CN102471752A

CN102471752A - 用于在流式细胞仪系统中测量来自多个并行流动通道的多个发射的系统和方法

Info

Publication number: CN102471752A
Application number: CN2010800274800A
Authority: CN
Inventors: 加里·杜拉克
Original assignee: Sony Corp; Sony Corp of America
Current assignee: Sony Corp; Sony Corp of America
Priority date: 2009-07-02
Filing date: 2010-07-02
Publication date: 2012-05-23
Also published as: US20110001963A1; TW201105950A; KR20120024795A; WO2011003073A1

Abstract

本发明公开了用于在流式细胞仪系统中测量来自多个并行流动通道的多个发射的系统及方法，其中利用不同的频率来调制各个激发源。使用一个检测器来收集由全部流动通道中的全部源所激发的荧光发射，并且通过使用傅里叶变换技术来分离此发射。该系统和方法非常适于微流体应用。

Description

用于在流式细胞仪系统中测量来自多个并行流动通道的多个发射的系统和方法

关联申请的交叉引用

本申请要求享有申请日为2009年7月2日的美国临时专利申请No.61/222,509的优先权，在此通过引用将其整体结合在本说明书中。

技术领域

本发明总体涉及流式细胞仪系统，具体而言，涉及用于在流式细胞仪系统中测量来自多个并行流动通道的多个发射的系统及方法。

背景技术

二十多年前，基于流式细胞仪的细胞分选术被首次引入到研究领域。这是一种已经被广泛用于生命科学研究等诸多领域的技术，成为遗传学、免疫学、分子生物学和环境学等领域工作人员的重要工具。与诸如免疫淘选(immuno-panning)和磁柱分离之类的体(bulk)细胞分离技术不同，基于流式细胞仪的细胞分选设备以每秒几千个细胞或者更高的速度对个别细胞或粒子连续地进行测量、归类并分选。这种对单个细胞“逐个”进行的快速处理使得流式细胞仪成了从其它异质细胞悬液中提取高纯度细胞亚群的、独特且极具价值的工具。

用以分选的材料通常用荧光材料以某种方式标记。当细胞经过聚焦集中、强度极高的光束(通常为激光光束)时，关联于该细胞的荧光探测器便发出荧光。计算机记录用于各细胞的发射强度。这些数据接着被用来对各细胞进行归类以用于具体的分选操作。基于流式细胞仪的细胞分选已经被成功地应用到上百种细胞类型、细胞成分和微生物，以及多种尺寸相当的无机粒子中。

流式细胞仪也被广泛地用来快速地分析异质细胞悬液以识别成分亚群。其中发现使用了基于流式细胞仪的细胞分选的应用示例包括：用于AIDS研究的免疫系统细胞的稀有群体的分离、用于癌症研究的畸形细胞的基因分离、用于遗传学研究的特定染色体的分离和用于环境学研究的各种微生物的分离。例如，被荧光标记的单克隆抗体通常被用作识别免疫细胞诸如T淋巴细胞和B淋巴细胞的“标记”，临床实验室经常使用该技术来对HIV感染者的“CD4阳性”T细胞进行计数，并且他们还使用该技术来识别与各种白血病和淋巴瘤癌相关的细胞。

最近，人们感兴趣的两个领域除了严格的研究应用之外，便是让细胞分选走近临床和对病人的治疗应用。首先是从对化学制药的研发转向对生物制药的研发。例如，许多新的癌症疗法利用了生物材料。这些疗法包括一类基于抗体的癌症治疗。基于流式细胞仪的细胞分选器可以在这些产品的识别、发展、净化以及最终的生产过程中发挥重要的作用。

与此相关的便是在护理病人过程中转向使用细胞代替治疗。目前关于干细胞的热门研究均围绕一个全新的医学领域展开，其通常被称为再生疗法或再生医学。这些疗法可能往往要求从病人的组织中分离出大量的比较罕见的细胞。例如，可从骨髓中分离出成年干细胞，并且最终将其作为再注入物的一部分返回到分离了成年干细胞的病人体内。流式细胞仪和细胞分选是能够提供这种疗法的重要组织处理工具。

存在两种目前正被广泛使用基本类型的细胞分选器。他们分别是“液滴细胞分选器(droplet cell sorter)”和“流体切换细胞分选”。液滴细胞分选器利用微液滴作为容纳体来将所选择的细胞输送到收集器。通过将超声波能量耦合到喷射流来形成该微液滴。接着以静电方式将该液滴引导到所期望的位置，其中该液体含有被选择用以分选的细胞。这是一个非常高效的处理，每秒钟允许从单流中分选多达90,000个细胞，该处理主要受液滴生成频率和照明所需时间的限制。

Durack等人的美国公开专利申请No.2005/0112541对现有的流式细胞仪系统进行了详细的描述。

然而，液滴细胞分选器在生物安全(biosafe)方面并不十分优异。在一部分液滴形成处理中所生成的气溶胶会携有生物危险材料。由此，已经发展了一种包含在生物安全柜中的生物安全液滴细胞分选器，其可以在基本封闭的环境中操作。不幸的是，这种类型的系统自身并不适用于临床环境下患者样本的常规分选所需求的无菌状态和操作保护。

基于流式细胞仪的细胞分选器的第二种类型为流体切换细胞分选器。大多数流体切换细胞分选器利用压电装置来驱动机械系统，其中该机械系统会将一部分流动样品转移到收集容器中。与液滴细胞分选器相比，流体切换细胞分选器因被用来转移样品流的机械系统的循环时间而具有较低的最大细胞分选率。该循环时间，即样品的初始分流与恢复到稳定的未分选的流动之间的时间，通常远远高于液滴细胞分选器上液滴生成器的周期。而该较长的循环时间限制了流体切换细胞分选器每秒钟处理细胞的速率。由于同样的原因，被流体细胞分选器所切割的流段通常至少是来自液滴发生器的单个微滴的体积的十倍。相应地，这会导致流体切换分选器的收集容器与液滴分选器的收集容器相比，细胞浓度较低。

