CN102596173A - 递送白介素-1受体拮抗剂的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

产生和使用富含白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)之溶液的方法和组合物。产生和分离白介素-1受体拮抗剂的方法包括将脂肪组织和/或脂肪细胞与聚丙烯酰胺珠孵育以产生白介素-1受体拮抗剂。将白介素-1受体拮抗剂与聚丙烯酰胺珠分离以获得富含白介素-1受体拮抗剂的溶液。治疗患者的炎症部位的方法包括向该炎症部位施用富含白介素-1受体拮抗剂的溶液。

Description

递送白介素-1受体拮抗剂的方法和组合物
与相关申请的交叉引用
本申请要求于2009年8月27日提交的美国实用专利申请12/549,015的优先权，该申请为2009年2月27日提交的美国专利申请No.12/394,723的部分继续申请，后者要求2008年2月27日提交的美国临时申请No.61/031,803、2008年11月21日提交的美国临时申请No.61/116,940和2009年2月24日提交的美国临时申请61/155,048的权益。上述各申请的全部公开内容以参考方式整体并入本文。
引言
本发明技术涉及包含白介素-1受体拮抗剂的组合物，以及产生、分离和递送此类组合物的方法。
白介素-1(IL-1)包括一个能够刺激淋巴细胞和巨噬细胞、活化吞噬细胞、增加前列腺素产生、促使骨关节退化、增强骨髓细胞增殖并涉及许多慢性炎性病症的细胞因子家族。IL-1能够由巨噬细胞、单核细胞和树突细胞产生，并可作为对感染的炎性应答的一部分。
IL-1的作用模式可由白介素-1受体拮抗剂蛋白(IL-1ra，也被称为“IRAP”)介导。IL-1ra与IL-1结合细胞表面上的相同受体，由此阻止IL-1向该细胞发送信号。如Arend WP，Malyak M，Guthridge CJ，GabayC(1998)″Interleukin-1receptor antagonist：role in biology″Annu.Rev.Immunol.16：27-55一文中所述，IL-1ra由白细胞分泌(包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、多形核细胞(PMN)和其他细胞)，并可调节多种IL-1相关的免疫和炎性应答。IL-1ra的产生是受几种物质刺激，包括粘附的免疫球蛋白G(IgG)、其他细胞因子以及细胞或病毒组分。IL-1ra在关节炎、结肠炎和肉芽肿性肺病中是一种重要的天然抗炎蛋白。
IL-1ra可以用于治疗类风湿性关节炎(IL-1在其中起关键作用的一种自身免疫病)，减少与该疾病相关的炎症和软骨退化。例如，KineretTM(阿那白滞素)是IL-1ra的非糖基化重组形式(Amgen Manufacturing，Ltd.，Thousand Oaks，California)。2003年7月29日授权的Sommer等人的美国专利No.6,599,873、1991年12月24日授权的Hannum等人的美国专利No.5,075,222以及2005年9月8日公布的Mellis等人的美国专利申请公开No.2005/0197293中描述了多种重组白介素-1抑制剂和治疗方法。此外，2003年9月23日授权的Reincke等人的美国专利No.6,623,472、2004年3月30日授权的Reincke等人的美国专利No.6,713,246以及2004年7月6日授权的Reincke等人的美国专利No.6,759,188中描述了从体液中产生IL-1ra的方法，包括使用自体液体。
使用IL-1ra的组合物和方法为本领域所熟知。例如，如2000年8月1日授权的Collins等人的美国专利No.6,096,728中所述，IL-1ra已作为与透明质酸组合物的一部分递送。不过，许多此类方法和组合物有与IL-1ra的稳定性和半衰期以及所提供IL-1ra的量和速率相关的问题。因此，改进递送IL-1ra的方法是理想的，并可用于治疗由白介素-1受体介导的病症和病理状况，包括炎症的控制。
概述
本发明技术提供了产生富含白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)的溶液和向人类或动物受试者的炎症部位施用此类溶液的方法。产生此类溶液的方法包括将脂肪组织与聚丙烯酰胺珠孵育。随后将富含白介素-1受体拮抗剂的溶液与聚丙烯酰胺珠分离。脂肪组织可得自所述受试者。
治疗人类或动物受试者内由白介素-1受体介导的症状(如炎症)的方法包括共施用富含白介素-1受体拮抗剂的溶液和纤维蛋白原。多个实施方案中，此类方法还包括向受试者施用凝血酶和氯化钙。炎症部位可与例如关节炎(如骨关节炎)相关。优选地，所述IL-1ra溶液是自体的。
附图说明
本发明技术从详细的描述和附图中可得到更充分的理解，其中：
图1为根据本发明技术的一个实施方案产生IL-1ra的溶液的第一种方法的图解说明；
图2为根据本发明技术的一个实施方案用于分离包含白细胞和血小板的液体体积的代表性装置的部分横断面剖视图；
图3A和3B为根据本发明技术的一个实施方案用于将一定体积的白细胞和血小板与聚丙烯酰胺珠孵育的代表性装置的部分横断面剖视图；
图4为可用于本发明技术方法中的血液组分分离装置；
图5为图4血液组分分离装置的侧视图，展示了该装置主室的内部部分；
图6为根据本发明技术的一个实施方案递送IL-1ra的方法的图解说明；和
图7为根据本发明技术的一个实施方案用于递送IL-1ra的代表性装置的部分横断面剖视图；
应当注意的是，本文所列附图旨在举例说明本发明技术中材料和方法的一般特征，其目的是为了描述某些实施方案。这些附图可以未必准确反应任何给定实施方案的特征，并且不一定旨在限定或限制本发明技术范围内的具体实施方案。
发明详述
以下技术描述的性质仅为对一个或多个发明的主题、生产和使用进行示例，并非旨在限制本申请中或可要求本申请优先权的其他申请(或其授权专利)中要求保护的任何具体发明的范围、应用或用途。在了解本文公开的技术时，必须考虑以下定义和非限定性指导。
本文所用标题(例如“引言”和“概述”)和副标题旨在仅为本公开内容中主题的大体结构，并非旨在限定本发明技术或其任何方面。特别地，“引言”中所公开的主题可能包括新技术，并且可以并不构成对现有技术的描述。“概述”中所披露的主题不是对本发明技术的完整范围或其任何实施方案的穷举或完全的公开。在本说明书章节内对材料的特定用处的分类或讨论是为方便起见，不应当由此推论该材料必须或仅能与在用于任何给定组合物时的分类一致。
