CN1037214A - 波长分散电泳仪 - Google Patents

Abstract

波长分散电泳仪用于测定标有多种荧光电泳的 脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及其类似物 试样发射出的不同波长的荧光。为了分离和分辩各 种荧光电泳的发射波长，仪器中装有一个直视棱镜 (14)，该镜置于一平面荧光检测器(7)和一电泳盘 (17)之间，直视棱镜(14)分离荧光波长的方法是：采 用一简单的装置将不同波长的荧光分离开作测定，灵 敏度高且不会破坏荧光图象。

Description

本发明涉及一种电泳仪，用于分别测定脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）及其类型物，更确切地说，它是一种波长分散电泳仪，特别适用于测定由不同波长的多种荧光电泳所标记的试样发出的荧光。

以往DNA碱基序例的测定方法是这样的：用放射自显影术将分离的结构转拍成照片，然而用这种方法处理放射性元素很麻烦，而且废刀废时。为此，就考虑了这样工作的系统：在电泳分离期间通过DNA通过荧光标记实时地测定DNA断片（L.M.史密斯等，自然，第321卷，674-679页（1986年））。用这种方法，当特定的DNA的一端固定时，在另一端或中间做上荧光标记，以便分出四种DNA断片组，每一种DNA断片的另一端的核酸碱基分别为腺膘（A），胞嘧啶（C），胸腺嘧啶（T）或（G）。这时，用发射不同波长的荧光电泳来标记各个碱基试样，然后将四种断断片组放在一起由凝胶电泳分离。电泳在较短的DNA断片上移动速度更快些，因此当某一试样进入一固定距离的某一处被激光照射后，DNA断片便从照射过的地方通过，其中最短的断片会成功地发出荧光。由于不同碱基试样发射波长不同，所以可用波长来测定不同的碱基试样。而断片的长度则可用移动的时长来测定。

为辩别四种不同波长的荧光。L.M.史密斯等转换四种发射不同波长的滤光器。此外，美国应用生物系统股份公司出售一种仪器，仪器上有一浅盘式凝胶可供测量多种试样。此仪器内有一激光束照射着凝胶平面的一个点。荧光从这里发射穿过一旋转滤光器，荧光由光敏部位测定，测定大量试样时，用激光交替照射不同部位，直线扫描凝胶并检测光敏部位，用这种方法取得各项信息。

以前的工艺是采用旋转滤光器，没有考虑增强被测定部位接收荧光的量，更确切地说，在测定水平方向（与电泳垂直的方向）10Cm之内的电泳盘表面区域时，激光照射每个点的周期为一个扫描周期（通常为1秒钟左右）的 1/200 假设激光束的宽度为0.5mm，另外由于四个滤光旋转与四个碱基样本相对应，测定每个碱基试样的周期则仅是每个点周间的四分之一。最终，测定一个碱基试样某一点所用的时间仅为一个整测定时间的 1/800 ，因此由于吸收的荧光量很小，所以灵敏度不高。

本发明的目标是要提供一个高灵敏度的波长分散电泳仪。该仪器采用没有旋转滤光器的简单装置，在整个检测周期内接受各种波长的荧光。

为达到上述目标，本发明的波长分散电泳仪的构造是这样的;一个测量区（即一个复盖了水平方向上一段固定长度的区域，此固定长度是予先确定的，自电泳盘上的电泳起点起始）同时被一光束照射，发射的荧光由一直视棱镜（即一复合棱镜，它由一组不同材料做成的棱镜组合而成，该镜使D线的偏斜几乎为零，并将其两面的其他线分散开）产生波长散射，而后透镜系统使波长的散射聚焦在一图象增强器上，平面探测器检测聚焦的图象。

也就是说，本发明的波长分散电泳仪达到其目标的方法是这样的：通过在聚焦透镜前配置一直视棱镜来聚焦荧光（在聚焦透镜和电泳盘之间）使其能进行波长分散并同时将分散的荧光聚焦。

更具体的说，该电泳仪有用电泳分离一试样组的装置，该试样组是由标有至少二种荧光电泳标记的试验组成。激发装置用以激发已标定试样的荧光电泳，使试样发射荧光，探测装置用于探测发射出的荧光;本发明的波长分散电泳仪含有一直视棱镜。它能分散各种波长的荧光，并将其配置在上面所说的探测器前。

更详细地说，本发明的波长分散电泳仪的典型结构如下：ⅰ）由平行配置的多个移动通道所构成的电泳分离装置;ⅱ）所说的激发装置是指形成激发光的装置，激发光与所有移动通道相交，并垂直射入移动通道;ⅲ）由平面检测器构成所述的检测装置;Ⅵ）直视棱镜和探测装置的安排可以使荧光图象按垂直方向（移动方向）进行波长分散。

