CN107105724A - 丝素衍生的蛋白质组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种丝素衍生的蛋白质组合物,该组合物在水溶液中具有增强的溶解性和稳定性。天然丝素的初级氨基酸序列在SDP中被修饰,使得丝素重链和丝素轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫键被还原或消除。另外,与天然丝素蛋白相比,所述组合物的丝氨酸含量可以降低40%以上,并且SDP的平均分子量小于约100kD。
Description
相关申请
本申请根据U.S.C.§119(e)的规定要求下述在先申请的优先权:2014年8月20日提交的美国临时专利申请62/039,675以及2015年7月17日提交的美国临时专利申请62/193,790。上述在先申请在此通过引用纳入本文。
背景技术
从家蚕Bombyx mori得到的蚕丝纤维和分泌蛋白已经在纺织行业中使用了数百年。分泌蛋白近来在生物医学应用中被当作生物材料,包括作为结构部件以及作为蛋白溶液。自然地,家蚕蛋白以丝蛋白丝素和丝胶的混合物存在,其中丝胶为与丝素结合的胶状物质并且保持蚕茧的形状。去除丝胶,例如通过洗涤剂介导的提取作用或在高热和高碱洗涤情况下,得到无丝胶的丝素纤维,其包括丝素蛋白的、通过单个二硫桥结合的重链和轻链。这种纤维丝向水溶性丝素蛋白的转化需要添加浓缩的重盐(例如,8-10m的溴化锂),其干扰分子间-和分子内的离子键和氢键,否则会导致丝素蛋白不溶于水。
丝素蛋白质的应用通常需要消除高LiBr盐浓度,例如通过采用渗析作用,从而所述盐类不会在给定的环境下对合适材料的功能产生干扰。没有这些盐类与溶解的丝素蛋白质的离子和氢键合的竞争,丝素蛋白质溶液就会比较地不稳定,易于发生蛋白质集聚,并且常常会从水溶液中沉淀出来。所述的集聚的发生被认为是通过丝素蛋白质之间的相互作用,然后由于在所述丝素重链的疏水氨基酸结构基元之间的beta-折叠二级蛋白质结构形成引起的后续物料胶凝作用。一旦形成这样的结构,由溶解的丝素溶液到不溶解的丝素凝胶的转化过程是迅速的而且在很大程度上也是不可逆转的,从而由于有限的物料储藏期限而限制了以水溶液为基础的应用中溶液的用途。
为了克服上述含水丝素的凝胶性质,尝试了尽量减少蛋白质的聚结以及后续的beta-折叠结构的形成。降低溶液中的丝素浓度是一种依数性方法用来减弱蛋白质─蛋白质相互作用,其先于这些结构的形成,然而可能会导致丝素溶液对于相关蛋白质应用来说过于稀释。或者,对水溶液进行调节,其可能会阻止聚结的发生和/或beta-折叠的形成(例如,溶液pH、添加稳定辅料)可以预防这些情形。但是,这些调节和化学添加可能会由于增加生物毒性或在溶液中引入不相容的用剂而限制后续的应用。因此,需要丝素衍生的蛋白质(SDP)物料,其能够抵抗聚结并且具有对于各种不同工业用途有用的储存稳定性。
用以避免含水丝素的上述缺陷的一种新对策是对丝素蛋白质本身而不是含水溶液的环境进行生化结构和品质上的改进。为此,对在含水丝素生产过程中所涉及的丝素纤维的提取工艺过程和/或条件的改进能够影响氨基酸的初级序列以及引起蛋白质聚结和beta-折叠形成的化学作用。因此,开发出用于改进丝素物料的方法可以显着地延长丝溶液产品的稳定性和保质期。
发明内容
本发明提供了一种来自蚕丝素的蛋白质组合物。所述组合物本质上具有在水溶液中增强的溶解度和稳定性。在一种实施方式中,本发明提供了一种经由包括在加压下加热含水丝素溶液的过程制备的蛋白质组合物。所述含水丝素溶液包括浓度至少为8M的溴化锂。所述含水丝素溶液在至少约 10PSI的压力下被加热到至少约105℃(221°F)达至少约20分钟,用以提供所述蛋白质组合物。所述蛋白质组合物的多肽类包括少于8.5%的丝氨酸氨基酸残基,并且所述蛋白质组合物在水中的10% w/w溶液具有低于5cP的水相粘度。
在另一种实施方式中,本发明提供了一种经由包括在加压下加热含水丝素溶液的过程制备的蛋白质组合物,其中所述含水丝素溶液包括浓度为9-10M的溴化锂,以及其中所述含水丝素溶液在约 14PSI至约20PSI的压力下被加热到约115℃(239°F)至约125℃(257°F)达至少约20分钟;用以提供所述蛋白质组合物。所述蛋白质组合物可以包括少于6.5%的丝氨酸氨基酸残基,并且所述蛋白质组合物在水中的15%w/w溶液具有低于10cP的水相粘度。
本发明还提供了一种丝素衍生的蛋白质组合物,其具有在水溶液中增强的稳定性,其中:所述丝素衍生的蛋白质组合物的初级氨基酸序列在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量的组合差别方面与天然丝素具有至少4%的差别;丝素重蛋白链和丝素轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫桥被还原或去除;所述组合物具有与天然丝素蛋白质相比降低25%以上的丝氨酸含量;以及其中所述丝素衍生的蛋白质组合物的平均分子量为小于约100kDa。
在另外的实施方式中,本发明还提供了一种丝素衍生的蛋白质组合物,其具有在水溶液中增强的稳定性,其中:所述丝素衍生的蛋白质组合物的初级氨基酸序列在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量的组合差别方面与天然丝素具有至少6%的差别;丝素重蛋白链和丝素轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫桥被还原或去除;所述组合物具有与天然丝素蛋白质相比降低40%以上的丝氨酸含量;以及其中所述丝素衍生的蛋白质组合物的平均分子量为小于约96kDa。
本发明进一步提供了一种丝素衍生的蛋白质组合物,其具有在水溶液中增强的稳定性,其中所述丝素衍生的蛋白质组合物的初级氨基酸序列是修饰自天然丝素,所述丝素重蛋白链和丝素轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫桥被还原或去除;所述丝素衍生的蛋白质的平均分子量为小于约100kDa且大于约25kDa;以及所述丝素衍生的蛋白质组合物在5秒钟超声处理后至少两个小时保持550nm处的吸收度低于0.25。
在另外的实施方式中,本发明进一步提供了一种丝素衍生的蛋白质组合物,其具有在水溶液中增强的稳定性,其中:所述丝素衍生的蛋白质组合物的初级氨基酸序列是修饰自天然丝素,以致所述蛋白质组合物的初级氨基酸序列在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量的组合差别方面与天然丝素具有至少5%的差别;丝素重蛋白链和丝素轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫桥被还原或去除;所述丝素衍生的蛋白质的平均分子量为小于约96kDa;以及所述丝素衍生的蛋白质组合物在5秒钟超声处理后至少两个小时保持550nm处的吸收度低于0.2。
所述丝素衍生的蛋白质组合物可以例如经由渗析和/或过滤被分离和/或提纯成为一种干粉或膜片。替代地,所述丝素衍生的蛋白质组合物能够被分离和/或纯化为稳定的水溶液,其可以被修饰以用作食物或饮料组合物,或用于医疗制剂,比如眼科制剂。
附图简要说明
下述附图属于说明书的一部分并且是用来对本发明的一些实施方式或不同方面作进一步的描述。在一些实例中,本发明的实施方式可以通过参照附图并结合本文提供的详细描述得到更好地理解。这些描述和附图可以突出某些具体的实施例或者本发明的某些方面。然而,本领域技术人员应当理解这些部分的实施例或方面也可用于结合本发明的其他实施例或方面。
图1、描述SDP溶液和现有技术丝素溶液生成的主要工艺步骤的流程图。所述SDP生产过程包括增加的步骤(中间斜体表述部分)用来提高溶液随时间的稳定性,而该步骤在所述现有技术丝素溶液生产过程中是没有的。
图2、显示对稳定的SDP溶液进行劳伦斯稳定性测试(样品1,如右,由标准水解条件制备) 结果的图片。目测表明所述样品1没有发生胶凝、是稳定的水溶液,而样品2已经发生胶凝、从而不是稳定的水溶液。
图3、显示含水丝素蛋白质到SDP溶液的经过工艺修饰的凝胶图片。该图片显示SDP溶液(泳道3,经过热压处理)与现有技术丝素溶液(泳道2,未经热压处理)对比的分子量(MW)分布。蛋白质标准梯状标志(泳道1)和相关的重量(泳道1左侧的数字)用来作为MW的参考。值得指出,泳道2在23-26kDa的显著MW带在热压处理之后完全没有出现,表明由于所述SDP物料增强的稳定性导致所述丝素轻链的分解。还有,热压处理之后(泳道3)丝素蛋白质的MW范围显示出明显的偏移,表明天然丝素蛋白质到所述SDP物料组合物的修饰。
图4A-B、图片显示(A)SDP物料不发生胶凝,然而(B)现有技术丝素溶液物料在超声处理后2小时之内发生胶凝。
图5、本文所述的丝素处理过程对蛋白质溶液稳定性和粘性的影响。总结曲线图显示溶液年度与现有技术丝素(PASF),其中PASF被加热至225°F达30分钟(PASF-225°F),以及SDP中蛋白质浓度的关系。PASF和PASF-225°F表现出在>75mg/g(7.5%w/w)溶液中粘度的急剧增加,而且不能够在高于200mg/g浓度时没有蛋白质从溶液中析出。相反,SDP在全部浓度范围均保持低的粘度,并且浓度能够达到高出240mg/g的程度。
图6A-B、热处理后的丝素蛋白质产生丙酮酸盐,表明所述丝素初级结构的修饰。(A)归总图表显示在未经受加热或被加热到65℃(~150°F),90℃(~200°F)和99℃(~210°F)时丝素蛋白质溶液中的丙酮酸盐浓度(50mg/mL)。(B)热处理的持续时间进一步增加丙酮酸盐从丝素中的形成。含水丝素蛋白质在经受99℃(~210°F)达30分钟时,相较于这一温度刚开始达到的时候,丙酮酸盐浓度呈现几乎两倍的增加,而相较于未经加热的样品,丙酮酸盐浓度呈现高出四倍的增加。
图7A-B、加热处理改变天然丝素蛋白质的氨基酸组成。(A)归总图表显示,在未经加热(即“未加热”/现有技术)的丝素蛋白质溶液(左列,10%丝氨酸)和经过实施例1所述处理(例如~121 C,17psi)达30分钟(“加热”;右列,5.7%丝氨酸)的SDP溶液中,丝氨酸成分在丝素蛋白质中总氨基酸的百分比。加热处理使得在SDP溶液样品中的丝氨酸成分,与现有技术丝素溶液样品中的相比,降低了40%以上。(B)归总图表显示了在现有技术丝素蛋白质溶液(左边的“未加热”列)和经过加热和加压处理(~121℃,17psi)的SDP溶液(右边的“加热”列)中甘氨酸和丙氨酸的百分比浓度。加热和加压处理促进了甘氨酸和丙氨酸的浓度相对于现有技术丝素溶液对照的增加。