新一代微流体技术极有希望提高流体切换装置的效率并在概念上类似于电子集成电路的芯片上提供细胞分选功能。已经证实：许多微流体系统能够成功地分选异质细胞群中的细胞。其优点在于其完全地自我包含、易于消毒并且可以作为一次性部件被大规模制造(由此获得足够的生产效率)。

图1示出了普通的微流体装置，总体上由标号1表示。微流体装置1包括基底2，其中基底2具有通过本领域所公知的任何常规处理形成于其中的流体流通道3。基底2可以由玻璃、塑料或任何其它常规材料形成，并且可以是大致透明的或者其一部分可以是大致透明的。基底2还具有三个耦合到该基底2的端口4、5和6。端口4是用于管状流体的入口。端口4具有流体连通到与流体流通道3结合的流体流通道7的中心轴通路，使得从外部供应器(未示出)进入端口16的管状流体可进入流体流通道7中，并接着流入到流体流通道3中。该管状流体供应器可以通过本领域技术人员所公知的任何常规耦合机构连接到端口4。

端口5也具有通过样品注入管8流体连通到流体流通道3的中心轴通路。样品注入管8被布置为与流体流通道3的水平轴同轴。在管状流体被注入到端口4中的同时，将细胞的液体样品注入到端口4中，因此这会导致流经流体流通道3的细胞被管状流体所包围。流体流通道3和7，以及样品注入管8的维度和构造被选择为使得当管状/样品流体流经该装置1时，其呈现出本领域所公知的层流。端口6被耦合到流体流通道3的末端，使得该管状/样品流体可以从该微流体装置1中流出。

当管状/样品流体流经流体流通道3时，可以在样品注入管8与出口6之间的一些位置处使光源透过基底2并照射到流体流通道3中，并通过细胞仪技术对其进行分析。另外，可以更改微流体装置1，以用于本领域所公知的细胞分选操作。

但是，这些微流体技术并未被广泛地采用，主要是考虑到在这样的装置上达到最大细胞分选吞吐量的成本。最快的微流体细胞分选器以每秒1000至2000个细胞的速率工作，比目前可用的液滴细胞分选系统慢将近40倍。微流体的支持者建议：可以将大量并行分选通道集成到一个一次性芯片上，以将总吞吐量增加至与液滴细胞分选系统相同的数量级。表面上，这是一个有吸引力的提议，直到有人分析了使用大量并行微流体芯片来提供使细胞分选器运作所需要的所有组件的成本。对于每个细胞分选通道而言，激光器、滤光器和光探测器以及数据获取元件共计数千美元。当40通道微流体分选系统能够与基于单个液滴的细胞分选系统的吞吐量匹敌时，大多数潜在用户都不愿意(或不能)为所需系统组件的其它组件支付40倍的费用。例如，很容易计算出单细胞分选通道所需的激光器、滤光器、光探测器和数据采集元件的一般价格为$15,000，所以制造40通道微流体分选系统将花费$600,000以上，而当零售时，制造商为了获取利润，还将抬高此价格。相比而言，基于单流动通道液滴的常规细胞分选器的零售价为$350,000。

因此，需要对现有技术进行改进，提供一种采用了多个并行流动通道的流式细胞仪系统，以在系统成本与基于液滴的细胞分选器相比具有优势的情况下达到所需要的吞吐率。本发明意在满足这种需要。

发明内容

公开了用于在流式细胞仪系统中测量来自多个并行流动通道的多个发射的系统及方法，其中利用不同的频率来调制各个激发源。使用一个检测器来收集由全部流动通道中的全部源激发的荧光发射，并且通过使用傅里叶变换技术来分离此发射。该系统和方法非常适于微流体应用。

在一个实施例中，公开了用于测量来自粒子的发射的流式细胞仪，所述流式细胞仪包括第一流动通道；第一激发电磁辐射源，所述第一激发电磁辐射源产生了以第一频率调制的第一调制激发光束，所述第一调制激发光束入射在所述第一流动通道上；第二流动通道；第二激发电磁辐射源，所述第二激发电磁辐射源产生了以第二频率调制的第二调制激发光束，所述第二调制激发光束入射在所述第二流动通道上；检测器，当所述粒子位于所述第一流动通道或所述第二流动通道内时，所述检测器适于检测来自所述粒子的任一者的发射，所述检测器产生了检测器输出信号；以及信号处理器，所述信号处理器用于耦合到所述检测器以接收所述检测器输出信号，所述信号处理器用来区分由所述第一调制激发光束激发所述粒子的一者产生的发射所引起的所述检测器输出信号的第一部分和由所述第二调制激发光束激发所述粒子的另一者产生的发射所引起的所述检测器输出信号的第二部分。

在另一实施例中，公开了用于在流式细胞仪中测量来自粒子的发射的方法，其中所述流式细胞仪包括第一和第二流动通道，所述方法包括以下步骤：a)：提供第一激发电磁辐射源；b)：以第一频率调制所述第一激发电磁辐射源以产生第一调制激发光束；c)：使所述第一调制激发光束入射在所述第一流动通道上；d)：提供第二激发电磁辐射源；e)：以第二频率调制所述第二激发电磁辐射源以产生第二调制激发光束；f)：使所述第二调制激发光束入射在所述第二流动通道上；g)：检测来自所述第一和第二流动通道的一者中的任一所述粒子的发射，并且产生单检测器输出信号；以及h)：确定所述单检测器输出信号来自由所述第一调制激发光束激发所述粒子的一者所引起的所述检测发射的第一部分和由所述第二调制激发光束激发所述粒子的另一者所引起的所述检测发射的第二部分。

