CN1032458A - 金属溶胶捕获免疫测定法、该方法所用的药盒和捕获的含金属复合物 - Google Patents
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Abstract
分散于含水体系中的抗体包被的金溶胶颗粒和
抗体包被的固相颗粒,作为待分析样品中分析物存在
的函数而发生免疫反应,从而产生可收集的、含金固
相复合物。通过离心或沉淀作用在滤器上或试管底
部收集复合物,通过直接目测所收集的固相复合物来
测定或检测样品中的分析物,固相复合物中由于含金
而呈粉色或红色或紫色。进行测试所需的材料包括
包被的金颗粒、包被的固相颗粒和一个收集装置如滤
器。所收集的含金属固相复合物可通过直接目测来
测定或检测其中的金,从而检测样品中的分析物。
Description
本发明涉及测定及检测具有免疫活性的分析物如含水样品中的配基或配基受体的方法。更具体地说,本发明涉及特异结合对的应用,这种结合对由具有免疫活性的配基和具有特异免疫活性的可与配基结合的抗配基或配基受体组成。本发明还涉及实施本发明方法所用的药盒及根据本发明产生的可进行目测或检测的、收集得到的含金属的固相复合物。
长期以来,人们一直需要一个高度灵敏和特异的方法对物质进行测定。特别是在这样一些领域如临床医学、法医学、环境质量测试、食品品质检验、药物测试及其它有关领域,测试样品中微量物质的存在和/或含量常常是很重要的。在这样一些领域中,ppm数量级或更小数量级的极低浓度的测定有时是必不可少的。此外,这些测试或测定常需对特定的分子进行鉴定,而不受其它结构尽管相似但仍然不同的分子的影响。
过去已致力于过解决对灵敏而特异的测试方法的需求,从而发展了一些基于抗原和针对此抗原的抗体间的高度特异而灵敏的相互作用的免疫检测法。抗原和抗体最初是作为动物免疫过程的参与者而发现的,即向一动物注射外源物质(即抗原或抗体产生剂)时,动物随即发生反应产生抗体,抗体是一些蛋白质分子,它们能识别侵入的抗原并与之紧密结合,由此加速抗原的除去或破坏。免疫过程是高度特异的,利用免疫检测法鉴定特殊物质已获得了很大的成功。这些方法又被Milstein和Kohler的重大发现(Nature 256:495-497,1975)进一步促进,这一重大发现就是制备所谓单克隆抗体的方法。该工作的详情已为人所熟知,这里不必重复;然而,Milstein和Kohler工作的结果已促进了高度灵敏而特异的试剂的发展。
在已知的称为放射免疫测定法的先有分析方法中,抗原或抗体用放射性同位素如I125标记。根据这些已知方法,可以测定免疫复合物中的放射性同位素含量,此含量是测试溶液中分析物的存在及含量的函数。众所周知,放射免疫测定可通过各种途径进行,例如利用竞争性或免疫夹层法,这里仅举几个例子。RIA方法已用来检测大分析物如大分子,也用来检测小得多的物质包括小分子如茶碱。由于RIA法能够达到高度的灵敏度和特异性,因此目前已能用RIA法检测所有具有抗原性的物质及通过与合适载体的偶联而能使其被赋予抗原性的物质,这种方法已广泛被人们接受,特别是在临床诊断实验室。
另一方面,RIA法的确有一些缺点,使其在某些环境下对某些类型的测试不适用。即RIA法需要利用复杂仪器如γ或闪烁计数器进行放射性同位素检测。而且,放射性同位素本来就不稳定,保存期有限。此外,放射性同位素很危险,其使用仅限于经过专门训练的技术人员和配备危险废物处理装置和设备的实验室。
通过采用非放射性标记或标志已克服了RIA法的固有缺点,例如采用产生颜色的酶、荧光物质、化学发光标志等。如果用酶作标记,测定方法就叫做酶免疫测定法(EIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA),其中利用了固相免疫吸附剂。常用作标记的这类酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶及脲酶。这些酶与特异的底物反应产生可检测的信号,通常是产生颜色,这个信号可用稍微简单一些的仪器如比色计定量测定,而不需用RIA法中的复杂仪器。而且,和放射性同位素比较,使用酶基本上无害或完全无害。
大多数用于EIA或ELISA法的酶系统比较稳定,在冷冻条件下常能贮存一年左右。所以,使用酶标记的测定法如今已广泛应用于各种实验室,某些情况下还用于诊室甚至用户家中。其它方法如荧光和化学发光测定法也同样克服了RIA的不稳定性和危险性。但是,这些方法一般需要复杂仪器,所以其应用仅限于装备良好的实验室。美国专利第4,233,402中公开了一些可用于免疫测定法的酶、荧光和化学发光标记物。
总的来说,酶标记免疫测定法已用来满足在遥远场所进行高度灵敏而特异的免疫测定的需要。上述需要进行这种测试的遥远场所包括诊室和用户的家中。在诊室里,它通常可用于进行快速简单的测定,这样医生在病人还未离去时就可完成诊断,使病人看一次病就可得到及时治疗。如果没有这种舛ǎ缴捅匦朐诓∪说谝淮慰床∈笔占罚缓笏偷矫耪锸笛槭医蟹治觯浣峁谝欢问奔浜笤儆墒笛槭冶ǜ娓缴M保∪吮凰突丶抑校匦朐倮匆淮我员愕玫绞实钡闹瘟坪?或药物。这种延迟效率低而且有害,某些情况下甚至可能危及生命。
家庭测试是很方便的,这样可促使消费者在其私宅中进行测试。测试结果可以指示消费者是否需要去看病。可在家中进行测试的例子有对妊娠、排卵、链球菌感染的测试,及测试其它能从尿、唾液或其它适当的测试样品中检测到的感染。
假定能达到足够的灵敏度和特异性,对遥远场所的测试来说,在实际测定中至少还有三个要求。这三个必要因素中的第一个是速度,即测定必须在一个可接受的短时期内进行,越短越好。稳定性也是一个必要的因素,即测定组份必须在没有冰冻或特殊处理的情况下,在较长时间内保持稳定,分析结果或仪器显示的读数必须足够稳定,以便在进行最初测试的甚至几天后仍能证实所作的结论。最后,从商业的角度讲,测试必须尽可能简单,仅需要极少的仪器或不需要仪器,并杜绝错误及不良操作导致的不正确的结论。
目前,商业上已有用于测定排卵和妊娠的采用标记酶的免疫测定药盒。这些药盒中一般包括的技术组份为(1)一个携有固定抗体的固相,(2)一个酶标抗体,(3)一冲洗溶液(在某些情况下可能是用户的自来水),(4)一个酶底物。典型的方法是使样品与固相混合并保温(随后的冲洗步骤可有可无),然后弃去样品。然后使固相和酶标抗体接触并保温,随后冲洗固相并使之与底物接触。一段时间后(大约5分钟),便可观察到固相的颜色。美国专利第4,632,901号中描述了这样一种测定方法。
酶标免疫测定也不是没有缺点的,这些缺点是由某些酶系统的不稳定性、药盒组份的数目及方法的复杂性而产生的。因此,人们正在继续努力对免疫测定法进行简化,提高其速度及使其组份和产物保持稳定性,特别是在努力改进在遥远场所进行的方法。这项工作的一个成果便是认识到金属溶胶颗粒能在免疫测定法中作为标记物。美国专利4,313,734中公开了这种方法。在这项公开的专利中,使蛋白包裹的金属溶胶颗粒与蛋白包裹的固相反应,从而引起光学性质的变化,在液相中进行比色测定。免疫反应导致分散的物质凝集或团聚,引起液相的光吸收和反射特征的变化。这种变化可用仪器如分光光度计测定。在某些情况下,液相中的颜色变化甚至可通过样品颜色与对照液颜色的对比进行目测估计,甚至可通过观察液体颜色的精细变化,如颜色从红到紫到无色而进行估计。在凝集测试中,反应过程与时间有关,目测必须在一个特定的时间点进行。而且,实验结果通常缺乏稳定性,因为甚至在目测估计之后,反应仍在进行。
由免疫活性试剂的反应导致并用金作为标记的凝集反应,还被Horisberger和Rosset用来检测甘露聚糖,他们在题为“Colloidal Gold,A Useful Marker For Transmission And Scanning Electron Microscopy”(J.Histochem.Cytochem.25,1977,pp.295-305)的文章中描述了这项工作。这项工作采用了凝集法,在免疫反应后用分光光度计读出液体的光吸收。这项工作为′734号专利中描述的工作揭开了序幕。
美国专利第4,115,533号中描述了另一种利用蛋白包裹颗粒的先有方法。′535号专利描述的方法涉及免疫方法,它使包有相同蛋白的两种不同的颗粒凝集。其中一种颗粒有磁性,以便可用一块磁铁将凝集物质从液体中分离出来。所述的另一种颗粒由具有荧光和/或色彩清晰的聚合物小颗粒组成。每一种颗粒的大小指定为1微米或更小。尽管此专利用金属颗粒做为磁性颗粒,但却未提及利用金属颗粒提供比色结果。美国专利第4,486,530号中公开的方法也包括凝集作用。