本文所引用的参考文献不构成认可那些参考文献为现有技术或与本文所披露技术的专利性具有任何相关性。本说明书“发明详述”章节中引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文。
在说明本发明技术的实施方案时，描述和具体实例均仅用于说明目的，并非旨在限制本发明技术的范围。此外，对具有所述特征的多个实施方案的描述并非旨在排除具有额外特征的其他实施方案，或具有特征的不同组合的其他实施方案。提供具体实例是为阐明如何制备并使用本发明技术的装置和系统之目的，除非另有明确声明，否则均不旨在作为本发明技术已经或尚未作出或测试的给定实施方案的代表。
本文所用词“优选的”和“优选地”涉及某些情境下提供某些益处的本发明技术实施方案。不过，其他实施方案在相同或不同情况下也可以是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的描述并不意味其他实施方案不可用，并且并非旨在将其他实施方案排除于本发明技术范围外。
如本文所称，除非另有规定，否则所有组成百分数均以总组合物的重量计。本文中所用词“包括”及其变体意为非限定性，这样，对列表中各项的详述并非排除其他也可用于本发明技术的材料、组合物、装置和方法中的类似项。同样地，术语“可以”和“可能”及其变体意为非限定性，这样，提到实施方案可以或可能包含特定要素或特征时并不排除本发明技术的其他不含那些要素或特征的实施方案。
本文所用无数量词修饰的名词表示存在“至少一个”项目；如有可能，该项目可能存在多个。“约”在用于修饰数值时表示计算或测量值允许该数值有一定的稍不精确(准确数值的一些近似值；近似或合理接近的数值；大致)。如果出于某种原因，这种由“约”提供的不精确未被本领域技术人员理解为这一常用意义，那么本文中“约”至少表示由测量或使用此类参数的常用方法可产生的变异。此外，对范围的公开包括对所有不同值以及在整个范围内进一步划分的范围的公开。
本发明技术涉及白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)，包括产生IL-1ra的方法、由此类方法产生的含有IL-1ra的组合物、使用IL-1ra的方法、包含IL-1ra的治疗方法，以及产生、分离和施用IL-1ra的装置。
产生富含白介素-1受体拮抗剂之溶液的方法可以包括以下方面。一些实施方案中，产生富含白介素-1受体拮抗剂之溶液的方法包括将含有脂肪细胞的液体体积与聚丙烯酰胺珠接触，并将所述液体体积与聚丙烯酰胺珠和脂肪细胞分离，以获得富含白介素-1受体拮抗剂的溶液。不作为对本发明技术的机制、效用或功能的限制，聚丙烯酰胺珠看来作为脂肪细胞产生IL-1ra的活化剂。在一些方面中，脂肪细胞与聚丙烯酰胺珠表面的接触看来刺激了脂肪细胞的IL-1ra产生和分泌。当脂肪组织可包括白细胞的情况下，所产生IL-1ra的量与白细胞浓度之间看来具有相关性。因此，本发明技术使用脂肪组织和解聚的脂肪组织来获得脂肪细胞，其中白细胞可以存在于脂肪组织以及从脂肪组织中获得的脂肪细胞中。
该方法还可包括以下方面。脂肪细胞的液体体积可以是分离的脂肪组织的一部分；例如，其中所述脂肪组织可包括其他细胞类型。脂肪细胞与聚丙烯酰胺的接触可包括将脂肪细胞的液体体积与聚丙烯酰胺珠孵育约30秒至约24小时的时间。除了脂肪细胞的液体体积与聚丙烯酰胺珠的接触外，接触还可包括将含有白细胞的液体体积与聚丙烯酰胺珠接触。白细胞的液体体积可以是全血、富含血小板的血浆，或者全血和富含血小板的血浆。白细胞还可以从骨髓中获得。一些实施方案中，为获得富含白介素-1受体拮抗剂溶液而进行的分离包括对脂肪细胞液体体积和聚丙烯酰胺珠进行离心，以获得含有富含白介素-1受体拮抗剂之溶液的上清液。所得富含白介素-1受体拮抗剂的溶液可包含约30,000pg/mL至约110,000pg/mL的白介素-1受体拮抗剂。
一些实施方案中，提供了产生可用于治疗患者的炎性病症的富含白介素-1受体拮抗剂之溶液的方法。这些方法包括从所述患者获得脂肪组织并将脂肪组织装入浓缩装置内，其中所述浓缩装置包含聚丙烯酰胺珠。孵育聚丙烯酰胺珠和脂肪组织的混合物以形成白介素-1受体拮抗剂的溶液。随后以离心速度旋转该浓缩装置，以将白介素-1受体拮抗剂与聚丙烯酰胺珠和脂肪组织分离，从而获得富含白介素-1受体拮抗剂的溶液。所述浓缩装置的装载可包括将脂肪细胞的液体体积与聚丙烯酰胺珠孵育约30秒至约24小时的时间。装载还可包括将含有白细胞的液体体积装入浓缩装置中。所述白细胞液体体积可以是全血、富含血小板的血浆或者全血与富含血小板的血浆的组合。
本发明技术还包括治疗患者一个或多个炎症部位的方法。此类方法包括将含有脂肪细胞的液体体积与聚丙烯酰胺珠接触。随后将所述液体体积与聚丙烯酰胺珠和脂肪细胞分离，以提供富含白介素-1受体拮抗剂的溶液。向患者一个或多个炎症部位施用该富含白介素-1受体拮抗剂的溶液。所用脂肪组织可来自所述患者，即是自体的。该方法可用于治疗与骨关节炎相关的炎症。
一些实施方案中，本发明方法除了施用富含白介素-1受体拮抗剂的溶液外还包括向炎症部位施用纤维蛋白原、凝血酶和钙。例如，该方法可包括共施用(i)含有白介素-1受体拮抗剂和纤维蛋白原的第一溶液，和(ii)含有凝血酶和钙的第二溶液。
本发明方法中所用的凝血酶可通过包括将全血或血浆和钙溶液装入血液分离装置的方法来制备。全血或血浆在至少约20℃温度下加热至少20分钟。通过对加热后的全血或血浆进行离心来分离凝血酶。全血或血浆可得自该患者。
还提供了治疗患者的炎性病症的方法。此类方法包括从患者获得脂肪组织和将脂肪组织装入浓缩装置内，其中该装置包含聚丙烯酰胺珠。孵育珠和脂肪组织的混合物以形成白介素-1受体拮抗剂的溶液。随后以离心速度旋转该浓缩装置，以将白介素-1受体拮抗剂与聚丙烯酰胺珠分离并获得富含白介素-1受体拮抗剂的溶液。从患者获得全血并与钙溶液一起装入血液分离装置中。全血在至少约20℃温度下加热至少约20分钟。对加热后的全血进行离心以获得凝血级分(clotting fraction)。富含白介素-1受体拮抗剂的溶液和凝血级分随后施用于该患者的炎症部位。
治疗方法还可包括以下方面。将脂肪组织装入浓缩装置中(其中所述装置包含聚丙烯酰胺珠)，这可包括将包含白细胞的液体体积与脂肪组织一起装入，并孵育珠、脂肪组织和白细胞的混合物以形成白介素-1受体拮抗剂的溶液。所述白细胞液体体积可以是全血、富含血小板的血浆或者全血和富含血小板的血浆。纤维蛋白原也可以与富含白介素-1受体拮抗剂的溶液和凝血级分一起施用于患者的炎症部位。该方法可用于治疗至少部分由于骨关节炎引起的炎症。
