CN101965508B - 识别流中的微粒的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

提供将从流式细胞仪中的多个询问区产生的脉冲与流过流式细胞仪的特定微粒相关联的方法、存储介质和系统。方法、存储介质和系统的实施例包括用于利用具有唯一信号的校准微粒校准流式细胞仪以确定流过流式细胞仪的微粒的飞行时间的配置。基于所计算的飞行时间和与流式细胞仪的采集器相对应的询问区的相对位置，所述方法、存储介质和系统可进一步包括将其它信号脉冲关联到一个或多个不同微粒集的微粒的配置。

Description

识别流中的微粒的系统和方法
背景技术
1.技术领域 
本发明一般涉及流式细胞仪系统、存储介质和方法，进一步涉及询问和识别流过流式细胞仪的微粒的系统、存储介质和方法。 
2.相关技术描述 
一般地，流式细胞仪提供对直线地通过流通室的被照明微珠或微粒的荧光强度的测量。对荧光的两次或多次测量可以用于将微粒归类为特定的微粒子集。另外，其它被称为“指示器(reporter)”的荧光测量可用于量化感兴趣的化学反应，以确定试样中是否存在分析物。每个荧光测量在不同的波长下进行。在有些情况下，流式细胞仪能进一步用于测量微粒的一个或多个其他性质，诸如但不限于被微粒和/或微粒的电阻抗散射的光的水平。 
许多常规的流式细胞仪测量系统询问两个物理地址中的微粒，这两个物理地址在流体流动方向上约相隔30μm-100μm。在第一询问点处，微粒被照亮，且在通常被称为“DD”、“CL1”和“CL2”的三个通道上同时检测到其散射和荧光。同一微粒接着在第二点处被询问，在第二点处照明激励被束缚至该微球体的指示器标签。该指示器荧光在通常被称为“RP1”的通道上被探测，但也可使用其他参照物。在这种常规流式细胞仪中，流通池内部的微粒间距估算约为400μm-1000μm。在微粒间距是询问点之间距离的很多倍的情况下，两个微粒在两个点处被同时询问的机会很小。因此，在两个询问点处连续采集的测量通常指定同一个微粒。尽管如此，由于采用了在不同询问点同时询问多个微粒的可能性增长的系统和/或技术，准确关联流式细胞仪内的不同询问点处产生的脉冲带来了挑战。 
发明概要
以下对用于将从流式细胞仪中的多个询问区域产生的脉冲与流过流式细胞仪的特定微粒相关联的方法、存储介质和系统的不同实施例进行的描述不会以任何方式限制所附权利要求的主题。 
方法、存储介质和系统的实施例包括校准流式细胞仪的装置，该装置采用具有独特信号的校准微粒以确定微粒流过流式细胞仪的飞行时间。基于所计算的飞行时间和与流式细胞仪的采集器相对应的询问点的相关位置，所述方法、存储介质和系统可进一步包括将其他信号脉冲关联到一个或更多不同微粒集的微粒的装置。 
附图简述 
在阅读下面的细节描述和参考附图后，本发明的其他目的和优点将变得明显： 
图1是流式细胞仪的示意图； 
图2是图1中描述的流式细胞仪的示例性的检查系统的示意图； 
图3是流式细胞仪的询问区的一部分内的部件的示意图； 
图4是流式细胞仪的询问区的一部分内的部件的替代配置的示意图； 
图5是绘制从流式细胞仪的检测系统的DD、CL1和CL2通道产生的波形的曲线图； 
图6是与图5相似的、叠有飞行时间校准微粒的阈值的波形曲线图； 
图7是与图5相似的、标记有DD通道高和低信号阈值的波形曲线图； 
图8是一个与图5相似的、各个通道上的脉冲分配给共同微粒的波形图； 
图9是将从流式细胞仪的多个询问区域产生的信号脉冲与试样中的不同微粒子集的微粒相关联的过程的流程图； 
图10是校准流式细胞仪以确定流过流式细胞仪的微粒的飞行时间的过程的流程图；以及 
图11是关联在流式细胞仪的不同询问点处产生的脉冲的过程的流程图。 