在已出版的Abstracts of the Annual Meeting-1986 of the International Congress of Immunology.第363页(Abstract C-213)中公开了一个有趣的先有技术方法。该方法包括利用硝酸纤维素膜上的固定化抗体。抗体被用来在样品用膜进行免疫过滤的过程中捕获抗原。然后,膜用胶态金结合的抗体染色。据说红点是表明阳性反应。该方法和上述的酶免疫测定法有同样的缺点,即需要两个倾倒步骤,需要预先制备并使用一种结合有特异抗体的膜。
本发明克服了上述的先有技术方法的缺点。也就是说,本发明提供了一个简化的、灵敏而特异的利用稳定组份并提供稳定测试结果的方法。根据本发明,提供了一种测定和检测水溶液样品中免疫活性分析物的方法。该方法包括提供一个标记组份,该组份包括免疫活性物质和含有金属的颗粒的偶联产物,所述颗粒的大小和特征有利于维持标记组份的单分散悬浮液的一般稳定性。还提供了一个固相组份,它包括免疫活性物质和固相颗粒的偶联产物,所述颗粒的大小和特征有利于维持固相组份悬浮液的一般稳定性。使固相组份和标记组份混合在一起,并和待分析样品接触以形成一个含有各组份和待分析样品的单一的混合含水悬浮液。偶联到颗粒上的免疫活性物质能作为分析物存在的函数直接或间接地结合,形成一个分散的、可收集的、含金属的固相复合物。该方法还包括一个最终步骤,即收集复合物,通过直接目测估计所收集的固相复合物中金属的存在来测定或检测样品中的分析物。
该方法一般可用于测定和检测有免疫活性的分析物,特别是配基或抗配基,后者有时叫做配基受体。本发明更独特的方面在于,含金属的颗粒最好是大小在约50埃到1000埃范围内的金属溶胶颗粒,在约135到约500埃的范围内更好。本发明的特别优选方案是采用金溶胶颗粒。
用于本发明方法的标记组份可通过将免疫活性物质直接偶联到颗粒上来制备。此外,标记组份的制备可利用生物素/抗生物素蛋白连接将免疫活性物质偶联到颗粒上。在后一种方法中,免疫活性物质可以是生物素化的,含金属颗粒则以抗生物素蛋白化合物包裹。这样,免疫活性物质上的生物素可以和颗粒上的抗生物素蛋白化合物反应,将免疫活性物质和颗粒偶联在一起。在本发明的另一个方案中,标记组份的制备可利用牛血清清蛋白(BSA)将免疫活性物质和颗粒偶联。
根据本发明,固相组份的制备也可以将相应的物质直接偶联到固相颗粒上。还可利用BSA连接将该物质偶联到颗粒上。在另一种选择方案中,可利用明胶将该物质偶联到颗粒上而制备固相组份。
根据本发明的一种优选方案,这两种免疫活性物质都能结合分析物而形成夹层。在这里,每种物质都可以是能免疫结合抗原分析物的抗体。这两种抗体最好分别结合在抗原的不同位点。
在本发明的另一种优选方案中,免疫活性物质可互相结合,即其中一种物质可以是抗体,另一种物质可以是抗原。标记组份的免疫活性物质最好是抗体。在本发明的这种方案中,测定方法可依赖于竞争性抑制作用。
根据本发明的一个优选方面,收集步骤可包括在多孔过滤装置的表面捕获复合物。此装置允许滤液通过,但阻止复合物的通过。就本发明的这一方面而言,滤液可通过重力、离心力或毛细作用力通过过滤装置。在本发明的另一方面,收集步骤可包括使复合物受重力作用沉积到有限的空间而形成浓缩沉淀。在本发明的另一方面,收集步骤可包括使水悬浮液离心,使复合物进入有限的空间而将其压成致密的沉淀。
在另一个重要方面,本发明提供了一个用于测定和检测含水样品中免疫活性分析物的药盒。该药盒可包括,例如,一个标记组份,它包括免疫活性物质和含金属颗粒的偶联产物,所述颗粒的大小和特征有利于维持标记组份的单分散悬浮液的一般稳定性;一个固相组份,它包括免疫活性物质和固相颗粒的偶联产物,所述颗粒的大小和特征有利于维持固相组份悬浮液的一般稳定性,上述二组份可用于及共同用于形成它们二者混合的含水悬浮液,该悬浮液含有待分析的样品,上述标记组份和固相组份能够作为样品中分析物存在的函数直接或间接地结合,由此形成一个分散的、可收集的、含金属的固相复合物;一个用于复合物的收集并可直接目测的收集装置,以便估计固相复合物中的金属含量,从而检测或测定最初的样品中是否存在分析物。
在本发明的另一方面,提供了一种稳定的、含金属的固相复合物的收集物质,它能直接通过目测观察以表明含水样品中分析物的最初存在、不存在或存在量。该复合物包括一个标记组份,它是免疫活性物质和含金属颗粒的偶联产物,所述颗粒的大小和特征有利于直昙亲榉莸シ稚⑿∫旱囊话阄榷ㄐ?一个固相组份,它包括免疫活性物质和固相颗粒的偶联产物,所述颗粒的大小和特征有利于维持固相组份悬浮液的一般稳定性,上述物质通过直接或间接相互结合而形成上述复合物。在本发明的这一方面,通过多孔过滤装置或在试管底部收集物质。以这种形式收集的复合物颜色相对稳定,并可为了证实结果而在一段时间后再次得到。
根据本发明的概念和原则,大小在约50到约1000埃范围内的金属溶胶颗粒可包以抗体。M.Horisberger等已描述过这种金属颗粒,特别是表面包有抗体的金溶胶颗粒(Experimentia,31,pp.1147-1149,15 October,1975)。这种包有抗体或抗原的金颗粒有明显的颜色,或者是橙色、红色,或者是紫色,根据颗粒大小而定。
根据本发明,意外地发现在许多通常以酶为颜色形成物的免疫测定中,金标记的免疫反应物可直接代替酶标记的免疫反应物而无显著的灵敏度降低。这是一个最重要的发现,因为在下述条件下,金标抗体可直接以肉眼观察,而酶标抗体的检测则需外加酶的底物。因此,金属溶胶的测定,特别是金溶胶的测定,省去了一个步骤和一种试剂。此外,胶态金颗粒一般比大多数酶标抗体稳定得多。
根据本发明的方法,使包有免疫试剂的金颗粒和固体颗粒如胶乳、硅烷化玻璃、Sepharose、Reactogel或异硫氰酸盐活化的玻璃的悬浮液混合,这些固体颗粒也都包有免疫试剂。使这个混合的悬浮液与含有分析物的样品接触,该分析物可与结合在金溶胶相和悬浮固相中的免疫试剂的任意一个结合,或与二者相结合。这样,金颗粒便免疫特异地连到固相上(夹层方式),或者预期的连接受到阻碍(竞争性抑制方式)。下面将描述这个思想的各种具体方案。
在这里描述的每个具体方案和实例中,悬浮固相的收集或捕获可通过沉降、离心或在多孔捕获基质之上或之中截留。测定结果可通过对捕获固相的直接目测得到。如果采用金溶胶颗粒,则捕获的固相将呈明显的红色、粉色或基本无色,取决于分析物的存在与否,并假定在没有金溶胶颗粒时,固相本身是无色的。
根据本发明,所用的金属溶胶颗粒可通过已知方法制备。例如,G.Frens在一篇文章中公开了金溶胶颗粒的制备方法(Nature,241,20-22,1973)。此外,金属溶胶颗粒可以是金属或金属化合物或包有金属或金属化合物的聚合物核,如前面提到的′734号专利所述。就此而言,金属溶胶颗粒可以是铂、金、银或铜或任何一种有特征颜色的金属化合物。
固相颗粒可包括许多已知的可分散于水中的颗粒中的任何一种,例如美国专利3,088,875中公开的聚苯乙烯胶乳颗粒。这种固相物质仅由不溶于水的小颗粒悬浮液组成,这种颗粒可与蛋白质如本发明的免疫活性物质结合。美国专利第4,184,849;4,486,530;4,636,479中也公开了合适的固相颗粒。
可用于本发明的固相颗粒包括,例如,胶乳颗粒或其它载体物质的颗粒如硅石、琼脂糖、玻璃、聚丙烯酰胺类、聚甲基丙烯酸甲酯类、羧基胶乳或Sepharose。颗粒大小的变化最好在约0.2微米到约10微米。具体地说,可用于本发明的市售的固相颗粒包括0.99微米的羧基胶乳(Polysciences)、溴化氰活化的Sepharose珠(Sigma)、熔凝硅石颗粒(Ciba Corning,批号#6)、异硫氰酸盐玻璃(Sigma)、Reactogel 25DF(Pierce)和Polybead-羧酸酯的单分散微球体(Polysciences)。根据本发明,这些颗粒可包有一层免疫活性物质,该物质已用技术上已知的方法偶联到颗粒上而产生固相组份。