图8、多种样本配方被置于疏水的蜡表面:磷酸缓冲盐(PBS),TheraTears(TT),Blink,Systane Balance(SB)和5%w/v SDP配方(显示于左边的图)。配方溶液的铺开被成像并且然后所述铺开面积在机械铺开的前后进行了测量(数据显示于右边的图)。在机械铺开之后,所述SDP制剂显示出与其他所有样本制剂比较的显著增强的铺开程度(超过三倍)。
图9A-C、在SDP中的氨基酸转化削弱二级蛋白质结构并且允许溶解。(A)PASF溶液和SDP 溶液的真空水处理的样品在处理前和处理后的FTIR谱图。所述现有技术样品显示真空水处理之后在 1624cm-1和1510cm-1附近的显著beta-折叠特征峰,而所述SDP溶液的谱图并未表明beta-折叠峰的形成、而是表明在处理之后显著降低的beta-折叠含量。(B)SDP和PASF丝素溶液干燥成膜片的代表性图片。(C)SDP膜片后续在水中的溶解是完全的,表明没有形成beta-折叠二级结构;但是, PASF膜片不能完全溶解,表现为部分溶解的PASF和含有未溶解的beta-折叠的蛋白质聚结体的混合物。
图10、带有胰蛋白酶的丝素的酶分裂提高不稳定并且加速凝胶的形成但并不影响SDP。归总图表显示先前用胰蛋白酶处理过的PASF在超声处理之后在所标示时间点的吸收度(550nm)。吸收度增加表明丝素beta-折叠的形成,其使凝胶形成达到高潮,表现出溶液的不稳定。
图11、归总图表描述在超声处理前30分钟采用0(对照)、10或100mM二硫苏糖醇(DTT) 处理的PASF溶液的纵向吸收度(550nm)。所述数据提供了在PASF或SDP溶液中二级结构随时间形成的一种指标。累积beta-折叠的形成,显示为增加吸收度,立即发生在PASF溶液声波处理之后 (例如,在30分钟之内以及后续增加)。相反地,SDP未显示形成二级结构的倾向。与对照PASF 相比,用DTT的还原二硫桥会减慢beta-折叠和后续凝胶的形成,但是所述物料最终形成大量的 beta-折叠结构。相反地,SDP未显示形成二级结构的倾向从而保持稳定。因此,天然丝素中二硫桥的还原提高稳定性但是并不防止凝胶的形成,而且PASF的纵向不稳定性在SDP中被消除了。
图12、在溴化锂(LiBr)不存在时对PASF的加热使聚结作用减弱。归总图表描绘由在超声处理之前的标示时间里未经加热(对照)或在~200°F加热的PASF溶液的光吸收度(550nm)。对溶液加热导致相对于非加热PASF在加热时间的基底吸收度的增加。所有PASF溶液呈现吸收度随时间而增加,表明蛋白质性质的变化。相比之下,在整个实验期间,SDP在超声波处理后的吸收度没有变化。
具体描述
本发明提供了一种从丝素衍生的蛋白质组合物。所述蛋白质组合物具有在水溶液中增强的溶解度和稳定性。在所述丝素衍生的蛋白质组合物中的天然丝素的初级氨基酸序列被修饰,从而丝素重蛋白链和丝素轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫桥被还原或去除。另外,所述组合物可以具有与天然丝素蛋白质相比降低40%以上的丝氨酸含量,以及在所述组合物中所述蛋白质的平均分子量为小于约 100kDa。
定义
下面的定义是用来对说明书和权利要求书提供清晰和一致的理解。本文所采用的术语具有下述的含义。本说明书中所采用的其他术语和短语具有本领域技术人员所能理解的普通含义。这种普通含义可通过参考技术辞典获得,例如Hawley’s Condensed ChemicalDictionary 14th Edition,by R.J. Lewis,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,2001。
本说明书中提及的“一种实施方式”("one embodiment")、“实施方式”("anembodiment")等表明所描述的实施方式可包含特定的方面、特征、结构、部分或特性,但并不是每个实施方式都必须包含这些特定的方面、特征、结构、部分或特点。此外,这些短语可能,但并不一定,适用于在本说明书其它部分提及的相同的实施方式。此外,当特定的方面、特征、结构、部分或特点是结合某种实施方式进行描述的,本领域技术人员应当能够知道将这些特定的方面、特征、结构、部分或特点应用到或关联到其它的实施方式,无论是否明确地表述出来。
单数形式的冠词"a,""an"和"the"包括复数含义,除非上下文存在明确的不同阐述。因此,例如,“化合物”可以是指包括多个这样的化合物,从而化合物X包括多个的化合物X。进一步值得注意的是,权利要求书可能被撰写为排除任何可选元素。因此,本声明旨在作为排除性术语使用的前置基础,例如"单独(solely)"、"仅仅(only)"等术语,与本文所描述的任何元素相关联和/或作为对权利要求所述要素的限定或者用作“负面”限制。
术语“和/或”("and/or")是指相关项目的任何一项、任何组合,或它们的全部。短语“一个或多个”("one or more")和“至少一个”("at least one")是本领域技术人员都能容易理解的,尤其是根据上下文理解。例如,这些短语可以是指一、二、三、四、五、六、十、一百,或大约比已经列举的下限高出10、100或1000倍的任何上限值。
术语“大约”("about")表示特定值可以具有±5%、±10%、±20%或±25%的变化。例如,“大约50”百分比在一些实施方式中可变化为45到55百分比。对于整数范围,术语“大约”可包含在所指范围各端相较于所列举的整数小或大一个或两个整数。除非文中另有说明,术语“大约”是用来包括对于成分、组合或实施例的功能来说等同的接近所列范围的数值。术语“大约”也能够用来对本段前述范围的端点进行调整。
本领域技术人员应当能够理解,包括表示成分含量、诸如分子量的性质、反应条件等等的任何数目都可以是近似的,并且在各种情下都能够采用术语“大约”进行修饰。取决与本领据技术人员通过本文所述方法所期望获得的性质,这些值是可以有变化的。还应当理解,这些值,由于测试中出现的标准偏差必然会导致其内在的可变化性。
本领域技术人员应当能够理解,出于任何各种目的,尤其是就提供文字描述来说,本文提供的任何范围还包括所有可能的子范围和这些子范围的组合,以及构成所述范围的单独值,尤其是整数值。所引述范围(例如重量百分比或碳基团)包括各个特定的数值、整数、小数或所述范围内的特性。应当易于理解,所列举的任何范围能够充分描述并能够使的相同的范围被分解为相等的二等份、三等分、四等分、五等分或十等分。作为非限制性例子,本文所述的每个范围都可容易地分解为下三分之一,中三分之一和上三分之一等等。本领域技术人员也应当能够理解,诸于“高至”、“至少”、“高于”、“低于”、“多于”、“或以上”或类似的术语包含所列举的数字,并且这种术语还指所述范围可随后分成上文述及的子范围。同样地,本文所列的任何比率也包含落在较宽比率之内的子比率。因此,自由基、取代基和范围的具体数值只是用来进行说明;其不排除自由基和取代基的其它指定数值或其它指定范围的数值。
本领域技术人员还应当能够容易理解,当单元被按照通常的方式例如在马库什群组中被组合起来时,本发明不仅包括所列单元组合构成的整体,还包括所述群组单独的每个单元以及所述基本群组的任何可能的亚群组。另外,对于所有的目的,本发明不仅包括基本群组,还包括基本群组去掉一个或多个单元的群组。可见,本发明可以包括明确排除所引述群组的任何一个或多个单元。因此,有关约束条件可以附加于任何公开的范畴或实施方式,其中任何一个或多个单元、种类或实施方式,可从所述范畴或实施方式中排除出来,例如,用于明示负面限定的场合。
术语“接触”("contacting")是指触及、接触,或者邻接或紧密地靠近,例如,包括在细胞或分子水平,比如在溶液或反应混合物中,在体外或体内,发生生理反应、化学反应或物理变化。
对于治疗应用,术语“有效量”是指有效地治疗疾病、失调和/或病症,或者造成所述效果的量。例如,有效量可以是有效地减缓所治疗的病症或症状的进展或程度的剂量。对治疗上有效量是在本领域技术人员能力范围内能够确定的。术语“有效量”是指包括本文所描述的化合物的量,或本文所描述的肽类的组合的量,比如,是用于针对受试者有效地治疗或预防疾病或失调,或者治疗疾病或失调的症状。因此,“有效量”通常是指能提供预期效果的量。
对于工艺和制备应用,“有效量”是指有效引起所指效果的量,例如在反应混合物中形成产物所需的量。对治疗上有效量是在本领域技术人员能力范围内能够方便确定的,尤其是根据本文所提供的详细描述。对治疗上有效量是在本领域技术人员能力范围内能够确定的。术语“有效量”是指包括本文所描述的化合物或用剂的量,或本文所描述的化合物的组合、或与本文所述过程的相关条件的量,比如,在反应混合物中有效形成所需产物的量。因此,“有效量”通常是指能提供预期效果的量。
丝素源于Bombyx mori家蚕的蚕茧。所述丝素蛋白包括约350-400kda分子量的重链和约25kda 分子量的轻链,其中所述重链和轻链通过二硫桥连接在一起。所述重链和轻链的初级序列在本领域是已知的。丝素蛋白链具有亲水的N和C末端结构域,以及疏水/亲水氨基酸序列的交替嵌段,从而允许与溶液中周围分子的空间和静电作用。在低浓度的稀释度(1%或以下)所述丝素蛋白分子已知呈现延长的蛋白链形式并且在溶液中不会立即聚结。所述丝素蛋白能够高度混溶于诸如HA、PEG、甘油和CMC的水合分子,并且被发现是高度生物相容的,在体内通过酶的作用自然结合或降解。天然的丝素蛋白质或现有技术丝素蛋白(PASF)是在本领域已知的,并且已被描述于,例如 Daithankar et al.(IndianJ.Biotechnol.2005,4,115-121)。
术语“丝衍生的蛋白质(silk-derived protein)”(SDP)和“丝素衍生的蛋白质(fibroin-derived protein)”在本文中可以交换使用。这些物料由本文所述方法制备,涉及热、压力和重盐溶液的高浓度。因此“丝衍生的”和“丝素衍生的”指的是修饰丝素蛋白的工艺过程的原料,以获得具有本文所述结构、化学和物理性质的蛋白质组合物。
丝素衍生的蛋白质组合物的制备
本文所述的丝素衍生的蛋白质组合物在水溶液中与天然丝素相比具有增强的稳定性。所述丝素衍生的蛋白质组合物,此处亦称丝衍生的蛋白质(SDP)具有的增强的稳定性使得所述物料与天然的/现有技术丝素蛋白质(此处称为PASF)相比能够在溶液中显著地保持较久。SDP物料的所述增强的稳定性也使得能够制备高浓度的SDP溶液而不会发生聚结、沉淀或胶凝。在涉及诸如食品、饮料、眼滴剂或要求蛋白质溶解于溶液场合的商业应用中,所述增强的稳定性能够通过减少蛋白质的聚结为产品提供合适的、较长的储藏期和改进的质量。蛋白质在溶液中可能发生的聚结会对相关用途产品的期望性能产生负面影响。使所述SDP在溶液中达到较高浓度(高于50%w/v或>500 mg/mL)的能力对于配置能够按原样使用或者按需要任意稀释的有用的工作溶液是有好处的。这类用途的例子包括将SDP作为蛋白质补料或添加剂用于食品、饮料或眼科制剂。