参考图1，产生富含IL-1ra溶液的方法100的示意图。在步骤110从患者体内分离脂肪组织。该脂肪组织可直接用于步骤130，或者可以在步骤120中处理以提供脂肪细胞。
脂肪组织指任何类脂肪组织(白色或棕色脂肪组织均可)，其可来源于皮下、网膜/内脏、乳腺、性腺或其他脂肪组织部位。一些实施方案中，脂肪组织来源于通过抽吸辅助脂肪切除术或抽脂术分离的人皮下脂肪。脂肪细胞可以用任何适宜方法从脂肪组织和/或组织部分中分离和/或释放，包括本领域内已知方法，例如机械离心和分解离心。脂肪细胞还可用酶解消化的方法分离。例如，脂肪细胞可以从脂肪抽吸物(lipoaspirate)中分离，用超声波和/或酶解消化处理，并通过离心富集。从脂肪组织中分离的脂肪细胞可进行清洗和沉淀。
分离脂肪组织和脂肪细胞的方法可以包括如下方面。通过抽吸辅助的肿胀抽脂术(tumescent liposuction)将约50cc脂肪组织收集在与抽吸胶管和抽脂套管相连的专门的收集容器中。收集容器可以带有纱布型格栅过滤器，其允许使肿胀液(tumescent fliud)通过并保留固体脂肪组织。收集完脂肪组织后，将收集容器从抽吸装置中移出，再与离心装置相连。过滤单元还可包含具有约100微米孔径的过滤器。一旦含有脂肪组织的收集容器与离心装置相连，即对组织进行超声处理。超声完成后，将整个装置放入离心桶内离心，例如以300×g离心5分钟。离心后，将与过滤单元相连的收集容器分离，可丢弃。含有脂肪细胞的沉淀随后可重悬于生物相容性溶液中，例如自体血浆、血浆浓缩液和富含血小板的血浆。
脂肪组织也可用消化酶类和减弱相邻细胞间连接的螯合剂处理，使其能够将组织分散成单细胞(包括脂肪细胞)的悬液，而无明显的细胞破损。解聚后，可从细胞和解聚组织的悬液中分离脂肪细胞。
多种用于分离和/或分级分离脂肪组织的方法和装置包括Leach等在U.S.Pat.Nos.7,374,678和7,179,391中以及Leach等在U.S.Pub.Nos.2009/0014391、2008/0283474和2007/0208321中描述的那些。诸如GPSTM血小板浓缩系统(Biomet，Warsaw，IN)的装置可用于分离脂肪细胞。这些方法可包括如下获得脂肪细胞：通过对患者实施抽脂术获得脂肪组织，对脂肪组织进行酶促消化，并用这些装置分离和/或清洗脂肪细胞。
如图1步骤130所示，将脂肪组织和/或脂肪细胞与聚丙烯酰胺珠接触。一些实施方案中，将脂肪组织和/或脂肪细胞与聚丙烯酰胺珠孵育至有效移除白细胞和血小板液体体积中一部分液体的时间。孵育可以进行约30秒至约72小时，并且可以在约20℃至约41℃温度下进行。例如，孵育可以从约1分钟至48小时，从约5分钟至约12小时，或从约10分钟至约6小时。一些实施方案中，孵育在约37℃下进行。一些实施方案中，脂肪组织和/或脂肪细胞不进行孵育，而是与聚丙烯酰胺珠仅接触至进行后续处理所需的时间。接触可发生在环境条件下，例如约20-25℃的温度下。
步骤130中所用聚丙烯酰胺珠可使用本领域熟知的可控的标准操作流程由丙烯酰胺单体聚合形成，以产生由聚丙烯酰胺凝胶形成的相对均一的珠。通常，聚丙烯酰胺由丙烯酰胺与适当的双官能团交联试剂聚合形成，最常用的为N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(双丙烯酰胺)。凝胶聚合通常用过硫酸铵来起始，并通过加入催化剂加快反应速度，例如N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)。在多个实施方案中，聚丙烯酰胺珠包括每毫升珠0.5微摩尔的羧基，赋予轻微的阴离子特征(负电荷)。珠通常也耐受pH值的变化，并在许多水溶液和有机溶液中稳定。通过调节总丙烯酰胺浓度，可以形成多种孔径范围的聚丙烯酰胺凝胶。此外，可形成许多种尺寸的聚丙烯酰胺珠，并具有相对均一的大小分布。珠大小可从直径几微米至直径几毫米。例如，多种类型的Bio-GelTM P聚丙烯酰胺凝胶珠(Bio-RadLaboratories，Hercules，California，USA)具有的粒径从小于约45μm到多至约180μm。聚丙烯酰胺珠还可购于SNF Floerger(Riceboro，Georgia，USA)、Pierce Biotechnoloty，Inc.(Rockford，Illinois，USA)和Polymers，Inc.(Fayetteville，Arkansas，USA)。
聚合后，聚丙烯酰胺珠可以干燥并以粉末样形式贮存。干燥的珠不溶于水，但经再水化后可显著膨胀。再水化还原了聚丙烯酰胺珠的凝胶稠度，可变成干燥状态的约2至3倍大小。因此，干燥的聚丙烯酰胺珠可用于吸收一部分液体体积，包括小于珠孔径大小的溶质，并可用于浓缩由脂肪细胞和/或脂肪组织产生的IL-1ra。例如，步骤130中干燥聚丙烯酰胺珠与脂肪细胞和/或脂肪组织的结合激活了IL-1ra的产生，也因为干燥珠的再水化和膨胀而减少了总液体体积。
不作为对本发明技术的机制、效用或功能的限制，聚丙烯酰胺珠可作为脂肪细胞产生IL-1ra的活化剂。因此，就干燥聚丙烯酰胺珠而言，不仅液体被从脂肪细胞中吸收，从而浓缩了所形成的IL-1ra，而且珠还作为刺激脂肪细胞产生IL-1ra的表面。看起来IL-1ra量的增加并非简单地由于通过减少样品体积来增加浓度引起的，而是由于脂肪细胞被聚丙烯酰胺珠活化而增加了IL-1ra的产生和/或释放。
一些实施方案中，还可向聚丙烯酰胺珠和脂肪组织和/或脂肪细胞中添加包含白细胞的液体体积(如富含血小板的血浆和/或全血)以产生IL-1ra。可离心血液以分离含有白细胞和血小板的富含血小板的血浆(PRP)，其在沉降后可位于血沉棕黄层中。可用于步骤120中分离富含血小板的血浆的装置的一个实例如图2所示。
就这一点而言，图2所示装置200包括装有血液后置于离心机中的容器205，如管。容器205包括具有隔离器210和浮标215的浮标系统(buoysystem)。浮标215具有选定的密度，其调整成以在离心后达到选定的平衡位置；该位置位于更大密度的血液级分和更小密度的血液级分之间。离心过程中，浮标215通过沉降至两个级分之间的位置而在容器205中将血液分离成至少两个级分，级分之间基本不会混杂。就这一点而言，隔离器210和浮标215限定了包括富含血小板的血浆220的层，而更小密度的缺少血小板的血浆225通常分级在隔离器210上方，更大密度的红细胞230通常分级在浮标215下面。离心后，注射器或离心管随后可与浮标系统的一部分互相连接以抽取富含血小板的血浆，包括白细胞。不同的实施方案中，此类装置可用于产生包括约为全血8倍的血小板浓度和约为全血5倍的白细胞浓度的富含血小板的血浆。所述富含血小板的血浆可包含全血中存在的约80％至约90％的白细胞。此类市售装置包括来自BiometBiologies，LLC(Warsaw，Indiana，USA)的II血小板浓缩系统和来自Biomet Biologies，LLC(Warsaw，Indiana，USA)的