根据本发明,无论单克隆抗体还是多克隆抗体,都可用于检测或测定特异抗原。有用的单克隆抗体可根据前面引用的Milstein和Kohler的方法制备。本发明特别要求的单克隆抗体可利用Gefler、Margulies和Scharff报道的聚乙二醇(PEG)促进的杂交方法来制备(Somatic Cell Genetics,Vol.3,No.2,1977,pp.231-236)。适用于检测人绒毛膜促性腺激素(hCG)和人促黄体生成激素(hLH)的抗体可用稍加修改的Gefter等的方法来制备,它包括应用各种已知的免疫方法、抗原剂量及抗原施用方式中的任何一种,用hLH或hCG免疫A品系小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine)。这种方法诱导产生能够成功产生杂交瘤细胞系的抗原反应性的血清抗体。具体地说,杂交瘤通过Gefter等的聚乙二醇催化的细胞融合法制备,即使来自免疫小鼠的Sp6小鼠淋巴细胞与SP2/0-Ag14细胞(参见M.J.Shulman和G.Kohler,Nature,274:917-919,1978)融合。杂交瘤组织培养上清液可根据Klinman等的固相抗原结合免疫测定法来测定(Klinman,N.R.,Pickard,A.R.,Sigal,N.H.,Gearhart,P.J.,Metcalf,E.S.and Pierce,S.K.,Ann.Immunol.(Inst Pasteur),Vol 127C,pp 489-502,1976)。
利用常规方法进行测定和筛选后,鉴别到了生产具有足够结合效力和特异性的抗体的杂交瘤细胞系。为了方便起见,及为了鉴定利用这种杂交瘤细胞系产生的抗体,用2B2命名hCG特异性抗体、用LH26代表hLH特异性抗体,用HCG/KLH/2G9代表能与hLH和hCG二者发生特异反应的抗体。2B2抗体选择性地结合到hCG抗原分子上的一个独立的结合位点上,而HCG/KLH/2G9抗体选择性地结合到hCG分子上的另一个独立的结合位点上。同样,LH26和HCG/KLH/2G9抗体选择性地结合到hLH上的另一个不同的独立结合位点上。
可根据本发明检测和测定的目标配基和抗配基的目录太长,这里不能都包括。然而,可以说配基和抗原如IgE、hCG、hLH、孕二醇-3-葡糖苷酸(P3G)和在动物体液中发现的其他抗原和配基,及与细菌、寄生物、真菌或病毒如链球菌、衣原体或淋病有关的抗原都可用本发明的方法检测或测定。而且,利用本发明的方法还可检测或测定小分子治疗药物和控制物质,例如茶碱。
通过以下实例进一步说明本发明。
实例
实例Ⅰ 金溶胶的制备
(a)根据上述Frens(1973)的方法制备金溶胶颗粒。一般地,将0.2克氯金酸(HAuCl4)(AESAR,Seabrook,New Hampshire)溶于2升19兆欧的去离子蒸馏水中并在30分钟内煮沸。边搅拌边迅速加入48ml新配的1%柠檬酸三钠溶液。5分钟内便形成亮橙色的溶胶分散体。对所形成的物质进行光学扫描,发现最大吸收在520纳米(nm)处。所得颗粒的直径利用扫描电子显微镜观察进行测定,测得直径约为135埃(A)。
(b)用实例Ⅰ(a)的方法制备直径为500A的金溶胶颗粒,但加入15ml的柠檬酸三钠溶液,而不是48ml。
实例Ⅱ 金探针的制备
用蛋白包裹金溶胶颗粒的最适条件根据不同蛋白和不同批的金溶胶颗粒而不同。一般来说,这些条件必须根据经验确定。为了确定最适条件,将吸附于金溶胶颗粒的蛋白先在室温下对pH为8的2mM硼酸盐-10mM叠氮化物溶液进行彻底的透析。包裹之前,将透析过的制剂通过0.20微米(μm)的Millex GV滤器(Milipore,Bedford,Massachusetts)过滤。蛋白质浓度利用1.4的消光系数通过分光光度法测定。为了测定最适包裹金溶胶颗粒所需的蛋白质量,建立pH和蛋白质浓度变量的等温线。采用稍加修改的Goodman、Hodges、Trejdosiewicz和Livingston的方法(Journal of Microscopy,Vol.123,Pt.2,August,1981,pp.201-213),参见下文所述。用pH从2.3到11.0的十一个不同的一组缓冲液,测定了pH对金颗粒吸附蛋白质的影响。所用的缓冲液按照pH增加的次序依次为Tris、磷酸钠、碳酸钠、柠檬酸、硼酸、巴比妥、哌嗪、吗啉、乳酸、水杨酸钠、邻苯二甲酸。为了进行分光光度分析,将270微升(μl)金溶胶加入到30μl70mM等分的缓冲液中,其中含有10mM叠氮化物。搅拌这些溶液并在室温下保持15分钟。然后边搅拌边加入60μl50微克(μg)/ml的蛋白溶液。在室温下静置1小时后,加入60μl10%氯化钠溶液。在最大吸收(520nm)处测定未絮凝溶胶的光吸收。反应也可进行目测,因为溶胶的原初颜色为橙/红色,絮凝后的颜色变成兰/灰色。利用胶态金的这种特性,根据Goodman等的方法选择最适缓冲液。蛋白质浓度等温线可用同样的方法测定,所用浓度范围为1mg/ml到3.9mg/ml。这样,对蛋白质和每批金溶胶的每种结合,都可选出最适缓冲液和蛋白吸附浓度。在蛋白质浓度高于和低于最适包裹浓度时,利用探针制剂检测蛋白质过量吸附的影响。根据上述方法制备最适包裹的金溶胶颗粒,并用于下列实例中。
(a)如下述制备包有能特异地与人绒毛膜促性腺激素(hCG)或人倩铺迳杉に兀╤LH)反应的单克隆抗体(即上面鉴定为HCG/KLH/2G9的抗体)的金探针。根据实例Ⅰ(a),在4升烧杯中将200ml 70mM碳酸盐-10mM叠氮化物缓冲液和1800ml金溶胶分散制剂迅速混合。混合后的pH为9.9。边混合边加入400ml pH为8.0的150μg/ml抗体在2mM硼酸盐-10mM叠氮化物缓冲液中的溶液,反应15分钟。然后边混合边加入180ml已用5μm Acrodisc(Gelman,Ann Arbor)预过滤的5%聚乙二醇(PEG)20M(Sigma,St.Louis),使混合物在室温下反应15分钟。然后将探针等分到一系列220ml Nalgene聚碳酸酯纤维瓶中,放在Sorvall GSA转子中在4℃下以10,000rpm在Sorvall RC5B离心机中离心45分钟。弃去上清液,深红色沉淀用等体积X缓冲液再悬浮,X缓冲液pH为7.3,含有0.1%牛血清清蛋白(BSA)(Miles)、0.1g/l乙基汞硫代水杨酸钠(Marchem Research)、0.3g/l氯化钠和0.2g/l PEG 20M(Sigma)。重复离心步骤,所得沉淀用最小体积的X缓冲液再悬浮,用0.2μm的Millex GV装置(Millipore)过滤,然后再用X缓冲液将体积增加到50ml。然后将所制备的探针放在琥珀玻璃瓶中,在4℃下贮存备用。用去离子水以1∶20稀释的试样在525nm有最大吸收并呈橙/红色。
(b)孕二醇-3-葡糖苷酸探针如下述制备。将598.5ml实例Ⅰ(a)的金溶胶分散体和pH为8.5的66.5ml70mM硼酸盐-10mM叠氮化物缓冲液迅速混合。边混合边向缓冲的金溶胶混合物中加入133ml含有孕二醇抗体(浓度为75μg/ml)和pH为8.0的2mM硼酸盐-10mM叠氮化物缓冲液的溶液。使所得的混合物反应15分钟。然后离心该材料,并如上述实例Ⅱ(a)进行操作。
(c)制备另一个对hCG和hLH二者都适用的多用途探针时,首先用抗生蛋白链菌素(Sigma,St.Louis)包裹金溶胶颗粒。在这种情况下,将67.5ml实例Ⅰ(a)的金溶胶分散液和7.5ml pH8.3的碳酸盐缓冲液放入一烧杯中,迅速混合。迅速混合期间,加入15ml含浓度为75μg/ml的抗生蛋白链菌素的硼酸缓冲液。溶液在室温下混合15分钟,然后加入6.75ml经过滤的PEG20M。离心并洗涤之后,此探针也如上述实例Ⅱ(a)进行操作。
将HCG/KLH/2G9抗体(它和hCG和hLH二者都可发生特异性反应)生物素化以促进它对抗生蛋白链菌素金探针的附着。为此,将1mg生物素-e-氨基己酸N-羟基丁二酰亚胺酯(生物素 -X-NHS,Cal.Biochem.)溶于1ml DMSO(Aldridge)中。采用0.1M碳酸氢钠缓冲液制备含有浓度为1mg/ml抗体的溶液,使其pH值维持在8.2。将60、120、240μl的生物素-X-NHS溶液分别加到1ml抗体溶液的等分试样中,在室温下反应2.4小时。保温后,在室温下对pH为7.2的磷酸盐缓冲的盐水(PBS)一叠氮化物溶液透析16小时。然后使每个样品的400μl等分试样与156μl包有抗生物素蛋白的金探针反应。每个样品都在室温下反应15分钟,然后用12ml的X缓冲液稀释样品并在4℃下在Sorvall RC5B离心机中以10,000rpm离心30分钟。然后用0.2μ Millex GV滤器过滤样品并在4℃下贮存。