在溶液中的增强的稳定性是通过将初级氨基酸序列由天然的丝素蛋白质转化为SDP物料所得到的。初级氨基酸序列的这些改变降低了分子聚结的倾向。聚结作用会导致凝胶的形成。在天然丝素的转化中,丝氨酸和半胱氨酸两者都会在高温和脱水的条件下被分裂。类似地,Patchornik et al.(J. Am.Chem.Soc.1964,86,1206)指出脱氢丙氨酸(DHA)中间体是从溶液中的丝氨酸和半胱氨酸所形成的。当存在强脱水溶剂体系时,氨基酸被进一步促使降解,例如在本文所述的50-55%w/v LiBr溶液中,氢化物发生转移从而诱发水的去除。所述降解可以在氢氧根离子存在时(例如pH 7.5至pH 11)发生,而这又进一步促使了DHA中间体的分裂。所述分裂作用形成酰胺,丙酮酰肽和LiBr。在方案1 中针对氨基酸丝氨酸概括了一种可行的化学机理,该方案也适用于氨基酸半胱氨酸。所述PASF蛋白质到DHA中间体的半胱氨酸通过进一步水解分裂的化学改变导致所述SDP的增强的溶液稳定性。
反应式1、详细描述了丝氨酸和半胱氨酸降解所涉及的化学反应。降解作用是由DHA中间体的生成所驱动的,而DHA中间体是在存在脱水高盐浓度环境由氢化物转移反应形成的。然后DHA的降解是在碱性溶剂环境中通过SN2反应而完成的。
上面所讨论的裂解反应显着影响在稳定的SDP物料的水溶液中所得到的肽类的大分子性质。丝素蛋白质的初始蛋白质聚结被认为是被天然丝素在半胱氨酸的重链和轻链的相互作用所驱使,其描述于Greving et al.(Biomacromolecules 2012,13(3):676-682)。在丝素轻链和重链中的半胱氨酸氨基酸通过二硫键相互作用。这些二硫桥参与了丝素蛋白质的聚结和凝胶网的凝聚。没有天然丝素轻链存在时,所述蛋白质明显较少发生聚结。因此,本文所述的工艺过程,通过降低半胱氨酸的含量以及还原或消除二硫键形成的容量,有效地减少天然丝素轻链形成二硫键的能力。通过这种机理,本文所述的转化过程,通过降低或消除形成半胱氨酸引起的聚结的能力,使得在功能上稳定溶液中所获得的SDP。
除了聚结作用引起的二硫桥,丝素进一步聚结成为凝聚结构的倾向性也受到蛋白质的氨基酸化学性能的驱动,其描述可见于Mayen et al.(Biophysical Chemistry 2015,197:10-17)。丝素的丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸的氨基酸序列的分子模拟显示丝氨酸的存在,通过在相邻丝素蛋白质链部分之间形成氢键的较大倾向性,增强了初始的蛋白质对蛋白质的相互作用。所述模型显示丝氨酸的减少和丙氨酸及甘氨酸的增加回使蛋白质聚结的初始倾向降低。分子模拟的观察表明,通过改变所述丝素蛋白质的天然氨基酸化学特性,能够形成一种在溶液中具有较高稳定性的物料。
为了增强稳定性的一种策略是从蛋白质去除带电的功能团,例如羟基。由于羟基相对较高的电负性,这种化学特性会促使与可用氢原子的氢键以及与带正电荷的氨基酸基团的非特异性电荷相互作用。几乎12%的天然丝素蛋白质的含量构成是丝氨酸,其带有羟基功能团。因此,通过减少有利于氢键的羟基的可得性就能够提高全部蛋白质的稳定性。本文所述的过程能够有效降低丝氨酸的含量并且增加丙氨酸和甘氨酸的相对含量,这样就去除去了可形成氢键的可用羟基的量。通过这种机理,本文所述的过程在功能上能够长时间(例如,至少几个[6-8]月和/或超过1.5年;进一步的研究仍在进行,表明稳定性能够保持超过2年或超过3年)稳定溶液中所得到的SDP。
除了减少半胱苷酸和丝氨酸的结构部分,溶剂的电荷相互作用对于蛋白质溶液的稳定是重要的。在初始的蛋白质絮凝之后,聚结过程被认为有利于促使在天然丝素重链之间形成较近的结合,这样就会导致在重链的疏水团块之间形成分子内和分子间的beta-折叠结构。一旦形成明显的beta-折叠,丝素溶液就会转化成为凝胶。随着溶液转化为凝胶,所述丝素就会变得不可溶并且对于基于溶液的产品来说不再有用。为了防止聚结,所述SDP溶液的pH能够提高到高碱性用以增强稳定性,例如超过7.5的pH。结果,增加的pH能够产生另外的自由羟基,其在溶液中的SDP分子周围形成价键保护。所形成的价键保护会产生电达电位从而通过降低源于氢键或非特异电荷和/或疏水相互作用的蛋白质对蛋白质相互作用。所述丝素转化过程通过这种和其它的机理在功能上稳定被处理的溶液中的SDP。
SDP物料可以经由下述过程制备:
1、通过去除蛹材料并在温水中预先漂洗来制备丝茧。
2、通过在碱性pH下在高水温(通常为95℃或以上)的水中洗涤所述茧,从胶状丝胶蛋白中提取天然丝素蛋白纤维。
3、将提取的丝素蛋白纤维干燥然后溶解于溶剂系统,其使beta-折叠之间的氢键中和;20%w/v 丝素蛋白质的54%LiBr水溶液对于该中和步骤是有效的。
4、将LiBr溶液中溶解的丝素蛋白在高压釜环境(~121℃[~250°F],于~15-17PSI压力下加热约 30分钟)进行处理。
5、然后将经过加热处理的丝素蛋白和LiBr溶液透析以从溶液中除去锂和溴离子。在本过程的这个时候,物料已被化学转化为SDP。
6、然后将透析的SDP过滤以除去任何不溶解的聚结物以及污染的生物负载。
所述SDP溶液使用与目前丝素蛋白溶液生产中使用的方法明显不同的方法制备,如图1所示。值得注意的是,丝素蛋白,当与溶液中的LiBr组合时的高压釜启动化学转变以产生稳定的SDP物料。将丝素蛋白溶解于LiBr溶液,其中和溶解的天然丝素蛋白的氢键和静电相互作用。这使得蛋白质在溶液中没有具体的二级结构确认。因此,水解丝素蛋白链内的共价键所需的热力学能量是处于引发水解裂解的最低能量需求。
在一种实施方式中,在15-17PSI高压釜条件下将温度设定为121℃达30分钟。然而,在多种实施例中,可以修改处理条件以将SDP物料稳定到不同程度。在其它实施方式中,可以在该过程中使用另外的蛋白质增溶剂,包括其它或另外的卤化物盐如氯化钙和硫氰酸钠,有机试剂如尿素,盐酸胍和1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇,另外的强离子液体溶液添加剂如硝酸钙和1-丁基-3-甲基咪唑氯化物,或其组合。
丝素衍生的蛋白质组合物
本发明提供了一种丝素衍生的蛋白质组合物,该组合物在水溶液中具有增强的溶解性和稳定性。在一种实施方式中,本发明提供了一种蛋白质组合物,其通过包括在升高的压力下加热含水丝素溶液的方法制备。所述含水丝素溶液包含至少8M浓度的溴化锂。所述含水丝素溶液在至少约10PSI 的压力下被加热到至少约105℃(221°F)达至少约20分钟,以提供蛋白质组合物。所述蛋白质组合物的多肽包含少于8.5%的丝氨酸氨基酸残基,并且所述蛋白质组合物以10%w/w水溶液具有低于5 cP的水相粘度。
在其它实施方式中,本发明提供了一种蛋白质组合物,其通过包括在升高的压力下加热含水丝素溶液的方法制备,其中所述含水丝素溶液包含9-10M浓度的溴化锂,并且其中所述含水丝素溶液在约15PSI至约20PSI的压力下被加热至约115℃(239°F)至约125℃(257°F)的温度达至少约20 分钟,以提供蛋白质组合物。所述蛋白质组合物可以包括少于6.5%的丝氨酸氨基酸残基,并且所述蛋白质组合物以15%w/w水溶液可以具有低于10cP的水相粘度。
本发明还提供了一种丝素衍生的蛋白质组合物,其具有在水溶液中增强的稳定性,其中:所述丝素衍生的蛋白质组合物的初级氨基酸序列在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量的组合差别方面与天然丝素具有至少4%的差别(丝素衍生的对比PASF);丝素重蛋白链和丝素轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫桥被减少或去除;所述组合物具有与天然丝素蛋白质相比降低25%以上的丝氨酸含量;以及其中所述丝素衍生的蛋白质组合物的平均分子量为小于约100kDa且大于约25kDa。
在另外的实施方式中,本发明还提供了一种丝素衍生的蛋白质组合物,其具有在水溶液中增强的稳定性,其中:所述丝素衍生的蛋白质组合物的初级氨基酸序列在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量的组合差别方面与天然丝素具有至少6%的差别;丝素重蛋白链和丝素轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫桥被减少或去除;所述组合物具有与天然丝素蛋白质相比降低40%以上的丝氨酸含量;以及其中所述丝素衍生的蛋白质组合物的平均分子量为小于约96kDa且大于约25kDa。
本发明进一步提供了一种丝素衍生的蛋白质组合物,其具有在水溶液中增强的稳定性,其中所述丝素衍生的蛋白质组合物的初级氨基酸序列是修饰自天然丝素;所述丝素重蛋白链和丝素轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫桥被减少或去除;所述丝素衍生的蛋白质的平均分子量为小于约100kDa且大于约25kDa;以及所述丝素衍生的蛋白质组合物在5秒钟超声处理后至少两个小时保持550nm处的吸收度低于0.25。例如,所述蛋白质组合物的5%w/w溶液可以在以10Hz和20%振幅进行5秒超声处理之后保持550nm处的吸收度低于0.1,这是本文所述用于超声处理的标准条件。
在另外的实施方式中,本发明进一步提供了一种丝素衍生的蛋白质组合物,其具有在水溶液中增强的稳定性,其中:所述丝素衍生的蛋白质组合物的初级氨基酸序列是修饰自天然丝素,以致所述蛋白质组合物的初级氨基酸序列在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量的组合差别方面与天然丝素具有至少5%的差别;丝素重蛋白链和丝素轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫桥被减少或去除;所述丝素衍生的蛋白质的平均分子量为小于约96kDa且大于约25kDa;以及所述丝素衍生的蛋白质组合物在5秒钟超声处理后至少两个小时保持550nm处的吸收度低于0.2。
