CN102596204B - 新的核酸前药及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了核酸前药和包含手性磷部分的核酸前药。本文还公开了制备和使用核酸前药和包含手性磷部分的核酸前药的方法。

Description

新的核酸前药及其使用方法
交叉引用
本申请要求2009年7月6日提交的美国临时申请号61/223,369和2009年9月15日提交的美国临时申请号61/242,722的权益，上述每个申请全文通过引用并入本文。
发明领域
本文描述了核酸前药和包含手性磷部分的核酸前药以及它们的制备和使用方法。
发明背景
寡核苷酸适用于治疗、诊断、研究和新的纳米材料应用。DNA或RNA的天然序列的使用受到例如其对核酸酶的稳定性的限制。此外，体外研究显示，反义核苷酸的性质受到磷原子构型的影响，所述性质例如结合亲和力、对互补RNA的序列特异性结合、对核酸酶的稳定性。因此，在许多体外和体内应用中需要立体确定的寡核苷酸的前药以对寡核苷酸分子赋予额外的稳定性。本文描述了包含磷原子修饰的核酸的立体确定的寡核苷酸的前药及其使用方法。
发明概述
一个实施方案提供了手性核酸前药。
一个实施方案提供具有以下结构的核酸前药：
其中R1是-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-P(O)(Re)2、-HP(O)(Re)、-ORa或-SRc；
Y1是O、NRd、S或Se；
Ra是封闭基团；
Rc是封闭基团；
Rd在每种情况下独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)(Re)2或-HP(O)(Re)；
Re在每种情况下独立地为氢、烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y2-、烯基-Y2-、炔基-Y2-、芳基-Y2-或杂芳基-Y2-，或是为Na+1、Li+1或K+1的阳离子；
Y2是O、NRd或S；
R2在每种情况下独立地为氢、-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-ORb或-SRc，其中Rb是封闭基团；
Ba在每种情况下独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基；
X至少在一种情况下是-OCH2CH2S-S(O)2R10、-OCH2CH2S-SCH2CH2OH、-OCH2CH2CO2H、
R3是氢、封闭基团、连接至载体的连接部分或连接至核酸的连接部分；
R10是具有1至4个碳原子的烷基；
R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；
R12是氢或烷基；
Z是S或O；
q是0、1或3；
w是1、2、3、4、5或6；
R15和R16独立地为氢或甲基；
R17选自烷基、芳基或CH2CH＝CH2；
R18选自N(CH3)2、 并且
n是1至约200的整数。
另一个实施方案提供具有以下结构的核酸前药：
其中R1是-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-P(O)(Re)2、-HP(O)(Re)、-ORa或-SRc；
Y1是O、NRd、S或Se；
Ra是封闭基团；
Rc是封闭基团；
Rd在每种情况下独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)(Re)2或-HP(O)(Re)；
Re在每种情况下独立地为氢、烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y2-、烯基-Y2-、炔基-Y2-、芳基-Y2-或杂芳基-Y2-，或是为Na+1、Li+1或K+1的阳离子；
Y2是O、NRd或S；
R2在每种情况下独立地为氢、-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-ORb或-SRc，其中Rb是封闭基团；
Ba在每种情况下独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌 呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基；
X至少在一种情况下是
R3是氢、封闭基团、连接至载体的连接部分或连接至核酸的连接部分；
R10是具有1至4个碳原子的烷基；
R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；
R12是氢或烷基；并且
n是1至约200的整数。
另一个实施方案提供了核酸前药，其中通式1化合物的每个X-膦酸酯部分通过31PNMR波谱或反相HPLC测定为非对映异构体纯度大于98％。
另一个实施方案提供了核酸前药，其中每个X-膦酸酯部分具有 RP构型。
另一个实施方案提供了核酸前药，其中每个X-膦酸酯部分具有SP构型。另一个实施方案提供了核酸前药，其中每个X-膦酸酯独立地具有RP构型或SP构型。
另一个实施方案提供了核酸前药，其中R10是甲基。另一个实施方案提供了核酸前药，其中R11是甲基。另一个实施方案提供了核酸前药，其中R12是甲基。
另一个实施方案提供了核酸前药，其中所述核酸前药的X部分的至少25％独立地选自 另一个实施方案提供了核酸前药，其中所述核酸前药的X部分的至少50独立地选自 另一个实施方案提供了核酸前药，其中所述核酸前药的X部分的至少90％独立地选自 另一个实施方案提供了核酸前药，其中所述核酸前药的每个X部分独立地选自
另一个实施方案提供了核酸前药，其中所述核酸前药的每个X部分独立地选自-OCH2CH2S-S(O)2R10、-OCH2CH2S-SCH2CH2OH、-OCH2CH2CO2H、
R3是氢、封闭基团、连接至载体的连接部分或连接至核酸的连接部分；
R10是具有1至4个碳原子的烷基；
R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；
R12是氢或烷基；
Z是S或O；
q是0、1或3；
w是1、2、3、4、5或6；
R15和R16独立地为氢或甲基；
R17选自烷基、芳基或CH2CH＝CH2；并且
R18选自N(CH3)2、
一个实施方案提供具有以下结构的核酸前药：
其中R1是-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-P(O)(Re)2、-HP(O)(Re)、-ORa或-SRc；
Y1是O、NRd、S或Se；
Ra是封闭基团；
Rc是封闭基团；
Rd在每种情况下独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)(Re)2或-HP(O)(Re)；
Re在每种情况下独立地为氢、烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y2-、烯基-Y2-、炔基-Y2-、芳基-Y2-或杂芳基-Y2-，或是为Na+1、Li+1或K+1的阳离子；
Y2是O、NRd或S；
R2在每种情况下独立地为氢、-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-ORb或-SRc，其中Rb是封闭基团；
Ba在每种情况下独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基；
至少一个X是 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基，
R3是氢、封闭基团、连接至载体的连接部分或连接至核酸的连接部分；并且
n是1至约200的整数。
另一个实施方案提供了核酸前药，其中R10是甲基。另一个实施方案提供了核酸前药，其中R11是甲基。另一个实施方案提供了核酸前药，其中R12是甲基。
另一个实施方案提供了核酸前药，其中所述核酸前药的X部分的至少25％独立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基。另一个实施方案提供了核酸前药，其中所述核酸前药的X部分的至少50％独立地选自
其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基。另一个实施方案提供了核酸前药，其中所述核酸前药的X部分的至少90％独立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并 且R12是氢或烷基。另一个实施方案提供了核酸前药，其中所述核酸前药的每个X部分独立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基。
一个实施方案提供一种药物组合物，所述药物组合物包含具有以下结构的核酸前药：
其中R1是-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-P(O)(Re)2、-HP(O)(Re)、-ORa或-SRc；
Y1是O、NRd、S或Se；
Ra是封闭基团；
Rc是封闭基团；
Rd在每种情况下独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、 取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)(Re)2或-HP(O)(Re)；
Re在每种情况下独立地为氢、烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y2-、烯基-Y2-、炔基-Y2-、芳基-Y2-或杂芳基-Y2-，或是为Na+1、Li+1或K+1的阳离子；
Y2是O、NRd或S；
R2在每种情况下独立地为氢、-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-ORb或-SRc，其中Rb是封闭基团；
Ba在每种情况下独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基；
其中所述核酸前药的至少一个X部分独立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基；
R3是氢、封闭基团、连接至载体的连接部分或连接至核酸的连接部分；并且
n是1至约200的整数；
其中用于合成所述核酸前药的方法包括以下步骤：(1)使包含非手性H-膦酸酯部分的分子与包含5’-OH部分的核苷反应以形成缩合的中间体；和(2)使所述缩合的中间体转化为包含手性X-膦酸酯部分的核酸前药。
另一个实施方案提供包含具有通式1结构的核酸前药的药物组合物，其中通式1化合物的每个X-膦酸酯部分通过31P NMR波谱或反相HPLC测定为非对映异构体纯度大于98％。另一个实施方案提供包含具有通式1结构的核酸前药的药物组合物，其中每个X-膦酸酯部分具有RP构型。另一个实施方案提供包含具有通式1结构的核酸前药的药物组合物，其中每个X-膦酸酯部分具有SP构型。另一个实施方案提供包含具有通式1结构的核酸前药的药物组合物，其中每个X-膦酸酯独立地具有RP构型或SP构型。
另一个实施方案提供包含具有通式1结构的核酸前药的药物组合物，其中所述核酸前药的X部分的至少25％独立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基。另一个实施方案提供包含具有通式1结构的核酸前药的药物组合物，其中所述核酸前药的X部分的至少50％独立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基。另一个实施方案提供包含具有通式1结构的核酸前药的药物组合物，其中所述核酸前药的X部分的至少90％独立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基。另一个实施方案提供包含具有通式1结构的核酸前药的药物组合物，其中X在每种情况下独立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基。
另一个实施方案提供包含具有通式1结构的核酸前药的药物组合物，其中R10是甲基。另一个实施方案提供包含具有通式1结构的核酸前药的药物组合物，其中R11是甲基。另一个实施方案提供包含具有通式1结构的核酸前药的药物组合物，其中R12是甲基。
一个实施方案提供通过施用治疗量的手性核酸前药治疗与核糖核酸酶L的上调相关的疾病的方法。另一个实施方案提供治疗与核糖核酸酶L的上调相关的疾病的方法，其中所述疾病是慢性疲劳综合征。一个实施方案提供通过施用治疗量的手性核酸前药治疗与核糖核酸酶L的下调相关的疾病的方法。另一个实施方案提供治疗与核糖核酸酶L的下调相关的疾病的方法，其中所述疾病是癌症。在另一实施方案中，所述癌症选自前列腺癌、结肠直肠癌和胰腺癌。在一个实施方案中，与核糖核酸酶L的下调相关的癌症是胰腺癌。在另一个实施方案中，与核糖核酸酶L的下调相关的癌症是前列腺癌。还在另一个实施方案中，与核糖核酸酶L的下调相关的癌症是结肠直肠癌。
一个实施方案提供治疗癌症的方法，所述方法包括施用治疗量的具有以下结构的核酸前药：
其中R1是-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-P(O)(Re)2、 -HP(O)(Re)、-ORa或-SRc；
Y1是O、NRd、S或Se；
Ra是封闭基团；
Rc是封闭基团；
Rd在每种情况下独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)(Re)2或-HP(O)(Re)；
Re在每种情况下独立地为氢、烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y2-、烯基-Y2-、炔基-Y2-、芳基-Y2-或杂芳基-Y2-，或是为Na+1、Li+1或K+1的阳离子；
Y2是O、NRd或S；
R2在每种情况下独立地为氢、-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-ORb或-SRc，其中Rb是封闭基团；
Ba在每种情况下独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基；
所述核酸前药的至少一个X部分独立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基；
R3是氢、封闭基团、连接至载体的连接部分或连接至核酸的连接部分；并且n是1至约200的整数；
R10是具有1至4个碳原子的烷基；
其中用于合成所述核酸前药的方法包括以下步骤：(1)使包含非手性H-膦酸酯部分的分子与包含5’-OH部分的核苷反应以形成缩合的中间体；和(2)使所述缩合的中间体转化为包含手性X-膦酸酯部分的核酸前药。
另一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的通式1化合物，其中所述核酸前药的X部分的至少25％独立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基。另一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的通式1化合物，其中所述核酸前药的X部分的至少50％独立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基。另一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的通式1化合物，其中所述核酸前药的X部分的至少90％独 立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基。另一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的通式1化合物，其中X在每种情况下独立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基。
另一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的通式1化合物，其中R10是甲基。另一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的通式1化合物，其中R11是甲基。另一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的通式1化合物，其中R12是甲基。
另一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的通式1化合物，其中通式1化合物的每个X-膦酸酯部分通过31P NMR波谱或反相HPLC测定为非对映异构体纯度大于98％。另一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的通式1化合物，其中每个X-膦酸酯部分具有RP构型。另一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的通式1化合物，其中每个X-膦酸酯部分具有SP构型。另一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的通式1化合物，其中每个X-膦酸酯独立地具有RP构型或SP构型。
另一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的通式1化合物，其中所述癌症是胰腺癌。
一个实施方案提供具有以下结构的核酸前药：
其中R1是-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-P(O)(Re)2、 -HP(O)(Re)、-ORa或-SRc；
Y1是O、NRd、S或Se；
Ra是封闭基团；
Rc是封闭基团；
Rd在每种情况下独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)(Re)2或-HP(O)(Re)；
Re在每种情况下独立地为氢、烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y2-、烯基-Y2-、炔基-Y2-、芳基-Y2-或杂芳基-Y2-，或是为Na+1、Li+1或K+1的阳离子；
Y2是O、NRd或S；
R2在每种情况下独立地为氢、-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-ORb或-SRc，其中Rb是封闭基团；
Ba在每种情况下独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基；
X至少在一种情况下是
R3是氢、封闭基团、连接至载体的连接部分或连接至核酸的连接部分；
R10是具有1至4个碳原子的烷基；
R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；
R12是氢或烷基；并且
n是1至约200的整数。
一个实施方案提供通式2的核酸前药，其中通式2化合物的每个X-膦酸酯部分通过31P NMR波谱或反相HPLC测定为非对映异构体纯度大于98％。另一个实施方案提供通式2的核酸前药，其中每个X-膦酸酯部分具有RP构型。另一个实施方案提供通式2的核酸前药，其中每个X-膦酸酯部分具有SP构型。另一个实施方案提供通式2的核酸前药，其中每个X-膦酸酯独立地具有RP构型或SP构型。
另一个实施方案提供通式2的核酸前药，其中R10是甲基。另一个实施方案提供通式2的核酸前药，其中R11是甲基。另一个实施方案提供通式2的核酸前药，其中R12是甲基。
另一个实施方案提供通式2的核酸前药，其中所述核酸前药的X部分的至少25％独立地选自 另一个实施方案提供通式2的核酸前药，其中所述核酸前药的X部分的至少50％独立地选自 另一个实施方案提供通式2的核酸前药，其中所述核酸前药的X部分的至少90％独立地选自 另一个实施方案提供通式2的核酸前药，其中所述核酸前药的每个X部分独立地选自
一个实施方案提供一种药物组合物，所述药物组合物包含具有以下结构的核酸前药：
其中R1是-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-P(O)(Re)2、-HP(O)(Re)、-ORa或-SRc；
Y1是O、NRd、S或Se；
Ra是封闭基团；
Rc是封闭基团；
Rd在每种情况下独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)(Re)2或-HP(O)(Re)；
Re在每种情况下独立地为氢、烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y2-、烯基-Y2-、炔基-Y2-、芳基-Y2-或杂芳基-Y2-，或是为Na+1、Li+1或K+1的阳离子；
Y2是O、NRd或S；
R2在每种情况下独立地为氢、-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳 基-Y1-、-ORb或-SRc，其中Rb是封闭基团；
Ba在每种情况下独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基；
其中所述核酸前药的至少一个X部分独立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基；
R3是氢、封闭基团、连接至载体的连接部分或连接至核酸的连接部分；并且
n是1至约200的整数；
其中用于合成所述核酸前药的方法包括以下步骤：(1)使包含非手性H-膦酸酯部分的分子与包含5’-OH部分的核苷反应以形成缩合的中间体；和(2)使所述缩合的中间体转化为包含手性X-膦酸酯部分的核酸前药。
另一个实施方案提供包含通式2化合物的药物组合物，其中通式2化合物的每个X-膦酸酯部分通过31P NMR波谱或反相HPLC测定为非对映异构体纯度大于98％。另一个实施方案提供包含通式2化合物的药物组合物，其中每个X-膦酸酯部分具有RP构型。另一个实施方案提供包含通式2化合物的药物组合物，其中每个X-膦酸酯部分具有SP构型。另一个实施方案提供包含通式2化合物的药物组合物，其中每个X-膦酸酯独立地具有RP构型或SP构型。
另一个实施方案提供包含通式2化合物的药物组合物，其中所述核酸前药的X部分的至少25％独立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基。另一个实施方案提供包含通式2化合物的药物组合物，其中所述核酸前药的X部分的至少50％独立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基。另一个实施方案提供包含通式2化合物的药物组合物，其中所述核酸前药的X部分的至少90％独立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基。另一个实施方案提供包含通式2化合物的药物组合物，其中X在每种情况下独立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基。
另一个实施方案提供包含通式2化合物的药物组合物，其中R10是甲基。另一个实施方案提供包含通式2化合物的药物组合物，其中R11是甲基。另一个实施方案提供包含通式2化合物的药物组合物，其中R12是甲基。
一个实施方案提供治疗癌症的方法，所述方法包括施用治疗量的具有以下结构的核酸前药：
其中R1是-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-P(O)(Re)2、-HP(O)(Re)、-ORa或-SRc；
Y1是O、NRd、S或Se；
Ra是封闭基团；
Rc是封闭基团；
Rd在每种情况下独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)(Re)2或-HP(O)(Re)；
Re在每种情况下独立地为氢、烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y2-、烯基-Y2-、炔基-Y2-、芳基-Y2-或杂芳基-Y2-，或是为Na+1、Li+1或K+1的阳离子；
Y2是O、NRd或S；
R2在每种情况下独立地为氢、-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-ORb或-SRc，其中Rb是封闭基团；
Ba在每种情况下独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基；
所述核酸前药的至少一个X部分独立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基；
R3是氢、封闭基团、连接至载体的连接部分或连接至核酸的连接部分；并且n是1至约200的整数；
R10是具有1至4个碳原子的烷基；
其中用于合成所述核酸前药的方法包括以下步骤：(1)使包含非手性H-膦酸酯部分的分子与包含5’-OH部分的核苷反应以形成缩合的中间体；和(2)使所述缩合的中间体转化为包含手性X-膦酸酯部分的核酸前药。
另一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的具有通式2结构的化合物，其中所述核酸前药的X部分的至少25％独立地选 自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基。另一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的具有通式2结构的化合物，其中所述核酸前药的X部分的至少50％独立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基。另一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的具有通式2结构的化合物，其中所述核酸前药的X部分的至少90％独立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基。另一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的具有通式2结构的化合物，其中X在每种情况下独立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基。
另一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的具有通式2结构的化合物，其中R10是甲基。另一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的具有通式2结构的化合物，其中R11是甲基。另一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的具有通式2结构的化合物，其中R12是甲基。
另一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的具有通式2结构的化合物，其中通式2化合物的每个X-膦酸酯部分通过31PNMR波谱或反相HPLC测定为非对映异构体纯度大于98％。
另一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的具有通 式2结构的化合物，其中每个X-膦酸酯部分具有RP构型。另一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的具有通式2结构的化合物，其中每个X-膦酸酯部分具有SP构型。另一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的具有通式2结构的化合物，其中每个X-膦酸酯独立地具有RP构型或SP构型。
一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的具有通式2结构的化合物，其中所述癌症是胰腺癌。
一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的具有通式2结构的化合物，其中所述化合物具有下式：
其中每个A是腺嘌呤，并且每个R11独立地选自烷基、芳基、杂芳基、杂环基和环烷基。另一个实施方案提供治疗胰腺癌的方法，包括施用治疗量的通式A3-2化合物。
一个实施方案提供治疗癌症的方法，包括施用治疗量的具有通式2结构的化合物，其中所述化合物具有下式：
另一个实施方案提供治疗胰腺癌的方法，包括施用治疗量的通式A3-3化合物。
一个实施方案提供具有下式的化合物或其药物可接受的盐：
其中每个A是腺嘌呤；并且至少一个X部分是 其中R10是具有1 至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基。
另一个实施方案提供具有通式A3-1结构的化合物或其药物可接受的盐，其中所述核酸前药的X部分的至少两个独立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基。
另一个实施方案提供具有通式A3-1结构的化合物或其药物可接受的盐，其中所述核酸前药的X部分的至少三个独立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基。
另一个实施方案提供具有通式A3-1结构的化合物或其药物可接受的盐，其中所述核酸前药的每个X部分独立地选自 其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；并且R12是氢或烷基。
另一个实施方案提供具有通式A3-1结构的化合物或其药物可接受的盐，其中所述化合物具有下式：
通过引用并入
本说明书中公开的所有出版物和专利申请全文通过引用并入本文，其程度如同指出将每个单独的出版物或专利申请具体并单独地通过引用并入。
附图简述
本发明的新颖特征在所附权利要求中详细给出。参考其中利用本发明原理给出的示例性实施方案的以下详述和附图可以更好地理解本发明的特征和优点。
图1提供了化合物64和GSH的代表性分析型HPLC图谱。
图2提供了化合物64a、谷胱甘肽加合物和从前部分释放后的最终产物的代表性HPLC图谱。
图3提供了化合物64a和64b随时间转化的曲线。
图4提供了通过LC-MS测定的谷胱甘肽辅助的化合物64a的前药 释放的反应时程。
发明详述
本文使用的章节标题仅用于组织目的并且不被解释为限制所描述的主题。本申请中引用的所有文件或文件的各部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、手册和论文，出于任何目的，在此明确地通过引用全文并入。
除另有说明外，包括说明书和权利要求书在内的本申请中使用的以下术语具有以下给出的定义。必须注意，除上下文明确另有规定外，说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物。除另有说明外，采用质谱学、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。本申请中，除另有说明外，“或”或“和”的使用表示“和/或”。而且，术语“包括(including)”以及其它形式例如“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。
某些化学术语
除另有说明外，使用的诸如但不限于“烷基”、“胺”、“芳基”之类的一般化学术语是未经取代的。
如本文使用的，C1-Cx包括C1-C2、C1-C3...C1-Cx。仅作为例子，命名为“C1-C4”的基团表示该部分中存在1至4个碳原子，即，含有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子或4个碳原子的基团，范围C1-C2和C1-C3也是如此。因此，仅作为例子，“C1-C4烷基”表示该烷基中存在1至4个碳原子，即该烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。无论何时在本文出现时，数值范围例如“1至10”指给定范围内的每个整数；例如，“1至10个碳原子”表示该基团可以具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子、6个碳原子、7个碳原子、8个碳原子、9个碳原子或10个碳原子。
本文单独或组合使用的术语“杂原子”或“杂”指碳或氢以外的原子。杂原子可以独立地选自氧、氮、硫、磷、硅、硒和锡，但不限于 这些原子。在其中存在两个或更多个杂原子的实施方案中，所述两个或更多个杂原子可以彼此相同，或者所述两个或更多个杂原子的一些或全部可以彼此不同。
本文单独或组合使用的术语“烷基”指具有1至约10个碳原子或1至6个碳原子的直链或支链饱和烃单价基。实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2，2-二甲基-1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2，2-二甲基-1-丁基、3，3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异丙基、新戊基、叔戊基和己基，以及更长的烷基，如庚基、辛基等。无论何时在本文出现时，数值范围例如“C1-C6烷基”或“C1-6烷基”表示该烷基可以由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子组成。在一个实施方案中，“烷基”是经取代的。除另指出外，“烷基”是未经取代的。
本文单独或组合使用的术语“烯基”指具有一个或多个碳-碳双键并具有2至约10个碳原子或2至约6个碳原子的直链或支链烃单价基。该基团可关于双键呈顺式或反式构型，并且应该被理解为包括两种异构体。实例包括但不限于乙烯基(-CH＝CH2)、1-丙烯基(-CH2CH＝CH2)、异丙烯基[-C(CH3)＝CH2]、丁烯基、1，3-丁二烯基等。无论何时在本文出现时，数值范围例如“C2-C6烯基”或“C2-6烯基”表示该烯基可以由2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子组成。在一个实施方案中，“烯基”是经取代的。除另指出外，“烯基”是未经取代的。
本文单独或组合使用的术语“炔基”指具有一个或多个碳-碳三键并具有2至约10个碳原子或2至约6个碳原子的直链或支链烃单价基。实例包括但不限于乙炔基、2-丙炔基、2-丁炔基、1，3-丁二炔基等。无论何时在本文出现时，数值范围例如“C2-C6炔基”或“C2-6炔基”表示该炔基可以由2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子组成。在一个实施方案中，“炔基”是经取代的。除另指出外， “炔基”是未经取代的。
本文单独或组合使用的术语“杂烷基”、“杂烯基”和“杂炔基”分别指如上所述的烷基、烯基和炔基结构，其中主链碳原子(以及任何相关的氢原子，视情况而定)的一个或多个各自独立地被杂原子(即，非碳原子，例如但不限于氧、氮、硫、硅、磷、锡或其组合)或杂原子基团(例如但不限于-O-O-、-S-S-、-O-S-、-S-O-、＝N-N＝、-N＝N-、-N＝N-NH-、-P(O)2-、-O-P(O)2-、-P(O)2-O-、-S(O)-、-S(O)2-、-SnH2-等)替代。
本文单独或组合使用的术语“卤代烷基”、“卤代烯基”和“卤代炔基”分别指如上所述的烷基、烯基和炔基，其中一个或多个氢原子被氟、氯、溴或碘原子或其组合所替代。在一些实施方案中，两个或更多个氢原子可以被彼此相同的卤素原子所替代(例如，二氟甲基)；在其它实施方案中，两个或更多个氢原子可以被彼此不完全相同的卤素原子所替代(例如，1-氯-1-氟-1-碘乙基)。卤代烷基的非限制性实例是氟甲基、氯甲基和溴甲基。卤代烯基的非限制性实例是溴乙烯基。卤代炔基的非限制性实例是氯乙炔基。
本文单独或组合使用的术语“碳链”指是直链、环状或其任意组合的任何烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基或杂炔基。如果该链是连接体的一部分并且该连接体包括一个或多个环作为核心主链的一部分，为了计算链长度，“链”仅包括构成给定环的下部或上部而非两者的那些碳原子，并且当环的上部和下部长度不等时，应使用较短的距离确定链长度。如果链含有杂原子作为主链的一部分时，那些原子不被算作碳链长度的一部分。
本文单独或组合使用的术语“环烷基”指饱和的烃单价基环，含有3至约15个环碳原子或3至约10个环碳原子，但是可以包括另外的非环碳原子作为取代基(例如，甲基环丙基)。无论何时在本文出现时，数值范围例如“C3-C6环烷基”或“C3-6环烷基”表示该环烷基可以由3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子组成，即是环丙基、环丁基、环戊基或环庚基，但是本定义也涵盖其中未指定数值范围的术语“环烷基”的情况。该术语包括稠合、非稠合、桥接和螺基。稠合的环烷基可以含有2至4个稠环，其中连接的环是环烷基环，并且其它单个环可以是脂环、杂环、芳族、杂芳族的或其任意组合。实例包括但不限于环丙基、环戊基、环己基、萘烷基和双环[2.2.1]庚基和金刚烷基环系统。示例性实例包括但不限于以下部分：
在一个实施方案中，“环烷基”是经取代的。除另指明外，“环烷基”是未经取代的。
本文单独或组合使用的术语“非芳族杂环基”和“杂脂环基”指含有3至约20个环原子的饱和、部分不饱和或完全不饱和的非芳族环单价基，其中环原子的一个或多个是非碳原子，独立地选自氧、氮、硫、磷、硅、硒和锡，但不限于这些原子。在环中存在两个或更多个杂原子的实施方案中，所述两个或更多个杂原子可以彼此相同，或者所述两个或更多个杂原子的一些或全部可以彼此不同。该术语包括稠合的、非稠合的、桥接的和螺基。稠合的非芳族杂环基可以含有2至4个稠环，其中连接环是非芳族杂环，并且其它单个的环可以是脂环、杂环、芳族、杂芳族或其任意组合。稠环系统可以经单键或双键以及经碳-碳、碳-杂原子或杂原子-杂原子的键来稠合。该术语还包括具有3至约12个骨架环原子的基，以及具有3至约10个骨架环原子的基。非芳族杂环亚基与其母体分子的连接可以经由杂原子或碳原子。同样，另外的取代可以经由杂原子或碳原子。作为非限制性实例，咪唑烷非芳族杂环可以经由其N原子(咪唑烷-1-基或咪唑烷-3-基)或其碳原子的任何一个(咪唑烷-2-基、咪唑烷-4-基或咪唑烷-5-基)连接至母体分子。在某些实施方案中，非芳族杂环含有一个或多个羰基或硫代羰基，例如含有氧代和硫代的基团。实例包括但不限于吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢噻喃基、哌啶子基、吗啉代、硫代吗啉代、噻噁烷基、哌嗪基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、高哌啶基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、氧杂氮杂环庚烷基、二氮杂环庚烷基、硫氮杂环庚烷基、1，2，3，6- 四氢吡啶基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、二氢吲哚基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二氧杂环己基、1，3-二氧戊环基、吡唑啉基、二噻烷基、二硫戊环基、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮杂双环[3.1.0]己烷基、3-氮杂双环[4.1.0]庚烷基、3H-吲哚基和喹啉基。也被称为非芳族杂环的杂环烷基的示例性实例包括：