(d)制备茶碱探针时首先将110mg BSA和20mg TBA溶于3ml含有9份水和1份吡啶的混合物中,将茶碱丁酸(TBA-Cal.Biochem,581116)和牛血清清蛋白(BSA)结合在一起。将29mg N-乙基,N-二甲基氨基碳二亚胺盐酸盐加入该溶液。室温下保温过夜后,将混合物对PBS彻底透析,然后贮存在4ml PBS中。
将TBA-BSA结合物如下述包于胶态金上。将8ml根据前面实施例Ⅰ(a)制备的在0.001M Tris缓冲液中的金溶胶分散体加到1ml pH为7.0的0.07M Tris缓冲液中。将200μl所得的TBA-BSA结合物溶液用3ml PBS稀释,然后滴加到缓冲的胶态金溶液中,同时搅拌溶液。然后加入30ml PBS,混合液以27,000G离心20分钟。将沉淀物再悬浮,再同样离心洗涤6次。茶碱包裹的金溶胶最后再用约3ml含有0.1%BSA的PBS悬浮。
(e)利用实例Ⅱ(a)的方法,制备用能与hCG或hLH二者之一特异反应的单寺】固灏慕鹛秸耄煌υ谟谡饫锏慕鹑芙悍稚⑻甯菔道瘢╞)制备,抗体溶液的抗体浓度为300μg/ml。制得的500A金探针颗粒如实例Ⅱ(a)所述过滤、洗涤、处理及贮存。
实例Ⅲ 固相组份的制备
(a)将1.0ml0.99μ的羧基胶乳(Polysciences)和20ml0.15M NaCl溶液放在离心管中。将0.75ml浓度为100mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液加到离心管中,混合物搅拌20分钟。然后加入11ml0.15M NaCl溶液,该混合物以38,000G离心10分钟。弃去上清液,沉淀的胶乳颗粒用20ml0.15M NaCl溶液再悬浮。悬浮液如上述再离心,最后的沉淀用4ml 0.15M NaCl溶液再悬浮。将2ml该胶乳悬浮液、1.5ml 0.15M NaCl溶液和1.5ml含有浓度为1.678mg/ml hLH特异性抗体(上述称为LH26的抗体)的溶液在15ml塑料试管中混合。盖上试管,混合物在Labquake旋转器上于22℃下垂直搅拌保温16小时。然后加入1.0ml pH 7.5的1M赖氨酸溶液,混合物再搅拌30分钟。接着将抗体包被的胶乳用30ml0.15M NaCl溶液洗涤4次,重复上述沉淀过程。最后的沉淀用2ml含有1mg/ml BSA的0.15M NaCl溶液再悬浮。
(b)兔抗茶碱抗血清得自Kallested Laboratories,Chaska,Minnesota(目录号 334,批号X3531)。血清的γ球蛋白部分如下述得到:加入硫酸铵至终浓度为40%,离心,在PBS中再溶解并对PBS透析。0.2ml该制剂(蛋白浓度为23mg/ml)与0.5g溴化氰活化的Sepharose珠(Sigma Chemical Co.)反应,该Sepharose珠悬浮于2ml0.15M NaCl、0.059M NaHCO3溶液中。在室温下混合2小时后,加入2ml pH8.4的0.27M赖氨酸溶液终止反应。然后在烧结玻璃滤器上收集多克隆抗体包裹的Sepharose珠,用0.15M NaCl洗涤,贮存在等渗盐水中。
(c)溴化氰Sepharose/抗hCG抗体制剂制备如下。将1.0g溴化氰Sepharose 4B珠(Sigma)在烧结玻璃滤器上用200ml 0.0001M HCl洗涤。然后将洗过的Sepharose珠加到含有3ml PBS和9.0mg hCG特异性抗体(前面称为2B2)的试管中。盖上试管,混合物在室温下垂直旋转过夜。加入2ml pH8.1的含100mg赖氨酸的水溶液终止反应。手摇继续混合30分钟,然后悬浮液通过一烧结玻璃滤器过滤,用0.15M NaCl溶液反复冲洗。然后将hCG抗体包被的Sepharose珠用4ml等渗盐水再悬浮。
(d)制备包有抗hCG抗体的异硫氰酸盐玻璃固相制剂时,将0.127g异硫氰酸盐玻璃珠(Sigma)和3ml蛋白浓度为2.886mg/ml的2B2抗体溶液混合。该抗体溶液用硼酸盐缓冲液缓冲至pH9.0,混合物在室温下垂直混合过夜。加入1ml pH8.1的赖氨酸浓度为40mg/ml的赖氨酸-盐酸溶液终止反应。混合1小时后,悬浮液通过烧结玻璃过滤并用0.15M NaCl溶液洗涤。然后将2B2抗体包被的玻璃珠贮存在3ml0.15M NaCl溶液中。
(e)制备Reactogel-抗hCG抗体制剂时,用与实例Ⅲ(d)对异硫氰酸盐玻璃概述的完全相同的方法进行,将0.15g Reactogel 25DF(Pierce Chemical)偶联到2B2抗体上。
(f)熔凝硅石玻璃与抗hCG抗体的固相制备如下。通过将10g硅石颗粒悬浮于40ml水中并加入10ml3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(Eastman Kodak Company,目录号8746,批号C14D),使熔凝硅石颗粒(Ciba Corning,批号#6)进行硅烷化。该混合物在密闭试管中于室温下垂直旋转4小时。然后将硅烷化的颗粒每次用50ml水洗涤6次,以1,500G离心10分钟。将100mg氨烷基硅烷化颗粒悬浮于2ml含2.5%戊二醛的水溶液中。该混合物在密闭的试管中于室温下垂直旋转4小时。然后以1,500G离心10分钟收集颗粒。所得沉淀用2ml蛋白浓度为3.5mg/ml的2B2 hCG特异性抗体溶液再悬浮。该悬浮液垂直旋转4小时。然后如上离心收集颗粒,并再悬浮于2ml含10mg/ml BSA的PBS溶液中。该悬浮液也垂直旋转1小时,收集颗粒并再悬浮于2ml含1mg/ml BSA的PBS中。
(g)将游离酸形式的孕二醇-3-葡糖苷酸(P3G)(Sigma)通过混合酸酐法共价偶联到明胶(Sigma)上,完全如Erlanger等所述(J.Biol.Chem.228,713-727(1957))的方法进行。将1ml Polybead羧基单分散微球体(Polysciences)和10ml PBS混合,然后在混合物中加入11mg1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(Sigma)。在密闭试管中于22℃下垂直混合保温10分钟后,将胶乳悬浮液在装有SS-34转子的Sorvall RC5B离心机上以10,000rpm离心,弃去上清液。沉淀再悬浮于10ml含有8.9mg明胶P3G的PBS中。该混合液在22℃下垂直搅拌保温12小时。然后加入1ml浓度为10mg/ml的赖氨酸盐酸盐水溶液以封闭未反应的结合位点,10分钟后,利用上述离心方法收集抗体包被的颗粒。用这种方法两次洗涤沉淀后,包有抗体的胶乳颗粒最后再悬浮于5ml PBS中。
(h)利用实例Ⅲ(a)所述的方法制备由包有hCG特异性抗体的胶乳颗粒组成的固相组份,只是这里用1.5ml浓度为1.678mg/ml的2B2 hCG特异性抗体的溶液代替hLH特异性抗体溶液。
实例Ⅳ 测定方法
(a)用测定法评价根据上述实例Ⅱ(c)制备的、含有吸附偶联于生物素化的hCG/KLH/2G9抗体上的抗生物素蛋白并且有不同生物素与抗体比例的金探针。在这个方法中,准备6个含0.5ml缓冲液的试管,缓冲液由0.3M NaCl、0.1M pH 7.2的HEPES缓冲液和1%PVP(分子量为360,000)组成。其中三个试管还含有200mIULH/ml,而其余试管不含LH。然后,每个试管中加入0.020ml含分散胶乳颗粒的胶乳悬浮液,该胶乳颗粒包有根据实例Ⅲ(a)制备的共价连接的LH特异性抗体,以及0.150-0.175ml根据实例Ⅱ(c)制备的金探针。所得的混合物呈橙/红色,每个混合物中含有一个由抗体包被的胶乳颗粒组成的分散固相组份和一个由抗体包被的金探针颗粒组成的标记组份。样品在室温下保温10分钟,在此期间,试管中颜色不变。然后,每个样品用1μ的RC60Schleicher and Schuell滤器真空过滤(过滤在Schleicher and Schuell SRC-96型装置中进行)。样品过滤后,用0.5ml含1%SDS的1%Igepal CA-720(GAF)洗涤每个样品。滤器在空气中干燥,1μ滤器上捕获颗粒颜色的强度用目测和反射分光光度计(Macbeth,Kollmorgen Corporation)定量测定。结果列于表1。
表1
金探针中生物素 mIU/ml 观测结果
NHS:抗体的比例 LH 反射光谱 目测