通常，把激光束作为激发光，一般情况下，激光束可看作一平行光束，在测量区域内的那段光束基本上是圆环状，其直径为0.3mm或小于0.3mm。

多种荧光标记物之间的波长差异及直视棱镜角度分散之间的差异都得到完善的处理，以致使图象增强器上基于不同电泳的荧光图象之间的间隔在0.1mm以上，原因是在当今具有图象增强器的荧光探测器上，其荧光图象的位置分辩力是0.03～0.05mm。

另外，直视棱镜前通常配置一切割激发激光束的滤光器（位于直视棱镜与电泳盘之间）。

相应地，这些装置的排列顺序为：移动通道，滤光器，直视棱镜，聚光透镜，图象增强器和平面探测器。

移动通道是凝胶做成的，如众所周知的聚丙烯酰胺凝胶。通常使用的电泳盘具有多条移动通道。一般，电泳盘的结构是：凝胶被夹在面荧平盘的支架之间。

通常平面探测器的输出信号经一检测电路传到监视器，也可经过检测电路和计算机传送到输出装置，如绘图仪，阴极射线管，这一输出信号是经过处理和分析的。

众所周知，图象增强器可将光学图象聚焦在其感光荧光屏上，然后转换成光电子，这些光电子又被放大为次电子被投射到荧光屏上，从而可看到清晰的密度图象。该设备是一种光信号放大器。

上面所描述的本发明的波长分散电泳仪避免了以前那种使用旋转滤光器的缺陷。而且本发明的电泳仪使用的是直视棱镜，它不同于传统的信号棱镜，它由多种棱镜组成。发射的光路并不完全不同于入射的光路，仅基于波长导致分散。因此，利用透镜系统并以波长分散的形式，无失直的荧光图象能在图象增强仪或高灵敏度的平面探测器上聚焦。

假设，荧光图象在水平方向上出现，荧光图象在垂直方向上产生波长分散，则各种波长是由其在垂直方向上的不同部位来区分的，而所照射的不同部位是由水平方向的坐标来区分的。垂直方向的散射表示带有不同荧光标记的基本物质，而水平方向的位置则反映了加载位置的不同并表示了试样的差异性。

本发明很好的利用了已知的荧光检测型的电泳仪技术，只是更新了区分荧光波长的测量方法，尤其是采用了直视棱镜和激发激光束的（不同）进入方向。

图1是一原理图，展示了一台波长分散电泳仪的结构，是该发明的具体装置。

图2A是一个解释性的图解，示出了一个DNA碱基序列的例子。

图2B是一个解释性的图解，说明了确定DNA碱基序列的原理。

图3是一个截面图，展示了用于该发明的波长分散电泳仪具体装置的直视棱镜。

现对本发明的具体装置作一图解说明。

图1显示了整个仪器的结构，图2A、2B说明了碱基序列判决的原理，图3是复合棱镜的工作原理。

要测定其序列的DNA16的一端（见图2A）用荧光电泳F₁作标记，另一端（〔A〕组）备有一组断片，每一段片为腺膘呤碱基（A），同时备有类似的其他几组碱基断片;胞嘧啶（C），乌嘌呤，（G）和胸腺嘧啶（T），然后对不同的断片组变换使用标定的荧光电泳即对C、G和T分别改用F₂、F₃和F₄。最后将〔A〕、〔C〕、〔G〕和〔T〕碱基断片组放在一起并将试样放到电泳凝胶上的试样槽18内，以便进行电泳，一个试样用一条移动通道（31）在这装置中，电泳盘17可容纳多条移动通道31，这样便可同时测定大量的试样，如图2B所示，较短的DNA断片移动得快些。因此，用光照射一段距离的某一点（在这一装置中为20～30cm），这段距离是事先确定并从电泳的起始点开始的，然后在观察通过这一点的DNA断片发射出的各种荧光时，便可从经历的时间周期来测定碱基的长度，通过荧光的波长可确定在另一端的碱基种类。

电泳凝胶含有3-8重量百分比的聚丙烯酰凝胶，其厚度为0.2mm，宽度为20cm，长度为30cm，电泳凝胶夹在石英平盘中间。虽然图2B中DNA带15只出现在移动通道31的左边，但实际上DNA带可出现在移动通道31的各个通道上。

至于激发光，以所使用的激光束13（图1）为例，激光器2发射出激光束13，经镜子3适当地反射，反射光水平地进入凝胶盘1的一面，且基本与盘子的表面平行。测定区域是电泳盘上水平方向的10cm范围。