在多种实施方式中,所述丝素衍生的蛋白质组合物可以例如经由渗析和/或过滤被分离和/或提纯成为一种干粉或膜片。或者,所述丝素衍生的蛋白质组合物能够被分离和/或纯化为稳定的水溶液,其可以被修饰以用作食物或饮料组合物,或用于医疗制剂,比如眼科制剂。因此,本发明还提供了包含本文所述蛋白质组合物和食品或饮料成分的食品或饮料组合物。所述食品成分可以包括一种或多种的单糖、二糖、碳水化合物、脂肪、油类、维生素、矿物质和水。所述饮料成分可以包括一种或多种的水、着色剂(例如,合成着色剂或天然着色剂如藏红花)、维生素和矿物质。
在多种实施方式中,所述丝素衍生的蛋白质的氨基酸组成与天然丝素的氨基酸组成相比,差别为至少4%、至少4.5%、至少5%、至少5.5%、或至少6%,就丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的组合含量来说。
所述组合物的丝氨酸含量,与天然丝素的丝氨酸含量相比,可以降低大于25%、大于30%、大于35%、大于40%或大于45%。
所述丝蛋白衍生蛋白质组合物的平均分子量可以小于约100kDa,小于约98kDa,小于约96 kDa,小于约95kDa,小于约90kDa,小于约85kDa,小于约80kDa,小于约75kDa,或小于约70 kDa。在不同的实施方式中,所述丝蛋白衍生蛋白质组合物的平均分子量可以为大于约30kDa,大于约35kDa,大于约40kDa,大于约50kDa,大于约60kDa,或大于约70kDa。相应地,所述丝蛋白衍生蛋白质组合物的(重均)平均分子量可以为约30kDa至约100kDa,约30kDa至约96kDa,约30kDa至约90kDa,约35kDa至约80kDa,约35kDa大约70kDa,约40kDa约60kDa。在不同的实施方式中,所述丝蛋白衍生蛋白质组合物的平均分子量可以为约60kDa至约80kDa,约50 kDa至约70kDa,约40kDa至约60kDa,约30kDa至约50kDa,约35kDa至约45kDa,或约40 kDa至约43kDa。
在多种实施方式中,所述蛋白质组合物在水中的10%w/w溶液具有低于4cP的水相粘度。在另外的实施方式中,所述蛋白质组合物在水中的24%w/w溶液具有低于10cP的水相粘度。
在一些实施方式中,所述蛋白质组合物能够在40%w/w溶解于水而不会发生任何能够目测得到的沉淀现象。
在多种实施方式中,所述蛋白质组合物,在其高至10%w/w浓度的水溶液进行超声处理后,不会发生胶凝。在另外的实施方式中,所述蛋白质组合物,在其高至15%w/w,高至20%w/w,高至25% w/w,高至30%w/w,高至35%w/w,或高至40%w/w浓度的水溶液进行超声处理后,不会发生胶凝。
在一些实施方式中,所述蛋白质组合物包括少于8%的丝氨酸氨基酸残基。在另外的实施方式中,所述蛋白质组合物包括少于7.5%的丝氨酸氨基酸残基,7%的丝氨酸氨基酸残基,6.5%的丝氨酸氨基酸残基,或6%的丝氨酸氨基酸残基。
在一些实施方式中,所述蛋白质组合物包括多于46.5%的甘氨酸,相对于所述蛋白质组合物的总氨基酸含量。在另外的实施方式中,所述蛋白质组合物包括多于47%的甘氨酸,多于47.5%的甘氨酸,或多于48%的甘氨酸。
在一些实施方式中,所述蛋白质组合物包括多于30%的丙氨酸,相对于所述蛋白质组合物的总氨基酸含量。在另外的实施方式中,所述蛋白质组合物包括多于30.5%的丙氨酸,多于31%的丙氨酸,或多于31.5%的丙氨酸。
在一些实施方式中,所述蛋白质组合物在被干燥成膜片之后完全地重新溶解。在多种实施方式中,所述蛋白质组合物在水溶液中没有beta-折叠蛋白质结构。在一种具体实施方式中,所述蛋白质组合物在至少5秒钟超声处理后保持在水溶液中550nm处的吸收度低于0.25。
在一些实施方式中,所述蛋白质组合物是与水结合。所述蛋白质组合物能够完全溶解于水,其浓度为10%w/w,或甚至浓度高于例如15%w/w,20%w/w,25%w/w,30%w/w,35%w/w,或40% w/w。在一些实施方式中,所述蛋白质组合物能够被分离或纯化,例如,采用渗析,过滤,或其组合的方式。
在多种实施方式中,所述蛋白质组合物能够增强含有所述蛋白质组合物和眼科制剂组合物的水溶液的铺开作用,例如,相较于不包含所述蛋白质组合物的相应组合物的铺开作用。所述铺开作用的增强能够导致所述水溶液表面积提高两倍或三倍以上。
在一些实施方式中,所述蛋白质组合物在高至20%w/v,高至30%w/v,或高至40%w/v的浓度不会形成凝胶。所述蛋白质组合物能够维持在溶液高到至少9.8cP的粘度。
在一些实施方式中,所述丝素衍生的蛋白质组合物能够具有甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸 (GAGA)的氨基酸片断,其包括所述丝素衍生的蛋白质组合物的氨基酸的至少约47.5%。所述丝素衍生的蛋白质组合物还能够具有甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸(GAGA)的氨基酸片断,其包括所述蛋白质组合物的氨基酸的至少约48.5%,至少约49%,至少约49.5%,或至少约50%。
在一些实施方式中,所述丝素衍生的蛋白质组合物具有甘氨酸-丙氨酸(GA)的氨基酸片断,其包括所述丝素衍生的蛋白质组合物的氨基酸的至少约59%。所述丝素衍生的蛋白质组合物还能够具有甘氨酸-丙氨酸(GA)的氨基酸片断,其包括所述蛋白质组合物的氨基酸的至少约59.5%,至少约60%, 至少约60.5%,至少约61%,或至少约61.5%。
在另一实施方式中,所述丝素衍生的蛋白质组合物的初级氨基酸序列在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量的组合差别方面与天然丝素具有至少6%的差别;所述丝素衍生的蛋白质组合物的平均分子量为小于约100kDa;以及所述丝素衍生的蛋白质组合物在5秒钟超声处理后至少两个小时保持550nm 处的光吸收度小于0.25。因此,在一种具体实施方式中,本发明提供了一种具有在水溶液中增强稳定性的丝素衍生的蛋白质组合物,其中:所述丝素衍生的蛋白质组合物的初级氨基酸序列在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量的组合差别方面与天然丝素具有至少6%的差别;丝素重蛋白链和丝素轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫桥被减少或去除;所述组合物具有与天然丝素蛋白质相比降低40%以上的丝氨酸含量;以及其中所述丝素衍生的蛋白质组合物的平均分子量为小于约96kDa。
在另一实施方式中,本发明提供了一种丝素衍生的蛋白质组合物,其具有在水溶液中增强的稳定性,其中:所述丝素衍生的蛋白质组合物的初级氨基酸序列是修饰自天然丝素;丝素重蛋白链和丝素轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫桥被减少或去除;所述丝素衍生的蛋白质的平均分子量为小于约 100kDa;以及所述丝素衍生的蛋白质组合物在5秒钟超声处理后至少两个小时保持550nm处的吸收度低于0.25。在一种具体实施方式中,所述丝素衍生的蛋白质组合物的初级氨基酸序列是修饰自天然丝素,以致所述蛋白质组合物的初级氨基酸序列在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量的组合差别方面与天然丝素具有至少5%的差别;丝素重蛋白链和丝素轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫桥被减少或去除;所述丝素衍生的蛋白质的平均分子量为小于约96kDa;以及所述丝素衍生的蛋白质组合物在5秒钟超声处理后至少两个小时保持550nm处的吸收度低于0.2。
因此,在一种具体实施方式中,本发明提供了一种丝素衍生的蛋白质组合物,其具有在水溶液中增强的稳定性,其中:所述丝素衍生的蛋白质组合物的初级氨基酸序列是修饰自天然丝素,以致所述蛋白质组合物的初级氨基酸序列在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量的组合差别方面与天然丝素具有至少5%的差别;丝素重蛋白链和丝素轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫桥被减少或去除;所述丝素衍生的蛋白质的平均分子量为小于约96kDa;以及所述丝素衍生的蛋白质组合物在5秒钟超声处理后至少两个小时保持550nm处的吸收度低于0.2。
本发明还提供了一种蛋白质组合物,经由包括在加压下加热含水丝素溶液的过程制备,其中所述含水丝素溶液包括浓度至少为8M的溴化锂;以及其中所述含水丝素溶液在至少约10PSI的压力下被加热到至少约105℃(即221°F)达至少约20分钟;用以提供所述蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物包括少于8.5%的丝氨酸氨基酸残基,并且所述蛋白质组合物在水中的10%w/w溶液具有低于5cP的水相粘度。因此,本发明提供了一种制备丝素衍生的蛋白质组合物的方法,其包括本文所述的一个或多个工艺步骤。
在一种实施方式中,溴化锂的浓度为约8.5M至约11M。在一些实施方式中,溴化锂的浓度为约 9M至约10M,或约9.5M至约10M。
在一些实施方式中,所述含有溴化锂的含水丝素溶液被加热到至少约107℃(225°F),至少约 110℃(230°F),至少约113℃(235°F),至少约115℃(239°F),或至少约120℃(248°F)。
在一些实施方式中,所述含有溴化锂的含水丝素溶液在压力下被加热,所述压力为至少约12 PSI,至少约14PSI,至少约15PSI,或至少约16PSI,高至约18PSI,或高至约20PSI。
在一些实施方式中,所述含有溴化锂的含水丝素溶液被加热至少约20分钟,至少约30分钟,至少约45分钟,或至少约1小时,高至几(例如12-24)小时。
在一些实施方式中,所述蛋白质组合物在水中的10%w/w溶液具有低于4cP的水相粘度。在多种实施方式中,所述蛋白质组合物在水中的24%w/w溶液具有低于10cP的水相粘度。
在一些实施方式中,所述所述蛋白质组合物能够在40%w/w溶解于水而不发生可观察到的沉淀
在一些实施方式中,所述丝素与丝胶分离。
在一些实施方式中,溴化锂被从所述蛋白质组合物去除,用以提供纯化的蛋白质组合物。在多种实施方式中,所述蛋白质组合物被分离和纯化,例如,通过渗析,过滤,或其组合的方式。
在多种实施方式中,所述蛋白质组合物,在其高至10%w/w,高至15%w/w,高至20%w/w,高至 25%w/w,高至30%w/w,高至35%w/w,或高至40%w/w浓度的水溶液进行超声处理后,不会发生胶凝。