也公开了其它实施例。

附图说明

图1是现有技术的微流体装置的概要立体图。

图2是现有技术的多通道流式细胞仪系统中的流体流动路径、激发激光器和荧光检测器的概要视图。

图3是根据本发明第一实施例的多通道流式细胞仪系统的概要视图。

图4是根据本发明第二实施例的多通道流式细胞仪系统的概要视图。

图5是根据本发明第三实施例的多通道流式细胞仪系统的概要视图。

图6是根据本发明第四实施例的多通道流式细胞仪系统的概要视图。

图7是用于实施本发明的多通道流式细胞仪的第一实施例方法的概要流程图。

具体实施方式

为了提高对本发明原理的理解，现在将参考附图中所示例的实施例，并且将使用特定的语言来描述相同的特征。然而，应理解，由此并不意在限制本发明的范围，而意在保护本发明所涉及领域的技术人员通常能够理解的、所示例装置和方法的替代和进一步修改以及所示例的本发明原理的进一步应用。

通过下面的描述，本领域技术人员将认识到本实施例可以利用任何并行的通道系统，而并不只适用于微流体系统，这样做只是为了在方便的环境下描述本发明的概念。还应理解，如本文所使用的术语“并行”意在包括任何数目的、并行操作的流动通道，无论这些通道是物理地互相并行，或者甚至是物理地互相接近。

本文所公开的实施例包括用于在许多微流体通道之间共享可选择的检测构件、数据获取通道和分选判定处理器的可扩展方法。本文所公开实施例中的一些实施例，例如在具有相同的有效吞吐量的情况下，将实现将40并行通道微流体分选系统的成本缩减到与液滴细胞分选通道几乎相同的成本。一些实施例阐明了利用激发激光器的方法，其中该激发激光器被分别调制为用于多个并行流动流通道的每一者。所公开的技术可接着被用于通过单检测通道来分离来自不同微流体流动通道的发射。

通过本文应理解，本文所公开的技术可被施加到其中并行流动通道共享同一样品源的系统中和被设计为同时分选不同粒子样品的系统中。还应理解，本文所公开的技术可被施加到微流体系统中，其中该微流体系统包括并行分选和/或串行分选和/或检测模块的结合。被分选的部分可以收集在相同的收集容器中或者多个收集容器中。例如，微流体分选通道的体系可以被构造并被配置为如同具有多个分选路径、闸门和检测点的决策树来工作。此外，技术人员可以在不同检测点处利用具有不同波长的激光或者可以利用现有技术来区分来自多个检测点的发射，其中细胞连续经过该多个检测点。因此，本实施例使得单个光电检测器、信号处理路径和分选控制系统能够与多个分选和/或检测模块相互作用，其中该多个分选和/或检测模块的流动通道，例如并行或串行流动通道的结构及配置和/或决策树的流动结构是独立的。本文所公开的技术也可具有液滴分选技术，其中细胞由流动通道流体流中异步所产生的液滴通过任何期望的方法分选。

图2概要地阐明了如何利用现有技术中的多通道并行流动配置来分选粒子，其中系统总体上由标号10表示。所公开的实施例被用在高速细胞分选应用中。如本文所使用的，术语“细胞”和“粒子”是可以互换的。尽管“细胞”是指生物材料，“粒子”是指非生物材料，但是本文所公开的系统和方法对细胞或者粒子都行得通，因此该术语在本发明和权利要求书中是可以互换的。源12供应期望被分选的细胞。来自细胞源12的各个细胞14向下流过供应通道或路径16，并且被随机地引入到三个分选通道18(1)、18(2)和18(3)之一中。本领域技术人员应理解，出于解释的目的，仅示出了三个分选通道，并且潜在的分选通道的数目并不受到限制。为了进一步解释，假设细胞14具有两种类型14a和14b。其中期望细胞14a被分选到被分选的细胞盛器20中，并且细胞14b被丢弃到废弃物盛器22中。

分选通道18的每一者分叉进入到分选通道24和废弃物通道26中，其中分选通道24耦合到被分选的细胞盛器20，废弃物通道26耦合到废弃物盛器22。由分流器28的位置来决定细胞的流动是指向各分选通道18中的分选通道24或是废弃物通道26。在一个实施例中，分流器28是能够通过电指令信号激发的压电装置，用以根据分流器28的位置，将流经分选通道18的流动机械地分流到分选通道24和废弃物通道26中。在其它实施例中，分流器28不是压电装置，而例如可以是从壁引入而使流动转向的气泡，通过电场移动或激发的流体导流板，或者本领域技术人员所公知的任何其它分流器或分选闸门。

在细胞分选处理过程中，为了确定应将分流器28放置在任何点处哪个位置，流经细胞分选通道18的细胞会受到来自激发光源30的电磁激发。激发光源30可以包括例如激光源，如激光器和激光发光二极管(LED)，但并不限于这两个示例。各激光器30被放置为使得流经分选通道18的细胞将经过激光30的光束。相应的检测器32被放置在各个分选通道18处，以在细胞14经过激发光源30的光束时接收可能由细胞14发出的任何荧光发射。此外，还可以检测不同于荧光的发射，诸如Roman散射、磷光、冷光或散射，但并不限于这些示例。