该术语还包括碳水化合物的所有环形式，所述碳水化合物包括但不限于单糖、二糖和寡糖。在一个实施方案中，“非芳族杂环基”或“杂脂环基”是经取代的。除另指明外，“非芳族杂环基”或“杂脂环基”是未经取代的。
本文单独或组合使用的术语“芳基”指6至约20个环碳原子的芳族烃基，并且包括稠合和非稠合的芳环。稠合的芳环基含有2至4个稠环，其中连接环是芳环，并且其它单个环可以是脂环、杂环、芳族、杂芳族或其任意组合。而且，术语芳基包括含有6至约12个环碳原子的稠环和非稠环，以及含有6至约10个环碳原子的那些。单环芳基的非限制性实例包括苯基；稠环芳基包括萘基、菲基、蒽基、薁基；非稠合双芳基包括联苯基。在一个实施方案中，“芳基”是经取代的。除另指明外，“芳基”是未经取代的。
本文单独或组合使用的术语“杂芳基”指含有约5至约20个骨架环原子的芳族单价基，其中所述环原子的一个或多个是杂原子，独立地选自氧、氮、硫、磷、硅、硒和锡，但不限于这些原子，并且条件是 所述基团的环不含有两个相邻的O或S原子。在环中存在两个或更多个杂原子的实施方案中，所述两个或更多个杂原子可以彼此相同，或者所述两个或更多个杂原子的一些或全部可以彼此不同。术语杂芳基包括具有至少一个杂原子的稠合和非稠合的杂芳基。术语杂芳基还包括具有5至约12个骨架环原子的稠合和非稠合的杂芳基，以及具有5至约10个骨架环原子的那些。键合至杂芳基可以经由碳原子或杂原子。因此，作为非限制性实例，咪唑基可以经由其碳原子的任何一个(咪唑-2-基、咪唑-4-基或咪唑-5-基)或其氮原子(咪唑-1-基或咪唑-3-基)连接至母体分子。同样，杂芳基可以经由其碳原子的任何一个或全部和/或其杂原子的任何一个或全部而被进一步取代。稠合的杂芳基可以含有2至4个稠环，其中连接环是杂芳族环，并且其它单个环可以是脂环、杂环、芳族、杂芳族或其任意组合。单环杂芳基的非限制性实例包括吡啶基；稠环杂芳基包括苯并咪唑基、喹啉基、吖啶基；并且非稠合双杂芳基包括双吡啶基。杂芳基的更多实例包括但不限于呋喃基、噻吩基、噁唑基、吖啶基、吩嗪基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并苯硫基、苯并噁二唑基、苯并三唑基、咪唑基、吲哚基、异噁唑基、异喹啉基、吲嗪基、异噻唑基、异吲哚基噁二唑基、吲唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吡咯基、吡嗪基、吡唑基、嘌呤基、酞嗪基、蝶啶基、喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、三唑基、四唑基、噻唑基、三嗪基、噻二唑基等，及其氧化物，例如吡啶基-N-氧化物。杂芳基的示例性实例包括以下部分：
在一个实施方案中，“杂芳基”是经取代的。除另指明外，“杂芳基”是未经取代的。
本文单独或组合使用的术语“杂环基”统指杂脂环基和杂芳基。在 本文，无论何时指明杂环中碳原子数(例如，C1-C6杂环)时，至少一个非碳原子(杂原子)必须存在于环中。名称例如“C1-C6杂环”仅指环中的碳原子数，而不是指环中的原子总数。名称例如“4-6元杂环”指环中含有的原子总数(即，4、5或6元环，其中至少一个原子是碳原子，至少一个原子是杂原子，并且其余2至4个原子是碳原子或杂原子)。对于具有两个或更多杂原子的杂环，那两个或更多杂原子可以彼此相同或不同。非芳族杂环基团包括环中仅具有三个原子的基团，而芳族杂环基团环中必须具有至少5个原子。键合(即，连接至母体分子或进一步取代)至杂环可以经由杂原子或碳原子。在一个实施方案中，“杂环基”是经取代的。除另指明外，“杂环基”是未经取代的。
本文单独或组合使用的术语“卤素”、“卤代”或“卤化物”指氟、氯、溴和/或碘。
某些药学术语
在本文使用的关于罹患疾患的个体的术语“受试者”、“患者”或“个体”等包括哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于哺乳动物类的任何成员：人，非人灵长类动物，例如黑猩猩，和其它猿和猴类；农场动物，例如牛、马、绵羊、山羊、猪；家畜，例如兔、狗和猫；实验动物，包括啮齿类动物，例如大鼠、小鼠和豚鼠等。非哺乳动物的实例包括但不限于鸟、鱼等。在本文提供的方法和组合物的一个实施方案中，哺乳动物是人。
本文使用的术语“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”指足以治疗或预防特定疾病或病症的被施用的至少一种药剂或化合物的量。结果可以是疾病的体征、症状或病因的减少和/或缓解，或生物系统的任何其它期望的改变。例如，治疗用途的“有效量”是提供临床上显著的疾病减少所需的包含本文公开化合物的组合物的量。任何个体病例中适当的“有效”量可以使用例如剂量递增研究等技术来确定。
如本文使用的，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”或“减轻”或“缓解”在本文可互换使用。这些术语指用于获得有益或期望结果的方法，所述有益或期望结果包括但不限于治疗益处和/或预防益处。治疗益处意思是被治疗的潜在疾患的消除或缓解。而且，治疗益处通过与潜在 疾患相关的生理症状的一种或多种的消除或缓解来实现，使得在患者中观察到改善，尽管患者可能依然受潜在疾患的困扰。对于预防益处，组合物可以被施用给处于发生特定疾病的风险的患者，或者施用给报告了疾病的生理症状的一种或多种的患者，尽管可能还未进行该疾病的诊断。
如在本文使用的，术语“治疗效果”包括上述的治疗益处和/或预防益处。预防效果包括延迟或消除疾病或病症的出现，延迟或消除疾病或病症的症状的发作，减缓、停止或逆转疾病或病症的进展，或其任意组合。
本文使用的术语“药学上可接受的”指不破坏本文描述的化合物的生物学活性或性质并且相对无毒的材料，例如载体或稀释剂，即，所述材料可以被施用给个体而不引起不希望的生物学效果或者以有害方式与包含它的组合物的任何组分相互作用。
本文使用的术语“药物组合物”指任选与至少一种药学上可接受的化学成分混合的生物活性化合物，所述药学上可接受的化学成分例如但不限于载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂。
本文使用的术语“载体”指促进化合物进入细胞或组织的相对无毒的化合物或试剂。
术语“前药”意思指可以在生理条件下或者通过溶剂分解作用被转化为本文描述的生物活性化合物的化合物。因此，术语“前药”指药学上可接受的生物活性化合物的前体。前药可以在施用给受试者时是非活性的，但是例如通过水解在体内转化为活性化合物。前药化合物通常提供在哺乳动物生物体中溶解性、组织相容性或延迟释放的优点(参见例如，Bundgard，H.，Design of Prodrugs(1985)，pp.7-9，21-24(Elsevier，Amsterdam)。前药的讨论提供于Higuchi，T.，等人.，“Pro-drugs as Novel Delivery Systems，”A.C.S.Symposium Series，Vol.14，和Bioreversible Carriers in Drug Design，编辑Edward B.Roche，American Pharmaceutical Association and Pergamon Press，1987，两者全文通过引用并入本文。术语“前药”意思还包括任何共价键合的载体， 其在此类前药施用给哺乳动物受试者时体内释放活性化合物。本文描述的活性化合物的前药可以通过以如下方式修饰活性化合物中存在的官能团来制备：修饰在常规操作或在体内被裂解成母体活性化合物。前药包括其中羟基、氨基或巯基被键合至任何基团的化合物，当活性化合物的前药被施用给哺乳动物受试者时，所述基团裂解以分别产生游离羟基、游离氨基或游离巯基。前药的实例包括但不限于磷原子修饰核酸的酰氧基、硫代酰氧基、2-烷氧碳酰乙基、二硫化物、硫缩醛胺和烯醇酯衍生物。
术语“前寡核苷酸”或“前核苷酸”或“核酸前药”指已经被修饰为寡核苷酸的前药的寡核苷酸。
某些核酸术语
天然核酸具有磷酸主链；人工核酸可以含有其它类型的主链，但是含有同样的碱基。
本文使用的术语“核苷酸”指由杂环碱基、糖和一个或多个磷酸基团组成的多核苷酸的单体单元。天然存在的碱基(鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U))是嘌呤或嘧啶的衍生物，但要理解，也包括天然和非天然存在的碱基类似物。天然存在的糖是戊糖(五碳糖)脱氧核糖(形成DNA)或核糖(形成RNA)，但要理解，也包括天然和非天然存在的糖类似物。核酸通过磷酸酯键连接以形成核酸或多核苷酸，尽管许多其它键接是本领域已知的(例如但不限于硫代磷酸酯、硼代磷酸酯等)。人工核酸包括PNA(肽核酸)、硫代磷酸酯和天然核酸的磷酸主链的其它变体。
术语“核苷”指其中核碱基或修饰的核碱基共价结合至糖或修饰的糖的部分。
术语“糖”指闭环和/或开环形式的单糖。糖包括但不限于核糖、脱氧核糖、呋喃戊糖、吡喃戊糖和吡喃己糖部分。
术语“修饰的糖”指可以替代糖的部分。修饰的糖模拟糖的空间排列、电子性质或一些其它物理化学性质。
本文使用的术语“核酸”和“多核苷酸”指任何长度的核苷酸的多聚体形式，核糖核苷酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸(DNA)。这些术语指分子 的一级结构，并且因此包括双链和单链DNA以及双链和单链RNA。这些术语包括作为等同物的由核苷酸类似物或修饰的多核苷酸(例如但不限于甲基化和/或封端的多核苷酸)制成的RNA或DNA的类似物。这些术语涵盖多聚核糖核苷酸或寡聚核糖核苷酸(RNA)和多聚脱氧核糖核苷酸或寡聚脱氧核糖核苷酸(DNA)；由核碱基和/或修饰的核碱基的N-糖苷或C-糖苷衍生的RNA或DNA；由糖和/或修饰的糖衍生的核酸；和由磷酸酯桥和/或修饰的磷原子桥衍生的核酸。这些术语涵盖含有核碱基、修饰的核碱基、糖、修饰的糖、磷酸酯桥或修饰的磷原子桥的任意组合的核酸。实例包括但不限于含有核糖部分的核酸、含有脱氧核糖部分的核酸、含有核糖和脱氧核糖部分的核酸、含有核糖和修饰的核糖部分的核酸。词头多聚-指含有约1至约10,000个核苷酸单体单元的核酸，并且其中词头寡聚-指含有约1至约200个核苷酸单体单元的核酸。
术语“核碱基”指参与氢键合的核酸部分，所述氢键合使一个核酸链与另一个互补链以序列特异性方式结合。最常见的天然存在的核碱基是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。
术语“修饰的核碱基”指可以替代核碱基的部分。修饰的核碱基模拟核碱基的空间排列、电子性质或一些其它物理化学性质，并且保留使一个核酸链与另一个核酸链以序列特异性方式结合的氢键合的性质。修饰的核碱基可以与所有五种天然存在的碱基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、或鸟嘌呤)配对，而基本上不影响寡核苷酸双链体的解链行为、由细胞内酶的识别或活性。
术语“手性试剂”指是手性或对映体纯的并且可用于不对称诱导核酸合成的化合物。
术语“手性配体”或“手性助剂”指是手性或对映体纯的并且控制反应的立体化学结果的部分。
在缩合反应中，术语“缩合试剂”指激活反应性较低的位点并且使之更易受亲核试剂攻击的试剂。
术语“封闭基团”指暂时掩蔽官能团的反应性的基团。官能团随后 可以通过去除封闭基团而被去掩蔽。
术语“硼化剂”、“硫亲电子试剂”、“硒亲电子试剂”指适用于修饰步骤的化合物，分别用于引入BH3、S和Se基团以在磷原子处修饰。
术语“部分”指分子的特定区段或官能团。化学部分是包埋入或附接至分子的通常识别的化学实体。
术语“载体”指能够实现合成的大量生产核酸并且可以在需要时再利用的任何支持体。如本文使用的，该术语指在进行合成核酸的反应步骤中使用的介质中不可溶并且被衍生化以包括反应性基团的聚合物。
术语“连接部分”指任选定位于末端核苷和载体之间或者末端核苷和另一核苷、核苷酸或核酸之间的任何部分。
“DNA分子”指脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)以其单链形式或双链螺旋的多聚体形式。该术语仅指分子的一级和二级结构，并且不将之限制于任何特定的三级形式。因此，该术语包括尤其在线性DNA分子(例如，限制性片段)、病毒、质粒和染色体中存在的双链DNA。在讨论特定双链DNA分子结构时，序列在本文可以根据仅以沿着DNA的非转录链(即，具有与mRNA同源的序列的链)5’至3’方向给出序列的正常约定来描述。
DNA“编码序列”或“编码区”是当处于适当表达控制序列的控制下时在体内转录和翻译成多肽的双链DNA序列。编码序列(“开放阅读框”或“ORF”)的边界由在5′(氨基)末端的起始密码子和在3′(羧基)末端的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括但不限于原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如，哺乳动物)DNA的基因组DNA序列和合成DNA序列。聚腺苷酰化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3′。术语“非编码序列”或“非编码区”指不被翻译成氨基酸的多核苷酸序列区域(例如，5′和3′未翻译区)。
术语“阅读框”指双链DNA分子的六个可能的阅读框(每个方向三个)之一。使用的阅读框决定DNA分子的编码序列内哪些密码子用于编码氨基酸。
如本文使用的，“反义”核酸分子包括与编码蛋白质的“有义”核酸 互补的核苷酸序列，例如，与双链cDNA分子的编码链互补，与mRNA序列互补，或者与基因的编码链互补。因此，反义核酸分子可以与有义核酸分子氢键合。
术语“碱基对”或(“bp”)：双链DNA分子中腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的伙伴关系。在RNA中，尿嘧啶(U)取代了胸腺嘧啶。
如本文使用的，“密码子”指当被转录和翻译时编码单个氨基酸残基或者在UUA、UGA或UAG的情况下编码终止信号的三个核苷酸。编码氨基酸的密码子是本领域公知的并且在此为了方便而提供于表1。
表1
密码子使用表
密码子 氨基酸 AA 缩写 密码子 氨基酸 AA 缩写
UUU 苯基丙氨酸 Phe F UCU 丝氨酸 Ser S
UUC 苯基丙氨酸 Phe F UCC 丝氨酸 Ser S
UUA 亮氨酸 Leu L UCA 丝氨酸 Ser S
UUG 亮氨酸 Leu L UCG 丝氨酸 Ser S
CUU 亮氨酸 Leu L CCU 脯氨酸 Pro P
CUC 亮氨酸 Leu L CCC 脯氨酸 Pro P
CUA 亮氨酸 Leu L CCA 脯氨酸 Pro P
CUG 亮氨酸 Leu L CCG 脯氨酸 Pro P
AUU 异亮氨酸 Ile I ACU 苏氨酸 Thr T
AUC 异亮氨酸 Ile I ACC 苏氨酸 Thr T
AUA 异亮氨酸 Ile I ACA 苏氨酸 Thr T
AUG 蛋氨酸 Met M ACH 苏氨酸 Thr T
GUU 缬氨酸 Val V GCU 丙氨酸 Ala A
GUC 缬氨酸 Val V GCC 丙氨酸 Ala A
GUA 缬氨酸 Val V GCA 丙氨酸 Ala A
GUG 缬氨酸 Val V GCG 丙氨酸 Ala A
UAU 酪氨酸 Tyr Y UGU 半胱氨酸 Cys C
UAC 酪氨酸 Tyr Y UGC 半胱氨酸 Cys C
UUA 终止子 UGA 终止子
UAG 终止子 UGG 色氨酸 Trp W
CAU 组氨酸 His H CGU 精氨酸 Arg R
CAC 组氨酸 His H CGC 精氨酸 Arg R
CAA 谷氨酰胺 Gln Q CGA 精氨酸 Arg R
CAG 谷氨酰胺 Gln Q CGG 精氨酸 Arg R
AAU 天冬酰胺 Asn N AGU 丝氨酸 Ser S
AAC 天冬酰胺 Asn N AGC 丝氨酸 Ser S
AAA 赖氨酸 Lys K AGA 精氨酸 Arg R
AAG 赖氨酸 Lys K AGG 精氨酸 Arg R
GAU 天冬氨酸 Asp D GGU 甘氨酸 Gly G
GAC 天冬氨酸 Asp D GGC 甘氨酸 Gly G
GAA 谷氨酸 Glu E GGA 甘氨酸 Gly G
GAG 谷氨酸 Glu E GGG 甘氨酸 Gly G
如本文使用的，“摆动位置”指密码子的第三个位置。在一些实施方案中，密码子摆动位置内的DNA分子突变导致氨基酸水平的沉默或保守突变。例如，存在编码甘氨酸的四个密码子，即GGU、GGC、GGA和GGG，因此，任何其它核苷酸的任何摆动位置核苷酸的突变不导致编码的蛋白质的氨基酸水平变化，并因此是沉默取代。
因此，“沉默取代”或“沉默突变”是其中密码子内的核苷酸被修饰但不导致由密码子编码的氨基酸残基变化的突变。实例包括密码子第三个位置的突变，以及在某些密码子中第一个位置的突变，例如当突变为AGG时依然编码Arg的密码子“CGG”。
本文使用的术语“基因”、“重组基因”和“基因构建体”指编码蛋白质或其一部分的DNA分子或DNA分子的一部分。DNA分子可以含有编码蛋白质的开放阅读框(作为外显子序列)，并且可以进一步包括内含子序列。本文使用的术语“内含子”指给定基因中存在的不被翻译成蛋白质并且在一些但非所有情况下在外显子之间存在的DNA序列。期望基因可操作连接于(或者它可以包括)一个或多个启动子、增强子、阻遏子和/或其它调节序列以调节基因的活性或表达，这是本领域公知的。
如本文使用的，“互补DNA”或“cDNA”包括由mRNA的反转录合成的其中除去了间插序列(内含子)的重组多核苷酸。
“同源性”或“同一性”或“相似性”指两个核酸分子之间的序列相似性。同源性和同一性可以各自通过比较可以为比较目的而比对的每个 序列中的位置来确定。当被比较序列中等同位置被相同碱基占据时，分子在该位置是同一的；当等同位置被相同或相似核酸残基(例如，空间和/或电子性质类似)占据时，分子可以被称为在该位置是同源的(相似的)。作为同源性/相似性或同一性百分比的表述指被比较序列共有的位置处相同或相似核酸的数目的函数。“不相关的”或“非同源的”序列与本文描述的序列共有小于40％同一性、小于35％同一性、小于30％同一性或小于25％同一性。在比较两个序列时，残基(氨基酸或核酸)的缺乏或额外残基的存在也降低同一性和同源性/相似性。
术语“同源性”描述了基于数学的序列相似性比较，用于鉴定相似功能或基序的基因。本文描述的核酸序列可以用作“查询序列”以进行针对公开数据库的检索，例如以鉴定其它家族成员、相关序列或同源物。此类检索可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)进行。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序进行，评分＝100，字长＝12，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以使用Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中描述的空位BLAST。当利用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各个程序(例如，XBLAST和BLAST)的缺省参数(参见www.ncbi.nlm.nih.gov)。
如本文使用的，“同一性”表示当比对序列以最大化序列匹配，即考虑空位和插入时，在两个或更多个序列中相应位置的同一核苷酸残基的百分比。同一性可以通过已知方法容易地计算，包括但不限于以下中描述的那些：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，编，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informaticsand Genome Projects，Smith，D.W.，编，Academic Press，New York，1993；ComputerAnalysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，编.，HumanaPress，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，编，MStockton Press，New York，1991；和Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)。测定同一性的方法旨在给出被测试序列之间的最大匹 配。而且，测定同一性的方法被编在可公开获得的计算机程序中。测定两个序列之间同一性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.，等人.，Nucleic Acids Research 12(1)：387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等人.，J.Molec.Biol.215：403-410(1990)和Altschul等人.Nuc.Acids Res.25：3389-3402(1997))。BLAST X程序可公开获自NCBI和其它来源(BLAST Manual，Altschul，S.，等人.，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.，等人.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。公知的Smith Waterman算法也可用于测定同一性。
DNA序列中的“异源”区是较大DNA序列内可识别的DNA片段，该可识别的DNA片段不与天然中的较大序列结合存在。因此，当异源区编码哺乳动物基因时，该基因通常具有不在来源生物体基因组中的哺乳动物基因组DNA侧翼的DNA侧翼。异源编码序列的另一个实例是其中编码序列自身不是天然存在的序列(例如，其中基因组编码序列含有内含子的cDNA或具有不同于未修饰基因的密码子或基序的合成序列)。等位基因变异或天然存在的突变事件不产生本文定义的异源DNA区。
术语“转换突变”指其中嘧啶(胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T))被另一嘧啶替代，或者嘌呤(腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))被另一嘌呤替代的DNA序列中的碱基变化。
术语“颠换突变”指其中嘧啶(胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T))被嘌呤(腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))替换，或者嘌呤被嘧啶替换的DNA序列中的碱基变化。
包含手性X-膦酸酯部分的核酸前药
前药设计的一般原理由Bundgard(Design and Application of Prodrugs.In aTextbook of Drug Design and Development；Krogsgaard-Larsen，P.，Bundgard，H.，Eds.；Harwood：Reading，UK，1991)概述。
改善具有期望的生物学活性但差的药学性质的分子的药学性质的一个策略是施用作为前药衍生物的感兴趣的分子。与母体分子相比， 这些前药可以表现出以下性质的一个或多个：增加的口服生物利用率、增加的细胞通透性、增加的水溶解度、降低的首过效应、增加的稳定性、肠转运蛋白的主动转运、或外流转运蛋白的躲避。
寡核苷酸具有可以通过应用前药策略而被改善的几种药学性质。具体说，寡核苷酸被核酸酶快速降解并表现出差的经细胞质细胞膜的细胞摄取(Poijarvi-Virta等人.，Curr.Med.Chem.(2006)，13(28)；3441-65；Wagner等人.，Med.Res.Rev.(2000)，20(6)：417-51；Peyrottes等人.，Mini Rev.Med.Chem.(2004)，4(4)：395-408；Gosselin等人.，(1996)，43(1)：196-208；Bologna等人.，(2002)，Antisense&Nucleic Acid Drug Development 12：33-41)。在一个实例中，Vives等人.，(Nucleic Acids Research(1999)，27(20)：4071-76)发现叔丁基SATE前寡核苷酸表现出与母体寡核苷酸相比显著增加的细胞穿透。
在一些实施方案中，前药部分被酯酶、核酸酶或细胞色素P450酶选择性去除，细胞色素P450酶包括但不限于以下所列的那些。
在一些实施方案中，前药在前寡核苷酸还未经细胞膜转运时被去除。在其它实施方案中，前药仅在前寡核苷酸经细胞膜转运之后从前寡核苷酸去除。可选地，前药仅在被转运至细胞内的细胞器中之后被 去除。在一些实施方案中，前药部分经非酶去除而被去除，包括但不限于在细胞内自发还原。
本文描述了包含手性X-膦酸酯的修饰的核酸的前药，其中所述修饰改善了核酸的一种或多种物理化学、药代动力学或药效动力学性质。前药部分连接至与核苷酸的膦酸酯或硫代磷酸酯基团的磷原子连接的氧或硫原子。前药部分包括但不限于S-酰基-2-硫代乙基、酰氧基、硫代酰氧基、2-烷氧碳酰乙基、二硫化物、硫缩醛胺和烯醇酯衍生物。
在一个实施方案中，前药部分是具有以下结构的S-酰基-2-硫代乙基部分。
其中R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基。在一些实施方案中，R11是甲基、乙基或环丙基。
在其它实施方案中，前药部分是具有以下结构的酰氧基部分：
其中R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基，并且R12是氢或烷基。在一些实施方案中，R11是甲基并且R12是氢。
可选地，前药部分是具有以下结构的硫代酰氧基部分：
其中R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基，并且R12是氢或烷基。在一些实施方案中，R11是甲基并且R12是氢。
本发明还提供了具有以下结构之一的前药2-烷氧碳酰乙基部分：
其中R10是具有1至4个碳原子的烷基。在一些实施方案中，R10是甲基或乙基。
在其它实施方案中，前药部分是具有以下结构的二硫化物部分：
其中R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基。在一些实施方案中，R11是甲基、乙基或苄基。
在其它实施方案中，前药部分是具有以下结构的硫缩醛部分：
其中R10是具有1至4个碳原子的烷基，并且R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基。在一些实施方案中，R10是甲基，并且R11是甲基或苯基。
本发明还提供了具有以下结构之一的烯醇酯前药部分：
其中R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基。在一些实施方案中，C3-烯醇酯前药部分或C4烯醇酯前药部分是顺式形式。在C3-烯醇酯前药部分或C4烯醇酯前药部分的一些实施方案中，R11是甲基、乙基或苯基。
在一个实施方案中，前药部分是具有以下结构之一的三烷基铵乙基部分：
在一个实施方案中，前药部分是具有以下结构之一的烷基氧肟酸酯部分：
在一个实施方案中，前药部分是具有以下结构之一的酰基氧肟酸酯部分：
一个实施方案提供了具有以下结构的核酸前药：
其中R1是-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-P(O)(Re)2、-HP(O)(Re)、-ORa或-SRc；
Y1是O、NRd、S或Se；
Ra是封闭基团；
Rc是封闭基团；
Rd在每种情况下独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)(Re)2或-HP(O)(Re)；
Re在每种情况下独立地为氢、烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y2-、烯基-Y2-、炔基-Y2-、芳基-Y2-或杂芳基-Y2-，或是为Na+1、Li+1或K+1的阳离子；
Y2是O、NRd或S；
R2在每种情况下独立地为氢、-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-ORb或-SRc，其中Rb是封闭基团；
Ba在每种情况下独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基；
X至少在一种情况下是-OCH2CH2S-S(O)2R10、 -OCH2CH2S-SCH2CH2OH、-OCH2CH2CO2H、
R3是氢、封闭基团、连接至载体的连接部分或连接至核酸的连接部分；
R10是具有1至4个碳原子的烷基；
R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；
R12是氢或烷基；
Z是S或O；
q是0、1或3；
w是1、2、3、4、5或6；
R15和R16独立地为氢或甲基；
R17选自烷基、芳基或CH2CH＝CH2；
R18选自N(CH3)2、 并且
n是1至约200的整数。
一方面，本发明提供了具有以下结构的核酸前药：
其中R1是-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-OP(O)(Re)2、-HP(O)(Re)、-ORa或-SRc；
Y1是O、NRd、S或Se；
Ra是封闭基团；
Rc是封闭基团；
Rd在每种情况下独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)(Re)2或-HP(O)(Re)；
Re在每种情况下独立地为氢、烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y2-、烯基-Y2-、炔基-Y2-、芳基-Y2-或杂芳基-Y2-，或是为Na+1、Li+1或K+1的阳离子；
Y2是O、NRd或S；
R2在每种情况下独立地为氢、-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-ORb或-SRc，其中Rb是封闭基团；
Ba在每种情况下独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基；
X在每种情况下为
R3是氢、封闭基团、连接至载体的连接部分或连接至核酸的连接部分；
R10是具有1至4个碳原子的烷基；
R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；
R12是氢或烷基；并且
n是1至约200的整数。
一方面，本发明提供了具有以下结构的核酸前药：
其中R1是-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-OP(O)(Re)2、-HP(O)(Re)、-ORa或-SRc；
Y1是O、NRd、S或Se；
Ra是封闭基团；
Rc是封闭基团；
Rd在每种情况下独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)(Re)2或-HP(O)(Re)；
Re在每种情况下独立地为氢、烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y2-、烯基-Y2-、炔基-Y2-、芳基-Y2-或杂芳基-Y2-，或是为Na+1、Li+1或K+1的阳离子；
Y2是O、NRd或S；
R2在每种情况下独立地为氢、-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-ORb或-SRc、其中Rb是封闭基团；
Ba在每种情况下独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基；
X在每种情况下为
R3是氢、封闭基团、连接至载体的连接部分或连接至核酸的连接部分；
R10是具有1至4个碳原子的烷基；
R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；
R12是氢或烷基；并且
n是1至约200的整数。
另一个实施方案提供了通式1或通式2的核酸前药，其中所述核酸前药的每个X部分独立地选自-OCH2CH2S-S(O)2R10、-OCH2CH2S-SCH2CH2OH、-OCH2CH2CO2H、
R3是氢、封闭基团、连接至载体的连接部分或连接至核酸的连接部分；
R10是具有1至4个碳原子的烷基；
R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；
R12是氢或烷基；
Z是S或O；
q是0、1或3；
w是1、2、3、4、5或6；
R15和R16独立地为氢或甲基；
R17选自烷基、芳基或CH2CH＝CH2；并且
R18选自N(CH3)2、
在一些实施方案中，n是1至约50；1至约40；1至约30；1至约25；1至约20；1至约15；或1至约10的整数。
一个实施方案提供非外消旋的前寡核苷酸，其中所述前寡核苷酸是具有下式结构的2-5A的类似物：
其中X是本文描述的前药部分的任何一个。
在一些实施方案中，非外消旋的前寡核苷酸是具有以下结构的2-5A类似物：
其中R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基。
在一个实施方案中，非外消旋的前寡核苷酸是具有以下结构的2-5A类似物：
合成的示例性方法
包含手性X-膦酸酯部分的核酸前药的合成方法的一般讨论
本文描述的方法提供了磷原子修饰的核酸前药的有效合成，其中磷原子处的立体化学构型被控制，由此产生立体确定的寡核苷酸。虽然本文描述的示例性合成方法提供3’-5’核苷酸键合，但也涵盖了2’-5’核苷酸键合。
本发明的前寡核苷酸可以通过修饰核苷酸或核酸的手性硫代磷酸酯或手性H-膦酸酯来合成。
S-酰基-2-硫代乙基前核苷酸可以由包含手性H-膦酸酯的核酸或核苷酸合成，如以下方案显示：
方案1
在一些实施方案中，R1是-OP(O)(Re)2，其中Re是 手性H-膦酸酯用N-氯代琥珀酰亚胺处理，然后与S-酰基-2-硫代乙醇反应生成S-酰基-2-硫代乙基前药。R1、R2和/或R3处存在的保护基可以随后被去除。
酰氧基核酸前药可以由包含手性H-膦酸酯的核酸或核苷酸合成，如以下方案显示：
方案2
手性H-膦酸酯用N-氯代琥珀酰亚胺处理，然后与乙酸羟甲酯化合物反应生成酰氧基前药。R1、R2和/或R3处存在的保护基可以随后被去除。
硫代酰氧基核酸前药可以由包含手性硫代磷酸酯的核酸或核苷酸合成，如以下方案显示：
方案3
手性硫代磷酸酯与氯代甲基酰氧基化合物反应生成酰氧基前药。R1、R2和/或R3处存在的保护基可以随后被去除。
2-烷氧碳酰乙基核酸前药可以由包含手性硫代磷酸酯的核酸或核苷酸合成，如以下方案显示：
方案4
去质子化的手性硫代磷酸酯与丙烯酸烷基酯反应生成2-烷氧碳酰乙基前核苷酸。R1、R2和/或R3处存在的保护基可以随后被去除。
二硫化物核酸前药可以由包含手性硫代磷酸酯的核酸或核苷酸合成，如以下方案显示：
方案5
去质子化的手性硫代磷酸酯与二烷基硫化物反应生成烷基二硫化物前核苷酸。R1、R2和/或R3处存在的保护基可以随后被去除。
硫缩醛核酸前药可以由包含手性硫代磷酸酯的核酸或核苷酸合成，如以下方案显示：
方案6
1，1，-二烷氧基3-酰氧基丙烷与三甲基甲硅烷基三氟甲基磺酸酯反应，然后向反应混合物添加去质子的手性硫代磷酸酯以产生硫缩醛前核苷酸。R1、R2和/或R3处存在的保护基可以随后被去除。
C3烯醇酯核酸前药可以由包含手性硫代磷酸酯的核酸或核苷酸合成，如以下方案显示：
方案7
去质子的手性硫代磷酸酯与(E)-3-氯-1-酰氧基-丙-1-烯化合物反应生成C3烯醇酯核酸前药。R1、R2和/或R3处存在的保护基可以随后被去除。
C4烯醇酯核酸前药可以由包含手性硫代磷酸酯的核酸或核苷酸合成，如以下方案显示：
方案8
去质子的手性硫代磷酸酯与(E)-3-氯-1-酰氧基-丁-1-烯化合物反应生成C3烯醇酯核酸前药。R1、R2和/或R3处存在的保护基可以随后被去除。
在一些实施方案中，包含手性硫代磷酸酯或手性H-膦酸酯的核酸如本文描述地合成。在其它实施方案中，其它合成方法可用于提供包含手性硫代磷酸酯或手性H-膦酸酯的核酸。
方案9.本发明前药寡核苷酸的手性硫代磷酸酯前体的合成(路线A)
包含通式2的非手性H-膦酸酯部分的分子与包含通式1V的亲核部分的核苷反应导致缩合的中间体(V)的生成；其被转化为包含手性X’-膦酸酯部分的核酸，手性X’-膦酸酯部分可被进一步修饰以产生包含手性X-膦酸酯部分的通式1的前药寡核苷酸。缩合的中间体的合成包括以下步骤：(a)用缩合剂活化通式2化合物以生成中间体II，(b)与手性试剂反应生成中间体III，随后(c)与通式1V化合物反应。
可以通过用部分A对手性助剂封端并修饰磷以引入J来将缩合的 中间体转化为通式1′的包含手性X’膦酸酯部分的核酸，所述部分A是酰基、芳基、烷基、芳烷基或甲硅烷基部分，所述J是S、Se或BH3，由此产生通式VII化合物。
通过裂解手性试剂，并且在需要时解除封闭基团并从载体裂解，通式VII化合物可以被转化为通式1’化合物，其中X′是S、Se或BH3，并且n是1。可选地，通过去封闭5’端，并重复偶联步骤以产生缩合的中间体，如前所述，通式VII化合物经受链延伸。封端、修饰、去封闭和链延伸的步骤被重复，直至达到期望的n。此时，每个膦酸酯处的手性试剂被裂解，如果需要，剩余的封闭基团被裂解，包括从载体裂解，以产生通式1’化合物，其中X′是S、Se或BH3，并且n大于或等于2并且小于约200。当X′是S时，通式1’化合物通过本文描述的方法转化以生成通式1的前寡核苷酸化合物。
用于在路线A中缩合的中间体V的手性磷处引入S、Se或BH2的修饰剂
在一些实施方案中，修饰剂是硫亲电子试剂、硒亲电子试剂或硼化剂。在一些实施方案中，硫亲电子试剂是具有下式之一的化合物：
S8(式B)、Z10-S-S-Z11或Z10-S-X-Z11，
其中Z10和Z11独立地为烷基、氨基烷基、环烷基、杂环、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、酰基、酰胺、酰亚胺或硫代羰基，或者Z10和Z11一起形成3至8元脂环或杂环，其可以是取代的或未取代的；X是SO2、O或NRf；并且Rf是氢、烷基、烯基、炔基或芳基。在其它实施方案中，硫亲电子试剂是式B、C、D、E或F的化合物：
在其它实施方案中，硫亲电子试剂是式F、式E或式B。
在一些实施方案中，硒亲电子试剂是具有下式之一的化合物：
Se(式G)、Z10-Se-Se-Z11或Z10-Se-X-Z11，
其中Z10和Z11独立地为烷基、氨基烷基、环烷基、杂环、环烷基 烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、酰基、酰胺、酰亚胺或硫代羰基，或者Z10和Z11一起形成3至8元脂环或杂环，其可以是取代的或未取代的；X是SO2、S、O或NRf；并且Rf是氢、烷基、烯基、炔基或芳基。
在其它实施方案中，硒亲电子试剂是式G、H、I、J、K或L的化合物。
在一些实施方案中，硒亲电子试剂是式G或式L。
在一些实施方案中，硼化剂是硼烷-N，N-二异丙基乙胺(BH3·DIPEA)、硼烷-吡啶(BH3·Py)、硼烷-2-氯吡啶(BH3·CPy)、硼烷-苯胺(BH3·An)、硼烷-四氢呋喃(BH3·THF)或硼烷-二甲硫醚(BH3·Me2S)、苯胺-氰基硼烷、三苯基膦-烷氧羰基硼烷。
在其它实施方案中，硼化剂是硼烷-N，N-二异丙基乙胺(BH3·DIPEA)、硼烷-2-氯吡啶(BH3·CPy)、硼烷-四氢呋喃(BH3·THF)或硼烷-二甲硫醚(BH3·Me2S)。
方案10。
通过手性H-膦酸酯合成前药寡核苷酸的前体(路线B).