在另外的实施方式中,所述蛋白质组合物具有上述的性能,以及上述有关丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量的氨基酸组合物。
在多种实施方式中,所述蛋白质组合物在被干燥成膜片之后完全地重新溶解。所述蛋白质组合物在溶液中可以没有beta-折叠蛋白质结构。所述蛋白质组合物在至少5秒钟超声处理后能够保持在水溶液中550nm处的吸收度低于0.25。
在一种具体实施方式中,本发明提供了一种经由包括在加压下加热含水丝素溶液的过程制备的蛋白质组合物,其中所述含水丝素溶液包括浓度为9-10M的溴化锂,以及其中所述含水丝素溶液在约14PSI至约20PSI的压力下被加热到约115℃(239°F)至约125℃(257°F)达至少约20分钟;用以提供所述蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物可以包括少于6.5%的丝氨酸氨基酸残基,并且所述蛋白质组合物在水中的15%w/w溶液具有低于10cP的水相粘度。
本发明的进一步的实施方式描述如下。
本发明提供了一种新颖的丝衍生的蛋白质(SDP)组合物,其在化学上有别于天然的丝素蛋白质。所述SDP在水溶液中具有增强的稳定性。所述SDP能够用于包括将食品、饮料或眼科制剂与本文所述的蛋白质组合物混合起来的制备食品成分、饮料、或眼科制剂的方法。所述溶液可以包含约0.01%至约92%w/v的SDP。所述溶液可以是约8%至约99.9%w/v的水。
在一种实施方式中,所述具有增强溶液稳定性的SDP物料能够用于供人类或动物消费的饮料成分,例如运动饮料、营养饮料、软性饮料或瓶装水中的成分或添加物。在另一种实施方式中,所述具有增强溶液稳定性的SDP物料可以用作食品的成分,比如在奶制品、谷类或加工食品中,在还有另一种实施方式中,所述具有增强溶液稳定性的SDP物料可以用作眼科滴剂的成分,比如用于人造泪液,眼润滑剂,眼睑洗剂,或治疗配方。
在一方面,本发明提供了一种包括丝素蛋白质的水解、氨基酸分解或其组合的工艺过程,以致所述蛋白质的平均分子量从采用现有技术方法生产的丝素的约100-200kDa降低到本文所述SDP物料的约30-90kDa或约30-50kDa。所获得的多肽类能够以本文所述范围各种平均分子量肽类进行随机分类。另外,所述氨基酸化学性质能够通过将半胱氨酸含量降低到由标准测试手段检测不到的程度而发生改变。例如,所述丝氨酸含量能够从存在于天然丝素的程度降低50%以上,这样,由标准测试手段确定,能够引起丙氨酸和甘氨酸的总体含量减少5%(相对氨基酸含量)。所述工艺过程提供了一种氨基酸组合物,其中所述丝素轻链蛋白质在处理过程之后,以及样品采用标准SDS-PAGE 电泳方法是观察不到的。在一种实施方式中,所述SDP物料能够在具有40-60%w/v溴化锂(LiBr)溶液并且在高压釜或类似条件下(即大约120℃和14-18PSI)通过丝素纤维的处理而制得。
在一些实施方式中,本发明提供了一种包含所述SDP作为成分的食品或饮料产品。所述SDP能够用来提供额外的蛋白质含量,从而对于消费所述食品或饮料的人或动物来说能够提升营养价值、健康效益和/或治疗好处。在另外的实施方式中,所述SDP被用于诸如酸乳、能量条、谷类、面包或意式面点的食用产品。
所述食品或饮料产品可以包括有效量的SDP,比如约0.01%重量至约92%重量的SDP。在多种实施方式中,所述SDP可以是约0.1%重量至约30%重量,约0.5%重量至约20%重量,或约1%重量至约10%重量。
在另外的实施方式中,本发明提供了一种眼科组合物,用于治疗人或哺乳动物的干眼症状。所述组合物可以是包含有效量治疗干眼病症的SDP的水溶液。例如,所述水溶液可以包含约0.01%重量至约80%重量的SDP。在另外的实施方式中,所述水溶液可以包含约0.1%重量至约10%重量,或约0.5%重量至约2%重量的SDP。在有些具体实施方式中,所述眼科组合物能够包含约0.05%w/v SDP,约0.1%w/v SDP,约0.2%w/v SDP,约0.25%w/vSDP,约0.5%w/v SDP,约0.75%w/v SDP,约1% w/v SDP,约1.5%w/v SDP,约2%w/v SDP,约2.5%w/v SDP,约5%w/v SDP,约8%w/v SDP,或约10% w/v SDP.所述SDP能够是衍生于Bombyx mori家蚕丝素。
在多种实施方式中,所述眼科制剂可以包含水溶液中的其它成分,例如缓和剂、缓冲剂和/或稳定剂。所述缓和剂可以是例如透明质酸(HA)、羟乙基纤维素、羟丙甲纤维素、葡聚糖、明胶、多元醇、羧甲基纤维素(CMC)、聚乙二醇、丙二醇(PG)、羟丙甲纤维素、甘油、聚山梨醇酯80、聚乙烯醇或聚维酮。所述缓和剂可以是,例如,约0.01%重量至约10%重量,或约0.2%重量至约2%重量。在一种具体实施方式中,所述缓和剂为HA。在多种实施方式中,所述HA可以是所述制剂的约0.2%重量。
所述眼科制剂的缓冲剂或稳定剂可以是磷酸缓冲盐、硼酸缓冲盐、柠檬酸缓冲盐、氯化钠、氯化钙、氯化镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化锌、盐酸、氢氧化钠、依地酸二钠或它们的组合。
所述眼科制剂可以进一步包含有效量的抗菌防腐剂。所述抗菌防腐剂可以是,例如,过硼酸钠、聚季铵盐-1(例如防腐剂)、苯甲烃铵(BAK)氯化物、亚氯酸钠、溴莫尼定、二硫化铁溴莫尼定、聚亚硫酸盐或它们的组合。
所述眼科制剂可以进一步包含有效量的血管收缩剂、抗组织胺、或它们的组合。所述血管收缩剂或抗组织胺可以是盐酸萘甲唑啉、盐酸麻黄碱、盐酸去氧肾上腺素、盐酸四氢唑啉、马来酸苯吡胺或它们的组合。
在一种实施方式中,所述眼科制剂可以包含有效量本文所述的与水结合的丝素衍生的蛋白质以及一种或多种眼科成分。所述眼科成分可以是例如a)聚乙烯醇;b)PEG-400和透明质酸;c)PEG- 400和丙二醇,d)CMC和甘油;e)丙烯甘醇和甘油;f)甘油,羟丙甲纤维素和PEG-400;或任何一种或多种上述成分的组合。所述眼科制剂可以包括一种或多种非活性成分,例如HP-瓜尔胶、硼酸盐、氯化钙、氯化镁、氯化钾、氯化锌等。所述眼科制剂还可包括一种或多种眼科防腐剂,例如亚氯酸钠(防腐剂(NaClO2)、多季胺聚合物(polyquad)、BAK、EDTA、山梨酸,苄基醇等。所述眼科成分、非活性配料和保护剂可以包括在约0.1%至约5%w/v,例如约0.25%、0.3%、0.4%、 0.5%、1%、2%、2.5%或5%,或者上述任何两个值之间的范围。
于是,本发明提供了一种丝素衍生的蛋白质(SDP)组合物,其具有在水溶液中增强的稳定性,其中:所述丝素衍生的蛋白质组合物的初级氨基酸序列是修饰自天然丝素;丝素重蛋白链和丝素轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫桥被减少或去除;其中所述组合物具有与天然丝素蛋白质相比降低40%以上的丝氨酸含量;以及其中在所述丝素衍生的组合物中所述蛋白质的平均分子量为小于约96kDa。
本发明还提供了一种眼科制剂,用于治疗人或动物的眼科病症,其中所述眼科制剂包括水以及有效量的上述SDP。本发明进一步提供了一种用于人和哺乳动物眼科治疗的眼科组合物,其中所述眼科组合物包括水、一种或多种缓冲剂和稳定剂,以及有效量的上述SDP。
所述SDP在水中是高度稳定的,其储存期溶液稳定性是在溶液中天然丝素的两倍以上。例如,所述SDP在水中是高度稳定的,其储存期溶液稳定性与在溶液中天然丝素相比为10倍以上。所述 SDP物料,于水溶液中,在5%(50mg/mL)浓度的溶液进行声波处理后不会发生胶凝。在另外的实施方式中,所述SDP物料,于水溶液中,在10%(100mg/mL)浓度的溶液进行声波处理后不会发生胶凝。
所述SDP无聊可以是相较于天然丝素蛋白质去除了超过50%的丝素轻链。所述SDP物料可以是具有少于约8%相对氨基酸含量的丝氨酸氨基酸含量,或少于约6%相对氨基酸含量的丝氨酸氨基酸含量。
所述SDP物料可以具有超过约46.5%的甘氨酸含量。所述SDP物料可以具有超过约30%的或超过约30.5%的丙氨酸含量。所述SDP物料可以具有检测不到的半胱氨酸含量,例如,经由所述蛋白质组合物的水解多肽的HPLC分析。
所述SDP物料可以形成相较于天然丝素蛋白质少90%,少95%,或少98%的beta-折叠二级蛋白质结构,例如,经由下述实施例8所述的FTIP分析。
本发明另外还提供了一种眼科成分,用于人或哺乳动物的眼科治疗,所述组合物包括水溶液,其含有有效量的上述SDP物料以及缓冲剂或稳定剂。
本发明还进一步提供了一种眼科制剂,用于治疗人或哺乳动物的眼科病症,所述组合物包括水溶液,其包含有效量的上述具有增强稳定性的SDP物料。
本发明还提供了一种用来形成带有丝蛋白质的饮料混合物、食品组合物或眼科组合物的方法,其包括将食、饮料或眼科成分与本文所述的丝素衍生的蛋白质组合物进行混合。
以下实施例是用来对上述发明内容进行说明,而不应被解释为限制发明的范围。本领域技术人员应很容易的认识到所述实施例能够提示本发明可以通过很多其他方法来实施。应当理解,在本发明的范围内可以进行很多的变化和修改。
实施例1、丝素衍生的蛋白的制备和劳伦斯稳定性测试
材料:蚕茧来自Tajima Shoji Co.,Ltd.,Japan。溴化锂(LiBr)来自FMC Lithium,Inc.,NC。高压釜来自Tuttnauer Ltd.,NY。3,500Da分子量截留(MWCO)透析膜来自ThermoScientific,Inc.,MA。 Oakton Bromide(Br-)双结离子选择性电极来自ISE,OaktonInstruments,IL。
过程:如图1所示,制备了两个样品,即SDP和现有技术丝素蛋白。简单来说,通过将无蛹、切割的蚕茧(3-5切/茧)以在233mL水/克茧浸没在95℃加热含有0.3wt%NaCO3的去离子水(diH2O) 中。蚕茧在所述溶液中搅拌75分钟以溶解丝胶,从而与丝纤维分离。随后,将茧子以类似稀释度的 diH2O冲洗四次,每次20分钟,以从洗涤的丝纤维中除去残留的丝胶。然后将纤维在60℃的对流烘箱中干燥2小时,称重,并以每克提取的纤维的4×LiBr体积的比例溶解在54wt%LiBr水溶液中。该溶液被覆盖,然后在60℃的对流烘箱中加热2小时,以加快被提取纤维的溶解。然后所述将溶液被置于高压釜中并暴露于灭菌条件(121℃,17PSI,90-100%湿度)30分钟以促进丝素的转化。所得溶液被任其冷却至室温,然后用diH2O稀释至5%丝素并且用3,500Da MWCO膜透析以除去LiBr盐。在diH2O中进行多次交换,直到Br-离子小于1-ppm,在水解的丝素溶液中通过Oakton Bromide(Br-) 双结离子选择性电极读取进行测定。所述溶液通过1–5μm孔隙过滤器进一步过滤,然后通过0.2μm 增泽过滤器进行过滤。该产品在图2中标为“SDP溶液”。