Figure BDA0000147097930000092
III血小板浓缩系统。
可用于在步骤120中分离富含血小板的血浆的装置也有描述，例如，2002年6月4日授权的Blasetti等的美国专利No.6,398,972，2003年11月18日授权的Brandt等的美国专利No.6,649,072，2004年9月14日授权的Dolocek的美国专利No.6,790,371，2006年3月14日授权的Sukavaneshvar等的美国专利No.7,011,852，2004年12月16日公布的Leach等的美国专利申请公开No.2004/0251217(通过参考并入本文)，2005年5月26日公布的Leach等的美国专利申请公开No.2005/0109716(通过参考并入本文)，2005年9月8日公布的Dorian等的美国专利申请公开No.2005/0196874(通过参考并入本文)，以及2006年8月10日公布的Dorian等的美国专利申请公开No.2006/0175242(通过参考并入本文)。
也可使用其他方法分离富含血小板的血浆。例如，可对全血进行离心而不使用浮标系统(buoy system)，可对全血进行多阶段离心，可以使用连续流离心，还可以过滤。此外，包括富含血小板的血浆在内的血液组分可以通过将红细胞与血浆分离而产生，其中使用低速离心步骤以防止血小板沉淀。在另一些实施方案中，可将从离心血液中形成的血沉棕黄层级分与余下的血浆分离，并重悬形成富含血小板的血浆。
除了
Figure BDA0000147097930000093
血小板浓缩系统及分离系统之外，许多其他的市售装置也可用于步骤120分离富含血小板的血浆，包括Medtronic公司(Minneapolis，Minnesota，USA)出售的MagellanTM自体血小板分离器系统、Harvest Technologies公司(Plymouth，Massachusetts，USA)出售的SmartPRePTM、DePuy(Warsaw，Indiana，USA)、Cytomedix公司(Rockville，Maryland，USA)出售的AutoloGelTM Process、EmCyte公司(Fort Myers，Florida，USA)出售的GenesisCS系统以及Biomet 3i公司(Palm Beach Gardens，Florida，USA)出售的PCCS系统。
从患者体内抽取的血液可以与抗凝血剂混合。适用的抗凝血剂包括肝素、柠檬酸磷酸葡萄糖(CPD)、乙二胺四乙酸(EDTA)、抗凝柠檬酸葡萄糖溶液(ACD)及其混合物。抗凝血剂可以置于用于从受试者抽取血液的注射器内，或者可在血液抽出后与其混合。
白细胞也可使用本领域熟知的其他方法制备。例如，白细胞可通过裂解红细胞而从全血中制备，或通过使用密度梯度离心全血，其中白细胞沉降物位于离心管底部。密度离心法的一个实例包括Ficoll-PaqueTM Plus(GE Healthcare Bio-Sciences，Piscataway，New Jersey，USA)。某些情况下中，密度梯度可以用于进一步分离单个核细胞和多形核细胞。白细胞还可用过滤法从全血中制备；一个实例包括AcelereTM MNC Harvest System(Pall Life Sciences，Ann Arbor，Michigan，USA)。白细胞还可从骨髓中获取。
再参考图1，与聚丙烯酰胺珠孵育后，如步骤140所述将富含IL-1ra的溶液与聚丙烯酰胺珠和脂肪组织和/或脂肪细胞分离。可以通过抽出液体体积并留下珠来完成分离。一些情况下，可以在抽出富含IL-1ra的溶液之前通过离心使珠沉淀。还可以通过过滤进行分离，其中聚丙烯酰胺珠被过滤器保留，富含IL-1ra的溶液流过过滤器，例如利用离心力或利用真空。如果步骤130中与聚丙烯酰胺的孵育利用干燥的聚丙烯酰胺珠，则液体体积可由于珠的再水化膨胀而减少，从而浓缩所得富含IL-1ra溶液。为保持增加的浓度，步骤140中应十分小心，以避免挤压珠或从已膨胀珠中抽出液体。例如，高离心力或高真空度可能压碎珠和/或从珠内部体积中抽出液体。
在一些情况下，步骤130与聚丙烯酰胺珠的孵育和步骤140中所得富含IL-1ra溶液的分离可用同一装置进行。将脂肪组织和/或脂肪细胞与聚丙烯酰胺珠一起孵育的装置的一个实例如图3A和3B所示。就这一点而言，装置300具有上室305和下室310。上室305具有侧壁315，被凝胶珠搅拌器325的搅拌器杆320从中穿过。装置300还具有穿过侧壁315进入上室305的入口330。装置300还包括与导管340相通的出口335。上室305的底面包含滤膜345，其上表面支撑干燥的浓缩聚丙烯酰胺珠350。
使用过程中，将含有脂肪组织和/或脂肪细胞的流体355通过入口330注射到上室305中，与聚丙烯酰胺珠350混合。流体335和聚丙烯酰胺珠350可通过旋转搅拌器杆320和凝胶珠搅拌器325来混合，以帮助混合流体355和珠350。混合的流体355和聚丙烯酰胺珠350随后在期望的温度下孵育期望的时间。随后对装置300进行离心以使液体进入到下室310而聚丙烯酰胺珠350被滤膜345保留，从而将聚丙烯酰胺珠350与下室310中收集的所得IL-lra溶液360分离。溶液360可通过出口335从装置中移出。
2006年8月10日公布的Dorian等人的美国专利申请公开2006/0175268和2006年11月2日公布的Swift等人的美国专利申请公开2006/0243676中公开了图3的示例性装置；两者均通过参考并入本文。此类装置作为Biomet Biologies，LLC(Warsaw，Indiana，USA)的PlasmaxTMPlus血浆浓缩机以商品销售。