虽然本发明允许各种修改和变形，但本发明的特定实施例通过附图中的示例示出并在此详细描述。然而，应该理解的是，这里的附图和细节描述不旨在将发明限定为所公开的特定形式，相反，本发明旨在覆盖所附权利要求所限定的落在本发明精神和范围内的所有修改、等价方案和替代方案。 
优选实施例的详细描述 
转到附图，提供了将从流式细胞仪的多个询问区域产生的脉冲与流过流式细胞仪的特定微粒相关联的示例性的方法、存储介质和系统。特别地，图1说明了一个示例的流式细胞仪的示意图。特别地，图1描述了流式细胞仪10，其包括流动系统12、照明系统14、检测系统16以及控制器18。流动系统12一般包括配置成输送具有大量微粒的流体、并进一步配置成集中样本以使至少部分微粒能够被单独询问的系统。更特别地，流动系统12可配置成经由鞘液(sheathfluid)流体动力学地集中试样，该鞘液形成允许大部分微粒连续通过的微粒流动通道。一般地，部分或全部这种微粒流动通道可作为询问区，在该询问区内设置了多个询问区域以询问微粒。这里所描述的方法、存储介质和系统能够适用于连续询问微粒的任何流动系统，且术语“流式细胞仪”旨在包含所有这样的系统。另外，这里描述的方法、存储介质和系统可适用于分析任何类型的试样的流式细胞仪，这些试样具体而言是期望确定其中是否存在一种或多种感兴趣的分析物的任何生物、化学或环境的试样。 
此处使用的术语“微粒”一般指微球体、聚苯乙烯珠、量子点、纳米点、纳米微粒、纳米壳、珠、微珠、微粒子、胶乳颗粒、胶乳珠、荧光珠、荧光微粒、有色微粒、有色珠、组织、细胞、微生物、有机物、无机物或者本领域已知的其他任何不连续的酶或者物质。在此，此类术语都可以交替使用。在某些情况下，微粒可包括辅助识别的材料，例如荧光、磁性、电磁共振和放射性材料。可用于所述方法和系统的示例性微粒包括可从德克萨斯州奥斯汀市的Luminex公司购买到的xMAP 
Figure GPA00001139431200031
微球体。一般地，此处涉及的微粒可作为分子反应的媒介。 
一般地，照明系统14配置成将光导向由流动系统12形成的微粒流动通道的多个不同的询问点。多个询问点可以是大于1的任意多个询问区域。如以下将详细描述的那样，在一些情况下，具有至少3个询问点是有利的，但是此处描述的系统和方法并不限于此。在某些实施例中，不同的询问点可用于微粒的各个不同参数，如以下参照图4所描述的那样。然而，在其他实施例中，如参照图3所示例子中所述的那样，在一个询问点处可以测量多个参数。无论如何，询问点之间的距离通过确定已知的值或通过推断他们的间距(即与检测器之间的间距相等或成比例)而已知。这样，可确定校准微粒的飞行时间，并接着应 用于将从多个询问区域产生的脉冲关联到其他微粒子集的特定微粒。 
一般地，照明系统14可包括任意多个光源，包括单个光源或者多个相同类型或者不同类型的光源。在某些实施例中，照明系统14可包括针对各个询问点的不同光源，如图3和4所示以及在下面将进行更详细描述的的示例系统中所示。在这些情况下，光源可设置成直接向流式细胞仪的微粒流动通道投射光，从而照明系统14可不必包括将光导向流动通道的分束器和反射镜。这种设置有利于最小化流式细胞仪的大小和/或简化流式细胞仪的设计。在其它实施例中，分束器和反射镜可包括在对每个询问点具有不同光源的照明系统中。在；另外的其他情况下，照明系统14可包括数量少于光源直接照射的多个询问点的数量的多个光源。在这些实施例中，照明系统14可包括分束器，并且在某些情况下还包括将单个光源的光导向多个询问点的反射镜。这样，尽管图1所示的流式细胞仪10以及图3和图4所示的示例配置显示出以基本垂直的入射角分别把光导向流动系统12和微粒流动通道40，但需要理解的是照明系统14可配置成以任何合适的入射角引导光。 