“对照”丝素溶液的制备如图1所示,以提供图2所示的“现有技术丝素溶液”。除了高压釜步骤之外,采用了如前所述相同的方法。来自各个样品的取样体积(5mL)被置于分开的20mL玻璃烧杯中,并且烧杯采用箔纸密封。然后,所述样品进行劳伦斯稳定性测试。
劳伦斯稳定性测试通过将含水蛋白质测试溶液(5%w/v,50mg/mL)置于高压釜室内进行。然后,高压釜在121℃,17PSI,30分钟,97-100%湿度下运行。循环完成后,溶液被冷却,再从高压釜室移出。然后,将溶液摇动以观察溶液凝胶化表现。如果溶液在摇动约10秒钟就发生胶凝,就认为样品没通过劳伦斯稳定性测试。试验未通过就表明该物料作为蛋白质溶液本身是不稳定的。
对SDP溶液和现有技术丝素溶液都进行了劳伦斯稳定性测试。现有技术丝素溶液样品立即凝胶化,因此未通过劳伦斯稳定性测试。相反,SDP溶液样品无限期保持为溶液,因此通过了劳伦斯稳定性测试。未出现凝胶化可归因于SDP溶液的制备包括了图1所示的高压釜处理步骤。不同测试结果(未凝胶化和凝胶化)的图像如图2所示。
实施例2、丝素衍生的蛋白质分子量表征
为了评价处理过程对溶解的蛋白质的分子量分布的影响,将SDP溶液和现有技术丝素溶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),其依据分子量对蛋白质进行分离。具体而言,将15μg的样品与含有十二烷基硫酸钠和二硫苏糖醇(Biorad Inc.,CA)的运行缓冲液混合以分别除去任何二级折叠结构和二硫键。然后所述混合物被加热至70℃达5分钟。所述混合物与2.5-200kDa分子量梯状标志(Life Technologies,CA)一起装载到含有Bis-Tris缓冲盐(Life Technologies,CA)的预制的4-12%聚丙烯酰胺梯度凝胶上,然后在BioRadPowerPac Power电源(BioRad Inc.,CA)上暴露于120V的电场达90分钟。然后凝胶被取出并置于Coomassie Blue染色中12小时对蛋白质进行染色,接着在diH2O中洗涤6小时。然后所述凝胶在Biorad GS-800 Calibrated Desitometer(BioRad Inc.,CA)上被扫描。
所得凝胶如图3所示。结果表明用于制备SDP溶液的处理过程将平均分子量从150-200kDa显着地转变为小于80kDa(图3)。分子量的转变清楚地表明原始天然丝素的初级和/或二级结构的转化。此外,丝素的丝素轻链在高压灭菌过程之后不存在于SDP中(可见于现有技术丝素的泳道2的 23-26kDa处),这表明蛋白质的丝素轻链部分已经通过处理过程被降解或消除。这些结果表明,高压釜处理将天然丝素蛋白转化成具有比天然丝素蛋白更小的肽片段的新物料。所述处理过程进一步降解/修饰丝素轻链。这些转化通过所述化学变化得出具有增强的溶液稳定性的SDP物料。
实施例3、丝素衍生的蛋白质稳定性研究
为了进一步确定高压釜工艺对所得SDP的稳定性与现有技术丝素蛋白的稳定性相比的功能影响,样品分析采用了一种方法,见于Wang et al.(Biomaterials 2008,29(8):1054-1064),用以模拟丝素蛋白凝胶化的良好表征模型。定量的两个样品(0.5mL,SDP和PASF)被加入到1.7mL透明离心管中,并进行超声处理(20%振幅,10Hz,15秒)。然后含有溶液的透明管由目测被监测凝胶的形成。
所述SDP溶液样品未能形成凝胶,如图4A所示。甚至在超声处理3个月之后,所述SDP样品仍保留在溶液中,并且通过目视检查确定没有蛋白质聚结现象。所述现有技术丝素溶液样品在超声处理后迅速(2小时内)形成凝胶。所得凝胶的现有技术丝素蛋白如图4B所示。这些结果进一步表明,高压釜工艺将现有技术丝素转化成新的物料并且表明所得SDP物料的稳定性。
实施例4、加热对水性丝溶液粘度性能的影响
对PASF和SDP的物理化学性质的研究,特别注意到蛋白质浓度对溶液粘度的影响。Zafar et al. (Biomacromolecules 2015,16(2):606-614)表明丝素重链和轻链蛋白在其流变学特性上是不同的,因此这些成分在PASF中的不同降解速率会对给定溶液的粘度随时间引起不可预计的变化。此外,总纤素蛋白浓度对粘度的影响是非线性的,亦由Zafaretal.所示,并且随着纯化的丝素溶液超过 100mg/mL而加速升高,从而限制了特定应用中所述蛋白质溶液的可用浓度。
为了确定这些限制是否可以通过最终达到SDP中的氨基酸转化来克服,80-100mL的PASF或高压釜处理的SDP以50-80mg/mL产生。为了评估将PASF加热到低于高压釜条件水平的影响,将 PASF在如上所述的夹套反应容器中加热至225°F达30分钟。净化的溶液在~22℃被置于层流罩 (Baker Sterilgard 56400,Class II)中的140mm浅塑料称重盘中以促进蒸发。以周期性间隔,收集浓缩样品以测定蛋白质含量(以%w/w计算),并使用粘度计(Brookfield LVDV-E,spindle 00)评估粘度。测定是以每分钟轴转数(约1-100rpm)进行,具有能够允许在25℃对16mL样品体积进行精确粘度测定的扭矩范围。
如图5所示,当溶液超过75mg/g时,PASF的粘度陡然上升。此外,PASF不能浓缩至>200mg/g,此时丝素蛋白会开始变得不溶。PASF溶液在透析前加热至225°F显示热量对溶液粘度的影响。特别地,被加热的PASF相对于未被加热的PASF在给定浓度下显示出降低的粘度。相比之下, SDP在140mg/g或以下的浓度下的溶液粘度呈现最低的变化(图5)。此外,在PASF不能再保持在溶液中的蛋白质浓度(例如,240mg/g),SDP的粘度保持低于~10cP。重要的是,SDP能够在超过 400mg/g的浓度保持均质,其中粘度保持在150cP以下。
与高于4%w/w的所有浓度的PASF相比,含水SDP溶液显示较低的粘度。另外,PASF溶液在约20%w/w开始出现凝胶化,此时不可能进行精确的粘度测量,而SDP物料的浓度增加而没有显示出凝胶、聚结现象或粘度显著增加,一直到25%w/w溶液。
总之,这些结果清楚地表明,本文所述的用于制备SDP的与方法相关的蛋白质转化需要用于高度浓缩的、低粘度的蛋白质溶液的生产。
实施例5、丙酮酰肽的形成
上文所示反应式1描述的化学反应导致生成丙酮酰肽。丙酮酸肽降解成丙酮酸盐,通过标准丙酮酸盐分析法可以很容易地检测。为了证明热量和压力(例如,高压釜中的环境)的施用能够促进丝素蛋白处理工艺中的丙酮酰生成,使用上述现有方法制备了水性丝素溶液(5%w/v于水)。然后将物料在高温夹套烧杯(ChemGlass,NJ)中在高至210°F的设定温度或刚好低于蛋白质溶液的沸点进行加热。具体而言,现有技术丝素蛋白质溶液被加热至~65℃(~150°F),~90℃(~200°F),或~99℃ (~210°F),然后在达到这些温度时进行取样从而通过比色分析(丙酮酸盐分析试剂盒,MAK071, Sigma-Aldrich)测量丙酮酸盐的浓度。
在90℃和99℃的加热样品中,丙酮酸盐的产量都增加。在99℃时丙酮酸盐增加50%(图 6A)。为了确定丙酮酸盐转化是否随时间进一步增加,样品被加热至99℃,并在该温度下保持30 分钟(图6B)。持续的加热导致丙酮酸盐形成的强劲增加,相对于未加热的样品,丙酮酸盐的产生量增加四倍以上。这些结果表明,所述丝素蛋白在被加热时,通过丙酮酸盐测定检测到含丙酮酰的物质的化学转化。从该数据可以得出结论,在更加极端的加热环境中,例如在高压釜工艺中,丝素蛋白将被激发更大程度地产生丙酮酸盐。这提供了进一步的证据,即最终的SDP产品与现有技术丝素是化学上不同的物质。
实施例6、氨基酸分布分析
采用离子交换色谱法(AOAC Official Method 994.12,Amino Acids.com,MN)研究了溶解在9.3M LiBr溶液中的丝素纤维的加热对氨基酸分布的影响。利用实施例1中描述的方法制备了用作SDP溶液和现有技术丝素溶液的样品。然后所述溶液以相同浓度用来通过色谱法进行评估。尤其关注了氨基酸丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸,考虑到其在丝素蛋白初级序列中的显著组成及其在二级结构形成中的关键作用。
SDP溶液样品被发现相对于现有技术丝素溶液样品含有少40%的丝氨酸(图7A),以及甘氨酸和丙氨酸含量的相应增加(图7B)。这些结果表明氨基酸含量发生显着变化,这种变化导致了由于高压釜工艺而引起不同(和增强)的化学和物理性能。这些结果也印证了Mayen et al.(Biophysical Chemistry 2015.197:10-17)文献中的结果,其中增加的丝氨酸含量显示增加了丝素蛋白的初始聚结,而甘氨酸和丙氨酸含量增加的丝素氨蛋白需要更大的能量阈值才能开始聚结。因此,通过减少丝氨酸并增加丙氨酸和甘氨酸含量,聚结的倾向(和/或可能性)被降低或消除,导致SDP的更大的溶液稳定性。
实施例7、人造泪液制剂
所述SDP溶液被用来配制治疗眼部疾病和症状的人造泪液。所述人造泪液可以专门配制并用于治疗“干眼症”的不适。所述人造泪液也可以被配制并用于治疗由意外或手术损伤引起的眼部伤口。
将SDP掺入人造泪液制剂是特别有利的,因为它增加了制剂的铺散性。含有SDP的人造泪液,由于其溶液稳定性,也具有非常长的保存期限。位于所述SDP蛋白背梁的亲水和疏水氨基酸基团的嵌段共聚物排列允许分子与泪液膜片内的水溶性和水不溶性化学物质相互作用。当包含作为人造泪液滴眼制剂中的成分时,SDP成分用于增强人造泪液的铺散性,为患者提供额外的舒适感并且使产品的功效延长。对于获得这种铺散性不需要现有技术丝素溶液的聚结性基团,所以去除这些区域以提高溶液中蛋白质产物在随时间的稳定性是有利的。
通过将主要品牌人造泪液与使用SDP成分配制的人造泪液进行比较,展示了人造泪液的增强铺散能力。利用测试方案来评估机械铺散对各种滴眼剂产品润湿能力的影响。在实验中比较了磷酸盐缓冲盐水(PBS)、AVR的(TT)人造泪液、AMO的Tears滴眼剂、Alcon的Systane (SB)滴眼剂和含有SDP的制剂。作为参考,PBS含有100mmol PBS盐在水中,TT含有 0.25%wt.的羧甲基纤维素(CMC)作为活性成分以及加有的其它缓冲盐在水中,Blink含有0.2%wt.的透明质酸(HA)作为活性成分以及缓冲盐在水中,SB含有0.6%wt.的丙二醇(PG)作为活性成分以及用 HP-瓜尔胶和矿物油作为随缓冲盐的增强赋形剂,并且所述SDP溶液含有0.25%wt.CMC以及1% wt./vol.SDP和缓冲盐(即含有137mM NaCl的0.01M磷酸盐缓冲液)。