在方案10描述的另一个实施方案中，通式2的非手性H-膦酸酯用缩合试剂处理以生成结构II的中间体。结构II的中间体未经分离并在相同罐中用手性试剂处理生成结构III的手性中间体。结构III的中间体未经分离并在相同罐中经历与结构IX的核苷或修饰核苷的反应以提供结构X的手性亚磷酸酯化合物。在一些实施方案中，结构X被萃取进入溶剂以使之与副产物、杂质和/或试剂分离。在其它实施方案中，当通过固相合成进行该方法时，包含结构X的化合物的载体与副产物、杂质和/或试剂过滤分离。结构X的化合物用酸处理以去除增长的核酸链的5′-端的封闭基团(结构XI)。酸化步骤也去除手性助剂配体以提供手性H-膦酸酯IX。5′-去封闭的中间体被任选地允许再次进入链延伸循环以形成含有封闭的5′-端的缩合的中间体，其然后被酸化以去除5′-端的封闭基团和手性助剂配体。
当达到期望的链长度时，5′-脱保护的中间体经历修饰步骤以引入与每个磷原子键合的部分X，以提供结构XII的化合物。修饰的中间体通过去除剩余保护基而被去封闭，例如核碱基、修饰的核碱基、糖或修饰的糖保护基被去除以提供通式1的核酸。在其中使用载体的实施方案中，磷原子修饰的核酸则从载体裂解。在某些实施方案中，核酸为纯化目的而保持连接在载体上，然后在纯化之后从载体裂解。在一个实施方案中，当式A的手性助剂配体的G1和G2位置不是氢时，方案10中描述的合成是有用的。
修饰通过路线B获得的通式1X化合物以引入X-或X′-膦酸酯部分。
用于修饰通过路线B获得的通式1X化合物的其它方法示例描述于反应方案10a和10b。已知膦酸酯和亚磷酸酯互变异构体化并平衡存在。亚磷酸酯互变异构体比膦酸酯互变异构体较不稳定。由于非常强的P＝O键，平衡在中性条件下朝向膦酸酯互变异构体。在酸性条件下，膦酸酯的磷酰基变得可逆地质子化。中间体中的P-H键的裂解缓慢发生以产生亚磷酸酯中间体。然后，使用反应方案10a和10b中显示的试剂修饰结构IX以生成结构XII。
反应方案10a。
使用在磷处的初始卤化，修饰通过路线B合成的中间体的磷中心
反应方案10b。
使用初始甲硅烷基化修饰通过路线B合成的中间体中的磷
在一些实施方案中，通过使结构IX与卤化试剂反应，随后与亲核试剂反应，进行修饰步骤。在具体实施方案中，卤化试剂是CCl4、CBr4、CI4、Cl2、Br2、I2、硫酰氯(SO2Cl2)、光气、三光气、一氯化硫、二氯化硫、氯胺、CuCl2、N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)或N-碘代琥珀酰亚胺(NIS)。在其它具体实施方案中，卤化试剂是CCl4、CBr4、Cl2、硫酰氯(SO2Cl2) 或N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)。在一些实施方案中，亲核试剂是伯胺或仲胺、醇或硫醇。在其它实施方案中，亲核试剂是NRfRfH、RfOH或RfSH，其中Rf是氢、烷基、烯基、炔基或芳基，并且NRfRfH的Rf的至少一个不是氢。
还可以通过使结构IX与甲硅烷基化试剂反应，然后与硫亲电子试剂、硒亲电子试剂、硼化剂、烷化剂、醛或酰化剂反应，来进行修饰步骤。
在具体实施方案中，甲硅烷基化试剂是氯代三甲基硅烷(TMS-Cl)、三异丙基甲硅烷基氯(TIPS-Cl)、叔丁基二甲基甲硅烷基氯(TBDMS-Cl)、叔丁基二苯基甲硅烷基氯(TBDPS-Cl)、1，1，1，3，3，3-六甲基二硅胺烷(HMDS)、N-三甲基甲硅烷基二甲基胺(TMSDMA)、N-三甲基甲硅烷基二乙胺(TMSDEA)、N-三甲基甲硅烷基乙酰胺(TMSA)、N，O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA)或N，O-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)。
在其它具体实施方案中，硫亲电子试剂是具有下式之一的化合物：
S8(式B)、Z10-S-S-Z11或Z10-S-X-Z11，
其中Z10和Z11独立地为烷基、氨基烷基、环烷基、杂环、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、酰基、酰胺、酰亚胺或硫代羰基，或者Z10和Z11一起形成3至8元脂环或杂环，其可以是取代的或未取代的；X是SO2、O或NRf；并且Rf是氢、烷基、烯基、炔基或芳基。在其它实施方案中，硫亲电子试剂是式B、C、D、E或F的化合物：
在其它实施方案中，硫亲电子试剂是式F、式E或式B。
在一些实施方案中，硒亲电子试剂是具有下式之一的化合物：
Se(式G)、Z10-Se-Se-Z11或Z10-Se-X-Z11，
其中Z10和Z11独立地为烷基、氨基烷基、环烷基、杂环、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、酰基、 酰胺、酰亚胺或硫代羰基，或Z10和Z11一起形成3至8元脂环或杂环，其可以是取代的或未取代的；X是SO2、S、O或NRf；并且Rf是氢、烷基、烯基、炔基或芳基。
在其它实施方案中，硒亲电子试剂是式G、H、I、J、K或L的化合物。
在一些实施方案中，硒亲电子试剂是式G或式L。
在一些实施方案中，硼化剂是硼烷-N，N-二异丙基乙胺(BH3·DIPEA)、硼烷-吡啶(BH3·Py)、硼烷-2-氯吡啶(BH3·CPy)、硼烷-苯胺(BH3·An)、硼烷-四氢呋喃(BH3·THF)或硼烷-二甲硫醚(BH3·Me2S)、苯胺-氰基硼烷、三苯基膦-烷氧羰基硼烷。在其它实施方案中，硼化剂是硼烷-N，N-二异丙基乙胺(BH3·DIPEA)、硼烷-2-氯吡啶(BH3·CPy)、硼烷-四氢呋喃(BH3·THF)或硼烷-二甲硫醚(BH3·Me2S)。
在其它实施方案中，烷化剂是烷基卤、烯基卤、炔基卤、烷基磺酸酯、烯基磺酸酯或炔基磺酸酯。
在其它实施方案中，醛是(对)-甲醛、烷基醛、烯基醛、炔基醛或芳基醛。
还在其它实施方案中，酰化剂是式M或N的化合物：
其中G7是烷基、环烷基、杂环、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基或杂芳氧基；并且M是F、Cl、Br、I、3-硝基-1，2，4-三唑、咪唑、烷基三唑、四唑、五氟苯或1-羟基苯并三唑。
方案11.通过立体选择性合成来合成手性二核苷硫代磷酸酯
立体选择性二核苷硫代磷酸酯合成的一种方法涉及使用立体化学纯的3’-亚磷酰胺，如Oka等人，(J.Am.Chem.Soc.(2003)，125：8307-17)所描述的。如方案6a(上文)所示，使2-氯噁唑磷烷衍生物与5’-O-(TBDPS)核苷反应以提供3’-O-噁唑磷烷衍生物。3’-O-(TBDPS)核苷与3’-O-噁唑磷烷衍生物在活化剂例如N-(氰基甲基)吡咯烷存在下反应，得到作为单一非对映体的二核苷亚磷酸酯。二核苷亚磷酸酯可以通过三步过程转化为硫代磷酸酯，所述三步过程涉及用乙酸酐酰化，用Beaucage试剂(3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮-1，1-二氧化物；Iyer等人，J.Am.Chem.Soc.(1990)，112：1253-4)硫化，并用过量DBU裂解手性助剂。然后通过本文公开的方法将被保护的二核苷硫代磷酸酯转化为前药。
用于合成二核苷硫代磷酸酯的其它方法包括酶促方法(Hacia等人.Biochemistry(1994)，33：5367-9；Tang等人.Nucleosides Nucleotides(1995)，14：985-990)，涉及分离通过非立体选择性方法制备的非对映体硫代磷酸酯混合物的方法(Zon等人Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach；IRL Press：London，1991，pp87-108)和涉及立体选择性合成硫代磷酸酯的方法(Wilk等人.J.Am.Chem.Soc.2000，122，2149-2156；Lu等人，Angew.Chem.，Int.编2000，39，4521-4524；Iyer等人Tetrahedron：Asymmetry 1995，6，1051-1054.Iyer等人Tetrahedron Lett.1998，39，2491-2494；Lu等人Tetrahedron 2001，57，1677-1687.Stec等人Nucleic acids Res.1991，19，5883-5888；Stec等人J.Am.Chem.Soc.1995，117，12019-12029；Uznan′ski等人J.Am.Chem.Soc.1992，114，10197-10202.
反向5′至3′核酸合成
包含手性X-膦酸酯部分的通式1核酸可选地从5′至3′方向合成。在其中使用载体的实施方案中，核酸通过其增长核酸的5′端连接至载体，从而为反应提供其3′基团，所述反应包括酶促反应(例如，连接和聚合)。在一些实施方案中，通过制备包含5′位置的非手性H-膦酸酯部分和3′位置的受保护的羟基的核苷单体来设计方向。在一个实施方案中，根据方案12合成核酸。在方案12中，-R4是上文定义的-ORb，或者在最后一个合成循环中是R4，其等同于本文定义的R1。
方案12.
包含手性X-膦酸酯部分的通式1的前寡核苷酸的5′至3′合成.
在方案12中描述的实施方案中，结构Ir的非手性H-膦酸酯用缩合试剂处理以生成结构IIr的中间体。结构IIr的中间体不经分离并在相同罐中用手性试剂处理生成结构IIIr的中间体。结构IIIr的中间体不经分离并在相同罐中经历与结构XIII的核苷或修饰核苷的反应以提供结构XIV的手性亚磷酸酯化合物。在一些实施方案中，结构XIV被萃取进入溶剂以使之与副产物、杂质和/或试剂分离。在其它实施方案中，当通过固相合成进行该方法时，包含结构XIV的化合物的载体与副产物、杂质和/或试剂过滤分离。结构XIV的化合物用酸处理以去除增长的核酸链的3′-端的封闭基团(结构XV)。酸化步骤也去除手 性助剂配体以提供结构XIII的化合物。3′-去封闭的中间体被任选地允许再次进入链延伸循环以形成含有封闭的3′-端的缩合的中间体，其然后被酸化以去除3′-端的封闭基团和手性助剂配体。在至少一轮链延伸循环之后，3′-脱保护的中间体经历修饰步骤以引入与每个磷原子键合的部分X，以提供结构XVI的化合物。修饰的中间体通过去除剩余保护基而被去封闭，例如核碱基、修饰的核碱基、糖或修饰的糖保护基被去除以提供通式1的核酸。在其它实施方案中，包含3′-OH部分的核苷是来自本文描述的前一个链延伸循环的中间体。还在其它实施方案中，包含3′-OH部分的核苷是从另一种已知的核酸合成方法获得的中间体。在使用第一核苷的合成循环之后，含有未保护的-OH部分的核苷、核苷酸或核酸可以用于随后的延伸循环。在其中使用载体的实施方案中，磷原子修饰的核酸可以从位于5′端的载体裂解。在某些实施方案中，核酸可以任选地为纯化目的而保持连接在载体上，然后在纯化之后从载体裂解。一方面，当式A的手性助剂配体的G1和G2位置均不为氢时，方案12中描述的合成是有用的。可以使用方案12中相同的起始材料以与路线A的步骤类似的机制完成反向5′至3′合成。
由H-膦酸酯产生具有可逆保护基的硫代磷酸三酯
硫代磷酸酯可以立体特异性方式由H-膦酸酯合成，保留磷原子的构型(J.Org.Chem.1991，3861-3869)。还考虑使用该反应以使用含巯基部分合成硫代磷酸三酯，所述含巯基部分还携带生物可逆的保护基，参见方案13。此外，还报道了寡核苷H-膦酸酯的立体控制的固相合成(Angew.Chem.Int.Ed.2009，48，496-499)，并且考虑该方法与载体合成期间的烷基化组合以在支持体上制备硫代磷酸三酯。
方案13
本发明方法中使用的反应条件和试剂
条件
包含非手性H-膦酸酯部分的分子与包含5′-OH部分的核苷反应生成缩合的中间体的步骤可以在不分离任何中间体的情况下进行。在一些实施方案中，包含非手性H-膦酸酯部分的分子与包含5′-OH部分的核苷反应生成缩合的中间体的步骤进行是一罐反应。在一个实施方案中，包含非手性H-膦酸酯部分的分子、缩合试剂、手性试剂和包含游离亲核部分的化合物在不同时间添加至反应混合物。在另一个实施方案中，包含非手性H-膦酸酯部分的分子、缩合试剂和手性试剂存在于相同的反应容器或相同的罐中。在另一个实施方案中，包含非手性H-膦酸酯部分的分子、缩合试剂、手性试剂和包含游离亲核部分的化合物存在于相同的反应容器或相同的罐中。这允许反应在不分离中间体的情况下进行，去除了耗时步骤，得到经济有效的合成。在具体实施方案中，非手性H-膦酸酯、缩合试剂、手性氨基醇、5′-OH核苷在反应中同时存在。在另一个实施方案中，用于缩合的手性中间体的生成是原位生成并且在缩合反应之前不分离。在另一个实施方案中，包含非手性H-膦酸酯部分的分子已经通过在不同反应容器中与缩合试剂、手性试剂的反应而被活化，所述不同反应容器是当手性中间体与包含游离5′-OH部分反应时使用的。
载体上的合成
在一些实施方案中，核酸的合成在溶液中进行。在其它实施方案中，核酸的合成在固相上进行。载体的反应性基团可以是未保护的或受保护的。在寡核苷酸合成期间，载体在几个合成循环中用各种试剂 处理以实现单个核苷酸单元对增长的寡核苷酸链的逐步延伸。如本文使用的，在链末端直接连接载体的核苷单元被称为“第一核苷”。第一核苷通过连接体部分结合至载体，连接体部分即对载体和核苷的聚合物两者具有共价键的二价基。连接体在为组装寡核苷酸链而进行的合成循环期间保持完整并且在链组装之后被裂解以从支持体释放寡核苷酸。
固相核酸合成的载体包括描述于例如以下的支持体：美国专利4,659,774、5,141,813、4,458,066；Caruthers美国专利号4,415,732、4,458,066、4,500,707、4,668,777、4,973,679和5,132,418；Andrus等人.美国专利号5,047,524、5,262,530；和Koster美国专利号4,725,677(再颁为Re34,069)。在一些实施方案中，载体是有机聚合物支持体。在其它实施方案中，固相是无机聚合物支持体。在一些实施方案中，有机聚合物支持体是聚苯乙烯、氨基甲基聚苯乙烯、聚乙二醇-聚苯乙烯接枝共聚物、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、高度交联聚合物(HCP)或其它合成的聚合物、碳水化合物例如纤维素和淀粉或其它多聚体碳水化合物、或其它有机聚合物和任何共聚物、复合材料或上述无机或有机材料的组合。在其它实施方案中，无机聚合物支持体是二氧化硅、氧化铝、作为硅胶支持体的受控的苯乙烯玻璃(CPG)、或氨基丙基CPG。其它有用的载体包括含氟载体(参见例如，WO/2005/070859)、长链烷基胺(LCAA)受控孔玻璃(CPG)载体(参见例如，S.P.Adams，K.S.Kavka，E.J.Wykes，S.B.Holder和G.R.Galluppi，J.Am.Chem.Soc.，1983，105，661-663；G.R.Gough，M.J.Bruden和P.T.Gilham，Tetrahedron Lett.，1981，22，4177-4180)。膜支持体和多聚体膜(参见例如Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis，Peptides，Proteins and Nucleic acids，ch 21 pp 157-162，1994，编辑Roger Epton和美国专利号4,923,901)也用于合成核酸。一旦生成，膜可以被化学官能化以用于核酸合成。除了将官能团连接至膜以外，可以使用连接至膜的连接体或间隔基团来最小化膜和合成链之间的空间位阻。
其它适合的载体包括本领域公知适合用于固相方法的那些，包括例如以PrimerTM200支持体出售的玻璃、控制孔径的玻璃(CPG)、草 酰基受控孔玻璃(参见例如，Alul，等人.，Nucleic acids Research，1991，19，1527)、TentaGel Support-一种氨基聚乙二醇衍生的支持体(参见例如，Wright，等人.，Tetrahedron Lett.，1993，34，3373)和Poros-一种聚苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物。
已经证明表面活化的聚合物用于在几种载体介质上合成天然和修饰的核酸和蛋白质。载体材料可以是孔隙度适当均一的任何聚合物，具有足够的胺含量，并且足够柔性以经历任何伴随的操作而不失去完整性。适合的选定材料的实例包括尼龙、聚丙烯、聚酯、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯和硝基纤维素。根据考察者的设计，其它材料可用作载体。考虑到一些设计，例如，可以选择涂覆金属，特别是金或铂(参见例如，美国公开号20010055761)。在寡核苷酸合成的一个实施方案中，例如，核苷被锚定至被羟基或氨基残基官能化的载体。可选地，载体被衍生化以提供酸不稳定的三烷氧基三苯甲基，例如三甲氧基三苯甲基(TMT)。不受理论束缚，预期三烷氧基三苯甲基的存在将允许在DNA合成仪上常用的条件下初始脱三苯甲基。为了在含有氨水的溶液中更快释放寡核苷酸材料，二乙醇酸酯连接体任选地被引至支持体上。
连接部分
连接部分或连接体被任选地用于连接载体至包含游离亲和部分的化合物。适合的连接体是已知的，例如在固相合成技术中用于连接载体至初始核苷分子的官能团(例如，羟基)的小分子。在一些实施方案中，连接部分是琥珀酰胺酸连接体、或琥珀酸酯连接体(-CO-CH2-CH2-CO-)、或草酰连接体(-CO-CO-)。在其它实施方案中，连接部分和核苷通过酯键键合在一起。在其它实施方案中，连接部分和核苷通过酰胺键键合在一起。在其它实施方案中，连接部分连接核苷至另一个核苷酸或核酸。适合的连接体公开于例如OligonucleotidesAnd Analogues A Practical Approach，Ekstein，F.编，IRL Press，N.Y.，1991，第1章。
连接体部分用于连接包含游离亲核部分的化合物与另一核苷、核苷酸或核酸。在一些实施方案中，连接部分是磷酸二酯键。在其它实 施方案中，连接部分是H-膦酸酯部分。在其它实施方案中，连接体部分是X膦酸酯部分。
用于合成的试剂
核酸的合成在非质子有机溶剂中进行。在一些实施方案中，溶剂是乙腈、吡啶、四氢呋喃或二氯甲烷。在一些实施方案中，当非质子有机溶剂不是碱性时，反应步骤中存在碱。在一些实施方案中，当存在碱时，碱是吡啶、喹啉或N，N-二甲基苯胺。其它碱的实例包括吡咯烷、哌啶、N-甲基吡咯烷、吡啶、喹啉、N，N-二甲基氨基吡啶(DMAP)或N，N-二甲基苯胺。在一些实施方案中，非质子有机溶剂是无水的。在其它实施方案中，无水非质子溶剂是新蒸馏的。在一些实施方案中，新蒸馏的无水非质子有机溶剂是吡啶。在其它实施方案中，新蒸馏的无水质子有机溶剂是四氢呋喃。在其它实施方案中，新蒸馏的无水质子有机溶剂是乙腈。
去除封闭基团的酸化条件
去除封闭基团的酸化通过 酸或路易斯酸完成。在一些实施方案中，酸化用于去除R1封闭基团。有用的 酸是羧酸、烷基磺酸、芳基磺酸、磷酸及其衍生物、膦酸及其衍生物、烷基膦酸及其衍生物、芳基膦酸及其衍生物、次膦酸、二烷基次膦酸和二芳基次膦酸，其在有机溶剂或水(在80％乙酸的情况下)中具有-0.6(三氟乙酸)至4.76(乙酸)的pKa(25℃于水中)值。酸化步骤中使用的酸浓度(1至80％)取决于酸的酸度。必须考虑到酸强度，因为强酸条件将导致脱嘌呤/脱嘧啶，其中嘌呤碱基或嘧啶碱基从核糖环裂解。
在一些实施方案中，酸化通过路易斯酸的有机溶剂溶液完成。有用的路易斯酸是ZnX2，其中X是Cl、Br、I或CF3SO3。
在一些实施方案中，酸化包括添加将缩合的中间体有效转化成式4化合物的量的酸或路易斯酸，不用从缩合的中间体去除嘌呤部分。
用于酸化步骤的酸还包括但不限于有机溶剂中10％磷酸、有机溶 剂中盐酸、有机溶剂中1％三氟乙酸、有机溶剂中3％二氯乙酸、或水中80％乙酸。该过程中使用的任何酸或路易斯酸的浓度被选择为使得酸浓度不超过引起核碱基从糖部分裂解的浓度。
在一些实施方案中，酸化包括添加有机溶剂中1％三氟乙酸。在一些实施方案中，酸化包括添加有机溶剂中约0.1％至约8％三氟乙酸。在其它实施方案中，酸化包括添加有机溶剂中3％二氯乙酸。在其它实施方案中，酸化包括添加有机溶剂中约0.1％至约10％二氯乙酸。在其它实施方案中，酸化包括添加有机溶剂中3％三氯乙酸。在其它实施方案中，酸化包括添加有机溶剂中约0.1％至约10％三氯乙酸。在一些实施方案中，酸化包括添加水中80％乙酸。在一些实施方案中，酸化包括添加水中约50％至约90％、或约50％至约80％、约50％至约70％、约50％至约60％、约70％至约90％乙酸。在一些实施方案中，酸化包括向酸溶剂中进一步添加阳离子清除剂。在具体实施方案中，阳离子清除剂可以是三乙基硅烷或三异丙基硅烷。在一些实施方案中，R1在酸化缩合的中间体步骤之前被去封闭。在一些实施方案中，R1通过酸化去封闭，酸化包括添加有机溶剂中1％三氟乙酸。在一些实施方案中，R1通过酸化去封闭，酸化包括添加有机溶剂中3％二氯乙酸。在一些实施方案中，R1通过酸化去封闭，酸化包括添加有机溶剂中3％三氯乙酸。
封闭部分或基团的去除
在合成期间，位于核碱基或糖部分上的官能团例如羟基或氨基部分常规用封闭(保护)基团(部分)封闭，随后被去封闭。一般而言，封闭基团赋予分子对特定反应条件惰性的化学官能，并且可以在后来从分子中的这种官能去除，而不实质损害分子的其余部分(参见例如，Green和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第2版，John Wiley&Sons，New York，1991)。例如，氨基可以用氮封闭基团例如苯二酰亚氨基、9-芴基甲氧基羰基(FMOC)、三苯基甲基亚磺酰基、t-BOC、4，4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)、4-甲氧基三苯甲基(MMTr)、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)、三苯甲基(Tr)或9-(p-甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)来封闭。羰基可以被保护为乙酰基。羟基可以被保护， 例如四氢吡喃基(THP)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、1-[(2-氯-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基(Ctmp)、1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(Fpmp)、1-(2-氯乙氧基)乙基、3-甲氧基-1，5-二甲酯基戊烷-3-基(MDP)、双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)、[4-(N-二氯乙酰基-N-甲基氨基)苄基氧基]甲基、2-氰基乙基(CN)、特戊酰氧基甲基(PivOM)、levunyloxy甲基(ALE)。其它代表性的羟基封闭基团已经被描述(参见例如，Beaucage等人.，Tetrahedron，1992，46，2223)。在一些实施方案中，羟基封闭基团是酸不稳定基团，例如三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(p-甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。化学官能团还可以通过在前体形式中包括它们而被封闭。因此，叠氮基团可以被认为是胺的封闭形式，因为叠氮基团容易被转化为胺。核酸合成中使用的其它代表性保护基是已知的(参见例如Agrawal等人.，Protocols for Oligonucleotides Conjugates，Eds.，Humana Press，New Jersey，1994，Vol.26，pp.1-72)。
各种方法是已知的，并且用于从核酸去除封闭基团。在一些实施方案中，所有封闭基团被去除。在其它实施方案中，封闭基团被部分去除。在其它实施方案中，反应条件可以被调整以去除某些部分上的封闭基团。在某些实施方案中，当R2是封闭基团时，R2的封闭基团的去除与R1的封闭基团的去除是直交的。R1和R2的封闭基团在合成步骤期间保持完整，并且在链组装之后被一起去除。在一些实施方案中，R2封闭基团与核酸从载体的裂解和核碱基封闭基团的去除同时去除。在具体实施方案中，R1封闭基团被去除，同时R2封闭基团和核碱基保持完整。使用有机碱例如伯胺、仲胺或其混合物，R1封闭基团在载体上可裂解。R1位置的去封闭通常称为前端脱保护。
在一个实施方案中，如果存在，核碱基封闭基团可在各自核酸组装之后用酸性试剂裂解。在另一个实施方案中，核碱基封闭基团的一个或多个在酸性或碱性条件下都不可裂解，例如用氟化物盐或氢氟酸复合物可裂解。在另一个实施方案中，核碱基封闭基团的一个或多个 在碱或碱性溶剂存在下在各自核酸组装之后可裂解，并且其中核碱基封闭基团对用胺的前端脱保护步骤的条件稳定。
在一些实施方案中，核碱基的封闭基团不是必需的。在其它实施方案中，核碱基的封闭基团是必需的。在其它实施方案中，某些核碱基需要封闭基团，而其它核碱基不需要封闭基团。在其中核碱基被封闭的实施方案中，封闭基团在适合去除前端封闭基团的条件下被完全或部分去除。例如，R1可以指示ORa，其中Ra是酰基，并且Ba指示用酰基封闭的鸟嘌呤，酰基包括但不限于异丁酰基、乙酰基或4-(叔丁基苯氧基)乙酰基。R1和Ba的酰基将在相同的去封闭步骤中去除或部分去除。
试剂
缩合试剂
用于本发明的缩合试剂(CR)具有以下通式之一：
其中Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、Z8和Z9独立地选自烷基、氨基烷基、环烷基、杂环、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、或杂芳氧基，或者其中Z2和Z3、Z5和Z6、Z7和Z8、Z8和Z9、Z9和Z7、或Z7和Z8和Z9的任何一个一起形成3至20元脂环或杂环；Q-是反离子；并且L是离去基团。
在一些实施方案中，缩合试剂CR的反离子是Cl-、Br-、BF4 -、PF6 -、TfO-、Tf2N-、AsF6 -、ClO4 -或SbF6 -，其中Tf是CF3SO2。在一些实施方案中，缩合试剂CR的离去基团是F、Cl、Br、I、3-硝基-1，2，4-三唑、咪唑、烷基三唑、四唑、五氟苯、或1-羟基苯并三唑。
可以在过程中使用的缩合剂的实例包括但不限于五氟苯甲酰氯、羰基二咪唑(CDI)、1-均三甲基苯磺酰基-3-硝基三唑(MSNT)、1-乙基-3-(3’-二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐(EDCI-HCl)、苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷六氟磷酸盐(PyBOP)、N，N’-双(2-氧-3-噁唑烷基)膦酰氯(BopCl)、2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)和O-苯并三唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、 DIPCDI；N，N’-双(2-氧-3-噁唑烷基)膦酰溴(BopBr)、1，3-二甲基-2-(3-硝基-1，2，4-三唑-1-基)-2-吡咯烷-1-基-1，3，2-二氮杂磷六氟磷酸盐(MNTP)、3-硝基-1，2，4-三唑-1-基-三(吡咯烷-1-基)磷六氟磷酸盐(PyNTP)、溴代三吡咯烷基磷六氟磷酸盐(PyBrOP)；O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)；和四甲基氟代甲酰胺六氟磷酸盐(TFFH)。在某些实施方案中，缩合试剂CR的反离子是Cl-、Br-、BF4 -、PF6 -、TfO-、Tf2N-、AsF6 -、ClO4 -或SbF6 -，其中Tf是CF3SO2。
在本发明的其它实施方案中，缩合试剂是1-(2，4，6-三异丙基苯磺酰基)-5-(吡啶2-基)四氮唑、特戊酰氯、溴代三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐、N，N’-双(2-氧-3-噁唑烷基)膦酰氯(BopCl)或2-氯-5，5-二甲基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷。在一个实施方案中，缩合试剂是N，N’-双(2-氧-3-噁唑烷基)膦酰氯(BopCl)。其它已知的缩合试剂已经被描述(参见例如，WO/2006/066260)。
在其它实施方案中，缩合试剂是1，3-二甲基-2-(3-硝基-1，2，4-三唑-1-基)-2-吡咯烷-1-基-1，3，2-二氮杂磷六氟磷酸盐(MNTP)或3-硝基-1，2，4-三唑-1-基-三(吡咯烷-1-基)磷六氟磷酸盐(PyNTP)。
手性试剂
在本发明方法中，手性试剂用于赋予X-膦酸酯键生成中的立体选择性。许多不同的手性助剂可用于该方法，其是通式3-I化合物，其中W1和W2是-O-、-S-或-NG5-的任何一个，其能够与H-膦酸酯起始材料通式2化合物反应生成手性中间体，如方案5和6的结构III所示。
U1和U3是碳原子，其通过单键、双键或三键在存在U2时键合至 U2或当r是0时彼此键合。U2是-C-、-CG8-、-CG8G8-、-NG8-、-N-、-O-或-S-，其中r是0至5的整数，并且不超过两个杂原子是相邻的。当U2的任何一个是C时，在作为C的第二个U2或至U1或U3之一之间必然形成三键。类似地，当U2的任何一个是CG8时，在作为-CG8-或-N-C的第二个U2或至U1或U3之一之间必然形成双键。
例如，在一些实施方案中，-U1-(U2)r-U3-是-CG3G4-CG1G2-。在一些实施方案中，-U1-(U2)r-U3-是-CG3＝CG1-。在一些实施方案中，-U1-(U2)r-U3-是-C≡C-。在一些实施方案中，-U1-(U2)r-U3-是-CG3＝CG8-CG1G2-。在一些实施方案中，-U1-(U2)r-U3-是-CG3G4-O-CG1G2-。在一些实施方案中，-U1-(U2)r-U3-是-CG3G4-NG8-CG1G2-。在一些实施方案中，-U1-(U2)r-U3-是-CG3G4-N-CG2-。在一些实施方案中，-U1-(U2)r-U3-是-CG3G4-N＝C G8-CG1G2-。
G1、G2、G3、G4、G5和G8独立地为氢、烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂芳基或芳基，或者G1、G2、G3、G4、G5和G6中的两个一起形成最多约20个环原子的饱和的、部分不饱和的或不饱和的碳环或含杂原子的环，其是单环或多环，并且是稠合的或未稠合的。在一些实施方案中，如此形成的环被氧代、硫代、烷基、烯基、炔基、杂芳基或芳基部分所取代。在一些实施方案中，当通过将两个G6结合在一起而形成的环被取代时，它被体积足以赋予反应期间的立体选择性的部分所取代。
例如，在一些实施方案中，通过将两个G6结合在一起而形成的环是环戊基、吡咯基、环丙基、环己烯基、环戊烯基、四氢吡喃基或哌嗪基。
在本发明的一些实施方案中，手性试剂是通式3化合物。
在通式3的一些实施方案中，W1和W2独立地为-NG5-、-O-或-S-；G1、G2、G3、G4和G5独立地为氢、烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂芳基或芳基，或者G1、G2、G3、G4、G5和G6中的 两个一起形成最多约20个环原子的饱和的、部分不饱和的或不饱和的碳环或含杂原子的环，其是单环或多环、稠合的或未稠合的，并且G1、G2、G3、G4和G5中不超过4个是G6。类似于通式3’化合物，G1、G2、G3、G4或G5的任何一个被氧代、硫代、烷基、烯基、炔基、杂芳基或芳基部分所取代。在一些实施方案中，这种取代诱导了X-膦酸酯生成中的立体选择性。
在本发明的一些实施方案中，手性试剂具有下式之一：
在一些实施方案中，手性试剂是氨基醇。在一些其它实施方案中，手性试剂是氨基硫醇。在其它实施方案中，手性试剂是氨基酚。在一些实施方案中，手性试剂是(S)-和(R)-2-甲基氨基-1-苯基乙醇、(1R、2S)-麻黄碱或(1R、2S)-2-甲基氨基-1，2-二苯基乙醇。
在本发明的其它实施方案中，手性试剂是下式之一的化合物：
手性试剂例如式O表示的异构体或其立体异构体式P的选择允许特异控制磷的手性。因此，可以在每个合成循环中选择RP或SP构型，允许核酸产物的总体三维结构的控制。在本发明的一些实施方案中，核酸产物具有所有RP立体中心。在本发明的一些实施方案中，核酸产物具有所有SP立体中心。在一些实施方案中，做出RP和SP中心的选择以赋予核酸链特定的三维超结构。
寡核苷硫代磷酸酯键的立体化学
寡核苷硫代磷酸酯已经显示了治疗潜力(Stein等人.，Science(1993)，261：1004-12；Agrawal等人.，Antisence Res.and Dev.(1992)，2：261-66；Bayever等人.，AntisenseRes.and Dev.(1993)，3：383-390)。不考虑硫代磷酸酯立体化学而制备的寡核苷硫代磷酸酯以2n非对映体的混合物存在，其中n是核苷酸间硫代磷酸酯键的数目。这些非对映体硫代磷酸酯的化学和生物学性质可以不同。例如，Wada等人(Nucleic Acids Symposium SeriesNo.51 p.119-120； doi：10.1093/nass/nrm060)发现，立体确定的-(Rp)-(Ups)9U/(Ap)9A双链体显示出比天然-(Up)9U/(Ap)9A更高的Tm值，并且立体确定的-(Sp)-(Ups)9U不形成双链体。在Tang等人.，(Nucleosides Nucleotides(1995)，14：985-990)研究的另一实例中，发现立体纯的Rp-寡聚脱氧核糖核苷硫代磷酸酯具有比具有不确定的磷手性的母体寡聚脱氧核糖核苷硫代磷酸酯更低的对人血清内源性核酸酶的稳定性。
核碱基和修饰的核碱基
通式1中核碱基Ba是天然核碱基或衍生自天然核碱基的修饰的核碱基。实例包括但不限于其各自氨基被酰基保护基保护的尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤，2-氟尿嘧啶、2-氟胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、氮杂胞嘧啶，嘧啶类似物例如假异胞嘧啶和假尿嘧啶，和其它修饰的核碱基例如8-取代的嘌呤、黄嘌呤或次黄嘌呤(后两个是天然降解产物)。Chiu和Rana，RNA，2003，9，1034-1048，Limbach等人.NucleicAcids Research，1994，22，2183-2196以及Revankar和Rao，Comprehensive NaturalProducts Chemistry，vol.7，313中公开的修饰的核碱基也被考虑作为通式1的Ba部分。
以下通式代表的化合物也被考虑作为修饰的核碱基：
在上式中，R8是具有1至15个碳原子的直链或支链的烷基、芳基、芳烷基或芳氧基烷基，仅作为实例，包括甲基、异丙基、苯基、苄基或苯氧基甲基；并且R9和R10的每一个代表具有1至4个碳原子的直链或支链烷基。
修饰的核碱基还包括尺寸增加的核碱基，其中已经添加了一个或多个苯环。GlenResearch catalog(www.glenresearch.com)；Krueger AT 等人，Acc.Chem.Res.，2007，40，141-150；Kool，ET，Acc.Chem.Res.，2002，35，936-943；Benner S.A.，等人.，Nat.Rev.Genet.，2005，6，553-543；Romesberg，F.E.，等人.，Curr.Opin.Chem.Biol.，2003，7，723-733；Hirao，I.，Curr.Opin.Chem.Biol.，2006，10，622-627中描述的核碱基置换被考虑用于合成本文描述的核酸。这些尺寸增加的核碱基的一些实例显示如下：
在此，修饰的核碱基还包括不被认为是核碱基而是其它部分的结构，例如但不限于咕啉或卟啉衍生的环。卟啉衍生的碱基置换描述于Morales-Rojas，H和Kool，ET，Org.Lett.，2002，4，4377-4380。以下显示了可以用作碱基置换的卟啉衍生的环的实例：
其它修饰的核碱基还包括碱基置换，例如以下显示的那些：
还考虑了荧光的修饰的核碱基。这些碱基置换的非限制性实例包括菲、芘、芪、异黄嘌呤、异黄蝶呤、三联苯、三噻吩、苯并三噻吩、香豆素、二氧四氢蝶啶、拴系芪、苯并尿嘧啶和萘并尿嘧啶，如以下 显示：
修饰的核碱基可以是未取代的，或者含有进一步的取代，例如杂原子、烷基、或连接至荧光部分、生物素或抗生物素蛋白部分或其它蛋白或肽的连接部分。修饰的核碱基还包括某些通用碱基，其不是最经典意义上的核碱基，但是功能类似于核碱基。这种通用碱基的一个代表性实例是3-硝基吡咯。
除了结构IV或IX的核苷以外，其它核苷也可以用于本文公开的方法中并且包括具有修饰的核碱基或共价结合至修饰糖的核碱基的核苷。具有修饰的核碱基的核苷的一些实例包括4-乙酰胞苷；5-(羧基羟基甲基)尿苷；2′-O-甲基胞苷；5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷；5-羧基甲基氨基甲基尿苷；二氢尿苷；2′-O-甲基假尿苷；β，D-半乳糖基Q核苷(galactosylqueosine)；2′-O-甲基鸟苷；N6-异戊基腺苷；1-甲基腺苷；1-甲基假尿苷；1-甲基鸟苷；1-甲基肌苷；2，2-二甲基鸟苷；2-甲基腺苷；2-甲基鸟苷；N7-甲基鸟苷；3-甲基-胞苷；5-甲基胞苷；N6-甲基腺苷；7-甲基鸟苷；5-甲基氨基乙基尿苷；5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿苷；β，D-甘露糖基Q核苷(mannosylqueosine)；5-甲氧基羰基甲基尿苷；5-甲氧基尿苷；2-甲基硫-N6-异戊基腺苷；N-((9-β，D-呋喃核糖基-2-甲基硫嘌呤-6-基)氨甲酰)苏氨酸；N-((9-β，D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)-N-甲基氨甲酰)苏氨酸；尿苷-5-乙醇酸甲基酯；尿苷-5-乙醇酸(v)；假尿苷； Q核苷(queosine)；2-硫胞苷；5-甲基-2-硫尿苷；2-硫尿苷；4-硫尿苷；5-甲基尿苷；2′-O-甲基-5-甲基尿苷；和2′-O-甲基尿苷。
在一些实施方案中，核苷包括在6′-位置具有(R)或(S)-手性的6′-修饰的双环核苷类似物，并且包括美国专利号7,399,845中描述的类似物。在其它实施方案中，核苷包括在5′-位置具有(R)或(S)-手性的5′-修饰的双环核苷类似物，并且包括美国专利申请公开号20070287831中描述的类似物。
在一些实施方案中，核碱基或修饰的核碱基包括生物分子结合部分，例如抗体、抗体片段、生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素、受体配体或螯合部分。在其它实施方案中，Ba是5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶或2，6-二氨基嘌呤。在其它实施方案中，Ba通过用荧光或生物分子结合部分取代来修饰。在一些实施方案中，Ba上的取代基是荧光部分。在其它实施方案中，Ba上的取代基是生物素或抗生物素蛋白。
核苷酸/核苷的修饰的糖
最常见的天然存在的核苷酸是与核碱基腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)连接的核糖。还包括修饰的核苷酸，其中核苷酸中的磷酸基或修饰的磷原子部分可以连接至糖或修饰的糖的不同位置。作为非限制性实例，磷酸基或修饰的磷原子部分可以连接至糖或修饰的糖的2′、3′、4′或5′羟基部分。含有上述修饰的核碱基的核苷酸也可用于本文公开的方法。在一些实施方案中，包含未保护的-OH部分的核苷酸或修饰的核苷酸用于本文公开的方法。
除了方案1-4b中描述的核糖部分外，其它修饰的糖也可以加入本文公开的核酸中。在一些实施方案中，修饰的糖包含在2′位置的一个或多个取代基，包括以下之一：F；CF3、CN、N3、NO、NO2、O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基、O-烷基-N-烷基或N-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代的或未取代的C1-C10烷基或C2-C10烯基和炔基。取代基的实例包括但不限于O(CH2)nOCH3和O(CH2)nNH2(其中n是1至约10)、MOE、DMAOE、DMAEOE。本文还考虑了WO 2001/088198；和Martin等 人.，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504中描述的修饰的糖。在一些实施方案中，修饰的糖包括取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、报道基团、荧光标记、嵌入剂、用于改善核酸药代动力学性质的基团、或用于改善核酸药效动力学性质的基团、和具有类似性质的其它取代基。修饰可以在糖或修饰糖的2′、3′、4′、5′或6′位置进行，包括3′-末端核苷酸上糖的3′位置或5′-末端核苷酸的5′位置。
修饰的糖还包括糖模拟物，例如替代五碳呋喃糖的环丁基或环戊基部分。教导此类修饰糖结构的制备的代表性的美国专利包括但不限于美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；和5,359,044。考虑的一些修饰的糖包括：
修饰的糖的其它非限制性实例包括甘油，其形成甘油核酸(GNA)类似物。GNA类似物的一个实例在下文显示并且描述于Zhang，R等人.，J.Am.Chem.Soc.，2008，130，5846-5847；Zhang L，等人.，J.Am.Chem.Soc.，2005，127，4174-4175和Tsai CH等人.，PNAS，2007，14598-14603：
其中X如本文定义。另一个GNA衍生的类似物的实例，基于甲酰基甘油的混合乙缩醛胺的柔性核酸(FNA)描述于Joyce GF等人.，PNAS，1987，84，4398-4402以及Heuberger BD和Switzer C，J.Am.Chem.Soc.，2008，130，412-413，并且显示如下：
修饰的糖的其它非限制性实例包括六碳吡喃糖(6’至4’)、五碳吡喃糖(4’至2’)、五碳吡喃糖(4’至3’)或四碳呋喃糖(3’至2’)。
考虑的六碳吡喃糖(6’至4’)包括：
考虑的五碳吡喃糖(4’至2’)包括：
考虑的五碳吡喃糖(4’至3’)包括：
考虑的四碳呋喃糖(3’至2’)包括：
考虑的其它修饰的糖包括：
还考虑在下文示例说明的糖模拟物，其中X选自S、Se、CH2、N-Me、N-Et或N-iPr。
修饰的糖和糖模拟物可以由本领域已知的方法制备，包括但不限于：A.Eschenmoser，Science(1999)，284：2118；M.Bohringer等人，Helv.Chim.Acta(1992)，75：1416-1477；M.Egli等人，J.Am.Chem.Soc.(2006)，128(33)：10847-56；A.Eschenmoser inChemical Synthesis：Gnosis to Prognosis，C.Chatgilialoglu和V.Sniekus，编，(KluwerAcademic，Netherlands，1996)，p.293；K.-U.Schoning等人，Science (2000)，290：1347-1351；A.Eschenmoser等人，Helv.Chim.Acta(1992)，75：218；J.Hunziker等人，Helv.Chim.Acta(1993)，76：259；G.Otting等人，Helv.Chim.Acta(1993)，76：2701；K.Groebke等人，Helv.Chim.Acta(1998)，81：375；和A.Eschenmoser，Science(1999)，284：2118。
封闭基团
在描述的反应中，在某些实施方案中有必要保护反应性官能团，例如羟基、氨基、巯基或羧基，其中这些是终产物中期望的，以避免其不希望的参与反应。使用保护基来封闭一些或所有反应性部分并防止此类基团参与化学反应，直至去除保护性基团。在一个实施方案中，每个保护性基团通过不同方式可去除。在完全不同的反应条件下裂解的保护性基团符合差异去除的要求。在一些实施方案中，保护性基团通过酸、碱和/或氢解去除。诸如三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、乙缩醛和叔丁基二甲基甲硅烷基的基团是酸不稳定的，并且用于某些实施方案中以在用可通过氢解去除的Cbz基团和/或碱不稳定的Fmoc基团保护的氨基存在下保护羧基和羟基反应性部分。在其它实施方案中，羧酸和羟基反应性部分在用酸不稳定基团例如叔丁基氨基甲酸酯或用酸和碱稳定的但可水解去除的氨基甲酸酯封闭的胺存在下用例如但不限于甲基、乙基和乙酰基的碱不稳定基团封闭。
在另一个实施方案中，羟基反应性部分用水解可去除的保护性基团例如苄基封闭，而能够与酸氢键合的胺基团用碱不稳定基团例如Fmoc封闭。在另一个实施方案中，羧酸反应性部分通过转化为简单的酯化合物而被保护，或者它们在另一个实施方案中用可氧化去除的保护性基团例如2，4-二甲氧基苄基封闭，而共存的氨基用氟化物不稳定的甲硅烷基或氨基甲酸酯封闭基团封闭。
烯丙基封闭基团在酸和碱保护基存在下是有用的，因为前者是稳定的并且可随后通过金属或pi酸催化剂去除。例如，烯丙基封闭的羟基可以在酸不稳定叔丁基氨基甲酸酯或碱不稳定乙酸胺保护基存在下用Pd(0)-催化的反应脱保护。另一种形式的保护基是化合物或中间体连接的树脂。只要残基连接至树脂，则该官能团被封闭并且不能反应。一旦从树脂释放，官能团可用于反应。 通常，仅作为例子，用于合成本文描述的化合物的封闭/保护基有：
用于在合成期间保护核苷酸的代表性保护基包括碱不稳定保护基和酸不稳定保护基。碱不稳定保护基用于保护杂环核碱基的环外氨基。这种类型的保护通常通过酰化来实现。为此目的三个常用的酰化基团是苯甲酰氯、苯氧基乙酸酐和异丁酰氯。这些保护基对于核酸合成期间使用的反应条件是稳定的，并且在合成结束时碱处理期间以大约相等的速率裂解。
在一些实施方案中，5′-保护基是三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、2-氯三苯甲基、DATE、TBTr、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)或9-(p-甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。
在一些实施方案中，巯基部分被加入式1、2、4或5的化合物并且被保护。在一些实施方案中，保护基包括但不限于pixyl、三苯甲基、苄基、p-甲氧基苄基(PMB)或叔丁基(t-Bu)。
其它保护基以及对适用于产生保护基及其去除的技术的详细描述被描述于Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，John Wiley&Sons，NewYork，NY，1999，和Kocienski，Protective Groups，Thieme Verlag，New York，NY，1994，这种公开通过引用并入本文。
