CN102186338B

CN102186338B - 改进的细胞组合物及制备所述组合物的方法

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Publication number: CN102186338B
Application number: CN200980141716.0A
Authority: CN
Inventors: 安迪·查特林; 格雷戈里·鲁索蒂; 何沭阳; 阿贾伊·帕尔; 宏·J·陈; 托马斯·布列瓦; 瑞恩·绍尔; 布莱恩·墨菲
Original assignee: Anthrogenesis Corp
Current assignee: Clarity Acquisition II LLC
Priority date: 2008-08-20
Filing date: 2009-08-20
Publication date: 2016-03-16
Anticipated expiration: 2029-08-20
Also published as: US20100047213A1; AU2013203191A1; CN105766891A; KR20180049231A; RU2011110455A; AU2013203191B2; EP3172963A1; EP2330889B1; CA2734236A1; EP3539380A3; KR20210010648A; CN102186338A; WO2010021714A2; KR20170023194A; RU2563518C2; JP2020105207A; IL252119B; KR20110050521A; AU2009283216B2; US20190261623A1

Abstract

本发明提供一种配制包含胎盘干细胞的组合物的改进方法，及其由此制备的改良组合物和细胞制剂。

Description

改进的细胞组合物及制备所述组合物的方法

本申请要求2008年8月20日根据35U.S.C.$119(e)提交的美国临时申请号61/090,577的权利，在此将其整体纳入作为参考。

1.技术领域

本发明提供包含细胞的改良组合物，例如药物组合物，以及制备该组合物的改进方法，所述细胞为例如干细胞和胎盘细胞，如分离的人胎盘贴壁多能细胞，例如第5.3节所述多能胎盘细胞，或分离自人胎盘灌洗液的细胞，例如分离自人胎盘灌洗液的总有核细胞。

2.技术背景

细胞组合物，例如干细胞组合物，已成为对大量生理缺陷有吸引力的治疗手段，如骨髓移植。存在改进细胞制剂的需要，给需要这种组合物的个体施用的干细胞。

3.发明概述

本发明提供制备改良的含细胞组合物的方法，例如分离的胎盘细胞，如胎盘干细胞、胎盘多能细胞、能扩增并具有分化成至少两种不同类型细胞的潜能的胎盘细胞，例如成骨和软骨形成细胞类，或从胎盘灌洗液分离的细胞，例如从胎盘灌洗液分离的总有核细胞，以及包含这些细胞的组合物，例如适合施用于个体。所述改进方法使用具体的步骤和具体组合物进行冷冻前保存处理、冷冻保存和解冻细胞。在某些实施方案中，所属改进方法减少了或消除了冷冻保存细胞解冻后的聚积。在优选的实施方案中，改良组合物包含胎盘多能细胞。

在一个实施方案中，本发明提供一种制备组合物的方法，该方法包括：(a)使细胞与含右旋糖酐和人血清白蛋白(HSA)的溶液接触，形成含细胞溶液；(b)过滤该含细胞溶液形成过滤的含细胞溶液；(c)可选地，用含有右旋糖酐的第一稀释溶液稀释该过滤的含细胞溶液至大约1到50×10⁶、1到40×10⁶、1至30×10⁶、1至20×10⁶、1至15×10⁶、或1至10×10⁶细胞每毫升；及(d)可选地，用含有右旋糖酐的第二稀释溶液稀释该过滤的含细胞溶液。在一些实施方案中，步骤(c)中所用的步骤(b)中的过滤的含细胞溶液包含大于15×10⁶细胞每毫升，其中步骤(c)中所述稀释是稀释到大约15×10⁶细胞每毫升。在具体的实施方案中，步骤(c)中所用的步骤(b)中的过滤的含细胞溶液包含大于大约10±3×10⁶细胞每毫升，其中步骤(c)所述稀释是稀释到大约10±3×10⁶细胞每毫升。在一些实施方案中，步骤(c)所用的步骤(b)中的过滤的含细胞溶液包含超过大约7.5×10⁶细胞每毫升，其中步骤(c)所述稀释是稀释到大约7.5×10⁶细胞每毫升。在一个具体的实施方案中，步骤(d)的含右旋糖酐的溶液不含人血清白蛋白。在一个具体的实施方案中，过滤的含细胞组合物中的细胞在步骤(d)前冷冻保存。在一些实施方案中，如果步骤(a)后细胞数少于10±3×10⁶细胞每毫升，过滤是可选的。在一些实施方案中，如果步骤(a)后细胞数少于7.5×10⁶细胞每毫升，过滤是可选的。

在一些实施方案中，所述第一稀释溶液或所述第二稀释溶液中所述右旋糖酐为2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％、或10％右旋糖酐。在一些实施方案中，所述第一稀释溶液或所述第二稀释溶液中所述右旋糖酐为11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％右旋糖酐。第一稀释溶液或第二稀释溶液中所述右旋糖酐可以是任何低分子量的右旋糖酐，如具有大约1kDa到大约150kDa、大约1kDa至大约125kDa、大约1kDa到大约100kDa、大约1kDa至大约75kDa、大约1kDa至大约50kDa、或大约1kDa至大约25kDa分子量的右旋糖酐。在一些实施方案中，第一稀释溶液或第二稀释溶液中所述右旋糖酐具有大约1kDa到大约10kDa、大约30kDa到大约50kDa、或大约60kDa到大约80kDa的分子量。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液或所述第二稀释溶液中所述右旋糖酐是右旋糖酐1。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液和所述第二稀释溶液中所述右旋糖酐是右旋糖酐1。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液或所述第二稀释溶液中所述右旋糖酐是右旋糖酐70。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液和所述第二稀释溶液中所述右旋糖酐是右旋糖酐70。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液或所述第二稀释溶液中所述右旋糖酐是右旋糖酐40。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液和所述第二稀释溶液中所述右旋糖酐是右旋糖酐40。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液或所述第二稀释溶液中所述右旋糖酐40是2.5％至10％的右旋糖酐40。在一些实施方案中，所述第一稀释溶液或所述第二稀释溶液中所述右旋糖酐40是大约2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％、或10％的右旋糖酐40。在一些实施方案中，所述第一稀释溶液或所述第二稀释溶液中所述右旋糖酐是大约11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％或20％右旋糖酐40。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述右旋糖酐40为5.0％的右旋糖酐40。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述右旋糖酐40为5.5％的右旋糖酐40。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述右旋糖酐40为10％的右旋糖酐40。

在其它实施方案中，所述第一和/或第二稀释溶液除了右旋糖酐外还包含多糖，或者用多糖代替它右旋糖酐。例如在某些实施方案中，所述第一和/或第二稀释溶液包含麦芽糊精(例如大约2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％、或10％的麦芽糖糊精)，海藻糖(例如大约2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％、或10％的海藻糖)，或羟乙基淀粉(例如大约2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％、或10％的羟乙基淀粉)。在其它实施方案中，所述第一和/或第二稀释溶液包含蔗糖(例如大约2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％、或10％的蔗糖)，肝素(例如55USP单位/ml肝素)，或糖原(例如大约2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％、或10％的糖原)。在一个具体实施方案中，所述第一和/或第二稀释溶液除了右旋糖酐外，还包含麦芽糊精，或者用麦芽糊精代替右旋糖酐。在另一具体实施方案中，所述第一和/或第二稀释溶液除了右旋糖酐外，还包含海藻糖，或者用海藻糖代替右旋糖酐。在另一具体实施方案中，所述第一和/或第二稀释溶液除了右旋糖酐外，还包含羟乙基淀粉，或者用羟乙基淀粉代替右旋糖酐。

在另一具体实施方案中，所述含HSA的溶液中所述HSA为大约1至17％的HSA。在另一具体实施方案中，所述含HSA的溶液中所述HSA为大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％或17％的HSA。在另一具体实施方案中，所述含HSA的溶液中所述HSA为大约4至10％的HSA。在另一具体实施方案中，所述含HSA的溶液中所述HSA为大约3.125％的HSA。在另一具体实施方案中，所述含HSA的溶液中所述HSA为大约5％的HSA。在另一具体实施方案中，所述含HSA的溶液中所述HSA为大约10％的HSA。在另一具体实施方案中，所述含HSA的溶液中所述HSA为大约16.875％的HSA。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述HSA为大约1至17％的HSA。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述HSA为大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％或17％的HSA。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述HSA为大约4至10％的HSA。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述HSA为大约3.125％的HSA。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述HSA为大约5％的HSA。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述HSA为大约10％的HSA。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述HSA为大约16.875％的HSA。

在其它实施方案中，牛血清白蛋白(BSA)(例如大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的BSA)或胎牛血清(FBS)(例如大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的胎牛血清)可用于补充或代替所述溶液中的HSA。

在一些实施方案中，第一稀释溶液中HSA对右旋糖酐的比例，如右旋糖酐1、右旋糖酐40或右旋糖酐70，是大约6∶1的HSA∶右旋糖酐至大约1∶2.6的HSA∶右旋糖酐。在一些实施方案中，HSA对右旋糖酐的比例大约为6∶1、5.5∶1、5∶1、4.5∶1、4∶1、3.5∶1、3∶1、2.5∶1、2.0∶1、1.5∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2或1∶2.6HSA∶右旋糖酐。在一些实施方案中，第一稀释溶液中HSA对右旋糖酐的比例，例如右旋糖酐1、右旋糖酐40或右旋糖酐70，为大约3.13％HSA/8.25％右旋糖酐。在一些实施方案中，第一稀释溶液中HSA对右旋糖酐的比例，例如右旋糖酐1、右旋糖酐40或右旋糖酐70，为大约16.88％HSA/2.75％右旋糖酐。在具体实施方案中，第一稀释溶液中HSA对右旋糖酐的比例，例如右旋糖酐1、右旋糖酐40或右旋糖酐70，为大约10％HSA/5.5％右旋糖酐，如右旋糖酐1、右旋糖酐40或右旋糖酐70。

在另一具体实施方案中，步骤(a)中所述溶液或含细胞溶液包含冷冻保护剂。在一个更具体实施方案中，所述冷冻保护剂是二甲基亚砜(DMSO)。在一具体实施方案中，步骤(a)所述溶液包含大约1％至大约15％、大约2.5％至大约15％、大约2.5％至10％左右、大约5％至15％左右、大约5％至大约10％、或大约10％至15％的DMSO。在一具体实施方案中，步骤(a)所述溶液包含大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的DMSO。在一具体实施方案中，步骤(a)所述溶液包含大约5％的DMSO。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液还包含冷冻保护剂。在一更具体的实施方案中，所述冷冻保护剂是二甲基亚砜(DMSO)。在一具体实施方案中，所述第一稀释溶液还包含大约1％至大约15％、大约2.5％至大约15％、大约2.5％至10％左右、大约5％至15％左右、大约5％至大约10％、或大约10％至15％的DMSO。在一个具体实施方案中，所述第一稀释溶液还包含大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的DMSO。

在一个具体实施方案中，所述第一稀释溶液还包含大约5％的DMSO。

在一个具体实施方案中，所述方法制备的组合物包含细胞和大约2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％、或10％的右旋糖酐，如右旋糖酐1、右旋糖酐40或右旋糖酐70。在另一具体实施方案中，所述方法制备的组合物包含细胞和大约7.5％至大约9％右旋糖酐，例如右旋糖酐40。在另一具体实施方案中，所述方法制备的组合物包含大约1.5×10⁶细胞每毫升至大约3.75×10⁶细胞每毫升。在另一具体实施方案中，所述方法制备的组合物包含大约1.0±0.3×10⁶细胞每毫升至大约5.0±1.5×10⁶细胞每毫升。在其它具体的实施方案中，所述方法制备的组合物包含大约1.0×10⁶细胞每毫升到15×10⁶细胞每毫升之间，例如大约7.5×10⁶细胞每毫升到大约15×10⁶细胞每毫升之间。在另一具体实施方案中，所述方法制备的组合物包含从大约1％HSA至15％HSA。在另一具体实施方案中，所述方法制备的组合物包含从大约1％HSA到10％HSA。

本发明还提供一种制备组合物的方法，包括：(a)用70μM-150μM过滤器过滤包含5.5％右旋糖酐40和10％HSA的溶液中的多个细胞，形成过滤的含细胞溶液；(b)可选地，用5.5％右旋糖酐40、10％HSA和5％DMSO稀释过滤的含细胞溶液到大约1至50×10⁶、1到40×10⁶、1至30×10⁶、1至20×10⁶、1至15×10⁶、或1至10×10⁶细胞每毫升；(c)冷冻保存所述细胞；(d)解冻所述细胞和(e)用10％右旋糖酐40稀释所述过滤的含细胞溶液，制备所述组合物。在一些实施方案中，步骤(b)所用的步骤(a)中过滤的含细胞溶液包含大于大约15×10⁶细胞每毫升，其中步骤(b)中所述稀释为稀释到大约15×10⁶细胞每毫升。在一些实施方案中，如果步骤(a)中过滤的含细胞溶液中含有少于15×10⁶细胞每毫升，可任选过滤。在一些实施方案中，步骤(b)所用的步骤(a)中过滤的含细胞溶液包含大于大约10±3×10⁶细胞每毫升，其中步骤(b)中所述稀释为稀释到大约10±3×10⁶细胞每毫升。在一些实施方案中，如果步骤(a)中过滤的含细胞溶液中含有少于10±3×10⁶细胞每毫升，可任选过滤。在一些实施方案中，步骤(b)所用的步骤(a)中过滤的含细胞溶液包含大于大约7.5×10⁶细胞每毫升，其中步骤(b)中所述稀释为稀释到大约7.5×10⁶细胞每毫升。在一些实施方案中，如果步骤(a)中过滤的含细胞溶液中含有少于7.5×10⁶细胞每毫升，可任选过滤。在一些实施方案中，步骤(e)包括用10％的右旋糖酐40以1∶1至1∶5(v/v)稀释过滤的含细胞溶液。在一些实施方案中，步骤(e)包括用10％的右旋糖酐40以1∶1至1∶11(v/v)稀释过滤的含细胞溶液。在更具体的实施方案中，步骤(a)的含细胞溶液还包含冷冻保护剂，如DMSO，例如大约2％至大约15％的DMSO。在一个具体实施方案中，步骤(a)中所述溶液还包含大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的DMSO。在一个具体实施方案中，步骤(a)中所述溶液还包含大约5％的DMSO。在优选的实施方案中，步骤(a)中的过滤器是70μM到100μM的过滤器。

在另一实施方案中，本发明提供一种制备组合物的方法，该方法包括：(a)离心多个细胞以收集该细胞；(b)重悬所述细胞于5.5％右旋糖酐40中；(c)离心所述细胞以收集该细胞；(d)重悬所述细胞于含有10％HSA的5.5％右旋糖酐40溶液中，制备含细胞溶液；(e)用40μM至150μM过滤器过滤所述含细胞溶液，产生过滤的含细胞溶液；(f)可选地，用5.5％右旋糖酐40、10％HSA和冷冻保护剂，如DMSO，如5％DMSO，稀释所述过滤的含细胞溶液到大约1到50×10⁶、1到40×10⁶、1至30×10⁶、1至20×10⁶、1至15×10⁶、或1至10×10⁶细胞每毫升；(g)冷冻保存所述细胞；(h)解冻所述细胞；及(i)用与含细胞溶液的比例为1∶1到1∶11(v/v)的10％右旋糖酐40稀释该细胞溶液，制备所述组合物。在一些实施方案中，步骤(f)中所用的步骤(e)中过滤的含细胞溶液包含超过大约15×10⁶细胞每毫升，其中步骤(f)所述稀释是稀释到大约15×10⁶细胞每毫升。在具体的实施方案中，步骤(f)中所用的步骤(e)中过滤的含细胞溶液包含超过大约10±3×10⁶细胞每毫升，其中步骤(f)所述稀释是稀释到大约10±3×10⁶细胞每毫升。在一些实施方案中，步骤(f)中所用的步骤(e)中过滤的含细胞溶液包含超过大约7.5×10⁶细胞每毫升，其中步骤(f)所述稀释是稀释到大约7.5×10⁶细胞每毫升。在一些实施方案中，如果在步骤(d)后细胞数少于10±3×10⁶细胞每毫升，可任选地过滤。在一些实施方案中，如果在步骤(d)后细胞数少于7.5×10⁶细胞每毫升，可任选地过滤。在一具体实施方案中，如果步骤(d)中所述重悬会导致含细胞溶液包含少于大约10±3×10⁶细胞每毫升，步骤(d)中所述溶液包含冷冻保护剂，例如DMSO，如大约2％至大约15％DMSO，并且步骤(f)不执行。在优选的实施方案中，步骤(e)中的过滤器是70μM到100μM的过滤器。

本发明还提供一种制备组合物的方法，该方法包括：(a)用过滤器过滤包含分离的胎盘细胞、5.5％右旋糖酐40和10％人血清白蛋白(HSA)的溶液，除去可见的细胞团块，产生过滤的含分离的胎盘细胞的溶液；(b)任选地，用一定量含有5.5％右旋糖酐40、10％人血清白蛋白(HSA)和5％二甲基亚砜(DMSO)的溶液稀释所述过滤的含分离的胎盘细胞的溶液，所述量足以使过滤的含分离的胎盘细胞的溶液稀释到大约1至50×10⁶、1到40×10⁶、1至30×10⁶、1至20×10⁶、1至15×10⁶、或1至10×10⁶细胞每毫升；及(c)用10％右旋糖酐40稀释所述过滤的含分离的胎盘细胞的溶液，制备所述组合物。在一些实施方案中，步骤(b)中所用的步骤(a)中的过滤的含细胞溶液包含超过大约15×10⁶细胞每毫升，其中步骤(b)中所述稀释为稀释到大约15×10⁶细胞每毫升。在具体的实施方案中，步骤(b)中所用的步骤(a)中的过滤的含细胞溶液包含超过大约10±3×10⁶细胞每毫升，其中步骤(b)中所述稀释为稀释到大约10±3×10⁶细胞每毫升。在一些实施方案中，步骤(b)中所用的步骤(a)中的过滤的含细胞溶液包含超过大约7.5×10⁶细胞每毫升，其中步骤(b)中所述稀释为稀释到大约7.5×10⁶细胞每毫升。在一些实施方案中，步骤(c)包括以大约1∶1至1∶11含分离的胎盘细胞的溶液∶右旋糖酐40(v/v)，用10％右旋糖酐40稀释所述过滤的含分离的胎盘细胞的溶液。在一些实施方案中，步骤(c)包括以大约1∶1至1∶5含分离的胎盘细胞的溶液∶右旋糖酐40(v/v)，用10％右旋糖酐40稀释所述过滤的含分离的胎盘细胞的溶液。在一些实施方案中，如果细胞数少于10±3×10⁶细胞每毫升，任选地过滤。在一些实施方案中，如果细胞数少于7.5×10⁶细胞每毫升，任选地过滤。在一个具体实施方案中，所述过滤器是70μM的过滤器。在另一具体实施方案中，所述过滤器是100μM的过滤器。在另一具体实施方案中，所述过滤器是70μM至100μM的过滤器。

在任何上述方法的具体实施方案中，所述组合物是药物组合物。

在任何上述方法的另一具体实施方案中，所述方法还包括浓缩得到的细胞组合物到大约5×10⁶细胞每毫升至1×10⁸细胞每毫升。这种组合物是有用的，例如给需要的个体皮下施用该组合物。

另一个方面，本发明提供一种药物组合物，例如含细胞的药物组合物，例如干细胞、分离的胎盘细胞，例如胎盘干细胞和胎盘多能细胞。在某些实施方案中，所述组合物是由本发明描述的任何方法制备的。在一个实施方案中，本发明提供一种组合物，例如一种溶液，其包含多个细胞，例如干细胞、分离的胎盘细胞，例如胎盘干细胞或胎盘多能细胞，其中所述组合物包含大约1.0±0.3×10⁶细胞每毫升到大约5.0±1.5×10⁶细胞每毫升之间，其中所述组合物不含可见的细胞团块(即没有大的细胞团块)，或基本上不含这种可见的团块。在某些其它实施方案中，所述组合物包含大约1.0×10⁶细胞每毫升和15×10⁶细胞每毫升之间，例如大约7.5×10⁶细胞每毫升和大约15×10⁶细胞每毫升之间。在某些其它实施方案中，所述组合物包含小于20×10⁶细胞每毫升。

在一些实施方案中，所述组合物包含大约2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％或10％的右旋糖酐，如右旋糖酐1、右旋糖酐40或右旋糖酐70。在一个具体实施方案中，所述组合物包含大约7.5％到90％的右旋糖酐40。在一个具体实施方案中，所述组合物包含大约5.5％的右旋糖酐40。

在其它实施方案中，除了右旋糖酐，所述组合物还包含多糖，或者用多糖代替右旋糖酐。在某些实施方案中，多糖是聚葡萄糖，不含非葡萄糖亚基。在其它实施方案中，所述组合物包含麦芽糊精(例如大约2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％、或10％的麦芽糊精)，海藻糖(例如大约2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％、或10％的海藻糖)，或羟乙基淀粉(例如大约2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％、或10％的羟乙基淀粉)。在其它实施方案中，所述组合物包含蔗糖(例如大约2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％、或10％的蔗糖)，肝素(如55USP/ml肝素)，或糖原(例如大约2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％、或10％的糖原)。在一个具体实施方案中，所述组合物除了右旋糖酐外，还包含麦芽糊精，或者用麦芽糊精代替右旋糖酐。在另一具体实施方案中，所述组合物除了右旋糖酐外，还包含海藻糖，或者用海藻糖代替右旋糖酐。在另一具体实施方案中，所述组合物除了右旋糖酐外，还包含羟乙基淀粉，或者用羟乙基淀粉代替右旋糖酐。

在另一具体实施方案中，所述组合物包含大约1％至大约17％的HSA。在一些实施方案中、所述组合物包含大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、或大约17％的HSA。在一些实施方案中，所述组合物包含大约3.125％HSA。在一些实施方案中，所述组合物包含大约5％HSA。在一些实施方案中，所述组合物包含大约10％HSA。在一些实施方案中，所述组合物包含大约16.875％HSA。

在其它实施方案中，所述组合物除了HSA，还包含牛血清白蛋白(BSA)(例如大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的BSA)或胎牛血清(FBS)(例如大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％胎牛血清)，或者用含牛血清白蛋白胎牛血清代替HSA。

在一些实施方案中，所述组合物包含冷冻保护剂，如DMSO，例如大约1％至15％DMSO。在一些实施方案中，所述组合物包含大约1％至5％的DMSO。在一些实施方案中，所述组合物包含大约1％至大约15％、大约2.5％至大约15％、大约2.5％至大约10％、大约5％至大约15％、大约5％至大约10％或大约10％至大约15％的DMSO。在一些实施方案中，所述组合物包含大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的DMSO。在一个具体实施方案中，所述组合物包含大约5％的DMSO。

在一个具体实施方案中，所述细胞已经被冷冻保存和解冻。在另一具体实施方案中，所述细胞已经通过70μM至100μM过滤器过滤。在另一具体实施方案中，所述组合物不含可见的细胞团块。在另一具体实施方案中，所述组合物包含每10⁶个细胞少于200个细胞团块，其中所述细胞团块仅在显微镜下可见，例如在光学显微镜下。在另一具体实施方案中，所述组合物包含每10⁶个细胞少于150个细胞团块，其中所述细胞团块仅在显微镜下可见，例如在光学显微镜下。在另一具体实施方案中，所述组合物包含每10⁶个细胞少于100个细胞团块，其中所述细胞团块仅在显微镜下可见，例如在光学显微镜下。

在本发明所述任何方法或组合物的具体实施方案中，所述细胞是干细胞，例如分离自排尽血的人类产后胎盘的干细胞。在某些实施方案中，这些细胞已被扩增。在上述任何实施方案的另一具体实施方案中，所述细胞是贴壁细胞，即粘附于组织培养表面的细胞，如组织培养塑料(无包被或被如纤维连接蛋白，层粘连蛋白等包被)。贴壁细胞的实例包含，例如本发明所述贴壁胎盘干细胞、骨髓间充质干细胞、成纤维细胞等。在另一实施方案中，所述细胞是人细胞。

在另一实施方案中，所述细胞是从胎盘灌流液获得(如分离)的细胞。在一更具体实施方案中，所述细胞是从胎盘灌流液获得的有核细胞，例如总有核细胞。在某些实施方案中，在灌流胎盘收集胎盘总有核细胞前，排除胎盘血液，并灌流胎盘以除去残留的血液。在某些其它实施方案中，在灌流胎盘收集胎盘总有核细胞前，排除胎盘血液但不灌流胎盘除去残留的血液。在某些其它实施方案中，在灌流收集胎盘总有核细胞前，既不排除胎盘血液也不灌流胎盘除去残留的血液。

在所述方法的另一个具体实施方案中，所述细胞是干细胞。在更具体的实施方案中，所述干细胞是成人干细胞、体干细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、脐带血干细胞、羊水干细胞、骨髓间充质干细胞、脐血间充质干细胞、外周血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或骨膜间充质干细胞。在另一实施方案中，所述细胞是自然杀伤细胞。

在另一具体实施方案中，所述细胞是分离的胎盘细胞。在某些实施方案中，所述分离的胎盘细胞是分离的胎盘干细胞。在某些其它实施方案中，所述分离的胎盘细胞是分离的胎盘多能细胞。

在某些实施方案中，所述分离的胎盘细胞是分离的胎盘干细胞。在某些其它实施方案中，所述分离的胎盘细胞是分离的胎盘多能细胞。在一个具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是以流式细胞仪检测到的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺细胞。在一个更具体的实施方案中，所述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺细胞是胎盘干细胞。在另一更具体实施方案中，所述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺细胞是胎盘多能细胞。在另一具体实施方案中，所述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞具有分化成神经细胞表型、成骨细胞表型、或软骨细胞表型的潜能。在更具体的实施方案中，所述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞还是CD200⁺细胞。在另一更具体实施方案中，所述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞还是用流式细胞仪检测到的CD90⁺或CD45^-。在另一更具体实施方案中，所述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞还是用流式细胞仪检测到的CD90⁺或CD45^-。在另一个更具体的实施方案中，所述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘细胞还是用流式细胞仪检测到的CD90⁺或CD45^-。在另一更具体实施方案中，所述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘细胞还是用流式细胞仪检测到的CD90⁺和CD45^-。在另一更具体实施方案中，所述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD90⁺和CD45^-细胞还是用流式细胞仪检测到的CD80^-和CD86^-。

在一个更具体实施方案中，所述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺细胞还是CD29⁺、CD38^-、CD44⁺、CD54⁺、CD80^-、CD86^-、SH3⁺或SH4⁺中的一种或多种。在另一更具体的实施方案中，所述细胞还是CD44⁺。在任何上述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞的具体实施方案中，所述细胞也是CD117^-、CD133^-、KDR^-(VEGFRT^-)、HLA，B，C⁺、HLA-DP，DQ，DR^-和/或程序性死亡-1配体(PDL1)⁺中的一种或多种。

在其它实施方案中，所述分离的胎盘细胞是CD200⁺和HLA-G⁺；CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺；CD200⁺和OCT-4⁺；CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺；CD73⁺和CD105⁺，并且当包含所述分离的胎盘细胞的胎盘细胞群在允许形成胚样体的条件下培养时，促进在所述胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；或OCT-4⁺，并且当包含所述分离的胎盘细胞的胎盘细胞群在允许形成胚样体的条件下培养时，促进所述胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；或者上述的任何组合。在一个具体实施方案中，所述CD200⁺、HLA-G⁺胎盘细胞是CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺和CD105⁺。在另一具体实施方案中，所述CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺胎盘细胞是CD34^-、CD38^-、CD45^-和HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，所述CD200⁺、OCT-4⁺胎盘细胞是CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，所述CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺胎盘细胞是CD34^-、CD45^-、OCT-4⁺和CD200⁺。在另一具体实施方案中，所述CD73⁺、CD105⁺胎盘细胞是OCT-4⁺、CD34^-、CD38^-和CD45^-。在另一具体实施方案中，所述胎盘细胞是CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-和CD45^-。

在某些实施方案中，分离的胎盘细胞是CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD80^-、CD86^-、CD90⁺、CD117^-、CD133^-、CD200⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^-、SSEA4^-、OCT-4⁺、MHC-I⁺、KDR^-(VEGFR2^-)、HLA-A，B，C⁺、HLA-DP，DQ，DR^-、PDL1⁺、ABC-p中的一种或多种，其中ABC-p是一种胎盘特异性ABC转运蛋白(也称为乳腺癌耐药蛋白(BCRP)和米托蒽醌耐药蛋白(MXR))。在一个具体实施方案中，分离的胎盘细胞是CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^-、SSEA4^-、和OCT-4⁺。在另一个实施方案中，分离的胎盘细胞是CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD54⁺、SH2⁺、SH3⁺、和SH4⁺。在另一个实施方案中，分离的胎盘细胞是CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD54⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺和OCT-4⁺。在另一个实施方案中，分离的胎盘细胞是CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、HLA-1⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺。在另一实施方案中，分离的胎盘细胞是OCT-4⁺和ABC-P⁺。在另一个实施方案中，分离的胎盘细胞是SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺和OCT-4⁺。在另一实施方案中，分离的胎盘细胞是OCT-4⁺、CD34^-、SSEA3^-和SSEA4^-。在一个具体实施方案中，所述OCT-4⁺、CD34^-、SSEA3^-、和SSEA4^-细胞还是CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、SH2⁺、SH3⁺、和SH4⁺。在另一个实施方案中，分离的胎盘细胞是OCT-4⁺和CD34^-，以及SH3⁺或SH4⁺。在另一个实施方案中，分离的胎盘细胞是CD34^-，以及CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD90⁺或OCT-4⁺。在某些实施方案中，分离的胎盘细胞是CD10⁺、CD34^-、CD105⁺和CD200⁺。