再参考图1，步骤150中向人或动物受试者(患者)施用富含IL-1ra的溶液。接受富含IL-1ra的溶液的患者可以是步骤110中取得脂肪组织的同一患者。这种情况下，该方法提供了IL-1ra的自体制备。可以使用多种手段给药，例如通过使用注射器注射富含IL-1ra的溶液、手术施用或在其他外科手术时同时施用。然而，应当理解，步骤150可包括用于植入、注射或以其他方式在部位处或附近施用富含IL-1ra的溶液的任何生物医药可接受的方法或程序，以便介导与白介素-1受体刺激相关的效应，例如炎症和由于骨关节炎引起的炎症。例如，为治疗由关节炎导致的炎症，可通过注射向患者施用富含自体IL-1ra的溶液。注射可在炎症关节的滑液腔处或之内，或在关节处或附近。
可以通过包括无菌滤器来处理最终分离的IL-1ra产物而对通过本发明技术产生的富含IL-1ra的溶液的多种制备物进行灭菌。同样地，抗生素可以在孵育过程中包含在聚丙烯酰胺中，或在本文所述方法的各种步骤的一步或多步中加入。
本发明技术提供了用于制备富含IL-1ra溶液(包括富含自体IL-lra的浓缩血浆溶液)的改进方法，其减少和/或基本上消除了使用非自体材料或重组材料时可能出现的免疫学问题。此外，由于IL-1ra由患者的细胞产生，因此天然的翻译后修饰如糖基化已经存在。大部分重组蛋白不是这样，因为它们是在原核宿主中产生的。
通过本发明技术产生的富含IL-1ra溶液可表征为与通常在全血中发现的IL-1ra浓度相比具有更高的IL-1ra浓度。例如，本发明方法和组合物可以包括约34,000pg/mL至约108,000pg/mL的IL-1ra，而全血可包括约200pg/mL至约800pg/mL。然而，应该理解，在任何给定溶液中存在的浓度可因本发明方法中所用脂肪组织、脂肪细胞和/或白细胞来源中组分的起始水平而变化，并且浓度的增加是与那些材料的起始水平相比较而言的。通常，IL-1ra以至少约10,000pg/ml、至少约25,000pg/ml或至少约30,000pg/ml浓度存在于本发明溶液中，能够高达108,000pg/mL或更高。
可施用富含IL-1ra的溶液以介导IL-1的效应并减弱白介素-1受体介导的信号。通过竞争性地抑制IL-1与许多组织和器官中表达的白介素-1型受体的结合，富含IL-1ra的溶液可用于阻断天然IL-1的生物活性，包括与关节炎相关的炎症和软骨退化。例如，骨吸收和组织损伤(如软骨退化)作为IL-1引起的蛋白聚糖流失的结果，可通过施用富含IL-1ra的溶液来治疗。在关节炎患者中，滑膜和滑液内可能不存在足以中和这些患者体内IL-1浓度的有效IL-1ra浓度，因此可施用本发明的富含IL-1ra的溶液以在这些部位治疗这些病症。治疗的剂量、给药和频率可根据已确立的医学实践来修改以达到有效治疗。
再参考图1，步骤150中向人或动物受试者(即患者)施用富含IL-1ra的溶液。接受富含IL-1ra的溶液的患者可以是步骤110中脂肪组织衍生来源的同一患者。这种情况下，该方法提供了IL-1ra的自体制备。可以使用多种手段给药，例如通过使用注射器注射富含IL-1ra的溶液、手术施用或在其他外科手术时同时施用。然而，应当理解，步骤150可包括用于植入、注射或以其他方式在部位处或附近施用富含IL-1ra的溶液的任何生物医药可接受的方法或程序，以便介导与白介素-1受体刺激相关的效应，例如炎症。例如，对治疗由关节炎导致的炎症而言，可通过注射向患者施用自体同源的富含IL-1ra的溶液。注射可在炎症关节滑液空间部位或之内。
本发明技术还提供了用于递送IL-1ra的方法。此类递送方法提供了IL-1ra和纤维蛋白原的溶液，其中纤维蛋白原被活化以形成在治疗部位保护并保留IL-1ra的纤维蛋白基质。纤维蛋白基质可以在递送IL-1ra后在原位形成。
纤维蛋白原可通过用凝血剂和钙活化而交联形成三维基质。适当的凝血剂包括凝血酶(例如，牛的、重组人的、合并人的或自体的)、自体凝血蛋白和聚乙二醇。钙可以是钙盐的形式，例如氯化钙。
一些实施方案中，凝血剂包括自体凝血蛋白，例如来自从待治疗患者的血的凝血级分或组合物。适当的凝血组分可以通过以下方法获得：将全血或血浆与钙溶液(例如溶于乙醇的氯化钙)装入血液分离装置中，在至少约20℃的温度下加热全血或血浆至少约20分钟，分离凝血组分。分离可通过将加热的全血或血浆离心来进行。图4和图5中描述了一种合适的分离装置。此类装置为Biomet Biologies公司(Warsaw，Indiana，USA)出售的Clotalyst自体凝血酶收集系统。
参考图4和图5，血液分离装置700通常包括主体，其具有限定出主室702的圆柱形壁以及第一末端704和第二末端706。第一末端704处是第一端口708、第二端口710、第三端口712、出口713和滤器714。第一端口708、第二端口710、第三端口712和出口713各自穿过第一末端704，并允许流体在装置700外部和主室702之间流通。第一端口708可被第一盖716所覆盖，第二端口710可被第二盖718所覆盖，第三端口712可被第二盖720所覆盖。第一端口708的第一替换盖722可用第一绳724系于第一端口708。当第一替换盖722未使用时，第一盖726可固定于第一替换盖722。第二端口710的第二替换盖728可用第二绳730系于第二端口710。当第二替换盖728未使用时，第二盖732可固定于第二替换盖728。
第一端口708和第二端口710各自包括终止阀以避免材料(如玻璃珠740)通过第一和第二端口708和710离开主室702。所述阀可以是任何合适的阀，比如鸭嘴阀(duck-billed valve)。
特别参考图5，第三端品712包括伸入主室702中的长管状部分734。长管状部分734从第一末端704延伸至主室702内部的一定深度，以允许从主室702抽出选定的材料，如凝血酶和其他血液凝结因子。例如，如以下的进一步描述，其中主室702包含白细胞、试剂(例如，钙溶液，其包含溶于乙醇或其他适当溶剂的钙化合物)、抗凝剂和玻璃珠，对该混合物的孵育和离心在主室702的第二末端706处形成大致包括红细胞、血浆和玻璃珠在内的凝血团。在凝血团顶部，在凝血团离第一末端704最近的一侧，形成包含凝血酶和多种其他凝血因子的流出物。可用肉眼区分第二末端706处的凝血团与流出物。为了使用长管状部分734提取凝血酶和其他凝血因子，长管状部分734延伸至主室702内部与流出物中最接近凝血团部分大致相平的深度。
在长管状部分734的远端提供吸头736。吸头736大致以直角从长形部分734伸出。所述吸头包括凹槽或凹口737。两个支柱739从长形部分734的吸头736处附近径向伸出以接触主室702内部。支柱739使吸头736偏向主室702内部，以使吸头736在主室702中保持恒定的位置。当吸头736与主室702内部接触时，凹口737在主室702内壁和吸头736之间提供开口或空隙，以允许材料由凹口737通过并进入吸头736。吸头736有助于尽可能地增加通过长形部分734抽出的材料的量，尤其是当主室702倾斜以将吸头736周围的额外材料带到凹口737时。两个支柱739和吸头736有助于使长形部分734在主室702内居中。