可替换地，可以使几对激光路径和检测器与一个分选分流器相关联。这样的光束路径/检测对可以在到达分流器之前串联排列在流动路径中。也可以具有直线排列的多个激光器，其中以不同的频率调制该多个激光器每一者，以使得一个PMT能够测量多个发射，如发明名称为“SYSTEMAND METHOD FOR MEASUREMENT OF MULTIPLE FLUORESCENTEMISSIONS IN A FLOW CYTOMETRY SYSTEM(用于在流式细胞仪系统中测量多个荧光发射的系统和方法)”的美国公开专利申请No.2008/0213915A1所公开的，在此通过引用将其内容结合在本说明书中。

在一个实施例中，检测器32包括诸如透镜、带通滤光器和光电倍增管之类的检测光学系统，这些检测光学系统将感应由细胞14发出的滤光器的通带内的射线，并且产生随被接收的射线密度变化的模拟电信号。该模拟信号可接着被转换为能够被数字信号处理器分析的数字信号，以确定随时间变化的信号或脉冲中所表示的荧光发射特性是否与先前所建立的、用以分选的特性设置匹配。如果特性匹配，则适当地标记细胞14，并将其分选到被分选的细胞盛器20中。因此，依据检测器32所检测到的射线布置分流器28以将细胞14引入到合适的盛器中。因为各分选通道18具有激光30、检测器32和相关联的分流器28，所以期望尽可能多的分选通道18能够并行操作，以实现所期望的系统10的吞吐量。

如上所述，图2的配置受到与需要操作各个分选通道18的电子系统相关的成本的影响。为了实现所期望的分选吞吐量，随着分选通道数目的增加，需要的电子系统的数目则会同步增加，这会导致系统10十分不经济。为了消除此缺点，本文所公开的实施例包括如图3概要示出的系统10的修改例，并且总体由标号100表示。使用相同的标号来表示系统10和100的相同部分。

在系统100中，在一个实施例中，利用合适的函数(诸如正弦函数(sin或sin²)，但并不限于此示例)以特定的公知频率来调制(例如，通过振幅调制)激发每一个激光器30。本发明也提出可以通过任何调制方案，诸如振幅调制、频率调制或相位调制来调制激光器30，但并不限于这些示例。可以通过晶体管-晶体管逻辑(TTL)门来调制许多二极管激光(该激光器的一个示例是来自Coherent，Inc.，5100Patrick Henry Drive，Santa Clara，CA 95054的CUBE^TM激光器系列)或者通过将周期信号(正弦波、矩形波)引入到电子装置中来驱动该二极管激光器。许多激光器因其物理腔室设计会产生高度周期性脉冲序列。上述激光器的示例为(Newport Corporation，1791Deere Avenue，Irvine CA 92606出售的)VANGUARD^TM 350-HMD 355激光器，其以约80MHz的频率产生脉冲。可以通过电光调制器(electro-optic modulator，EOM)或声光调制器(acousto-optic modulator，AOM)来实现低频率调制。EOM和AOM被用来将振幅、相位或频率调制引入到连续波(CW)激光光束上。另外，可以通过使安装在电流计上或者旋转镜面上的反射镜快速地扫描横跨通道的光束来执行调制，其中该旋转镜面具有多个平坦侧面。应理解，本文所公开的各种实施例可以使用振幅、相位或频率调制，或者这些技术的结合。在光源中产生周期性激发的任何方法将通过荧光标记来产生周期性荧光发射，其中该荧光标记能够通过本文所述的系统和方法来分析。

在利用微流体技术进行细胞分选的情况下，细胞通常以0.1至5m/s(取决于所采用的流体压力)的速度流经光学系统。此外，如果在单闸门开关中被分选的多个细胞来可以接收，则可以实现压力高达90psi的高压微流体系统。这会在光学测量区域中产生10至100微秒的驻留时间(粒子经过测量区域或穿过激光光束焦距所需要的时间)，对于高压系统来说，会产生0.5至10毫秒的驻留时间。也可以采用可能导致500纳秒至10毫秒的驻留时间的高速系统和低速系统。因为期望在驻留时间期间完成多于两个周期的调制，所以调制频率可以优选在约10KHz与1GHz之间。在本文所公开的微流体细胞分选器的一些实施例中，调制频率在20KHz与500KHz之间。

在一个实施例中，可以通过被调制的电源102(1)至102(3)来完成上述调制，其中被调制的电源102(1)至102(3)用来驱动激发激光器30(1)至30(3)。在另一实施例中，如图4概要地所示，可以使用电光调制器(EOM)来调制从各个激发激光器发出的光。电光调制器是其中信号控制的元件被用来调制光束的光学装置。其以线性电光效应(也被称作Pockel效应)，即通过电场对非线性晶体的折射率的调制与场强呈正比为基础。可以将该调制强加在被调制光束的相位、频率、振幅或方向上。通过使用合适的调制器可以使调制带宽扩展至千兆赫兹的范围。当使用EOM时，如图4的第二实施例流式细胞仪系统200所示，EOM104(1)至104(3)被放置为接收各个相应激发激光器30的输出。在另一配置中，以不同的频率和/或以不同的方式对各个激发光源30进行振幅调制。在另一实施例中，可以使用声光调制器(AOM)来调制从各个激发激光器射出的光。AOM，也被称作布拉格盒，通过声波利用声光效应来衍射并改变光的频率。AOM比通常的机械装置(如有时被用来调制光束的机械截波器)更快，这是因为AOM改变离开光束所需要的时间大致被限制为声波横跨光束的渡越时间，通常为5至100内秒。可以在高达1MHz的频率下使用AOM。当需要更快速的控制时，可以使用EOM。但是，这需要高达10千伏的超高电压，而AOM则可以提供较大的反射范围、简化的设计和较低的功率消耗。