在另一实施方案中，在本发明所述治疗方法中有用的分离的胎盘细胞是CD10⁺、CD29^-、CD44⁺、CD45^-、CD54/ICAM^-、CD62^-E^-、CD62^-L^-、CD62^-P^-、CD80^-、CD86^-、CD103^-、CD104^-、CD105⁺、CD106/VCAM⁺、CD144/VE^-钙粘蛋白^low，CD184/CXCR4^-、β2^-微球蛋白^low，MHC-I^low，MHC-II^-、HLA-G^low，和/或PDL1^low中的一种或多种。在一个具体实施方案中，分离的胎盘细胞至少是CD29^-和CD54^-。在另一具体实施方案中，分离的胎盘细胞至少是CD44⁺和CD106⁺。在另一具体实施方案中，分离的胎盘细胞至少是CD29⁺。

在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞以比相同数目骨髓间充质干细胞更高的可检测水平表达至少一种或多种基因，其中所述一种或多种基因是ACTG2、ADARB1、AMIG02、ARTS-I、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、ICAM1、IER3、IGFBP7、ILIA、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAK1、PCDH7、PDLIM3、PKP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN、和ZC3H12A中的一种或多种，其中所述骨髓间充质干细胞的培养传代次数等于所述分离的胎盘细胞的传代次数。在更具体的实施方案中，所述分离的胎盘细胞当在培养基中倍增大约3至大约35倍时，表达所述一种或多种基因，该培养基包含60％Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)-LG(优选来自Gibco)和40％MCDB-201(优选来自Sigma)；2％小牛血清(优选来自Hyclone实验室)；1×胰岛素铁硒传递蛋白(ITS)；1×亚油酸-牛血清白蛋白(LA-BSA)；10^-9M地塞米松(优选来自Sigma)；10^-4M抗坏血酸2-磷酸(优选来自Sigma)；表皮生长因子10ng/mL(优选来自R&D系统)和血小板生长因子(PDGF-BB的)10ng/mL(优选来自R&D系统)。在更具体的实施方案中，所述分离的胎盘细胞当在培养基中倍增大约3至大约35倍时，表达所述一种或多种基因，该培养基包含60％Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)-LG(优选来自Gibco)和40％MCDB-201(优选来自Sigma)；2％小牛血清(优选来自Hyclone实验室)；1×胰岛素铁硒传递蛋白(ITS)；1×亚油酸-牛血清白蛋白(LABSA)；10^-9M地塞米松(优选来自Sigma)，10^-4M抗坏血酸2-磷酸(优选来自Sigma)；表皮生长因子10ng/mL(优选来自R&D系统)和血小板生长因子(PDGF-BB的)10ng/mL(优选来自R&D系统)。

在另一具体实施方案中，所述胎盘干细胞表达源于神经营养因子胶质细胞的神经营养因子(GDNF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、肝细胞生长因子(HGF)、胎盘生长因子(PGF)和血管内皮生长因子(VEGF)。

在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞包含于细胞群内，该细胞群的至少50％是所述分离的胎盘细胞。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞包含于细胞群内，该细胞群的至少70％是所述分离的胎盘细胞。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞包含于细胞群内，该细胞群的至少80％是所述分离的胎盘细胞。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞包含于细胞群内，该细胞群的至少90％是所述分离的胎盘细胞。在某些其它实施方案中，所述细胞群中的胎盘细胞基本上没有母体基因型细胞，例如所述细胞群中至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的胎盘细胞具有胎儿基因型，即源于胎儿。在某些其它实施方案中，包含所述胎盘细胞的细胞群基本上不含母体基因型细胞，例如所述细胞群中至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的胎盘细胞具有胎儿基因型，即源于胎儿。

在某些实施方案中，分离的胎盘细胞是CD34⁺胎盘细胞，如造血胎盘细胞。这种细胞可从胎盘组织获得，例如已经被排出脐血并灌流而清除残留血液的胎盘。在某些实施方案中，在CD34⁺胎盘细胞是CD38⁺。在某些实施方案中，在CD34⁺胎盘细胞是CD38^-。在某些其它实施方案中，CD34⁺胎盘细胞是CD45⁺。在一个具体实施方案中，胎盘细胞是CD34⁺、CD38^-和CD45⁺。

在分离的胎盘细胞的任何上述实施方案中，分离的胎盘细胞在生长培养基的培养过程中一般不分化，即培养基被配制成促进细胞增殖，例如在生长培养基中增殖的过程中。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞不需要滋养层来实现增殖。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞因在缺乏滋养层的情况下在培养过程中不分化。

在另一个更具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞通过灌流产后胎盘而获得，所述胎盘已排干血液并灌流清除残留血液；所述胎盘已排干血液但没有灌流清除残留血液；所述胎盘即没有排干血液也没有灌流清除残留血液。在一个更具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞通过物理方法和/或酶法裂解胎盘组织而获得。

在上述方法的某些实施方案中，分离的胎盘细胞经过滤和冷冻保存成为构建胎盘细胞库的一部分。例如分离的胎盘细胞从胎盘或胎盘组织分离，并经过培养后，悬浮在包含例如右旋糖酐，例如右旋糖酐40，例如5.5％右旋糖酐40的溶液中。在更具体的实施方案中，为冷冻保存作准备，该溶液还包含HSA和/或DMSO。将细胞库中冷冻保存的分离的胎盘细胞，根据需要，解冻和用例如所述包含10％右旋糖酐40的溶液稀释。在某些实施方案方法中，所述过滤和稀释不是最初用来分离获得分离的胎盘细胞的一部分。

在某些实施方案中，所述分离的胎盘细胞通过灌流产后胎盘而获得，所述胎盘已排干血液并灌流清除残留血液。在另一更具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞通过物理方法和/或酶法裂解胎盘组织而获得。

4.附图的简要说明

图1的三元图描绘出HSA、右旋糖酐40和DMSO的解空间，以及评估各种组分浓度对细胞存活力和增殖的影响的实验设计。

图2是包含不同百分比DMSO制剂的过滤器保留实验(FRA)数据。数据以Vi-Cell细胞活力分析仪上的每百万负载细胞的像素(像素/MM)读数表示。分析对照＝经细胞染色的无细胞的100％右旋糖酐40溶液。

图3是包含不同体积比例HSA的细胞制剂的FRA数据。数据表示为细胞活力分析仪上的每百万负载细胞的像素(像素/MM)读数。分析对照＝经细胞染色，无细胞的100％右旋糖酐40溶液。

图4是包含不同百分比DMSO(0-20％)的细胞制剂解冻后台盼蓝生存能力。

图5是解冻后总细胞功能恢复对各种浓度DMSO(0-20％)的函数。

图6：培养重建对含不同浓度DMSO的制剂的函数，根据MTS法评价(见下第6.3.1节)。

图7是包含不同体积分数25％HSA的细胞制剂解冻后的细胞活力。

图8是解冻后总细胞功能恢复对HSA体积分数的函数。

图9是培养重建对不同比例HSA的函数的评估数据，通过应用CellTiter96Aqueous非放射性细胞增殖实验(Promega，Madison，Wisconsin)产生。

图10：通过对含不同浓度制剂组分的制剂的磁珠反应实验来评估的免疫抑制水平。

图11：通过FRA法分析确定的细胞聚积对不同冷冻细胞密度(1-40×10⁶细胞/mL)的函数。数据表示为细胞活力分析仪上的每百万负载细胞像素(px/MM)读数。

图12：细胞聚积对冷冻细胞密度(1-40百万细胞/mL)的函数。数据表示为细胞活力分析仪上的每百万负载细胞的像素(px/MM)读数。

图13：通过FRA法分析确定的细胞聚积对不同分子量右旋糖酐的函数。测定了右旋糖酐1,000、40,000和70,000(即分别是右旋糖酐1，右旋糖酐40和右旋糖酐70)的FRA信号等同值。数据用每百万负载细胞的像素(px/MM)表示。分析对照＝细胞染色的无细胞的100％右旋糖酐40溶液。

图14是包含不同分子量右旋糖酐的制剂的解冻后存活力。

图15是包含不同分子量右旋糖酐的制剂的细胞功能恢复。

图16是包含不同分子量右旋糖酐的制剂的CD105⁺/CD200⁺。

图17是包含不同分子量右旋糖酐制剂的磁珠T细胞反应(BTR)数据。

图18是通过FRA测得的包含不同多糖制剂的细胞聚积。分析对照＝经细胞染色的无细胞100％右旋糖酐40溶液。

图19是非右旋糖酐40多糖配制的细胞解冻后存活力。数据用每百万负载细胞的像素(像素/MM)表示。

图20：活细胞功能恢复对包含不同多糖的制剂的函数。

图21是包含右旋糖酐40，或麦芽聚糖、蔗糖、海藻糖、肝素、羟乙基淀粉或用糖原代替右旋糖酐40的细胞制剂中CD105⁺/CD200⁺的表达。

图22是右旋糖酐40和六个非右旋糖酐40的不同糖/多糖的BTR数据。

图23是通过FRA检测的包含10％人血清白蛋白(HSA)、10％牛血清白蛋白(BSA)或10％胎牛血清(FBS)的制剂的细胞聚积。分析对照＝细胞染色的无细胞的100％右旋糖酐40溶液。

图24：包含10％HSA，10％BSA或10％FBS的制剂的细胞解冻后存活力。

图25是包含10％HAS、10％BSA或10％FBS的制剂解冻后的功能恢复。

图26是包含10％HAS、4％HAS、10％BSA或10％FBS的测量的CD105⁺/CD200⁺表达细胞特性。

图27是包含10％HAS、10％BSA或10％FBS的制剂的CD34^-/CD10⁺表达。

图28是BTR实验测量的包含10％HAS、4％HAS、10％BSA或10％FBS的制剂的细胞功能。

图29是骨髓间充质干细胞(BMMSC)和自然杀伤(NK)细胞的FRA细胞聚积结果。数据用每百万负载细胞的像素(像素/MM)表示。

5.发明详述

5.1定义

本发明所用的术语“大约”意思是，例如：在所述数字或值的10％以内。

本发明所用“大的细胞团块”是指不放大即可见的细胞聚积体，例如肉眼可见的，并且通常指大于大约150微米的细胞聚积体。

本发明所用的“微细胞团块”是指只有在放大时才可见的细胞聚积体，一般是指小于大约150微米的细胞聚积体。

本发明所用术语“SH2”是指结合于标记物CD105上的一个表位的抗体。因此，被称为SH2⁺的细胞是CD105⁺。

本发明所用的术语“SH3”和“SH4”是指结合存在于标记物CD73上的表位的抗体。因此，被称为SH3⁺和/或SH4⁺的细胞是CD73⁺。

本发明所用术语“分离的细胞”，例如“分离的干细胞”是指基本上与该细胞来源组织(如胎盘)的其它细胞分离的细胞。如果至少有50％、60％、70％、80％、90％、95％、或至少99％与所述细胞自然相关的细胞从该细胞中除去，例如在收集和/或培养细胞期间，该细胞是分离的。

本发明所用的“多能”，当用来指一种细胞，指该细胞具有分化成某些类型的体细胞，但不一定是全部类型的体细胞，或分化成具有某些体细胞(但不是所有体细胞)的某些特性的细胞。在某些实施方案中，例如具有分化成具有成骨或软骨细胞特征细胞的能力的分离的多能细胞，是一种多能细胞。

本发明所用的术语“分离的细胞群”是指基本上与该细胞群来源组织(如胎盘)的其它细胞分离的一群细胞。

本发明所用的术语“胎盘干细胞”，是指来源于哺乳动物的胎盘的一种干细胞或祖细胞，无关形态、细胞表面标志物、或原代培养后的细胞传代次数。胎盘干细胞不是从血液获得，也不能从血液获得，例如脐带血或胎盘血。然而，本发明所用的术语“胎盘干细胞”和“胎盘多能细胞”不是指胚胎滋养层细胞、血管母细胞、造血血管母细胞、胚胎生殖细胞、胚胎干细胞，或从囊胚内细胞团获得的细胞、从胚胎性腺嵴获得的细胞，例如胚胎生殖细胞。如果一种细胞显示干细胞的标志，例如与一种或多种类型干细胞有关的标记物或基因的表达谱；培养中至少10-40倍的复制能力；分化成一个或三个胚层的细胞的能力；缺乏成熟(即分化)细胞的特性，等等，该细胞被认为是干细胞。术语“胎盘干细胞”和“胎盘来源的干细胞”可以互换使用。除非另有说明，术语“胎盘”包含脐带。本发明公开的胎盘干细胞，在某些实施方案中，在体外分化(在分化条件下)，在体内分化，或两者兼而有之。

当特定的标记物在背景上可检测时，本发明所用的细胞，例如干细胞，对该标记物是“阳性的”。例如胎盘干细胞对于CD73是阳性的，因为CD73在胎盘干细胞上的数量超过背景的可检测量(与同型对照相比)，是可检测的。当一种标记物可用于将该细胞与至少一种其它细胞区别开时，或者当存在于该细胞或由该细胞表达时能用于选择或分离该细胞，该细胞对该标记物也是阳性的。就“阳性的”作为一个特定细胞的表面标记物存在的标志而言，例如抗体介导的检测，意味着该标记物用特别适合它的抗体，例如荧光标记的抗体，是可检测的；“阳性的”也指一种细胞显示出标记物以产生背景上可检测的信号的数量，例如在细胞计数仪上可检测的。例如一个细胞是“CD200⁺”，其中该细胞用特定的CD200抗体可检测标记，该抗体产生的信号可检测地比对照高(例如背景或同型对照)。相反，“阴性的”在同样的情况下意味着该细胞表面标记物与背景相比对于该标记物的特定抗体是不可检测的。例如一种细胞是“CD34^-”，其中该细胞对于CD34的特定抗体标记与对照相比是重复性不可检测的(例如背景或同型对照)。利用适当的对照，通过类似的方式，利用抗体检测不到标志物或不可检测到标志物，确定所述标志物为阳性的或阴性的。例如如果在检测一种细胞或细胞群的RNA中，OCT-4RNA的数量是可检测的比背景高，例如通过检测RNA的方法如RT-PCR、狭缝杂交等，该细胞或细胞群被认为是OCT-4⁺。除非本发明另有说明，分化抗原簇(“CD”)标记物可用抗体检测。如果OCT-4RNA用RT-PCR法是可检测的，OCT-4可以确定为存在并且该细胞是“OCT-4⁺”。

5.2改良的含细胞组合物及制备该组合物的方法

本发明提供制备含细胞组合物的改进方法，例如干细胞，如胎盘干细胞，及其该方法制备的改良组合物，例如药物组合物。当例如细胞团块，尤其是肉眼可见的细胞团块(即大团块)在给个体施用该药物组合物前被除去了时，包含细胞的组合物，如适合以液态形式给药的组合物，通常对受试者耐受性更好。本发明所述制备包含细胞(例如干细胞，如来自排干血液的人产后胎盘的干细胞，胎盘细胞)的组合物的方法，制备出的组合物在施用于个体时更耐受。

在一个实施方案中，本发明提供一种制备组合物的方法，包括过滤一种包含细胞的溶液，以产生过滤的含细胞溶液；用第一稀释溶液稀释该过滤的含细胞溶液至不超过大约10±3×10⁶细胞每毫升，例如在冷冻保存前；和可选地用包含右旋糖酐的第二稀释溶液稀释得到的过滤的含细胞溶液，得到所述组合物。在另一实施方案中，本发明提供一种制备组合物的方法，包括过滤一种包含细胞的溶液，以产生过滤的含细胞溶液；用第一稀释溶液稀释该过滤的含细胞溶液至不超过大约1至50×10⁶、1到40×10⁶、1至30×10⁶、1至20×10⁶、1至15×10⁶、或1至10×10⁶细胞每毫升，例如在冷冻保存前；和可选地用包含右旋糖酐的第二稀释溶液稀释得到的过滤的含细胞溶液，得到所述组合物。在某些实施方案中，如果细胞数少于10±3×10⁶细胞每毫升，过滤是可选的。

在一个具体实施方案中，所述细胞是干细胞。在更具体的实施方案中，所述干细胞是骨髓间充质干细胞或成体干细胞。在一具体实施方案中，所述细胞是分离的胎盘细胞。在一个更具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是胎盘干细胞或胎盘多能细胞。在另一具体实施方案中，所述细胞是来自胎盘灌流液的细胞，例如来自胎盘灌流液的有核细胞。获得胎盘灌流液细胞的方法记载于下面的第5.3.4节中。

在一个具体实施方案中，所述细胞在所述用第一稀释溶液稀释与所述第二稀释溶液稀释之间冷冻保存。在另一具体实施方案中，第一稀释溶液包含右旋糖酐和HSA。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述右旋糖酐是大约2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％、或10％的右旋糖酐。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液或所述第二稀释溶液中所述右旋糖酐是右旋糖酐1。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液和所述第二稀释溶液中所述右旋糖酐是右旋糖酐1。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液或所述第二稀释溶液中所述右旋糖酐是右旋糖酐70。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液和所述第二稀释溶液中所述右旋糖酐是右旋糖酐70。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液或所述第二稀释溶液中所述右旋糖酐是右旋糖酐40。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液和所述第二稀释溶液中所述右旋糖酐是右旋糖酐40。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述右旋糖酐40是大约2.5％的右旋糖酐40至大约10％的右旋糖酐40。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述右旋糖酐40是大约2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、5.75％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％8.0％、8.5％、9.0％、9.5％或10％的右旋糖酐40。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述右旋糖酐40是大约5.5％的右旋糖酐40。

在其它实施方案中，所述第一和/或第二稀释溶液除右旋糖酐以外可包含多糖，或者用多糖代替右旋糖酐。在某些实施方案中，所述多糖是葡萄糖的聚合物(2个或更多亚基)，并且不包含非葡萄糖亚基。在其它实施方案中，所述第一和/或第二稀释溶液包含麦芽糊精(例如大约2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％、或10％的麦芽糊精)，海藻糖(例如大约2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％、或10％的海藻糖)，或羟乙基淀粉(例如大约2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％、或10％的羟乙基淀粉)中的一种或多种。在其它实施方案中，第一和/或第二稀释溶液包含蔗糖(例如大约2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％、或10％的蔗糖)，肝素(例如大约55USP单位/ml肝素)，或糖原(例如大约2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％、或10％的糖原)中的一种或多种。在一具体实施方案中，所述第一和/或第二稀释溶液除右旋糖酐外还包含麦芽聚糖，或者用麦芽聚糖代替右旋糖酐。在另一具体实施方案中，所述第一和/或第二稀释溶液除右旋糖酐外还包含海藻糖，或者用海藻糖代替右旋糖酐。在另一具体实施方案中，所述第一和/或第二稀释溶液除右旋糖酐外还包含羟乙基淀粉，或者用羟乙基淀粉代替右旋糖酐。

在另一具体实施方案中，所述包含HSA的溶液中的所述HSA是大约1至17％的HSA。在另一具体实施方案中，所述包含HSA的溶液中的所述HSA是大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、或大约17％的HSA。在另一具体实施方案中，所述包含HSA的溶液中所述HSA是大约4至10％的HSA。在另一具体实施方案中，所述包含HSA的溶液中所述HSA是大约3.125％的HSA。在另一具体实施方案中，所述包含HSA的溶液中所述HSA是大约5％的HSA。在另一具体实施方案中，所述包含HSA的溶液中所述HSA是大约10％的HSA。在另一具体实施方案中，所述包含HSA的溶液中所述HSA是大约16.875％的HSA。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液包含HSA。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述HSA是大约1至17％HSA。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述HSA是大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％或17％的HSA。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述HSA是大约4至10％的HSA。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述HSA是大约3.125％的HSA。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述HSA是大约5％的HSA。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述HSA是大约10％的HSA。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述HSA是大约16.875％的HSA。

在其它实施方案中，牛血清白蛋白(BSA)(例如大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的BSA)或胎牛血清(FBS)(例如大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、1％、12％、13％、14％或15％的FBS)可用于补充或取代，即代替所述溶液中的HSA。

在一些实施方案中，第一稀释溶液中HSA对右旋糖酐的比例，如右旋糖酐1、右旋糖酐40或右旋糖酐70，是大约6∶1的HSA∶右旋糖酐到大约1∶2.6的HSA∶右旋糖酐。在一些实施方案中，HSA对右旋糖酐的比例是大约6∶1、5.5∶1、5∶1、4.5∶1、4∶1、3.5∶1、3∶1、2.5∶1、2.0∶1、1.5∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2或1∶2.6的HSA∶右旋糖酐。在一些实施方案中，第一稀释溶液中HSA对右旋糖酐的比例，如右旋糖酐1、右旋糖酐40或右旋糖酐70，是大约3.13％HSA/8.25％右旋糖酐。在一些实施方案中，第一稀释溶液中HSA对右旋糖酐的比例，如右旋糖酐1、右旋糖酐40或右旋糖酐70，是大约16.88％HSA/2.75％右旋糖酐。在具体的实施方案中，第一稀释溶液中HSA对右旋糖酐的比例，如右旋糖酐1、右旋糖酐40或右旋糖酐70，是大约10％HSA/5.5％右旋糖酐。

在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液还包含冷冻保护剂。在更具体的实施方案中，所述冷冻保护剂是二甲基亚砜(DMSO)。在一个具体实施方案中，所述第一稀释溶液还包含大约1％至大约15％、大约2.5％至大约15％、大约2.5％至10％左右、大约5％至15％左右、大约5％到大约10％、或大约10％至15％的DMSO。在一个具体实施方案中，所述第一稀释溶液还包含大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的DMSO。在一个具体实施方案中，所述第一稀释溶液还包含大约5％的DMSO。

在一个具体实施方案中，所述第一稀释溶液包含大约5.5％右旋糖酐40，大约10％HSA，和大约5％DMSO。

在另一具体实施方案中，所述第二稀释溶液中所述右旋糖酐40是大约10％的右旋糖酐40。在另一具体实施方案中，所述含细胞组合物包含大约2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、5.75％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％或10％的右旋糖酐。在另一具体实施方案中，所述含细胞组合物包含大约7.5％至大约9％的右旋糖酐。在另一具体实施方案中，所述组合物包含大约1.5×10⁶细胞每毫升到大约5.0×10⁶细胞每毫升。在另一具体实施方案中，所述组合物包含大约1.0±0.3×10⁶细胞每毫升到大约5.0±1.5×10⁶细胞每毫升。在一个具体实施方案中，所述第二稀释溶液不包含HSA。

可用于本发明提供的方法的右旋糖酐可以是具有大约1kDa和150kDa之间的分子量的右旋糖酐，例如1kDa(右旋糖酐1)、大约40kDa(右旋糖酐40)、大约70kDa(右旋糖酐70)。

在另一具体实施方案中，所述含细胞溶液包含冷冻保护剂。如果所述含细胞溶液包含少于10±3×10⁶细胞每毫升，第一稀释步骤可以省略，并在某些实施中，所述的细胞悬浮于其中的溶液可以包含冷冻保护剂，如DMSO，例如大约2％至大约15％的DMSO，例如大约5％的DMS0。

在另一实施方案中，本发明提供的制备组合物的方法包括：(a)过滤包含细胞、右旋糖酐和人血清白蛋白(HSA)的溶液，所述细胞为例如分离的胎盘细胞，例如胎盘干细胞或胎盘多能细胞，或者从胎盘灌流液分离的细胞，例如从胎盘灌流液分离的总有核细胞，以产生过滤的含细胞溶液；(b)可选择地用包含右旋糖酐的第一稀释溶液稀释所述过滤的含细胞溶液到大约1至50×10⁶、1至40×10⁶、1至30×10⁶、1至20×10⁶、1至15×10⁶、或1至10×10⁶细胞每毫升；和(c)可选择地用包含右旋糖酐但不含HSA的第二稀释溶液稀释该过滤的含细胞溶液，从而制得组合物。在一些实施方案中，在执行步骤(b)时，步骤(a)中过滤的含细胞溶液包含超过大约15×10⁶细胞每毫升，其中步骤(b)中所述稀释为稀释到大约15×10⁶细胞每毫升。在一些实施方案中，在执行步骤(b)时，步骤(a)中过滤的含细胞溶液包含大于大约10±3×10⁶细胞每毫升，其中步骤(b)中所述稀释为稀释到大约10±3×10⁶细胞每毫升。在一些实施中所述过滤的含细胞溶液包含少于10±3×10⁶细胞每毫升，省略步骤(b)中的稀释，并且步骤(a)中的溶液包含冷冻保护剂，如DMSO，例如大约2％至大约15％的DMSO。在一些实施方案中，在执行步骤(b)时，步骤(a)中过滤的含细胞溶液包含大于大约7.5×10⁶细胞每毫升，其中步骤(b)中所述稀释为稀释到大约7.5×10⁶细胞每毫升。在所述方法的具体实施方案中，所述细胞在步骤(c)前冷冻保存。在某些实施方案中，如果细胞数少于10±3×10⁶细胞每毫升，过滤是可选的。在所述方法的具体实施方案中，所述细胞在步骤(c)前冷冻保存。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液或第二稀释溶液中所述右旋糖酐是右旋糖酐40。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液和第二稀释溶液中所述右旋糖酐是右旋糖酐40。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述右旋糖酐40是5.0％的右旋糖酐40。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述右旋糖酐40是5.5％的右旋糖酐40。在另一具体实施方案中，所述含细胞溶液中所述HSA是大约1％的HSA至15％的HSA。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液包含HSA。在一个更具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述HSA是大约5％的HSA。在一个更具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述HSA是大约10％的HSA。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液还包含冷冻保护剂。在一个更具体实施方案中，所述冷冻保护剂是DMSO，例如大约2％至大约15％的DMSO。在另一具体实施方案中，所述第二稀释溶液中所述右旋糖酐40是10％的右旋糖酐40。在另一具体实施方案中，步骤(a)中所述溶液包含冷冻保护剂。

在所述方法的一个方面，优选在冷冻保存前利用过滤减少或消除最终含细胞组合物中的细胞团块数。在某些实施方案中，所述含细胞溶液中的细胞被冷冻保存，所述含细胞溶液在冷冻保存前经过滤。例如溶液中的细胞，例如胎盘干细胞，在冷冻保存前可通过过滤器以除去可见细胞团块(细胞聚积体，即大的细胞团块)。在一个实施方案中，过滤包括在冷冻保存所述细胞前将含细胞溶液通过过滤器进行过滤，其中所述过滤器包含直径在大约50μM和大约150μM之间的孔(即过滤器是大约50μM的过滤器到大约150μM的过滤器)，其中过滤器适合于过滤溶液。例如过滤器包含的孔可以是大约50至大约80μM之间、大约60μM和大约90μM之间、大约70μM和大约100μM之间、大约80μM和大约110μM之间、大约90μM和大约120μM之间、大约100μM和大约130μM之间、大约之间110μM和140μM之间、或大约120μM和大约150μM之间的孔，过滤器也可以是50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150μM的过滤器。在一个具体实施方案中，所述过滤器是70μM的过滤器。在另一具体实施方案中，所述过滤器是100μM的过滤器。在另一具体实施方案中，所述过滤器是大约70μM的过滤器到大约100μM的过滤器。在另一具体实施方案中，所述含细胞溶液在冷冻之前过滤，解冻后再过滤。

在某些其它实施方案中，如果细胞数少于10±3×10⁶细胞每毫升，过滤是可选的。

在各实施方案中，制备包含细胞(例如分离的胎盘细胞)的组合物的方法包括以不超过50×10⁶、40×10⁶、30×10⁶、20×10⁶、15×10⁶、10×10⁶、9.5×10⁶、9×10⁶、8.5×10⁶、8×10⁶、7.5×10⁶、7×10⁶、6.5×10⁶、6×10⁶、5.5×10⁶、5×10⁶、4.5×10⁶、4×10⁶、3.5×10⁶、3×10⁶、或2.5×10⁶细胞每毫升冷冻保存所述细胞。在一个具体实施方案中，所述细胞以不超过大约10±3×10⁶细胞每毫升冷冻保存。在另一具体实施方案中，所述细胞以不超过大约15×10⁶细胞每毫升冷冻保存。在另一具体实施方案中，所述细胞以不超过大约5×10⁶细胞每毫升冷冻保存。在另一具体实施方案中，所述细胞以不超过大约5×10⁶到大约7.5×10⁶细胞每毫升冷冻保存。在另一具体实施方案中，所述细胞以大约5×10⁶细胞每毫升冷冻保存。在另一具体实施方案中，所述细胞以大约7.5×10⁶细胞每毫升冷冻保存。在一个具体实施方案中，所述细胞以大约10±3×10⁶细胞每毫升冷冻保存。在另一具体实施方案中，所述细胞以这样的数量冷冻保存，当所述细胞解冻并用右旋糖酐40，如10％的右旋糖酐40以1∶1到1∶11(v/v)，例如1∶1到1∶5(第v/v)稀释时，导致每10⁶细胞形成2个或更少的可见细胞团块(即大的细胞团块)。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞以这样的数量冷冻保存，当所述细胞解冻并用右旋糖酐40，如10％的右旋糖酐40以1∶1到1∶11(v/v)，例如1∶1到1∶5(第v/v)稀释时，导致没有可见的细胞团块形成。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞以这样的数量冷冻保存，当所述细胞解冻并用右旋糖酐40，如10％的右旋糖酐40以1∶1到1∶11(v/v)，例如1∶1到1∶5(第v/v)稀释时，导致每10⁶细胞形成少于150、140、130、120、110或100微细胞团块。

在另一实施方案中，本发明提供制备组合物的方法，例如包括在冷冻保存后，用包含右旋糖酐40的溶液接触细胞，例如分离的胎盘细胞，例如用包含右旋糖酐40的溶液重悬细胞或稀释细胞。在一个具体实施方案中，所述溶液包含大约2.5％到大约10％的右旋糖酐40(w/v)。在具体实施方案中，所述溶液包含大约5％的右旋糖酐40至大约10％的右旋糖酐40(w/v)。在另一具体实施方案中，所述溶液是5.0％的右旋糖酐溶液或10％的右旋糖酐溶液。在另一具体实施方案中，所述溶液是5.5％的右旋糖酐溶液或10％的右旋糖酐溶液。在其它实施方案中，右旋糖酐具有大约1千道尔顿和大约150千道尔顿之间的分子量，如平均分子量。在其它实施方案中，右旋糖酐具有大约1kDa至大约150kDa之间、大约有1kDa至大约125kDa之间、大约有1kDa至大约100kDa之间、大约有1kDa至75kDa之间、大约1kDa至50kDa之间、或大约1kDa至25kDa之间的分子量，如平均分子量。在其它实施方案中，右旋糖酐具有大约1kDa至10kDa之间、大约30kDa至50kDa之间、或大约60kDa至80kDa之间的分子量，如平均分子量。在其它实施方案中，所述溶液包含大约2％和大约25％之间的右旋糖酐。在一个具体实施方案中，所述溶液不含HSA。在另一具体实施方案中，所述溶液与所述细胞(例如所述胎盘干细胞)的密度相匹配，例如所述溶液的分离的胎盘细胞为5％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的密度内。在另一具体实施方案中，所述溶液与所述细胞密度不匹配。