60 ug:mg 0 0.45 +1
200 3.59 +3
120 ug:mg 0 0.85 +1
200 3.99 +3
240 ug:mg 0 0.51 +1
200 2.48 +2
如前所述,通过直接目测所收集的固相复合物中的金属含量来检测和测定样品中的LH含量。金属在滤器上产生可目测的颜色,此颜色表明金属的存在。由此分析法得到的另一个结果是确定了利用较低的生物素对抗体比例可得到更好的目测结果。该结果既可直接测定,也可利用反射分光镜来测定。
(b)茶碱的竞争性沉降测定方法如下进行。将前面实例Ⅲ(b)制备的包有抗体的Sepharose悬浮液,在临用前进行摇动使其再悬浮,向一系列圆锥形塑料管(Falcon 2097)中各加入40ml该悬浮液。向管中加入含不同浓度茶碱的溶液,混合并在室温下保温2分钟后,向每个管中加入250μl根据上述实例Ⅱ(d)制备的茶碱-BSA金溶胶分散液,摇动4分钟使内容物混合。然后将珠粒放置约30分钟,目测每个试管中沉降的珠粒和上清液的颜色。在含有0.1μg以上茶碱的管中,珠粒基本上呈白色,上清液为明显的粉红色。然而,在茶碱含量不到0.1μg的管中,珠粒的粉红色随茶碱浓度的减少而增加。同时,上清液透明度增加。还可通过测定上清液的光吸收评价结果,结果如下。
表Ⅱ
管中茶碱的含量 上清液在540nm处的光吸收
.0001 ug .046
.001 ug .049
.01 ug .064
.1 ug .104
1.0 ug .109
10 ug .109
100 ug .109
可以看到,结果和竞争性测试一致,即一般测试样品中茶碱量的增加导致固相中标记茶碱量的减少。也就是说,样品中的茶碱抑制标记的茶碱与固相的结合。相应地,直接目测可以看到,样品中茶碱浓度的增加导致所收集的固相颜色变浅,上清液颜色变深。
(c)如下进行hCG的重力分离测定。在此方法中,向一系列圆锥形塑料管中各加入50μl根据实例Ⅲ(c)制备的包有hCG特异性抗体的Sepharose颗粒、300μl根据实例Ⅱ(a)制备的包有抗体的金溶胶颗粒、几份100μl含有不同量(1、10或100ng)hCG的标准溶液中的一个和300μl PBS-BSA缓冲液。旋转混合30到35分钟后,使珠粒沉降到管底。沉降后,直接目测珠粒的颜色。在hCG含量为1纳克(ng)的那些管中,固相颜色基本为白色。然而,在hCG含量为10ng的那些管中,珠粒呈浅粉色,在hCG最初含量为100ng的那些管中,珠粒呈深粉色。相应地,样品中hCG的存在及含量的测定和检测通过直接目测结合在所收集的固相复合物上的金属的颜色而进行。当然,浅粉色和深粉色是由于在这些测试中沉降到每个管底的所收集的含金属的固相复合物中金的存在而产生的。
(d)分别向一系列圆锥形塑料管中加入100μl根据实例Ⅲ(d)制备的包有抗体的异硫氰酸盐玻璃颗粒。向每管中加入20μl根据实例Ⅱ(a)制备的包有抗体的金颗粒、40μl PBS-BSA缓冲液和100μl含1000,100,10,1或0ng/ml hCG的溶液。盖上试管,在室温下垂直旋转混合1小时。沉降后,直接目测珠粒的颜色。用根据实例Ⅲ(e)制备的包有抗体的Reactogel 25DF颗粒复重该操作。在异硫氰酸盐玻璃颗粒和Reactogel颗粒的情况下,发现试管中直至10ng hCG水平的测试灵敏度,与上述实例Ⅳ(c)的溴化氰Sepharose珠的测定结果十分相似。另外,包有抗体的金颗粒和包有抗体的固相颗粒同抗原反应,产生分散的、可收集的金属固相复合物,该复合物利用重力进行收集。原始样品中hCG的存在及含量,通过直接目测由所收集的固相复合物中的金属产生的颜色来评价。在每种情况下,当管中hCG的初始水平为10ng或更多时,组合物中金属的存在将产生粉色。
(e)hCG的存在也通过利用离心力收集复合物的方法进行检测和测定。向96孔微量滴定板(Dynatech,Immunlon)的小孔中加入200μl PBS-BSA缓冲液、25μl分别含25、2.5或0ng hCG的溶液、20μl根据实例Ⅱ(a)制备的包有抗体的金溶胶颗粒和10μl根据实例Ⅲ(f)制备的包有抗体的熔凝硅石颗粒。保温5分钟后,滴定板在装有276转子的IEC PR2离心机中以2000rpm离心。弃去上清液,沉淀用200μl PBS洗涤。把滴定板放在白色背景上,直接目测观察最后的沉淀。在原始样品中不含hCG时,观察到基本为白色的沉淀,而在最初含有2.5或25ng hCG抗原的那些小孔中,产生明显的粉色或红色沉淀。
(f)如下进行hCG的多孔基质捕获测定。在该方法中,准备2个试管,每管含有50μl根据实例Ⅲ(h)制备的包有hCG特异性抗体的胶乳颗粒、300μl按照实例Ⅱ(a)制备的包有抗体的金溶胶颗粒和300μl PBS-BSA缓冲液的混合物。其中一个试管中还含有100μl含50mIU hCG/ml的标准溶液,而另一个试管还含有不含hCG的标准溶液。所得的混合物呈橙/红色,其中各含有分散的由抗体包被的胶乳颗粒组成的固相组份和由抗体包被的金探针颗粒组成的标记组份。试管中的混合物在室温下保温10分钟,这期间试管中颜色不变。如下所述,将样品倒入装在内装型流动装置中的玻璃纤维滤器(Whatman GF/A)基质上。在与含hCG溶液接触过的基质上出现肉眼可见的明显的粉色斑点。在与不含hCG的溶液接触的基质处,没有这种斑点。有斑点的基质在阴暗处不见光放置4天,粉色斑点保持原色的鲜明度。同样的斑点在笔记本上维持6到12个月仍可清楚辨认。
(g)利用与实例Ⅳ(f)同样的方法进行hCG的另一个多孔基质捕获测定,只是利用实例Ⅱ(f)的金探针而不是实例Ⅱ(a)的金探针。在这种情况下,溶液最初呈深紫色,含hCG溶液接触捕获基质处产生的色斑呈粉红-紫色。其它情况下所得结果与实例Ⅳ(f)相同。
(h)利用实例Ⅱ(b)的金探针、实例Ⅲ(g)的固相及实例Ⅳ(b)的方法对P3G进行竞争性沉淀测定。观察到的结果与实例Ⅳ(b)基本相同,即随着P3G浓度的降低,珠粒粉色增加,上清液透明度增加。
同上述实例Ⅳ(f)说明和描述相似的多孔基质捕获方法,可归结为本发明最重要的商业方法。在多孔基质捕获方法中,分散的、可收集的含金属固相复合物,不管它所含的固相组份如何,都被多孔基质的表面和间隙及孔捕获。为了便于基质捕获方法在实验室中的使用,已构造出一种内装型流动装置,它用于使捕获基质与吸收剂紧密接触,从而使液体自动地流过捕获基质,而不需要真空或外加压力。已发现实验室中最有用的吸收介质是由纤维素塞子组成的Transorb(American Filtrona)装置。发现将分离器放在捕获基质和吸收剂之间时,便可保证吸收液相和多孔基质上捕获并收集的固相之间完全分离。
已对一些分离层进行了评价,发现此分离层可由玻璃纤维层(Whatman)、吸墨纸(Gillman)或多孔塑料层(Porex或Pellon)组成,它们的使用结果基本相同。同样,已评价了许多捕获基质,发现它们都是合适的。根据本发明,玻璃纤维滤器(Whatman GF/A)、再生纤维素膜(Schleicher和Schuell)和微孔膜(Millipore MF系列膜HAWP、SSWP、SMWP、SCWP,孔径分别为0.45、3、5、8微米)都已被成功地用来捕获和收集含金属固相复合物。还未测出哪些捕获基质在商业应用中最好,可能一种基质对一种情况较合适,另一种基质对另一种情况较合适。然而,在实验室中,发现玻璃纤维滤器特别适用。
在选择适当的捕获基质时,必须考虑两个因素,即多孔性和非特异结合性。较大的孔径和多孔性会造成更快速的流动,因此是有利的,特别是在那些不能施加外加压力或真空的情况下。但是,如果捕获基质孔太多或太大,含金属的固相复合物则会穿过基质而观察不到了。还观察到一些捕获基质会非特异性地与抗体包被的金属颗粒结合,也就是说,在没有免疫反应,也许甚至没有固相捕获颗粒的情况下。这种非特异性结合对本领域专业人员是熟知的,并可通过用非特异性结合阻断剂预处理捕获基质来抑制。非特异性结合阻断剂有聚乙烯吡咯烷酮、小牛血清、牛血清清蛋白和/或在有关领域中众所周知的多种其它物质和聚合物。可根据本发明成功使用的一种方法已在美国专利第4,632,901号中公开,主要区别在于本发明使用的膜不结合免疫试剂。而且,本发明的膜仅用作机械滤膜。其它可改用于本发明目的的先有技术设备已在美国专利第4,246,339和4,407,943中公开。这些先有技术设备也有反应物结合在膜上,而在本发明中,膜上不需结合反应物。而遥楹衔锛虻サ赝ü诵头椒ń惺占?