无论如何，照明系统14的光源可包括本领域已知的任何适合的光源，诸如但不限于发光二极管(LEDs)、激光器、弧光灯、光纤导光灯、光热灯泡和白炽灯。另外，在某些实施例中，照明系统14包括光学元件而不是光源，诸如但不限于，分束器、反射镜、准直透镜、滤光器、中性密度滤光片、起偏元件、漫射器和/或均化器。在某些情况下，照明系统14可配置成使用不同波长或波长带的光(例如蓝光和绿光)来连续照明微粒，以使被导向微粒的光为单色、接近单色、多色或宽带。此外，注意流式细胞仪10内是否包括照明系统14是可选择的，并且通常取决于流式细胞仪10是否用于检测荧光发射。特别的，在某些实施例中，流式细胞仪10被应用于产生化学发光反应并测量发光发射结果，并且在某些情况下可不用于产生和测量荧光发射。在这些情况下，照明系统14可关掉或者从流式细胞仪10中省去。 
如图1所示，流式细胞仪10可包括检测系统16。一般地，检测系统16可设置成采集从通过流动系统12询问区的询问区域的微粒发射和/或散射的光。更特别地，检测系统16可包括多个采集器，这些采集器设置成从询问区采集光，且进一步设置成产生表示所采集的光强度的信号。特别地，采集器的输出电流正比于入射在其上的光，并导致一个电流脉冲。这个电流脉冲可转换成电压脉 冲、经低通滤波、然后经过模/数转换器进行数字化转换而产生一数据信号。根据所采集的光，该数据信号可以是散射信号、通信标记信号、荧光信号、磁信号和/或电磁谐振信号。注意到检测系统16的采集器的功能参照从询问区而不是询问点所采集的光进行描述。此处使用的术语“询问点”指的是沿着光源被引导和照明的微粒流动通道的点。此处使用的术语“询问区”指的是环绕从中采集光线的询问点的区域。一般地，询问区域的面积通常取决于所使用的采集器的配置。 
一般地，检测系统16可包括针对要测量微粒的各个不同参数的不同采集器。这些采集器可包括任意类型的光电检测器，包括但是不限于雪崩光电二极管(APD)、光电倍增管(PMT)、电荷耦合器件(CCD)。此外，这些采集器可以是相同类型或不同类型，这取决于所收集的光的类型。在某些情况下，检测系统16可包括滤光片、反射镜和/或透镜。在某些实施例中，检测系统16的采集器可设置成从询问区的不同询问区域采集光，如图4的示例系统中以及随后的更详细描述中所示。在这些情况下，采集器可设置成直接从询问区域采集光，并且因此检测系统16可不必包括分束器和反射镜来为不同的采集器采集光。这种配置有利于最小化流式细胞仪的尺寸和/或简化流式细胞仪的设计。在其他实施例中，分束器和反射镜可包括在检测系统中，该检测系统在每个不同的询问区域都配置一个采集器。 
在其他情况下，检测系统16的一些采集器可设置成从相同的采集区域采集光，如图3的示例系统所示且将随后更详细描述。在这些实施例中，检测系统16可包括分束器，并且在某些情况下还包括反射镜，以将光从询问区域引导向多个采集器。为简化附图，此类附加元件没有在图3中示出，因此不应理解为省去。同样，尽管图1所示的流式细胞仪10以及图3和图4所示的示例配置分别表明是在常规的入射角收集光，但应该理解的是，检测系统16可设置成以任何合适的角度收集光。 
如图1进一步所示，流式细胞仪10可包括与检测系统16可操作地连接的检查系统18。一般地，检查系统18可设置成接收、监控以及评价从检测系统的采集器产生的信号，从而确定试样中的分析物的类型和/或量。在某些实施例中，检查系统18是被设置成使流式细胞仪10的操作自动化的控制系统的一部分。在这些情况下，检查系统18可进一步可操作地耦合至流动系统12和照明系统 14。在其他实施例中，检查系统18可从这样的一个控制系统中分离。在任一种情况下，检查系统18可包括处理器和可由该处理器执行的程序指令，这些程序指令用于执行图9-11中概述的流程图中以及图5-8中描绘的图像中描述的任何过程。图2所示为检查系统18的示例性配置的示意图。需要注意，这样一个配置仅仅是示例性的，因而也可以考虑其他设置。 