端口708、710和712的大小与合适的流体递送或运输设备(如注射器)相匹配。例如，第一端口708的大小可与试剂注射器匹配，以允许试剂通过第一端口708并进入主室702；第二端口710的大小可与血液注射器匹配，以允许血液通过第二端口710并进入主室702；第三端口712的大小可与注射器匹配，以允许从主室702内抽出血液成分，如凝血酶和其他凝血因子。
滤器714可以是用于在材料通过第三端口712从主室702内抽出时对其进行过滤的任何适当滤器。滤器714包括安装于第一端口708和第二端口710顶上的聚酯筛。所述聚酯筛包括范围为约15微米至约25微米大小的开口。例如，开口可以为约17微米大小。作为滤膜714的替代或补充，可在长形部分734中或吸头736处提供与滤器714相似的滤器。
主室702还包括活化剂，如玻璃珠740。玻璃珠的带负电荷的表面激活凝血并激活凝血因子的释放，在主室702的第二末端706处形成凝血团。玻璃珠740可以是任何适当类型的玻璃珠，如硼硅酸盐珠。
使用图5的设备产生凝血剂的示例性程序开始于将含有氯化钙和乙醇的试剂通过第一端口708注射到主室702中。试剂注射后，用第一替换盖722关闭第一端口708。带有抗凝剂的血液通过第二端口710注射到主室702中。血液注射后，用第二替换盖728关闭第二端口710。可选地，注射器和血液分离装置700预热至约25℃的温度。
通过反复颠倒装置700来混合血液成分分离装置700的内容物，例如约12次，以使血液与玻璃珠接触。混合后，孵育装置。孵育过程可在允许装置700的内容物在约25℃孵育15分钟的温度和时间下进行。孵育过程完成后，在主室702的第二末端706处形成红细胞、血浆和玻璃珠的凝血团。孵育完成后，充分振摇装置700以去除并破碎任何可能存在的凝胶。装置700随后置于适当的离心机中，以约3200RPM离心约15分钟，从剩余的血液成分中分离出凝血酶。离心后，凝血酶和其他凝血因子的流出物与凝血团分离。离心完成后，移去第三盖720，使用适当的抽取装置(如注射器)通过第三端口712、长形部分734和吸头736的途径从主室702中移去凝血酶和其他凝血因子的流出物。
因此，本发明技术的递送方法可包括施用IL-1ra、纤维蛋白原、凝血酶和钙，以在治疗部位形成纤维蛋白基质。可向IL-1ra溶液中加入外源纤维蛋白原，例如牛凝血酶，优选地为1000U/mL。或者，IL-1ra溶液可能已经含有足量的内源纤维蛋白原。在IL-1ra溶液和/或纤维蛋白原或其制剂包括抗凝剂(例如ACD-A，抗凝柠檬酸葡萄糖溶液)的情况下，为激活纤维蛋白原而(与凝血酶一起)加入的钙应当超过抗凝剂中任何螯合剂的有效量。
当向脂肪细胞和/或脂肪组织和聚丙烯酰胺珠中进一步加入全血和/或富含血小板的血浆时，用本发明方法制备的富含IL-1ra的溶液可提供与全血相比增加的内源纤维蛋白原的浓度。例如，上述利用富含血小板的血浆、脂肪组织、聚丙烯酰胺珠和图3所示装置的方法得到了相对于全血而言同时富含IL-1ra和纤维蛋白原的溶液。此类装置作为Biomet Biologies，LLC(Warsaw，Indiana，USA)的PlasmaxTM Plus血浆浓缩机以商品销售，包括2006年8月10日公布的Dorian等人的美国专利申请公开号2006/0175268和2006年11月2日公布的Swift等人的美国专利申请公开号2006/0243676中所述的那些装置和方法；两者均通过参考并入本文。该富含IL-1ra和纤维蛋白原的溶液可用于治疗原始全血和脂肪组织的来源患者，即自体治疗。
用以上方法使用全血、脂肪组织和聚丙烯酰胺珠以PlasmaxTM Plus血浆浓缩机制备的富含IL-1ra和纤维蛋白原的溶液提供了约为全血3倍(3×)的纤维蛋白原浓度。从3倍高纤维蛋白原浓度形成的纤维蛋白基质/凝块比由基线纤维蛋白原水平形成的纤维蛋白凝块更坚固，并且更能抵抗分解和吸收。
参考图6，显示了递送IL-1ra 900的示意图。步骤910中，提供了IL-1ra的溶液。IL-1ra溶液可用本公开内容中所述方法来制备。步骤920中向IL-1ra溶液中加入外源纤维蛋白原。外源纤维蛋白原可从不同于IL-1ra溶液的来源制备，例如不同的患者，或可来源于牛。或者，外源纤维蛋白原可从不同于IL-1ra溶液的起始材料制备，但仍为同一来源或患者。例如，IL-1ra溶液和外源纤维蛋白原可从取自于同一患者的不同血液样品制备。或者，如步骤930所示，制备富含IL-1ra和纤维蛋白原的溶液，例如，如本文所述通过使用聚丙烯酰胺珠和PlasmaxTM装置。步骤940中提供了凝血酶和钙的溶液，与IL-1ra溶液在治疗部位共同施用。其后，如步骤950所示，组合溶液中的纤维蛋白原位发生交联，在治疗部位形成基质，起着保护、保持并减慢释放IL-1ra的作用。
IL-1ra的递送可包括向受试者共施用IL-1ra和纤维蛋白原的第一溶液以及凝血酶和钙的第二溶液。此类实施方案中，第一溶液和第二溶液在施用前保持彼此分离，以使纤维蛋白原直到溶液混合并注射到治疗部位后才形成纤维蛋白基质。溶液可在即将递送至治疗部位时混合，或者可在治疗部位混合。
参考图7，可以以医学适用程序使用双注射装置1000。该双注射装置1000包括第一针管1005和第二针管1010，两者均与混合室1015相连。第一活塞1020插入第一针管1005中，第二活塞1025插入第二针管1010中。第一活塞1020与第二活塞1025通过构件1030连接。混合室1015与套管1035连接。双注射装置1000含有在第一针管1005中的IL-1ra和纤维蛋白原的第一溶液1040，以及在第二针管1010中的凝血酶和钙的第二溶液1045。共施用过程中，构件1030被推向混合室1015，以使第一针管1005和第二针管1010中的内容物均被推进混合室1015中。混合的第一溶液1040和第二溶液1045流经套管1035，在患者关节1060中的治疗部位1055处形成纤维蛋白基质1050。
如图7所示实施方案中，患者的关节1060是包括股骨1065、胫骨1070、腓骨1075、髌骨1080和软骨1085在内的膝关节。然而应当理解，治疗部位1055可为人类患者或动物的任何关节，包括肩、肘、腕、踝、髋和脊椎。此外，本发明治疗和方法可用于治疗其他组织(如肌肉和肌腱)部位的炎症。