来自激光器30(1)至30(3)的个别被调制的激发光束在其相应的分选通道18内集中在一点(检测容积)处，其中当它们穿过分选通道18时，流式细胞仪中的细胞14流经该分选通道18。来自激光30的激发光束与细胞14的相互作用可以导致荧光发射。除了被放置在各分选通道18附近的检测器32，为了接收上述荧光发射，图3的实施例利用光纤电缆106捕获该发射。光纤电缆106(1)至106(3)将其接收的发射全部传送到检测光学系统108。检测光学系统108因此同时接收可能存在于所有分选通道18处的任何发射信号。本领域技术人员将认识到，可以采用任何装置将来自各种分选通道的发射传送到检测光学系统，诸如反射通道、波导管、光管和线性光学系统。此外，如果分选通道物理地充分接近，则可以将检测光学系统放置为使得分选通道均位于该检测光学系统的视场内，在此情况下，该检测光学系统直接接收发射。应考虑到，检测光学系统108可以包括单个光学系统或多个光学系统。

检测光学系统108使所有分选通道18的组合荧光发射聚焦到光检测器(未示出)，诸如在模拟模式(非光子计数)下工作的光电倍增管(PMT)上。区分感兴趣的个别光谱带(即，由标注荧光分子发出的期望荧光带)的滤光器优选位于PMT前方。在一些实施例中，诸如当系统100被用来感应通过不同荧光标记所标出的多个细胞类型时，单个光学系统将发射传送到多个PMT，其多个PMT的每一者具有使所期望的发射频率的一个范围通过PMT的关联带通滤光器。可以使用长带和短带分色滤光器的网络来分割发射光谱的一部分，并且将适当的部分引到位于PMT前方的光纤系统中。例如，可以将该发射耦合到光纤系统中，并接着将其输入到多个PMT中。可以采用包括窄带陷波滤波器的光学滤波器来阻挡来自分选通道流或粒子的、强烈的激光散射。

在一个实施例中，PMT和相关联的放大系统具有约45MHz(.5-45MHz)的带宽。该带宽被选择为使得其包括所采用的全部调制频率，但是最高通过频率优选小于被用来获取数据的数字采样频率的2.5倍。Nyquist定理指出，为了避免数字采样数据中的调和伪像(harmonicartifacts)，信号的频率内容必须被限制为小于采样频率的两倍。通过模拟数字转换(ADC)112以大于Nyquist频率的速率对检测光学系统108中的模拟信号110进行连续采样，以产生被检测信号110的数字化版本114。在一个实施例中，ADC112通过使用14比特ADC而采用了105MHz的采样速率。

在另一实施例中，ADC112通过使用16比特声音ADC而采用了200MHz的采样速率。在本实施例中，PMT和相关联的放大系统具有约80MHz的带宽。在一些使用了多个MPT的实施例中，优选使用单独的ADC对各MPT中的模拟输出进行采样。在合适的数据处理器(例如使用了适当软件的数字信号处理系统(DSP)116)中，对该数字化数据流114进行分析。在其它使用了多个PMT的实施例中，使来自所有MPT的输出混合在一起以产生由来自全部检测器的信号组成的单一信号。接着可以使用单个ADC对全部PMT的模拟信号进行采样。例如，该系统可以包括40个通道和三个发射带。PMT可被用于三个发射带的一者，然而只有一个ADC被用来对来自这三个PMT的组合输出进行分析。由此与现有方法相比大大节省了资源，其中在现有方法中，40通道的每一者均需要三个检测器，即需求120个单独的ADC。如在现有技术的实施例中，在合适的数据处理器，诸如使用了适当软件的数字信号处理系统(DSP)116中，对来自单一ADC的数字化数据流114进行分析。在另一实施例中，除了使用数字信号处理技术之外，使用一系列无源或有源电子带通滤波器来为每个通道提取被调制的发射强度。接着，使用ADC来测量经过上述各个滤波器的功率。

该软件对被记录在数据中的粒子发射进行分析并检测，从而产生由来自PMT的电脉冲产生的数字化波形，其中来自PMT的电脉冲导致了细胞14中的荧光分子的荧光发射。荧光发射由经过激光器30(1)至30(3)之一所产生的激发光束的荧光标记细胞14产生。荧光分子的正弦激发光束从这些分子中产生大致为正弦的荧光发射强度。调制发射相移和调制发射的调制深度与发射衰变的寿命有关。调制发射频率将与激发源的频率匹配。在分选通道18的全部检测容积中，任何细胞14的组合荧光发射由检测光学系统28检测，并且因此可以表示为关于用于各个单独激发激光器30的一个频率的正弦函数之和，其中该激发激光器30导致了来自细胞14之一的荧光发射。

DSP116以激发激光器30的已知调制频率，通过对来自PMT的电信号110进行采样所获得的数字数据114计算离散时间傅里叶变换(DTFT)，来确定在各个调制频率处存在于信号中的功率。该功率与荧光材料因受到各个光源30的激发而产生的总发射成正比，其中以上述频率调制各个光源30。即使这些发射具有重合的光谱特性，该DTFT计算也可被用来使组合多通道发射信号不与各激光30的各个构件混合，并且得到各个单独发射成分的密度。可替换地，尤其在较慢的微流体系统中，可以计算快速傅里叶变换(FFT)。在其他实施例中，可以使用不同的数学算法来提取所需的信息。

期望将调制频率选择为使得调和不会与测量相互干扰。例如，如果使用了10kHz，则应该避免N×10kHz(例如，20kHz、30kHz、40kHz，等等)。因此，为了避免调和，可以为各个通道智能地选择频率。