该组被比较的产品包括多种抑制剂和另外的活性成分增强赋形剂。图8显示包含SDP成分的机械铺散能力比领头品牌配方提高了近四倍。这种铺散增强作用可以与穿过眼表面的眼睑擦拭进行比较。因此,SDP成分使患者获得更好的舒适度,同时提高产品的功效和稳定性。此外,将SDP成分添加到现有技术丝素溶液是有利的,因为现有技术丝素溶液会在产品保存期间发生胶凝并聚结。这些聚结体在基于目前美国药典(USP)的规定要求(注射中的颗粒物质:USP<788-789>)的眼科制剂中是不可接受的。
实施例8、蛋白质二级结构的分析
对高压釜工艺过程对于二级结构形成的影响进行了评估。将5%w/v SDP溶液和5%w/v现有技术丝素溶液(各100μL)浇于14mm直径的硅酮橡胶表面(n=6),并让其在几小时内风干成固态膜片。然后所述膜片通过ATR-FTIR(Nicolet iS10,Thermo Scientific,MA)以4nm分辨率各16次扫描进行评估。
所述膜片还在真空水处理室(water-annealing chamber)中处理5小时,所述真空水处理室为在底盆中充有水的真空容器以形成100%RH的环境。水蒸气诱导形成丝素蛋白膜片的二级结构,最显著的是beta折叠结构,其被描述于Jin et al.(AdvancedFunctional Materials 2005,15:1241-1247)。然后,膜片样品通过如上所述的FTIR进行再分析。光谱分析揭示,SDP和现有技术丝素膜片在物料处理之前产生了相似的IR特征,但SDP物料在处理之后没有形成beta折叠二次结构的能力,其表现为在IR 光谱分别位于1624cm-1和1510cm-1的酰胺I和酰胺II区域没有熟知的beta折叠吸收峰(图9A)。该发现表明两种样品物料组成的显着差异,这是SDP和PASF样品中氨基酸化学性质固有地不同的直接迹象。
为了表征二级结构在功能上的影响,将两种150mL的溶液样品在对流的清洁空气环境中在室温下干燥48小时。这导致形成固体蛋白质物料,其表现出两种溶液之间的显着差异(图9B)。最显着的是,与透明和更清晰的PASF物料相比,高压釜处理的SDP物料呈现出暗黄色的半透明状,表明对芳族氨基酸的化学改变。此外,SDP物料形成干燥的表皮层,防止料体的下部区域完全脱水,从而部分地保持液态。现有技术丝素物料与此不同,而是被完全干燥并且在形体上变形成起伏状物料。这些结果表明,由于高压釜处理形成SDP物料,物料的机械性能以及化学相互作用发生了显着的变化。
为了评估溶解度随高压釜处理工艺的变化,两种干燥物料的样品经称重并在去离子水(diH2O) 中重构。对于SDP物料,坚韧的外皮随后被剥离并称重,而对于现有技术丝素,部分物料被弄开并称重。对于两个样品,都是将500mg物料加入到25mL的diH2O(2%w/v溶液)中,然后以高速涡旋 10分钟。有趣的是,SDP物料完全溶解于diH2O,而现有技术丝素物料仅有极少量溶解(图9C)。这些结果表明,由于高压釜处理工艺,SDP和现有技术丝素物料之间的物料溶解度和溶解度化学性能发生了明显的改变。
实施例9、酶性丝素分裂对溶液稳定性的影响
为了鉴别SDP增加的稳定性是由氨基酸的转化直接造成或者仅仅是由于水解生成的较小丝素蛋白而产生,现有技术丝素(PASF)用丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶处理以对丝素进行酶性分解,其操作过程可见于Shaw(Biochem.J.1964,93(1),45-54)。简言之,将从牛胰腺分离的0.5-1.0mg/mL胰蛋白酶 (Sigma-Aldrich,T1426,MO)加到含有HEPES缓冲盐的PASF(78mg/mL)溶液中,混合,并且然后在 37℃培养1、2、4或6小时。反应由加入2mM苯甲基磺酰氟(PMSF)而停止,并且通过如实施例 3所述的1D-PAGE和密度测定法测量丝素分级的程度。
表1、在增加的持续时间内用胰蛋白酶酶切的现有技术丝素的平均分子量。
如表1所示,胰蛋白酶处理被证明直到4小时有效地逐渐降低PASF的平均分子量。然后将这些物料进行超声波处理,以引发beta-折叠的形成和凝胶化,其操作描述于Wanget al.(Biomaterials 2008.29(8):1054-1064)。然而,PASF与胰蛋白酶的分离引起凝胶化动力学的急剧加速,如图10中所归纳的。具体来说,对PASF的1小时胰蛋白酶处理在超声处理后~40分钟的时候诱导凝胶形成,在暴露于胰蛋白酶4小时的PASF中被延缓至~60分钟的时候。PASF对照(存在失活的胰蛋白酶) 表现出随时间的增加的不稳定性,其在大约1300分钟的时候(数据未显示)达到最大程度的β-折叠形成(表现为550nm处的吸收度,图10)。相比之下,丝素衍生的蛋白质(SDP)在这段时间内没有表现出不稳定的趋势,表现为550nm处的最小和不变的吸收度(图10)。这些结果表明,通过选择性肽键的酶切但不进行氨基酸转化,PASF的分级是无效的,并且对于防止β-折叠形成、不稳定性和凝胶形成实际上是会产生相反效果的。
实施例10、二硫键对蛋白质稳定性的影响
丝素重链和轻链二聚体之间通过单个共价二硫键的结合,如(Biochim BiophysActa.1999, 1432(1):92-103)所述。二聚体分离可以引发丝素的肽-肽相互作用,其最终导致不溶性蛋白质聚结(Shulha et al.,Polymer 2006,47:5821-5830),其在beta折叠形成和凝胶化之前(Nagarkar et al.,Phys. Chem.Chem.Phys.2010,12:3834-3844)。因此,为了确定丝素重链二聚体的破坏是否刺激蛋白质聚结因而不稳定,PASF被采用0(对照)、10或100mM的二硫键还原剂二硫苏糖醇(DTT,Sigma- Aldrich,MO)进行处理,然后进行超声波处理以引起β-折叠和凝胶的形成。如图11所示,有10mM DTT的PASF中的二硫键的还原作用降低了,但不抑制不稳定性,表现为相对于对照样品在550nm 处吸收度随时间的增加。这些效应在有100mM DTT的情况下进一步显现,但是对于不稳定性的预防仍然不发生作用。相比之下,SDP在超声波处理后没有不稳定的趋势,表现为不变的基底吸收度,其不受DTT添加的影响(图11)。总之,这些结果表明,丝素二硫桥参与了PASF不稳定性的机理,但它们的还原对于防止β-折叠形成和凝胶化是不起作用的。
实施例11、在溴化锂存在下丝素稳定性需要热量
为了确定在PASF中热介导的氨基酸转化是否需要溴化锂,进行了研究以鉴定当在最终水溶液 (不含溴化锂)中加热PASF时是否可以实现相似的稳定性。为此,以50mg/mL的浓度制备PASF (无额外的加热),然后在连接到加热器/冷却器(Neslab,RTE-7,ThermoScientific,MA)的夹套反应烧杯(Chemglass,CG-1103-01,NJ)中加热,用以主动循环硅油热交换液(AceGlass,14115-05,NJ)。循环器设定在~200°F,该温度刚好低于不含溴化锂盐的PASF的沸点,让其稳定15±1分钟。PASF(25 mL)在带有PTFE涂覆的搅拌棒的反应烧杯中进行培养,并置于搅拌板(IKA C-MAG HS7,NC)上以确保溶液温度均匀。使用外部热电偶(Omega HH-603,Omega Engineering,CT)在整个加热期间主动监测PASF温度,并在以下时间点取出样品(3mL):
温度 | 时间点 |
68°F | 0min |
196±1°F | 30min |
196±1°F | 60min |
196±1°F | 90min |
196±1°F | 120min |
然后取出的样品被超声处理以引发beta折叠的形成和凝胶化,如先前Wang etal.(Biomaterials 2008,29(8):1054-1064)所描述的那样。为了将这些结果与在溴化锂存在下加热的PASF进行比较, SDP被分开进行超声波分析,并纵向监测550nm处的吸收度,以比较丝素不稳定性的动力学。如图 12所示,相对于未加热的对照样品,施加热量对PASF实际上增加了基线吸收率,以至于不稳定性。此外,PASF热暴露的持续时间(从30至120分钟)与基底吸收度成反比,表明需要有溴化锂存在于SDP的生产期间以达到在后者溶液中观察到的最小吸收度(图12)。此外,550nm处的吸收度在所有加热的PASF溶液中随时间继续升高,但是在超声处理的SDP溶液中基线没有改变,因此清楚地表明热处理的样品正在经历beta折叠的形成并因此变得不稳定。总之,这些结果表明,在不存在溴化锂的情况下,热介导的PASF水解不足以调节氨基酸转化而以本文所述SDP相同程度促进蛋白质的稳定性。
本发明的实施方式包括如下列举的实施方式。
1、一种丝素衍生的蛋白质组合物,其具有在水溶液中增强的稳定性,其中:所述丝素衍生的蛋白质组合物的初级氨基酸序列在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的组合氨基酸含量方面与天然丝素具有至少4%的差别;丝素的丝素重蛋白链和丝素轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫桥被还原或去除;所述组合物具有与天然丝素蛋白质相比降低25%以上的丝氨酸含量;以及其中所述丝素衍生的蛋白质组合物的平均分子量为小于约100k并且可选择地大于25kDa。
2、根据实施方式1所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物在水中的10%w/w溶液具有低于4cP的水相粘度。
3、根据实施方式1或2所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物在水中的24%w/w溶液具有低于10cP的水相粘度。
4、根据实施方式1-3任一项所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物能够在40%w/w溶解于水而不发生沉淀。
5、根据实施方式1-4任一项所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物,当其高至10%w/w 浓度的水溶液在超声处理后不会发生凝胶。
6、根据实施方式1-5任一项所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物包括少于8%的丝氨酸氨基酸残基。