在另一实施方案中，制备含细胞例如分离的胎盘细胞的组合物的方法，包括：(a)在冷冻保存前过滤包含所述细胞的含细胞溶液；(b)以大约1至50×10⁶、1到40×10⁶、1至30×10⁶、1至20×10⁶、1至15×10⁶、或1至10×10⁶细胞每毫升冷冻保存所述细胞；(c)解冻所述细胞；和(d)用右旋糖酐40溶液以大约1∶1(v/v)到大约1∶11(v/v)稀释所述含细胞溶液。在某些实施方案中，在步骤(b)中大约15×10⁶细胞被冷冻保存。在某些实施方案中，在步骤(b)中细胞以不超过15×10⁶细胞每毫升被冷冻保存。在某些实施方案中，在步骤(b)中细胞以不超过10±3×10⁶细胞每毫升被冷冻保存。在某些其它实施方案中，如果细胞数少于10±3×10⁶细胞每毫升，过滤是可选的。在一更具体实施方案中，步骤(b)中所述细胞在包含大约5％至大约10％右旋糖酐40和HSA的溶液中冷冻保存。

在另一实施方案中，所述制备组合物的方法包括以下步骤：

(a)通过70μM的过滤器过滤包含细胞、5.5％右旋糖酐40溶液、和10％HSA的溶液，产生过滤的含细胞溶液；

(b)用包含5.5％右旋糖酐40、10％的HAS、5％DMSO的溶液稀释所述过滤的含细胞溶液到大约1至50×10⁶、1至40×10⁶、1至30×10⁶、1至20×10⁶、1至15×10⁶、或1至10×10⁶细胞每毫升；

(d)冷冻保存所述过滤的含细胞溶液中的细胞；

(e)解冻所述细胞；和

(f)可选地，用10％的右旋糖酐40稀释所述过滤的含细胞溶液。

在某些实施方案中，步骤(b)中所述稀释为稀释到不超过大约15×10⁶细胞每毫升。在某些实施方案中，步骤(b)中所述稀释为稀释到不超过大约10±3×10⁶细胞/mL。在过滤的含细胞溶液包含少于10±3×10⁶细胞/mL的实施方案中，步骤(a)中所述溶液包含冷冻保护剂，如DMSO，例如大约1％至大约5％的DMSO，并且省略步骤(b)。在某些其它实施方案中，如果细胞数少于10±3×10⁶细胞每毫升，过滤是可选的。在某些实施方案中，步骤(f)包括用10％的右旋糖酐40以1∶1到1∶11(v/v)稀释所述过滤的含细胞溶液。在一些实施方案中，步骤(f)包括用10％的右旋糖酐40以1∶1到1∶5(v/v)稀释所述过滤的含细胞溶液。

在另一实施方案中，本发明提供的所述制备组合物的方法包括以下步骤：

(a)离心多个细胞以收集该细胞；

(b)在5.5％的右旋糖酐40中重悬所述细胞；

(c)离心所述细胞以收集所述细胞；

(d)在包含10％HSA的5.5％的右旋糖酐40溶液中重悬所述细胞，以产生含细胞溶液；

(e)通过70μM过滤器过滤所述含细胞溶液，以产生过滤的含细胞溶液；

(f)以5.5％的右旋糖酐40、10％的HAS、和5％的DMSO中稀释所述过滤的含细胞溶液达到大约1至50×10⁶、1至40×10⁶、1至30×10⁶、1至20×106、1至15×10⁶、或1至10×10⁶细胞每毫升；

(g)冷冻保存所述过滤的含细胞溶液中的细胞；

(h)解冻所述细胞；及

(i)可选地，用10％的右旋糖酐40稀释所述过滤的含细胞溶液。

在某些实施方案中，步骤(f)中所述稀释是达到不超过15×10⁶细胞每毫升。在某些实施方案中，步骤(f)中所述稀释是达到不超过10±3×10⁶细胞/mL。在某些其它实施方案中，如果细胞数少于10±3×10⁶细胞每毫升，过滤是可选的。在步骤(d)中重悬产生的含细胞溶液包含少于大约10±3×10⁶细胞/mL的实施方案中，步骤(d)中的溶液包含冷冻保护剂，例如DMSO，如大约1％至5％的DMSO，省略步骤(f)。在某些实施方案中，步骤(i)包括用10％的右旋糖酐40稀释所述过滤的含细胞溶液到1∶1到1∶5(v/v)。在某些实施方案中，步骤(i)包括用10％的右旋糖酐40稀释所述过滤的含细胞溶液到1∶1到1∶11(v/v)。

在任何上述方法的具体实施方案中，DMSO基本上从所述含细胞组合物中除去，因此所述组合物中的DMSO终浓度小于2.5％、2.0％、1.5％、1.0％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、或大约0.1％。除去DMSO可以通过，例如离心所述细胞和重悬所述细胞于10％的右旋糖酐40中来完成。这种离心和重悬步骤可重复一次或多次。

在任何上述方法的另一具体实施方案中，所述方法还包括浓缩得到的细胞组合物到大约5×10⁶细胞每毫升至1×10⁸细胞每毫升。这样的组合可以用于例如向需要的个体皮下注射所述组合物。

在任何上述方法的另一具体实施方案中，所述细胞是除胎盘干细胞以外的细胞。在更具体的实施方案中，例如所述细胞可以是干细胞或非干细胞。在所述细胞是干细胞的具体实施方案中，干细胞可以是，例如成人干细胞、成体干细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、脐血干细胞、羊水干细胞、骨髓间充质干细胞、脐血间充质干细胞、外周血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或骨膜干细胞。在另一具体实施方案中，所述细胞是自然杀伤细胞，例如CD3^-、CD56⁺自然杀伤细胞。

另一方面，本发明提供了组合物，例如药物组合物。在某些实施方案中，所述组合物由上述方法制备。在某些实施方案中，所述组合物没有明显的细胞团块，即大的细胞团块。在某些其它实施方案中，所述组合物与没有过滤的组合物相比，包含的微型细胞团块数(仅在显微镜下可见，例如光学显微镜)大幅减少，例如减少大约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的微细胞团块。

在一个实施方案中，本发明提供的组合物，如药物组合物，包括10％右旋糖酐40的溶液中的多个细胞，例如多个分离的胎盘细胞，或从胎盘灌流液分离出的细胞，例如从胎盘灌流液分离的总有核细胞，其中所述组合物包含大约1.0±0.3×10⁶细胞每毫升到大约为5.0±1.5×10⁶细胞每毫升之间，并且其中所述组合物不含可见的细胞团块(即不含大的细胞团块)。在某些实施方案中，所述组合物包含大约1.5×10⁶细胞每毫升到大约3.75×10⁶细胞每毫升之间。在某些其它实施方案中，所述组合物包含大约1.0×10⁶细胞每毫升到大约15×10⁶细胞每毫升之间，如：大约7.5×10⁶细胞每毫升到大约15×10⁶细胞每毫升之间。在某些其它实施方案中，所述组合物包含少于大约20×10⁶细胞每毫升。在一个具体实施方案中，所述细胞经冷冻保存和解冻。在另一具体实施方案中，所述细胞经70μM到100μM过滤器过滤。在另一具体实施方案中，所述组合物不含大的细胞团块。在另一具体实施方案中，所述组合物包含少于大约200个微细胞团块每10⁶个细胞。在另一具体实施方案中，所述组合物包含少于大约150个微细胞团块每10⁶个细胞。在另一具体实施方案中，所述组合物包含少于大约100个微细胞团块每10⁶个细胞。在另一具体实施方案中，所述组合物包含少于1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、或0.1％的DMSO。

在其它实施方案中，所述组合物除了右旋糖酐外还包含多糖，或者用多糖代替右旋糖酐。在某些实施方案中，所述多糖是不包含非葡萄糖亚基的葡萄糖聚合物。在其它实施方案中，所述组合物包含麦芽糊精(例如大约2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％、或10％的麦芽糊精)，海藻糖(例如大约2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％、或10％的海藻糖)，或羟乙基淀粉(例如大约2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％、或10％的羟乙基淀粉)。在其它实施方案中，所述组合物包含蔗糖(例如大约2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％、或10％的蔗糖)，肝素(例如55USP单位/ml的肝素)，或糖原(例如大约2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％、或10％的糖原)。在一个具体实施方案中，所述组合物除了右旋糖酐外还包含麦芽聚糖或者代替它。在另一具体实施方案中，所述组合物除了右旋糖酐外还包含海藻糖或者代替它。在另一具体实施方案中，所述组合物除了右旋糖酐外还包含羟乙基淀粉或者代替它。

在另一具体实施方案中，所述组合物包含大约1％至大约17％的HSA。在某些实施方案中，所述组合物包含大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、或大约17％的HSA。在某些实施方案中，所述组合物包含大约3.125％的HSA。在某些实施方案中，所述组合物包含大约5％的HSA。在某些实施方案中，所述组合物包含大约10％的HSA。在某些实施方案中，所述组合物包含大约16.875％的HSA。

在其它实施方案中，所述组合物除了HSA外还包含牛血清白蛋白(BSA)(例如大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的BSA)或胎牛血清(FBS)(例如大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的胎牛血清)，或者用牛血清白蛋白或胎牛血清代替HSA。

在一些实施方案中，所述组合物包含冷冻保护剂，例如DMSO，如大约1％至15％的DMSO。在一些实施方案中，所述组合物包含大约1％至5％的DMSO。在一些实施方案中，所述组合物包含大约1％至大约15％、大约2.5％至大约15％、大约2.5％至10％左右、大约5％至大约15％、大约5％至大约10％或大约10％至大约15％的DMSO。在一些实施方案中，所述组合物包含大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的DMSO。在一个具体实施方案中，该组合物包含大约5％的DMSO。

本发明进一步提供包含细胞的组合物，其中所述组合物由本发明公开的一种方法制备。例如在一个实施方案中，本发明提供一种包含细胞的组合物，其中所述组合物的制备方法包括过滤含有所述细胞的溶液，以形成过滤的含细胞溶液；用第一稀释溶液稀释所述过滤的含细胞溶液到大约1至50×10⁶、1至40×10⁶、1至30×10⁶、1至20×10⁶、1至15×10⁶、或1至10×10⁶细胞每毫升，例如在冷冻保存前；以及用包含右旋糖酐但不含HSA的第二稀释溶液稀释得到的过滤的含细胞溶液，产生所述组合物。在某些实施方案中，所述稀释为稀释到不超过15×10⁶细胞每毫升。在某些实施，所述稀释为稀释到不超过10±3×10⁶细胞每毫升。在某些实施，所述稀释不超过大约7.5×10⁶细胞每毫升。在其它某些实施方案中，如果细胞数少于10±3×10⁶细胞每毫升，过滤是可选的。在一个具体实施方案中，所述细胞在用第一稀释溶液稀释和用第二稀释溶液稀释之间冷冻保存。在另一具体实施方案中，第一稀释溶液包含右旋糖酐和HSA。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液或第二稀释溶液中所述右旋糖酐是右旋糖酐40。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液和第二稀释溶液中所述右旋糖酐是右旋糖酐40。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述右旋糖酐40为5.0％的右旋糖酐40。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述右旋糖酐40为5.5％的右旋糖酐40。在另一具体实施方案中，所述含HSA溶液中所述HSA是10％HSA。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液包含HSA。在一个更具体实施方案中，所述第一稀释溶液中所述HSA是10％HSA。在另一具体实施方案中，所述第一稀释溶液包含冷冻保护剂。在一个更具体实施方案中，所述冷冻保护剂是DMSO。在另一具体实施方案中，所述第二稀释溶液中所述右旋糖酐40是大约10％的右旋糖酐40。在另一具体实施方案中，所述含细胞组合物包含大约7.5％至大约9％的右旋糖酐。在另一具体实施方案中，所述含细胞组合物包含大约1.0±0.3×10⁶细胞每毫升至大约5.0±1.5×10⁶细胞每毫升。在另一具体实施方案中，所述含细胞组合物包含大约1.5×10⁶细胞每毫升至大约3.75×10⁶细胞每毫升。

在另一实施方案中，所述含细胞组合物由包括以下步骤的方法制备：(a)在冷冻保存之前过滤包含所述细胞的含细胞溶液，以产生过滤的含细胞溶液；(b)以大约1至50×10⁶、1到40×10⁶、1至30×10⁶、1至20×10⁶、1至15×10⁶、或1至10×10⁶细胞每毫升冷冻保存所述过滤的含细胞溶液中的细胞；(c)解冻细胞；和(d)用右旋糖酐40溶液以大约1∶1至大约1∶11(v/v)稀释所述过滤的含细胞溶液。在某些实施方案中，如果细胞数少于10±3×10⁶细胞每毫升，过滤是可选的。在一个更具体实施方案中，步骤(b)中的细胞以大约10±3×10⁶细胞每毫升冷冻保存。在一个更具体实施方案中，步骤(b)中的细胞在包含大约5％至大约10％右旋糖酐40和HSA的溶液中冷冻保存。在某些实施方案中，步骤(d)中所述稀释为稀释到不超过15×10⁶细胞每毫升。

在另一实施方案中，所述含细胞组合物由包括以下步骤的方法制备：(a)将细胞悬浮于包含10％HSA的5.5％右旋糖酐40溶液中，形成含细胞溶液；(b)通过70μM过滤器过滤所述含细胞溶液；(c)用包含5.5％右旋糖酐40、10％HSA和5％DMSO的溶液稀释所述含细胞溶液到大约1至50×10⁶、1到40×10⁶、1至30×10⁶、1至20×10⁶、1至15×10⁶、或1至10×10⁶细胞每毫升；(d)冷冻保存所述细胞；(e)解冻所述细胞；及(f)用10％右旋糖酐40以1∶1到1∶11(v/v)稀释所述含细胞溶液。在某些实施方案中，步骤(b)中所述稀释为稀释到不超过15×10⁶细胞每毫升。在某些实施方案中，步骤(b)中所述稀释为稀释到不超过大约10±3×10⁶细胞/mL。在另一实施方案中，所述包含细胞的组合物由包括以下步骤的方法制备：(a)离心多个细胞以收集细胞；(b)重悬所述细胞于5.5％右旋糖酐40中；(c)离心所述细胞以收集细胞；(d)重悬所述细胞于包含10％HSA的5.5％右旋糖酐40溶液中；(e)通过70μM过滤器过滤所述细胞；(f)用5.5％右旋糖酐40、10％HSA和5％DMSO稀释所述细胞到大约1至50×10⁶、1到40×10⁶、1至30×10⁶、1至20×10⁶、1至15×10⁶、或1至10×10⁶细胞每毫升；(g)冷冻保存所述细胞；(h)解冻所述细胞；及(i)用10％右旋糖酐40以1∶1到1∶11(v/v)稀释所述细胞。在某些实施方案中，步骤(f)中所述稀释为稀释到不超过15×10⁶细胞每毫升。在某些实施方案中，步骤(f)中所述稀释为稀释到大约10±3×10⁶细胞/mL。在其它某些实施方案中，如果细胞数少于10±3×10⁶细胞每毫升，过滤是可选的。

本发明所述含细胞的组合物，例如药物组合物，可包含任何哺乳动物细胞，包括哺乳动物干细胞和哺乳动物非干细胞。在一些实施方案中，本发明所述含细胞组合物，例如药物组合物，可包含分离的胎盘细胞，例如本发明所述任何分离的胎盘细胞(参加，例如下文的第5.3节)。在一个具体实施方案中，用流式细胞仪检测，所述分离的胎盘细胞是CD34^-、CD10⁺和CD105⁺。在一个更具体实施方案中，所述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞是胎盘干细胞。在另一更具体实施方案中，所述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞是多能胎盘细胞。在另一具体实施方案中，所述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞具有分化成神经表型细胞、成骨表型细胞、或软骨表型细胞的潜能。在更具体的实施方案中，所述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞还是CD200⁺。在另一更具体实施方案中，用流式细胞仪检测，所述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞还是CD90⁺或CD45^-。在另一更具体实施方案中，用流式细胞仪检测，所述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞还是CD90⁺或CD45^-。在一个更具体实施方案中，用流式细胞仪检测，所述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘细胞还是CD90⁺或CD45^-。在另一项更具体实施方案中，用流式细胞仪检测，所述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘细胞还是CD90⁺和CD45^-。在另一个更具体实施方案中，用流式细胞仪检测，所述CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD90⁺、CD45^-细胞还是CD80^-和CD86^-。

在一个更具体实施方案中，所述CD34^-、CD10⁺、CD105⁺细胞还是CD29⁺、CD38^-、CD44⁺、CD54⁺、CD80^-、CD86^-、SH3⁺或SH4⁺中的一种或多种。在另一个更具体实施方案中，细胞还是CD44⁺。在上述任何分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞的具体实施方案中，所述细胞还是CD117^-、CD133^-、KDR^-(VEGFR2^-)、HLA-A，B，C⁺、HLA-DP，DQ，DR^-和/或程序性死亡配体(PDL1)⁺中的一种或多种。

在某些其它实施方案的组合物中，所述分离的胎盘细胞是CD200⁺和HLA-G⁺；CD73⁺、CD105⁺、和CD200⁺；CD200⁺和OCT-4⁺；CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺；CD73⁺和CD105⁺，并且当所述细胞群在允许形成胚样体的条件下培养时，促进在包含所述胎盘细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；或者是OCT-4⁺，并且当所述细胞群在允许形成胚样体的条件下培养时，促进在包含所述胎盘细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；或者上述的任意组合。在一个具体实施方案中，所述CD200⁺、HLA-G⁺细胞是CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺和CD105⁺。在另一具体实施方案中，所述CD73⁺、CD105⁺、和CD200⁺细胞是CD34^-、CD38^-、CD45^-、和HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，所述CD200⁺、OCT-4⁺细胞是CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，所述CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺细胞是CD34^-、CD45^-、OCT-4⁺和CD200⁺。在另一具体实施方案中，所述CD73⁺和CD105⁺细胞是OCT-4⁺、CD34^-、CD38^-和CD45^-。在另一具体实施方案中，所述OCT-4⁺细胞是CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-、和CD45^-。可以包含在本发明所述含细胞组合物中的分离的胎盘细胞在下文的第5.3节更详细地描述。

在本发明提供的组合物的其它具体实施方案中，所述细胞是除胎盘干细胞以外的细胞。在更具体的实施方案中，例如所述细胞可以是干细胞或非干细胞。在所述细胞是干细胞的具体实施方案中，干细胞可以是，例如成人干细胞、成体干细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、脐血干细胞、羊水干细胞、骨髓间充质干细胞、脐血间充质干细胞、外周血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或骨膜干细胞。在另一具体实施方案中，所述细胞是自然杀伤细胞，例如CD3^-、CD56⁺自然杀伤细胞。

5.3分离的胎盘细胞和分离的胎盘细胞群

可以在本发明提供的组合物，如药物组合物中使用的分离的胎盘多能细胞，可从胎盘或其一部分中获得，其粘附于组织培养底物并具有多能细胞或干细胞的特征。在某些实施方案中，本发明公开的方法中可用的分离的胎盘细胞具有分化成非胎盘的细胞类型的能力。本发明公开的方法中可用的分离的胎盘细胞可以是胎儿或母体来源(即可以分别具有胎儿或母体的基因型)。优选地，分离的胎盘细胞和分离的胎盘细胞群是胎儿来源。本发明中所使用的短语“胎儿来源”或“非母体来源”表示分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群是从脐带或与胎儿有关的胎盘结构获得，即具有胎儿的基因型。本发明中所使用的短语“母体来源”表示细胞或细胞群是从与母体有关的胎盘结构获得，其具有母体的基因型。分离的胎盘细胞，或包含分离的胎盘细胞的细胞群，可以只包含胎儿来源的分离的胎盘细胞或者母体来源的分离的胎盘细胞，或者可以同时包含来源于胎儿和母体的混合的分离的胎盘细胞群。分离的胎盘细胞，或包含分离的胎盘细胞的细胞群可以通过下文讨论的形态学、标记物和培养特征来识别和筛选。适合用于本发明所述方法和组合物的分离的胎盘细胞可以包括，例如在美国专利申请公开号2007/0275362和美国专利号7,468,276中所述，其公开作为参考整体并入本文。

5.3.1物理和形态特征

当在原代培养或细胞培养中培养时，本发明所述分离的胎盘细胞粘附于组织培养底物上，例如组织培养容器表面(例如组织培养塑料器具)，或者用细胞外基质或配体，如层粘连蛋白、胶原蛋白(例如天然或变性)、明胶、纤维连接蛋白、鸟氨酸、玻璃体结合蛋白、和细胞外膜蛋白(例如MATRIGEL)(BDDiscoveryLabware，Bedford，Mass.)包被的组织培养表面上。培养中分离的胎盘细胞一般认为是纤维母细胞样细胞，呈星形外观，具有从中央细胞体延伸的大量突起。然而，所述细胞从形态学上不同于在相同条件下培养的成纤维细胞，因为分离的胎盘细胞比成纤维细胞显示出了更大量的这种突起。形态学上，分离的胎盘细胞也可与造血干细胞区分，造血干细胞在培养中的形态通常更圆或卵圆。

5.3.2细胞表面、分子及遗传标记物

分离的胎盘细胞，例如多能细胞或干细胞，和分离的胎盘细胞群表达多个可用来识别和/或分离所述干细胞或含干细胞的细胞群的标记物。本发明所述分离的胎盘细胞以及胎盘细胞群(即两个或多个分离的胎盘细胞)包括直接从胎盘或其任意部分(如羊膜、绒毛膜、胎盘绒毛叶等)获得的胎盘细胞和含胎盘细胞的细胞群。分离的胎盘细胞群还包括培养中的分离的胎盘细胞群(即两个或更多)和容器例如培养药袋中的细胞群。本发明所述分离的胎盘细胞不是胚胎滋养层细胞、细胞滋养层细胞、成血管细胞、胚胎生殖细胞、或胚胎干细胞。本发明所述方法和组合物中有用的胎盘多能细胞描述在美国专利申请公开号2007/0275362、美国专利号7,045,148和No.7,468,276，其公开作为参考整体并入本文并如下所述。

本发明所述方法和组合物中可用的分离的胎盘细胞一般表达标记物CD73、CD105、CD200、HLA-G和/或OCT-4、不表达CD34、CD38、或CD45，并且是HLA-DP，DQ，DR^-。分离的多能细胞一般也是CD10⁺、CD29⁺、CD54⁺、CD90⁺、CD44⁺和CD38⁺。在某些实施方案中，所述细胞是SSEA3^-、SSEA4^-或ABC-p⁺中的一种或多种。分离的胎盘细胞也可表达HLA-ABC(MHC-1)。这些标记物可以任意组合用于识别分离的胎盘细胞，如分离的胎盘干细胞或分离的多能细胞，或区分来自其它细胞类型的分离的胎盘细胞。由于分离的胎盘细胞可表达CD73和CD105，它们可以有间充质干细胞样特征。缺乏CD34，CD38和/或CD45的表达，例如将所述分离的胎盘细胞识别为非造血干细胞。

在某些实施方案中，所述分离的胎盘细胞是分离的胎盘干细胞。在某些其它实施方案中，所述分离的胎盘细胞是分离的胎盘多能细胞。在一个实施方案中，用流式细胞仪检测，所述分离的胎盘细胞是CD34^-、CD10⁺和CD105⁺。在一个具体实施方案中，所述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞是胎盘干细胞。在另一具体实施方案中，分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞是多能胎盘细胞。在另一具体实施方案中，分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞具有分化成神经表型细胞、成骨表型细胞、或软骨表型细胞的潜能。在另一具体实施方案中，所述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞还是CD200⁺。在另一具体实施方案中，所述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞还是CD45^-或CD90⁺。在另一具体实施方案中，用流式细胞仪检测，所述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞还是CD45^-和CD90⁺。在一个更具体实施方案中，用流式细胞仪检测，所述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘细胞还是CD90⁺或CD45^-。在另一个更具体实施方案中，用流式细胞仪检测，所述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘细胞还是CD90⁺和CD45^-，即所述细胞是CD34^-、CD10⁺、CD45^-、CD90⁺、CD105⁺和CD200⁺。在一个更具体实施方案中，所述CD34^-、CD10⁺、CD45^-、CD90⁺、CD105⁺、CD200⁺细胞还是CD80^-和CD86^-。

在具体实施方案中，上述任何CD34^-、CD10⁺、CD105⁺细胞还是CD29⁺、CD38^-、CD44⁺、CD54⁺、SH3⁺或SH4⁺中的一种或多种。在另一更具体实施方案中，所述细胞还是CD44⁺。在任何上述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞的另一具体实施方案中，所述细胞还是CD117^-、CD133^-、KDR^-(VEGFR2^-)，HLA-A，B，C⁺、HLA-DP，DQ，DR^-、和/或PDL1⁺中的一种或多种。在另一具体实施方案中，所述CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞还是CD13⁺、CD29⁺、CD33⁺、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD62E^-、CD62L-、CD62P^-、SH3⁺(CD73⁺)、SH4⁺(CD73⁺)、CD80^-、CD86^-、CD90⁺、SH2⁺(CD105⁺)、CD106/VCAM⁺、CD117^-、CD144/VE^-钙粘着蛋白^low、CD184/CXCR4^-、CD200⁺、CD133^-、OCT-4⁺、SSEA3^-、SSEA4^-、ABC-p⁺、KDR^-(VEGFR2^-)、HLA-A，B，C⁺、HLA-DP，DQ，DR^-、HLA-G⁺、或程序性死亡-1配体(PDL1⁺)中的一种或多种，或者它们的任何组合。在一个更具体实施方案中，所述CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞还是CD13⁺、CD29⁺、CD33⁺、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54/ICAM⁺、CD62E^-、CD62L⁺、CD62P⁺、SH3⁺(CD73⁺)、SH4⁺(CD73⁺)、CD80^-、CD86^-、CD90⁺、SH2⁺(CD105⁺)、(CD106/VCAM⁺、CD117^-、CD144/VE^-钙粘着蛋白^low、CD184/CXCR4^-、CD200⁺、CD133^-、OCT-4⁺、SSEA3^-、SSEA4^-、ABC-p⁺、KDR^-(VEGFR2^-)、HLA-A，B，C⁺、HLA-DP，DQ，DR^-、HLA-G⁺、和程序性死亡-1配体(PDL1⁺)。

在另一实施方案中，可用于本发明的组合物及方法的细胞群是包含，例如富集CD34^-、CD10⁺和CD105⁺胎盘细胞的细胞群。在各实施方案中，所述细胞群中至少大约10％、至少大约20％、至少大约30％、至少大约40％、至少大约50％、至少大约60％的细胞是CD34^-、CD10⁺和CD105⁺胎盘细胞。优选地，所述细胞群中至少大约70％的细胞是CD34^-、CD10⁺和CD105⁺胎盘细胞。更优选地，至少大约90％、95％或99％的所述细胞是CD34^-、CD10⁺和CD105⁺胎盘细胞。在一个具体实施方案中，分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞还是CD200⁺。在一个更具体实施方案中，用流式细胞仪检测，分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘细胞还是CD90⁺或CD45^-。在另一个更具体实施方案中，用流式细胞仪检测，分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘细胞还是CD90⁺和CD45^-。在一个更具体实施方案中，上述任意的分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞还是CD29⁺、CD38^-、CD44⁺、CD54⁺、SH3⁺或SH4⁺中的一种或多种。在另一个更具体实施方案中，分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞，或分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘细胞还是CD44⁺。在包含上述分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞的任何细胞群的具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞还是CD13⁺、CD29⁺、CD33⁺、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD62E^-、CD62L⁺、CD62P⁺、SH3⁺(CD73⁺)、SH4⁺(CD73⁺)、CD80^-、CD86^-、CD90⁺、SH2⁺(CD105⁺)、CD106/VCAM⁺、CD117^-、CD144/VE^-钙粘着蛋白^low、CD184/CXCR4^-、CD200⁺、CD133^-、OCT-4⁺、SSEA3^-、SSEA4^-、ABC-p⁺、KDR^-(VEGFR2^-)、HLA-A，B，C⁺、HLA-DP，DQ，DR^-、HLA-G⁺、和程序性死亡-1配体(PDL1)⁺中的一种或多种，或者它们的任意组合。在一个更具体实施方案中，所述CD34^-、CD10⁺、CD105⁺细胞还是CD13⁺、CD29⁺、CD33⁺、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54/ICAM⁺、CD62E^-、CD62L⁺、CD62P⁺、SH3⁺(CD73⁺)，SH4⁺(CD73⁺)、CD80^-、CD86^-、CD90⁺、SH2⁺(CD105⁺)、CD106/VCAM⁺、CD117^-、CD144/VE^-钙粘着蛋白^low、CD184/CXCR4^-、CD200⁺、CD133^-、OCT-4⁺、SSEA3^-、SSEA4^-、ABC-p⁺、KDR^-(VEGFR2^-)、HLA-A，B，C⁺、HLA-DP，DQ，DR^-、HLA-G⁺、和程序性死亡-1配体(PDL1)⁺。

在某些实施方案中，所述分离的胎盘细胞是CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^-、SSEA4，OCT-4⁺、和ABC-P⁺中的一种或多种或全部，其中所述分离的胎盘细胞通过物理和/或酶法裂解胎盘组织而获得。在一个具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是OCT-4⁺和ABC-p⁺。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是OCT-4⁺和CD34^-，其中所述分离的胎盘细胞具有至少一种下述特征：CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^-、和SSEA4^-。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是OCT-4⁺、CD34^-、CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^-、和SSEA4^-。在另一实施方案中，所述分离的胎盘细胞是OCT-4⁺、CD34^-、SSEA3^-、和SSEA4^-。在一个更具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是OCT-4⁺和CD34^-，以及是SH2⁺或SH3⁺。在一个更具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是OCT-4⁺、CD34^-、SH2⁺、和SH3⁺。在另一个更具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是OCT-4⁺、CD34^-、SSEA3^-、和SSEA4^-，以及是SH2⁺或SH3⁺。在另一个更具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是OCT-4⁺和CD34^-，以及是SH2⁺或SH3⁺，并且是CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、SSEA3^-、或SSEA4^-中的至少一种。在另一更具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是OCT-4⁺、CD34^-、CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、SSEA3^-、和SSEA4^-、以及是SH2⁺或SH3⁺。