根据本发明,尽管抗体包被的固体颗粒和抗体包被的金属颗粒都是多价的,因为每个颗粒都携带许多抗体,但已测出,作为此测定结果而最后产生的分散的、可收集的、含金属固相复合物,仅仅含有由结合在其上的金颗粒包被的固相颗粒。通过本发明免疫反应产生的附着在固相颗粒上的包被的金颗粒,似乎不与另一种抗体包被的固相颗粒连接,即使每个金颗粒表面都带有未反应的抗体。其原因还不很清楚,但已确定不会发生这种连接,并且本发明不包括如美国专利第4,313,734号所利用的凝集或团聚现象。
通过利用本发明,特别是利用可悬浮于水中的颗粒如胶乳、玻璃珠等,以及利用抗体包被的金溶胶颗粒,本发明的hCG测定法能够检测出少至37.5mIU的hCG,但灵敏度的最终水平还未确定。由本发明的方法得到的改进的结果可能是由于所用的可悬浮颗粒提供了更多的表面区域,并且颗粒捕获是在有限的体积中进行,这样便使人眼能观察到的颜色强度扩大了许多倍。
还必须注意,在采用凝集原理的先有技术测定法中,是利用液相颜色的变化(通常是由红到兰紫)来测量反应的过程。因此,本领域专业人员可预期到,当抗体包被的金溶胶和抗体包被的珠粒混合时,二者将在液相中共凝集,产生由红到紫到兰的颜色变化。在本发明的情况下,在液相和固相中都不发生这种颜色变化,对于固相来说,当它从被收集后,特别是在用金作标记时,具有人眼易见的明显的红色。
尽管本发明不限于检测和/或测定人尿中的分析物,但在商业应用中,特别是在涉及妊娠和排卵的测试中,测试溶液一般将包括早晨的第一次尿样品。已发现尿中含有许多非特异性的、分散的颗粒污染物和/或杂质,它们会产生假阳性结果或干扰本发明的测试。所以,在利用尿样品进行本发明的测试时,发现一般需要在测试前对尿样进行过滤以除去这些污染物。任何一种能除去颗粒污染物的滤器都可使用;然而,发现前述的用作分离器的高密度多孔聚乙烯Porex塞子对这种过滤十分有效。
Claims (43)
1、一种测定及检测含水样品中免疫活性分析物的方法,其步骤如下:
(a)提供一个标记组份,它包括免疫活性物质和含金属颗粒的偶联产物,所述颗粒的大小和特征有利于维持标记组份单分散悬浮液的一般稳定性;
(b)提供一个固相组份,它包括免疫活性物质和固相颗粒的偶联产物,所述颗粒的大小和特征有利于维持固相组份悬浮液的一般稳定性;
(c)形成上述组份的混合的含水悬浮液,其中含有待分析的分析样品,所述物质能够作为该分析物存在的函数直接或间接地结合,从而形成可收集的含金属固相复合物。
(d)收集复合物;
(e)通过直接目测所收集固相复合物中金属的存在来测定或检测样品中的分析物。
2、权利要求1的方法,其特征在于所述分析物是选自配基和抗配基的具有生物活性的物质。
3、权利要求1的方法,其特征在于所述含金属颗粒为金属溶胶颗粒。
4、权利要求3的方法,其特征在于所述金属溶胶颗粒的大小在约50埃到约1000埃的范围内。
5、权利要求4的方法,其特征在于所述金属溶胶颗粒的大小在约135到约500埃。
6、权利要求3的方法,其特征在于所述颗粒为金溶胶颗粒。
7、权利要求4的方法,其特征在于所述颗粒为金溶胶颗粒。
8、权利要求5的方法,其特征在于所述颗粒为金溶胶颗粒。
9、权利要求1的方法,其特征在于所述标记组份是通过将物质直接偶联到含金属颗粒上而制备的。
10、权利要求1的方法,其特征在于通过利用生物素抗生物素蛋白连接将物质偶联到颗粒上来制备所述标记组份。
11、权利要求10的方法,其特征在于,通过使物质生物素化,用抗生物素蛋白化合物包裹含金属颗粒并使物质表面的生物素和颗粒表面的抗生物素蛋白化合物反应来制备所述的标记组份。
12、权利要求1的方法,其特征在于,利用牛血清清蛋白将物质偶联到颗粒上来制备所述的标记组份。
13、权利要求1的方法,其特征在于,通过将物质直接偶联到固相颗粒上来制备固相组份。
14、权利要求1的方法,其特征在于,利用牛血清清蛋白连接使物质与颗粒偶联来制备所述固相组份。
15、权利要求1的方法,其特征在于,利用明胶将物质偶联到颗粒上来制备所述固相组份。
16、权利要求11的方法,其特征在于,使混合的含水悬浮液的所有其它组份混合在一起,然后再通过向其中加入抗生物素蛋白包被的含金属颗粒来制备标记组份。
17、权利要求1的方法,其特征在于所述两种物质都能与分析物结合形成夹层。
18、权利要求17的方法,其特征在于所述物质都是抗体,分析物是抗原。
19、权利要求18的方法,其特征在于所述抗体结合在抗原的不同位点上。
20、权利要求1的方法,其特征在于所述物质相互结合。
21、权利要求20的方法,其特征在于所述物质中有一个为抗体,另一个为抗原。
22、权利要求20的方法,其特征在于标记组份的物质为抗体。
23、如权利要求1所述的方法,其特征在于所述收集过程包括,在多孔过滤装置表面捕获复合物,该装置允许滤液通过,但阻止复合物通过。
24、如权利要求1所述的方法,其特征在于所述收集过程包括,通过沉降作用使复合物沉降到一有限体积的空间,从而形成浓缩沉淀。
25、如权利要求1所述的方法,其特征在于所述收集过程包括,使含水悬浮液离心,迫使复合物进入有限体积的空间,从而形成致密沉淀。
26、权利要求23的方法,其特征在于通过离心力使滤液通过过滤装置。
27、权利要求23的方法,其特征在于通过毛细作用力使滤液通过过滤装置。
28、一种用于测定和检测含水样品中免疫活性分析物的物质的药盒,该药盒包括:
一个标记组份,它包括免疫活性物质和含金属颗粒的偶联产物,所述颗粒的大小和特征有利于维持标记组份单分散悬浮液的一般稳定性;
一个固相组份,它包括免疫活性物质和固相颗粒的偶联产物,所述颗粒的大小和特征有利于维持固相组份悬浮液的一般稳定性;
上述二组份可用于及共同用于形成它们二者混合的含水悬浮液,该悬浮液含有待分析的分析样品,所述标记组份和固相组份能够作为所述分析物存在的函数而直接或间接地结合,从而形成一分散的、可收集的合金属固相复合物;
用于收集和直接目测复合物的收集装置,以测定结合到所收集的固相复合物上的金属,从而检测或测定样品中的分析物。
29、权利要求28所述的药盒,其特征在于所述物质都能和分析物结合形成夹层。
30、权利要求29所述的药盒,其特征在于所述物质都是抗体,分析物是抗原。
31、权利要求30所述的药盒,其特征在于抗体结合在抗原的不同位点上。
32、权利要求28所述的药盒,其特征在于所述物质可互相结合。
33、权利要求28所述的药盒,其特征在于所述含金属颗粒为金属溶胶颗粒。
34、权利要求33所述的药盒,其特征在于所述金属溶胶颗粒的大小在约50到约1000埃范围内。
35、权利要求34所述的药盒,其特征在于所述金属溶胶颗粒的大小在约135到约500埃的范围内。
36、权利要求33所述的药盒,其特征在于所述颗粒为金溶胶颗粒。
37、权利要求34所述的药盒,其特征在于所述颗粒为金溶胶颗粒。
38、权利要求35所述的药盒,其特征在于所述颗粒为金溶胶颗粒。
39、一种稳定的含金属固相复合物的收集物质,所述复合物能通过直接目测而表明含水样品中分析物的最初存在、不存在或存在量,所述复合物包括:
一个标记组份,它包括免疫活性物质和含金属颗粒的偶联产物,所述颗粒的大小和特征有利于维持标记组份单分散悬浮液的一般稳定性;
一个固相组份,它包括免疫活性物质和固相颗粒的偶联产物,所述颗粒的大小和特征有利于维持固相组份悬浮液的一般稳定性;
上述物质直接或间接互相结合形成上述复合物。
40、权利要求39的发明,其特征在于所述复合物包括分析物,所述物质都以夹层形式与分析物结合。
41、权利要求40的发明,其特征在于所述物质在多孔过滤装置上收集。
42、权利要求40的发明,其特征在于所述物质在试管底部收集。
43、权利要求39的发明,其特征在于所述物质直接相互结合。
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---|---|---|---|
US105,285 | 1987-10-07 | ||
US07/105,285 US4859612A (en) | 1987-10-07 | 1987-10-07 | Metal sol capture immunoassay procedure, kit for use therewith and captured metal containing composite |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
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Family
ID=22304989
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN88109104A Pending CN1032458A (zh) | 1987-10-07 | 1988-10-07 | 金属溶胶捕获免疫测定法、该方法所用的药盒和捕获的含金属复合物 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
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RU (1) | RU2025732C1 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN100420947C (zh) * | 2005-05-30 | 2008-09-24 | 孙东旭 | 用单一捕获剂定量检测特异性分析物的方法及其试剂盒 |
CN101151532B (zh) * | 2005-03-29 | 2012-12-12 | 美艾利尔瑞士公司 | 胶态金属轭合物 |
Families Citing this family (90)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5622871A (en) | 1987-04-27 | 1997-04-22 | Unilever Patent Holdings B.V. | Capillary immunoassay and device therefor comprising mobilizable particulate labelled reagents |
WO1988002118A1 (en) * | 1986-09-22 | 1988-03-24 | Nippon Telegraph And Telephone Corporation | Laser magnetic immunoassay method and apparatus therefor |
US5238810A (en) * | 1986-09-22 | 1993-08-24 | Nippon Telegraph And Telephone Corporation | Laser magnetic immunoassay method and apparatus thereof |
USRE38430E1 (en) | 1987-03-27 | 2004-02-17 | Becton, Dickinson And Company | Solid phase chromatographic immunoassay |
JPH0746107B2 (ja) * | 1987-04-27 | 1995-05-17 | ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ | 検定法 |
US5202267A (en) * | 1988-04-04 | 1993-04-13 | Hygeia Sciences, Inc. | Sol capture immunoassay kit and procedure |
US5094962A (en) * | 1988-06-13 | 1992-03-10 | Eastman Kodak Company | Microporous article having a stabilized specific binding reagent, a method for its use and a diagnostic test kit |
AU2684488A (en) | 1988-06-27 | 1990-01-04 | Carter-Wallace, Inc. | Test device and method for colored particle immunoassay |
US5079172A (en) * | 1988-11-04 | 1992-01-07 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Method for detecting the presence of antibodies using gold-labeled antibodies and test kit |
IE71197B1 (en) * | 1988-11-14 | 1997-02-12 | Akzo Nv | Aqueous suspension for diagnostic tests |
US5102788A (en) * | 1988-11-21 | 1992-04-07 | Hygeia Sciences, Inc. | Immunoassay including lyophilized reactant mixture |
US5155021A (en) * | 1989-02-09 | 1992-10-13 | Eastman Kodak Company | Method and kit for determination of herpes simplex viral antigen by direct binding to polymeric particles |
CA2016999A1 (en) * | 1989-07-19 | 1991-01-19 | Sunil G. Anaokar | Assay method and apparatus |
CA2026409C (en) * | 1989-09-29 | 2004-11-09 | Ernest G. Schutt | Method of producing a reagent containing a narrow distribution of colloidal particles of a selected size and the use thereof |
GR1000686B (el) * | 1989-11-16 | 1992-10-08 | Ortho Diagnostic Systems Inc | Μεθοδος παραγωγης ενος αντιδραστηριου κολλοειδους μεταλλου που περιεχει κολλοειδη τεμαχιδια μεταλλου με προκαθορισμενο μεγεθος. εθος. |
US5252496A (en) * | 1989-12-18 | 1993-10-12 | Princeton Biomeditech Corporation | Carbon black immunochemical label |
KR910014706A (ko) * | 1990-01-10 | 1991-08-31 | 원본미기재 | 세척이 필요없는 개량된 이뮤노어세이(immunoassay)장치 |
US5141850A (en) * | 1990-02-07 | 1992-08-25 | Hygeia Sciences, Inc. | Porous strip form assay device method |
FR2664704B1 (fr) * | 1990-07-11 | 1997-05-30 | Bio Merieux | Procede de detection d'une substance biologique dans un milieu liquide selon une technique de filtration permettant de retenir la substance biologique sur des particules ne traversant pas le filtre. |
JP2628792B2 (ja) * | 1990-09-26 | 1997-07-09 | アカーズ・リサーチ・コーポレーシヨン | 改良されたリガンドのアッセイ |
DE4037776A1 (de) * | 1990-11-28 | 1992-06-04 | Behringwerke Ag | Waschloesung fuer festphasen-immunometrisches verfahren, die einen komplexbildner fuer metallionen enthaelt und ihre verwendung |
US5294369A (en) * | 1990-12-05 | 1994-03-15 | Akzo N.V. | Ligand gold bonding |
GB9028038D0 (en) * | 1990-12-24 | 1991-02-13 | Nycomed Pharma As | Test method and reagent kit therefor |