包含手性X-膦酸酯部分的核酸前药的使用方法
由于稳定性、确定的手性和容易合成的组合，通过本发明方法获得的包含手性磷或硫代膦酸酯部分的立体确定的寡核苷酸前药用于许多应用领域。广泛地，通过本方法合成的化合物用作治疗剂、诊断探针和试剂、用于产生其它寡核苷酸产物的合成工具、和适合许多新材 料和计算应用的纳米结构材料。
本发明的立体确定的寡核苷酸前药相比于天然DNA/RNA等同物具有提高的血清稳定性，特别是硫代磷酸酯类的立体确定的寡核苷酸前药。而且，SP异构体比RP异构体更稳定。在一些实施方案中，血清稳定性水平通过在选定位置引入所有SP中心或SP中心而被调节以赋予降解抗性。在其它实施方案中，可选择的RP和/或SP立体中心的引入可以提供特定碱基与内源性或外源性靶的配对结合，由此保护靶免受代谢并增强特定的生物反应。
核糖核酸酶H活化还由立体控制的硫代磷酸酯核酸类似物的存在调节，天然DNA/RNA比RP立体异构体更敏感，而RP立体异构体比相应的SP异构体更敏感。
对RP硫代磷酸酯寡核苷酸观察到提高的向RNA的双链体稳定性，RP硫代磷酸酯寡核苷酸具有比相应SP寡核苷酸更大的双链体稳定性，而SP寡核苷酸表现出比天然DNA/RNA更高的稳定性。对SP观察到提高的向DNA的双链体稳定性，SP具有比RP更大的双链体稳定性，RP具有比天然DNA/RNA更高的稳定性(P.Guga，Curr.Top Med.Chem.，2007，7，695-713)。
在许多特定应用中，这些分子可用作治疗剂。它们可以被加入还含有标准DNA/RNA核苷的寡核苷酸中，或者它们可以作为本发明的立体控制的寡核苷酸的完整序列而被合成。一些类别的治疗剂包括但不限于反义寡核苷酸、与靶向序列形成三股螺旋以阻遏不期望的基因转录并调节蛋白表达和/或活性的反基因寡核苷酸、诱变寡核苷酸、DNA疫苗、适体、核酶、脱氧核酶(DNA酶或DNA酶)、siRNA、微小RNA、ncRNA(非编码RNA)和P-修饰的前药。调节包括间接或直接增加或减少蛋白活性或抑制或促进蛋白表达。这些核酸化合物可用于控制细胞增殖、病毒复制或任何其它细胞信号传导过程。
在一个实例中，siRNA治疗剂领域需要可以提供增加的抗核糖核酸酶活性的稳定性的寡核苷酸类，以相对于天然核苷构成的siRNA提高作用持续时间。此外，A形式螺旋形成似乎更多暗示进入RNAi比特定天生元件在寡核苷酸上存在的成功。这两个需求可以通过使用本 发明的立体控制的寡核苷酸来满足，本发明的立体控制的寡核苷酸可以提供增强的稳定性(Y-L Chiu，T.M.Rana RNA，2003，9，1034-1048)。
治疗方法
本文描述的核酸用作抗各种疾病状态的治疗剂，包括用作抗病毒剂。核酸可以用作通过调节DNA和/或RNA活性而治疗疾病的药剂。在一些实施方案中，核酸可用于抑制特定基因表达。例如，核酸可以与特定靶信使RNA(mRNA)序列互补。它们可用于抑制众多病毒的病毒复制。示例性的病毒家族包括正黏病毒、痘病毒、疱疹病毒、乳头状瘤病毒、小核糖核酸病毒、黄病毒、逆转录病毒、肝炎病毒、副粘病毒、呼肠孤病毒、细小病毒、丝状病毒、冠状病毒、沙粒病毒、棒状病毒和腺病毒。其它病毒家族是已知的，并且还在本文涵盖。其它实例包括用作抗HIV RNA或其它逆转录病毒RNA的反义化合物或用于与编码tat蛋白的HIV mRNA或HIV mRNA的TAR区杂交。在一些实施方案中，核酸模拟HIV mRNA的TAR区的二级结构并由此结合tat蛋白。在一个实施方案中，核酸用于通过使细胞与通式1化合物接触而抑制靶蛋白的表达，其中细胞中其它蛋白的表达不受抑制或者最低限度地受到抑制。在一些实施方案中，靶蛋白抑制在哺乳动物体内发生。在其它实施方案中，治疗有效量的通式1化合物被施用以抑制靶蛋白的表达。
表达可以被调节的蛋白的其它实例包括Jun N-末端激酶(JNK)蛋白、二酰基甘油酰基转移酶I、载脂蛋白B、胰高血糖素受体、AuroraB、酰基CoA胆固醇酰基转移酶-2、c-反应蛋白、STAT(转录的信号转导子和激活子)蛋白家族和MDR P-糖蛋白。核酸可用于抑制蛋白磷酸酶1B(PTP1B)表达、RNA依赖性RNA病毒聚合酶。核酸可用于在癌细胞中诱导诸如细胞凋亡的事件，或者使细胞更容易细胞凋亡。核酸可用于调节蛋白活性。例如，它可以帮助调节靶向多药抗性(MDR)RNA分子的核糖核酸酶H活性。
另一方面，本发明提供在需要这种治疗的受试者(例如，哺乳动物，例如人)中治疗由不期望的基因表达介导的疾病的方法。“疾病”意思是疾病或疾病症状。该方法包括给受试者施用有效量的本发明的非外消 旋的前寡核苷酸。
由不期望的基因表达介导的疾病的实例包括癌症(例如，白血病、肿瘤和转移)、过敏、哮喘、肥胖、炎症(例如，炎症疾病，例如炎症呼吸道疾病)、高胆固醇血症、血液系统疾患、严重急性呼吸综合征(SARS)、呼吸道堵塞疾病、哮喘、自身免疫疾病、逆转录疾病例如AIDS或HIV、其它病毒感染、宫内感染、代谢疾病、感染(例如，细菌、病毒、酵母、真菌感染)、CNS疾病、脑肿瘤、退行性神经疾病、心血管疾病、和与血管生成、新血管形成和血管发生相关的疾病。
在示例性实施方案中，化合物用于治疗癌症(包括胰腺癌)和涉及异常细胞增殖的其它疾病或疾患。
位于上腹(腹膜后腔)的胰腺是消化和内分泌系统的双功能腺体。在某些情况下，胰腺发挥内分泌腺体的作用(例如，产生几种重要的激素)。在某些情况下，胰腺发挥外分泌腺体的作用(例如，分泌含有消化酶的液体，其穿过小肠)。
在美国，胰腺癌是癌症死亡的第四大原因(排在肺癌、结肠癌和乳腺癌之后)，占所有癌症相关死亡的6％。在2008年，在美国估计有37,680个新胰腺癌病例被诊断，34,290死亡。疾病发病率在50岁之后直线上升，唯一确定的风险因素是吸烟(吸烟者发生疾病的可能性是不吸烟者的四倍)。侵入性胰腺癌通常是致命的。所有患者的总体中值存活时间是4-6个月。相对的1年存活率是24％；总体5年存活率＜5％。
胰腺癌在早期是无症状的，并且经常持续几个月未确诊(少于三分之一的患者在出现症状的2个月内被诊断)。在某些情况下，被延迟的诊断导致(部分或完全)癌细胞向肝或淋巴结转移。
目前，手术(胰腺切除)是胰腺癌的首要且唯一治愈性疗法。然而，仅15-25％的肿瘤在诊断时可切除，并且仅10-20％的经历手术的患者存活超过2年。一旦发生肿瘤侵润并累及其它组织，手术就不再可能了。
在某些情况下，糖尿病或胰腺炎使个体容易发生多个胰腺细胞的增殖性疾患。在某些情况下，由于选自由遗传非息肉性结肠直肠癌(HNPCC)和家族性腺瘤性息肉(FAP)组成的组的遗传综合征，个体处于 发生许多胰腺细胞的增殖性疾患的增加的风险。在某些情况下，由于在选自由MSH2、MSH6、MLH1和APC组成的组的基因中的突变，个体处于发生许多胰腺细胞的增殖性疾患的增加的风险。
理想地，胰腺癌的有效治疗应该(i)最初并后续控制原发性肿块，和(ii)治疗转移性肿瘤细胞。化学预防(施用诸如药物、生物制剂、营养剂等等物质)显示逆转或抑制癌变的进展，从而降低发生侵入性或临床显著疾病的风险。
在某些实施方案中，本文公开了治疗胰腺癌的方法。如本文使用的，“胰腺癌”包括胰腺的癌症形式。在一些实施方案中，胰腺癌是转移性胰腺癌。在一些实施方案中，胰腺癌是癌、肉瘤、癌症或其组合。在一些实施方案中，待治疗的胰腺癌包括偶发和遗传的胰腺癌。在一些实施方案中，胰腺癌是导管细胞癌、腺泡细胞癌、乳头状粘液性癌、印戒癌、腺鳞癌、未分化的癌、粘液癌、巨大细胞癌、小细胞癌、囊肿癌、浆液性囊肿癌、粘液性囊肿癌、未分类胰腺癌、胰胚细胞瘤或其组合。
在一些实施方案中，需要治疗胰腺癌的个体出现局部胰腺肿瘤。在一些实施方案中，需要治疗胰腺癌的个体出现阴性区域淋巴结活检。在一些实施方案中，需要治疗胰腺癌的个体出现阳性区域淋巴结活检。在一些实施方案中，需要治疗胰腺癌的个体出现淋巴结阴性胰腺肿瘤(例如淋巴结阴性)。在一些实施方案中，需要治疗胰腺癌的个体出现淋巴结阳性肿瘤(例如淋巴结阳性)。
在一些实施方案中，需要治疗胰腺癌的个体中的胰腺癌转移至体内其它位置。在一些实施方案中，胰腺癌转移至选自由淋巴结、胃、胆管、肝、骨、卵巢、腹膜和脑组成的组的位置。
在一些实施方案中，癌细胞或癌前期细胞通过组织样品(例如，活检样品)的组织学分型或分级来鉴定。在一些实施方案中，癌细胞或癌前期细胞通过使用适当的分子标记来鉴定。
在一些实施方案中，需要治疗胰腺癌的个体的胰腺癌根据美国癌症联合委员会(AJCC)TNM分类系统分期，其中肿瘤(T)被指定Tx、T1、T2、T3、T4期；并且其中区域淋巴结(N)被指定NX、N0、N1期；并 且其中远距离转移(M)被指定MX、M0或M1期。在一些实施方案中，需要治疗胰腺癌的个体的胰腺癌被分期为0、I、IA、IB、II、IIA、IIB、III和IV期胰腺癌。在一些实施方案中，需要治疗胰腺癌的个体的胰腺癌被分期为GX级(例如，等级不能被评估)、1级、2级、3级或4级。
用本发明化合物治疗的癌症的更具体实例包括乳腺癌、肺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、鳞状细胞癌、成交质细胞癌、卡波济肉瘤、多发性骨髓瘤和白血病。
癌症评价和治疗
术语“肿瘤细胞抗原”在本文定义为以比不相关的肿瘤细胞、正常细胞或正常体液中更大的量存在于肿瘤细胞上或体液中的抗原。抗原的存在可以通过本领域技术人员已知的许多分析法来测试，包括但不限于抗体的阴性和/或阳性选择，例如ELISA分析、放射性免疫分析或通过Western印迹。
“凋亡诱导剂”在本文定义为诱导凋亡/程序性细胞死亡，并且包括例如抗癌剂和其中细胞(例如肿瘤细胞)被诱导经历程序性细胞死亡的治疗。示例性的凋亡诱导剂在下文更详细描述。
术语“凋亡”或“程序性细胞死亡”指在发育和其它正常的生物学过程中消除不想要的或无用的细胞的生理过程。凋亡是在正常生理条件下发生的细胞死亡模式，并且细胞是其自行死亡(“细胞自杀”)的积极参与者。它最常见于正常细胞翻转和组织动态平衡、胚胎形成、诱导和维持免疫耐受性、神经系统发育和内分泌依赖性组织萎缩期间。经历凋亡的细胞显示特征形态和生化特征。这些特征包括染色质聚集、细胞核和细胞质浓缩、细胞质和细胞核分配入含有核糖体的膜结合的小囊泡(凋亡小体)、形态完整的线粒体和核质。在体内，这些凋亡小体被快速识别并被巨噬细胞、树突细胞或相邻的上皮细胞吞噬。由于这种用于体内去除凋亡细胞的有效机制，没有引发炎症反应。在体外，凋亡小体以及剩余的细胞片段最终溶胀并最后溶解。这种体外细胞死亡的终末期被称为“继发性坏死”。凋亡可以通过本领域技术人员已知的方法测量，所述方法如DNA片段化、膜联蛋白V暴露、胱天蛋白 酶活化、细胞色素c释放、等等。已经被诱导死亡的细胞在本文称为“凋亡细胞”。
凋亡还可以使用标准膜联蛋白V凋亡分析测试：NIH：OVCAR-3细胞在6孔板(NUNC)中生长并用拮抗剂(或与另一种抗癌药物组合)照射或治疗4-48小时，洗涤并用膜联蛋白V-FITC(BD-Pharmingen)染色1小时。细胞通过流式细胞术(Becton-Dickinson，CellQuest)分析，用碘化丙啶复染，并再次用流式细胞仪分析。
可以在一个或多个时间点评价患者的症状，时间点包括治疗方案之前、治疗方案期间和治疗方案之后。治疗可以导致改善受试者病症，并且可以通过确定是否出现以下因素来评价：降低的肿瘤尺寸、降低的细胞增殖、降低的细胞数目、降低的新血管形成、增加的凋亡或至少一部分肿瘤细胞的降低的存活。这些事件的一个或多个在一些情况下导致癌症的部分或完全消除和患者存活的延长。可选地，对于终末期癌症，治疗可以导致疾病停止、更好的生活质量和/或存活延长。
分析细胞迁移的方法
有关细胞迁移的分析描述于文献，例如Brooks，等人.，J.Clin.Invest 1997，99：1390-1398，并且用于测量细胞迁移的方法是本领域技术人员已知的。在测量本文描述的细胞迁移的一种方法中，来自内皮细胞细胞迁移室的膜用基底包被，内皮细胞被洗涤，并且非特异性结合位点被BSA封闭。来自近汇合培养物的肿瘤细胞被收集、洗涤并重悬于存在或不存在测定抗体的迁移缓冲液。使肿瘤细胞迁移至包被的内皮细胞膜下侧之后，保留在膜上侧的细胞被去除，并且迁移至下侧的细胞用结晶紫染色。然后通过对每个显微镜视野直接细胞计数来定量细胞迁移。
分析肿瘤生长的方法
肿瘤生长可以通过本领域技术人员已知的方法分析，例如SCID小鼠模型、裸小鼠模型和具有同基因肿瘤的BALB/c小鼠。有关肿瘤生长的SCID小鼠模型进行如下：近汇合的人M21黑素瘤细胞(或任何期望的肿瘤细胞类型)被首席、洗涤并悬浮于无菌PBS(20x106/mL)。SCID小鼠被皮下注射100μL M21人黑素瘤细胞(2x106)悬浮液。肿 瘤细胞注射后三天，小鼠未治疗或用期望剂量范围内的拮抗剂腹腔内治疗。小鼠每天治疗，持续24天。肿瘤尺寸用测径器测量，并使用公式V＝(L x W2)/2估算体积，其中V等于体积，L等于长度，W等于宽度。
可选地，裸小鼠模型、SCID小鼠模型和/或BALB/c同基因小鼠模型也可用于评价肿瘤生长和人源化抗内皮糖蛋白抗体或本文描述的抗原结合片段对它的抑制。
分析细胞增殖的方法
可以通过本领域技术人员已知的方法评价细胞增殖。如本文描述的，近汇合的人内皮细胞(HUVEC)可以在存在或不存在来自ECV或ECVL细胞的CM(25μL)下重悬于含有低(5.0％)血清的增殖缓冲液，并且允许内皮细胞增殖24小时。可以通过使用可商业途径获得的WST-1测定试剂盒(Chemicon)测量线粒体脱氢酶活性来定量增殖。而且，如本文描述的，增殖可以通过使用标准方法测量3H掺入来定量(She等人.，Int.J.Cancer，108：251-257(2004))。
评估细胞增殖的其它方法是本领域已知的并且在此被考虑。其它非限制性实例在实施例中更详细描述。
将理解，本文描述的分类和分期系统代表评价本文描述的癌症治疗的一种方式；此外，其它分期方案是本领域已知的，并且可以与本文描述的方法一起使用。仅作为实例，恶性肿瘤的TNM分类可用作癌症分期系统以描述患者身体中癌症的程度。T描述肿瘤的大小以及它是否侵入了附近组织，N描述了涉及的区域淋巴结，M描述了远距离转移。TNM由国际抗癌联盟(UICC)维持，并且由美国癌症联合委员会(AJCC)和国际妇产科联合会(FIGO)使用。要理解，并非所有肿瘤具有TNM分类，例如脑肿瘤。一般而言，T(a是(0)，1-4)被测量为原发性肿瘤的大小或直接程度。N(0-3)指向区域淋巴结扩散的程度：N0表示肿瘤细胞不存在于区域淋巴结，N1表示向最近或小数量的区域淋巴结的肿瘤细胞扩散，N2表示程度在N1和N3之间的肿瘤细胞扩散；N3表示向最远或大量区域淋巴结的肿瘤细胞扩散。M(0/1)指转移的存在：M0表示不存在远距离转移；M1表示转移发生在远端器官(远离区 域淋巴结)。还可以评价其它参数。G(1-4)指癌细胞等级(即，如果它们表现类似于正常细胞则它们是低等级，如果它们表现为低分化则是高等级)。R(0/1/2)指操作完成(即，没有肿瘤细胞或相反的切除边界)。L(0/1)指侵入淋巴管。V(0/1)指侵入血管。C(1-4)指V的确定性(质量)的修改者。
本文提供了用于降低、抑制癌细胞生长或杀伤癌细胞的方法，包括使细胞与有效降低、抑制癌细胞生长或杀伤癌细胞的量的本文描述的化合物接触。
本文提供了在个体中抑制肿瘤尺寸增加、减小肿瘤尺寸、减少肿瘤增殖或预防肿瘤增殖的方法，包括给所述个体施用有效量的本文描述的化合物以抑制肿瘤尺寸增加、减小肿瘤尺寸、减少肿瘤增殖或预防肿瘤增殖。在一些情况下，肿瘤治疗包括症状停止，即，通过治疗患者，癌症不恶化，并且患者存活被延长。
可以在一个或多个时间点评价患者的症状，时间点包括治疗方案之前、治疗方案期间和治疗方案之后。治疗可以导致改善受试者病症，并且可以通过确定是否出现以下事件来评价：降低的肿瘤尺寸、降低的细胞增殖、降低的细胞数目、降低的新血管形成和/或增加的凋亡。这些事件的一个或多个在一些情况下导致癌症的部分或完全消除和患者存活的延长。可选地，对于终末期癌症，治疗可以导致疾病停止、更好的生活质量和/或存活延长。评价治疗的其它方法是本领域已知的并且在此被考虑。
在示例性实施方案中，本发明的前寡核苷酸化合物被施用给罹患特征为存在一类不希望的细胞的医学疾患例如癌症或非恶性病症的受试者，例如哺乳动物(例如人)。
可以评估使用本文描述的方法治疗的患者的主要结果量度，例如，无进展存活。在一个实施方案中，与无治疗相比，发现无进展存活的增加量是约2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或更多。在另一个实施方案中，与无治疗相比，无进展存活的增加被增加约3个月、约6个月、约9个月、约12个月、约18个月、约2年、约3年、约4年、约5年或更长的存活。
次要结果量度也可以被评估，并且包括响应持续时间、肿瘤进展时间、总体存活、严重和不严重的不良事件。例如，治疗可以预防疾病进展(即，停止)，或者可以导致改善。可选地或此外，其它目标可以对以下一个或多个测量：降低的肿瘤负荷、降低的新血管形成、降低的副作用、降低的不良反应、和/或增加的患者依从性。
其治疗通过本发明化合物或组合物治疗或预防的疾病或疾患的其它具体实例包括但不限于移植排斥(例如，肾、肝、心脏、肺、岛细胞、胰腺、骨髓、角膜、小肠、皮肤同种异体移植物或异种移植物和其它移植物)、移植物抗宿主疾病、骨关节炎、类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、糖尿病视网膜病、炎性肠病(例如，Crohn病、溃疡性结肠炎和其它肠病)、肾病、恶病质、脓毒性休克、狼疮、重症肌无力、牛皮鲜、皮肤炎、湿疹、皮脂溢、阿尔茨海默病、帕金森病、化疗期间干细胞保护、自体或同种异体骨髓移植的体外选择或体外净化、眼病、视网膜病(例如，黄斑变性、糖尿病性视网膜病和其它视网膜病)、角膜疾病、青光眼、感染(例如，细菌、病毒或真菌)、心脏病，包括但不限于再狭窄。
核糖核酸酶L的活化
2′-5′寡腺苷酸(2-5A)/核糖核酸酶L途径是由干扰素诱导的酶促途径之一。核糖核酸酶L在结合至2’-5’腺苷酸的5’-磷酸化片段之后被活化。这些2’-5’腺苷酸(2-5A)的片段在2’-5’寡(A)合酶控制下生成。该途径是天然免疫系统的一部分，并且在预防病毒感染中具有重要作用。2-5A-诱导的单链RNA裂解导致凋亡。2-5A的生物稳定的硫代磷酸酯类似物已经显示是核糖核酸酶L的有效活化剂(Xianh等人.，Cancer Research(2003)，63：6795-6801)。在该研究中，2-5A类似物诱导核糖核酸酶L活性，并且引起晚期转移性人前列腺癌细胞系DU145、PC3和LNCaP的培养物凋亡。
核糖核酸酶L的持续活化引发凋亡的线粒体途径，该途径消除病毒感染的细胞以及癌/肿瘤细胞。核糖核酸酶L可以抑制纤维肉瘤生长、前列腺癌生长、结肠直肠癌生长和胰腺癌生长。考虑到核糖核酸酶L在不同癌症中的共同作用，考虑本文描述的发明可用于治疗任何 类型的癌症。Silverman，RH，Cytokine Growth Factor Rev，18(5-6)：381-388(2007)；Bisbal，C.和Silverman，RH，Biochimie.89(6-7)：789-798(2007)。作为例子，核糖核酸酶L的下调指编码核糖核酸酶L的基因表达水平的任何下降，编码核糖核酸酶L的基因沉默，包括核糖核酸酶L的蛋白的表达/翻译水平下降，细胞中存在的核糖核酸酶L的量减少，和/或与示例性健康群体中核糖核酸酶L的预定水平相比核糖核酸酶L活性的任何降低。可选地，本文描述的核糖核酸酶L水平的任何降低可以指示核糖核酸酶L的下调。
在一个示例性实施方案中，本文描述的化合物用于治疗具有下调的核糖核酸酶L的疾病。在另一个实施方案中，与相关下调的核糖核酸酶L的疾病是癌症。在其它实施方案中，癌症是胰腺癌、前列腺癌或结肠直肠癌。可选地，本文描述的化合物用于治疗具有上调的核糖核酸酶L的疾病。在一个示例性实施方案中，具有上调的核糖核酸酶L的疾病是慢性疲劳综合征。具有上调的核糖核酸酶L的其它疾病是本领域已知的并在此被考虑。
当用作治疗剂时，本文描述的核酸作为药物组合物施用。在一些实施方案中，药物组合物包括治疗有效量的包含通式1的手性X-膦酸酯部分的核酸或其药物可接受的盐和至少一种药学上可接受的无活性成分，所述药学上可接受的无活性成分选自药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，药物组合物被配制用于静脉内注射、口服施用、口腔施用、吸入、鼻施用、局部施用、眼施用或耳施用。在其它实施方案中，药物组合物是片剂、丸剂、胶囊、液体、吸入剂、鼻喷雾溶液、栓剂、悬浮液、凝胶、胶体、分散液、悬浮液、溶液、乳状液、软膏、洗剂、滴眼剂或滴耳剂。
药物组合物和施用
另一方面，本发明提供了包含与药学上可接受的赋形剂混合的非外消旋的前寡核苷酸的药物组合物。本领域技术人员将发现，药物组合物包括上述非外消旋的前寡核苷酸的药物可接受的盐。
用于增强和靶向递送的化合物
本文描述的前寡核苷酸可以使用多种策略递送，包括寡核苷酸与各种配体的轭合物，以及使用纳米载体方法。任何核酸递送策略被考虑用于本文描述的前寡核苷酸。包括但不限于化学轭合物、阳离子脂质/脂质体转移媒介物和超分子纳米载体的示例性递送策略的选择取决于治疗环境，并且用于确定最佳递送形式的方法是本领域已知的并且在此被进一步考虑。
细胞穿透化合物(“CPC”)
已知许多化合物用作货物例如核酸的载体，并且有利于核酸在体内环境下进入细胞。示例性载体描述于Dietz等人.，Molecular&Cellular Neuroscience，27(2)：85-131(2004)，其在此通过引用并入本文。从Tat和触角足转录调节子衍生的原型CPC已经被大量新部分结合。作为例子，作为肽的CPC可以是相对短的(9-30个氨基酸)富含精氨酸和赖氨酸的聚阳离子肽或膜交互式疏水序列。CPC可以通过重组DNA技术连接或者化学偶联至包括CPC‘货物’的肽、寡核苷酸或纳米载体。
细胞靶向配体(“CTL”)
另一个策略是使用CTL递送寡核苷酸，CTL以高亲和力结合至能够经历有效内化的细胞表面受体。潜在配体包括抗体、衍生自噬菌体展示文库的多肽、和小有机分子。其它细胞包厢配体是本领域已知的或者将被开发并且被考虑用于本文描述的发明。因为各种受体经常在特定细胞类型上差异表达，该方法提供了对寡核苷酸试剂的提高的选择性的可能性。示例性受体靶包括但不限于脂蛋白受体(例如肝中的那些)、整联蛋白、受体酪氨酸激酶和G蛋白偶联受体(GPCR)超家族。
纳米载体
许多超分子纳米载体可以用于递送核酸。示例性纳米载体包括但不限于脂质体、阳离子聚合物复合物和各种聚合体。核酸与各种聚阳离子的复合是细胞内递送的另一种方法；这包括使用PEG化的聚阳离子、聚乙烯胺(PEI)复合物、阳离子嵌段共聚物和树状聚物。几种阳离子纳米载体包括PEI和聚酰胺树状聚物，帮助内容物从内涵提释放。其它方法包括使用聚合体纳米粒子、聚合物胶束、量子点和脂质体。
除了本文描述的示例性递送策略，其它核酸递送策略是已知的。
在治疗和/或诊断应用中，本发明化合物被配制用于多种施用方式，包括全身和局部或区域施用。技术和配制一般可以参见Remington，The Science and Practice ofPharmacy，(第20版.2000)。
根据本发明的化合物在宽剂量范围内有效。例如，在成年人的治疗中，每天0.01至1000mg、0.5至100mg、1至50mg和5至100mg的剂量是可以使用的剂量实例。确切剂量将取决于施用途径、化合物被施用的形式、待治疗的受试者、待治疗的受试者的体重、和主治医师的偏好和经验。
药物可接受的盐是本领域普通技术人员公知的，并且可以包括例如但不限于乙酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate)、苯磺酸盐(besylate)、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、乙二胺四乙酸钙、右旋樟脑磺酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯月桂硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酰对氨基苯胂酸盐、己基间苯二酚酸盐、哈胺、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、扑酸盐(双羟萘酸盐)、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式醋酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、单宁酸盐、酒石酸盐或茶氯酸盐。其它药物可接受的盐可以参见例如Remington，The Science and Practice of Pharmacy(第20版.2000)。优选的药物可接受的盐包括例如乙酸盐、苯甲酸盐、溴化物、碳酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、扑酸盐(双羟萘酸盐)、磷酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐或酒石酸盐。
根据被治疗的特定病症，这种药剂可以被配制成液体或固体剂型，并且被全身或区域施用。如本领域技术人员已知的，药剂可以例如以延时或持续低释放形式递送。用于配制和施用的技术可以参见Remington，The Science and Practice of Pharmacy(第20版.2000)。适合的途径可以包括口服、口腔、通过吸入喷雾、舌下、直肠、经皮、阴道、经粘膜、鼻或肠施用；胃肠外递送，包括肌肉内、皮下、髓内 注射以及鞘内、直接脑室内、静脉内、关节内、胸骨内、滑膜内、肝内、病灶内、颅内、腹膜内、鼻内或眼内注射或其它递送方式。
为了注射，本发明药剂可以在水溶液中配制和稀释，例如在生理相容的缓冲液中，例如Hank溶液、林格式溶液或生理盐水缓冲液。为了这种经粘膜施用，制剂中使用了适合待穿透障碍的渗透剂。此类渗透剂是本领域公知的。
使用药学上可接受的惰性载体将为实施本发明而在本文公开的化合物配制成适合全身施用的剂型在本发明范围内。适当选择载体和适合的生产实践，本发明组合物，特别是配制为溶液的那些，可以胃肠外施用，例如通过静脉内注射。化合物可以使用本领域公知的药学上可接受的载体容易配制成适合口服施用的剂型。此类载体使本发明化合物能够被配制成片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，用于待治疗受试者(例如患者)的口服摄入。
对于鼻或吸入递送，本发明药剂还可以通过本领域技术人员已知的方法配制，并且可以包括例如但不限于增溶剂、稀释剂或分散剂的实例，例如盐水、防腐剂例如苄基醇、吸收促进剂和氟碳化合物。
适用于本发明的药物组合物包括其中包含实现其预期目的的有效量的活性成分的组合物。有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内，特别是参考本文提供的详细公开。
除了活性成分外，这些药物组合物可以含有适合的药学上可接受的载体，包括赋形剂和助剂，其促进活性化合物加工成可以药学使用的制剂。为口服施用配制的制剂可以是片剂、锭剂、胶囊或溶液的形式。
用于口服使用的药物制剂可以通过以下步骤获得：将活性化合物与固体赋形剂混合，任选地研磨得到的混合物，并在添加可能需要的适合助剂之后加工颗粒混合物以获得片剂或锭剂核心。具体说，适合的赋形剂有填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖或山梨糖醇；纤维素制剂，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、土豆淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羧基甲基纤维素钠(CMC)和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP：聚维酮)。如果需要，可以添加崩解 剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，例如藻酸钠。
锭剂核心被提供有适合的包衣。为此目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇(PEG)和/或二氧化钛、漆溶液和适合的有机溶剂或溶剂混合物。染料或色素可以被添加至片剂或锭剂包衣以识别或表征不同的活性化合物剂量组合。
可口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推合式胶囊，以及由明胶和增塑剂例如甘油或山梨糖醇制成的软密封胶囊。推合式胶囊可以含有与填充剂例如乳糖、粘合剂例如淀粉、和/或润滑剂例如滑石或硬脂酸镁、和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可以被溶解或悬浮于适合的液体，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇(PEG)。此外，可以添加稳定剂。
根据待治疗或预防的特定病症或疾病状态，被正常施用以治疗或预防该病症的其它治疗剂可以与本发明抑制剂一起施用。例如，化疗剂或其它抗增殖剂可以与本发明抑制剂组合以治疗增殖性疾病和癌症。显示的化疗剂的实例包括但不限于阿霉素、地塞米松、长春新碱、环磷酰胺、氟尿嘧啶、托泊替康、紫杉酚、干扰素和铂衍生物。
还可以与本发明的非外消旋的前寡核苷酸组合的药剂的其它实例包括但不限于抗炎剂，例如皮质类固醇、TNF阻断剂、IL-1RA、硫唑嘌呤、环磷酰胺和硫氮磺胺吡啶；免疫调节剂和免疫抑制剂，例如环孢霉素、他克莫司、纳巴霉素、霉酚酸酯、干扰素、皮质类固醇、环磷酰胺、硫唑嘌呤和硫氮磺胺吡啶；神经元营养因子，例如乙酰胆碱酯酶抑制剂、MAO抑制剂、干扰素、抗惊厥剂、离子通道阻断剂、利鲁唑和抗帕金森病剂；用于治疗心血管疾病的药剂，例如β-阻断剂、ACE抑制剂、利尿剂、硝酸盐、钙通道阻断剂和抑制素；用于治疗肝病的药剂，例如皮质类固醇、消胆胺、干扰素和抗病毒剂；用于治疗血液疾患的药剂，例如皮质类固醇、抗白血病剂和生长因子；用于治疗糖尿病的药剂，例如胰岛素、胰岛素类似物、α葡糖苷酶抑制剂、双胍类和胰岛素增敏剂；和用于治疗免疫缺陷疾患的药剂，例如γ球蛋白。
这些额外药剂可以与含有非外消旋的前寡核苷酸的组合物分开施用或者作为多剂量方案的一部分。可选地，这些药剂可以是单剂量形式的部分，在单一组合物中与非外消旋的前寡核苷酸混合在一起。
以下提供的实施例和制备进一步示例说明和例证了本发明化合物和制备此类化合物的方法。要理解，本发明范围不以任何方式受以下实施例和制备的限制。
实施例
实施例1：方案A示例描述了(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-4tt]的合成。
方案A
8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷-3′-基膦酸酯(1t)(100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水吡啶(1mL)。添加N，N’-双(2-氧-3-噁唑烷基)膦酰氯(BopCl；500μmol)，混合物被搅拌5分钟。氨基醇(L-2)(100μmol)溶液与无水吡啶反复共蒸发并溶解于无水吡啶(1mL)。通过注射器向 反应混合物滴加氨基醇溶液，混合物在氩气下搅拌5分钟。3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷3t利用与无水吡啶的反复共蒸发而被干燥并溶解于100μmol吡啶。上述混合物通过插管添加至3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷3t的无水(100μmol)吡啶溶液。5分钟后，添加N-三氟乙酰基咪唑(CF3COIm；200μmol)。再经30秒之后，添加N，N’-二甲基秋兰姆二硫化物(DTD；120μmol)。再经3分钟之后，混合物被真空干燥。向残余物添加浓NH3(10mL)，混合物在55℃下加热12小时。然后使混合物冷却至室温，然后减压浓缩至干燥。混合物用CHCl3(5mL)稀释，用0.2M磷酸盐缓冲液(pH 7.0，5mL)洗涤。水层用CHCl3(2×5mL)反萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩至干燥。残余物通过PTLC纯化。产物溶解于CHCl3(5mL)，用0.2M 1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯碳酸氢盐缓冲液(5mL)洗涤，并用CHCl3(2×5mL)反萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并浓缩至干燥而得到(SP)-4tt。
实施例2.(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-脱氧腺苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-4at]的合成
(SP)-4at获自1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-脱氧腺苷-3′-基膦酸酯(1a)，替代1t，使用实施例1和方案A中针对(SP)-4tt描述的反应步骤。
实施例3.(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯4-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-脱氧胞苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-4ct]的合成
(SP)-4ct获自1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯4-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-脱氧胞苷-3′-基膦酸酯(1c)，替代1t，使用实施例1和方案A中针对(SP)-4tt描述的反应步骤。
实施例4.(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)脱氧鸟苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-4gt]的合成
(SP)-4gt获自1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯2-N-苯氧基乙酰 基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)脱氧鸟苷-3′-基膦酸酯(1g)，替代1t，使用实施例1和方案A中针对(SP)-4tt描述的反应步骤。
实施例5.(RP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基硫代磷酸酯[(Rp)-4tt]的合成
(RP)-4tt通过实施例1和方案A中针对(SP)-4tt的合成而描述的转化而生成，使用氨基醇D-2作为手性试剂替代L-2。
实施例6.(RP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)脱氧腺苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基硫代磷酸酯[(RP)-4at]的合成
(RP)-4at通过实施例2中描述的转化而生成，使用化合物1a和氨基醇D-2作为手性试剂替代L-2。
实施例7.(RP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯4-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)脱氧胞苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基硫代磷酸酯[(RP)-4ct]的合成
(RP)-4ct通过实施例3中描述的转化而生成，使用化合物1c和氨基醇D-2作为手性试剂替代L-2。
实施例8.(RP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)脱氧鸟苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基硫代磷酸酯[(RP)-4gt]的合成
(RP)-4gt通过以上实施例4中描述的转化而生成，使用化合物1g和氨基醇D-2作为手性试剂替代L-2。
方案B
实施例9.(RP)-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基H-膦酸酯[(RP)-7tt]的合成，如方案B所述。
1t(100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水吡啶(1mL)。添加N，N’-双(2-氧-3-噁唑烷基)膦酰氯(BopCl；500μmol)，混合物被搅拌5分钟。通过注射器向混合物滴加氨基醇((αR，2S)-6)(100μmol)溶液，氨基醇已经通过与无水吡啶共蒸发而被干燥并溶解于无水吡啶(1mL)，混合物在氩气下搅拌5分钟。3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷利用与无水吡啶的反复共蒸发而被干燥，并溶解于100μmol吡啶。上述混合物通过插管添加至3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷3t的无水(100μmol)吡啶溶液。15分钟之后，混合物被减压浓缩。残余物用CH2Cl2(5mL)稀释，用饱和NaHCO3(3×5mL)洗涤。合并的水层用CH2Cl2(2×5mL)反萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩至大约1mL。在0℃下通过注射器向搅拌的1％三氟乙酸(TFA)的无水CH2Cl2(20mL)溶液滴加残余物。另外5分钟之后，混合物用无水CH2Cl2(100mL)稀释，用饱和NaHCO3水溶液(2×100mL)洗涤。合并的水层用CH2Cl2(2×100mL)反萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩至干燥而得到粗品(RP)-7tt。
实施例10.(RP)-6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)脱氧腺苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基H-膦酸酯 [(RP)-7at]的合成
粗品(RP)-7at如实施例9所述被生成，使用1a替代1t。
实施例11.(RP)-4-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)脱氧胞苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基H-膦酸酯[(RP)-7ct]的合成
粗品(RP)-7ct如实施例9所述被生成，使用1c替代1t。
实施例12.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)脱氧鸟苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基H-膦酸酯[(RP)-7gt]的合成
粗品(RP)-7gt如实施例9所述被生成，使用1g替代1t。
实施例13.(SP)-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基H-膦酸酯[(SP)-7tt]的合成
粗品(SP)-7tt如实施例9所述被生成，使用替代(αR，2S)-6作为手性试剂的(αS，2R)-6。
实施例14.(SP)-6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)脱氧腺苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基H-膦酸酯[(SP)-7at]的合成
粗品(SP)-7at如实施例9所述被生成，使用化合物1a和(αS，2R)-6替代(αR，2S)-6作为手性试剂。
实施例15.(SP)-4-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)脱氧胞苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基H-膦酸酯[(SP)-7ct]的合成
粗品(SP)-7ct如实施例9所述被生成，使用化合物1c和(αS，2R)-6替代(αR，2S)-6作为手性试剂。
实施例16.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)脱氧鸟苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基H-膦酸酯[(SP)-7gt]的合成
粗品(SP)-7gt如实施例9所述被生成，使用化合物1g替代1t，和化合物(αS，2R)-6替代化合物(αR，2S)-6作为手性试剂。
方案C
实施例17.(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-10uu]的合成
1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-3′-基膦酸酯(8u)(100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水吡啶(1mL)。添加N，N’-双(2-氧-3-噁唑烷基)膦酰氯(BopCl；500μmol)，混合物被搅拌5分钟。通过注射器向混合物滴加氨基醇(L-2)(100μmol)溶液，氨基醇已经通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥并溶解于无水吡啶(1mL)，混合物在氩气下搅拌5分钟。2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷9u通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，并溶解于100μmol吡啶。然后，上述混合物通过插管添加至2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷9u(100μmol)的溶液。10分钟之后，添加N-三氟乙酰基咪唑(CF3COIm；200μmol)。另外30s之后，添加N，N’-二甲基秋兰姆二硫化物(DTD；120μmol)。另外3分钟之后，混合物被真空干燥。向残余物添加浓NH3-EtOH(3∶1，v/v，10mL)，混合物被搅拌12小时，然后减压下浓缩至干燥。然后，混合物用CHCl3(5mL) 稀释，并用0.2M磷酸盐缓冲液(pH 7.0，5mL)洗涤。水层用CHCl3(2×5mL)反萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩至干燥。残余物通过PTLC纯化。产物溶解于CHCl3(5mL)，用0.2M 1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯碳酸氢盐缓冲液(5mL)洗涤，并用CHCl3(2×5mL)反萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并浓缩至干燥而得到(SP)-10uu。
实施例18.(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)腺苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-10au]的合成
(SP)-10au如实施例17所述被生成，使用1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)腺苷-3′-基膦酸酯(8a)替代8u。
实施例19.(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯4-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胞苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-10cu]的合成
(SP)-10cu如实施例17所述被生成，使用1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯4-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胞苷-3′-基膦酸酯(8c)替代8u。
实施例20.(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)鸟苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-10gu]的合成
(SP)-10gu如实施例17所述被生成，使用1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)鸟苷-3′-基膦酸酯(8g)替代8u。
实施例21.(RP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基硫代磷酸酯[(RP)-10uu]的合成
(Rp)-10uu如实施例17所述被生成，使用手性试剂D-2替代手性试剂L-2。
实施例22.(RP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)腺苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基硫代磷酸酯[(RP)-10au]的合成
(RP)-10au如实施例17所述被生成，使用8a替代8u和手性试剂D-2替代手性试剂L-2。
实施例23.(RP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯4-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胞苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基硫代磷酸酯[(RP)-10cu]的合成
(RP)-10cu如实施例17所述被生成，使用替代8u的8c和替代手性试剂L-2的手性试剂D-2。
实施例24.(RP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)鸟苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基硫代磷酸酯[(RP)-10gu]的合成
(RP)-10gu如实施例17所述被生成，使用替代8u的8g和替代手性试剂L-2的手性试剂D-2。
方案D
实施例25.(RP)-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基H-膦酸酯[(RP)-12uu]的合成