在一个实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的分离的胎盘细胞是CD200⁺或HLA-G⁺。在一个具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是CD200⁺和HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是CD73⁺和CD105⁺。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是CD34^-、CD38^-和CD45^-。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺和CD105⁺。在另一具体实施方案中，所述CD200⁺或HLA-G⁺分离的胎盘细胞在允许形成胚样体的条件下，促进在包含分离的胎盘细胞的的胎盘细胞群中形成胚样体。在另一具体实施方案中，分离的胎盘细胞与不是干细胞或多能细胞的胎盘细胞相分离。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞与不显示这些标记物的胎盘干细胞相分离。

在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的细胞群是包含，例如即富集CD200⁺、HLA-G⁺胎盘细胞的细胞群。在各实施方案中，所述细胞群中至少大约10％、至少大约20％、至少大约30％、至少大约40％、至少大约50％、至少大约60％的细胞是CD200⁺、HLA-G⁺胎盘细胞。优选地，所述细胞群中至少大约70％的细胞是CD200⁺、HLA-G⁺胎盘细胞。更优选地，所述细胞群中至少大约90％、95％、或99％细胞是CD200⁺、HLA-G⁺胎盘细胞。在分离的细胞群的具体实施方案中，所述胎盘细胞也是CD73⁺和CD105⁺。在另一具体实施方案中，所述胎盘细胞也是CD34^-、CD38^-或CD45^-。在一个更具体的实施方案中，所述胎盘细胞也是CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺和CD105⁺。在另一实施方案中，所述分离的细胞群当在允许形成胚样体的条件下培养时，产生一个或多个胚样体。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞群与不是干细胞的胎盘细胞分离。在另一具体实施方案中，所述胎盘细胞群与不显示这些标记物的胎盘细胞相分离。

在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的胎盘细胞是CD73⁺、CD105⁺、和CD200⁺。在另一具体实施方案中，所述胎盘细胞是HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，所述胎盘细胞是CD34^-、CD38^-或CD45的^-。在另一具体实施方案中，所述胎盘细胞是CD34^-、CD38^-和CD45^-。在一个更具体实施方案中，所述胎盘细胞是CD34^-、CD38^-、CD45^-、和HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，当所述细胞群在允许形成胚样体的条件下培养时，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、和CD200⁺胎盘细胞促进在所述胎盘细胞的细胞群中形成一个或多个胚样体。在另一具体实施方案中，所述胎盘细胞与不是干细胞的胎盘细胞分离。在另一具体实施方案中，所述胎盘细胞与不显示这些标记物的胎盘细胞分离。

在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的细胞群是包含，例如即富集分离的CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘细胞的细胞群。在各实施方案中，所述细胞群中至少大约10％、至少大约20％、至少大约30％、至少大约40％、至少大约50％、至少大约60％的细胞是CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘细胞。在另一实施方案中，所述细胞群中至少大约70％的所述细胞是分离的CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘细胞。在另一个实施方案中，所述细胞群中至少大约90％、95％或99％的所述细胞是分离的CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘细胞。在所述细胞群的具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞还是CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是CD34^-、CD38^-和CD45^-。在一个更具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞还是CD34^-、CD38^-、CD45^-、和HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，所述细胞群当在允许形成胚样体的条件下培养时，产生一个或多个胚样体。在另一具体实施方案中，所述胎盘细胞群与不是干细胞的胎盘细胞分离。在另一个具体实施方案中，所述胎盘细胞群与不显示这些标记物的胎盘细胞相分离。

在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的分离的胎盘细胞是CD200⁺和OCT-4⁺。在一个具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是CD73⁺和CD105⁺。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，所述分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘细胞是CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方案中，所述分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘细胞是CD34^-、CD38^-和CD45^-。在一个更具体实施方案中，所述分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘细胞是CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，当所述细胞群在允许形成胚样体的条件下培养时，所述分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘细胞促进包含该分离的细胞的胎盘细胞群形成一个或多个胚样体。在另一具体实施方案中，所述分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘细胞与不是干细胞的胎盘细胞分离。在另一具体实施方案中，所述分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘细胞与不显示这些标记物的胎盘细胞相分离。

在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的细胞群是包含，例如即富集CD200⁺、OCT-4⁺胎盘细胞的细胞群。在各实施方案中，所述细胞群中至少大约10％、至少大约20％、至少大约30％、至少大约40％、至少大约50％、至少大约60％的细胞是CD200⁺、OCT-4⁺胎盘细胞。在另一实施方案中，至少大约70％的所述细胞是分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘细胞。在另一个实施方案中，所述细胞群中至少大约90％、95％或99％的细胞是分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘细胞。在所述分离的细胞群的具体实施方案中，所述分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘细胞还是CD73⁺和CD105⁺。在另一具体实施方案中，所述分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘细胞还是HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，所述分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘细胞还是CD34^-、CD38^-和CD45^-。在一个更具体实施方案中，所述分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘细胞还是CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，所述细胞群当在允许形成胚样体的条件下培养时，产生一个或多个胚样体。在另一具体实施方案中，所述分离的细胞群与不是CD200⁺、OCT-4⁺胎盘细胞的胎盘细胞分离。在另一具体实施方案中，所述分离的细胞群与不显示这些标记物的胎盘细胞分离。

在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的分离的胎盘细胞是CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺胎盘细胞还是CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方案中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G⁺胎盘细胞还是CD34^-、CD38^-和CD45^-。在另一具体实施方案中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G⁺胎盘细胞还是OCT-4⁺。在另一具体实施方案中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G⁺胎盘细胞还是CD200⁺。在一个更具体实施方案中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G⁺胎盘细胞还是CD34^-、CD38^-、CD45^-、OCT-4⁺和CD200⁺。在另一具体实施方案中，当所述细胞群在允许形成胚样体的条件下培养时，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G⁺胎盘细胞促进在包含所述细胞的胎盘细胞群中形成胚样体。在另一具体实施方案中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G⁺胎盘细胞与不是CD73⁺、CD105⁺、HLA-G⁺胎盘细胞的胎盘细胞分离。在另一具体实施方案中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G⁺胎盘细胞与不显示这些标记物的胎盘细胞分离。

在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的细胞群是包含，例如即富集CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺胎盘细胞的细胞群。在各实施方案中，所述细胞群中至少大约10％、至少大约20％、至少大约30％、至少大约40％、至少大约50％、至少大约60％的细胞是CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺胎盘细胞。在另一实施方案中，所述细胞群中至少大约70％的细胞是分离的CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺胎盘细胞。在另一个实施，所述细胞群中至少大约90％、95％或99％的细胞是分离的CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺胎盘细胞。在上述细胞群的具体实施方案中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G⁺胎盘细胞还是CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方案中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G⁺胎盘细胞还是CD34^-、CD38^-和CD45^-。在另一具体实施方案中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G⁺胎盘细胞还是OCT-4⁺。在另一具体实施方案中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G⁺胎盘细胞还是CD200⁺。在一个更具体实施方案中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G⁺胎盘细胞还是CD34^-、CD38^-、CD45^-、OCT-4⁺和CD200⁺。在另一具体实施方案中，所述细胞群与不是CD73⁺、CD105⁺、HLA-G⁺胎盘细胞的胎盘细胞相分离。在另一具体实施方案中，所述细胞群与不显示这些标记物的胎盘细胞相分离。

在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的分离的胎盘细胞是CD73⁺和CD105⁺，并且当所述细胞群在允许形成胚样体的条件下培养时，促进在包含所述CD73⁺、CD105⁺细胞的分离的细胞群中形成一个或多个胚样体。在另一具体实施方案中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘细胞还是CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方案中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺还是胎盘细胞CD34^-、CD38^-和CD45^-。在另一具体实施方案中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘细胞还是OCT-4⁺。在一个更具体实施方案中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘细胞还是OCT-4⁺、CD34^-、CD38^-和CD45^-。在另一具体实施方案中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘细胞与不是所述细胞的胎盘细胞分离。在另一具体实施方案中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘细胞与不显示这些特征的胎盘细胞分离。

在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的细胞群是包含，例如即富集分离的胎盘细胞的细胞群，所述分离的胎盘细胞是CD73⁺、CD105⁺，并且当所述细胞群在允许形成胚样体的条件下培养时，促进在包含所述细胞的分离的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体。在各实施方案中，所述细胞群中至少大约10％、至少大约20％、至少大约30％、至少大约40％、至少大约50％、至少大约60％的细胞是分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘细胞。在另一个实施方案中，所述细胞群中至少大约70％的细胞是分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘细胞。在另一个实施方案中，所述细胞群中至少大约90％、95％或99％的细胞是所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘细胞。在上述细胞群的具体实施方案中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘细胞还是CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方案中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘细胞还是CD34^-、CD38^-和CD45^-。在另一具体实施方案中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘细胞还是OCT-4⁺。在另一具体实施方案中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘细胞还是CD200⁺。在一个更具体实施方案中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘细胞还是CD34^-、CD38^-、CD45^-、OCT-4⁺和CD200⁺。在另一具体实施方案中，所述细胞群与不是所述CD73⁺、CD105⁺胎盘细胞的胎盘细胞分离。在另一具体实施方案中，所述细胞群与不显示这些标记物的胎盘细胞分离。

在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的分离的胎盘细胞是OCT-4⁺，并且当在允许形成胚样体的条件下培养时，促进在包含所述细胞的分离的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体。在一个具体实施方案中，所述分离的OCT-4⁺胎盘细胞还是CD73⁺和CD105⁺。在另一具体实施方案中，所述分离的OCT-4⁺胎盘细胞还是CD34^-、CD38^-、或CD45^-。在另一具体实施方案中，所述分离的OCT-4⁺胎盘细胞还是CD200⁺。在一个更具体实施方案中，所述分离的OCT-4⁺胎盘细胞还是CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-、和CD45^-。在另一具体实施方案中，所述分离的OCT-4⁺胎盘细胞与不是OCT-4⁺胎盘细胞的胎盘细胞分离。在另一具体实施方案中，所述分离的OCT-4⁺胎盘细胞与不显示这些特征的胎盘细胞分离。

在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的细胞群是包含，例如即富集OCT-4⁺的分离的胎盘细胞的细胞群，并且当所述细胞群在允许形成胚样体的条件下培养时，促进在包含所述细胞的分离的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体。在各实施方案中，所述细胞群中至少大约10％、至少大约20％、至少大约30％、至少大约40％、至少大约50％、至少大约60％的细胞是所述分离的OCT-4⁺胎盘细胞。在另一实施方案中，所述细胞群中至少大约70％细胞是所述分离的OCT-4⁺胎盘细胞。在另一个实施方案中，所述细胞群中至少大约80％、90％、95％或99％的细胞是所述分离的OCT-4⁺胎盘细胞。在上述细胞群的具体实施方案中，所述分离的OCT-4⁺胎盘细胞还是CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方案中，所述分离的OCT-4⁺胎盘还是CD34^-、CD38^-和CD45^-。在另一具体实施方案中，所述分离的OCT-4⁺胎盘细胞还是CD73⁺和CD105⁺。在另一具体实施方案中，所述分离的OCT-4⁺胎盘细胞还是CD200⁺。在一个更具体实施方案中，所述分离的OCT-4⁺胎盘细胞还是CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-、和CD45^-。在另一具体实施方案中，所述细胞群与不是所述细胞的胎盘细胞分离。在另一具体实施方案中，所述细胞群与不显示这些标记物的胎盘细胞分离。

在其它某些实施方案中，所述分离的胎盘细胞是CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^-、SSEA4^-、OCT-4⁺、MHC-I⁺或ABC-p⁺中的一种或多种。在一个具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺，SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^-、SSEA4^-、和OCT-4⁺。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD54⁺、SH2⁺、SH3⁺、和SH4⁺。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD54⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺和OCT-4⁺。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、HLA-1⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是OCT-4⁺和ABC-p⁺。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞的SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺和OCT-4⁺。在另一实施方案中，所述分离的胎盘细胞是OCT-4⁺、CD34^-、SSEA3^-、和SSEA4^-。在一个具体实施方案中，所述分离的OCT-4⁺、CD34^-、SSEA3^-、和SSEA4^-胎盘细胞还是CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、SH2⁺、SH3⁺、和SH4⁺。在另一实施方案中，所述分离的胎盘细胞是OCT-4⁺和CD34^-，以及SH3⁺或SH4⁺。在另一实施方案中，所述分离的胎盘细胞是CD34^-，以及CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD90⁺或OCT-4⁺。

在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的分离的胎盘细胞是分离的CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、和CD200⁺胎盘细胞。在另一个实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的细胞群是包含胎盘细胞的细胞群，其中所述细胞群的至少大约70％、至少大约80％、至少大约90％、至少大约95％或至少大约99％是CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺胎盘细胞。在上述实施方案的一个具体实施方案中，所述胎盘细胞还是CD90⁺和CD45^-。在一个具体实施方案中，所述胎盘细胞或胎盘细胞群与不是干细胞的胎盘细胞分离。在另一具体实施方案中，所述胎盘细胞或胎盘细胞群与不显示这些特点的胎盘细胞分离。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞非母体来源。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞群中至少大约90％、至少大约95％、或至少大约99％的所述细胞是非母体来源。

在所述分离的胎盘细胞或包含所述分离的胎盘细胞的细胞群的另一具体实施方案中，所述细胞或细胞群已经被扩增，例如传代至少、大约或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20倍，或者增殖至少、大约或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40倍增。在本发明公开的分离的胎盘细胞或包含分离的胎盘细胞的细胞群的另一个具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是胎儿来源(即具有胎儿基因型)。

在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的胎盘细胞是OCT-4⁺，并且当在允许形成胚样体的条件下培养时，其促进在包含所述分离的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体。在一个具体实施方案中，所述胎盘细胞是CD73⁺和CD105⁺。在另一具体实施方案中，所述胎盘细胞是CD34^-、CD38^-、或CD45^-。在另一具体实施方案中，所述胎盘细胞是CD200⁺。在一个更具体实施方案中，所述胎盘细胞是CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-、和CD45^-。在另一具体实施方案中，所述胎盘细胞与不是干细胞的胎盘细胞分离。在另一具体实施方案中，所述胎盘细胞与不显示这些特征的胎盘细胞分离。

在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的分离的胎盘细胞是分离的HLA-A，B，C^-、CD45^-、CD133^-和CD34^-胎盘细胞。在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的细胞群是包含分离的胎盘细胞的细胞群，其中所述分离的细胞群的至少大约70％、至少大约80％、至少大约90％、至少大约95％或至少大约99％细胞是分离的HLA-A，B，C^-、CD45^-、CD133^-和CD34^-胎盘细胞。在一个具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群与不是HLA-A，B，C^-、CD45^-、CD133^-和CD34^-胎盘细胞的胎盘细胞分离。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是非母体来源。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞群基本上没有母体来源，例如所述分离的胎盘细胞群中至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％或99％的所述细胞是非母体来源。

在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的分离的胎盘细胞是分离的CD10⁺、CD13⁺、CD33⁺、CD45^-、CD117^-和CD133^-胎盘细胞。在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的细胞群是包含分离的胎盘细胞的细胞群，其中所述细胞群中至少大约70％、至少大约80％、至少大约90％、至少大约95％或至少大约99％的人细胞是分离的CD10⁺、CD13⁺、CD33⁺、CD45^-、CD117^-和CD133^-胎盘细胞。在一个具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群与不是所述分离的胎盘细胞的胎盘细胞分离。在另一具体实施方案中，所述分离的CD10⁺、CD13⁺、CD33⁺、CD45^-、CD117^-和CD133^-胎盘细胞非母体来源，即具有胎儿的基因型。在另一具体实施方案中，所述胎盘细胞群中至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％或99％的细胞是非母体来源。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群与不显示这些特征的胎盘细胞分离。

在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的分离的胎盘细胞是分离的CD10^-、CD33⁺、CD44⁺、CD45^-、和CD117^-胎盘细胞。在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的细胞群是包含，例如富集分离的胎盘细胞的细胞群，其中所述细胞群中至少大约70％、至少大约80％、至少大约90％、至少大约95％或至少大约99％的细胞的是分离的CD10^-、CD33⁺、CD44⁺、CD45^-、和CD117^-胎盘细胞。在一个具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群与不是所述细胞的胎盘细胞分离。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是非母体来源。在另一具体实施方案中，在所述细胞群中至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％或99％的细胞是非母体来源。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群与不显示这些标记物的胎盘细胞分离。

在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的分离的胎盘细胞是分离的CD10^-、CD13^-、CD33⁺、CD45^-、CD117^-胎盘细胞。在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的有用的细胞群包含，例如富集分离的CD10^-、CD13^-、CD33⁺、CD45^-和CD117^-胎盘细胞的细胞群，其中在所述细胞群中至少大约70％、至少大约80％、至少大约90％、至少大约95％或至少大约99％的细胞是CD10^-，CD13^-、CD33⁺、CD45^-、和CD117^-胎盘细胞。在一个具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群与不是所述细胞的胎盘细胞分离。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是非母体来源。在另一具体实施方案中，在所述细胞群中至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％或99％的所述细胞是非母体来源。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群与不显示这些特征的胎盘细胞分离。

在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的分离的胎盘细胞是HLAA，B，C⁺、CD45^-、CD34^-、和CD133^-、并且还是CD10⁺、CD13⁺、CD38⁺、CD44⁺、CD90⁺、CD105⁺、CD200⁺和/或HLA-G⁺、和/或CD117^-阴性。在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的细胞群是包含分离的胎盘细胞的细胞群，其中在所述细胞群中至少大约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或大约99％的细胞是HLAA，B，C^-、CD45^-、CD34^-、CD133^-胎盘细胞，并且还是CD10、CD13、CD38、CD44、CD90、CD105、CD200和/或HLA-G阳性，和/或CD117阴性。在一个具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群与不是所述细胞的胎盘细胞分离。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是非母体来源。在另一具体实施方案中，在所述细胞群中至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％或99％的细胞是非母体来源。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群与不显示这些标记物的胎盘细胞分离。

在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的分离的胎盘细胞是这样的分离的胎盘细胞，其经抗体结合测定是CD200⁺和CD10⁺，经抗体结合和RT-PCR检测是CD117^-。在另一个实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的分离的胎盘细胞是这样的分离的胎盘的细胞，例如胎盘干细胞或胎盘多能细胞，其是CD10⁺、CD29^-、CD54⁺、CD200⁺、HLA-G⁺和HLA-I类抗原-和β-2-微球蛋白^-。在另一个实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的分离的胎盘细胞是这样的胎盘的细胞，其中至少一种细胞标记物的表达至少比间充质干细胞(如骨髓间充质干细胞)高两倍以上。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是非母体来源。在另一具体实施方案中，在所述细胞群中至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％或99％的所述细胞是非母体来源。

在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的分离的胎盘细胞是这样的分离的胎盘的细胞，例如胎盘干细胞或胎盘多能细胞，其是CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD45^-、CD54/ICAM⁺、CD62^-E⁺、CD62^-L-、CD62^-P⁺、CD80^-、CD86^-、CD103^-、CD104^-、CD105⁺、CD106/VCAM⁺、CD144/VE^-钙粘蛋白^low，CD184/CXCR4^-、β2^-微球蛋白^low、MHC-I^low，MHC-Ⅱ^-、HLA-G^low，和/或PDL1^low中的一种或多种。在一个具体实施方案中，分离的胎盘细胞至少是CD29⁺和CD54⁺。在另一具体实施方案中，分离的胎盘细胞至少是CD44⁺和CD106⁺。在另一具体实施方案中，分离的胎盘细胞至少是CD29⁺。

在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的细胞群包含分离的胎盘细胞，在所述细胞群中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的细胞是这样的分离的胎盘细胞，其是CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD45^-、CD54/ICAM⁺、CD62^-E⁺、CD62^-L⁺、CD62^-P⁺、CD80^-、CD86^-、CD103^-、CD104^-、CD105⁺、CD106/VCAM⁺、CD144/VE^-钙粘蛋白^low、CD184/CXCR4^-、β2^-微球蛋白^low、MHC-I^low、MHC-Ⅱ^-、HLA-G^low、和/或PDL1^low。在一个更具体实施方案中，在所述细胞群中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的细胞是CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD45^-、CD54/ICAM⁺、CD62^-E⁺、CD62^-L⁺、CD62^-P⁺、CD80^-、CD86^-、CD103^-、CD104^-、CD105⁺、CD106/VCAM⁺、CD144/VE^-钙粘蛋白^low、CD184/CXCR4^-、β2^-微球蛋白^low、MHC-I^low，MHC-Ⅱ^-、HLA-G^low、和/或PDL1^low。

在分离的胎盘细胞的某些实施方案中，所述分离的胎盘细胞在生长培养基，即促进细胞增殖的培养基中培养期间不分化，例如在生长培养基中的增殖期间。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞的增殖不需要饲养层。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞在缺乏饲养层的情况下培养不分化，仅仅因为缺乏饲养层。

在另一实施方案中，可用于本发明提供的组合物和方法的细胞是分离的胎盘细胞，其中多个所述分离的胎盘细胞经醛脱氢酶活性测试是醛脱氢酶阳性(ALDH)。这种测试是本领域已知的技术(例如参见BostianandBerts，Biochem.J.，173，787，(1978))。在一个具体实施方案中，所述ALDH测试采用ALDEFLUOR(Aldagen公司，亚什兰，俄勒冈州)作为醛脱氢酶活性的标记物。在一个具体实施方案中，所述“多个”是指所述细胞群中大约3％和25％的细胞。在另一实施方案中，本发明提供分离的脐带细胞群，例如分离的脐带多能细胞，采用ALDEFLUOR作为醛脱氢酶活性指标，经醛脱氢酶活性测定，其中多个所述分离的脐带细胞是醛脱氢酶阳性。在一个具体实施方案中，所述“多个”是指所述细胞群中大约3％和25％的细胞。在另一实施方案中，所述分离的胎盘细胞或脐带细胞群与具有相同细胞数并在相同条件下培养的骨髓间充质干细胞群相比，显示至少三倍，或至少五倍高的ALDH活性。

在所述分离的胎盘细胞或包含该分离的胎盘细胞的细胞群的另一具体实施方案中，所述细胞或细胞群扩增，例如传代至少、大约、或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次，或者增殖至少、大约、或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40群倍增数。在本发明公开的分离的胎盘细胞，或包含分离的胎盘细胞的细胞群的另一个具体实施方案中，所述分离胎盘的细胞是胎儿来源(即具有胎儿基因型)。

在任何上述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞的细胞群的具体实施方案中，细胞的染色体组型，或所述细胞群中至少大约95％或大约99％的细胞是正常的。在任何上述胎盘细胞或细胞群的具体实施方案中，所述细胞或细胞群中的细胞是非母体来源。

具有任何上述标记物的组合的分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群，可以任意比例组合。任何两个或更多上述分离的胎盘细胞群可以组合形成一个分离的胎盘细胞群。例如一个分离的胎盘细胞群可以包含由一种上述标记物的组合定义的第一胎盘细胞群，以及由另一种上述标记物的组合定义的第二胎盘细胞群，其中所述第一和第二细胞群以大约1∶99、2∶98、3∶97、4∶96、5∶95、10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20、90∶10、95∶5、96∶4、97∶3、98∶2、或大约99∶1的比例组合。以这样的方式，任何三个、四个、五个、或更多上述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群都可以组合。

可用于本发明提供的组合物和方法的分离的胎盘细胞可通过，例如裂解胎盘组织，用或不用酶消化(见第5.4.3节)或灌流(见第5.4.4节)获得。例如分离的胎盘细胞群可根据这样的方法生产，其包括对已经排干脐血和灌流清除掉残留血液的哺乳动物胎盘进行灌流；用灌流溶液灌流所述胎盘；收集所述灌流溶液，其中所述灌流后的灌流溶液包含胎盘细胞群，该细胞群包含分离的胎盘细胞；以及从细胞群中分离多个所述胎盘细胞。在一个具体实施方案中，灌流溶液通过脐静脉和脐动脉，并在从胎盘流出收集。在另一具体实施方案中，灌流溶液通过脐静脉并从脐动脉收集，或通过脐动脉并从脐静脉收集。

在各实施方案中，包含在通过灌流胎盘而获得的细胞群中的分离的胎盘细胞，是所述胎盘细胞群的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或至少99.5％。在另一具体实施方案中，通过灌流收集的分离的胎盘细胞包含胎儿和母体细胞。在另一具体实施方案中，通过灌流收集的分离的胎盘细胞至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或至少99.5％是胎儿细胞。

在另一具体实施方案中，本发明提供包含通过灌流收集的如本发明所述分离的胎盘细胞群的组合物，其中所述组合物包含至少一部分用于收集所述分离的胎盘细胞的灌流溶液。

本发明所述分离的胎盘细胞群可这样产生，通过用组织裂解酶消化胎盘组织以获得包含所述细胞的胎盘细胞群，和将多个胎盘细胞与其余胎盘细胞分离，或者基本上分离。胎盘的全部或者任何部分可以被消化以获得本发明所述分离的胎盘细胞。在具体的实施方案中，例如所述胎盘组织可以是整个胎盘、羊膜、绒毛膜、羊膜和绒毛膜的组合，或者任何上述的组合。在其它具体实施方案中，组织裂解酶是胰蛋白酶或胶原酶。在各实施方案中，消化胎盘获得的细胞群中包含的分离的胎盘细胞至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，99％或至少99.5％是所述胎盘细胞群。

基因分析证实，分离的胎盘细胞和分离的胎盘细胞群与其它细胞不同，例如间充质干细胞，例如骨髓间充质干细胞。本发明所述分离的胎盘细胞可与例如基于表达一种或多种基因的间充质干细胞不同，与骨髓间充质干细胞相比，所述基因在所述分离的胎盘细胞或者某些分离的脐血干细胞中的表达明显更高。特别是，可用于本发明提供的组合物和方法中的分离的胎盘细胞，可以根据一种或多种基因表达与间充质干细胞区别，当细胞在相同条件下生长时，这种表达在分离的胎盘细胞中比在相同数量的骨髓间充质干细胞中显著增高(即至少高两倍)，其中所述一种或多种基因是ACTG2、ADARB1、AMIG02、ARTS-I、B4GALT6、BCHE、Cllorf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、HLA-G、ICAM1、IER3、IGFBP7、ILIA、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAK1、PCDH7、PDLIM3、PKP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN、ZC3H12A，或任何前述的组合，参见例如美国专利申请公开号2007/0275362，其公开整体并入本发明作为参考。在一个更具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞当在包含DMEM-LG(Gibco)；2％胎牛血清(HycloneLabs)；1×胰岛素铁硒传递蛋白(ITS)；1×亚油酸牛血清白蛋白(LA-BSA)；10^-9M地塞米松(Sigma)；10^-4M的抗坏血酸2-磷酸酯(Sigma)；表皮生长因子10ng/mL(R&D系统公司)和血小板生长因子(PDGF-BB)10ng/mL(R&D系统公司)的培养基中培养大约3至大约35群倍增时，表达所属一种或多种基因。在一个具体实施方案中，分离的胎盘细胞的特异性基因或分离的脐带细胞的特异性基因是CD200。

这些基因的具体序列可从GenBank的以下登记号找到，截至2008年3月，NM_001615(ACTG2)、BC065545(ADARB1)、(NMJ81847(AMIGO2)、AY358590(ARTS-I)、BC074884(B4GAIT6)、BC008396(BCHE)、BC020196(Cllorf9)、BC031103(CD200)、NM_001845(COL4A1)、NM_001846(COL4A2)、BC052289(CPA4)、BC094758(DMD)、AF293359(DSC3)、NM_001943(DSG2)、AF338241(ELOVL2)、AY336105(F2RL1)、NM_018215(FLJ10781)、AY416799(GATA6)、BC075798(GPR126)、NM_016235(GPRC5B)、AF340038(ICAM1)、BC000844(IER3)、BC066339(IGFBP7)、BC013142(ILIA)、BT019749(IL6)、BC007461(IL18)、(BC072017)KRT18、BC075839(KRT8)、BC060825(LIPG)、BC065240(LRAP)、BCO10444(MATN2)、BCO11908(MEST)、BC068455(NFE2L3)、NM_014840(NUAK1)、AB006755(PCDH7)、NMJM4476(PDLIM3)、BC126199(PKP-2)、BC090862(RTN1)、BC002538(SERPINB9)、BC023312(ST3GAL6)、BCOO1201(ST6GALNAC5)、BC126160orBC065328(SLC12A8)、BC025697(TCF21)、BC096235(TGFB2)、BC005046(VTN)、和BC005001(ZC3H12A)。

在一个更具体实施方案中，与相同数量的骨髓间充质干细胞中相比、所述分离的胎盘细胞以可检测的高水平表达每一种以下基因：ACTG2、ADARB1、AMIGO2、ARTS-I、B4GALT6、BCHE、Cllorf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、HLA-G、ICAM1、IER3、IGFBP7、ILIA、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAK1、PCDH7、PDLIM3、PKP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN、和ZC3H12A。

在更具体的实施方案中，胎盘细胞群可以通过选择比骨髓间充质干细胞可检测地更高水平表达一种或多种基因的胎盘细胞进行筛选，其中所述一种或多种基因是选自ACTG2、ADARB1、AMIGO2、ARTS-I、B4GALT6、BCHE、Cllorf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、HLA-G、ICAM1、IER3、IGFBP7、ILIA、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAK1、PCDH7、PDLIM3、PKP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN、和ZC3H12A，其中所述骨髓干细胞经过与所述胎盘细胞相同数量的传代培养。在一个更具体实施方案中，所述筛选包括选择比骨髓间充质干细胞可检测地更高水平表达ACTG2、ADARB1、AMIGO2、ARTS-I、B4GALT6、BCHE、Cllorf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、HLA-G、ICAM1、IER3、IGFBP7、ILIA、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAK1、PCDH7、PDLIM3、PKP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN和ZC3H12A的细胞。