如图2所示，检查系统18包括存储介质20和处理器24。检查系统18可采用多种形式，包括个人计算机系统、大型计算机系统、工作站、网络设备、因特网设备、个人数字助理(PDA)、数字信号处理器(DSP)、现场可编程门阵列(FPGA)或其他设备。无论如何，存储介质20包括可使用处理器24执行而产生和传送输出28的程序指令2224。如下文所详细描述的一样，检查系统18被配置成接收输入28(即：从检测系统16的采集器产生的信号)以通过处理器24激活程序指令22和/或向程序指令22贡献数据以运行。尽管没有在图2中示出，存储介质20可包括可由程序指令22访问以执行下文概述的过程的数据库和/或查找表。示例性的数据库和/或查找表可包括例如预定信号范围和/或阈值，从检测系统16接收的信号与上述预定信号范围和/或阈值进行比较。在其他实施例中，这样的预定信号范围和/或阈值可包括在程序指令22中，因此，可从存储介质20中省去数据库和/或查找表。 
一般地，这里使用的术语“存储介质”可表示配置成保存一个或多个程序指令集的任何电子介质，诸如但不限于只读存储器、随机存取存储器、磁盘或光盘、或磁带。术语“程序指令”一般指的是被设置成执行特定功能的指令，例如下文将详细描述的将从流式细胞仪的多个询问区域产生的脉冲与流过流式细胞仪的特定微粒相关联。程序指令可以按照多种方式实施，包括基于程序的技术、基于元件的技术和/或面向对象的技术。例如，程序指令可利用Active X控件、C++对象、JavaBeans、微软基础类(“MFC”)或其他需要的技术或方法来实施。如上所述，程序指令24一般设置成执行在图9-11中描述的流程图中所概述的过程。同样，图9-11所示的流程图一般描述通过使用软件模块来执行的方法。更特别地，参照图9-11中所描述的方法包括通过使用一个或多个算法分析和计算相对大量的数据，因此通过计算机能最佳实现。因此，参照图9-11所描述的方法可称为“计算机实现的方法”。 
图3和图4示出了可考虑用于在此描述的方法和系统的流式细胞仪示例性 询问区的一部分。具体而言，图3和图4表明了流式细胞仪的示例性部分的示意图，其中照明系统的光源和检测系统的采集装置的位置相对于流式细胞仪的微粒流动通道示出。可以注意到图3和图4的示图是示例性的，而不应理解为用于限制可考虑用于本文所述方法和系统的流式细胞仪的设置。相反，图3和图4仅用来描述流式细胞仪部件的一些可能设置，并进一步帮助描述参照图5-12所描述的过程步骤。 
如图3所示，在某些实施例中，照明系统14包括两个光源，即光源30和32，它们被引导至微粒流动通道40中的询问区域41和42的两个不同的询问点。在询问区域41和42的接收终点处分别是采集器集50和采集器52。如图3所示，采集器集50包括三个采集器，每一个用于不同的通道DD、CL1和CL2。这样，从例如图3中所示的微粒60之类的单个通过微粒发出的散射和荧光可同时被检测。在某些情况下，这些通道可用来将微粒60归类至特定微粒集。此后，微粒60将通过询问区域42，从而光可被包括一报告标签信道(如图3指示的“RP1”)的采集器52采集。这个报告标签信道一般可用于检测和/或量化通过微粒上的分析物的量。 
如上所述，询问区域41和42的询问点取决于来自光源30和32的入射光，因此，如图3所示，询问区域的询问点之间的间距就由间距X表示。一般地，图3所示的间距X的距离和微粒的间距使在不同询问点同时询问是不太可能的。特别地，询问点彼此间间距太近(例如，约30μm-100μm)以致于在流通流体中的微粒间距(例如约400μm-1000μm的微粒间距)比间距X大很多，使得在多个询问点处的同时微粒询问不可能。如前所述，这样的询问区配置在常规的流式细胞仪中常见。然而，要注意的是，由于对试样内的微粒浓度更大的需求持续，此类装配最后服从于流过的流体中的微粒间距等于或小于间距X的情形，使得在不同的询问点同时询问微粒成为可能。特别地，在不远的将来，在某些点处，流过的流体中的微粒间距可减少到小于约100μm。同样，可以预期，此处描述的方法和系统可应用于图3所示的流式细胞仪的配置以及流式细胞仪的任何其他配置。 
