(2)SEQ ID NO：23信息：

(i)序列特征：

(A)长度：260碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：GTGGGAGGTC TATATAAGCA GAGCTCTCTG GCTAACTAGA GAACCCACTG CTTAACTGGC 60TTATCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG AGACCCAAGC TGTACCAGAT ATCAGGATCC 120CCCGGGCTGC AGGAATTCGA TATCAAGCTT CTCGAGGGGG GGCCCGGTAC CGATCCTGGC 180CAGCTAGCTA GTAGCTAGAG GATCTTTGTG AAGGAACCTT ACTTCTGTGG TGTGACATAA 240TTGGACAAAC TACCTACAGA 260(2)SEQ ID NO：24信息：

(i)序列特征：

(A)长度：596个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(ix)特性：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：(40..111，40..166，214..347，393..503，

549…569)联合(ix)特性：

(A)名称/关键词：sig肽

(B)位置：40..111(ix)特性：

(A)名称/关键词：外显子

(B)位置：40..166(ix)特性：

(A)名称/关键词：外显子

(B)位置：214..347(ix)特性：

(A)名称/关键词：外显子

(B)位置：393..503(ix)特性：

(A)名称/关键词：外显子

(B)位置：549..569(ix)特性：

(A)名称/关键词：-

(B)位置：(194，369，527)中之一

(D)其它信息：/注＝“在194，369和527位置的N表示

核苷酸不确定的数目和序列”(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：CCAGCACCCC CTTGCTCACT CTCTTGCTCA CAGTCCACGA TGGCCCGGTC CCTGGTGTGC 60CTTGGTGTCA TCATCTTGCT GTCTGCCTTC TCCGGACCTG GTGTCAGGGG TGGTCCTATG 120CCCAAGCTGG CTGACCGGAA GCTGTGTGCG GACCAGGAGT GCAGCCGTAA GAATGGGGAG 180GGTAGAATTG GGNCCCTTCT ATTCCTTCCC TAGACCCTAT CTCCATGGCT GTGGCCCTTC 240AGGACTACAT GGCCCCCGAC TGCCGATTCC TGACCATTCA CCGGGGCCAA GTGGTGTATG 300TCTTCTCCAA GCTGAAGGGC CGTGGGCGGC TCTTCTGGGG AGGCAGCGTG GGTCTTGGGA 360GAGTGAAANA GCTTTTAACT CCTCTTCCCC AGGTTCAGGG AGATTACTAT GGAGATCTGG 420CTGCTCGCCT GGGCTATTTC CCCAGTAGCA TTGTCCGAGA GGACCAGACC CTGAAACCTG 480GCAAAGTCGA TGTGAAGACA GACGTGGAGT GTCATGGGGG CTGGCANTTT CCCCTTTCTC 540TTTTTCAGAA ATGGGATTTC TACTGCCAGT GAGCTCAGCC TACCGCTGGC CCTGCC 596

Claims

1.抑制细胞系HTZ 19-dM和ATCC CRL 1424生长的具有黑素瘤抑制活性的蛋白质，该蛋白质

a)由编码成熟蛋白质或带N-端前序列的蛋白质的SEQ ID NO1所示DNA序列编码，或由SEQ ID NO 3所示的基因组序列编码，或者

b)由与SEQ ID NO 1或3所示的DNA序列或这些DNA序列在其编码成熟蛋白之DNA区的片段杂交的DNA序列所编码。

2.如权利要求1所要求的蛋白质，其分子量大约为11kD(SDS-Paye，非还原型)，可由黑素瘤细胞系HTZ 19-dM的细胞培养物上清液获得，并用凝胶色谱和反相HPLC纯化。