上述提及的基因的表达可通过标准技术评价。例如基于基因序列的探针可以单独选择和通过常规技术构建。所述基因的表达可以在例如包含一个或多个基因的微阵列，例如AffymetrixGENECHIP人类基因组U133A2.0array，或者AffymetrixGENECHIPHumanGenomeU133Plus2.0(SantaClara，California)上评价。即使某些GenBank的登记号的序列经过修订，这些基因的表达仍然可以评价，因为针对该修订序列的特定探针可以应用众所周知的标准技术很容易地产生。

这些基因的表达水平可以用来确认分离的胎盘细胞群的身份，确定细胞群包含至少多个分离的胎盘细胞，等等。分离的胎盘细胞群在其身份确认后可以克隆，例如将分离的胎盘细胞群从一个单独的或混合的干细胞群扩增，混合的干细胞群例如可以是只包含从多个分离的胎盘细胞扩增的分离的胎盘细胞的细胞群，或者包含本发明所述分离的胎盘细胞的细胞群和至少一种其它类型的细胞的细胞群。

这些基因的表达水平可用于筛选分离的胎盘细胞群。例如如果细胞群样品中一种或多种上文所列基因的表达明显高于相同数量的间充质干细胞，该细胞群，如克隆扩增的细胞群，可以被筛选出来。这种筛选可以是从多个分离的胎盘细胞群，从多个不明身份的细胞群等得到的细胞群。

分离的胎盘干细胞可以根据一种或多种这种基因的表达水平与例如间充质干细胞对照中所述一种或多种基因的表达水平，例如相同数量的骨髓间充质干细胞中所述一种或多种基因的表达水平相比来筛选。在一个实施方案中，包含相同数量的间充质干细胞的样品中所述一种或多种基因的表达水平用作对照。在另一个实施方案中，对于在一定条件下进行测试的分离的胎盘细胞，对照是代表上述条件下间充质干细胞中所述一种或多种基因表达水平的数字值。

本发明所述分离的胎盘细胞在原代培养中或者在包含DMEM-LG(Gibco)、2％胎牛血清(FCS)(HycloneLabs)、1×胰岛素铁硒传递蛋白(ITS)\1×亚油酸牛血清白蛋白(LA-BSA)，10^-9M地塞米松(Sigma)，10^-4M的抗坏血酸2-磷酸酯(Sigma)、表皮生长因子(EGF)10ng/mL(R&D系统公司)、血小板生长因子(PDGF-BB)10ng/mL(R&D系统公司)、和100U青霉素/1000U链霉素的培养基中增值期间显示上述特征(例如细胞表面标志物和/或基因表达谱的组合)。

如上所述的胎盘细胞的分离群和分离的胎盘细胞群一般可包含大约、至少、或不超过1×10⁵，5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹或更多分离的胎盘细胞。通过例如台盼蓝拒染实验测定，可用于本发明提供的组合物和方法中的分离的胎盘细胞群包含至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％有活力的分离的胎盘细胞。

5.3.3在培养基中生长

本发明所述分离的胎盘细胞，与任何哺乳动物细胞一样，部分依赖于选择的特定生长培养基。在优选条件下，分离的胎盘细胞通常在3-5天内倍增。在培养期间，本发明所述分离的胎盘细胞粘附于培养底物，如组织培养容器的表面(例如组织培养皿塑料，纤维连接蛋白包被的塑料等)，并形成单细胞层。

本发明所述分离的胎盘细胞群当在适当条件下培养时形成胚样体，即三维的细胞簇生长粘附于干细胞层之上。胚样体中的细胞表达与极早期干细胞有关的标记物，例如OCT-4⁺、Nanog、SSEA3和SSEA4。胚样体中的细胞与本发明所述分离的胎盘细胞不同，通常不会粘附于培养底物上，但在培养期间仍然粘附于贴壁细胞。胚样体细胞依赖于分离的贴壁胎盘细胞而存活，因为在缺乏分离的贴壁胎盘细胞的情况下不形成拟胚样体。因此在包含分离的贴壁胎盘细胞的胎盘细胞群中，分离的贴壁胎盘细胞促进一个或多个胚样体生长。不希望受理论约束，胚样体细胞被认为在分离的贴壁胎盘细胞上生长，就像胚胎干细胞在饲养层细胞上生长一样。间充质干细胞，如骨髓间充质干细胞，在培养中不发育成胚样体。

5.3.4造血胎盘干细胞

在某些实施方案中，分离的胎盘细胞是CD34⁺胎盘细胞，如造血胎盘细胞。然而这种CD34^-细胞不包括在本发明所用的术语“多能”中。这种细胞是从胎盘组织获得的，例如从已经被排干脐血和通过灌流清除残留血液的胎盘。在某些实施方案中，所述CD34⁺分离的胎盘细胞是CD38⁺。在某些实施方案中，所述CD34⁺分离的胎盘细胞是CD38^-。在其它某些实施方案中，所述CD34⁺分离的胎盘细胞是CD45⁺。在一个具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是CD34⁺、CD38^-和CD45⁺。

5.3.5胎盘灌流液细胞

在某些实施方案中，本发明提供的通过本发明提供的方法配制的组合物的细胞，是从胎盘灌流获得的细胞。本发明所用的“从胎盘灌流获得的细胞”包括从胎盘灌流获得例如分离的总有核细胞、从胎盘灌流获得的有核细胞亚群、或者直接从胎盘灌流获得的细胞通过培养或增殖得到的细胞。可以从灌流获得胎盘细胞前已经被排干脐血并经灌流清除残留血液的胎盘获得胎盘灌流液。也可以从已经被排干脐血但没有经灌流清除残留血液的胎盘获得胎盘灌流液。也可以从既没有被排干脐血也没有经灌流清除残留血液的胎盘获得胎盘灌流液。在后两个实施方案中，胎盘细胞，例如从胎盘灌流获得的有核细胞，例如从胎盘灌流总有核细胞，包含从胎盘血液和/或脐带血获得的有核细胞。获得胎盘灌流液的方法和从胎盘灌流液获得的细胞描述在下文的第5.4.4节中。

5.4获得分离的胎盘细胞的方法

5.4.1干细胞收集组合物

本发明进一步提供收集和分离胎盘细胞的方法，例如上文第5.2节所述胎盘细胞的分离。一般来说，这种细胞使用生理学可接受的溶液，例如干细胞收集组合物，从哺乳动物胎盘获得。在相关的美国专利申请公开号2007/0190042，题为“收集胎盘干细胞和保存器官的改良培养基”中详细描述了一种细胞收集组合物。

所述细胞收集组合物可以包含任何生理上可接受的溶液，其适合于收集和/或培养细胞，如本发明所述分离的胎盘细胞，例如盐溶液(如磷酸盐缓冲液，Kreb′s溶液，改良的Kreb′s溶液，Eagle′s溶液，0.9％NaCl等)，培养基(如DMEM，H.DMEM等)，等等。

所述细胞收集组合物可以包含一种或多种易于在收集时间到培养时间期间保存分离的胎盘细胞的成分，即避免分离的胎盘细胞死亡，或延迟分离的胎盘细胞死亡，减少细胞群中分离的胎盘细胞死亡数，等等。这种成分可以是例如凋亡抑制剂(例如胱天蛋白酶抑制剂或JNK抑制剂)；血管扩张剂(如硫酸镁、抗高血压药物、心房利钠肽(ANP)、促肾上腺皮质激素释放激素、硝普钠、肼苯哒嗪、三磷酸腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸镁、磷酸二酯酶抑制剂等)；坏死抑制剂(例如2^-(1H-吲哚^-3基)^-3^-戊基氨基马来酰亚胺、二硫代氨基甲酸吡咯烷、或氯硝西泮)；肿瘤坏死因子-α抑制剂和/或携氧全氟化碳(如全氟辛基溴，全氟癸基溴等)。

所述细胞收集组合物可以包含一种或多种组织降解酶，如金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、RNA酶或DNA酶，等等。这种酶包括但不限于胶原酶(如胶原酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或IV，从Clostridiumhistolyticum获得的胶原酶等)；分散酶、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、释放酶、透明质酸酶，等等。

所述细胞收集组合物可以包含抑菌或杀菌有效量的抗生素。在某些非限制性实施方案中，抗生素是大环内酯类抗生素(如妥布霉素)，头孢菌素(如头孢氨苄、头孢拉定、头孢呋辛、头孢丙烯、头孢克洛、头孢克肟或头孢羟氨苄)，克拉霉素，红霉素，青霉素(如青霉素V)或喹诺酮类(如氧氟沙星、环丙沙星和诺氟沙星)，四环素，链霉素等。在一个具体实施方案中，抗生素对革兰氏(+)和/或革兰氏(-)细菌有效，如绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等等。

所述细胞收集组合物也可以包含一种或多种下列化合物：腺苷(大约1mM至大约50mM)；D-葡萄糖(大约20mM至大约100mM)；镁离子(大约1mM至大约50mM)；分子量大于20000道尔顿的高分子，在一个实施方案中，以足以维持内皮细胞的完整性和细胞活力的量存在(例如以大约25g/l至大约100g/l，或大约40g/l至大约60g/l存在的合成或天然胶、多糖如右旋糖酐、或者聚乙二醇)；抗氧化剂(例如以大约25μM到大约100μM存在的丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、谷胱甘肽、维生素C和维生素E)；还原剂(例如以大约0.1mM至大约5mM存在的N-乙酰半胱氨酸)；防止钙离子进入细胞的试剂(如以大约2μM至大约25μM存在的维拉帕米)；硝酸甘油(例如大约0.05g/l至大约0.2g/l)；抗凝血剂，在一个实施方案中，以足以有助于防止残血凝固的量存在(如以大约1000单位/l至大约100000单位/l存在的水蛭素或肝素)；或者含阿米洛利的化合物(如以大约1.0μM到大约5μM存在的阿米洛利、乙基异丙基阿米洛利、环己阿米洛利、二甲基阿米洛利或异丁基阿米洛利)。

5.4.2胎盘的收集和处理

一般来说，人胎盘在出生后脱落后不久即回收。在优选的实施方案中，在病人知情同意后，建立病人的完整病历并与胎盘建立关联后回收胎盘。优选地，分娩后继续填写病历。此病历可以用来调整胎盘或由此收获的干细胞的后续使用。例如人类胎盘干细胞可以根据病历用于与胎盘有关的婴儿，或婴儿的父母，兄弟姐妹或其它亲属的个体化用药。

在回收分离的胎盘细胞之前，除去脐带血和胎盘血。在某些实施方案中，分娩后，胎盘中的脐带血被回收。胎盘可以经过常规的脐带血回收处理。通常用针或导管在重力作用下抽出胎盘血(参见，例如Anderson，美国专利号5,372,581；Hessel等人，美国专利号5,415,665)。针或导管通常放置在脐静脉中，可轻轻按摩胎盘，以帮助从胎盘排出血。这种脐血回收可以商业化，例如LifeBankUSA，CedarKnolls，N.J.，ViaCord，CordBloodRegistryandCryocell。优选地，胎盘不需要进一步处理而自重排干，将脐血回收中组织裂解减小到最少。

通常情况下，胎盘从分娩或出生室转移到另一位置，例如实验室，通过例如灌流或组织裂解回收脐血和收集干细胞。胎盘优选地在无菌、绝热的运输设备中运输(维持胎盘温度在20-28℃之间)，例如通过夹住近脐带端，将胎盘置于无菌拉链塑料袋中，然后置于绝热容器中。在另一实施方案中，胎盘在基本上如美国专利号7,147,626描述的脐血收集工具中运输。优选地，胎盘在分娩后四到二十四小时内运至实验室。在某些实施方案中，在脐带血回收前，优选在插入胎盘4-5cm(厘米)内夹住近脐带端。在其它实施方案中，在脐血回收后但在进一步处理胎盘之前夹住近脐带端后。

收集细胞前，胎盘可在无菌条件下和室温下或5至25℃(摄氏度)的温度下储存。在灌流胎盘以除去残留的脐带血之前胎盘可以存储4至24个小时、长至48小时、或比48小时更长的时间。在一个实施方案中，胎盘在脱落后大约零小时至大约两小时之间收获。胎盘优选地在5至25℃(摄氏度)的温度下储存于抗凝血剂溶液中。合适的抗凝血剂溶液是本领域众所周知的。例如可以使用肝素或华法林钠的溶液。在优选的实施方案中，抗凝血剂包含肝素溶液(例如1％w/w1∶1000的溶液)。放血的胎盘优选地在收集胎盘细胞之前储存不超过36小时。

哺乳动物的胎盘或其一部分，一旦按上述方法收集和制备，可以用任何本领域已知的方式处理，例如灌流或裂解，例如用一种或多种组织裂解酶消化，获得分离的胎盘细胞。

5.4.3胎盘组织的物理裂解和消化酶

在一个实施方案中，干细胞通过物理裂解哺乳动物胎盘的所有部分而收集。例如胎盘或其一部份可被，例如粉碎、剪切、切碎、切块、剁碎、泡软等。然后培养组织以获得分离的胎盘细胞群。通常情况下，胎盘组织在例如在胎盘细胞收集组合物中裂解(参见第5.2节和下文)。

胎盘在物理裂解和/或酶消化和回收干细胞之前可以被分割为各部分。胎盘干细胞可以从羊膜、绒毛膜、脐带、胎盘小叶、或其任意组合的全部或部分，包括从整个胎盘获得。优选地，分离的胎盘细胞从包括羊膜和绒毛膜的胎盘组织获得。通常情况下，分离的胎盘细胞可以通过裂解一小块胎盘组织获得，例如体积为大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或大约1000立方毫米的胎盘组织小块。任何物理裂解的方法都可以使用，只要该裂解方法能使所述器官中多个，优选地大多数，更优选地至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、或99％的细胞存活，通过例如台盼蓝拒染实验确定细胞存活。

干细胞一般可在胎盘脱落后前三天的任何时间内从胎盘或其一部分收集，但优选地在脱落后大约8小时和大约18小时之间收集。

在一个具体实施方案中，被裂解的组织在适合分离的胎盘细胞增殖的组织培养基中培养(例如参见下文第5.5节，描述了分离的胎盘细胞的培养)。

在另一具体实施方案中，分离的胎盘细胞通过物理裂解胎盘组织而收集，其中物理裂解包括酶消化，它可以通过使用一种或多种组织消化酶完成。胎盘或其一部份也可经物理裂解和用一种或多种酶消化，并将由此产生的物质然后浸泡在或混合到细胞收集组合物中。

优选的细胞收集组合物包含一种或多种组织裂解酶。优选地采用酶组合进行酶消化，例如基质金属蛋白酶和中性蛋白酶的组合，例如胶原蛋白酶和分散酶的组合。在一个实施方案中，胎盘组织的酶消化采用基质金属蛋白酶、中性蛋白酶和粘液溶解酶的组合来消化透明质酸，如胶原酶、分散酶和透明质酸酶或释放酶(Boe小时ingerMannheimCorp.，Indianapolis，Ind.)与透明质酸酶的组合。可用于裂解胎盘组织的其它酶包括木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、丝氨酸蛋白酶、如胰蛋白酶、糜蛋白酶、或弹性蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以抑制血清α2微球蛋白，因此用于消化的介质通常无血清。EDTA和DNA酶常用于酶消化过程中，以增加细胞回收效率。优选稀释消化液，以避免粘性消化液困住细胞。

可以使用任意组合的组织消化酶。典型的组织消化酶的浓度包括，例如50-200U/mL胶原酶I和胶原酶IV、1-10U/mL的分散酶、和10-100U/mL的弹性蛋白酶。蛋白酶可以组合使用，即在同一消化反应中用两种或两种以上的蛋白酶，或者顺序使用两种或两种以上的蛋白酶以释放胎盘细胞，例如胎盘干细胞和胎盘多能细胞。例如在一个实施方案中，胎盘或其一部分首先用合适量的胶原酶I以大约1至2mg/ml消化，例如30分钟，然后在37℃用胰蛋白酶以大约0.25％的浓度消化，例如10分钟。丝氨酸蛋白酶优选地在其它酶后连续使用。

在另一实施方案中，在用胎盘细胞收集组合物分离胎盘细胞之前，还可以加入螯合剂进一步裂解组织，例如向胎盘细胞收集组合物、或裂解和/或消化组织的溶液中加入螯合剂，例如乙二醇双(2-氨基乙醚)-N，N，N′，N′，-四乙酸(EGTA)或乙二胺乙酸(EDTA)。

消化后，消化产物用培养基洗涤，例如三次，洗净的细胞接种到培养瓶。细胞然后经差速贴壁分离并鉴定特征，例如活力、细胞表面标志物、分化能力等等。

将理解，在包含胎儿和母体细胞的整个胎盘或部分胎盘(例如包含绒毛膜或小叶的部分胎盘)中，收集的胎盘细胞包含来自胎儿和母体来源的胎盘细胞混合物，例如胎盘干细胞或胎盘多能细胞。在不含或者包含忽略不计的母体细胞的胎盘部分中，收集的胎盘细胞几乎只包含胎儿胎盘细胞，如或胎儿胎盘干细胞或胎儿胎盘多能细胞。

胎盘细胞可以通过差速胰蛋白酶消化从组织中分离(见下文5.4.5)，接着在一种或多种新培养容器中的新鲜增殖培养基中培养，可选的进行第二个差速胰蛋白酶消化步骤。

5.4.4胎盘灌流

胎盘细胞，例如胎盘干细胞或胎盘多能细胞，也可以通过灌流哺乳动物的胎盘获得。哺乳动物细胞胎盘的灌流方法公开在，例如Hariri，美国专利号7,045,148和7,255,729，以及相关的美国专利公开号2007/0190042，每一项都整体并入本发明。

胎盘干细胞可以通过，使用例如细胞收集组合物作为灌流溶液灌流例如胎盘血管来收集。在一个实施方案中，使灌流溶液通过脐动脉或脐静脉或同时通过二者来灌流哺乳动物胎盘。灌流溶液通过胎盘的流动可利用，例如流入胎盘的重力完成。优选地，利用外力，例如蠕动泵使灌流溶液通过胎盘。脐静脉可以用，例如导管进行插管，如TEFLON或塑料导管，其连接到一个无菌连接器，如无菌管。无菌连接器连接到灌流集流腔。

在灌流准备中，胎盘优选地以这样的方式定位(如悬挂)，其中脐动脉和脐静脉在胎盘的最高点位置。可以使灌流溶液流过胎盘血管和周围组织对胎盘进行灌流。也可以使灌流溶液流入脐静脉对胎盘进行灌流并从脐动脉收集灌流液，或使灌流溶液流入脐动脉进行灌流并从脐静脉收集灌流液。

在一个实施方案中，例如脐动脉和脐静脉同时连接到，例如吸管，其通过软连接器连接到灌流溶液储存器。灌流溶液流入脐静脉和动脉。灌流溶液排出血管壁和/或通过血管壁进入到胎盘的周围组织，从胎盘表面收集到一个合适的开放容器，胎盘表面在妊娠期间与母体的子宫接触。灌流溶液也可引入脐带开口，并允许从连接母体子宫壁的胎盘壁开口流出或渗出。通过此方法收集的胎盘细胞，可称为“盘”法，通常是胎儿和母体细胞的混合物。

在另一实施方案中，灌流溶液通过脐静脉和在脐动脉收集，或者通过脐动脉和在脐静脉收集。用这种方法收集的胎盘细胞，可称为“闭合回路”法，通常几乎仅仅是胎儿的胎盘细胞。

将理解，使用盘法进行的灌流，即在灌流液从胎盘的母体侧流出后收集灌流液，产生胎儿和母体细胞的混合物。因此，通过该方法收集的细胞包括胎儿与母体来源的胎盘干细胞的混合群。相反，仅仅通过闭环法中的胎盘脉管系统进行的灌流，使灌流液体通过一条或两条胎盘脉管，并只通过剩余的脉管收集灌流液体，其结果是收集了几乎仅仅胎儿来源的胎盘干细胞群。

在一个实施方案中，闭环灌流方法可以如下进行。出生后大约48小时获得分娩后胎盘。夹紧脐带，并在夹子上面切口。脐带可以丢弃，或可以进行处理以回收例如脐带干细胞，和/或加工脐带膜用于生产生物材料。灌流期间可保留羊膜，或可以从绒毛膜中分离羊膜，例如用手指进行钝器剖解。如果在灌流之前，从绒毛膜中分离羊膜，羊膜可以，例如丢弃，或处理，例如以通过酶消化来获得干细胞，或生产例如羊膜生物材料，例如美国申请公开号2004/0048796中描述的生物材料。清理完胎盘的所有可见的血块和残余血液以后(例如使用消毒纱布)，脐带脉管暴露，例如通过部分切割脐带膜以暴露脐带的横截面。确定脉管，并开口，例如通过推进闭合的弹簧夹通过每个脉管的切口末端。连接到灌流设备或螺形压缩泵的装置，例如塑料管，随后被插入到每条胎盘动脉中。泵可以是适于该用途的任何泵，例如螺形压缩泵。连接到无菌收集储存器(例如血药袋如250mL收集药袋)的塑料管随后被插入到胎盘静脉中。可选地，与泵连接的管被插入到胎盘静脉中，而与收集储存器连接的管被插入到一条或两条胎盘动脉中。然后胎盘用大量的灌流溶液，例如大约750ml的灌流溶液来灌流。然后通过例如离心来收集灌流液中的细胞。

在另一实施方案中，灌流，例如以收集胎盘灌流液细胞，按如下进行。含有胎盘血的胎盘利用，例如蠕动泵，仅通过胎盘血管泵入无菌0.9％NaCl(例如大约750mL)进行灌流，所得灌流液收集在收集药袋中。通过离心，例如大约420克离心，从灌流液收集细胞，然后除去过剩的上清液(NaCl、血浆、抗凝血剂)。然后将羟乙基淀粉加入到灌流细胞中得到30％的稀释液。灌流细胞然后置入血浆提取器例如大约一小时以分离红细胞。得到的血浆和有核细胞从收集药袋分离，并再次放入血浆提取器。剩下的细胞以最终体积大约20毫升重悬在5％人血清白蛋白中。加入预混的DMSO/PLASMALYTEA(1∶1v/v)获得大约24毫升体积。得到的细胞冷冻保存。在此方法的具体实施方案中，从中得到灌流液的胎盘在灌流收集胎盘细胞前排干脐带血，但不灌流。在另一具体实施方案中，从中获得灌流液的胎盘在灌流收集胎盘细胞前排干脐血，并灌流以清除残留血液。

在一个实施方案中，灌流期间夹住脐带近端，优选地在脐带插入胎盘的4-5cm(厘米)内夹住。

用于收集胎盘细胞的灌流液的体积，可根据要收集的细胞数目、胎盘大小、来源于单个胎盘的收集物的数目等等而改变。在不同的实施方案中，灌流液的体积可以为50mL到5000mL、50mL到4000mL、50mL到3000mL、100mL到2000mL、250mL到2000mL、500mL到2000mL、或750mL到2000mL。一般，放血之后，胎盘用700-800mL的灌流液进行灌流。

胎盘可以在超过几个小时或几天的时间内灌流多次。当胎盘要灌流多次时，胎盘可以在无菌条件下在容器或其它适合的容器中保持或培养，并用细胞收集组合物或标准的灌流溶液(例如常用盐溶液如磷酸盐缓冲盐水(“PBS”))进行灌流，所述标准的灌流溶液含有或没有抗凝血剂(例如肝素、华法林钠、香豆素、双香豆素)、和/或含有或没有抗微生物剂(例如β-巯基乙醇(0.1mM)；抗生素如链霉素(例如40-100μg/ml)、青霉素(例如40U/ml)、两性霉素B(例如0.5μg/ml)。在一个实施方案中，分离的胎盘保持或培养一段时间，而不收集灌流液，以便在灌流和收集灌流液之前，保持或培养胎盘1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24小时，或者2或3天或更多天。灌流的胎盘可以保持一段或多段另外的时间，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个小时，并用例如700-800mL灌流液进行第二次灌流。胎盘可以灌流1、2、3、4、5或更多次，例如每1、2、3、4、5或6小时一次。在优选的实施方案中，可重复灌流胎盘和收集灌流溶液，例如干细胞收集组合物，直到回收的有核细胞的数目降到100细胞/ml之下。不同时间点的灌流液可以进一步分别处理，以回收时间依赖性细胞群，例如干细胞。也可以合并来自不同时间点的灌流液。在优选的实施方案中，干细胞在胎盘娩出后的大约8小时到大约18小时之间收集一次或多次。

优选地，灌流导致收集的胎盘干细胞显著多于哺乳动物胎盘不用所述溶液灌流而且不经另外处理(例如通过组织裂解，如酶消化)而获得的细胞数。在这里，“显著多于”指至少多10％。灌流产生的胎盘干细胞显著多于例如从培养胎盘或其部分的培养基中所获得的胎盘细胞数。

胎盘细胞可以用包含一种或多种蛋白酶或其它组织裂解酶的溶液对胎盘进行灌流而分离。在具体的实施方案中，将胎盘或其部分(例如羊膜、胞衣和绒毛膜、胎盘小叶或绒毛叶、脐带，或任何上述的组合)置于25-37℃下，并在200mL培养基中用一种或多种组织裂解酶孵育30分钟。从灌流液中收集细胞，置于4℃下，并用包含5mMEDTA、2mM二硫苏糖醇和2mMβ-巯基乙醇的冷冻抑制混合物洗涤。数分钟后，用冷却的(例如4℃)干细胞收集组合物洗涤细胞。

5.4.5胎盘干细胞的分离，分选和表征

分离的胎盘细胞，例如上述第5.3节所述细胞，无论是通过灌流或物理裂解如酶消化获得的，可通过Ficoll梯度离心从其它细胞中进行初步纯化(即分离)。这种离心可以按照离心速度等任何标准方案来进行。在一个实施方案中，例如从胎盘中收集的细胞是通过室温下5000×g离心15分钟而从灌流液中回收的，这样的离心从例如污染碎片和血小板中分离出细胞。在另一实施方案中，胎盘灌流液浓缩到大约200ml，在Ficoll中轻轻地分层，并在22℃以大约1100×g离心20分钟，收集低密度的中间层细胞用于进一步地处理。

细胞沉淀可以在新鲜的干细胞收集组合物，或适于干细胞保持的培养基，例如含有2U/ml肝素和2mMEDTA的IMDM无血清培养基(GibcoBRL，NY)中，进行重悬。总的单核细胞成分可使用例如Lymphoprep(NycomedPharma，Oslo，Norway)，根据制备商的推荐方法来进行分离。

通过灌流或消化获得的胎盘细胞可以，例如通过差速胰蛋白酶消化，使用例如带有0.2％EDTA的0.05％胰蛋白酶溶液(Sigma，St.LouisMO)进行进一步，或初步地分离。差速胰蛋白酶消化是可能的，因为胎盘干细胞一般在大约5分钟内从塑料表面分离，而其它贴壁细胞群一般需要超过20-30分钟孵育。胰蛋白酶消化和使用例如胰蛋白酶中和溶液(TNS，Cambrex)的胰蛋白酶中和之后，可以收获脱附的胎盘干细胞。在分离贴壁细胞的实施方案中，例如大约5-10×10⁶细胞的等分试样置于每个T-75培养瓶中，优选纤粘连蛋白涂被的T75培养瓶。在这样的实施方案中，细胞可以用商业可获得的间充质干细胞生长培养基(MSCGM)(Cambrex)来培养，并置于组织培养孵育箱中(37℃，5％CO₂)。10到15天以后，非贴壁细胞通过用PBS洗涤从培养瓶中除去。然后用MSCGM代替PBS。优选每天检验培养瓶中存在的不同贴壁细胞类型，特别是，成纤维样细胞簇的鉴定和扩增。

从哺乳动物胎盘收集的细胞的数量和类型可以例如使用标准细胞检测技术如流式细胞仪、细胞分选、免疫细胞化学(例如用组织特异性的或细胞标记特异性的抗体进行染色)、荧光激活的细胞分选(FACS)、磁激活细胞分选(MACS)、通过使用光学或共焦显微镜技术检验细胞的形态学，和/或通过使用本领域公知的技术，如PCR和基因表达分布图，测量基因表达的改变来进行监控。也可以使用这些技术，来鉴定对于一种或多种特定标记呈阳性的细胞。例如使用抗CD34的抗体，使用上述的技术，可以确定细胞是否包含可检测数量的CD34；倘若如此，则细胞是CD34⁺。同样，如果细胞产生足以通过RT-PCR检测的OCT-4RNA，或显著多于成人细胞的OCT-4RNA，则细胞是OCT-4⁺。细胞表面标记抗体(例如CD标记如CD34)和干细胞特异基因的序列如OCT-4，是本领域公知的。

胎盘细胞，尤其是已经通过Ficoll分离、差异性贴壁、或它们的组合的方法分离的细胞，可以使用荧光激活细胞分选仪(FACS)进行分选。荧光激活细胞分选(FACS)是基于颗粒的荧光特性用于分离颗粒包括细胞的一种公知方法(Kamarch，1987，MethodsEnzymol，151：150-165)。单个颗粒中荧光部分的激光激发产生少量的电荷，其允许混合物的阳性和阴性颗粒的电磁分离。在一个实施方案中，细胞表面标记特异性抗体或配体用独特的荧光标记进行标记。细胞通过细胞分选仪进行处理，其允许基于它们与使用的抗体的结合能力来分离细胞。FACS分选的颗粒可以直接放置到96孔或384孔板的单个孔中，以便于分离和克隆。