一些实施方案中，双注射装置1000用于刺穿患者关节1060的软组织以施用混合的第一溶液1040和第二溶液1045。例如，套管1035可为中空针，如皮下注射针。或者，可在患者关节1060中制造切口，以允许套管1035进入，以使双注射装置800可进入治疗部位1055。
一些未显示的实施方案中，双注射装置1000不含有混合室1015，取而代之包括两个套管1035，各自引导一个针管至治疗部位1055。这种情况下，第一溶液1040和第二溶液1045流经单独的套管1035，在治疗部位1055处混合形成纤维蛋白基质1050。一些实施方案中，使用两个单独的单针管注射装置取代双注射装置。
本发明递送方法中形成的纤维蛋白基质可以留在治疗部位而不提高炎症。纤维蛋白基质中的IL-1ra被保护不受酶促降解，并可与纤维蛋白基质结合以便随时间缓慢地从基质中释放。因此，与不含纤维蛋白基质载体的IL-1ra注射相比，该方法可提供IL-1ra的持续递送。
本发明技术可以包括2008年2月27日提交的美国临时专利申请号No.61/031,803、2008年11月21日提交的美国临时专利申请号No.61/116,940和2009年2月24日提交的美国临时专利申请号No.61/155,048中的方面，并包括2009年2月27日提交的PCT/US2009/035541的方面。
提供以下具体实例是为阐明如何制备并使用本发明技术的组合物和方法之目的，除非另有明确声明，否则并非旨在作为本发明技术已经或尚未作出或测试的给定实施方案的代表。
实施例1
如下制备脂肪细胞。将脂肪组织切成小碎块(约1cm3)，在间歇机械搅拌条件下，在37℃水浴中用2mg/mL I型胶原酶(WorthingtonBiochemical Corp.，Lakewood，N.J.)消化180分钟。可通过加入培养基或来自血的溶液来中和消化反应。将细胞悬液离心(25℃下300×g离心7分钟)，然后从沉淀的细胞团中除去上清。随后将沉淀物重悬于相容的溶液中，以提供含有脂肪细胞的液体体积。
或者，将沉淀物用得自受试者的全血重悬，并加入来自BiometBiologies公司(Warsaw，Ind.)的GPSTM血小板浓缩系统。离心后，从系统中提取还包含脂肪细胞的富含血小板之血浆层。
随后将脂肪细胞(任选地包括富含血小板的血浆)与聚丙烯酰胺珠合并，以刺激IL-1ra的产生。从液体溶液中分离脂肪细胞和聚丙烯酰胺珠以获得富含IL-1ra的溶液。
实施例2
从脂肪细胞产生IL-1ra的治疗组合物。如下进行人脂肪细胞的分离：从抽吸辅助脂肪切除术/抽脂术获得人皮下脂肪组织，在I型胶原酶溶液(Worthington Biochemical Corp.，Lakewood，N.J.)中以37℃温和搅拌将该组织消化1小时。分离的细胞用500μm和250μm Nitex滤膜过滤。将级分在300×g离心5分钟。舍弃上清液，将细胞团重悬于相容性液体溶液中，例如血液来源的溶液。
将脂肪细胞在如图3A和3B所示的装置中与聚丙烯酰胺珠合并。将含有脂肪细胞的流体355通过入口330注射入上室中，并与聚丙烯酰胺珠350混合。可通过旋转搅拌器杆320和凝胶珠搅拌器325来混合流体355和聚丙烯酰胺珠350，以帮助混合流体355和珠350。混合的流体355和聚丙烯酰胺珠350随后在期望的温度下孵育期望的时间。随后对装置300进行离心以使液体进入下室310而聚丙烯酰胺珠350被滤器345保留，从而将聚丙烯酰胺珠350与从下室310中收集的所得IL-lra溶液360分离。富含IL-1ra的溶液360可通过出口335从装置中移出。
实施例3
如下制备富含IL-1ra的溶液。通过对患者实施抽脂术获得脂肪组织。从患者体内抽取全血(70mL)，以ACD-A(Braintree，Massachusetts，USA)抗凝(10％)。保留一部分(10mL)用于全血测量。用
Figure BDA0000147097930000181
II系统(Biomet Biologies公司，Warsaw，Indiana，USA)产生富含血小板的血浆(PRP)(6mL)。如Woodell-May JE，Ridderman DN，Swift MJ，Higgins J.在″Producing Accurate Platelet Counts for Platelet Rich Plasma：Validation of a Hematology Analyzer and Preparation Techniques forCounting″/Craniofac Surg(2005)Sep.16(5)：749-56中所述，按照已验证的程序从全血和PRP样品获得全血球计数(CBC)。
向改良的血浆浓缩装置(PlasmaxTM，Biomet Biologies公司，Warsaw，Indiana，USA)中加入脂肪组织(约5g)和PRP(约5mL)，与聚丙烯酰胺干燥珠在装置中以室温孵育24小时。孵育后，对血浆浓缩装置进行离心以分离富含IL-1ra的溶液。
为分析0时间点的IL-1ra基线水平，用50μL凝血酶和10％CaCl2(1,000单位/mL)活化脂肪组织、PRP和聚丙烯酰胺样品。血液凝块形成并在室温下孵育30分钟。孵育后，凝块以3,000rpm离心5分钟。从凝块中收集血清，并保留用于ELISA分析。来自血浆浓缩器的富含IL-1ra的溶液不需要用凝血酶激活，直接进行测试。所有样品均用ELISA试剂盒(IL-lra QuantikineTM Kit，R&D系统，Minneapolis，Minnesota，USA)对IL-1ra进行分析。
说明性数据以平均值±标准差表示。统计学显著性用Student′s t检验(a＝0.05)进行评估。使用关联分析来比较IL-1ra输出物与全血球计数(CBC)数据。
脂肪组织和PRP与聚丙烯酰胺珠孵育所产生的IL-1ra提供了增加的IL-1ra水平。IL-1ra的基线血清值(217±98pg/mL)与另一项研究中所得结果(73±4.8pg/mL)相似，如Meijer H，Reinecke J，Becker C，TholenG，Wehling P.在″The production of anti-inflammatory cytokines in wholeblood by physico-chemical induction″Inflamm.Res.2003Oct；52(10)：404-7中所述，尽管供体之间可存在显著变异性。脂肪组织和PRP与聚丙烯酰胺珠孵育后血清浓缩器的输出物中IL-1ra的血清水平在统计学上显著高于血清基线水平。例如，脂肪组织和PRP与聚丙烯酰胺珠在血清浓缩器装置中孵育24小时得到高于先前报道的ACS装置中24小时孵育数据(10,254±165pg/mL)的IL-1ra剂量(约36,000pg/mL)。