在为任何特殊的分选通道18确定单独的发射密度时，DSP116可以使用此信息通过将适当的控制信号施加到控制线路118(1)至118(3)来确定如何归类和分选细胞，其中控制线路118(1)至118(3)被耦合到相应的分流器28(1)至28(3)。应该注意，该系统也可用来分析样品但并不对其进行分选。换言之，该系统可以对粒子进行计数以统计识别和量化整个样本中的显著群体，但并不将这些群体分选到单独的物理收集器中。

与现有技术装置相比，目前所公开的实施例实现的另一显著优点表现在于校准方面。各个光检测器元件会表现出独特的响应度(进入到光检测器中的光子数量与从该光检测器中出来的光子数量之间的关系)。当在系统中例如使用40个光检测器时，为了确保所有的测量通道产生相同的响应，则需要复杂的校准方案。否则，它将需要对40个通道的每一者上的数据进行采样，并且鉴于该通道的响应度，为各个通道设定独特的分选标准。因为目前所公开的实施例共享用于所有通道的同一光检测器和ADC，从而保证了所有通道都表现出相同的响应度。调制频率可以使响应度发生一些变化，但是为了使用检测电子装置来检测标准的校准曲线，扫描贯穿调制频率的整个范围的单个通道相对而言并不麻烦。由于变化的主要来源是检测器和单检测路径中的信噪比之差，所以除了上述节约成本之外，在单检测路径中实施从许多通道接收的测量大大简化了校准。

现在参考图5，概要地示出了本发明的第三实施例，总体由标号300表示，其中并行的分选通道18被并入到离散的封装中。如图3所示的全部流动通道均通过粒子体领域所公知的方法，如相对于图1等所讨论的那些方法形成在集成基底302中。使用相同的标号来指代相同的组件。在图5的实施例中，基底302被概要的示为包含n个分选通道18，其中n为任何整数。耦合到基板302的通道内部被耦合到基底302的外部，以使其能够连接细胞源12、被分选的细胞盛器20和废弃物盛器22。透明视窗304(1)至304(n)形成在各个分选通道18上方的基底302中，以允许光从外部激发源30(1)至30(n)经由任何合适的诸如相应的光纤电缆306(1)至306(n)的装置被引导到各个相应的分选通道18(1)到18(n)内的检测容积。在某些实施例中，整个基底302是透明的。激发源30被示例为通过调制源102驱动；然而，本发明还包括使用其他手段如本文上述的EOM104或AOM来调制激发源。

透明视窗304(1)至304(n)也使来自分选通道18中的任何细胞的荧光发射能够被相应的光纤电缆106(1)至106(n)捕获，并且将其传送到检测光学系统108。参考图3如上所述，实施荧光发射信号的处理。将由此产生的、用于分流器28(1)至28(n)的指令信号通过线路118(1)至118(n)提供给基底302上的适当连接器。

在集成基底302内制造流动通道使得能够保护基底302的容积，从而降低其成本并且增加其使用的便利性。在一些实施例中，基底302是一次性的，即在使用之后，允许使用新的基底302来分选细胞的各个新样品。这大大地简化了分选设备的处理，并且降低了清洁该设备的难度，以避免分选序列之间的交叉污染，这是因为样品所流经的大部分硬件易于处理。也很适合在处理之前对基底302(如通过γ辐射)进行灭菌。为了方便更换新基底302，一些实施例包括一个励磁/读头402，如图6的实施例所概要地示出，其中该实施例总体由标号400表示。励磁/读头402只不过是将激发光纤电缆306和发射光纤电缆106相对于透明视窗304保持为期望取向的集成组件。励磁/读头402可通过夹持机构404或者其他任何确保将其放置在相对于透明视窗304的适当位置处的连接机构安装到基底302。当切换到不同的基底302时，可以断开所有的光纤电缆，并接着将其作为独立的单元重新连接，从而大大简化了操作。

应理解，通过目前所公开的实施例，消除用于各个分选通道18的、单独的检测器将显著减少价格昂贵的光学系统、PMT和ADC的数量，其中如果向各个分选通道18供应冗余的系统，则将需要这些价格昂贵的光学系统、PMT和ADC。对本文所公开的调制光源的使用允许将单检测部分使用于所有的分选通道。然而，将单个数字信号处理器用于全部分选通道比将处理器专用于分选通道之一需要更多的计算能力。对于使用了多个并行分选通道(例如，四十个这样的通道)的高速流式细胞仪来说，细胞以每秒钟高达100,000个细胞或者更高的平均速率随机间歇到达。通过本文所述的调制激发测量，必须在几百微秒内完成对每个细胞的归类和分选决定。为了将每个分选通道18中的细胞分选到适当的收集盛器中，必须实时地执行计算。对本文所公开的DTFT算法和高速处理结构的使用使得能够在这些速率下为细胞分选实现切实可行的解决方案。

图7阐明了用于检测并行流动通道中的荧光发射的概要处理流程图，其中该并行流动通道使用了系统100、200、300和400。处理开始于步骤500，其中在步骤500处，将单个或多个染料施加到细胞或其他粒子群。所使用的各个特定染料具有激发光谱或吸收光谱，以及所产生的荧光发射光谱。由于荧光的物理性能(被称为斯托克斯位移)，荧光发射将总是出现在较长的波长处。来自各种染料的一些或所有发射波长可能重叠。该染料可以由一个或多个激发源激发。

在步骤502处，以不同于其它激发光源的方式来调制具有与至少一种染料的激发光谱相对应的激发波长的激发光源。例如，可以利用正弦函数对各个激发光源进行振幅调制，其中该正弦函数具有不同于所有其它激发频率的频率。

在步骤504处，将各个激发光源的调制输出施加到相应的分选通道。在步骤506处，使来自正被研究的细胞/粒子群流经调制激发光束的检测容积，从而使与各染料相对应的荧光发射存在于该细胞/粒子上。