在一种分选方案中，来自胎盘的细胞，例如胎盘干细胞和胎盘多能细胞，可根据标记物CD34、CD38、CD44、CD45、CD73、CD105、OCT-4和/或HLA-G的表达来进行分选。这可以结合根据干细胞在培养中的附着特性选择干细胞的方法来完成。例如可以在基于标记表达的分选之前或之后，完成附着选择干细胞。在一个实施方案中，例如细胞首先基于它们的CD34的表达来分选；保留CD34^-细胞，且CD200⁺、HLA-G⁺细胞被从所有其它的CD34^-细胞中分离开。在另一实施方案中，来自胎盘的细胞是根据它们CD200和/或HLA-G标记的表达；例如显示这些标记中的任何一种的细胞被分离用于进一步的应用。表达例如CD200和/或HLA-G的细胞，在具体的实施方案中，可以根据它们的CD73和/或CD105、或抗体SH2、SH3或SH4识别的抗原表位的表达，或缺乏CD34、CD38或CD45的表达，来进行进一步地分选。例如在一个实施方案中，胎盘细胞通过CD200、HLA-G、CD73、CD105、CD34、CD38和CD45的表达或缺乏来分选，并且CD200⁺、HLA-G⁺、CD73⁺、CD105⁺、CD34^-、CD38^-和CD45^-的胎盘细胞被从其它的胎盘细胞中分离出用于进一步地应用。

关于抗体介导的检测和胎盘干细胞的分选，例如胎盘干细胞和胎盘多能细胞，可以将对特定标记具有特异性的任何抗体与适用于细胞检测和分选(例如荧光激活细胞分选)的任何荧光团或其它的标记联合使用。结合于特定标记的抗体/荧光团包括但不限于，异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的抗HLA-G的单克隆抗体(可获自Serotec，Raleigh，NorthCarolina)、CD10(可获自BDImmunocytometrySystems，SanJose，Califomia)、CD44(可获自BDBiosciencesPharmingen，SanJose，California)和CD105(可获自R&DSystemsInc.，Minneapolis，Minnesota)；藻红蛋白(PE)偶联的抗CD44、CD200、CD117和CD13的单克隆抗体(BDBiosciencesPharmingen)；藻红蛋白^-Cy7(PECy7)偶联的抗CD33和CD10的单克隆抗体(BDBiosciencesPharmingen)；别藻蓝蛋白(APC)偶联的链霉亲和素和抗CD38的单克隆抗体(BDBiosciencesPharmingen)；和生物素化的CD90(BDBiosciencesPharmingen)。可以使用的其它抗体包括但不限于，CD133-APC(Miltenyi)、KDR^-生物素(CD309，Abeam)、细胞角蛋白K^-Fitc(Sigma或Dako)、HLAABC-Fitc(BD)、HLADRDQDP-PE(BD)、β-2-微球蛋白-PE(BD)、CD80-PE(BD)和CD86-APC(BD)。

可以使用的其它抗体/标记组合包括，但不限于，CD45-PErCP(peridin叶绿素蛋白)；CD44-PE；CD19-PE；CD10^-F(荧光素)；HLA-G-F和7-氨基-放线菌素-D(7-AAD)；HLA-ABC-F；等等。

本发明提供的分离的胎盘细胞可以使用，例如藻红蛋白-Cy5(PECy5)偶联的链霉亲和素，以及生物素偶联的抗CD117或CD133的单克隆抗体来分析胎盘干细胞的CD117或CD133；然而，使用该系统，由于背景相对较高，细胞可显示出分别对CD117或CD133呈阳性。

本发明所述分离的胎盘细胞可以用单个标记的抗体进行标记、检测和/或分选。胎盘细胞也可以用不同标记的多种抗体同时进行标记。

在另一实施方案中，磁珠可用于分离细胞。细胞可使用磁激活细胞分选(MACS)技术来分选，其为一种根据其结合磁珠(0.5-100μm直径)的能力来分离颗粒的方法。可以对磁性微球进行各种有用的修饰，包括共价添加能特异性识别特定细胞表面分子或半抗原的抗体。然后将珠子与细胞混合以允许结合。然后使细胞通过磁场，以分离出具有特定细胞表面标记的细胞。在一个实施方案中，这些细胞然后可被分离，并与抗另外细胞表面标记的抗体偶联的磁珠重新混合。使细胞再次通过磁场，分离结合两种抗体的细胞。然后把这种细胞稀释到独立的盘中，如用于纯系分离的微量滴定盘。

分离的胎盘细胞也可以根据细胞形态和生长特性来进行表征和/或分选。例如分离的胎盘细胞可以表征为具有培养中的成纤维样形态，和/或根据培养中的成纤维样形态进行选择。分离的胎盘细胞还可以表征为具有形成胚样体的能力，和/或根据它们形成胚样体的能力进行选择。在一个实施方案中，例如具有成纤维样形状，表达CD73和CD105，并在培养中产生一个或多个胚样体的分离的胎盘细胞被从其它胎盘细胞中分离。在另一实施方案中，在培养中产生一个或多个胚样体的OCT-4⁺胎盘细胞被从其它的胎盘细胞中分离。

在另一实施方案中，分离的胎盘细胞可通过检测集落形成单位来鉴定和表征。集落形成单位的检测是本领域公知的，如MESENCULTTM培养基(StemCellTechnologies，Inc.，VancouverBritishColumbia)。

可以使用本领域已知的标准技术，如台盼蓝拒染实验、荧光素二乙酸酯吸收实验、碘化吡啶吸收实验(用于测定活力)；和胸腺嘧啶核苷吸收实验、MTT细胞增殖实验(用于测定增殖)，来测定分离的胎盘细胞的活力、增殖潜能和寿命。可通过本领域公知的方法，如通过测定在延长的培养中群倍增的最大数量来测定寿命。

分离的胎盘细胞也可以使用本领域已知的其它技术从其它胎盘细胞中分离，例如选择性生长(正选择)需要的细胞，选择性裂解(负选择)不需要的细胞；基于混合群中不同细胞的凝集性进行分离，例如利用大豆凝集素；冻融法；过滤；常规和区带离心法；离心洗脱(逆流离心)；单位重力分离；逆流分配；电泳；等等。

5.5分离的胎盘细胞的培养

5.5.1培养基

分离的胎盘细胞、或分离的胎盘细胞群、或从中生长出胎盘干细胞的细胞或胎盘组织，可用于起始或接种细胞培养物。细胞一般转入到无菌的组织培养容器中，其未包被或包被有胞外基质或配体如层粘连蛋白、胶原蛋白(例如天然的或者变性的)、明胶、纤粘连蛋白、鸟氨酸、玻连蛋白和胞外膜蛋白(例如MATRIGEL(BDDiscoveryLabware，Bedford，Mass.))。

分离的胎盘细胞可在本领域公认的适用于培养细胞，例如干细胞的任何培养基和任何条件下进行培养。优选地，培养基包含血清。分离的胎盘细胞可以培养在例如DMEM-LG(Dulbecco′s改良的基本培养基，低葡萄糖)/MCDB201(鸡成纤维细胞基础培养基)，其包含ITS(胰岛素转铁硒蛋白)、LA+BSA(亚油酸-牛血清白蛋白)、右旋糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF、IGF-1和青霉素/链霉素；包含1％至20％胎牛血清(FBS)的DMEM-HG(高葡萄糖)；包含15％FBS的DMEM-HG；包含10％FBS、10％马血清和氢化可的松的IMDM(Iscove′s改良的Dulbecco′s培养基)；包含10％FBS、EGF和肝素的M199；包含10％FBS、GLUTAMAX^TM和庆大霉素的α-MEM(最低必需培养基)；包含10％FBS、GLUTAMAX^TM和庆大霉素的DMEM，等等。

可用于培养胎盘细胞的其它培养基，包括DMEM(高或低葡萄糖)、Eagle’s基础培养基、Ham’sF10培养基(F10)、Ham’sF-12培养基(F12)、Iscove’s改良的Dulbecco’s培养基、间充质干细胞生长培养基(MSCGM)、Liebovitz’sL-15培养基、MCDB、DMEM/F12、RPMI1640、改进的DMEM(Gibco)、DMEM/MCDB201(Sigma)、和CELL-GROFREE。

培养基可以补充一种或多种组分，包括例如血清(例如胎牛血清(FBS)，优选大约2-15％(v/v)；马属(马)血清(ES)；人血清(HS))；β-巯基乙醇(BME)，优选大约0.001％(v/v)；一种或多种生长因子，例如血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)、血管内皮生长因子(VEGF)、和促红细胞生成素(EPO)；氨基酸，包括L-缬氨酸；和一种或多种用于控制微生物污染的抗生素和/或抗霉菌剂，如例如青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素，单独或其组合。

分离的胎盘细胞可以在标准组织培养条件下，例如在组织培养皿或多孔板中进行培养。分离的胎盘细胞也可以使用悬滴法来培养。在这种方法中，分离的胎盘细胞以大约1×10⁴细胞/ml悬浮在大约5mL的培养基中，一滴或多滴上述培养基置于组织培养容器例如100mL培养皿的盖内。液滴可以是，单滴，或例如来自多道移液管的多滴。小心地反转盖子，并置于培养皿底的顶部，培养皿中包含足以保持培养皿大气中水汽含量的液体，例如无菌PBS，并培养干细胞。

在一个实施方案中，分离的胎盘细胞在用于保持分离的胎盘细胞中未分化表型的化合物存在下培养。在具体的实施方案中，所述化合物是取代的3，4-二氢嘧啶并[4，5-d]嘧啶。在更具体的实施方案中，所述化合物是具有下列化学结构的化合物：

所述化合物可以以例如大约1μM到大约10μM之间的浓度与分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群进行接触。

5.5.2胎盘细胞的扩增和增殖

一旦获得分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群(例如这样的胎盘细胞或胎盘细胞群，其与至少50％在体内通常与干细胞或干细胞群混合的胎盘细胞相分离)，该细胞或细胞群可以在体外增殖和扩增。例如可以在组织培养容器，例如培养皿、培养瓶、多孔板等等中，培养足够长时间使细胞增殖到70-90％融合，即，直到所述细胞和其后代占据组织培养容器的70-90％的培养表面积。

分离的胎盘细胞可以以允许细胞生长的密度接种到培养容器中。例如可以以低密度(例如大约1,000到大约5,000细胞/cm²)到高密度(例如大约50,000或更多个细胞/cm²)接种细胞。在优选的实施方案中，细胞在含有大约0％到大约5％体积CO₂的空气存在下培养。在一些优选的实施方案中，细胞培养于含有大约2％到大约25％O₂的空气中，优选含有大约5％到大约20％O₂的空气中。细胞优选培养于大约25℃到大约40℃下，优选37℃。细胞优选培养于孵育箱中。培养基可以是静态的或摇动的，例如使用生物反应器。胎盘细胞，例如胎盘干细胞或胎盘多能细胞，优选生长于低氧化应激下(例如添加谷胱甘肽、抗坏血酸、过氧化氢酶、生育酚、N-乙酰半胱氨酸，等等)。

一旦获得小于大约100％融合，例如70％-90％融合，所述细胞可以进行传代。例如所述细胞可用本领域公知的技术进行酶处理，如胰蛋白酶化，从组织培养表面分离下来。移液移取细胞后计数，大约10,000-100,000细胞/cm²，优选大约50,000细胞/cm²被传代到包含新鲜培养基的新培养容器中。通常，所述新培养基是与从中移取分离的胎盘细胞的培养基相同类型的培养基。所述胎盘细胞群可以传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20次或更多次。

胎盘细胞库的制备

来自产后胎盘的分离的细胞，例如所述第5.3节所述分离的胎盘细胞，可以用许多不同的方式培养，以产生一系列批次的分离的胎盘细胞，例如一系列个体化给药剂量的胎盘细胞。这些批次可以，例如从来自胎盘灌流液的细胞或来自酶消化的胎盘组织的细胞获得。从多个胎盘获得的胎盘细胞的批次组，可以置于分离的胎盘细胞的库中，用于例如长期储存。一般来说，组织培养塑料贴壁胎盘细胞从胎盘材料的初始培养物获得，以形成种子培养物，其在受控条件下扩增，从大约相等数量的倍增物形成细胞群。各批次优选来源于单个胎盘的组织，但是也可以来源于多个胎盘的组织。

在一个实施方案中，如下获得胎盘细胞批次。胎盘组织首先例如通过切碎进行解离，用适合的酶例如胶原酶消化(参见上述5.4.3节)。胎盘组织优选包括，例如来自一个胎盘的全部羊膜、全部绒毛膜，或两者，但是也可以仅仅包括羊膜或绒毛膜部分。消化的组织培养例如大约1-3周，优选大约2周。除去非贴壁细胞以后，形成的高密度集落例如通过胰蛋白酶消化收集。收集这些细胞，并重悬于适当体积的培养基中，然后用于接种扩增培养。扩增培养可以是任意排列的独立细胞培养装置，例如通过NUNC^TM的细胞工厂。细胞可以细分到任何程度，以便用例如1×10³、2×10³、3×10³、4×10³、5×10³、6×10³、7×10³、8×10³、9×10³、1×10⁴、2×10⁴、3×10⁴、4×10⁴、5×10⁴、6×10⁴、7×10⁴、8×10⁴、9×10⁴或10×10⁴个干细胞接种扩增培养物。优选地，从大约1×10³到大约1×10⁴个细胞/cm²用于接种每一扩增培养物。扩增培养物的数量依赖于从中获得所述细胞的具体胎盘，在数量上可以更多或更少。

扩增培养物生长直到培养物中细胞的密度达到某个值，例如大约1×10⁵细胞/cm²。此时可以收集和冷藏细胞，或者传代到如上所述新扩增培养物中。使用之前，细胞可以传代，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。在扩增培养期间优选保留群倍增累积数的记录。所述细胞可以扩增2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40倍增，或高达60倍增。但优选地，在把细胞分为单独剂量之前，群倍增数为大约15到大约30。细胞可以在整个扩增过程中被连续培养，或者在扩增期间的一个或多个点被冷冻。

用于单独剂量的细胞可以被冷冻，例如冷冻保存用于以后使用。单独的剂量可以包含，例如每毫升大约1百万到大约5千万个细胞，而且可以包含总计大约10⁶到大约10¹⁰个细胞。

在一个实施方案中，因此，胎盘细胞库可由包括以下步骤的方法制备：从人分娩后的胎盘扩增原代培养胎盘细胞至第一个多个群倍增物；冷冻保存所述胎盘细胞以形成主细胞库；扩增来自主细胞库的多个胎盘细胞至第二个多个群倍增物；冷冻保存所述胎盘细胞以形成工作细胞库；扩增来自工作细胞库的大量胎盘细胞至第三个多个群倍增物；和以单独剂量冷冻保存所述胎盘细胞，其中所述单独剂量共同组成胎盘细胞库。在另一具体实施方案中，所述原始培养胎盘细胞包含来自胎盘灌流液的胎盘细胞。在另一具体实施方案中，所述原始培养胎盘细胞包含来自消化的胎盘组织的胎盘细胞。在另一具体实施方案中，所述原始培养胎盘细胞包含来自胎盘灌流液和来自消化的胎盘组织的胎盘细胞。在另一具体实施方案中，所述胎盘干细胞原始培养物中的所有所述胎盘干细胞来自于同一胎盘。在另一具体实施方案中，所述方法进一步包括，从来自所述工作细胞库的所述多个所述胎盘细胞中选择CD200⁺或HLA-G⁺胎盘细胞或CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺以形成单独剂量。在另一具体实施方案中，所述单独剂量包括大约10⁴到大约10⁵个胎盘细胞。在另一具体实施方案中，所述单独剂量包括大约10⁵到大约10⁶个胎盘细胞。在另一具体实施方案中，所述单独剂量包括大约10⁶到大约10⁷个胎盘细胞。在另一具体实施方案中，所述单独剂量包括大约10⁷到大约10⁸个胎盘细胞。在另一具体实施方案中，所述单独剂量包括大约10⁸到大约10⁹个胎盘细胞。在另一具体实施方案中，所述单独剂量包括大约10⁹到大约10¹⁰个胎盘细胞。

如本发明所述制备含胎盘细胞(例如胎盘干细胞或胎盘多能细胞)的组合物的方法，可以被合并到上述构建胎盘细胞库的任何步骤中。在一个实施方案中，主细胞库制备后，以及从所述主细胞库制备一个或多个工作细胞库期间，或从所述工作细胞库扩增胎盘细胞期间，制备药物组合物。例如可以从工作细胞库解冻和培养多个倍增群的胎盘细胞。在一个实施方案中，当产生所需数量的细胞时，或已经产生所需数量的群倍增，可以收集胎盘细胞，例如通过离心，并重悬浮于包含例如右旋糖酐40的溶液，例如5.5％的右旋糖酐40。在某些实施方案中，第二次收集胎盘干细胞和重悬浮于包含右旋糖酐和冷冻保护剂的溶液中，例如包含10％HSA和5％DMSO的5.5％右旋糖酐40溶液。冷冻保存的胎盘细胞在例如临用前解冻，例如在上述第5.2节所述组合物最终产生前临时解冻。

制备包含胎盘细胞例如胎盘干细胞或胎盘多能细胞的组合物的上述方法，可在制备和/或使用胎盘细胞库时使用一次，例如在冷冻保存胎盘细胞时，或者例如在胎盘细胞在最终冷冻保存前用来制备单独剂量时，以及在向个体给药前解冻时。

在优选的实施方案中，从其获得胎盘的供体(例如母体)被检测至少一个病原体。如果母体对所测病原体呈阳性，则丢弃来自该胎盘的整个批次。这种检测可以在生产胎盘细胞批次期间的任何时候进行，包括建立起始细胞培养物之前或之后，或者扩增培养期间。检测是否存在的病原体可非限制性地包括：甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、人类免疫缺陷性病毒(I型和II型)、巨细胞病毒、疱疹病毒，等等。

5.6胎盘细胞的保存

分离的胎盘细胞，例如上述第5.2节所述分离的胎盘多能细胞，在例如收集期间或者制备(例如用本发明所述方法)本发明所述组合物之前，可以进行保存，即，将其置于允许长期储存的条件下或抑制细胞死亡(由例如凋亡或坏死导致)的条件下。

胎盘细胞可以使用例如包含凋亡抑制剂、坏死抑制剂和/或携氧全氟化碳的组合物来保存，如相关的美国申请公开号2007/0190042中所述，其公开整体并入本发明作为参考。在一个实施方案中，保存用于本发明包含细胞的组合物中的细胞群的方法，包括使所述细胞群与含有凋亡抑制剂和含氧全氟化碳的细胞收集组合物接触，相较于没有与凋亡抑制剂接触的细胞群而言，其中所述凋亡抑制剂以足以降低或防止所述细胞群中的凋亡量和时间存在。在具体实施方案中，所述凋亡抑制剂是半胱氨酸蛋白酶抑制剂。在另一具体实施方案中，所述凋亡抑制剂是JNK抑制剂。在更具体实施方案中，所述JNK抑制剂不调节所述细胞的分化或增殖。在另一实施方案中，所述细胞收集组合物包括不同相中的所述凋亡抑制剂和所述含氧全氟化碳。在另一实施方案中，所述细胞收集组合物包括溶于乳液中的所述凋亡抑制剂和所述含氧全氟化碳。在另一实施方案中，细胞收集组合物另外包括乳化剂，例如卵磷脂。在另一实施方案中，在接触细胞时，所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳为大约0℃到大约25℃。在另一个更具体实施方案中，在接触细胞时，所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳为大约2℃到10℃，或大约2℃到大约5℃。在另一个更具体实施方案中，所述接触在转运所述细胞群期间进行。在另一个更具体实施方案中，所述接触在冻融所述细胞群期间进行。

胎盘细胞群可以，例如通过包括使所述细胞群与含有凋亡抑制剂和器官保存化合物接触来保存，相较于没有与凋亡抑制剂接触的细胞群而言，其中所述凋亡抑制剂以足以降低或防止所述细胞群中的凋亡量和时间存在。在具体实施方案中，器官保存化合物是UW溶液(记载于美国专利号4,798,824中；也称为ViaSpan；也参见Southard等，Transplantation49(2)：251-257(1990))，或Stern等的美国专利号5,552,267中记载的溶液。在另一实施方案中，所述器官保存化合物是羟乙基淀粉、乳糖酸、棉子糖或其组合。在另一实施方案中，所述细胞收集组合物另外包括两相中的或乳液状的含氧全氟化碳。

在所述方法的另一实施方案中，在灌流期间，使胎盘干细胞与包含凋亡抑制剂和含氧全氟化碳、器官保存化合物，或其组合的细胞收集组合物接触。在另一实施方案中，在组织裂解例如酶消化过程期间，使其与所述细胞接触。在另一实施方案中，在通过灌流收集以后，或通过组织裂解例如酶消化收集以后，胎盘细胞与所述细胞收集化合物接触。

通常，在胎盘细胞收集、富集和分离期间，优选将由于低氧和机械应力而产生的细胞应激最小化或消除。因此，在所述方法的另一实施方案中，在所述保存过程中，在收集、富集或分离期间，细胞或细胞群暴露于低氧条件小于6小时，其中低氧条件是氧浓度低于正常的血氧浓度。在更具体实施方案中，在所述保存过程中，所述细胞群暴露于所述低氧条件小于2小时。在另一个更具体实施方案中，收集、富集或分离期间，所述细胞群暴露于所述低氧条件小于1小时，或小于30分钟，或不暴露于低氧条件。在另一具体实施方案中，收集、富集或分离期间，所述细胞群不暴露于剪切应力下。

胎盘细胞可以用一般方法或本发明所公开的特定方法冷冻保存。在一个实施方案中，用于冷冻保存胎盘细胞的冷冻保护剂是DMSO。在另一实施方案中，冷冻保护剂是丙二醇，例如大约1.5M的丙二醇。冷冻保护剂也可以是例如甘油、乙二醇、多酚(例如大约30至大约120ppm)等，在其它实施方案中，冷冻保护剂是胎牛血清、人血清，或与DMSO、海藻糖、右旋糖酐中的一种或多种结合的人血清白蛋白。在一个具体实施方案中，冷冻保护剂是人血清、DMSO、和海藻糖，或者是胎牛血清和DMSO。在某些实施方案中，胎盘细胞冷冻保存在小容器如安瓿中的冷冻保存介质中。胎盘细胞优选在冷冻保存期间以大约1℃/min冷却。优选的冷冻保存温度为大约-80℃到大约-180℃，优选大约-125℃到大约-140℃。解冻使用之前，冷冻保存的细胞可以移入液氮中。在一些实施方案中，例如一旦安瓿瓶已经达到约-90℃，则它们移入液氮储存区域。冷冻保存也可以使用控制速率的冷冻机来进行。冷冻保存的细胞优选在大约25℃到大约40℃，优选大约37℃的温度下解冻。

5.7含细胞组合物

5.7.1包含胎盘细胞的组合物

本发明例如第5.3节中所述胎盘细胞可以包含一种或多种胎盘细胞，例如本发明所述胎盘干细胞或胎盘多能细胞，其中所述细胞从胎盘例如人类胎盘分离。在另一具体实施方案中，任何上述组合物包含一种基质。在一个更具体的实施方案中，所述基质是三维支架。在另一更具体的实施方案中，所述基质包含胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、果胶、鸟氨酸、或玻璃粘连蛋白。在另一个更具体的实施方案中，所述基质是羊膜或羊膜源性生物材料。在另一个更具体的实施方案中，所述基质包含细胞外膜蛋白。在另一个更具体的实施方案中，所述基质包含合成化合物。在另一个更具体的实施方案中，所述基质包含生物活性化合物。在另一个更具体的实施方案中，所述生物活性化合物是生长因子、细胞因子、抗体、或低于5000道尔顿的有机分子。

在另一实施方案中，本发明提供的组合物，例如药物组合物中有用的组分，包含由任何上述胎盘细胞或任何上述胎盘细胞群条件化的培养基。在一个具体实施方案中，任何这样的组合物包含不是来自胎盘的干细胞。在一个更具体的实施方案中，所述干细胞是胚胎干细胞。在另一个更具体的实施方案中，所述干细胞是间充质干细胞。在另一个更具体的实施方案中，所述干细胞是骨髓干细胞。在另一个更具体的实施方案中，所述干细胞是造血祖细胞。在另一个更具体的实施方案中，所述干细胞是成体干细胞。在一个更具体实施方案中，所述成体干细胞是神经干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、血管内皮干细胞、心脏干细胞或肌肉干细胞。

5.7.1.1药物组合物

分离的胎盘细胞群，或包含所述胎盘细胞的细胞群包含在药物组合物中，或者是药物组合物的成分。分离的胎盘细胞可以制成容易向个体给药的形式，例如胎盘灌流液细胞或分离的胎盘细胞，其装入适合医用的容器中。这种容器可以是例如注射器、无菌包装药袋、细口瓶、广口瓶或其它容器，胎盘干细胞群可以很容易从中分配。例如容器可以是血液药袋或其它塑料袋，适合于向受试者静脉注射的医学上可接受的药袋。在某些实施方案中，所述容器允许冷冻保存分离的胎盘细胞群。

在一个实施方案中，所述容器是一个有利于或允许执行一个或多个本发明所述方法的步骤的容器。例如制备含细胞组合物的方法包括，例如步骤(a)，使所述细胞与包含右旋糖酐和人血清白蛋白(HSA)的溶液接触，以产生含细胞溶液；(b)过滤该溶液；(c)用包含右旋糖酐的第一稀释溶液稀释所述细胞至大约1至50×10⁶、1到40×10⁶、1至30×10⁶、1至20×10⁶、1至15×10⁶、或1至10×10⁶个细胞每毫升；和(d)用包含右旋糖酐但不含HSA的第二稀释溶液稀释所述细胞，所述细胞例如分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞可以放入一个容器中，例如在步骤(c)和(d)之间，其中该容器是一个有利于冷冻保存和/或有利于递送该细胞到需要该细胞的个体等的容器。在某些实施方案中，所述稀释是稀释到不超过15×10⁶细胞每毫升。在某些实施方案中，所述稀释是稀释到不超过10±3×10⁶细胞每毫升。在其它某些实施方案中，如果细胞数少于10±3×10⁶细胞每毫升，过滤是可选的。

例如所述分离的胎盘细胞可以在例如药袋，如血液药袋或类似的药袋中冷冻保存和解冻，并最终在同一药袋中稀释。在另一个实施方案中，制备含细胞组合物的方法包括，例如(a)离心多个细胞，例如胎盘灌流液细胞或分离的胎盘细胞，以收集细胞；(b)在5.5％右旋糖酐40中重悬该细胞；(c)离心该细胞以收集细胞；(d)在包含10％HSA的5.5％右旋糖酐40溶液中重悬该细胞；(e)通过70μM到100μM的过滤器过滤该细胞；(f)在5.5％右旋糖酐40、10％HSA和5％DMSO中稀释该细胞至不超过大约10±3×10⁶细胞/mL；(g)冷冻保存该细胞；(h)解冻该细胞；及(i)用10％右旋糖酐40以1∶1到1∶11稀释该细胞，以产生所述药物组合物，将该细胞置于一个容器中，所述容器在步骤(e)后的任何步骤中例如有利于冷冻保存和/或向需要该细胞的个体施用该细胞。在某些实施方案中，步骤(f)所述稀释是稀释到大约1到50×10⁶、1到40×10⁶、1至30×10⁶、1至20×10⁶、1至15×10⁶、或1至10×10⁶细胞每毫升。在某些实施方案中，步骤(f)所述稀释是稀释到不超过15×10⁶细胞每毫升。在其它某些实施方案中，如果细胞数少于10±3×10⁶细胞每毫升，过滤是可选的。在一个具体实施方案中，例如细胞，如分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞，可在过滤后置于所述容器中，然后在所述容器中稀释、冷冻保存、解冻、和/或在向个体给药前最终稀释。

本发明提供的组合物例如药物组合物中分离的胎盘细胞，可以是来自单一供体或多个供体的胎盘细胞。所述分离的胎盘细胞可以与预期的接受者完全地HLA匹配，或者部分或完全地HLA-不匹配。

因此，在一个实施方案中，本发明提供的组合物中的分离的胎盘细胞给需要它的个体给药。在一个具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞以肌肉内、皮内，腹腔内，动脉内，皮下，静脉内或眼内给药。在一个实施方案中，本发明提供的组合物中分离的胎盘细胞以包含该分离的胎盘细胞的容器内组合物的形式向需要它的个体给药。在另一具体实施方案中，容器是药袋、细口瓶、或广口瓶。在更具体的实施方案中，所述药袋是无菌塑料袋。在更具体的实施方案中，所述药袋适于、允许或便于所述分离的胎盘细胞群的静脉内给药，例如静脉注射或推注等。所述药袋可以包括多个腔或间隔，其是互相连通的，以允许所述分离的胎盘细胞在施用之前或施用期间与一种或多种其它溶液，例如药物混合。在另一具体实施方案中，在冷冻保存之前，包含所述分离的胎盘细胞的溶液还包含一种或多种有利于冷冻保存细胞的化合物。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞群包含在生理学可接受的水性溶液中。在更具体的实施方案中，所述生理学可接受的水性溶液是0.9％NaCl溶液。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞包含与所述细胞群的受试者HLA匹配的胎盘细胞。在另一具体实施方案中，所述组合的细胞包含与所述细胞群的受试者至少部分HLA不匹配的胎盘细胞。在另一具体实施方案中，所述胎盘细胞来源于多个供体。

所述药物组合物中的分离的胎盘细胞可以是本发明所述任何分离的胎盘细胞。在一个具体实施方案中，本发明所述分离的胎盘细胞是置于容器中的CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺细胞。在一个具体实施方案中，本发明所述分离的胎盘细胞是置于容器中的CD200⁺、HLA-G⁺细胞。在另一具体实施方案中，本发明所述分离的胎盘细胞是置于容器中的CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺细胞。在另一具体实施方案中，本发明所述分离的胎盘细胞是置于容器中的CD200⁺、OCT-4⁺细胞。在另一具体实施方案中，本发明所述分离的胎盘细胞是置于容器中的CD73⁺、CD105⁺细胞，其中，当在允许形成胚样体的条件下与胎盘细胞群一起培养时，所述细胞有利于形成一个或多个胚样体。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是已冷冻保存并置于容器中的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G⁺细胞。在另一具体实施方案中，所述分离的胎盘细胞是置于容器中的OCT-4⁺细胞，其中，当在允许形成胚样体的条件下与胎盘细胞群一起培养时，所述细胞有利于形成一个或多个胚样体。在任何上述胎盘细胞的具体实施方案中，所述容器是药袋。