8u(100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水吡啶(1mL)。添加N，N’-双(2-氧-3-噁唑烷基)膦酰氯(BopCl；500μmol)，混合物被搅拌5分钟。通过注射器向混合物滴加氨基醇((αR，2S)-6)(100μmol)溶液，所述氨基醇通过与无水吡啶共蒸发而被干燥并溶解于无水吡啶(1mL)，混合物在氩气下搅拌5分钟。然后，混合物通过插管添加至9u(100μmol)的溶液，该溶液通过与无水吡啶反复共蒸发并溶解于吡啶来制备。15分钟之后，混合物被减压浓缩。残余物用CH2Cl2(5mL)稀释，并用饱和NaHCO3(3×5mL)洗涤。合并的水层用CH2Cl2(2×5mL)反萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩至大约1mL。残余物在0℃下通过注射器滴加至搅拌的1％三氟乙酸(TFA)的无水CH2Cl2(20mL)溶液。另外5分钟之后，混合物用无水CH2Cl2(100mL)稀释，并用饱和NaHCO3水溶液(2×100mL)洗涤。合并的水层用CH2Cl2(2×100mL)反萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩至干燥而得到粗品(Rp)-12uu，其通过31P NMR分析。
实施例26.(RP)-6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)腺苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基H-膦酸酯[(RP)-12au]的合成
粗品(RP)-12au如实施例25所述而生成，使用替代8u的8a。
实施例27.(RP)-4-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胞苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′基H-膦酸酯[(RP)-12cu]的合成
粗品(RP)-12cu如实施例25所述而生成，使用替代8u的8c。
实施例28.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)鸟苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基H-膦酸酯[(RP)-12gu]的合成
粗品(RP)-12gu如实施例25所述而生成，使用替代8u的8g。
实施例29.(SP)-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基H-膦酸酯[(SP)-12uu]的合成
粗品(SP)-12uu如实施例25所述而生成，使用替代手性试剂(αR，2S)-6的手性试剂(αS，2R)-6。
实施例30.(SP)-6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)腺苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基H-膦酸酯[(SP)-12au]的合成
粗品(SP)-12au如实施例25所述而生成，使用替代8u的8a和替代手性试剂(αR，2S)-6的手性试剂(αS，2R)-6。
实施例31.(SP)-4-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胞苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基H-膦酸酯[(SP)-12cu]的合成
粗品(SP)-12cu如实施例25所述而生成，使用替代8u的8c和替代手性试剂(αR，2S)-6的手性试剂(αS，2R)-6。
实施例32.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)鸟苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基H-膦酸酯[(SP)-12gu]的合成
粗品(SP)-12gu如实施例25所述而生成，使用替代8u的8g和替代手性试剂(αR，2S)-6的手性试剂(αS，2R)-6。
方案E
实施例33.(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(叔丁基二 苯基甲硅烷基)-3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-2′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-14uu]的合成
1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-3′-基膦酸酯(13u)(100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水吡啶(1mL)。添加N，N’-双(2-氧-3-噁唑烷基)膦酰氯(BopCl；500μmol)，混合物被搅拌5分钟。通过注射器向混合物滴加氨基醇(L-2)(100μmol)溶液，所述氨基醇通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥并溶解于无水吡啶(1mL)，混合物在氩气下搅拌5分钟。2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷9u通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥并溶解于100μmol吡啶。然后，上述混合物通过插管添加至2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷9u(100μmol)的溶液。10分钟之后，添加N-三氟乙酰基咪唑(CF3COIm；200μmol)。另外30s之后，添加N，N’-二甲基秋兰姆二硫化物(DTD；120μmol)。另外3分钟之后，混合物被真空干燥。向残余物添加浓NH3-EtOH(3∶1，v/v，10mL)，混合物被搅拌12小时，然后被减压浓缩至干燥。然后，混合物用CHCl3(5mL)稀释，并用0.2M磷酸盐缓冲液(pH 7.0，5mL)洗涤。水层用CHCl3(2×5mL)反萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩至干燥。渣通过PTLC纯化。产物溶解于CHCl3(5mL)，用0.2M 1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯碳酸氢盐缓冲液(5mL)洗涤，并用CHCl3(2×5mL)反萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并浓缩至干燥而得到(SP)-14uu。
实施例34.(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)腺苷-2′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-14au]的合成
(SP)-14au如实施例33所述而生成，使用替代13u的1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)腺苷-2′-基膦酸酯(13a)。
实施例35.(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯4-N-苯甲酰基 -5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胞苷-2′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-14cu]的合成
(SP)-14cu如实施例33所述而生成，使用替代13u的1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯4-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胞苷-2′-基膦酸酯(13c)。
实施例36.(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)鸟苷-2′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-14gu]的合成
(SP)-14gu如实施例33所述而生成，使用替代13u的1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)鸟苷-2′-基膦酸酯(13g)。
实施例37.(RP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-2′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基硫代磷酸酯[(RP)-14uu]的合成
(Rp)-14uu如实施例33所述而生成，使用替代手性试剂L-2的手性试剂D-2。
实施例38.(RP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)腺苷-2′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基硫代磷酸酯[(RP)-14au]的合成
(RP)-14au如实施例33所述而生成，使用替代13u的13a和替代手性试剂L-2的手性试剂D-2。
实施例39.(RP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯4-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胞苷-2′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基硫代磷酸酯[(RP)-14cu]的合成
(RP)-14cu如实施例33所述而生成，使用替代13u的13c和替代手性试剂L-2的手性试剂D-2。
实施例40.(RP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)鸟苷-2′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基硫代磷酸酯[(RP)-14gu]的合成
(RP)-14gu如实施例33所述而生成，使用替代13u的13g和替代手性试剂L-2的手性试剂D-2。
方案F
实施例41.(RP)-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-2′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基H-膦酸酯[(RP)-15uu]的合成
13u(100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水吡啶(1mL)。添加N，N’-双(2-氧-3-噁唑烷基)膦酰氯(BopCl；500μmol)，混合物被搅拌5分钟。通过注射器向混合物滴加氨基醇((αR，2S)-6)(100μmol)溶液，所述氨基醇通过与无水吡啶共蒸发而被干燥并溶解于无水吡啶(1mL)，混合物在氩气下搅拌5分钟。然后，混合物通过插管添加至9u(100μmol)的溶液，该溶液通过与无水吡啶反复共蒸发并溶解于吡啶来制备。15分钟之后，混合物被减压浓缩。残余物用CH2Cl2(5mL)稀释，并用饱和NaHCO3(3×5mL)洗涤。合并的水层用CH2Cl2(2×5mL)反萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩至大约1mL。残余物在0℃下通过 注射器滴加至搅拌的1％三氟乙酸(TFA)的无水CH2Cl2(20mL)溶液。另外5分钟之后，混合物用无水CH2Cl2(100mL)稀释，并用饱和NaHCO3水溶液(2×100mL)洗涤。合并的水层用CH2Cl2(2×100mL)反萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩至干燥而得到粗品(Rp)-12uu，其通过31P NMR分析。
实施例42.(RP)-6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)腺苷-2′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基H-膦酸酯[(RP)-15au]的合成
粗品(RP)-15au如实施例41所述而生成，使用替代13u的13a。
实施例43.(RP)-4-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胞苷-2′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基H-膦酸酯[(RP)-15cu]的合成
粗品(RP)-15cu如实施例41所述而生成，使用替代13u的13c。
实施例44.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)鸟苷-2′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基H-膦酸酯[(RP)-15gu]的合成
粗品(RP)-15gu如实施例41所述而生成，使用替代13u的13g。
实施例45.(SP)-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-2′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基H-膦酸酯[(SP)-15uu]的合成
粗品(SP)-15uu如实施例41所述而生成，使用替代手性试剂(αR，2S)-6的手性试剂(αS，2R)-6。
实施例46.(SP)-6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)腺苷-2′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基H-膦酸酯[(SP)-15au]的合成
粗品(SP)-15au如实施例41所述而生成，使用替代13u的13a和替代手性试剂(αR，2S)-6的手性试剂(αS，2R)-6。
实施例47.(SP)-4-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胞苷-2′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基H-膦酸酯[(SP)-15cu]的合成
粗品(SP)-15cu如实施例41所述而生成，使用替代13u的13c和替代手性试剂(αR，2S)-6的手性试剂(αS，2R)-6。
实施例48.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)鸟苷-2′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基H-膦酸酯[(SP)-15gu]的合成
粗品(SP)-15gu如实施例41所述而生成，使用替代13u的13g和替代手性试剂(αR，2S)-6的手性试剂(αS，2R)-6。
方案G：S-酰基-2-硫代乙基核酸前药的合成
实施例49.如方案G所述，(RP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的S-酰基-2-硫代乙基核酸前药[(RP)-16tt]的合成
(RP)-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基H-膦酸酯[(RP)-7tt](100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水吡啶(1mL)。添加N-氯琥珀酰亚胺(0.1mmol)，混合物在0℃搅拌2小时。混合物被浓缩并溶解于无水吡啶(1mL)。上述混合物用S-乙酰基-2-硫代乙醇(100μmol)的无水(100μmol)吡啶溶液处理。1小时后，混合物被浓缩，然后溶解于三氢氟酸三乙胺(500μL)。混合物在室温下搅拌15小时。然后向混合物添加0.1M乙酸铵缓冲液(2.5mL)，混合物用Et2O(3×3mL)洗涤。合并的有机层用0.1M乙酸铵缓冲液(3mL)反萃取。然后，合并的水层被减压浓缩至干燥，残余物通过反相柱色谱[在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中乙腈0-10％的线性梯度液]纯化以提供(RP)-16tt。
实施例50.(RP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯[(RP)-16at]的S-酰基-2-硫代乙基前核苷酸的合成
粗品(RP)-16at如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-7at。
实施例51.(RP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的S-酰基-2-硫代乙基前核苷酸[(RP)-16ct]的合成
粗品(RP)-16ct如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-7ct。
实施例52.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的S-酰基-2-硫代乙基前核苷酸[(RP)-16gt]的合成
粗品(RP)-16gt如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-7g。
实施例53.(SP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的S-酰基-2-硫代乙基前核苷酸[(SP)-16tt]的合成
粗品(SP)-16tt如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-7tt。
实施例54.(SP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的S-酰基-2-硫代乙基前核苷酸[(SP)-16at]的合成
粗品(SP)-16at如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-7at。
实施例55.(SP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的S-酰基-2-硫代乙基前核苷酸[(SP)-16ct]的合成
粗品(SP)-16ct如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-7ct。
实施例56.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的S-酰基-2-硫代乙基前核苷酸[(SP)-16gt]的合成
粗品(SP)-16gt如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-7gt。
实施例57.(RP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的S-酰基-2-硫代乙基前核苷酸[(RP)-16uu]的合成
粗品(RP)-16uu如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-12uu。
实施例58.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的S-酰基-2-硫代乙基前核苷酸[(RP)-16au]的合成
粗品(RP)-16au如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-12au。
实施例59.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的S-酰基-2-硫代乙基前核苷酸[(RP)-16cu]的合成
粗品(RP)-16cu如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-12cu。
实施例60.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的S-酰基-2-硫代乙基前核苷酸[(RP)-16gu]的合成
粗品(RP)-16gu如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-12gu。
实施例61.(SP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的S-酰基-2-硫代乙基前核苷酸[(SP)-16uu]的合成
粗品(SP)-16uu如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-12uu。
实施例62.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的S-酰基-2-硫代乙基前核苷酸[(SP)-16au]的合成
粗品(SP)-16au如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-12au。
实施例63.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的S-酰基-2-硫代乙基前核苷酸[(SP)-16cu]的合成
粗品(SP)-16cu如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-12au。
实施例64.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的S-酰基-2-硫代乙基前核苷酸[(SP)-16gu]的合成
粗品(SP)-16gu如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-12gu。
实施例65.(RP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的S-酰基-2-硫代乙基前核苷酸[(RP)-17uu]的合成
粗品(SP)-17uu如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15uu。
实施例66.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的S-酰基-2-硫代乙基前核苷酸[(RP)-17au]的合成
粗品(RP)-17au如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15au。
实施例67.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的S-酰基-2-硫代乙基前核苷酸[(RP)-17cu]的合成
粗品(RP)-17cu如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15cu。
实施例68.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基H-膦酸酯的S-酰基-2-硫代乙基前核苷酸[(RP)-17gu]的合成
粗品(RP)-17gu如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15gu。
实施例69.(SP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的S-酰基-2-硫代乙基前核苷酸[(SP)-17uu]的合成
粗品(SP)-17uu如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15uu。
实施例70.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的S-酰基-2-硫代乙基前核苷酸[(SP)-17au]的合成
粗品(SP)-17au如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15au。
实施例71.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的S-酰基-2-硫代乙基前核苷酸[(SP)-17cu]的合成
粗品(SP)-17cu如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15cu。
实施例72.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的S-酰基-2-硫代乙基前核苷酸[(SP)-17gu]的合成
粗品(SP)-17gu如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15gu。
方案H：酰氧基前核苷酸的合成
实施例73.如方案H中所述，(RP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的酰氧基前核苷酸[(RP)-18tt]的合成
(RP)-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基H-膦酸酯[(RP)-7tt](100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水吡啶(1mL)。添加N-氯琥珀酰亚胺(0.1mmol)，混合物在0℃搅拌2小时。混合物被浓缩并溶解于无水吡啶(1mL)。上述混合物用羟基甲基乙酸酯(100μmol)的无水(100μmol)二氯甲烷溶液处理。1小时后，混合物被浓缩，然后溶解于三氢氟酸三乙胺(500μL)。混合物在室温下搅拌15小时。然后向混合物添加0.1M乙酸铵缓冲液(2.5mL)，混合物用Et2O(3×3mL)洗涤。合并的有机层用0.1M乙酸铵缓冲液(3mL)反萃取。然后，合并的水层被减压浓缩至干燥，残余物通过反相柱色谱[在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中乙腈0-10％的线性梯度液]纯化以提供(RP)-18tt。
实施例74.(RP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的酰氧基前核苷酸[(RP)-18at]的合成
粗品(RP)-18at如实施例73所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-7at。
实施例75.(RP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的酰氧基前核苷酸[(RP)-18ct]的合成
粗品(RP)-18ct如实施例73所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-7ct。
实施例76.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的酰氧基前核苷酸[(RP)-18gt]的合成
粗品(RP)-18gt如实施例73所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-7g。
实施例77.(SP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的酰氧基前核苷酸[(SP)-18tt]的合成
粗品(SP)-18tt如实施例73所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-7tt。
实施例78.(SP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的酰氧基前核苷酸[(SP)-18at]的合成
粗品(SP)-18at如实施例73所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-7at。
实施例79.(SP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的酰氧基前核苷酸[(SP)-18ct]的合成
粗品(SP)-18ct如实施例73所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-7ct。
实施例80.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的酰氧基前核苷酸[(SP)-18gt]的合成
粗品(SP)-18gt如实施例73所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-7gt。
实施例81.(RP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的酰氧基前核苷酸[(RP)-18uu]的合成
粗品(RP)-18uu如实施例73所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-12uu。
实施例82.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的酰氧基前核苷酸[(RP)-18au]的合成
粗品(RP)-18au如实施例73所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-12au。
实施例83.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的酰氧基前核苷酸[(RP)-18cu]的合成
粗品(RP)-18cu如实施例73所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-12cu。
实施例84.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的酰氧基前核苷酸[(RP)-18gu]的合成
粗品(RP)-18gu如实施例73所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-12gu。
实施例85.(SP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的酰氧基前核苷酸[(SP)-18uu]的合成
粗品(SP)-18uu如实施例73所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-12uu。
实施例86.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的酰氧基前核苷酸[(SP)-18au]的合成
粗品(SP)-18au如实施例73所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-12au。
实施例87.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的酰氧基前核苷酸[(SP)-18cu]的合成
粗品(SP)-18cu如实施例73所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-12au。
实施例88.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的酰氧基前核苷酸[(SP)-18gu]的合成
粗品(SP)-18gu如实施例73所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-12gu。
实施例89.(RP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的酰氧基前核苷酸[(RP)-19uu]的合成
粗品(SP)-19uu如实施例73所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15uu。
实施例90.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的酰氧基前核苷酸[(RP)-19au]的合成
粗品(RP)-19au如实施例73所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15au。
实施例91.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的酰氧基前核苷酸[(RP)-19cu]的合成
粗品(RP)-19cu如实施例73所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15cu。
实施例92.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的酰氧基前核苷酸[(RP)-19gu]的合成
粗品(RP)-19gu如实施例73所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15gu。
实施例93.(SP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的酰氧基前核苷酸[(SP)-19uu]的合成
粗品(SP)-19uu如实施例73所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15uu。
实施例94.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的酰氧基前核苷酸[(SP)-19au]的合成
粗品(SP)-19au如实施例73所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15au。
实施例95.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的酰氧基前核苷酸[(SP)-19cu]的合成
粗品(SP)-19cu如实施例73所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15cu。
实施例96.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的酰氧基前核苷酸[(SP)-19gu]的合成
粗品(SP)-19gu如实施例73所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15gu。
方案I：硫代酰氧基前核苷酸的合成
实施例97.如方案I所述，(RP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代酰氧基前核苷酸[(RP)-20tt]的合成。
(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-4tt](100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水二氯甲烷(1mL)。混合物用通过Bodor等人.J.Org.Chem.(1983)，48：5280的方法制备的乙酸氯甲酯(100μmol)的无水(100μmol)二氯甲烷溶液处理。1小时后，混合物被浓缩，然后溶解于三氢氟酸三乙胺(500μL)。混合物在室温下搅拌15小时。然后向混合物添加0.1M乙酸铵缓冲液(2.5mL)，混合物用Et2O(3×3mL)洗涤。合并的有机层用0.1M乙酸铵缓冲液(3mL)反萃取。然后，合并的水层被减压浓缩至干燥，残余物通过反相柱色谱[在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中乙腈0-10％的线性梯度液]纯化以提供(RP)-20tt。
实施例98.(RP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代酰氧基前核苷酸[(RP)-20at]的合成
粗品(RP)-20at如实施例97所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4at。
实施例99.(RP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代酰氧基前核苷酸[(RP)-20ct]的合成
粗品(RP)-20ct如实施例97所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4ct。
实施例100.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代酰氧基前核苷酸[(RP)-20gt]的合成
粗品(RP)-20gt如实施例97所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4g。
实施例101.(SP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代酰氧基前核苷酸[(SP)-20tt]的合成
粗品(SP)-20tt如实施例97所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4tt。
实施例102.(SP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代酰氧基前核苷酸[(SP)-20at]的合成
粗品(SP)-20at如实施例97所述而生成，使用替代(RP)-4tt的 (SP)-4at。
实施例103.(SP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代酰氧基前核苷酸[(SP)-20ct]的合成
粗品(SP)-20ct如实施例97所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4ct。
实施例104.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代酰氧基前核苷酸[(SP)-20gt]的合成
粗品(SP)-20gt如实施例97所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4gt。
实施例105.(RP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代酰氧基前核苷酸[(RP)-20uu]的合成
粗品(RP)-20uu如实施例97所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10uu。
实施例106.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代酰氧基前核苷酸[(RP)-20au]的合成
粗品(RP)-20au如实施例97所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10au。
实施例107.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代酰氧基前核苷酸[(RP)-20cu]的合成
粗品(RP)-20cu如实施例97所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10cu。
实施例108.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代酰氧基前核苷酸[(RP)-20gu]的合成
粗品(RP)-20gu如实施例97所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10gu。
实施例109.(SP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代酰氧基前核苷酸[(SP)-20uu]的合成
粗品(SP)-20uu如实施例97所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10uu。
实施例110.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的 硫代酰氧基前核苷酸[(SP)-20au]的合成
粗品(SP)-20au如实施例97所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10au。
实施例111.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代酰氧基前核苷酸[(SP)-20cu]的合成
粗品(SP)-20cu如实施例97所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10au。
实施例112.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代酰氧基前核苷酸[(SP)-20gu]的合成
粗品(SP)-20gu如实施例97所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10gu。
实施例113.(RP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代酰氧基前核苷酸[(RP)-21uu]的合成
粗品(SP)-21uu如实施例97所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14uu。
实施例114.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代酰氧基前核苷酸[(RP)-21au]的合成
粗品(RP)-21au如实施例97所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14au。
实施例115.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代酰氧基前核苷酸[(RP)-21cu]的合成
粗品(RP)-21cu如实施例97所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14cu。
实施例116.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代酰氧基前核苷酸[(RP)-21gu]的合成
粗品(RP)-21gu如实施例97所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14gu。
实施例117.(SP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代酰氧基前核苷酸[(SP)-21uu]的合成
粗品(SP)-21uu如实施例97所述而生成，使用替代(RP)-4tt的 (SP)-14uu。
实施例118.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代酰氧基前核苷酸[(SP)-21au]的合成
粗品(SP)-21au如实施例97所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14au。
实施例119.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代酰氧基前核苷酸[(SP)-21cu]的合成
粗品(SP)-21cu如实施例97所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14cu。
实施例120.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代酰氧基前核苷酸[(SP)-21gu]的合成
粗品(SP)-21gu如实施例97所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14gu。
方案J：2-烷氧碳酰乙基前核苷酸的合成
实施例121.如方案J所述，(RP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的2-烷氧碳酰乙基前核苷酸[(RP)-22tt]的合成。
(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-4tt](100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水二氯甲烷(1mL)。混合物用丙烯酸甲酯(100μmol)的无水(100μmol)二氯甲烷溶液处理。1小时后，混合物被浓缩，然后溶解于三氢氟酸三乙胺(500μL)。混合物在室温下搅拌15小时。然后向混合物添加0.1M乙酸铵缓冲液(2.5mL)，混合物用Et2O(3×3mL)洗涤。合并的有机层用O.1M乙酸铵缓冲液(3mL)反萃取。然后，合并的水层被减压浓缩至干燥，残余物通过反相柱色谱[在0.1M乙 酸铵缓冲液(pH7.0)中乙腈0-10％的线性梯度液]纯化以提供(RP)-22tt。
实施例122.(RP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的2-烷氧碳酰乙基前核苷酸[(RP)-22at]的合成
粗品(RP)-22at如实施例121所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4at。
实施例123.(RP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的2-烷氧碳酰乙基前核苷酸[(RP)-22ct]的合成
粗品(RP)-22ct如实施例121所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4ct。
实施例124.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的2-烷氧碳酰乙基前核苷酸[(RP)-22gt]的合成
粗品(RP)-22gt如实施例121所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4g。
实施例125.(SP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的2-烷氧碳酰乙基前核苷酸[(SP)-22tt]的合成
粗品(SP)-22tt如实施例121所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4tt。
实施例126.(SP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的2-烷氧碳酰乙基前核苷酸[(SP)-22at]的合成