从凝胶发射出去的荧光图象以及包含多条移动通道的激发光在直线部位上所发射出的电泳都通过滤光器4以供切割激发光直视棱镜14迫使激发光波长分散，分散的图象通过聚焦镜5在图象增强器6上聚焦，形成所发射的区域图象。平面检测器7接收了分散的和增强后的图象。检测器的水平位置表示了发射区的座标，而垂直方向则与波长的分散相对应，因此，从一组DNA断片发出的荧光信号在检测器上接收到的是一条或几条水平线，波长分散的荧光信号在检测器上获得至少4条的水平线，检测电路9采集了这些信号，信号检测的状态可在监控器8上观察到，另外，检测电路9产生的信号可由存储器10，计算机11和输出设备12进行处理和分析。

这里进一步给出一个例子，波长为488nm的激光束作为激发光，同时FITC（异硫氰酸荧光素的发射波长为515nm）和它的同质异能素（发射波长为535nm，555nm，575nm）作为荧光电泳，正如图3所说明的，棱镜的折射组合系数为n₂和n₃不同波长的折射角所产生的散射角

可由下列公式

这里uout表示偏差角，λ为波长，α₂分别为第一块棱镜20和第三块棱镜22的顶角，n₂为第一和第三块棱镜的平均折射系数（“平均折射系数”指的是四种荧光波长取平均值后的折射系数）。

η₁为空气的折射系数，η₃为第二块棱镜21的平均折射系数。进一步说， 为第一块棱镜20和第三块棱镜22的光学成分玻璃的ηd值（D线折射系数为587.6nm）ηd₃为第二块棱镜21的光学成分玻璃的ηd值，νd₂为第一和第三块棱镜的光学成分玻璃的νd值（D线折射系数的散射），νd₃′为第二块棱镜的光学成分玻璃的νd值，λF、λC和λd（下线、C线、D线的波长分别为486.1nm，656.3nm和587.6nm，另外，折射系数n₁取值为1。

当顶角α₂取值为15°，“SFS1”和“FK5”分别取值于第一块棱镜和第二块棱镜的材质，得出折射系数η₂为1.92，折射系数η₃为1.4第二块棱镜21的顶角α₃为：

另外，νd₂＝21，ηd₂＝1.92，νd₃＝70，ηd₃＝1.4进而，可算出下式：

这里，假设波长之间的差值△λ＝20nm，透镜和透镜图象之间的距离L＝60mm，进而在图象增强器上散射△l为：

l＝0.095·△λ·L

＝0.11（mm）

即0.11mm的散射加在图象增强器上。另举一个要求更大散射的例子，设α₂＝30°，L＝100mm得出更大的散射为0.36mm，这里不同的波长可令人满意地分辩出来。顺提一下，图象增强器上的位移分辩力为0.03mm

图3中的数19表示一入射光束，数19′，19″，19″表示输出光束，输出光束分别具有D线波长、比D线长的波长以及比D线短的波长。

根据本发明的波长分散电泳仪，不需要更大地改变光路就能完成波长的分散，因此可以通过没有失真的波长分散来测定荧光图象，这一发明体系不同先前的技术手段，不需要用不同的旋转滤光器来分别接收不同的波长。在整个测量周期内，使用一个简单的装置就能接收到足够饬渴褂玫母髦植煌ǔさ挠猓虼嘶竦昧朔浅８叩牧槊舳取?

Claims (5)

1、电泳仪是用电泳方法分离试样组的装置，试样组由标以至少二种荧光电泳的试样组成，激发装置用于激发已标定的试样的荧光电泳使试样发射荧光，检测装置用于检测发射出的荧光。而波长分散电泳仪的特殊是一个复合棱镜(14)，该镜是由多种用不同材料做成的一组棱镜组成，它将不同波长的荧光分散，并将荧光投射在所说的检测装置前面。

2、权利要求1中所说的波长分散电泳仪中的电泳分散装置实际是由乡条并行配置的移动通道（31）组成，所说的激发装置是由激发光（13）组成，激发光与所有的移动通道（31）相交，并垂直射入移动通道（31），检测装置是一种平面检测器（7），复合棱镜（14）和检测装置的安排应使是波长分散发生在与荧光图家垂直的方向上。

3、权利要求2中所说的波长分散电泳仪的复合镜前配置一滤光器（4），用于切割。

4、波长分散电泳仪的组成ⅰ，一个电泳盘（17），它包括多条移动通道（31），对标有至少两种荧光电泳的试样组成的一组试样进行电泳;ⅱ一个滤光器（4）用于切割激发光;ⅲ，一个复合棱镜（14），它是由不同材料做成的多个棱镜组成;Ⅳ）一个聚焦透镜（5）;Ⅴ，一个图象增强器（6）;Ⅵ，一个平面荧光检测器（7），上述部件按ⅰ，-Ⅵ，的顺序排列放置。另有一个激发光装置，导致激光束（13）射入以便与所有的移动通道（31）垂直相交。

5、权利要求4中的波长分散电泳仪中的激光束（13）是一种平行光束，其截面为环形，在电泳盘（17）的测量区域内，其直径不超过3mm。

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