US6168956B1 (en) | 1991-05-29 | 2001-01-02 | Beckman Coulter, Inc. | Multiple component chromatographic assay device |
US5998220A (en) | 1991-05-29 | 1999-12-07 | Beckman Coulter, Inc. | Opposable-element assay devices, kits, and methods employing them |
US5869345A (en) * | 1991-05-29 | 1999-02-09 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Opposable-element assay device employing conductive barrier |
US5468648A (en) * | 1991-05-29 | 1995-11-21 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Interrupted-flow assay device |
US5877028A (en) | 1991-05-29 | 1999-03-02 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Immunochromatographic assay device |
US5607863A (en) * | 1991-05-29 | 1997-03-04 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Barrier-controlled assay device |
ZA923679B (en) * | 1991-06-21 | 1993-01-27 | Pro Soma Sarl | Diagnostic method |
US5310647A (en) * | 1992-04-01 | 1994-05-10 | Cherrystone Corporation | Detection and measurement of destructive and polymer forming enzymes by colloidal flocculation |
FR2708348B1 (fr) * | 1993-07-28 | 1995-10-06 | Stago Diagnostica | Procédé de dosage d'une substance immunologique au moyen de particules de latex magnétiques et de particules non-magnétiques. |
US5569608A (en) * | 1995-01-30 | 1996-10-29 | Bayer Corporation | Quantitative detection of analytes on immunochromatographic strips |
US6319676B1 (en) | 1995-05-02 | 2001-11-20 | Carter Wallace, Inc. | Diagnostic detection device and method |
US6057166A (en) * | 1995-12-22 | 2000-05-02 | Universal Healthwatch, Inc. | Fecal test method |
WO1997023774A1 (en) * | 1995-12-22 | 1997-07-03 | Universal Healthwatch, Inc. | Particle assisted immunoassay |
AU1336697A (en) * | 1995-12-22 | 1997-07-17 | Universal Health-Watch, Inc. | Fecal test method and device |
US5851777A (en) * | 1996-02-05 | 1998-12-22 | Dade Behring Inc. | Homogeneous sol-sol assay |
AU2121497A (en) * | 1996-02-22 | 1997-09-10 | Dexall Biomedical Labs, Inc. | Non-captive substrate liquid phase immunoassay |
US5874216A (en) * | 1996-02-23 | 1999-02-23 | Ensys Environmental Products, Inc. | Indirect label assay device for detecting small molecules and method of use thereof |
US6096563A (en) * | 1996-03-29 | 2000-08-01 | Strategic Diagnostics Inc. | Dual particle immunoassay method and kit |
US5879951A (en) | 1997-01-29 | 1999-03-09 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Opposable-element assay device employing unidirectional flow |
FR2762394B1 (fr) * | 1997-04-16 | 1999-05-28 | Bio Merieux | Compose ligand de coordination et utilisation pour fixer un materiel biologique |
US5939252A (en) | 1997-05-09 | 1999-08-17 | Lennon; Donald J. | Detachable-element assay device |
US6103468A (en) * | 1997-10-07 | 2000-08-15 | Labatt Brewing Company Limited | Rapid two-stage polymerase chain reaction method for detection of lactic acid bacteria in beer |
US6753189B1 (en) * | 1998-06-04 | 2004-06-22 | Mizuho Medy Co., Ltd. | Detection apparatus and method for the same |
US7297554B2 (en) * | 1998-11-18 | 2007-11-20 | Microdiagnostics, Inc. | Immunoassay system |
US6136610A (en) | 1998-11-23 | 2000-10-24 | Praxsys Biosystems, Inc. | Method and apparatus for performing a lateral flow assay |
US7759133B2 (en) * | 1998-12-22 | 2010-07-20 | Alk-Abello A/S | Method of detecting and/or quantifying a specific IgE antibody in a liquid sample |
US20050148101A1 (en) * | 1999-01-23 | 2005-07-07 | Bamdad Cynthia C. | Interaction of colloid-immobilized species with species on non-colloidal structures |
US6136044A (en) * | 1999-02-03 | 2000-10-24 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Stable coloring by in situ formation of micro-particles |
US6699507B1 (en) | 1999-08-05 | 2004-03-02 | Wisconsin Alulmni Research Foundation | Colloidal particles of different element composition for specific labeling purposes |
FR2797690B1 (fr) * | 1999-08-20 | 2001-10-12 | Bio Merieux | Procede de detection d'un analyte et necessaire pour la mise en oeuvre de ce procede |
GB9925461D0 (en) * | 1999-10-27 | 1999-12-29 | Genosis Ltd | Assay device |
DE10009503A1 (de) * | 2000-02-29 | 2001-08-30 | Roche Diagnostics Gmbh | Verfahren zur Immobilisierung von Konjugaten in diagnostischen Tests |
AU783559B2 (en) * | 2000-03-09 | 2005-11-10 | Colorado State University Research Foundation | Use of recombinant antigens to determine the immune status of an animal |
DE60128458T2 (de) | 2000-03-20 | 2008-01-10 | Massachusetts Institute Of Technology, Cambridge | Anorganische teilchenkonjugate |
FR2810739B1 (fr) | 2000-06-26 | 2007-01-26 | Centre Nat Rech Scient | Immunodosage electrochimiques a l'aide de marqueurs metalliques colloidaux |
DE60125388T2 (de) * | 2000-10-03 | 2007-09-27 | Minerva Biotechnologies Corp., Newton | Magnetisches in situ dilutionsverfahren |
GB0310522D0 (en) * | 2003-05-08 | 2003-06-11 | Yorktest Lab Ltd | Assay panel |
GB0312403D0 (en) * | 2003-05-29 | 2003-07-02 | Axis Shield Asa | Assay |
DE102004038163A1 (de) * | 2004-08-06 | 2006-03-16 | Diacdem Chip Technologies Gmbh | Fluoreszenz-basierte Assays zur schnellen, quantitativen Analyse von Biomolekülen (Proteine und Nukleinsäuren) durch Anreicherung auf Zellen oder Beads |
US7465587B2 (en) | 2004-12-03 | 2008-12-16 | Genzyme Corporation | Diagnostic assay device |
GB2420850A (en) * | 2004-12-03 | 2006-06-07 | Orion Diagnostica Oy | Particle based binding assay |
US8470608B2 (en) * | 2008-05-20 | 2013-06-25 | Rapid Pathogen Screening, Inc | Combined visual/fluorescence analyte detection test |
US8669052B2 (en) | 2008-06-10 | 2014-03-11 | Rapid Pathogen Screening, Inc. | Lateral flow nucleic acid detector |
US9201065B2 (en) | 2005-11-12 | 2015-12-01 | Platform Diagnostics Limited | Agglutination assay |
US20090159458A1 (en) * | 2006-04-07 | 2009-06-25 | Bio Device Technology Ltd. | Method for Determination of Test Substance |
US7704702B2 (en) * | 2006-08-10 | 2010-04-27 | Inverness Medical Switzerland Gmbh | Test strip for lateral flow assays |
JP5035622B2 (ja) * | 2008-01-11 | 2012-09-26 | 積水化学工業株式会社 | 着色ラテックス |
US20110086359A1 (en) * | 2008-06-10 | 2011-04-14 | Rapid Pathogen Screening, Inc. | Lateral flow assays |
DK2391892T3 (en) | 2009-01-30 | 2017-04-24 | Mycartis N V | BIOMARKET FOR DIAGNOSIS, PREDICTION AND / OR PROJECTS OF ACUTE HEART FAILURE AND USE thereof |
US8802427B2 (en) * | 2009-06-09 | 2014-08-12 | Church & Dwight Co., Inc. | Female fertility test |
AU2010309808B2 (en) | 2009-10-21 | 2016-04-28 | Mycartis Nv | Biomarker for diagnosis, prediction and/or prognosis of acute heart failure and uses thereof |
EP2553461B1 (en) | 2010-03-26 | 2016-01-20 | Mycartis N.V. | Ltbp2 as a biomarker for renal dysfunction and glomerular filtration rate |
AU2011240039B2 (en) | 2010-04-13 | 2017-01-19 | Mycartis Nv | Biomarkers for hypertensive disorders of pregnancy |
CA2802305A1 (en) | 2010-07-08 | 2012-01-12 | Pronota N.V. | Biomarker for hypertensive disorders of pregnancy |
US8956859B1 (en) | 2010-08-13 | 2015-02-17 | Aviex Technologies Llc | Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines |
US8828329B2 (en) | 2010-10-01 | 2014-09-09 | Church & Dwight, Co., Inc. | Electronic analyte assaying device |
WO2012076553A2 (en) | 2010-12-06 | 2012-06-14 | Pronota N.V. | Biomarkers and parameters for hypertensive disorders of pregnancy |
EP2788371A2 (en) | 2011-12-08 | 2014-10-15 | Biocartis NV | Biomarkers and test panels useful in systemic inflammatory conditions |