粗品(SP)-22at如实施例121所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4at。
实施例127.(SP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的2-烷氧碳酰乙基前核苷酸[(SP)-22ct]的合成
粗品(SP)-22ct如实施例121所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4ct。
实施例128.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的2-烷氧碳酰乙基前核苷酸[(SP)-22gt]的合成
粗品(SP)-22gt如实施例121所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4gt。
实施例129.(RP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的2-烷氧碳酰乙基前核苷酸[(RP)-22uu]的合成
粗品(RP)-22uu如实施例121所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10uu。
实施例130.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的2-烷氧碳酰乙基前核苷酸[(RP)-22au]的合成
粗品(RP)-22au如实施例121所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10au。
实施例131.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的2-烷氧碳酰乙基前核苷酸[(RP)-22cu]的合成
粗品(RP)-22cu如实施例121所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10cu。
实施例132.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的2-烷氧碳酰乙基前核苷酸[(RP)-22gu]的合成
粗品(RP)-22gu如实施例121所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10gu。
实施例133.(SP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的2-烷氧碳酰乙基前核苷酸[(SP)-22uu]的合成
粗品(SP)-22uu如实施例121所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10uu。
实施例134.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的2-烷氧碳酰乙基前核苷酸[(SP)-22au]的合成
粗品(SP)-22au如实施例121所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10au。
实施例135.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的2-烷氧碳酰乙基前核苷酸[(SP)-22cu]的合成
粗品(SP)-22cu如实施例121所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10au。
实施例136.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的2-烷氧碳酰乙基前核苷酸[(SP)-22gu]的合成
粗品(SP)-22gu如实施例121所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10gu。
实施例137.(RP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的2-烷氧碳酰乙基前核苷酸[(RP)-23uu]的合成
粗品(SP)-23uu如实施例121所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14uu。
实施例138.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的2-烷氧碳酰乙基前核苷酸[(RP)-23au]的合成
粗品(RP)-23au如实施例121所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14au。
实施例139.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的2-烷氧碳酰乙基前核苷酸[(RP)-23cu]的合成
粗品(RP)-23cu如实施例121所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14cu。
实施例140.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的2-烷氧碳酰乙基前核苷酸[(RP)-23gu]的合成
粗品(RP)-23gu如实施例121所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14gu。
实施例141.(SP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的2-烷氧碳酰乙基前核苷酸[(SP)-23uu]的合成
粗品(SP)-23uu如实施例121所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14uu。
实施例142.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的2-烷氧碳酰乙基前核苷酸[(SP)-23au]的合成
粗品(SP)-23au如实施例121所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14au。
实施例143.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的2-烷氧碳酰乙基前核苷酸[(SP)-23cu]的合成
粗品(SP)-23cu如实施例121所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14cu。
实施例144.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的2-烷氧碳酰乙基前核苷酸[(SP)-23gu]的合成
粗品(SP)-23gu如实施例121所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14gu。
方案K：二硫化物前核苷酸的合成
实施例145.如方案K所述，(RP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(RP)-24tt]的合成
(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-4tt](100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水乙醇(1mL)。混合物用二乙基二硫化物(200μmol)的无水(100μmol)乙醇溶液处理。1小时后，混合物被浓缩，然后溶解于三氢氟酸三乙胺(500μL)。混合物在室温下搅拌15小时。然后向混合物添加0.1M乙酸铵缓冲液(2.5mL)，混合物用Et2O(3×3mL)洗涤。合并的有机层用0.1M乙酸铵缓冲液(3mL)反萃取。然后，合并的水层被减压浓缩至干燥，残余物通过反相柱色谱[在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中乙腈0-10％的线性梯度液]纯化以提供(RP)-24tt。
实施例146.(RP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(RP)-24at]的合成
粗品(RP)-24at如实施例145所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4at。
实施例147.(RP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(RP)-24ct]的合成
粗品(RP)-24ct如实施例145所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4ct。
实施例148.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(RP)-24gt]的合成
粗品(RP)-24gt如实施例145所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4g。
实施例149.(SP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(SP)-24tt]的合成
粗品(SP)-24tt如实施例145所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4tt。
实施例150.(SP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(SP)-24at]的合成
粗品(SP)-24at如实施例145所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4at。
实施例151.(SP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(SP)-24ct]的合成
粗品(SP)-24ct如实施例145所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4ct。
实施例152.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(SP)-24gt]的合成
粗品(SP)-24gt如实施例145所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4gt。
实施例153.(RP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(RP)-24uu]的合成
粗品(RP)-24uu如实施例145所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10uu。
实施例154.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(RP)-24au]的合成
粗品(RP)-24au如实施例145所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10au。
实施例155.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(RP)-24cu]的合成
粗品(RP)-24cu如实施例145所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10cu。
实施例156.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(RP)-24gu]的合成
粗品(RP)-24gu如实施例145所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10gu。
实施例157.(SP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(SP)-24uu]的合成
粗品(SP)-24uu如实施例145所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10uu。
实施例158.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(SP)-24au]的合成
粗品(SP)-24au如实施例145所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10au。
实施例159.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(SP)-24cu]的合成
粗品(SP)-24cu如实施例145所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10au。
实施例160.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(SP)-24gu]的合成
粗品(SP)-24gu如实施例145所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10gu。
实施例161.(RP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(RP)-25uu]的合成
粗品(SP)-25uu如实施例145所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14uu。
实施例162.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(RP)-25au]的合成
粗品(RP)-25au如实施例145所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14au。
实施例163.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(RP)-25cu]的合成
粗品(RP)-25cu如实施例145所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14cu。
实施例164.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(RP)-25gu]的合成
粗品(RP)-25gu如实施例145所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14gu。
实施例165.(SP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(SP)-25uu]的合成
粗品(SP)-25uu如实施例145所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14uu。
实施例166.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(SP)-25au]的合成
粗品(SP)-25au如实施例145所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14au。
实施例167.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(SP)-25cu]的合成
粗品(SP)-25cu如实施例145所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14cu。
实施例168.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(SP)-25gu]的合成
粗品(SP)-25gu如实施例145所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14gu。
方案L：硫缩醛前核苷酸的合成
实施例169.如方案L所述，(RP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫缩醛前核苷酸[(RP)-26tt]的合成
3，3-二甲氧基丙基乙酸酯(100μmol)在-78℃下被添加至三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(100μmol)的二氯甲烷(1mL)溶液。在-78℃下搅拌30分钟之后，添加(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-4tt](100μmol)的无水二氯甲烷(1mL)溶液。允许混合物缓慢升至室温。1小时后，混合物被浓缩，然后溶解于三氢氟酸三乙胺(500μL)。混合物在室温下搅拌15小时。然后向混合物添加0.1M乙酸铵缓冲液(2.5mL)，混合物用Et2O(3×3mL)洗涤。合并的有机层用0.1M乙酸铵缓冲液(3mL)反萃取。然后，合并的水层被减压浓缩至干燥，残余物通过反相柱色谱[在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中乙腈0-10％的线性梯度液]纯化以提供(RP)-26tt。
实施例170.(RP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫缩醛前核苷酸[(RP)-26at]的合成
粗品(RP)-26at如实施例169所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4at。
实施例171.(RP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫缩醛前核苷酸[(RP)-26ct]的合成
粗品(RP)-26ct如实施例169所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4ct。
实施例172.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫缩醛前核苷酸[(RP)-26gt]的合成
粗品(RP)-26gt如实施例169所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4g。
实施例173.(SP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫缩醛前核苷酸[(SP)-26tt]的合成
粗品(SP)-26tt如实施例169所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4tt。
实施例174.(SP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫缩醛前核苷酸[(SP)-26at]的合成
粗品(SP)-26at如实施例169所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4at。
实施例175.(SP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫缩醛前核苷酸[(SP)-26ct]的合成
粗品(SP)-26ct如实施例169所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4ct。
实施例176.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫缩醛前核苷酸[(SP)-26gt]的合成
粗品(SP)-26gt如实施例169所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4gt。
实施例177.f(RP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫缩醛前核苷酸[(RP)-26uu]的合成
粗品(RP)-26uu如实施例169所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10uu。
实施例178.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫缩醛前核苷酸[(RP)-26au]的合成
粗品(RP)-26au如实施例169所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10au。
实施例179.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫缩醛前核苷酸[(RP)-26cu]的合成
粗品(RP)-26cu如实施例169所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10cu。
实施例180.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫缩醛前核苷酸[(RP)-26gu]的合成
粗品(RP)-26gu如实施例169所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10gu。
实施例181.(SP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫缩醛前核苷酸[(SP)-26uu]的合成
粗品(SP)-26uu如实施例169所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10uu。
实施例182.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫缩醛前核苷酸[(SP)-26au]的合成
粗品(SP)-26au如实施例169所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10au。
实施例183.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫缩醛前核苷酸[(SP)-26cu]的合成
粗品(SP)-26cu如实施例169所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10au。
实施例184.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫缩醛前核苷酸[(SP)-26gu]的合成
粗品(SP)-26gu如实施例169所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10gu。
实施例185.(RP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫缩醛前核苷酸[(RP)-27uu]的合成
粗品(SP)-27uu如实施例169所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14uu。
实施例186.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫缩醛前核苷酸[(RP)-27au]的合成
粗品(RP)-27au如实施例169所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14au。
实施例187.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫缩醛前核苷酸[(RP)-27cu]的合成
粗品(RP)-27cu如实施例169所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14cu。
实施例188.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫缩醛前核苷酸[(RP)-27gu]的合成
粗品(RP)-27gu如实施例169所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14gu。
实施例189.(SP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫缩醛前核苷酸[(SP)-27uu]的合成
粗品(SP)-27uu如实施例169所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14uu。
实施例190.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫缩醛前核苷酸[(SP)-27au]的合成
粗品(SP)-27au如实施例169所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14au。
实施例191.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫缩醛前核苷酸[(SP)-27cu]的合成
粗品(SP)-27cu如实施例169所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14cu。
实施例192.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫缩醛前核苷酸[(SP)-27gu]的合成
粗品(SP)-27gu如实施例169所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14gu。
方案M：C3烯醇酯前核苷酸的合成
实施例193.如方案M所述，(RP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的C3烯醇酯前核苷酸[(RP)-28tt]的合成
向(E)-3-氯丙-1-烯基乙酸酯(100μmol)的DMF(1mL)溶液添加(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-4tt](100μmol)。1小时后，混合物被浓缩，然后溶解于三氢氟酸三乙胺(500μL)。混合物在室温下搅拌15小时。然后向混合物添加0.1M乙酸铵缓冲液(2.5mL)，混合物用Et2O(3×3mL)洗涤。合 并的有机层用0.1M乙酸铵缓冲液(3mL)反萃取。然后，合并的水层被减压浓缩至干燥，残余物通过反相柱色谱[在0.1M乙酸铵缓冲液(pH7.0)中乙腈0-10％的线性梯度液]纯化以提供(RP)-28tt。
实施例194.(RP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的C3烯醇酯前核苷酸[(RP)-28at]的合成
粗品(RP)-28at如实施例193所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4at。
实施例195.(RP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的C3烯醇酯前核苷酸[(RP)-28ct]的合成
粗品(RP)-28ct如实施例193所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4ct。
实施例196.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的C3烯醇酯前核苷酸[(RP)-28gt]的合成
粗品(RP)-28gt如实施例193所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4g。
实施例197.(SP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的C3烯醇酯前核苷酸[(SP)-28tt]的合成
粗品(SP)-28tt如实施例193所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4tt。
实施例198.(SP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的C3烯醇酯前核苷酸[(SP)-28at]的合成
粗品(SP)-28at如实施例193所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4at。
实施例199.(SP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的C3烯醇酯前核苷酸[(SP)-28ct]的合成
粗品(SP)-28ct如实施例193所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4ct。
实施例200.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的C3烯醇酯前核苷酸[(SP)-28gt]的合成
粗品(SP)-28gt如实施例193所述而生成，使用替代(RP)-4tt的 (SP)-4gt。
实施例201.(RP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C3烯醇酯前核苷酸[(RP)-28uu]的合成
粗品(RP)-28uu如实施例193所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10uu。
实施例202.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C3烯醇酯前核苷酸[(RP)-28au]的合成
粗品(RP)-28au如实施例193所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10au。
实施例203.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C3烯醇酯前核苷酸[(RP)-28cu]的合成
粗品(RP)-28cu如实施例193所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10cu。
实施例204.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C3烯醇酯前核苷酸[(RP)-28gu]的合成
粗品(RP)-28gu如实施例193所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10gu。
实施例205.(SP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C3烯醇酯前核苷酸[(SP)-28uu]的合成
粗品(SP)-28uu如实施例193所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10uu。
实施例206.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C3烯醇酯前核苷酸[(SP)-28au]的合成
粗品(SP)-28au如实施例193所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10au。
实施例207.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C3烯醇酯前核苷酸[(SP)-28cu]的合成
粗品(SP)-28cu如实施例193所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10au。
实施例208.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸 酯的C3烯醇酯前核苷酸[(SP)-28gu]的合成
粗品(SP)-28gu如实施例193所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10gu。
实施例209.(RP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C3烯醇酯前核苷酸[(RP)-29uu]的合成
粗品(SP)-29uu如实施例193所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14uu。
实施例210.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C3烯醇酯前核苷酸[(RP)-29au]的合成
粗品(RP)-29au如实施例193所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14au。
实施例211.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C3烯醇酯前核苷酸[(RP)-29cu]的合成
粗品(RP)-29cu如实施例193所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14cu。
实施例212.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C3烯醇酯前核苷酸[(RP)-29gu]的合成
粗品(RP)-29gu如实施例193所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14gu。
实施例213.(SP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C3烯醇酯前核苷酸[(SP)-29uu]的合成
粗品(SP)-29uu如实施例193所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14uu。
实施例214.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C3烯醇酯前核苷酸[(SP)-29au]的合成
粗品(SP)-29au如实施例193所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14au。
实施例215.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C3烯醇酯前核苷酸[(SP)-29cu]的合成
粗品(SP)-29cu如实施例193所述而生成，使用替代(RP)-4tt的 (SP)-14cu。
实施例216.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C3烯醇酯前核苷酸[(SP)-29gu]的合成
粗品(SP)-29gu如实施例193所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14gu。
方案N：C4烯醇酯前核苷酸的合成
实施例217.如方案N所述，(RP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的C4烯醇酯前核苷酸[(RP)-30tt]的合成。
向(E)-4-氯丁-1-烯基乙酸酯(100μmol)的DMF(1mL)溶液添加(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-4tt](100μmol)。1小时后，混合物被浓缩，然后溶解于三氢氟酸三乙胺(500μL)。混合物在室温下搅拌15小时。然后向混合物添加0.1M乙酸铵缓冲液(2.5mL)，混合物用Et2O(3×3mL)洗涤。合并的有机层用0.1M乙酸铵缓冲液(3mL)反萃取。然后，合并的水层被减压浓缩至干燥，残余物通过反相柱色谱[在0.1M乙酸铵缓冲液(pH7.0)中乙腈0-10％的线性梯度液]纯化以提供(RP)-30tt。
实施例218.(RP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的C4烯醇酯前核苷酸[(RP)-30at]的合成
粗品(RP)-30at如实施例217所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4at。
实施例219.(RP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的C4烯醇酯前核苷酸[(RP)-30ct]的合成
粗品(RP)-30ct如实施例217所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4ct。
实施例220.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的C4烯醇酯前核苷酸[(RP)-30gt]的合成
粗品(RP)-30gt如实施例217所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4g。
实施例221.(SP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的C4烯醇酯前核苷酸[(SP)-30tt]的合成
粗品(SP)-30tt如实施例217所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4tt。
实施例222.(SP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的C4烯醇酯前核苷酸[(SP)-30at]的合成
粗品(SP)-30at如实施例217所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4at。
实施例223.(SP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的C4烯醇酯前核苷酸[(SP)-30ct]的合成
粗品(SP)-30ct如实施例217所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4ct。
实施例224.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的C4烯醇酯前核苷酸[(SP)-30gt]的合成
粗品(SP)-30gt如实施例217所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4gt。
实施例225.(RP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C4烯醇酯前核苷酸[(RP)-30uu]的合成
粗品(RP)-30uu如实施例217所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10uu。
实施例226.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C4烯醇酯前核苷酸[(RP)-30au]的合成
粗品(RP)-30au如实施例217所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10au。
实施例227.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C4烯醇酯前核苷酸[(RP)-30cu]的合成
粗品(RP)-30cu如实施例217所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10cu。
实施例228.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C4烯醇酯前核苷酸[(RP)-30gu]的合成
粗品(RP)-30gu如实施例217所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10gu。
实施例229.(SP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C4烯醇酯前核苷酸[(SP)-30uu]的合成
粗品(SP)-30uu如实施例217所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10uu。
实施例230.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C4烯醇酯前核苷酸[(SP)-30au]的合成
粗品(SP)-30au如实施例217所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10au。
实施例231.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C4烯醇酯前核苷酸[(SP)-30cu]的合成
粗品(SP)-30cu如实施例217所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10au。
实施例232.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C4烯醇酯前核苷酸[(SP)-30gu]的合成
粗品(SP)-30gu如实施例217所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10gu。
实施例233.(RP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C4烯醇酯前核苷酸[(RP)-31uu]的合成
粗品(SP)-31uu如实施例217所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14uu。
实施例234.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C4烯醇酯前核苷酸[(RP)-31au]的合成
粗品(RP)-31au如实施例217所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14au。
实施例235.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C4烯醇酯前核苷酸[(RP)-31cu]的合成
粗品(RP)-31cu如实施例217所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14cu。
实施例236.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C4烯醇酯前核苷酸[(RP)-31gu]的合成
粗品(RP)-31gu如实施例217所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14gu。
实施例237.(SP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C4烯醇酯前核苷酸[(SP)-31uu]的合成
粗品(SP)-31uu如实施例217所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14uu。
实施例238.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C4烯醇酯前核苷酸[(SP)-31au]的合成
粗品(SP)-31au如实施例217所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14au。
实施例239.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C4烯醇酯前核苷酸[(SP)-31cu]的合成
粗品(SP)-31cu如实施例217所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14cu。
实施例240.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的C4烯醇酯前核苷酸[(SP)-31gu]的合成
粗品(SP)-31gu如实施例217所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14gu。
方案O：受保护的2’-5’-A3H-膦酸酯的合成
实施例241.方案O-a示例描述了5’-O-(甲氧基三苯甲基)保护的2’-5’-A3H-膦酸酯的合成。
如实施例41的方案6所述，5’-O-(甲氧基三苯甲基)保护的化合物32与9a偶联。得到的H-膦酸酯33经受通过1％TFA的CH2Cl2溶液处理的脱保护，以产生5’-OH化合物34。如实施例41的方案6所述，34与32偶联产生H-膦酸酯三核苷酸35。使用1％TFA的CH2Cl2溶液脱保护5’-OH基团以产生H-膦酸酯三核苷酸36。
方案O-b：2’-5’-A3S-乙酰基-2-硫代乙基前核苷酸的合成
实施例242.方案O-b示例说明了2’-5’-A3S-乙酰基-2-硫代乙基前核苷酸的合成。
5’-OH H-膦酸酯三核苷酸化合物36通过Eldrup的方法转化为S-乙酰基-2-硫代乙基前药，如US 7,202,224中描述的。向36(1mmol)添加1H-四唑(1.1mmol)，混合物经P2O5干燥过夜。向该混合物添加无水乙腈(10mL)，随后添加双(S-乙酰基-2-硫代乙基)N，N-二异丙基亚磷酰胺(1.1mmol)，得到的混合物在室温搅拌2小时。去除溶剂，残余物被冷却至-40℃，添加m-CPBA(1.0mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液。在室温搅拌1小时之后，添加NaHSO3水溶液，分离有机层，并通过色谱分离产物37。
化合物37根据实施例49方案7的方法被转化为终产物39。化合物37(100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水吡啶(1mL)。添加N-氯琥珀酰亚胺(0.1mmol)，混合物在0℃搅拌2小时。混合物被浓缩并溶解于无水吡啶(1mL)。上述混合物用S-乙酰基-2-硫代乙醇(100μmol)的无水(100μmol)吡啶溶液处理。1小时后，混合物被浓缩，然后溶解于三氢氟酸三乙胺(500μL)。混合 物在室温下搅拌15小时。然后向混合物添加0.1M乙酸铵缓冲液(2.5mL)，混合物用Et2O(3×3mL)洗涤。合并的有机层用0.1M乙酸铵缓冲液(3mL)反萃取。然后，合并的水层被减压浓缩至干燥，残余物通过反相柱色谱[在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中乙腈0-10％的线性梯度液]纯化以提供39。