7、根据实施方式1-6任一项所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物包括少于6%的丝氨酸氨基酸残基。
8、根据实施方式1-7任一项所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物包括多于46.5%的甘氨酸。
9、根据实施方式1-8任一项所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物包括多于48%的甘氨酸。
10、根据实施方式1-9任一项所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物包括多于30%的丙氨酸。
11、根据实施方式1-10所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物包括多于31.5%的丙氨酸。
12、根据实施方式1-11任一项所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物在被干燥成为膜片之后能够完全地重新溶解于水。
13、根据实施方式1-12任一项所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物在水溶液中没有 beta-折叠蛋白质结构。
14、根据实施方式1-13任一项所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物在至少5秒钟超声处理后保持在水溶液中550nm处的吸收度低于0.25。
15、根据实施方式1-14任一项所述的蛋白质组合物并与水结合,其中所述蛋白质组合物能够在 40%w/w完全溶解于水。
16、根据实施方式1-15任一项所述的丝素衍生的蛋白质组合物,其中所述丝素衍生的蛋白质组合物的初级氨基酸序列在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量的组合差别方面与天然丝素具有至少6%的差别;所述丝素衍生的蛋白质组合物的平均分子量为小于约100kDa且大于约25kDa;以及所述丝素衍生的蛋白质组合物在5秒钟超声处理后至少两个小时保持550nm处的吸收度低于0.25。
17、一种丝素衍生的蛋白质组合物,其具有在水溶液中增强的稳定性,其中:所述丝素衍生的蛋白质组合物的初级氨基酸序列是修饰自天然丝素;丝素重蛋白链和丝素轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫桥被还原或去除;所述丝素衍生的蛋白质的平均分子量为小于约100kDa且大于约25kDa;以及所述丝素衍生的蛋白质组合物在5秒钟超声处理后至少两个小时保持550nm处的吸收度低于0.25。
17A、根据实施方式17所述的丝素衍生的蛋白质组合物,其包括实施方式1-15任一项所述的一种或多种元要素。
18、根据实施方式17或17A所述的丝素衍生的蛋白质组合物,其中所述丝素衍生的蛋白质组合物的初级氨基酸序列是修饰自天然丝素,从而所述初级氨基酸序列在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的组合差别方面与天然丝素具有至少5%的差别;所述丝素衍生的蛋白质组合物的平均分子量为小于约 70kDa;以及所述丝素衍生的蛋白质组合物在5秒钟超声处理后至少两个小时保持550nm处的吸收度低于0.2。
19、一种经由包括在加压下加热含水丝素溶液的过程所制备的蛋白质组合物,其中所述含水丝素溶液包括浓度至少为8M的溴化锂;以及其中所述含水丝素溶液在至少约10PSI的压力下被加热到至少约105℃(即221°F)达至少约20分钟;用以提供所述蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物包括少于8.5%的丝氨酸氨基酸残基,并且所述蛋白质组合物在水中的10%w/w溶液具有低于5cP 的水相粘度。
19A、根据实施方式19所述的蛋白质组合物,其包括实施方式1-15任一项所述的一种或多种要素。
20、一种食物或饮料组合物,其包含实施方式1-19任一项所述的蛋白质组合物以及食物或饮料成分。
文中描述了上述的一些实施方式和实施例,但这些描述都只是示意和说明性的,对本发明的范围不产生限制作用。根据本领域的普通技术可能进行一些改变和修饰,然而并不脱离本发明由下列权利要求所定义的较为宽泛的范围。
所有的出版物、授权专利和专利申请文献均通过参考纳入文本,就如各自单独通过参考纳入本文那样。由这些公开物,应当不会引入与本文公开内容不一致的限制。本发明的描述引述了各种特定和优选的实施方式和技术方案。应当理解,还有许多变化和修饰可被采纳,仍然都应属于本发明的精神和范围。
Claims (20)
1.一种丝素衍生的蛋白质组合物,其具有在水溶液中增强的稳定性,其中:
所述丝素衍生的蛋白质组合物的初级氨基酸序列在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的组合氨基酸含量方面与天然丝素相比具有至少4%的差别;
丝素的丝素重蛋白链和丝素轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫桥被还原或去除;
所述组合物具有与天然丝素蛋白质相比降低25%以上的丝氨酸含量;以及
其中所述丝素衍生的蛋白质组合物的平均分子量为小于约100kDa。
2.根据权利要求1所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物在水中的10%w/w溶液具有低于4cP的水相粘度。
3.根据权利要求1所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物在水中的24%w/w溶液具有低于10cP的水相粘度。
4.根据权利要求1所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物能够在40%w/w溶解于水而不发生沉淀。
5.根据权利要求1所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物,当其高至10%w/w浓度的水溶液在超声处理后不会发生凝胶化。
6.根据权利要求1-5任一项所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物包括少于8%的丝氨酸氨基酸残基。
7.根据权利要求6所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物包括少于6%的丝氨酸氨基酸残基。
8.根据权利要求1-5任一项所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物包括多于46.5%的甘氨酸。
9.根据权利要求8所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物包括多于48%的甘氨酸。
10.根据权利要求1-5任一项所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物包括多于30%的丙氨酸。
11.根据权利要求10所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物包括多于31.5%的丙氨酸。
12.根据权利要求1-5任一项所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物在被干燥成为薄膜之后能够完全地重新溶解于水。
13.根据权利要求1-5任一项所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物在水溶液中没有beta-折叠蛋白质结构。
14.根据权利要求1-5任一项所述的蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物在至少5秒钟超声处理后保持在水溶液中550nm处的吸收度低于0.25。
15.根据权利要求1-5任一项所述的蛋白质组合物并与水结合,其中所述蛋白质组合物能够在40%w/w完全溶解于水。
16.根据权利要求1-5任一项所述的丝素衍生的蛋白质组合物,其中所述丝素衍生的蛋白质组合物的初级氨基酸序列在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量的组合差别方面与天然丝素相比具有至少6%的差别;所述丝素衍生的蛋白质组合物的平均分子量为小于约100kDa且大于约30kDa;以及所述丝素衍生的蛋白质组合物在5秒钟超声处理后至少两个小时保持550nm处的吸收度低于0.25。
17.一种丝素衍生的蛋白质组合物,其具有在水溶液中增强的稳定性,其中:
所述丝素衍生的蛋白质组合物的初级氨基酸序列是修饰自天然丝素;
丝素重蛋白链和丝素轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫桥被还原或去除;
所述丝素衍生的蛋白质的平均分子量为小于约100kDa且大于约25kDa;以及
所述丝素衍生的蛋白质组合物在5秒钟超声处理后至少两个小时保持550nm处的吸收度低于0.25。
18.根据权利要求17所述的丝素衍生的蛋白质组合物,其中所述丝素衍生的蛋白质组合物的初级氨基酸序列是修饰自天然丝素,从而所述初级氨基酸序列在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的组合氨基酸含量方面与天然丝素相比具有至少5%的差别;所述丝素衍生的蛋白质组合物的平均分子量为小于约70kDa;以及所述丝素衍生的蛋白质组合物在5秒钟超声处理后至少两个小时保持550nm处的吸收度低于0.2。
19.一种经由包括在加压下加热含水丝素溶液的过程所制备的蛋白质组合物,
其中所述含水丝素溶液包括浓度至少为8M的溴化锂;以及
其中所述含水丝素溶液在至少约10PSI的压力下被加热到至少约105℃(即221°F)达至少约20分钟;
用以提供所述蛋白质组合物,其中所述蛋白质组合物包括少于8.5%的丝氨酸氨基酸残基,并且所述蛋白质组合物在水中的10%w/w溶液具有低于5cP的水相粘度。
20.一种食物或饮料组合物,其包含权利要求1、17或19任一项所述的蛋白质组合物以及食物或饮料成分。
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