实施例4
收集脂肪组织(120g)并用
Figure BDA0000147097930000191
III一次性用品(Biomet Biologies公司，Warsaw，Indiana，USA)制备。将分离的脂肪组织装入改良的血浆浓缩装置(
Figure BDA0000147097930000192
Biomet Biologies公司，Warsaw，Indiana，USA)中处理。将输出物分为4组；有或没有凝血酶活化(1000U/ml in 1M CaCl2)的浓缩血浆中的IL-1ra，或者有或没有凝血酶活化的无细胞的IL-1ra。IL-lra用ELISA(R&D Systems)随时间测量。
未凝血的样品在24小时中产生47.1±2.1ng的平均值(p＝0.34)。无细胞的样品产生33.7±1.5ng，在24小时中未发生变化(p＝0.38)。凝血后，IL-lra的流出减慢，10小时后仅有28％流出。无细胞样品中的释放也被推迟，但在10小时后100％的可用IL-lra流出。
本文所述实施例和其他实施方案仅为示例，并非旨在限于描述本发明技术的组成和方法的全部范围。可在本发明技术领域范围内对特定实施方案、材料、组成和方法进行等同的变更、修订和变化，获得基本相同的结果。

Claims (26)

1.产生富含白介素-1受体拮抗剂之溶液的方法，包括：
(a)将包含脂肪细胞的液体体积与聚丙烯酰胺珠接触；
(b)将所述液体体积与聚丙烯酰胺珠和脂肪细胞分离，以获得富含白介素-1受体拮抗剂的溶液。
2.根据权利要求1的产生富含白介素-1受体拮抗剂之溶液的方法，其中所述包含脂肪细胞的液体体积是分离的脂肪组织的一部分。
3.根据权利要求1的产生富含白介素-1受体拮抗剂之溶液的方法，其中所述接触包括将所述含有脂肪细胞的液体体积与聚丙烯酰胺珠孵育约30秒至约24小时的时间。
4.根据权利要求1的产生富含白介素-1受体拮抗剂之溶液的方法，其中所述接触还包括将含有白细胞的液体体积与所述聚丙烯酰胺珠接触。
5.根据权利要求4的产生富含白介素-1受体拮抗剂之溶液的方法，其中所述含有白细胞的液体体积为全血、富含血小板的血浆，或者全血和富含血小板的血浆。
6.根据权利要求1的产生富含白介素-1受体拮抗剂之溶液的方法，其中所述分离包括对脂肪细胞和聚丙烯酰胺珠的液体体积进行离心，以获得包含富含白介素-1受体拮抗剂之溶液的上清液。
7.根据权利要求1的产生富含白介素-1受体拮抗剂之溶液的方法，其中所述富含白介素-1受体拮抗剂的溶液包含约30,000pg/mL至约110,000pg/mL的白介素-1受体拮抗剂。
8.产生用于治疗患者中炎性病症的富含白介素-1受体拮抗剂之溶液的方法，该方法包括：
(a)从该患者体内获得脂肪组织；
(b)将所述脂肪组织装载到包含聚丙烯酰胺珠的浓缩装置中，孵育聚丙烯酰胺珠与脂肪组织的混合物以形成白介素-1受体拮抗剂的溶液；和
(c)以离心转速旋转所述浓缩装置，以将白介素-1受体拮抗剂与聚丙烯酰胺珠和脂肪组织分离，从而获得所述富含白介素-1受体拮抗剂的溶液。
9.根据权利要求8的产生富含白介素-1受体拮抗剂之溶液的方法，其中所述装载包括将所述脂肪组织与聚丙烯酰胺珠孵育约30秒至24小时的时间。
10.根据权利要求8的产生富含白介素-1受体拮抗剂之溶液的方法，其中所述装载还包括将包含白细胞的液体体积装载到所述浓缩装置中。
11.根据权利要求10的产生富含白介素-1受体拮抗剂之溶液的方法，其中所述包含白细胞的液体体积为全血、富含血小板的血浆，或者全血和富含血小板的血浆。
12.治疗患者的炎症部位的方法，包括：
(a)将含有脂肪细胞的液体体积与聚丙烯酰胺珠接触；
(b)将所述液体体积与聚丙烯酰胺珠和脂肪细胞分离，以获得富含白介素-1拮抗剂的溶液；和
(c)向该患者的炎症部位施用所述富含白介素-1拮抗剂的溶液。
13.根据权利要求12的治疗患者的炎症部位的方法，其中所述脂肪组织来自所述患者。
14.根据权利要求12的治疗患者的炎症部位的方法，其中所述炎症与骨关节炎相关。
15.根据权利要求12的治疗患者的炎症部位的方法，其中所述施用还包括向该炎症部位施用纤维蛋白原、凝血酶和钙。
16.根据权利要求12的治疗患者的炎症部位的方法，其中所述施用包括共施用(i)含有白介素-1受体拮抗剂和纤维蛋白原的第一溶液；和(ii)含有凝血酶和钙的第二溶液。
17.根据权利要求15的治疗患者的炎症部位的方法，其中所述凝血酶通过包括以下步骤的过程制备：
(a)将全血或血浆和钙溶液装入血液分离装置；
(b)以至少约20℃的温度加热所述全血或血浆至少约20分钟；和
(c)通过对加热的全血或血浆进行分离来凝血酶。
18.根据权利要求17的治疗患者的炎症部位的方法，其中所述全血或血浆得自所述患者。
19.治疗患者的炎性病症的方法，该方法包括：
(a)从该患者获得脂肪组织；
(b)将所述脂肪组织装载到包含聚丙烯酰胺珠的浓缩装置中，孵育珠与脂肪组织的混合物以形成白介素-1受体拮抗剂的溶液；和
(c)以离心转速旋转所述浓缩装置，以将白介素-1受体拮抗剂与聚丙烯酰胺珠分离，从而获得富含白介素-1受体拮抗剂的溶液。
(d)从患者获得全血；
(e)将所述全血和钙溶液装载到血液分离装置中；
(f)以至少约20℃的温度加热所述全血至少约20分钟；
(g)对加热的全血进行离心并获得凝血级分；和
(h)向该患者的炎症部位施用富含白介素-1拮抗剂的溶液和凝血级分。
20.根据权利要求19的治疗患者的炎性病症的方法，其中所述装载还包括将含有白细胞的液体体积与脂肪组织装载到含有聚丙烯酰胺珠的浓缩装置中，并孵育珠、脂肪组织和白细胞的混合物以形成白介素-1受体拮抗剂的溶液。
21.根据权利要求20的产生富含白介素-1受体拮抗剂之溶液的方法，其中所述含有白细胞的液体体积为全血、富含血小板的血浆，或者全血和富含血小板的血浆。
22.根据权利要求19的治疗人受试者患者的炎性病症的方法，其中所述施用还包括向该患者的炎症部位施用纤维蛋白原。
23.根据权利要求19的治疗人受试者的炎性病症的方法，其中所述炎症部位至少部分地是由骨关节炎所导致的。
24.用于治疗受试者的炎症的组合物，该组合物通过根据权利要求1-11中任何一项的方法制备。
25.根据权利要求24的组合物，其中所述液体体积是得自该受试者的全血或血浆。
26.根据权利要求24的组合物，其中所述炎症是由骨关节炎所导致的。
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