在步骤508处，将来自全部分选通道的荧光发射(如果有的话)组合到复合荧光发射中。在步骤510处，通过该系统的检测光学系统传送该荧光发射，产生与该组合发射脉冲的、随时间变化的强度相对应的模拟电信号。在步骤512处，数字化该电信号，使得能够通过使用数字信号处理设备对该数据进行分析。在步骤514处，为了至少获取各个激发光源的调制频率，对该数字化脉冲信号执行DTFT。以这些调制频率的每一者所计算的DTFT的数值与由各个激发光源的每一者所引起的发射产生的总输出信号的一部分相对应。接着在步骤516处，对这些DTFT数值进行检查，以确定各激发源是否有助于总荧光发射。系统通过确定各调制频率处的DTFT数值是否落在预定范围内，可以确定刚刚经过对应分选通道的检测容积的细胞/粒子是否被特定数量的对应染料标记，并且执行合适的动作以分选该细胞/粒子。例如，在步骤518处，可以将该细胞/粒子分选到被分离的群体中。

可以使用具有任何数量的激发光源30的流式细胞仪系统100、200、300和400。通过上述应理解，本文所公开的并行通道流式细胞仪系统与现有技术的并行通道系统相比，具有显著的进步。无论使用了多少激发光源30，只需要一个检测器108和相关联的信号处理回路。同时，可以通过使用相同的光学元件和光检测器，对来自每个激发源的荧光进行定量的测量，从而消除由现有的多光路径和多检测器实施所带来的变化。此外，由于只使用了一个探测器，所以可以增加该系统中通道的数目，以在没有显着增加系统成本和没有显著增加校准该系统的复杂性的情况下，实现所以期望的细胞处理速率。应理解，所有这些改进与现有技术流式细胞仪系统相比，提供了显著的性能优势。

检测器的动态范围

在一些情况下，可能存在两个与上述调制技术相关的潜在问题。首先，当使用具有多个分选通道的多个激发激光器时，来自一个以上样品的荧光发射可以同时发生。这是因为在实践中，探测器具有有限的测量范围(即，响应的动态范围)，可用于测量由各个激光器所激发的发射的动态范围的数量不总是恒定的，并且总是小于单个激光发射情况下的数量。此外，在一些情况下，当没有区分不同的激发激光器时，通过使用基于调制的测量系统所能够实现的任何频率下的荧光发射的最小检测点可能高于(低)于通过直接测量总荧光发射(典型的流式细胞仪的参数)所能够实现的最小检测点。

在较低的频率下，可以通过使用高分辨率的ADC来改善这些问题。例如，通过使用22比特的ADC分辨率，可以限制由各通道所产生的最大信号，使其不会到达该动态范围的限制。

本文所公开的分析方法适合在任何流式细胞仪DSP系统中实施。为了高效地进行傅里叶分析，特别设计了DSP硬件，如上所述。此外，应该注意，没有必要计算所有频率(高于Nyquist速率)下的能级，其中所需要的能级是在感兴趣的特定激发激光器调制频率处的傅里叶变换的数量级。因此，除了执行计算速度快的离散傅里叶变换(DFT)或更有效地实施被称为快速傅里叶变换(FFT)这种算法之外，可以计算各个频率下的、计算速度更快的离散时间傅里叶变换(DTFT)，使其可以在最多几微秒的时间内获得所需的信息。这意味着可以将该处理用在实时细胞分选应用中。

如上所述，目前所公开的实施例允许使用一个光检测器/信号处理路径和与多个检测/分选模块相互作用的分选控制系统，无论它们是否位于并行、串行、逻辑树结构或这些机构的组合体中。例如，如果技术人员期望在非常小的概率下进行分选，如1∶1,000,000事件，则可以使用这样的系统，其中第一分选闸门以高吞吐量的方式操作，并且同时(例如)分选十个细胞。换言之，第一分选门将同时看到十个细胞，并且当检测荧光发射时对其进行选择(表示这些细胞之一是所搜寻的粒子)。这意味着，对于每个要选择的细胞来说，其中可能存在几个不符合分类标准的被分选细胞。对于小概率事件，通过该闸门使样品群体比例高达1∶10将是令人满意的结果，并且允许该闸门同时有效地分选多个细胞则增加了该分选处理的前端吞吐量。第二分选闸门或平行设置的闸门接着可以接收该富集分选闸门的输出。即使在最坏情况下，如输入样品纯度至少为10％时，这些第二闸门也可以接着完成分选处理。

鉴于上述，尽管在附图和上面的描述中已经详细阐明并描述了本发明，但其特性同样被视为示例性而非限制性的，应理解，只示出并描述了示例性实施例，并且期望保护在本发明的实质范围内所作出的所有改变和修改。

Claims

1.一种用于测量来自粒子的发射的流式细胞仪，所述流式细胞仪包括：

第一流动通道；

第一激发电磁辐射源，所述第一激发电磁辐射源产生了以第一频率调制的第一调制激发光束，所述第一调制激发光束入射在所述第一流动通道上；

第二流动通道；

第二激发电磁辐射源，所述第二激发电磁辐射源产生了以第二频率调制的第二调制激发光束，所述第二调制激发光束入射在所述第二流动通道上；

检测器，其中当所述粒子位于所述第一流动通道或所述第二流动通道内时，所述检测器适于检测来自所述粒子的任一者的发射，所述检测器产生了检测器输出信号；以及

信号处理器，所述信号处理器用于耦合到所述检测器以接收所述检测器输出信号，所述信号处理器用来区分由所述第一调制激发光束激发所述粒子的一者产生的发射所引起的所述检测器输出信号的第一部分和由所述第二调制激发光束激发所述粒子的另一者产生的发射所引起的所述检测器输出信号的第二部分。