在各具体实施方案中，所述容器包含大约、至少或至多1×10⁶个分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞、5×10⁶个分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞、1×10⁷个分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞、5×10⁷个分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞、1×10⁸个分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞、5×10⁸个分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞、1×10⁹个分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞、5×10⁹个分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞、或1×10¹⁰个分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞。在其它实施方案中，各实施方案中的单一剂量单位的分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞可以包含大约、至少或不超过1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹或更多分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞。在其它实施方案中，分离的的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞的容器或剂量包含1×10⁵到5×10⁵分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞、5×10⁵到1×10⁶分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞、1×10⁶到5×10⁶分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞、5×10⁶到1×10⁷分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞、1×10⁷到5×10⁷分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞、5×10⁷到1×10⁸分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞、1×10⁸到5×10⁸分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞、5×10⁸到1×10⁹分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞、1×10⁹到5×10⁹分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞、5×10⁹到1×10¹⁰分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞、1×10¹⁰到5×10¹⁰分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞、5×10¹⁰到1×10¹¹分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞，或更多分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞。在优选的实施方案中，所述药物组合物包含足量的分离的胎盘细胞或胎盘灌流液细胞，以向受试者施用大约2×10⁷至大约10×10⁷细胞每千克。

在任何上述冷冻保存的细胞群的其它具体实施方案中，所述细胞已经传代大约、至少或不超过5次，不超过10次，不超过15次，或不超过20次。在任何上述冷冻保存的细胞群的另一具体实施方案中，所述细胞已经在所述容器中扩增。

包含本发明所述胎盘干细胞的药物组合物可以包含本发明其它部分所述任何分离的胎盘细胞群或其组合。所述药物组合物可以包含胎儿、母体、或二者的胎盘细胞，例如胎盘干细胞或胎盘多能细胞。本发明提供的药物组合物还可以包含从单一个体或胎盘获得的，或者从多个个体或胎盘获得的分离的胎盘细胞。

本发明提供的药物组合物包含50％或以上的活细胞(即细胞群中至少50％的细胞是功能性的或活的)的细胞群。优选地，所述细胞群中至少60％的细胞是活的。更优选地，所述药物组合物的细胞群中至少70％、80％、90％、95％、或99％的细胞是活的。

在一个实施方案中，所述药物组合物包含基本上或完全是非母体来源的分离的胎盘细胞，即其具有胎儿基因型，例如至少大约90％、95％、98％、99％、或大约100％是非母体来源。例如在一个实施方案中，药物组合包含分离的胎盘细胞群，这些细胞群是CD200⁺和HLA-G⁺；CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺；CD200⁺和OCT-4⁺；CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺；CD73⁺和CD105⁺，并且当所述胎盘细胞群在允许形成胚样体的条件下培养时，有利于在包含所述分离的胎盘细胞群的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；或OCT-4⁺，并且当所述胎盘细胞群在允许形成胚样体的条件下培养时，有利于在包含所述分离的胎盘细胞群的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；或者上述各项的组合，其中至少70％、80％、90％、95％或99％的所述分离的胎盘细胞是非母体来源。在另一实施方案中，药物组合物包含分离的胎盘细胞群，该细胞群是CD10⁺、CD105⁺和CD34^-；CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺和CD34^-；CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-，以及CD90⁺或CD45^-中的至少一种；CD10⁺、CD90⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-和CD45^-；CD10⁺、CD90⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-和CD45^-；CD200⁺和HLA-G⁺；CD73⁺、CD105⁺、和CD200⁺；CD200⁺和OCT-4⁺；CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺；CD73⁺和CD105⁺，并且当所述胎盘细胞群在允许形成胚样体的条件下培养时，有利于在包含所述分离的胎盘细胞群的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；或OCT-4⁺，并且当所述胎盘细胞群在允许形成胚样体的条件下培养时，有利于在包含所述分离的胎盘细胞群的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；或者CD117^-、CD133^-、KDR^-、CD80^-、CD86^-、HLA-A，B，C⁺、HLA-DP，DQ，DR^-、和/或PDL1⁺中的一种或多种；或者上述的组合，其中至少70％、80％、90％、95％或99％的所述分离的胎盘细胞非母体来源。在一个具体实施方案中，所述药物组合物还包含不是从胎盘获得的干细胞。

本发明提供的药物组合物可以包含一种或多种例如有利于植入移植物(例如抗T细胞受体抗体、免疫抑制剂等)的化合物；稳定剂如白蛋白、右旋糖酐40、明胶、羟乙基淀粉、勃脉力(Plasmalyte)，等等。

5.7.2包含造血胎盘细胞或胎盘灌流液细胞的组合物

在本发明提供的组合物的某些实施方案中，所述分离的胎盘细胞是CD34⁺胎盘干细胞，如造血胎盘细胞或祖细胞胎盘。这种细胞可从胎盘组织获得，例如从已经排干脐血和灌流以清除残留血液的胎盘获得。在某些实施方案中，CD34⁺胎盘干细胞是CD38⁺。在某些实施方案中，CD34⁺分离的胎盘细胞是CD38^-。在其它某些实施方案中，CD34⁺分离的胎盘细胞是CD45⁺。在一个具体实施方案中，CD34⁺分离的胎盘细胞是CD3⁺、CD38^-和CD45⁺。在某些实施方案中，细胞是造血细胞。在一个更具体实施方案中，胎盘CD34⁺细胞是造血细胞。在某些实施方案中，CD34⁺细胞或造血细胞从胎盘灌流获得。在某些实施方案中，CD34⁺细胞或造血细胞经酶消化或物理裂解胎盘组织获得。CD34⁺细胞及造血细胞可从单个胎盘或者从多个胎盘获得。

在某些实施方案中，本发明提供的通过本发明提供的方法配制的组合物中的细胞，是从胎盘灌流获得的细胞。本发明所用“从胎盘灌流获得的细胞”包括从胎盘灌流液获得的，例如分离的总有核细胞，从胎盘灌流液获得的有核细胞亚群，或者从胎盘灌流液直接获得的细胞经培养或增殖的细胞。胎盘灌流液可以在灌流以获得胎盘细胞之前从已经排干脐血和经灌流以清除残血的胎盘获得。胎盘灌流液可以从已经排干脐血和但没有经灌流以清除残血的胎盘获得。胎盘灌流液可以从既没有排干脐血又没有经灌流以清除残血的胎盘获得。在后两个实施方案中，胎盘细胞包含来自胎盘血液和/或脐带血的有核细胞，例如来自胎盘灌流液的有核细胞，例如来自胎盘灌流液的总有核细胞。胎盘灌流液细胞可从单个胎盘或从多个胎盘获得。

5.7.3永生化胎盘细胞株

哺乳动物胎盘细胞可以通过用包含生长促进基因的任何适合载体转染而有条件地永生化(生长促进基因也即编码在合适的条件下促进转染细胞生长的蛋白的基因)，由此生长促进蛋白的生产和/或活性可由外界因素调控。在优选的实施方案中，生长促进基因是致癌基因如，但不限于，v-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40大T抗原、多瘤大T抗原、Ela腺病毒或人乳头瘤病毒的E7蛋白。

生长促进蛋白的外部调节可通过把生长促进基因置于外部调控启动子的控制下而实现，例如其活性可通过如改变转染细胞的温度或与细胞接触的培养基的组成来调控的启动子。在一个实施方案中，可以应用四环素(tet)调控基因表达系统(参见，Gossen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5547-5551，1992；Hoshimaru等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：1518-1523，1996)。在缺乏tet的情况下，载体内的tet调控的反式激活因子(tTA)强烈激活从ph_CMV*-1的转录，其是一种来自与tet操纵子序列融合的人巨细胞病毒的最小启动子。tTA是大肠杆菌转座子-10来源的tet抗性操纵子抑制物(tetR)与单纯疱疹病毒VP16的酸性结构域的融合蛋白。低无毒浓度的tet(例如0.01-1.0μg/mL)几乎完全消除了tTA的反式激活。

在一个实施方案中，所述载体进一步包含编码选择标记，例如提供耐药性的蛋白的基因。细菌新霉素抗性基因(neo^R)是一种可用于本发明的这种标记。携带neo^R的细胞可通过本领域普通技术人员已知的方法筛选，如添加例如100-200μg/mLG418到生长培养基中。

可通过本领域普通技术人员已知的各种方法进行转染，其包括但不限于，逆转录病毒感染。通常，细胞培养物可通过与从载体制备细胞株收集的条件培养基和包含N2添加物的DMEM/F12的混合物孵育而进行转染。例如如上所述制备的胎盘细胞培养物，可以在例如体外5天以后，通过在一倍体积的条件培养基和两倍体积的包含N2添加物的DMEM/F12中孵育大约20小时来进行感染。然后如上所述选择携带选择标记的转染细胞。

转染以后，培养物转移到容许增殖的表面上，例如允许至少30％的细胞在24小时内倍增。优选地，所述底物是聚鸟氨酸/层粘连蛋白基质，其由包被有聚鸟氨酸(10μg/mL)和/或层粘连蛋白(10μg/mL)的组织培养塑料、聚赖氨酸/层粘连蛋白底物、或纤粘连蛋白处理的表面组成。然后每3-4天为培养物提供生长培养基，其可以添加或不添加一种或多种增殖增强因子。当培养物小于50％融合时，可以添加增殖增强因子到生长培养基中。

当80-95％融合时，条件化永生化的胎盘细胞株可以使用标准技术，如通过胰蛋白酶消化进行传代。在一些实施方案中，直至大约第二十次传代，有益于保持选择(通过，例如添加G418到包含新霉素抗性基因的细胞)。细胞也可以冷冻在液氮中用于长期贮存。

可以从如上所述制备的条件化永生化的人胎盘细胞株中分离克隆细胞株。通常，可使用标准技术，如通过有限次稀释或使用克隆环，来分离这种纯系细胞株并进行扩增。纯系细胞株一般可如上所述来培养和传代。

条件化永生化的人胎盘细胞株(可以但是不必是克隆的)一般可通过在促进分化的培养条件下，通过抑制生长促进蛋白的生成和/或活性进行诱导分化。例如如果编码生长促进蛋白的基因处于外部调控启动子的控制下，可以改变条件，例如温度或培养基的组成，以抑制生长促进基因的转录。对于上述讨论的四环素调控基因表达系统，可通过添加四环素以抑制生长促进基因的转录而实现分化。通常，使用1μg/mL四环素4-5天足以起始分化。为了促进进一步分化，生长培养基中可以包含另外的试剂。

5.7.4试剂盒

另一方面，本发明进一步提供用于制备和/或施用本发明的含分离的胎盘细胞的组合物的试剂盒。

在一个实施方案中，本发明提供的试剂盒包括在独立的容器内的一种或多种包含右旋糖酐，例如右旋糖酐40的溶液，包含人血清白蛋白(HSA)和冷冻保护剂的溶液。在一个具体实施方案中，所述试剂盒包含多个分离的胎盘细胞，例如冷冻保存的分离的胎盘细胞。在一个具体实施方案中，所述试剂盒包括一个盛有含5.5％右旋糖酐40(w/v)和10％HSA(w/v)的溶液的容器。在另一具体实施方案中，所述试剂盒包含一个盛有含5.5％右旋糖酐40、10％HSA和5％DMSO的溶液的容器。在另一具体实施方案中，所述试剂盒包含一个包含10％右旋糖酐40的容器。

在另一实施方案中，所述试剂盒包括一个过滤器或多个过滤器，适合于过滤细胞悬浮液。在具体的实施方案中，所述试剂盒中的一个或多个过滤器包含大约50μM直径至大约150μM直径之间的孔。在更具体的实施方案中，所述过滤器是70μM过滤器。在另一具体实施方案中，所述过滤器是100μM过滤器。

在另一实施方案中，所述试剂盒包括一个或多个玻璃器具或塑料器具，适合于制备或使用本发明所述组合物。例如所述试剂盒可以包括，例如一个适合于冷冻保存或稀释或转移细胞悬液的塑料袋，例如分离的胎盘细胞悬液。在另一个实施方案中，所述试剂盒包括：(1)多个分离的胎盘细胞，例如胎盘干细胞或胎盘多能细胞，例如在一个或多个小瓶中；(2)足够培养例如2-3代所述分离的胎盘细胞的塑料器具；(3)一个盛有包含5.5％右旋糖酐40(w/v)和10％HSA(w/v)的溶液的容器；(4)一个盛有包含5.5％右旋糖酐40、10％HSA和5％DMSO的溶液的容器；(5)一个盛有包含10％右旋糖酐40溶液的容器；及(6)一个或多个具有大约50μM直径至大约150μM直径之间的孔的过滤器，其中所述过滤器适合过滤含细胞溶液。

6.实施例

6.1实施例：制备包含分离的胎盘细胞的可施用组合物的改进方法

本实施例阐述在冷冻保存前和后配制人CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺分离的胎盘细胞，以制备均匀的、高活力的分离的胎盘细胞以给人或动物施用。所制备的组合物包含具有高活力和解冻后至少4小时内没有大的细胞团块的分离的胎盘细胞。一项小鼠急性给药研究表明，用下述的最终制剂经静脉输注给药，NOD/SCID小鼠耐受的最大剂量是至少1.5百万细胞每只鼠(假设平均重量20克，大约75百万细胞每千克)，没有任何心脏或肺毒性(可由呼吸困难、转圈和共济失调证实)，以及高达250百万细胞每千克皮下给药，比以前的制剂有改进。然而下面的实施例描述了表达特定表面标志物的分离的胎盘细胞的制剂，本发明的结果表明，所述方法和制剂可以与其它细胞例如表达不同表面标志的哺乳动物细胞一起使用，并且相容。

细胞团块分析

细胞团块(聚积体)被分为大的细胞团块或微细胞团块。大的细胞团块和微细胞团块，如果存在，根据下列方法确定。

大的细胞团块分析

细胞在37℃水浴的容器中解冻，直到只有一小片冰留在容器中。细胞用装有16号针头的注射器从容器中解冻，并且将细胞从容器分配到50mL锥形管中。过目测评估是否存在大的细胞团块。

微细胞团块分析

计数细胞以确定细胞浓度。细胞然后用10％右旋糖酐40稀释至4×10⁶细胞/ml，将50μL细胞、40μL10％右旋糖酐40、和10μL40μM的测量珠溶液加入到1.7mL离心管中。将管内的成分轻轻混匀。将10微升混合样品放在载玻片上并盖上盖玻片。计数所有包含三个或更多细胞的微细胞团块。

使用的胎盘细胞最初从包含贴壁胎盘细胞群的细胞库中获得，如本发明所述，贴壁胎盘细胞群在冷冻保存前传代4^-6代。

体内注射相容缓冲液，比较两种不同的分离的胎盘细胞株的使用数据表明，补充了1％人血清白蛋白(HSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)、勃脉力A(PlasmalyteA)和Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基(DMEM)都能够在解冻5小时后维持高的细胞活力。缓冲液中的最终细胞浓度为25×10⁶细胞/毫升。勃脉力A在缓冲液测试中能够最高促进细胞活力。如表10a和表10b表明，解冻后高活力维持了数小时；而且，解冻3小时后标称性表型没有改变。解冻后的制剂中细胞活力在细胞通过26号针头后无明显影响。由于使用小样品体积，在这两个实验中不可能测定细胞团块。

根据表1a和1b的数据，解冻后制剂最后被确定如下：细胞在37℃水浴中解冻，立即用解冻缓冲液(2.5％HSA+右旋糖酐40)以1∶1稀释。然后以400g离心细胞5分钟，并悬浮细胞在勃脉力A+1％HSA中。

表1a：不用注射器/针头测试，在勃脉力A+1％HSA中解冻后胎盘细胞的细胞活力和表型

	0小时	1小时	3小时	5小时
					活力	98.0％	97.1％	92.4％	93.8％
CD105⁺/200⁺	84.3％		87.9％

表1b：用注射器/针头测试，在勃脉力A+1％HSA中解冻后胎盘细胞的细胞活力和表型

	0小时	1小时	3小时	5小时
					活力	98.0％	97.2％	93.7％	97.3％
CD105⁺/200⁺	87.3％		87.3％

小鼠生物分布研究

上述解冻后的制剂应用于实验小鼠的生物分布研究。在解冻后的细胞制备过程中尤其是加入勃脉力后，观察到了大细胞团块。用这种细胞制备，在每只小鼠两次重复静脉注射50万每次共1百万细胞(大约20g)剂量中观察到急性肺毒性反应。这两种现象促使进一步研究胎盘细胞制剂。

根据实验小鼠生物分布研究中的现象，在加入勃脉力后诱导产生大的细胞团块，但右旋糖酐40不诱导产生大的细胞团块，右旋糖酐40作为稀释介质与勃脉力A、HSA和PBS一起用于这一研究。

表2：在解冻后4小时的细胞团块分级，较低的数字表明团块较少。

预先在勃脉力A+10％HSA+5％DMSO中冷冻的细胞，在37℃水浴中解冻，并分别用各种缓冲液以1∶7稀释。表2的数据显示在介质测试中含HSA的右旋糖酐40诱导最少的细胞团块。

解冻后立即观察各制剂中的细胞聚积。增加一个过滤步骤消除了细胞聚积，其中解冻后的细胞通过100μM过滤器过滤。测试对两个胎盘细胞批次进行过滤与特定稀释溶液结合的效果。当用10％右旋糖酐40以1∶1稀释细胞，在解冻后4小时期间，过滤后没有没有形成大细胞团块。参见表3a-3c。另外，活力保持很高。在几个不同的胎盘细胞批次观察到类似的结果。

表3a：大的细胞团块

表3b：右旋糖酐40中过滤后的大细胞团块

	批次1	批次2
			3-5细胞团块(团块/10⁶细胞)	1210	416
5细胞团块(团块/10⁶细胞)	491	119

表3c：在右旋糖酐40和勃脉力A中过滤后的活力

在上述研究的基础上，解冻后配制胎盘细胞简化为以下方法：将细胞在37℃水浴中解冻至3分钟，然后通过100μM过滤器过滤。得到的细胞株然后用10％右旋糖酐40以1∶1(v∶v)稀释。

预冻制剂

在细胞处理的冷冻前相也观察到了细胞团块。对冷冻介质、冷冻细胞密度和混悬过滤步骤进行了研究，以减少和/或消除冷冻前的细胞聚积。

冷冻介质

根据上述在解冻后制剂中右旋糖酐40的成功，将右旋糖酐40与勃脉力作为冷冻介质进行了比较。批次3的细胞以17百万细胞每毫升的浓度在勃脉力A+10％HAS+5％DMSO、或者5％右旋糖酐40+10％HAS+5％DMSO中冷冻。按以下方法评价细胞团块的存在：

表4a：比较勃脉力和右旋糖酐40作为冷冻介质-大细胞团块

表4b：比较勃脉力A和右旋糖酐40作为冷冻介质-大细胞团块

	勃脉力A	右旋糖酐40
			3-5细胞团块(团块/10⁶细胞)	1893	523
＞5细胞团块(团块/10⁶细胞)	929	205

表4c：比较勃脉力A和右旋糖酐40作为冷冻介质-活力

	勃脉力	右旋糖酐40
			解冻后0小时	89.9％	90.8％
解冻后4小时	89.2％	91.3％

在这些实验中应用右旋糖酐40比使用勃脉力A产生更少的大细胞团块、更少的微细胞团块和更高的细胞活力。根据这些结果，右旋糖酐40被选为冷冻介质。

冷冻细胞密度和冷冻前过滤

为了消除大细胞团块和减少微细胞团块，细胞密度和冷冻前过滤检测如下：

表5a：冷冻细胞密度和冷冻前过滤对细胞团块形成的影响。

浓度：细胞每毫升

表5b：冷冻细胞密度和冷冻前过滤对大细胞团块形成的影响

	条件1	条件2	条件3	条件4
					冷冻前过滤	否	是	否	是
解冻后过滤	否	是	否	是

否：没有大细胞团块形成；是：有大细胞团块形成

表5c：冷冻细胞密度和冷冻前过滤对微细胞团块形成的影响(团块每10⁶细胞)

表5b和5c所示的结果清楚地表明，冷冻前过滤消除了解冻后大细胞团块的形成。该数据还表明，高细胞浓度的样品，如20×10⁶细胞/ml，更有可能在解冻后形成微细胞团块。因此，需要进一步考察冷冻细胞密度对细胞团块形成的影响。

表6a：冷冻细胞密度对细胞团块形成的影响。

浓度：细胞每毫升

表6b：冷冻细胞密度对大细胞团块形成的影响

	条件1	条件2	条件3	条件4
					冷冻前	是(1团块)	否	否	否
解冻后0小时	是(3团块)	是(1团块)	否	否
					解冻后4小时	是(3团块)	是(1团块)	否	否

否：没有大细胞团块形成；是：有大细胞团块形成

表6c：冷冻细胞密度对微细胞团块形成的影响(团块每10⁶细胞)

表6b和6c的结果表明以7.5×10⁶/毫升或更低的密度冷冻不诱导解冻后形成大细胞团块。而且，在高达10×10⁶细胞/毫升的浓度，微细胞团块的数量合理的低，不到200微细胞团块/百万细胞。

根据上述结果，冷冻前和解冻后的制剂按如下方法制备。对于冷冻前的制剂，来自液体培养的胎盘细胞以220×g离心5分钟，悬浮于5％右旋糖酐40中至大约7.5×10⁶细胞/ml。细胞以400×g离心10分钟，然后悬浮于6％右旋糖酐40和10％HSA中至大约7.5×10⁶细胞/ml。悬浮细胞然后在重力作用下通过70μM过滤器。过滤的细胞然后用5％右旋糖酐40、10％HSA和5％DMSO稀释至大约7.5×10⁶细胞/ml的浓度。稀释后的细胞置于冷冻袋中冷冻，并在氮气中储存。对于解冻后的制剂，冷冻细胞在37℃水浴中解冻，然后用10％右旋糖酐40以1∶1到1∶5的含细胞缓冲液∶右旋糖酐40的不同体积比进行稀释。

胎盘细胞制剂的评估

1.解冻后无大细胞团块形成

使用上述配制方法制备五批次胎盘细胞(包括下述的批次11及批次12)。在任何该五批次中没有观察到解冻后的大细胞团块，并且微细胞团块数保持很低。

2.对表型没有影响

胎盘细胞的表型没有受到改进制剂的影响。制剂中超过90％的细胞保持CD10⁺、CD34^-、CD105⁺和CD200⁺。

3.GLP小鼠研究

批次12的细胞被用于小鼠生物分布研究。上述制剂中的胎盘细胞通过尾静脉向雄性或雌性NOD^-SCID或者雄性C57BL/10SgSnAi^-Rag2(tmi)γc(tmi)小鼠以单次和/或重复静脉注射给药。小鼠在治疗后4、14、28或47天处死，对肺、肝、心、肾、脾、肾上腺、骨髓、和脑组织样品进行处理，并以Q^-PCR技术分析hTERTDNA序列的存在，hTERT是人类端粒酶逆转录酶基因。静脉内给药后，检测来自给药后4天处死的小鼠肺、脑、心脏和/或肝脏样品中分离的总DNA中的人DNA。在肺部检测出DNA的最高水平。通过静脉输注给药，小鼠能够耐受25-100百万细胞每千克，没有任何心脏或肺毒性。批次11的细胞用于致瘤性小鼠研究。小鼠皮下(SC)给药高达250百万细胞每千克，无不良反应。

6.2实施例2：改进的可施用药组合物

本实施例阐述人多能组织培养塑料贴壁CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘细胞的制剂，其甚至在冷冻保存后仍表现出适合于向人或动物给药的均一性、高细胞活力。所述制剂的细胞聚积形成量平均减少400倍，静脉给药的小鼠模型中最大耐受剂量(MTD)比以前的制剂提高大约3倍(数据未显示)。虽然下面的实施例描述了对表达特定表面标志物的分离的胎盘细胞进行制剂，本发明的结果表明，所述方法和制剂可以被用于其它细胞例如表达不同表面标志的哺乳动物细胞，并且与所述其它细胞相容。

所述制剂(记为“制剂B”)包含具有上述表型的胎盘细胞，其在含有5.5％(w/v)右旋糖酐40、10％(w/v)人血清白蛋白(HSA)和5％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)的溶液中的浓度为10±3×10⁶细胞/mL。本发明使用的HAS、右旋糖酐40均为临床级；DMSO是GMP级。

基于勃脉力的制剂记为“制剂A”，描述在表7中，并且与基于右旋糖酐40的制剂B进行比较。在制备制剂B中，细胞在混悬液中通过70μM筛孔进行过滤，但在制备制剂A中不过滤细胞。

表7：制剂A和制剂B的组合物

	制剂A	制剂B
			细胞浓度	27±8×10⁶细胞/mL	10±3×10⁶细胞/mL
大量赋型剂	勃脉力	5.5％右旋糖酐40盐水
			DMSO浓度	5％(v/v)	5％(v/v)
HSA浓度	10％	10％

当解冻制剂A时观察到了显著的细胞聚积现象，随后的调查表明，大量参数，包括制剂介质的组成和细胞冷冻浓度是导致细胞聚积的主要原因。进行优化研究，专门设计了制剂B以减少或消除这些细胞聚积效应。另外，引入经70μM网过滤该细胞混悬液作为所述方法的一部分，以提供配制过程中细胞混悬液的更好对照。

为了定量制剂中的细胞聚积，设计了过滤保留检测作为开发工具，用来比较由制剂A和制剂B制备的胎盘细胞组合物系列批次。这变得特别关键，因为制剂B中的细胞聚积降低到无法通过肉眼明确辨认的程度。分析制剂A和制剂B的代表批次，表8显示多份样品的比较。所述方法通过过滤器数字成像，定量不同样品保留在过滤器上的预染细胞聚积，并报告聚积体覆盖的过滤器面积(“平均面积”)。如表8所示，制剂B始终具有比制剂A较小的覆盖面积(聚积体)，平均相差400倍。数据还显示出制剂B的良好进程控制和重现性。用于体内研究的两种制剂分离的胎盘细胞组合物批次也显示在表16中。从制剂A到制剂B的变化改进了在体内小鼠模型静脉给药的最大耐受量(MTD)大约3倍(数据未显示)。

表8：解冻后制剂A和制剂B中聚积体的形成

注：“袋”指解冻和测试批次的分离的细胞组合物的药袋数；“过滤器”指该批次的重复分析总数；“平均面积”指该批次的过滤器平均覆盖面积，以像素单位/施加到该过滤器的百万细胞计；“StdDev”＝标准差；“CV”＝变异系数。

6.3实施例3：改良的可施用组合物的表征

本实施例提供进一步表征包含HSA、右旋糖酐40和DMSO的药物制剂。用于下述一个或多个实验中的方法如下：

细胞活力评价：通过台盼蓝拒染实验采用血球计或Vi-Cell细胞活力分析仪(BeckmanCoulter，Fullerton，California)评估活力。活力以细胞总数的活细胞百分比表示。

细胞计数：采用血球计或Vi-Cell细胞活力分析仪(BeckmanCoulter，Fullerton，California)对细胞进行计数。细胞计数以百万细胞每毫升(MM/mL)表示。

细胞聚积：细胞聚积体数采用过滤器保留实验测定(FRA)，其中通过染色细胞，并使它们通过70μM过滤器来测定细胞聚积体数。大于70μM的细胞聚积体不能通过该过滤器，采用Vi-Cell细胞活力分析仪(BeckmanCoulter，Fullerton，California)通过成像分析进行定量。数据以像素每百万加载的细胞(px/MM)表示。

流式细胞仪：细胞通过流式细胞仪评估细胞标记物CD10、CD34、CD105和CD200的水平。数值以细胞对特定标记物的阳性和/或阴性或其组合的百分比表示。

免疫抑制：下述制剂中细胞的免疫抑制活性采用磁珠T细胞反应(BTR)法测定，其测定细胞抑制T细胞对抗原磁珠反应的能力。

虽然下述实施例描述表达特定表面标志物的分离的胎盘细胞制剂，本发明的结果表明，所述方法和制剂可以与与其它细胞，例如表达不同表面标志物的哺乳动物细胞一起使用，并且相容。

6.3.1确定DMSO和右旋糖酐∶HSA比例

本实施例描述各种浓度的HSA、右旋糖酐和DMSO，以及不同比例的右旋糖酐∶HSA对细胞聚积、细胞活力和功能恢复、细胞表型和功能的影响。

实验条件

适合于细胞制剂的三种成分(HSA、右旋糖酐40和DMSO)在图1的三元图所示条件下进行研究。实验条件沿两条轴线进行选择：一种保持右旋糖酐∶HSA的比例不变，以测试不同百分比的DMSO(见下述的制剂1-4)，另一种保持DMSO的百分比不变而改变右旋糖酐∶HSA的比例(见下述的制剂3，5-8)。

方法与材料

大约12百万冷冻保存的CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺胎盘多能细胞在适合每种下述制剂的Nunc^TM10-tray细胞工厂中扩增到大约1.2×10⁸细胞。通过在室温下用0.25％胰蛋白酶/EDTA孵育10分钟收获细胞。解离的细胞被转移到500mL离心管中，其含有250mL在Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基(DMEM)中的2％胎牛血清(FBS)。细胞然后在SorvallRC3BP离心机500毫升离心管中以1040RPM离心。细胞被重悬在0.9％生理盐水/5％右旋糖酐40溶液中。这些细胞然后在1420RPM离心10分钟，然后混悬在10mL以下八种制剂(在制剂3和5-8中，右旋糖酐∶HSA的比例显示为“25％HSA的体积分数”(VFHSA)单位)之一中：

制剂1：20％DMSO，8.5％HSA，4.6％右旋糖酐40

制剂2：10％DMSO，9.5％HSA，5.2％右旋糖酐40

制剂3：5％DMSO，10％HSA，5.5％右旋糖酐40(VFHSA＝0.4)(对照制剂)

制剂4：0％DMSO，10.5％HSA，5.8％右旋糖酐40

制剂5：5％DMSO，HSA0％，9.5％右旋糖酐40(VFHSA＝0)

制剂6：5％DMSO，3.125％HSA，8.25％右旋糖酐40(VFHSA＝0.125)

制剂7：5％DMSO，16.88％HSA，2.75％右旋糖酐40(VFHSA＝0.675)

制剂8：5％DMSO，23.75％HSA，0％右旋糖酐40(VFHSA＝0.95)