3.如权利要求1或2所要求的蛋白质，其中该蛋白质

a)是一种内源DNA的原核或真核生物的表达产物，

b)由编码成熟蛋白或带N-端前序列的蛋白质的SEQ ID NO1所示DNA序列，或者被SEQ ID NO 3所示的基因组序列编码，

c)由与SEQ ID NO 1或3所示的DNA序列或这些DNA序列在其编码成熟蛋白之DNA区的片段杂交的DNA序列所编码。

d)由假若不存在遗传密码简并性时将会与b)至c)中所定义的序列杂交并编码有相同氨基酸序列的多肽的DNA序列编码。

4.如权利要求1-3所要求的蛋白质，该蛋白质由SEQ ID NO1中的核苷酸40-432或112-432编码。

5.如权利要求1或3所要求的蛋白质，该蛋白质由SEQ ID NO4中的核苷酸110-499或179-499编码。

6.细胞系HTZ 19-dM(DSM ACC 2133)。

7.编码如权利要求1至5之一所要求的蛋白质的核酸，其中，该核酸选自：

a)SEQ ID NO 1或3所示的DNA序列或其互补DNA序列，

b)与a)中序列之一杂交的核酸序列，

c)假若不存在遗传密码的简并性时将会与a)或b)中所述序列之一杂交的核酸序列。

8.具有SEQ ID NO 1所示序列的DNA。

9.具有SEQ ID NO 3所示序列的DNA。

10.具有SEQ ID NO 4所示序列的DNA。

11.含有编码权利要求1至5所要求的蛋白质的DNA并在被转化微生物或被转化真核细胞中表达编码蛋白质之DNA的重组表达载体。

12.用编码权利要求1-5所要求的蛋白质的DNA转染并能产生所述蛋白质的原核或真核宿主细胞。

13.如权利要求12所要求的宿主细胞，该细胞是大肠杆菌或哺乳动物细胞系。

14.编码权利要求1至5所要求的蛋白质的DNA在转染原核或真核生物体上的用途。

15.一种通过用凝胶色谱分离法分离黑素瘤细胞系HTZ 19-dM的培养物上清液并纯化相应于分子量为大约11kD的上清液级分获得具有黑素瘤抑制活性蛋白质的方法。

16.一种通过在合适宿主细胞中表达权利要求7至10之一所要求的DNA，并从宿主细胞或宿主细胞培养物上清液分离蛋白质来重组制备具有黑素瘤抑制活性蛋白质的方法。

17.权利要求1-5之一所要求的具有黑素瘤抑制活性的蛋白质作为抗原或免疫原在产生与这种蛋白质结合的抗体上的用途。

18.通过用权利要求1-5之一所要求的蛋白质使动物免疫并由该免疫过的动物的血清或脾细胞分离可获得的抗黑素瘤抑制蛋白质的抗体。

19.权利要求1至5所要求的黑素瘤抑制蛋白质在制备能用于肿瘤治疗或作为一种免疫抑制剂的治疗剂上的用途。

20.含有权利要求1至5之一所要求的黑素瘤抑制蛋白质，如果需要，还含有药物上的辅助物质，填充剂和/或添加剂的治疗组合物。

21.检测编码MIA蛋白的核酸的方法，其中待测样品与选自下组的核酸探针一起温育：

a)SEQ ID NO 1和3所示的DNA序列或它们的互补序列，

b)与a)中序列之一杂交的核酸该核酸探针与样品的核酸一同温育，检测样品核酸与核酸探针的杂交，如果需要，经过进一步的结合配偶体进行检测。

22.如权利要求21所要求的方法，其中待测核酸在测定前被扩增。

23.产生权利要求1-5的蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：通过同源重组将一个DNA构建体插入到细胞基因组中而在哺乳动物细胞中表达编码这种蛋白质的内源基因，所述DNA构建体包含一个在有效地连接到所述基因上时，能调节所述基因表达的DNA调节元件，还含有一个或多个同源于这一基因组中的一个区的DNA靶片段，该区在所述基因内或紧邻所述基因；培养细胞并由细胞或细胞培养物上清液中收集MIA蛋白。

24.一种产生权利要求1至5所要求的蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：通过同源重组将一个DNA构建体插入到细胞的基因组中而在哺乳动物细胞内表达至少一种编码这种蛋白质的内源基因，所述DNA构建体包含一个在有效地连接到所述基因上时能调节所述基因表达的DNA调节元件，一种编码所述蛋白质的DNA元件且还包含一个或多个同源于这一基因组中一个区的DNA靶片段；培养细胞，并由细胞或细胞培养物上清液中回收MIA蛋白质。

25.能通过同源重组被导入到哺乳动物细胞基因组中的DNA构建体在制备肿瘤治疗剂和免疫抑制剂上的用途，所述DNA构建体包括：一个在有效地连接到基因上时能调节所述基因表达的DNA调节元件，编码权利要求1-5的蛋白质的所述基因；和一个或多个与这一基因组中一个区同源的DNA靶片段，这个区在所述基因内或紧邻所述基因；并且其中所述构建体能以使调节片段有效地与编码MIA活性蛋白的基因连接的方式插入到哺乳动物细胞基因组中。

26.能通过同源重组导入到哺乳动物细胞基因组中的DNA构建体的用途，所述构建体包括：一种在有效地连接到基因上时能调节基因表达的DNA调节元件，编码权利要求1至5的蛋白质的所述基因，和一个或多个同源于该基因组中一个区的DNA靶片段，在该区所述构建体的插入是合适的，并且其中所述构建体能以使调节片段调节所述基因在哺乳动物细胞中表达的方式插入到哺乳动物细胞的所述基因组中。