方案P：三甲基铵乙基核酸前药的合成
实施例243.如方案P所述，(RP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的三甲基铵乙基核酸前药[(RP)-16tt]的合成
(RP)-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基H-膦酸酯[(RP)-7tt](100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水吡啶(1mL)。添加N-氯琥珀酰亚胺(0.1mmol)，混合物在0℃搅拌2小时。混合物被浓缩并溶解于无水吡啶(1mL)。上述混合物用1-(2-羟基)-乙基-三甲基氯化铵(100μmol)的无水(100μmol)吡啶溶液处理。1小时后，混合物被浓缩，然后溶解于三氢氟酸三乙胺(500μL)。混合物在室温下搅拌15小时。然后向混合物添加0.1M乙酸铵缓冲液(2.5mL)，混合物用Et2O(3×3mL)洗涤。合并的有机层用0.1M乙酸铵缓冲液(3mL)反萃取。然后，合并的水层被减压浓缩至干燥，残余物通过反相柱色谱[在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中乙腈0-10％的线性梯度液]纯化以提供(RP)-40tt。
实施例244.(RP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的三甲基铵乙基前核苷酸[(RP)-40at]的合成
粗品(RP)-40at如实施例243所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-7at。
实施例245.(RP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的三甲基铵乙基前核苷酸[(RP)-40ct]的合成
粗品(RP)-40ct如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-7ct。
实施例246.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的三甲基铵乙基前核苷酸[(RP)-40gt]的合成
粗品(RP)-40gt如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-7g。
实施例247.(SP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的三甲基铵乙基前核苷酸[(SP)-40tt]的合成
粗品(SP)-40tt如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-7tt。
实施例248.(SP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的三甲基铵乙基前核苷酸[(SP)-40at]的合成
粗品(SP)-40at如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-7at。
实施例249.(SP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的三甲基铵乙基前核苷酸[(SP)-40ct]的合成
粗品(SP)-40ct如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-7ct。
实施例250.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的三甲基铵乙基前核苷酸[(SP)-40gt]的合成
粗品(SP)-40gt如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-7tt。
实施例251.(RP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的三甲基铵乙基前核苷酸[(RP)-40uu]的合成
粗品(RP)-40uu如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-12uu。
实施例252.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的三甲基铵乙基前核苷酸[(RP)-40au]的合成
粗品(RP)-40au如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-12au。
实施例253.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的三甲基铵乙基前核苷酸[(RP)-40cu]的合成
粗品(RP)-16cu如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-12cu。
实施例254.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的三甲基铵乙基前核苷酸[(RP)-40gu]的合成
粗品(RP)-40gu如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-12gu。
实施例255.(SP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的三甲基铵乙基前核苷酸[(SP)-40uu]的合成
粗品(SP)-40uu如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-12uu。
实施例256.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的三甲基铵乙基前核苷酸[(SP)-40au]的合成
粗品(SP)-40au如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-12au。
实施例257.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的三甲基铵乙基前核苷酸[(SP)-40cu]的合成
粗品(SP)-40cu如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-12au。
实施例258.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的三甲基铵乙基前核苷酸[(SP)-40gu]的合成
粗品(SP)-40gu如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-12gu。
实施例259.(RP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的三甲基铵乙基前核苷酸[(RP)-41uu]的合成
粗品(RP)-41uu如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-15uu。
实施例260.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的三甲基铵乙基前核苷酸[(RP)-41au]的合成
粗品(RP)-41au如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15au。
实施例261.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的三甲基铵乙基前核苷酸[(RP)-41cu]的合成
粗品(RP)-41cu如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15cu。
实施例262.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基H-膦酸酯的三甲基铵乙基前核苷酸[(RP)-41gu]的合成
粗品(RP)-41gu如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15gu。
实施例263.(SP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的三甲基铵乙基前核苷酸[(SP)-41uu]的合成
粗品(SP)-41uu如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15uu。
实施例264.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的三甲基铵乙基前核苷酸[(SP)-41au]的合成
粗品(SP)-41au如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15au。
实施例265.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的三甲基铵乙基前核苷酸[(SP)-41cu]的合成
粗品(SP)-41cu如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15cu。
实施例266.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的三甲基铵乙基前核苷酸[(SP)-41gu]的合成
粗品(SP)-41gu如实施例49所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15gu。
方案Q：烷基氧肟酸酯核酸前药的合成
实施例267.如方案Q所述，(RP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯核酸前药[(RP)-42tt]的合成。
(RP)-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基H-膦酸酯[(RP)-7tt](100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水吡啶(1mL)。添加N-氯琥珀酰亚胺(0.1mmol)，混合物在0℃搅拌2小时。混合物被浓缩并溶解于无水吡啶(1mL)。上述混合物用N-甲氧基-N-甲基-3-羟基丙酰胺(100μmol)的无水(100μmol)吡啶溶液处理。1小时后，混合物被浓缩，然后溶解于三氢氟酸三乙胺(500μL)。混合物在室温下搅拌15小时。然后向混合物添加0.1M乙酸铵缓冲液(2.5mL)，混合物用Et2O(3×3mL)洗涤。合并的有机层用0.1M乙酸铵缓冲液(3mL)反萃取。然后，合并的水层被减压浓缩至干燥，残余物通过反相柱色谱[在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中乙腈0-10％的线性梯度液]纯化以提供(RP)-42tt。
实施例268.(RP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-42at]的合成
粗品(RP)-42at如实施例267所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-7at。
实施例269.(RP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-42ct]的合成
粗品(RP)-42ct如实施例267所述而生成，使用替代(RP)-7tt的 (RP)-7ct。
实施例270.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-42gt]的合成
粗品(RP)-42gt如实施例267所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-7g。
实施例271.(SP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-42tt]的合成
粗品(SP)-42tt如实施例267所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-7tt。
实施例272.(SP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-42at]的合成
粗品(SP)-42at如实施例267所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-7at。
实施例273.(SP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-42ct]的合成
粗品(SP)-42ct如实施例267所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-7ct。
实施例274.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-42gt]的合成
粗品(SP)-42gt如实施例267所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-7gt。
实施例275.(RP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-42uu]的合成
粗品(RP)-42uu如实施例267所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-12uu。
实施例276.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-42au]的合成
粗品(RP)-42au如实施例267所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-12au。
实施例277.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷 基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-42cu]的合成
粗品(RP)-42cu如实施例267所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-12cu。
实施例278.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-42gu]的合成
粗品(RP)-42gu如实施例267所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-12gu。
实施例279.(SP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-42uu]的合成
粗品(SP)-42uu如实施例267所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-12uu。
实施例280.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-42au]的合成
粗品(SP)-42au如实施例267所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-12au。
实施例281.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-42cu]的合成
粗品(SP)-42cu如实施例267所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-12au。
实施例282.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-42gu]的合成
粗品(SP)-42gu如实施例267所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-12gu。
实施例283.(RP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-43uu]的合成
粗品(RP)-43uu如实施例267所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-15uu。
实施例284.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-43au]的合成
粗品(RP)-43au如实施例267所述而生成，使用替代(RP)-7tt的 (SP)-15au。
实施例285.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-43cu]的合成
粗品(RP)-43cu如实施例267所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15cu。
实施例286.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基H-膦酸酯[(RP)-43gu]的合成
粗品(RP)-43gu如实施例267所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15gu。
实施例287.(SP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-43uu]的合成
粗品(SP)-43uu如实施例267所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15uu。
实施例288.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-43au]的合成
粗品(SP)-43au如实施例267所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15au。
实施例289.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-43cu]的合成
粗品(SP)-43cu如实施例267所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15cu。
实施例290.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-43gu]的合成
粗品(SP)-43gu如实施例267所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15gu。
方案R：酰基氧肟酸酯核酸前药的合成
实施例291.如方案R所述，(RP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸的酰基氧肟酸酯核酸前药[(RP)-44tt]的合成。
(RP)-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基H-膦酸酯[(RP)-7tt](100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水吡啶(1mL)。添加N-氯琥珀酰亚胺(0.1mmol)，混合物在0℃搅拌2小时。混合物被浓缩并溶解于无水吡啶(1mL)。上述混合物用N-酰氧基-N-甲基-3-羟基丙酰胺(100μmol)的无水(100μmol)吡啶溶液处理。1小时后，混合物被浓缩，然后溶解于三氢氟酸三乙胺(500μL)。混合物在室温下搅拌15小时。然后向混合物添加0.1M乙酸铵缓冲液(2.5mL)，混合物用Et2O(3×3mL)洗涤。合并的有机层用0.1M乙酸铵缓冲液(3mL)反萃取。然后，合并的水层被减压浓缩至干燥，残余物通过反相柱色谱[在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中乙腈0-10％的线性梯度液]纯化以提供(RP)-44tt。
实施例292.(RP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-44at]的合成
粗品(RP)-40at如实施例291所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-7at。
实施例293.(RP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-44ct]的合成
粗品(RP)-44ct如实施例291所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-7ct。
实施例294.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′基胸苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-44gt]的合成
粗品(RP)-44gt如实施例291所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-7g。
实施例295.(SP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-44tt]的合成
粗品(SP)-44tt如实施例291所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-7tt。
实施例296.(SP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-44at]的合成
粗品(SP)-44at如实施例291所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-7at。
实施例297.(SP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-44ct]的合成
粗品(SP)-44ct如实施例291所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-7ct。
实施例298.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-44gt]的合成
粗品(SP)-44gt如实施例291所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-7gt。
实施例299.(RP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-44uu]的合成
粗品(RP)-44uu如实施例291所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-12uu。
实施例300.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-44au]的合成
粗品(RP)-44au如实施例291所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-12au。
实施例301.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-44cu]的合成
粗品(RP)-44cu如实施例291所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-12cu。
实施例302.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-44gu]的合成
粗品(RP)-40gu如实施例291所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-12gu。
实施例303.(SP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-44uu]的合成
粗品(SP)-44uu如实施例291所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-12uu。
实施例304.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-44au]的合成
粗品(SP)-44au如实施例291所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-12au。
实施例305.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-44cu]的合成
粗品(SP)-44cu如实施例291所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-12au。
实施例306.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-44gu]的合成
粗品(SP)-44gu如实施例291所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-12gu。
实施例307.(RP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-45uu]的合成
粗品(RP)-45uu如实施例291所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(RP)-15uu。
实施例308.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-45au]的合成
粗品(RP)-45au如实施例291所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15au。
实施例309.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-45cu]的合成
粗品(RP)-45cu如实施例291所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15cu。
实施例310.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基H-膦酸酯[(RP)-45gu]的合成
粗品(RP)-45gu如实施例291所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15gu。
实施例311.(SP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-45uu]的合成
粗品(SP)-45uu如实施例291所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15uu。
实施例312.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-45au]的合成
粗品(SP)-45au如实施例291所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15au。
实施例313.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-45cu]的合成
粗品(SP)-45cu如实施例291所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15cu。
实施例314.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基膦酸酯的烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-45gu]的合成
粗品(SP)-45gu如实施例291所述而生成，使用替代(RP)-7tt的(SP)-15gu。
方案S：硫代三烷基铵乙基前核苷酸的合成
实施例315.如方案S所述，(RP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(RP)-46tt]的合成。
(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-4tt](100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水二氯甲烷(1mL)。混合物用乙烯基三甲基氯化铵(100μmol)的无水(100μmol)二氯甲烷溶液处理。1小时后，混合物被浓缩，然后溶解于三氢氟酸三乙胺(500μL)。混合物在室温下搅拌15小时。然后向混合物添加0.1M乙酸铵缓冲液(2.5mL)，混合物用Et2O(3×3mL)洗涤。合并的有机层用0.1M乙酸铵缓冲液(3mL)反萃取。然后，合并的水层被减压浓缩至干燥，残余物通过反相柱色谱[在0.1M乙酸铵缓冲液(pH7.0)中乙腈0-10％的线性梯度液]纯化以提供(RP)-46tt。
实施例316.(RP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(RP)-46at]的合成
粗品(RP)-46at如实施例315所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4at。
实施例317.(RP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(RP)-46ct]的合成
粗品(RP)-46ct如实施例315所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4ct。
实施例318.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基硫 代磷酸酯的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(RP)-46gt]的合成
粗品(RP)-46gt如实施例315所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4g。
实施例319.(SP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(SP)-46tt]的合成
粗品(SP)-46tt如实施例315所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4tt。
实施例320.(SP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(SP)-46at]的合成
粗品(SP)-46at如实施例315所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4at。
实施例321.(SP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(SP)-46ct]的合成
粗品(SP)-46ct如实施例315所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4ct。
实施例322.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(SP)-46gt]的合成
粗品(SP)-46gt如实施例315所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4gt。
实施例323.(RP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(RP)-46uu]的合成
粗品(RP)-46uu如实施例315所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10uu。
实施例324.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(RP)-46au]的合成
粗品(RP)-46au如实施例315所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10au。
实施例325.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(RP)-46cu]的合成
粗品(RP)-46cu如实施例315所述而生成，使用替代(RP)-4tt的 (RP)-10cu。
实施例326.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(RP)-46gu]的合成
粗品(RP)-46gu如实施例315所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10gu。
实施例327.(SP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(SP)-46uu]的合成
粗品(SP)-46uu如实施例315所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10uu。
实施例328.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(SP)-46au]的合成
粗品(SP)-46au如实施例315所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10au。
实施例329.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(SP)-46cu]的合成
粗品(SP)-46cu如实施例315所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10au。
实施例330.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(SP)-46gu]的合成
粗品(SP)-46gu如实施例315所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10gu。
实施例331.(RP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(RP)-47uu]的合成
粗品(SP)-47uu如实施例315所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14uu。
实施例332.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(RP)-47au]的合成
粗品(RP)-47au如实施例315所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14au。
实施例333.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯 的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(RP)-47cu]的合成
粗品(RP)-47cu如实施例315所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14cu。
实施例334.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(RP)-47gu]的合成
粗品(RP)-47gu如实施例315所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14gu。
实施例335.(SP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(SP)-47uu]的合成
粗品(SP)-47uu如实施例315所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14uu。
实施例336.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(SP)-47au]的合成
粗品(SP)-47au如实施例315所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14au。
实施例337.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(SP)-47cu]的合成
粗品(SP)-47cu如实施例315所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14cu。
实施例338.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(SP)-47gu]的合成
粗品(SP)-47gu如实施例315所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14gu。
方案T：硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸的合成
实施例339.如方案T所述，(RP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-48tt]的合成。
(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-4tt](100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水二氯甲烷(1mL)。混合物用N，O-二甲基丙烯酰胺(100μmol)的无水(100μmol)二氯甲烷溶液处理。1小时后，混合物被浓缩，然后溶解于三氢氟酸三乙胺(500μL)。混合物在室温下搅拌15小时。然后向混合物添加0.1M乙酸铵缓冲液(2.5mL)，混合物用Et2O(3×3mL)洗涤。合并的有机层用0.1M乙酸铵缓冲液(3mL)反萃取。然后，合并的水层被减压浓缩至干燥，残余物通过反相柱色谱[在0.1M乙酸铵缓冲液(pH7.0)中乙腈0-10％的线性梯度液]纯化以提供(RP)-48tt。
实施例340.(RP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-48at]的合成。
粗品(RP)-48at如实施例339所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4at。
实施例341.(RP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-48ct]的合成
粗品(RP)-48ct如实施例339所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4ct。
实施例342.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基硫 代磷酸酯的硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-48gt]的合成
粗品(RP)-48gt如实施例339所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4g。
实施例343.(SP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-48tt]的合成
粗品(SP)-48tt如实施例339所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4tt。
实施例344.(SP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-48at]的合成
粗品(SP)-48at如实施例339所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4at。
实施例345.(SP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-48ct]的合成
粗品(SP)-48ct如实施例339所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4ct。
实施例346.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-48gt]的合成
粗品(SP)-48gt如实施例339所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4gt。
实施例347.(RP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-48uu]的合成
粗品(RP)-48uu如实施例339所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10uu。
实施例348.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-48au]的合成
粗品(RP)-48au如实施例339所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10au。
实施例349.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-48cu]的合成
粗品(RP)-48cu如实施例339所述而生成，使用替代(RP)-4tt的 (RP)-10cu。
实施例350.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-48gu]的合成
粗品(RP)-48gu如实施例339所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10gu。
实施例351.(SP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-48uu]的合成
粗品(SP)-48uu如实施例339所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10uu。
实施例352.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-48au]的合成
粗品(SP)-48au如实施例339所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10au。
实施例353.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-48cu]的合成
粗品(SP)-48cu如实施例339所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10au。
实施例354.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-48gu]的合成
粗品(SP)-48gu如实施例339所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10gu。
实施例355.(RP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-49uu]的合成
粗品(SP)-49uu如实施例339所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14uu。
实施例356.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-49au]的合成
粗品(RP)-49au如实施例339所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14au。
实施例357.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯 的硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-49cu]的合成
粗品(RP)-49cu如实施例339所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14cu。
实施例358.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-49gu]的合成
粗品(RP)-49gu如实施例339所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14gu。
实施例359.(SP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-49uu]的合成
粗品(SP)-49uu如实施例339所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14uu。
实施例360.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-49au]的合成
粗品(SP)-49au如实施例339所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14au。
实施例361.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-49cu]的合成
粗品(SP)-49cu如实施例339所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14cu。
实施例362.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-烷基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-49gu]的合成
粗品(SP)-49gu如实施例339所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14gu。