BR112014014456A2 (pt) | 2011-12-15 | 2018-09-25 | Pronota Nv | biomarcadores e parâmetros para distúrbios hipertensivos da gravidez |
US9528941B2 (en) | 2012-08-08 | 2016-12-27 | Scanadu Incorporated | Method and apparatus for determining analyte concentration by quantifying and interpreting color information captured in a continuous or periodic manner |
US9285323B2 (en) | 2012-08-08 | 2016-03-15 | Scanadu Incorporated | Quantifying color changes of chemical test pads induced concentrations of biological analytes under different lighting conditions |
US9311520B2 (en) | 2012-08-08 | 2016-04-12 | Scanadu Incorporated | Method and apparatus for performing and quantifying color changes induced by specific concentrations of biological analytes in an automatically calibrated environment |
US9091680B1 (en) | 2014-05-20 | 2015-07-28 | Robert Schreiber | Fecal occult blood testing system |
EP3180596A4 (en) | 2014-08-15 | 2018-09-26 | Scanadu Incorporated | Precision luxmeter methods for digital cameras to quantify colors in uncontrolled lighting environments |
US10151749B2 (en) * | 2015-08-05 | 2018-12-11 | Alfaisal University | Method and kit for the detection of microorganisms |
EP3574326A1 (en) | 2017-05-19 | 2019-12-04 | Philip Morris Products S.a.s. | Diagnostic test for distinguishing the smoking status of a subject |
WO2019084492A1 (en) | 2017-10-26 | 2019-05-02 | Essenlix Corporation | DEVICES AND METHODS FOR MONITORING LIQUID-SOLID CONTACT TIME |
Family Cites Families (43)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3088875A (en) * | 1959-10-27 | 1963-05-07 | Hyland Lab | Immunological diagnostics utilizing polystyrene latex particles of 0.15 to 0.25 micron |
US3096250A (en) * | 1959-11-30 | 1963-07-02 | Indiana University Foundation | Novel particulate antigens and process |
US3652761A (en) * | 1969-09-04 | 1972-03-28 | Corning Glass Works | Immunochemical composites and antigen or antibody purification therewith |
US3826613A (en) * | 1973-03-06 | 1974-07-30 | Us Navy | Detection and titration of viruses and antibodies using latex |
CA1039649A (en) * | 1973-08-30 | 1978-10-03 | General Electric Company | Method of forming multilayer immunologically complexed films |
US3960490A (en) * | 1974-04-01 | 1976-06-01 | General Electric Company | Method and apparatus for detecting immunologic reactions by diffusion in gel |
US4169138A (en) * | 1974-05-29 | 1979-09-25 | Pharmacia Diagnostics Ab | Method for the detection of antibodies |
US4018886A (en) * | 1975-07-01 | 1977-04-19 | General Electric Company | Diagnostic method and device employing protein-coated magnetic particles |
US3970518A (en) * | 1975-07-01 | 1976-07-20 | General Electric Company | Magnetic separation of biological particles |
FR2334106A1 (fr) * | 1975-12-02 | 1977-07-01 | Pasteur Institut | Gel magnetique convenant pour dosages immunoenzymatiques |
US4070246A (en) * | 1976-04-09 | 1978-01-24 | Abbott Laboratories | Reactive matrices |
IL49685A (en) * | 1976-05-31 | 1978-10-31 | Technion Res & Dev Foundation | Specific binding assay method for determining the concentration of materials and reagent means therefor |
US4157323A (en) * | 1976-06-09 | 1979-06-05 | California Institute Of Technology | Metal containing polymeric functional microspheres |
US4203724A (en) * | 1976-08-16 | 1980-05-20 | Mitsubishi Chemical Industries Limited | Method and apparatus for the measurement of antigens and antibodies |
US4208185A (en) * | 1976-08-16 | 1980-06-17 | Mitsubishi Chemical Industries Limited | Method and apparatus for the measurement of antigens and antibodies |
JPS5811575B2 (ja) * | 1976-08-16 | 1983-03-03 | 帝国臓器製薬株式会社 | 抗原−抗体反応の測定法 |
JPS5341420A (en) * | 1976-09-29 | 1978-04-14 | Mochida Pharm Co Ltd | Immunochemically measuring methoa of hapten |
US4407943A (en) * | 1976-12-16 | 1983-10-04 | Millipore Corporation | Immobilized antibody or antigen for immunoassay |
US4115535A (en) * | 1977-06-22 | 1978-09-19 | General Electric Company | Diagnostic method employing a mixture of normally separable protein-coated particles |
US4184849A (en) * | 1977-12-05 | 1980-01-22 | Technicon Instruments Corporation | Mixed agglutination |
US4233402A (en) * | 1978-04-05 | 1980-11-11 | Syva Company | Reagents and method employing channeling |
JPS5510590A (en) * | 1978-05-04 | 1980-01-25 | Wellcome Found | Enzyme immunity quantity analysis |
NL7807532A (nl) * | 1978-07-13 | 1980-01-15 | Akzo Nv | Metaal-immunotest. |
US4246339A (en) * | 1978-11-01 | 1981-01-20 | Millipore Corporation | Test device |
US4230664A (en) * | 1979-01-23 | 1980-10-28 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Test pack kit for immunoassay |
GB2045431B (en) * | 1979-02-26 | 1983-04-20 | Technicon Instr | Immunoassay utilising two particulate reagents |
NL185309C (nl) * | 1980-07-28 | 1990-03-01 | Akzo Nv | Methode voor het bepalen van antigenen met behulp van twee of meer monoklonale antilichamen alsmede immuunreagens. |
US4486530A (en) * | 1980-08-04 | 1984-12-04 | Hybritech Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
US4376110A (en) * | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
US4397959A (en) * | 1980-11-05 | 1983-08-09 | Research Corporation | Forced precipitation method for preparing antigen/antibody particles |
GB2095258B (en) * | 1981-03-19 | 1984-09-05 | Janssen Pharmaceutica Nv | A bright field light microscopic method of localizing tissue antigens |
NL8102178A (nl) * | 1981-05-02 | 1982-12-01 | Stichting Centraal Lab | Werkwijze voor het aantonen van tegen bepaalde antigenen gerichte antistoffen, alsmede inrichting en reagentia voor het uitvoeren van deze werkwijze. |
US4459361A (en) * | 1982-06-04 | 1984-07-10 | Angenics, Inc. | Ligand assay with one or two particulate reagents and filter |
US4636479A (en) * | 1983-04-20 | 1987-01-13 | Cooper-Lipotech, Inc. | Enhanced agglutination method and kit |
US4628037A (en) * | 1983-05-12 | 1986-12-09 | Advanced Magnetics, Inc. | Binding assays employing magnetic particles |
DK286083A (da) * | 1983-06-21 | 1984-12-22 | Dronningborg Maskinfab As | Apparat til kontinuerlig maaling af massestroem i en mejetaersker |
US4552839A (en) * | 1983-08-01 | 1985-11-12 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Determination of analytes in particle-containing medium |
US4582810A (en) * | 1983-09-30 | 1986-04-15 | Becton, Dickinson And Company | Immuno-agglutination particle suspensions |
US4595661A (en) * | 1983-11-18 | 1986-06-17 | Beckman Instruments, Inc. | Immunoassays and kits for use therein which include low affinity antibodies for reducing the hook effect |
US4621590A (en) * | 1983-12-06 | 1986-11-11 | Curwen Neil W | Livestock leg restrainer |
US4632901A (en) * | 1984-05-11 | 1986-12-30 | Hybritech Incorporated | Method and apparatus for immunoassays |
JPS6178668A (ja) * | 1984-09-27 | 1986-04-22 | Toshiba Corp | 記録ヘツドおよびそれを用いた記録方法 |
US4632461A (en) * | 1985-09-13 | 1986-12-30 | Randolph Ralph A | Dump cart |
-
1987
- 1987-10-07 US US07/105,285 patent/US4859612A/en not_active Expired - Lifetime
-
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101151532B (zh) * | 2005-03-29 | 2012-12-12 | 美艾利尔瑞士公司 | 胶态金属轭合物 |
CN100420947C (zh) * | 2005-05-30 | 2008-09-24 | 孙东旭 | 用单一捕获剂定量检测特异性分析物的方法及其试剂盒 |
Also Published As
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RU2025732C1 (ru) | 1994-12-30 |
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