这些制剂从以下原溶液制备：100％DMSO(BionichePharma，Belleville，Ontario)，25％HSA(Octapharma，Hoboken，NewJersey)和0.9％生理盐水中的10％右旋糖酐40(Hospira，LakeForest，Illinois)。

过滤器保留实验：细胞聚积体通过使用过滤器保留实验测定。细胞浓度在过滤前调整至大约1.2×10⁷细胞/mL。过滤器负载量(单位过滤器面积的细胞数)保持大约2.4×10⁸细胞/过滤器不变。细胞以7.5×10⁶细胞/mL的浓度在热控制降温仪中冷冻至-70℃。细胞在临用前解冻，而且样品解冻后立即处理。100μL未稀释的细胞混悬液样品解冻后，用900μM磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，使用Vi-Cell细胞活力分析仪(BeckmanCoulter，FuUerton，Califrnia)一式两份进行细胞计数，记录每百万细胞的像素数(较高的像素数表明细胞聚积数较高)。

细胞活力实验(MTS实验)：细胞活力采用CellTiter96非放射性细胞增殖实验(Promega，Madison，Wisconsin)测定。根据生产说明书的指示，细胞在96-孔板中与(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺酸苯基)-2H-四唑)(MTS)和吩嗪硫酸甲酯(PMS)结合，PMS为一种电子耦合试剂。然后测定细胞生物还原MTS产生的甲臜产物在490nm处的吸光度。

膜联蛋白孔板实验：解冻的细胞在膜联蛋白-V标记的溶液中稀释到浓度为1×10⁵细胞/mL(Roche，Cat.No.11828681001)。100μL的细胞混悬液一式三份加入到96孔板中，在室温下避光孵育15分钟。15分钟后，每孔的三个不同位置在明亮视野和荧光下成像(在488nm波长激发和528纳米波长检测)。采用自动细胞计数软件(Axiovision)计数每幅图像的细胞总数。每种条件的凋亡/坏死细胞群通过计数每个位置的膜联蛋白阳性细胞数(荧光成像)并除以每个位置的总细胞数(明亮视野成像)确定。凋亡/坏死的细胞群通过计算3个孔的三个不同位置的平均群来测定。

结果

细胞聚积

在不同百分比浓度的DMSO下，例如0至20％(制剂1-4)，没有观察到细胞的聚积效应，如图2所示。所有DMSO条件显示聚积水平在观察到的对照制剂范围内，所述对照制剂包含5％DMSO、5.5％HSA和10％右旋糖酐40的对照制剂。HSA和右旋糖酐的浓度在5％DMSO的恒定浓度下变化(图3)，从没有HSA(HSA的体积分数＝0)到没有右旋糖酐(HSA的体积分数＝0.95)的范围的条件。在0.125到0.95体积分数的25％HSA(终浓度分别为3.125％至23.75％HSA)下的FRA值显示最小聚积。在HSA存在下观察到的聚积水平等于或低于包含5％DMSO、5.5％HSA和10％右旋糖酐40的对照制剂。

解冻后的活力和功能恢复

在不同百分比的DMSO(0、5、10和20％)下，通过台盼蓝拒染实验使用Vi-Cell自动细胞计数仪测定解冻后的活力(图4)和解冻后的功能恢复(图5)，以评估每个制剂的冷冻保护能力。解冻后活力大于90％的制剂分别包含0％、5％和10％DMSO，在5％DMSO观察到最高值，而包含20％DMSO的制剂活力低于75％。通过MTS实验测定培养重构，在5％DMSO观察到了最大的培养重构(图6)。

在不同体积分数的25％HAS(即不同比例的右旋糖酐∶HAS)下的活力曲线如图7-9所示。通过台盼蓝拒染实验测定，不同体积分数的25％HAS下，解冻后的活力显示从83.5％到98.5范围的值(图7)。最大值在0.40比例的25％HSA，即10％HSA∶5.5％右旋糖酐40时获得。还计算了解冻后细胞的功能恢复，其值在80％至120％的范围，但包含至少0.2体积分数的25％HSA的样品显示从100％到120％范围的值(图8)。如MTS法检测的，培养重构的数据显示与解冻后的活力类似的曲线，最大值发生在0.125体积分数的25％HSA，即3.13％HSA∶8.25％右旋糖酐40(图9)。

台盼蓝活力实验不能检测细胞凋亡。但分析细胞大小分布可以表明细胞健康的变化。为了评估在DMSO存在下冷冻细胞解冻的细胞群中凋亡细胞的百分比，进行解冻后孔板膜联蛋白实验。该实验测定冷冻在0％DMSO中的细胞有51％凋亡，而冷冻在5％DMSO中的细胞有15％凋亡(数据未显示)。

表型和功能

过流式细胞仪测试不同百分比的成分保持细胞CD10⁺、CD34^-CD105⁺、CD200⁺表型的能力通。在制剂2(10％DMSO、9.5％HSA、5.2％右旋糖酐40)，制剂5(5％DMSO、0％HSA、9.5％右旋糖酐40)，制剂6(5％DMSO、3.13％HSA、右旋糖酐408.25％)和制剂7(5DMSO％、16.88％HSA、2.75％右旋糖酐40)中的细胞制剂保持这一表型，基本与对照制剂3近似，具有80.3％和84.5％之间的CD105⁺/CD200⁺值。另外，每种制剂CD10⁺/CD34^-的表达为＞95％。条件1、4和8表明细胞的生理特性变化可能是因为碎片影响流式细胞仪检测。

细胞的功能通过磁珠T细胞反应(BTR)实验进行评价，其可以测量细胞抑制T细胞对抗原磁珠的反应的能力(图10)。制剂6(5％DMSO、3.13％HSA、8.25％右旋糖酐40)和制剂7(5％DMSO、16.88％HSA、2.75％右旋糖酐40)的抑制率与包含5％DMSO、10％HSA和5.5％右旋糖酐40的对照制剂3相比，标准差在1以内。这三个样品具有最高的台盼蓝活力和培养重构值。其它样品具有较低水平的抑制率，通常随MTS降低而减小。

结论：

包含0到20％浓度范围的DMSO的制剂显示与包含5％DMSO、10％HAS、5.5％右旋糖酐40的对照制剂观察到的细胞聚积水平相当。然而，当细胞在包含20％DMSO的制剂中冷冻保存时，细胞活力减少，在0％DMSO中冷冻的细胞解冻后相对于在5％DMSO中冷冻的细胞表现出显着增强的细胞凋亡。对于包含5％和10％DMSO的制剂，还没有CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺表型的明显退化。因此，上述结果表明，优选使用包含5-10％DMSO的制剂，以保持解冻后的细胞活力。

关于各种比例的HSA∶右旋糖酐，包含23.75％HSA、0％右旋糖酐的制剂显示出解冻后活力和培养重构的一定程度减小，而对于包含右旋糖酐∶HSA的比例为：(i)3.13％HSA∶8.25％右旋糖酐；(ii)10％HSA∶5.5％右旋糖酐；及(iii)16.88％HSA∶2.75％右旋糖酐的制剂，解冻后的活力、免疫抑制活性和重构值最高。因此，这些结果表明，相对于包含HSA∶右旋糖酐的比例为10％HSA∶5.5％右旋糖酐40的制剂来说，本发明所述制剂的HSA∶右旋糖酐比例可在定义的范围内变化而不会明显出现解冻后细胞活力丧失、细胞功能恢复丧失，CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺表型退化或免疫抑制活性退化。本发明所述数据支持至少大约6∶1的HSA∶右旋糖酐到大约1∶2.6的HSA∶右旋糖酐比例的工作范围。

6.3.2冷冻细胞密度的影响

本实施例描述了细胞浓度对细胞活力；CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺表型；细胞聚积；和细胞免疫抑制功能的影响，例如冷冻细胞的密度从1-40×10⁶细胞/mL的范围。

材料与方法

CD10⁺、CD34⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞培养3天，收获，离心，和重悬在包含5％DMSO、5.5％右旋糖酐40、10％HSA的制剂中，达到大约3.5×10⁷细胞/mL的浓度，并通过70μM过滤器过滤。过滤后的细胞依次稀释在上述制剂中以产生在无菌包装袋中包含下述细胞密度的样品：1×10⁶细胞/mL、7.5×10⁶细胞/mL、15×10⁶细胞/mL和20×10⁶细胞/mL。分别收获细胞以产生包含4.0×10⁷细胞/mL的单独的细胞样品。4.0×10⁷细胞/mL的细胞样品重悬在5mL包含5％DMSO、5.5％右旋糖酐40、10％HSA的制剂中以达到大约4.6×10⁷细胞/mL的浓度，通过70μM过滤器过滤，并在20mL药袋中用上述制剂稀释至4.0×10⁷细胞/mL。一袋20mL4.0×10⁷细胞/mL的样品，一式两袋20mL的1×10⁶细胞/mL、7.5×10⁶细胞/mL、，15×10⁶细胞/mL和20×10⁶细胞/mL的样品，以及5个280μL的每个样品的小瓶用热控制降温仪冷冻到-70℃。这些样品稍后解冻并进行分析，以确定冷冻浓度对各种细胞特性的影响，包括(1)细胞计数；(2)活力；(3)表型；(4)细胞聚积；(5)潜能。

过滤器保留实验：通过采用过滤器保留实验测定细胞聚积。在过滤前将细胞浓度调整至大约1.2×10⁷细胞/mL。保持过滤器负载(单位过滤面积的细胞数)大约2.4×10⁸细胞/过滤器不变。细胞以7.5×10⁶细胞/mL的浓度在热控制降温仪中冷冻至-70℃冻存。细胞在临用前解冻，并且样品解冻后立即处理。100μL未稀释的细胞悬液样品解冻后，以900μM磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，一式两份使用Vi-Cell细胞活力分析仪(BeckmanCoulter，Fullerton，California)进行细胞计数，记录每百万细胞的像素数(较高的像素数代表较高的细胞聚积体数)。

结果：

细胞计数/活力

来自每个解冻药袋的一到两个1mL样品进行活细胞计数，使用Vi-Cell细胞活力分析仪(BeckmanCoulter，Fullerton，California)根据生产说明书的指示进行细胞计数。所有条件下平均活力保持不变，大约97％。活细胞计数相当于初始冷冻浓度(见下表9)。

表9：Vi-Cell活细胞浓度和活力

冷冻浓度	细胞计数(×10⁶)细胞/mL	活力(％)
			1×10⁶/mL	1.20	98.70
7.5×10⁶/mL	8.32	97.12
			15×10⁶/mL	16.47	97.33
20×10⁶/mL	20.80	97.61

40×10⁶/mL

39.92

96.71

表型

通过流式细胞仪测试了不同细胞密度保持细胞CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺表型的能力。如表10中所述，所述表型在不同的冷冻浓度之间不改变。所有条件下CD200⁺/CD105⁺表达保持在大约86％，CD34^-/CD10⁺的表达保持在大约99％。

表10：CD200⁺/CD105⁺和CD34^-/CD10⁺的表达

冷冻浓度	细胞计数(×10⁶)细胞/mL	活力(％)
			1×10⁶/mL	87.3	98.2
7.5×10⁶/mL	86.7	99.1
			15×10⁶/mL	85.8	99.1
20×10⁶/mL	85.5	98.9
			40×10⁶/mL	86.3	98.5
阴性对照	69.4	98.5
			阳性对照	91.1	98.8

细胞聚积

重复每种条件，通过过滤器保留实验分析确定在不同冷冻浓度下的细胞聚积程度(图11)。重复进行该实验，分析了1×10⁶细胞/mL、7.5×10⁶细胞/mL、15×10⁶细胞/mL和20×10⁶/mL的样品。一个细胞样品一式两份，分析了40×10⁶细胞/mL的样品。在所有细胞密度测试中，40×10⁶细胞/mL的样品产生了最高的细胞聚积信号。所有其它样品均在或低于对照样品观察到的聚积量，该对照样品以7.5×10⁶细胞/mL预先冷冻保存在5％DMSO、5.5％右旋糖酐40、10％HSA中。

此外，另外进行细胞聚积实验，测试以7.5×10⁶细胞/mL和20×10⁶/mL冷冻保存在包含5％DMSO、5.5％右旋糖酐40、10％HSA的制剂中的细胞(图12)。这些额外数据显示在20×10⁶/mL信号增强，表明以20×10⁶/mL冷冻的细胞会得到可变的细胞聚积结果。结果，在此浓度或更高浓度下冷冻的细胞具有聚积增强的趋势。这些数据表明，细胞聚积随细胞浓度的增加而增加，并且密度为20×10⁶mL的冷冻细胞相对于密度为7.5×10⁶/mL的冷冻细胞可能显示出细胞聚积增强。

功能

每个条件的小瓶用于混合淋巴细胞反应(MLR)和磁珠T细胞反应(BTR)实验，以评估在不同细胞密度冷冻的细胞的免疫调节特性，其通过抑制CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的增殖来测定。MLR结果表明15×10⁶细胞/mL和40×10⁶细胞/mL抑制CD4和CD8，尽管在20×10⁶细胞/mL的抑制率与在1×10⁶细胞/mL和7.5×10⁶细胞/mL观察到的相当。然而BTR结果表明，在20×10⁶细胞/mL和40×10⁶细胞/mL对CD4和CD8的抑制减少。

表11：MLR和BTR结果-与缺乏胎盘干细胞的T细胞活性相比的T细胞活性百分比

结论：

上述结果表明，细胞活力和CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺表型没有作为冷冻细胞密度的函数而改变。然而，以20×10⁶细胞/mL的密度冷冻保存的细胞表明细胞聚积可变的增加，以及免疫抑制活性可变的增加，而以40×10⁶细胞/mL的密度冷冻保存的细胞表现出细胞聚积的持续增加和免疫抑制活性的持续增加。因此，虽然细胞可在本发明所述制剂中以高达，例如40×10⁶细胞/mL的密度配制，且细胞活力或者表现出CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺表型的细胞数量没有明显下降，但优选冷冻细胞密度在1.0-15×10⁶细胞/mL的范围，以最大程度减小解冻后的细胞聚积。

6.3.3右旋糖酐分子量的影响

本实施例描述了不同分子量的右旋糖酐，如右旋糖酐1(MW＝1000)、右旋糖酐40(MW＝40,000)、右旋糖酐70(MW＝70,000)，对细胞聚积、活力、功能恢复，CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺表型和功能的影响。

材料与方法

1,200万冷冻保存的CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺胎盘多能细胞在Nunc^TM10-tray细胞工厂中扩增到大约1.2×10⁸细胞，Nunc^TM10-tray细胞工厂被用于下述每个制剂。通过在室温用0.25％胰蛋白酶/EDTA孵育10分钟收获细胞。游离的细胞被转移到包含250ml含2％胎牛血清(FBS)的Dulbecco′s改良Eagle′s培养基(DMEM)的500mL离心管中。然后在SorvallRC3BP离心机的500mL离心管中以1040rpm离心细胞。细胞被重悬于0.9％生理盐水/5％右旋糖酐40溶液中。细胞然后以1420rpm离心10分钟，并悬浮在10mL以下制剂中：

制剂1：5％DMSO，5.5％右旋糖酐40(Hospira，LakeForest，Illinois)，10％HSA(对照组)

制剂2：5％DMSO，5.5％右旋糖酐1(Pharmacosmos)，10％HSA

制剂3：5％DMSO，5.5％右旋糖酐40(Pharmacosmos)，10％HSA

制剂4：5％DMSO，5.5％右旋糖酐70(Pharmacosmos)，10％HSA

过滤器保留实验：通过过滤器保留实验评价细胞聚积。过滤前将细胞浓度调整至大约1.2×10⁷细胞/mL。过滤负载(单位过滤面积的细胞数)保持大约2.4×10⁸细胞/过滤器不变。细胞以7.5×10⁶细胞/ml的浓度在热控制降温仪中冷冻至-70℃冷冻保存。细胞在临用前解冻，而且样品解冻后立即处理。100μL未稀释的细胞悬液样品解冻后，以900μM磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，一式两份使用Vi-Cell细胞活力分析仪(BeckmanCoulter，Fullerton，California)进行细胞计数。

结果：

细胞聚积

每种制剂中的细胞聚积采用过滤器保留实验评估。制剂2(右旋糖酐1)、制剂3(右旋糖酐40)和制剂4(右旋糖酐70)表现出的细胞聚积率等于或低于5％DMSO、5.5％右旋糖酐40、10％HSA的对照制剂(图13)。

活力和功能恢复

包含右旋糖酐1、右旋糖酐40或右旋糖酐70的样品在解冻后的活力在96.0％至97.7％的范围内(图14)。同样，解冻后的功能恢复与对照制剂相当，细胞活力为对照制剂的的92％至109％(图15)。

表型和功能

不同分子量的右旋糖酐保持细胞CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺表型的能力通过流式细胞仪进行测试，细胞免疫抑制能力通过BTR实验测试。所有测试制剂的CD200⁺/CD105⁺表达从89.1％到91.6％，而所有条件下CD347⁺/CD10⁺的表达＞95％(图16)。此外，不同分子量右旋糖酐对CD4⁺和CD8⁺T细胞的抑制率与4个包含右旋糖酐40的不同标准对照制剂的重复实验中得到的期望值相比，标准差在1以内(图17)。

结论：

这些结果表明，右旋糖酐1或右旋糖酐70在本发明的制剂中可以替代右旋糖酐40而不影响细胞的聚积、活力、功能恢复、表型或免疫抑制能力。

6.3.4不同多糖的影响

本实施例描述了细胞制剂中除右旋糖酐40外的多糖对细胞活力和增殖的影响。

材料与方法

1,200万冷冻保存的CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺胎盘多能细胞在Nunc^TM10-tray细胞工厂中，扩增到大约1.2×10⁸细胞，Nunc^TM10-tray细胞工厂被用于下述每个制剂。在室温用0.25％胰蛋白酶/EDTA孵育10分钟收获细胞。游离的细胞被转移到包含250ml含2％胎牛血清(FBS)的Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基(DMEM)的500mL离心管中。然后在SorvallRC3BP离心机的500mL离心管中以1040rpm离心细胞。细胞被重悬于0.9％生理盐水/5％右旋糖酐40溶液中。细胞然后以1420rpm离心10分钟，并悬浮在10mL以下制剂中：

制剂1：5％DMSO，5.5％右旋糖酐40，10％HSA(对照)

制剂2：5％DMSO，5.5％麦芽糊精，10％HSA

制剂3：5％DMSO，5.5％蔗糖，10％HSA

制剂4：5％DMSO，5.5％海藻糖，10％HSA

制剂5：5％DMSO，55USP/mL肝素，10％HSA

制剂6：5％DMSO，3.3％羟乙基淀粉，10％HSA

制剂7：5％DMSO，5.5％糖原，10％HSA

过滤器保留实验：采用过滤器保留实验评估细胞聚积。过滤前将细胞浓度调整至大约1.2×10⁷细胞/mL。过滤负载(单位过滤面积的细胞数)保持大约2.4×10⁸细胞/过滤器不变。细胞在热控制降温仪中冷冻至-70℃冷冻保存。细胞在临用前解冻，而且样品解冻后立即处理。100μL未稀释的细胞悬液样品解冻后，以900μM磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，一式两份使用Vi-Cell细胞活力分析仪(BeckmanCoulter，Fullerton，California)进行细胞计数。

结果：

细胞聚积

每种制剂中的细胞聚积采用过滤器保留实验评估。检测出制剂2-7产生的细胞聚积等于或低于对照制剂5％DMSO、5.5％右旋糖酐40、10％HSA的细胞聚积(图18)。包含海藻糖的制剂4，包含肝素的制剂5，包含糖原的制剂7，显示的细胞聚积率大大低于对照制剂。

解冻后的活力和功能恢复

对每种制剂1-7，评估了解冻后的活力、活细胞的功能恢复和细胞大小的数据，以评估这些制剂的冷冻保护能力。解冻后的活力通过台盼蓝拒染实验Vi-Cell细胞活力分析仪(BeckmanCoulter，Fullerton，Calofornia)进行评估。解冻后存活率在95.2％至98.6％的范围内，含有蔗糖和糖原的制剂在该范围较低端(图19)。右旋糖酐对照制剂的结果为98％细胞存活率。计算解冻后细胞的功能恢复，以了解经过冷冻/解冻处理的细胞丢失，不同多糖的值在84％至115％的范围(图20)。

表型和功能

通过流式细胞仪测试不同多糖保持细胞CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺表型的能力。如同对照制剂1，制剂2^-4和6中的细胞保持此表型，大约为89.4％至92.9％CD105⁺/CD200⁺。每种制剂CD10⁺/CD34^-的表达为95％。在肝素中冷冻的细胞保持了85.4％的CD105⁺/CD200⁺表型(图21)。

通过磁珠T细胞反应法(BTR)评估了细胞的功能，该方法测量细胞抑制T细胞对抗原磁珠的反应的能力。在蔗糖中配制的细胞显示出降低的T细胞抑制率，与从包含右旋糖酐40的标准对照制剂的4种不同的重复实验中得到的期望值相比标准差在1以内(图22)。经过其它多糖，CD4和CD8T^-细胞的抑制率落在预期值的标准偏差1以内。

结论：

就细胞聚积、解冻后的活力、解冻后的细胞功能恢复和表型的保持而言，用包含麦芽聚糖、海藻糖和羟乙基淀粉的制剂使得胎盘细胞群具有与使用右旋糖酐40制剂大致相同的特征。因此，虽然包含蔗糖、肝素或糖原的制剂可用于配制CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞，但优选使用包含右旋糖酐40、麦芽聚糖、海藻糖或羟乙基淀粉的制剂。

6.3.5HSA的替代蛋白的影响

本实施例表明，在5.5％右旋糖酐40、10％HSA和5％DMSO的制剂中，人血清白蛋白的浓度可以降低，而且HSA可被牛血清白蛋白或胎牛血清代替。

制剂1(F1)由5.5％右旋糖酐40、10％HSA和5％DMSO组成。为了了解F1中HSA的作用并了解其对细胞成分的影响，对含有类似人血清白蛋白的相似蛋白质，例如牛血清白蛋白(BSA)和胎牛血清(FBS)的替代制剂进行了测试。

材料与方法

1,200万冷冻保存的CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺胎盘多能细胞在Nunc^TM10-tray细胞工厂中扩增到大约1.2×10⁸细胞，Nunc^TM10-tray细胞工厂用于下述每个制剂。在室温用0.25％胰蛋白酶/EDTA孵育10分钟收获细胞。游离的细胞被转移到包含250ml含2％胎牛血清(FBS)的Dulbecco′s改良Eagle′s培养基(DMEM)的500mL离心管中。然后在SorvallRC3BP离心机的500mL离心管中以1040rpm离心细胞。细胞被重悬于0.9％生理盐水/5％右旋糖酐40溶液中。细胞然后以1420rpm离心10分钟，并悬浮在10mL以下制剂中：

制剂1：5％DMSO，5.5％右旋糖酐40，10％HSA(对照组)

制剂2：5％DMSO，5.5％右旋糖酐40，4％HSA

制剂3：5％DMSO，5.5％右旋糖酐40，10％牛血清白蛋白

制剂4：5％DMSO，5.5％右旋糖酐40，10％胎牛血清

结果：

细胞聚积

通过过滤器保留实验(FRA)测量所有条件下的细胞聚积为100像素或100像素以下每平方毫米(图23)。然而，10％HSA和10％BSA似乎比4％HSA和10％BSA可分辨地产生更少的细胞聚积。

为了了解每种溶液的冷冻保护能力，在Vi-Cell细胞活力分析仪(BeckmanCoulter，Fullerton，California)上通过台盼蓝拒染实验测定解冻后的活力、功能恢复和细胞大小。每个条件下的解冻后活力都在测定变化范围内，活力在95％至98％范围内(图24)。同样，解冻后细胞功能恢复与10％HSA对照相当，其值在100到127％的范围(图25)。

表型和功能

不同制剂保持细胞CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺表型的能力通过流式细胞仪进行测试(图26和27)。制剂2^-4以及10％HSA的对照制剂中的细胞保持此表型的值大约为测试细胞的89.4％至92.9％。每种制剂CD10⁺/CD34^-的表达为95％。

通过磁珠T细胞反应法(BTR)评估了细胞的功能。与其它条件相比，当细胞在FBS中配制时CD4和CD8T细胞抑制率升高，与包含10％HSA的标准对照制剂的4种不同重复实验中得到的期望值相比，标准差在1.5以内(图28)。所有其它条件的抑制率与预期值的标准差在1以内。

结论：

上述结果表明，4％HSA、10％BSA或10％FBS可代替10％HSA而不会导致细胞活力、解冻后细胞功能的恢复，CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺表型的退化，或免疫抑制活性的明显损失。因此，至少在大约4％到大约10％之间的范围，HAS、BSA和/或FBS特别适合于本发明所述制剂。

6.3.6不同细胞类型的相容性

本实施例表明，骨髓间充质干细胞和自然杀伤细胞可以用与胎盘多能细胞相同的方法配制。因此，本实施例显示，除了胎盘多能细胞，其它细胞也可以用本发明相同的方法配制。

材料与方法：

骨髓间充质干细胞(BMMSC)和自然杀伤(NK)细胞使用以下制剂扩增和收获：

F1：培养细胞3天，随后收集细胞，在5％DMSO、5.5％右旋糖酐40、10％HSA中悬浮细胞，通过70μM过滤器过滤细胞，以大约7.5×10⁶细胞/mL冷冻保存细胞；和

F2：培养细胞4天，随后收集细胞和在包含5％DMSO和10％HSA的勃脉力A中悬浮细胞。

用控速降温仪在70℃冷冻细胞。BMMSC在F2制剂的20mL药袋中和F1制剂的10mL药袋中冷冻保存；以及CD3^-、CD56⁺NK细胞在F2制剂的10mL药袋中和F1制剂的1.5mL小瓶中冷冻保存。这些样品随后被解冻并进行分析，以确定冷冻制剂对细胞特性的影响。

结果

细胞活力

用解冻后的样品测定不同条件下冷冻的细胞活力。BMMSC和NK细胞的活力不受冷冻条件的明显影响。

表型

分析NK细胞标记物以确定F1和F2制剂对NK表型(CD3^-、CD56⁺)的影响。所述两种制剂并不显着影响显示NK表型的NK细胞的百分比。也分析了BMMSC对CD10、CD34、CD44、CD45、CD90、CD98、CD105、CD117、CD166、CD200、泛细胞角蛋白和KDR的表达。这些标记物的表达或缺乏，在F1或F2制剂配制的BMMSC中并没有显著变化。

细胞聚积

在过滤器保留实验中，对每种BMMSC制剂分析了两次，对NK制剂分析了一次。对于BMMSC和NK细胞，F1制剂比F2制剂产生明显减少的聚积体；然而F2制剂对BMMSC的影响远比对NK细胞的影响显著(图29)。

结论：

上述结果表明，骨髓间充质干细胞和自然杀伤细胞可以在5％DMSO、5.5％右旋糖酐40、10％HSA中成功配制，其细胞聚积、活力和表型保留类似于相同制剂中的CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺胎盘多能细胞。此外，对于胎盘多能细胞，BMMSC和NK细胞的含勃脉力制剂显示明显更高比例的细胞聚积；因此，含右旋糖酐制剂是优选的。

等同物：

本发明公开的组合物和方法不受本发明描述的具体实施方案的范围限制。事实上，除了已经描述的那些，根据上述说明书及其附图，所述组合物和方法的各种改进对于本领域技术人员来说是显而易见的。这些改进落入所附权利要求的保护范围内。

本发明引用了各种出版物、专利和专利申请，其公开的全部内容被纳入本申请作为参考。

Claims

1.一种制备含细胞组合物的方法，该方法依次包括：

(a)使所述细胞与含有右旋糖酐和人血清白蛋白(HSA)的溶液接触，形成含细胞的溶液；

(b)用过滤器从所述含细胞溶液过滤大的细胞团块；

(c)如果所述细胞溶液包含大于10±3×10⁶细胞每毫升，用含有右旋糖酐的稀释溶液稀释所述细胞至不超过10±3×10⁶细胞每毫升；和

(d)冷冻保存所述细胞，从而制备含细胞组合物。

2.权利要求1的方法，其中所述稀释溶液中的所述右旋糖酐是右旋糖酐40。

3.权利要求2的方法，其中所述稀释溶液中的所述右旋糖酐40为5.5％的右旋糖酐40。

4.权利要求1的方法，其中所述含HSA的溶液中的所述HSA为10％的HSA。

5.权利要求1的方法，其中所述稀释溶液含有HSA。

6.权利要求5的方法，其中所述稀释溶液中的所述HSA为10％的HSA。

7.权利要求1的方法，其中所述稀释溶液还包含冷冻保护剂。

8.权利要求7的方法，其中所述冷冻保护剂是DMSO。

9.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)中所述溶液包含冷冻保护剂。

10.根据权利要求1的方法，其中所述含细胞组合物包含7.5％至9％的右旋糖酐。

11.权利要求1的方法，其中所述含细胞组合物包含10±3×10⁶细胞每毫升至5±1.5×10⁶细胞每毫升。

12.权利要求1的方法，其中所述细胞是胎盘细胞。

13.权利要求12的方法，其中所述细胞是分离的人贴壁胎盘细胞。

14.权利要求1的方法，其中所述过滤器是70μM过滤器。

15.权利要求1的方法，其中所述过滤器是100μM过滤器。

16.权利要求1、4、5或6任一项的方法，其中所述细胞是分离的人贴壁胎盘细胞。

17.权利要求16的方法，其中所述分离的人贴壁胎盘细胞是CD10⁺、CD34^-和CD105⁺。

18.权利要求17的方法，其中所述CD10⁺、CD34^-和CD105⁺细胞是CD200⁺。

19.权利要求18的方法，其中所述CD10⁺、CD34^-、CD105⁺和CD200⁺细胞是CD45^-或CD90⁺。

20.权利要求18的方法，其中所述CD10⁺、CD34^-、CD105⁺和CD200⁺细胞是CD45^-和CD90⁺。

21.权利要求1或权利要求11的方法，所述方法还包括在步骤(d)后浓缩所述组合物至包含5×10⁶细胞每毫升到1×10⁸细胞每毫升。