2.根据权利要求1所述的流式细胞仪，还包括：

第一分流器，所述第一分流器与所述第一流动通道相关联并且用于耦合到所述信号处理器；以及

第二分流器，所述第二分流器与所述第二流动通道相关联并且用于耦合到所述信号处理器；

其中所述信号处理器基于所述检测器输出信号的被区分的所述第一部分来控制所述第一分流器；以及

其中所述信号处理器基于所述检测器输出信号的被区分的所述第二部分来控制所述第二分流器。

3.根据权利要求2所述的流式细胞仪，其中所述第一和第二分流器从由压电装置、气泡引入机构和磁动导流板构成的分组中选择。

4.根据权利要求1所述的流式细胞仪，其中所述粒子包括生物细胞。

5.根据权利要求1所述的流式细胞仪，其中所述第一和第二激发电磁辐射源包括激光器。

6.根据权利要求1所述的流式细胞仪，其中所述发射包括从由荧光发射、Roman散射、磷光、冷光或散射构成的分组中所选择的发射。

7.根据权利要求1所述的流式细胞仪，其中所述检测器包括：

光学系统，所述光学系统适于接收所述发射并产生透镜输出；

带通滤光器，所述带通滤光器适于接收所述透镜输出并产生所述滤波输出；以及

光电倍增管，所述光电倍增管适于接收所述滤波输出并产生所述检测器输出信号，所述检测器输出信号包括虚拟的电信号。

8.根据权利要求7所述的流式细胞仪，还包括：

模拟-数字转换器，所述模拟-数字转换器具有用于耦合到所述模拟电信号的转换器输入，并且还具有用于耦合到所述信号处理器的转换器输出。

9.根据权利要求1所述的流式细胞仪，其中所述第一和第二激发电磁辐射源分别包括：

激光器；以及

调制器，所述调制器用于耦合到所述激光器，用以产生所述调制激发光束。

10.根据权利要求9所述的流式细胞仪，其中所述调制器从由TTL门装置、驱动所述激发电磁辐射源的周期性信号、电光调制器、声光调制器、安装在电流计上的反射镜以及安装在旋转镜面上的反射镜构成的分组中选择，其中所述旋转镜面具有多个平面侧。

11.根据权利要求1所述的流式细胞仪，其中通过使用调制方案来调制所述第一和第二调制激发光束，所述调制方案是从由振幅调制、相位调制和频率调制构成的分组中选择的。

12.根据权利要求1所述的流式细胞仪，还包括：

光纤电缆，所述光线电缆具有第一输入、第二输入和输出，所述第一输入适于捕获由所述第一调制激发光束激发所述粒子的一者所产生的所述发射，所述第二输入适于捕获由所述第二调制激发光束激发所述粒子的另一者所产生的所述发射，所述输出适于向所述检测器提供所述发射。

13.根据权利要求2所述的制冷机，还包括：

微流体基底，其中所述第一和第二流动通道以及所述第一和第二分流器通过所述微流体基底形成。

14.一种用于在流式细胞仪中测量来自粒子的发射的方法，其中所述流式细胞仪包括第一和第二流动通道，所述方法包括以下步骤：

a)提供第一激发电磁辐射源；

b)以第一频率调制所述第一激发电磁辐射源以产生第一调制激发光束；

c)使所述第一调制激发光束入射在所述第一流动通道上；

d)提供第二激发电磁辐射源；

e)以第二频率调制所述第二激发电磁辐射源以产生第二调制激发光束；

f)使所述第二调制激发光束入射在所述第二流动通道上；

g)检测来自所述第一和第二流动通道的一者中的所述粒子的任一者的发射，并且产生单检测器输出信号；以及

h)确定所述单检测器输出信号来自由所述第一调制激发光束激发所述粒子的一者所引起的所述检测发射的第一部分和由所述第二调制激发光束激发所述粒子的另一者所引起的所述检测发射的第二部分。

15.根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：

i)基于所述检测发射的所述第一部分使所述第一流动通道中的流动分流；以及

j)基于所述检测发射的所述第二部分使所述第二流动通道中的流动分流。

16.根据权利要求15所述的方法，其中步骤i)和j)分别包括从由致动压电装置、将气泡引入所述各个流动通道以及磁性致动导流板构成的分组中选择的动作。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述粒子包括生物细胞。

18.根据权利要求14所述的方法，其中步骤b)和e)包括调制激光。

19.根据权利要求14所述的方法，其中所述发射包括从由荧光发射、Roman散射、磷光、冷光或散射构成的分组中所选择的发射。

20.根据权利要求14所述的方法，其中步骤g)包括利用光电倍增管来感应所述发射，所述光电倍增管产生所述单检测器输出信号。

21.根据权利要求14所述的方法，其中步骤h)包括对所述单检测器输出信号执行傅里叶变换。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述傅里叶变换包括离散时间傅里叶变换。

23.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一和第二激发电磁辐射源分别包括激光器。

24.根据权利要求18所述的方法，其中步骤b)和e)分别包括从由引动被耦合到激光二极管的TTL门装置、将周期性信号引入到用以驱动所述激发电磁辐射源的驱动信号中、操作电光调制器、操作声光调制器、操作安装在电流计上的反射镜以及操作安装在旋转镜面上的反射镜构成的分组中选择的动作，其中所述旋转镜面具有多个平面侧。

25.根据权利要求14所述的方法，其中步骤b)和e)包括通过使用调制方案来调制所述第一和第二调制激发光束，所述调制方案是从由振幅调制、相位调制和频率调制构成的分组中选择的。