方案U：硫代N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸的合成
实施例363.如方案U所述，(RP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-50tt]的合成。
(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-4tt](100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水二氯甲烷(1mL)。混合物用N-甲基-N-乙酰氧基-丙烯酰胺(100μmol)的无水(100μmol)二氯甲烷溶液处理。1小时后，混合物被浓缩，然后溶解于三氢氟酸三乙胺(500μL)。混合物在室温下搅拌15小时。然后向混合物添加0.1M乙酸铵缓冲液(2.5mL)，混合物用Et2O(3×3mL)洗涤。合并的有机层用0.1M乙酸铵缓冲液(3mL)反萃取。然后，合并的水层被减压浓缩至干燥，残余物通过反相柱色谱[在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中乙腈0-10％的线性梯度液]纯化以提供(RP)-50tt。
实施例364.(RP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-50at]的合成。
粗品(RP)-50at如实施例363所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4at。
实施例365.(RP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-50ct]的合成
粗品(RP)-50ct如实施例363所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4ct。
实施例366.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基硫 代磷酸酯的硫代N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-50gt]的合成
粗品(RP)-50gt如实施例363所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-4g。
实施例367.(SP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-50tt]的合成
粗品(SP)-50tt如实施例363所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4tt。
实施例368.(SP)-6-N-苯甲酰基-脱氧腺苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-50at]的合成
粗品(SP)-50at如实施例363所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4at。
实施例369.(SP)-4-N-苯甲酰基-脱氧胞苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-50ct]的合成
粗品(SP)-50ct如实施例363所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4ct。
实施例370.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-脱氧鸟苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-50gt]的合成
粗品(SP)-50gt如实施例363所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-4gt。
实施例371.(RP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-50uu]的合成
粗品(RP)-50uu如实施例363所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10uu。
实施例372.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-50au]的合成
粗品(RP)-50au如实施例363所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10au。
实施例373.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-50cu]的合成
粗品(RP)-50cu如实施例363所述而生成，使用替代(RP)-4tt的 (RP)-10cu。
实施例374.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-50gu]的合成
粗品(RP)-50gu如实施例363所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(RP)-10gu。
实施例375.(SP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-50uu]的合成
粗品(SP)-50uu如实施例363所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10uu。
实施例376.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-50au]的合成
粗品(SP)-50au如实施例363所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10au。
实施例377.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-50cu]的合成
粗品(SP)-50cu如实施例363所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10au。
实施例378.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-50gu]的合成
粗品(SP)-50gu如实施例363所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-10gu。
实施例379.(RP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-51uu]的合成
粗品(SP)-51uu如实施例363所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14uu。
实施例380.(RP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-51au]的合成
粗品(RP)-51au如实施例363所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14au。
实施例381.(RP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯 的硫代N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-51cu]的合成
粗品(RP)-51cu如实施例363所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14cu。
实施例382.(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸[(RP)-51gu]的合成
粗品(RP)-51gu如实施例363所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14gu。
实施例383.(SP)-尿苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-51uu]的合成
粗品(SP)-51uu如实施例363所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14uu。
实施例384.(SP)-6-N-苯甲酰基-腺苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-51au]的合成
粗品(SP)-51au如实施例363所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14au。
实施例385.(SP)-4-N-苯甲酰基-胞苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-51cu]的合成
粗品(SP)-51cu如实施例363所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14cu。
实施例386.(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-鸟苷-2′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代N-乙酰氧基氧肟酸酯前核苷酸[(SP)-51gu]的合成
粗品(SP)-51gu如实施例363所述而生成，使用替代(RP)-4tt的(SP)-14gu。
方案V：硫代三烷基铵乙基前核苷酸的合成
实施例387.如方案V所述，(RP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代三烷基铵乙基前核苷酸[(RP)-53tt]的合成。
(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(二甲氧基三苯甲基)胸苷-3′-基3′-O-(二甲氧基三苯甲基)胸苷-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-52tt]通过实施例1中用于制备化合物4tt的相同方法(方案A)制备。化合物(SP)-52tt(100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水二甲基甲酰胺(1mL)。混合物用2-碘乙基三甲基碘化铵(100μmol)的无水DMF(0.5mL)溶液处理。1小时后，混合物被浓缩，然后溶解于CH2Cl2(1000μL)，添加三氯乙酸(50μmol)。混合物在室温下搅拌15小时。然后向混合物添加0.1M乙酸铵缓冲液(2.5mL)，混合物用Et2O(3×3mL)洗涤。合并的有机层用0.1M乙酸铵缓冲液(3mL)反萃取。然后，合并的水层被减压浓缩至干燥，残余物通过反相柱色谱[在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中乙腈0-10％的线性梯度液]纯化以提供(RP)-53tt。
方案W：硫代三烷基铵乙基前核苷酸的合成
实施例388.如方案W所述，(RP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的二硫化物前核苷酸[(RP)-54tt]的合成。
化合物(SP)-52tt(100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水乙醇(1mL)。混合物用对硝基苯亚磺酰氯(200μmol)的无水(100μmol)乙醇处理。1小时后，混合物被浓缩，然后溶解于CH2Cl2(1000μL)，添加三氯乙酸(50μmol)。混合物在室温下搅拌15小时。然后向混合物添加0.1M乙酸铵缓冲液(2.5mL)，混合物用Et2O(3×3mL)洗涤。合并的有机层用0.1M乙酸铵缓冲液(3mL)反萃取。然后，合并的水层被减压浓缩至干燥，残余物通过反相柱色谱[在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中乙腈0-10％的线性梯度液]纯化以提供(RP)-54tt。
方案X：2-硫代新戊酰乙基核酸前药的合成
实施例389.如方案X所述，(RP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的 2-硫代新戊酰乙基核酸前药[(RP)-56tt]的合成。
(RP)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)胸苷-3′-基3′-O-(二甲氧基三苯甲基)胸苷-5′-基H-膦酸酯[(RP)-55tt]通过实施例8中用于制备化合物7tt的相同方法(方案B)制备。化合物(RP)-55tt(100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水吡啶(1mL)。添加N-氯琥珀酰亚胺(0.1mmol)，混合物在0℃下搅拌2小时。混合物被浓缩并溶解于无水吡啶(1mL)。上述混合物用2-羟基乙基硫代特戊酸钠(100μmol)的无水(100μmol)吡啶溶液处理。1小时后，混合物被浓缩，然后溶解于CH2Cl2(1000μL)，并添加三氯乙酸(50μmol)。混合物在室温下搅拌15小时。然后向混合物添加0.1M乙酸铵缓冲液(2.5mL)，混合物用Et2O(3×3mL)洗涤。合并的有机层用0.1M乙酸铵缓冲液(3mL)反萃取。然后，合并的水层被减压浓缩至干燥，残余物通过反相柱色谱[在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中乙腈0-10％的线性梯度液]纯化以提供(RP)-56tt。
方案Y：2-乙氧羰基乙基核酸前药的合成
实施例390.如方案Y所述，(RP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的2-乙氧羰基乙基核酸前药[(RP)-57tt]的合成。
化合物(RP)-55tt(100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水吡啶(1mL)。添加N-氯琥珀酰亚胺(0.1mmol)，混合物在0℃搅拌2小时。混合物被浓缩并溶解于无水吡啶(1mL)。上述混合物用2-羟基乙基丙酸乙酯(100μmol)的无水(100μmol)吡啶溶液处理。1小时后，混合物被浓缩，然后溶解于CH2Cl2(1000 μL)，添加三氯乙酸(50μmol)。混合物在室温下搅拌15小时。然后向混合物添加0.1M乙酸铵缓冲液(2.5mL)，混合物用Et2O(3×3mL)洗涤。合并的有机层用0.1M乙酸铵缓冲液(3mL)反萃取。然后，合并的水层被减压浓缩至干燥，残余物通过反相柱色谱[在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中乙腈0-10％的线性梯度液]纯化以提供(RP)-57tt。
方案Z：硫代(环己基)酰氧基前核苷酸的合成
实施例391.如方案Z所述，(RP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基硫代磷酸酯的硫代(环己基)酰氧基前核苷酸[(RP)-58tt]的合成。
化合物(SP)-52tt(100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水吡啶(1mL)。混合物用氯代甲基环己基乙酸乙酸酯(100μmol)的无水(100μmol)二氯甲烷溶液处理。1小时后，混合物被浓缩，然后溶解于CH2Cl2(1000μL)，添加三氯乙酸(50μmol)。混合物在室温下搅拌15小时。然后向混合物添加0.1M乙酸铵缓冲液(2.5mL)，混合物用Et2O(3×3mL)洗涤。合并的有机层用0.1M乙酸铵缓冲液(3mL)反萃取。然后，合并的水层被减压浓缩至干燥，残余物通过反相柱色谱[在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中乙腈0-10％的线性梯度液]纯化以提供(RP)-58tt。
方案AA：2-羧基乙基核酸前药的合成
实施例392.如方案AA所述，(RP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的2-羧基乙基核酸前药[(RP)-59tt]的合成。
化合物(RP)-55tt(100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水吡啶(1mL)。添加N-氯琥珀酰亚胺(0.1mmol)，混合物在0℃下搅拌2小时。混合物被浓缩并溶解于无水吡啶(1mL)。上述混合物用2-羟基乙基丙酸叔丁酯(100μmol)的无水(100μmol)吡啶溶液处理。1小时后，混合物被浓缩，然后溶解于CH2Cl2(1000μL)，并添加三氯乙酸(50μmol)。混合物在室温下搅拌15小时。然后向混合物添加0.1M乙酸铵缓冲液(2.5mL)，混合物用Et2O(3×3mL)洗涤。合并的有机层用0.1M乙酸铵缓冲液(3mL)反萃取。然后，合并的水层被减压浓缩至干燥，残余物通过反相柱色谱[在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中乙腈0-10％的线性梯度液]纯化以提供(RP)-59tt。
方案BB：2-((2-羟基乙基)二硫化物)乙基核酸前药的合成
实施例393.如方案BB所述，(RP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的2-((2-羟基乙基)二硫化物)乙基核酸前药[(RP)-60tt]的合成。
化合物(RP)-7tt(100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水吡啶(1mL)。添加N-氯琥珀酰亚胺(0.1mmol)，混合物在0℃搅拌2小时。混合物被浓缩并溶解于无水吡啶(1mL)。上述混合物用2-((2-(叔丁基二苯基甲硅烷氧基)乙基)二硫烷基)乙醇(100μmol)的无水(100μmol)吡啶溶液处理。1小时后，混合物被浓缩，然后溶解于三氢氟酸三乙胺(500μL)。混合物在室温下搅拌15小时。然后向混合物添加0.1M乙酸铵缓冲液(2.5mL)，混合物用Et2O(3×3mL)洗涤。合并的有机层用0.1M乙酸铵缓冲液(3mL)反萃取。然后，合并的水层被减压浓缩至干燥，残余物通过反相柱色谱[在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中乙腈0-10％的线性梯度液]纯化以提供(RP)-60tt。
方案CC：2-(甲基硫代磺酸酯)乙基核酸前药的合成
实施例394.如方案CC所述，(RP)-胸苷-3′-基胸苷-5′-基膦酸酯的2-(甲基硫代磺酸酯)乙基核酸前药[(RP)-61tt]的合成。
化合物(RP)-55tt(100μmol)通过与无水吡啶反复共蒸发而被干燥，然后溶解于无水吡啶(1mL)。添加N-氯琥珀酰亚胺(0.1mmol)，混合物在0℃搅拌2小时。混合物被浓缩并溶解于无水吡啶(1mL)。上述混合物用S-2-羟基乙基甲基硫代磺酸酯(100μmol)的无水(100μmol)吡啶溶液处理。1小时后，混合物被浓缩，然后溶解于CH2Cl2(1000μL)，添加三氯乙酸(50μmol)。混合物在室温下搅拌15小时。然后向混合物添加0.1M乙酸铵缓冲液(2.5mL)，混合物用Et2O(3×3mL)洗涤。合并的有机层用0.1M乙酸铵缓冲液(3mL)反萃取。然后，合并的水层被减压浓缩至干燥，残余物通过反相柱色谱[在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中乙腈0-10％的线性梯度液]纯化以提供(RP)-61tt。
方案DD：从H-膦酸酯胸苷二聚体合成前药分子
使用二核苷H-膦酸酯和O-亲核试剂的单独非对映体制备磷酸酸酯的碘介导的氧化偶联的化学选择性和立体特异性是本领域已知的(Nucleosides，Nucleotides&NuleicAcids 2003，第22卷，第5-8期，1467-1469)。产物通过硅胶色谱纯化并通过31P和1H NMR波谱鉴定。产物进一步通过反相HPLC纯化用于动力学研究。
方案DD
实施例395.用于合成63a、63b和63c的一般程序(方案DD)
(RP，SP)-5′-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷-3′-基3′-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷-5′-基H-膦酸酯(62)(113.5mg，100μmol)在高真空下干燥过夜并溶解于ACN(2ml)和吡啶(2ml)。添加叔丁基二苯基甲硅烷基氯(52μL，200μmol)和I2(76mg，300μmol)。反应混合物在冰中冷却，向反应混合物滴加溶解于ACN(2mL)的各自的烷化试剂(1mmol)。混合物在氩气下搅拌10分钟。粗反应混合物的TLC显示向产物的定量转化。蒸发溶剂，残余物溶解于乙酸乙酯并用5％Na-2S2O3、盐水洗涤，并经Na2SO4干燥。乙酸乙酯层在减压下浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化以提供(RP，SP)-5′-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷-3′-基3′-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷-5′-基磷酸三酯63a、63b和63c，产率为80-90％。
用于合成64a、64b和64c的一般程序
3％DCA/DCM被缓慢添加至DMTr保护的三酯，使反应在室温下搅拌30分钟。(反应用甲醇猝灭，溶剂被蒸发，残余物通过二氧化硅柱纯化。在化合物63a的情况下，TBDMS脱保护同时发生。以定量收率获得化合物64a、64b和64c。
化合物63a：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.58-7.18(m，20H)，6.87-6.78(m，8H)，6.49-6.27(m，2H)，5.11-5.07(m，1H)，4.2-4.05(m，3H)，3.99-3.87(m，1H)，3.85-3.73(m，13H)，3.73-3.56(m，1H)，3.54-3.26(m，2H)，2.94-2.66(m，8H)，1.97-1.78(m，4H)，1.76-1.54(m，1H)，1.43-1.3(m，3H)，0.94-0.78(m，9H)，0.11-0.03(m，6H).31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.19，-1.26(两种非对映体)。
化合物63b：1H NMR(400MHz，CDCl3+痕量Py-D5)δ9.72-9.45(m，2H)，7.62-7.18(m，20H)，6.90-6.81(m，8H)，6.48-6.31(m，2H)，5.18-5.10(m，1H)，4.31-4.09(m，3H)，4.03-3.91(m，1H)，3.88-3.74(m，15H)，3.74-3.62(m，1H)，3.54-3.31(m，2H)，2.89-2.76(m，4H)，2.67-2.31(m，2H)，1.98-1.89(m，1H)，1.88，1.85(2s，3H，非对映体)，1.76-1.64(m，1H)，1.39(s，3H).31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.24，-1.27(两种非对映体)。
化合物63c：1H NMR(400MHz，CDCl3+痕量Py-D5)δ7.6-7.16(m，20H)，6.9-6.77(m，8H)，6.49-6.27(m，2H)，5.18-5.06(m，1H)，4.32-4.04(m，2H)，4.0-3.85(m 3H)，3.82-3.71(m，12H)，3.71-3.57(m，1H)，3.55-3.27(m，2H)，3.07-2.88(m，2H)，2.62-2.24(m，2H)，1.97-1.89(m，1H)，1.89-1.81(m，3H)，1.78-1.59(m，3H)，1.45-1.32(m，3H)，1.22-1.14(m，9H).31PNMR(162MHz，CDCl3)δ-1.23，-1.27(两种非对映体).
化合物64a：1H NMR(400MHz，D2O)δ7.52(s，1H)，7.42(s，1H)，6.28-6.07(m，2H)，5.07-4.87(m，1H)，4.54-4.38(m，1H)，4.37-4.19(m，3H)，4.19-3.95(m，2H)，3.80-3.50(m，4H)，2.99-2.62(2m，4H)，2.60-2.17(m，4H)，1.85-1.60(m，6H).31P NMR(162MHz，CD3OD)δ-1.37，-1.41(两种非对映体).计算的质量＝682.66，ESI-ve模式中观察到的质量＝681.22
化合物64b：1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.74，7.49(2s，2H)，6.28-6.19(m，2H)，5.10-5.04(m，1H)，4.41-4.23(m，4H)，4.19-4.15(m，1H)，4.04-3.98(m，1H)，3.78-3.69(m，4H)，3.00-2.77(m，4H)，2.55-2.21(m，4H)，1.86，1.83(2s，6H).31P NMR(162MHz，CD3OD)δ-1.37，-1.41(两种非对映体).计算的质量＝684.63，ESI+ve模式中观察到的质量＝683.14
化合物64c：1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.799(s，1H)，7.54(s，1H)，6.32-6.24(m，2H)，5.17-5.07(m，1H)，4.48-4.26(m，3H)，4.26-4.12(m，3H)，4.08-3.99(m，1H)，3.21-3.15(m，2H)，2.61-2.48(m，1H)，2.46-2.16(m，3H)，1.9(s，3H)，1.87(s，3H)，1.27-1.19(d，9H).31PNMR(162MHz，CD3OD)δ-1.53，-1.60(两种非对映体).计算的质量＝690.66，ESI-ve模式中观察到的质量＝689.53
64a、64b和64c的HPLC纯化
使用与2487UV检测器、Phenomenex Luna 5u C18(2) 250x10mm柱和MassLynx v4.1组合的Waters 2525BGM进行反相纯化。使用流速5ml/min的水和乙腈梯度液。
用于化合物64a和64b的梯度液：10至50％B，30分钟
用于化合物64c的梯度液：20至60％B，30分钟
在254和280nm监测产物峰。
分析型HPLC条件
通过采用结合Empower软件的自动化Alliance Waters e2695HPLC仪器的反相HPLC进行定量分析。XBridge C18 3.5um，4.6x150mm，Waters part#186003034A被过滤并通过UV(254nm和280nm)进行检测。开发了能够在相同色谱内分辨前药、中间体和释放药物的梯度洗脱系统(表1)；流动相A由20mM乙酸铵的水溶液组成；流动相B是乙腈。
表1
柱温：60℃
时间 流速 ％A ％B 曲线
0.01 1.00 99.0 1.0
5.00 1.00 99.0 1.0 1
30.00 1.00 75.0 25.0 6
30.50 1.00 10.0 90.0 6
35.00 1.00 10.0 90.0 1
35.50 1.00 99.0 1.0 6
42.00 1.00 99.0 1.0 1
实施例396.谷胱甘肽辅助的前药释放
向20μL的64水溶液(2O.D.)混入100μL 10X PBS和630μLH2O。使混合物保持在设为37℃的热板中。250μL新鲜制备的20mM还原型L-谷胱甘肽被添加至上述混合物，在反应混合物产生5mM GSH浓度，这等于胞质浓度。以10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、1.5小时、2小时和2.5小时的时间间隔取100μl小份。每个小份立即用400μl100mM柠檬酸盐缓冲液(pH 4)猝灭，并通过反相HPLC和LC/MS分析。
方案EE：谷胱甘肽裂解的机制
化合物64b+GSH的反应混合物在20个时间点的LCMS
使用Waters Acquity UPLC和SDS鉴定前药释放期间生成的产物。使用XBridgec18 3.5um，4.6x150mm，Waters part#186003034以及溶剂系统A：5mM甲酸铵/水和B：乙腈，具有表2所示的线性梯度。
表2
时间 流速 ％A ％B 曲线
0.0 1.00 99.0 1.0
5.00 1.00 80 20 6
7 1.00 5 95 6
7.5 1.00 99 1 6
9 1.00 99 1 1
图1提供了化合物64a+GSH的代表性HPLC谱。
图2提供了化合物64a、谷胱甘肽加合物和从前-部分释放之后最终产物的代表性HPLC谱。
图3中，因为与底物相比谷胱甘肽浓度的过量极大，化合物64a和64b显示假一级动力学并因此在反应过程中保持有效不变。因为被鉴定为二核苷三酯的谷胱甘肽加合物的中间体的累积，清除起始材料和形成产物的曲线不是镜像(参见图2和图4)。
实施例397.羧酸酯酶辅助的化合物64c的裂解
方案FF
猪肝酯酶(Sigma Aldrich，产品号：E2884)是在3.2M硫酸铵pH＝8.0的悬浮液，浓度36mg蛋白质/mL和154单位/mg蛋白质。根据产品规格，一个单位在pH＝8.0、25℃下每分钟水解1μM丁酸乙酯为丁酸和乙醇。化合物64c(0.1O.D，5.5nmol)在10μL 1XPBS中37℃温育10分钟。在10个小瓶中进行PLE的连续稀释，各自浓度为在10μL 1XPBS中1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9个单位。蛋白质溶液在37℃温育10分钟，然后各自添加至含有化合物64c的10个小瓶。混合物在37℃下贮存30分钟，通过分析型HPLC和LCMS分析。64c在小瓶中被完全转化为磷酸二酯，蛋白质浓度为1、10-1和10-2。没有观察到副反应。蛋白质浓度为10-6至10-9的小瓶中无反应。含有蛋白质浓度10-3和10-4的小瓶中观察到一些产物。这表明，这些浓度适合使用PLE研究药物释放的动力学。时间依赖动力学将使用范围10-3至10-4/～6nmol化合物64c范围内的浓度来研究。
溶解于900μL 1XPBS的化合物64c(5O.D.，2.9μmol)在37℃温育10分钟。100μL1xPBS中猪肝酯酶(1U)被添加至上述混合物并贮存在37℃。在0分钟、15分钟和45分钟抽取100μL小份，用100μL乙腈猝灭，样品在冰浴中冷却。样品通过XBridge C-18 3.5μm，4.6x150mm上的UPLC SQD分析，溶剂系统A：5mM甲酸铵/水和B：乙腈，具有表3所示的线性梯度。在零分钟，仅观察到化合物64c，在15分钟生成近50％的产物，反应在45分钟完成。因此，TpT二酯64c通过羧酸酯酶处理而被释放，无可检测的任何中间体的累积。
表3
时间 流速 ％A ％B 曲线
0.0 1.00 99.0 1.0
2.0 1.00 99.0 1.0 1
7.0 1.00 60.0 40.0 6
9.0 1.00 5.0 95.00 6
9.5 1.00 99.0 1.0 6
11.0 1.00 99.0 1.0 1
实施例398.胰腺癌的治疗
考虑了用于治疗胰腺癌受试者的方法，该方法包括给受试者施用治疗有效量的包含实施例242的2’-5’-A3S-乙酰基-2-硫代乙基前核苷酸的组合物。与作为单剂施用的吉西他滨或组合施用的吉西他滨和厄洛替尼相比，预期治疗实现增加的肿瘤抑制。
实施例399.细胞穿透试验
P 32- 标记的核酸药物
使用[32P]dNTP放射性核苷酸(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)制备标记的核酸前药和母体药物，以合成本文所述的包含手性磷部分的核酸分子和相应母体药物。
细胞培养和穿透试验
选择在DMEM-10％FBS中生长的HeLa(粘附的人宫颈癌)细胞或在90％RPMI 1640-10％FBS中生长的BxPC-3(粘附的人胰腺癌)细胞的培养物。为了使细胞培养物铺板，用0.05％胰蛋白-EDTA将细胞胰蛋白酶化。通过在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中标准的台盼蓝染色来分析存活和细胞计数。稀释细胞并以6孔格式接种1x105细胞/孔。在37℃、5％CO2气氛中温育16小时或直至细胞粘附并生长到至少80％汇合。
将标记的前药混合物加至前药实验孔以实现预定范围的终浓度(例如，1μM、5μM和10μM)。将标记的母体药物混合物加至母体药物实验孔以实现预定范围的终浓度(例如，1μM、5μM和10μM)。(保留未处理的细胞用于阴性对照。使实验处理的细胞温育预定的时间范围(例如，15分钟、1小时、4小时和8小时)。
前药穿透的P 32 检测和确定
为了收获，用无血清培养基洗涤孔3次，并施加非变性的含有1％Triton X100(Cell Signaling Technology，Inc.，Boston，MA)的TRIS-HCl裂解缓冲液并简短进行声处理。通过标准收集技术收集胞质和核级分。
使用标准放射检测技术进行药物穿透的测量。为了通过闪烁计数仪检测，将50μL样品添加至5mL闪烁混合物并通过液体闪烁计数测量β-发射。每个样品小份通过Bradford比色测定来分析以通过总蛋白质浓度标准化放射计数。
实施例400.使用报道基因的功能细胞穿透试验
融合基因载体的组装和细胞系的转染
当使用核酸前药抑制特定基因表达，例如反义寡核苷酸或反基因寡核苷酸，功能穿透试验可能是需要的。在DMEM-10％FBS中培养HeLa(粘附人宫颈癌)细胞。将感兴趣的基因克隆入可商业途径获得的载体，例如Living Colors 荧光蛋白载体，Clontech，Mountain View，CA。使用标准技术进行DNA构建体对细胞的转染和稳定转染子的筛选。结果是感兴趣基因和荧光报道分子(例如，蛋白AcGFP1)的组成型表达。
抑制特定基因表达的核酸药物
制备本文描述的含有手性磷部分的核酸分子和相应母体药物以破坏载体的基因启动子序列。
细胞培养和穿透试验
通过首先用0.05％胰蛋白酶-EDTA铺板将细胞胰蛋白酶化而制备转染的培养物。通过在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中标准的台盼蓝染色来分析存活和细胞计数。稀释细胞并以6孔格式接种1x105细胞/孔。在37℃、5％CO2气氛中温育16小时或直至细胞粘附并生长到至少80％汇合。
首先在转染后8-12小时检测荧光信号。将前药混合物加至前药实验孔以实现预定范围的终浓度(例如，1μM、5μM和10μM)。将母体药物混合物加至母体药物实验孔以实现预定范围的终浓度(例如，1μM、5μM和10μM)。(保留未处理的细胞用于阴性对照。使实验处理 的细胞温育预定的时间范围(例如，15分钟、1小时、4小时和8小时)。
前药穿透的报道基因表达测定
为了收获，用无血清培养基洗涤孔3次并再次胰蛋白酶化。使用标准荧光检测技术进行药物穿透的测量。为了用显微镜定量荧光测量和用流式细胞仪定量测量，使用对荧光报道分子激发性的波长(例如，对于AcGFP1为488nm)。
虽然在本文已经显示并描述了本发明的优选实施方案，对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅作为实施例来提供。目前，本领域技术人员会想到不背离本发明的许多变化、改变和替代。应理解，可以采用本文描述的本发明实施方案的各种替代方案来实施本发明。意图所附权利要求确定本发明范围并且涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同替代。

Claims (42)

1.反义寡核苷酸，其具有下列结构：
其中R1是-OH或-ORa；
Ra是封闭基团；
R2在每种情况下独立地为氢、-OH或-ORb，其中Rb是封闭基团；
Ba在每种情况下独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基；
所述寡核苷酸的X部分独立地选自–OCH2CH2S-S(O)2R10、-OCH2CH2S-SCH2CH2OH、-OCH2CH2CO2H、
R3是氢、封闭基团、连接至载体的连接部分或连接至核酸的连接部分；
R10是具有1至4个碳原子的烷基；
R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；
R12是氢或烷基；
Z是S或O；
q是0、1或3；
R15和R16独立地为氢或甲基；
R17选自烷基、芳基或CH2CH＝CH2；并且
n是10至200的整数；以及
其中每一X-膦酸酯独立地具有RP构型或SP构型；以及
所述通式1的寡核苷酸的每一X-膦酸酯部分的非对映异构体纯度大于98％。
2.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中通过31P NMR波谱或反相HPLC测定，所述通式1的寡核苷酸的每一X-膦酸酯部分的非对映异构体纯度大于98％。
3.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中每一X-膦酸酯部分具有RP构型。
4.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中每一X-膦酸酯部分具有SP构型。
5.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中R10是甲基。
6.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中R11是甲基。
7.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中R12是甲基。
8.寡核苷酸组合物，所述寡核苷酸组合物包含多个具有下列结构的反义寡核苷酸：
其中R1是-OH或-ORa；
Ra是封闭基团；
R2在每种情况下独立地为氢、-OH或-ORb，其中Rb是封闭基团；
Ba在每种情况下独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基；
所述寡核苷酸的X部分独立地选自–OCH2CH2S-S(O)2R10、-OCH2CH2S-SCH2CH2OH、-OCH2CH2CO2H、
其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；
R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；
R12是氢或烷基；
R3是氢、封闭基团、连接至载体的连接部分或连接至核酸的连接部分；并且
n是10至200的整数，以及
其中每一X-膦酸酯独立地具有RP构型或SP构型；以及
在所述组合物内每一X-部分的非对映异构体纯度大于98％。
9.如权利要求8所述的组合物，其中通过31P NMR波谱或反相HPLC测定，所述通式1的寡核苷酸的每一X-膦酸酯部分的非对映异构体纯度大于98％。
10.如权利要求8所述的组合物，其中每一X-膦酸酯部分具有RP构型。
11.如权利要求8所述的组合物，其中每一X-膦酸酯部分具有SP构型。
12.如权利要求8所述的组合物，其中R10是甲基。
13.如权利要求8所述的组合物，其中R11是甲基。
14.如权利要求8所述的组合物，其中R12是甲基。
15.如权利要求8所述的组合物，其中所述组合物通过包括如下步骤的方法制备：
(1)使包含非手性H-膦酸酯部分的分子与包含5’-OH部分的核苷反应以形成缩合的中间体；以及
(2)使所述缩合的中间体转化为包含手性X-膦酸酯部分的核酸前药。
16.如权利要求8所述的组合物，其中所述寡核苷酸通过方案10中所描述的方法制备。
17.如权利要求15所述的组合物，其中所述组合物中的寡核苷酸通过方案10中所描述的方法制备。
18.如权利要求17所述的组合物，其中方案10中所描述的方法包括重复的循环直至达到所期望的寡核苷酸链长度。
19.药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求8所述的组合物和药物可接受的赋形剂。
20.反义寡核苷酸，其具有下列结构：
其中R1是-OH或-ORa；
Ra是封闭基团；
R2在每种情况下独立地为氢、-OH或-ORb，其中Rb是封闭基团；
Ba在每种情况下独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基；
所述寡核苷酸的X部分独立地为–OCH2CH2S-S(O)2R10、-OCH2CH2S-SCH2CH2OH、-OCH2CH2CO2H、
R3是氢、封闭基团、连接至载体的连接部分或连接至核酸的连接部分；
R10是具有1至4个碳原子的烷基；
R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；
R12是氢或烷基；并且
n是10至200的整数；以及
其中每一X-膦酸酯独立地具有RP构型或SP构型；以及
所述通式2的寡核苷酸的每一X-膦酸酯部分的非对映异构体纯度大于98％。
21.如权利要求20所述的寡核苷酸，其中通过31P NMR波谱或反相HPLC测定，所述通式2的寡核苷酸的每一X-膦酸酯部分的非对映异构体纯度大于98％。
22.如权利要求20所述的寡核苷酸，其中每一X-膦酸酯部分具有RP构型。
23.如权利要求20所述的寡核苷酸，其中每一X-膦酸酯部分具有SP构型。
24.如权利要求20所述的寡核苷酸，其中R10是甲基。
25.如权利要求20所述的寡核苷酸，其中R11是甲基。
26.如权利要求20所述的寡核苷酸，其中R12是甲基。
27.寡核苷酸组合物，所述寡核苷酸组合物包含多个具有下列结构的反义寡核苷酸：
其中R1是-OH或-ORa；
Ra是封闭基团；
R2在每种情况下独立地为氢、-OH或-ORb，其中Rb是封闭基团；
Ba在每种情况下独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基；
所述寡核苷酸的X部分独立地选自–OCH2CH2S-S(O)2R10、-OCH2CH2S-SCH2CH2OH、-OCH2CH2CO2H、
其中R10是具有1至4个碳原子的烷基；
R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；
R12是氢或烷基；
R3是氢、封闭基团、连接至载体的连接部分或连接至核酸的连接部分；并且
n是10至200的整数；以及
其中每一X-膦酸酯独立地具有RP构型或SP构型；以及
在所述组合物内每一X-部分的非对映异构体纯度大于98％。
28.如权利要求27所述的组合物，其中通过31P NMR波谱或反相HPLC测定，所述通式2的寡核苷酸的每一X-膦酸酯部分的非对映异构体纯度大于98％。
29.如权利要求27所述的组合物，其中每一X-膦酸酯部分具有RP构型。
30.如权利要求27所述的组合物，其中每一X-膦酸酯部分具有SP构型。
31.如权利要求27所述的组合物，其中R10是甲基。
32.如权利要求27所述的组合物，其中R11是甲基。
33.如权利要求27所述的组合物，其中R12是甲基。
34.制备寡核苷酸的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)使包含非手性H-膦酸酯部分的分子与包含5’-OH部分的核苷反应以形成缩合的中间体；以及
(2)使所述缩合的中间体转化为包含手性X-膦酸酯部分的核酸前药，从而制备了具有下列结构的寡核苷酸：
其中R1是-OH或-ORa；
Ra是封闭基团；
R2在每种情况下独立地为氢、-OH或-ORb，其中Rb是封闭基团；
Ba在每种情况下独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基；
所述寡核苷酸的X部分独立地选自–OCH2CH2S-S(O)2R10、-OCH2CH2S-SCH2CH2OH、-OCH2CH2CO2H、
R3是氢、封闭基团、连接至载体的连接部分或连接至核酸的连接部分；
R10是具有1至4个碳原子的烷基；
R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；
R12是氢或烷基；
Z是S或O；
q是0、1或3；
R15和R16独立地为氢或甲基；
R17选自烷基、芳基或CH2CH＝CH2；并且
n是10至200的整数；以及
其中每一X-膦酸酯独立地具有RP构型或SP构型；以及
所述通式1的寡核苷酸的每一X-膦酸酯部分的非对映异构体纯度大于98％。
35.制备药物组合物的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)使包含非手性H-膦酸酯部分的分子与包含5’-OH部分的核苷反应以形成缩合的中间体；以及
(2)使所述缩合的中间体转化为包含手性X-膦酸酯部分的核酸前药，从而制备了具有下列结构的多个寡核苷酸：
其中R1是-OH或-ORa；
Ra是封闭基团；
R2在每种情况下独立地为氢、-OH或-ORb，其中Rb是封闭基团；
Ba在每种情况下独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基；
所述寡核苷酸的X部分独立地选自–OCH2CH2S-S(O)2R10、-OCH2CH2S-SCH2CH2OH、-OCH2CH2CO2H、
R3是氢、封闭基团、连接至载体的连接部分或连接至核酸的连接部分；
R10是具有1至4个碳原子的烷基；
R11是烷基、芳基、杂芳基、杂环基或环烷基；
R12是氢或烷基；
Z是S或O；
q是0、1或3；
R15和R16独立地为氢或甲基；
R17选自烷基、芳基或CH2CH＝CH2；并且
n是10至200的整数；和
其中每一X-膦酸酯独立地具有RP构型或SP构型，并且
在所述组合物内每一X-部分的非对映异构体纯度大于98％；以及
将所述多个寡核苷酸与至少一种药物可接受的载体或赋形剂混合，从而制备了所述药物组合物。
36.如权利要求34或35所述的方法，其中通过31P NMR波谱或反相HPLC测定，所述通式1的寡核苷酸的每一X-膦酸酯部分的非对映异构体纯度大于98％。
37.如权利要求34或35所述的方法，其中所述通式1的寡核苷酸的每一X-膦酸酯部分具有RP构型。
38.如权利要求34或35所述的方法，其中所述通式1的寡核苷酸的每一X-膦酸酯部分具有SP构型。
39.如权利要求34或35所述的方法，其中所述通式1的寡核苷酸中的R10是甲基。
40.如权利要求34或35所述的方法，其中所述通式1的寡核苷酸中的R11是甲基。
41.如权利要求34或35所述的方法，其中所述通式1的寡核苷酸中的R12是甲基。
42.如权利要求34或35所述的方法，其中所述寡核苷酸通过方案10中所描述的方法制备。
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