图4示出了流式细胞仪的询问区的替代实施例。特别的，图4描述包括光源34、36、38以及32的照明系统14，这些光源被引导至微粒流动通道44的询问区域45-48中不同的询问点。询问区域45-48的接收终点上分别是采集器 54、56、58以及52。更具体地，询问区域45与光源34和包括信道DD的采集器54相关联。询问区域46与光源36和包括信道CL1的采集器56相关联，且询问区域47与光源38和包括信道CL2的采集器58相关联。类似地，询问区域48与光源32和包括信道RP1的采集器52相关联。与图3相对照，图4示出了流式细胞仪的询问区的一部分，其中微粒间距等于或小于询问点的间距(如图4中间距Y指出的)，使得在不同的询问点同时询问微粒成为可能。在图4所示的说明性实施例中，同时询问在区域45、46和47处发生。相对于询问点间距而言密集的微粒间距可能由例如密集珠子、大量珠子、或者询问区的宽距之类的多种情况引起。如前所述，在不背离此处描述的方法和系统的范围的情况下，询问点的数量、间距和激发源可不同。 
图5示出在DD、CL1和CL2信道上与图4中的三个询问窗口45-47相关联的假设波形。如图5所示，在三个信道之间存在多个同步波形脉冲。为分离流过询问区的微粒，必须知道哪些脉冲属于给定的微粒。此处描述的方法和系统利用下面的过程将微粒与脉冲关联，该过程使用：1)已知询问点位置；2)用于飞行时间计算的唯一可标识的微粒；以及3)检测算法。采用此类过程的示例在下文参照图4-8进行描述。此后，图9-11中所示的流程图说明了该过程的全部范围。 
一般的，此处描述的方法和系统通过识别与在至少两个信道中的与“校准”微粒相关联的独特信号来起作用。这些独特信号包括但不限于，由于尺寸产生的独特的散射信号、独特的报告标签信号、由于染色产生的一个或多个独特信号、独特的磁异常特征、独特的电磁谐振、或者放射性。以下参照图4-7给出的示例利用两个连续信道，但是具有已知间距的任意个信道都将起作用。在某些实施例中，采用具有相对大间距的信道是有利的。特别地，较大的间距为计算微粒飞行时间提供了较大的容许误差。因此，在某些实施例中，需要在询问区的两端都采用信道以识别校准微粒。 
一般地，校准微粒子集会具有与试样中的其他微粒子集不同的独特信号值范围。在某些实施例中，校准微粒子集可具有高于试样中的其他微粒子集的信号的独特信号。图6示出了这样的实施例。特别地，图6示出了来自图5的波形，其中分别示出了信道CL1和CL2的校准微粒识别阈值60和62。需要注意的是，一个或多个可选择的或附加的信道可用于检测校准微粒，因此，此处描 述的方法和系统不限于参照图6所述的示例。特别的，应当理解的是，此处描述的实施例可以使用微粒的任何可测量参数来区分微粒的不同种类。 
如图6所示，跨越CL1和CL2上的识别阈值的脉冲峰在时间轴上的位置分别标为T1和T2。此类脉冲的时间差标为dt，可由下式得到： 
dt＝T2-T1
由于微粒聚集，阀值有可能跨越CL1和CL2上的信号。同样，在某些实施例中，验证单个校准微粒实际已被识别是有利的。为了回答这个问题，可查看DD信道以寻找落在可接受界限内的信号。DD信道检查微粒的散射以确定是否发现单个微粒或者多个微粒的聚集。在图4-7描述的实施例中，DD信道被放置在上游并毗邻CL1信道。在这种情况下，对应于该微粒的DD信道信号的位置T0可以通过下式得出： 
T0＝T1-dt 
但是，需要注意的是，这个计算可根据相对于用于检测校准微粒的信道(例如CL1和CL2)的DD信道的位置而变化。 
图7是来自图5的波形图，其中分别示出了DD信号电平界限64和66以及在DD、CL1和CL2信道上的脉冲峰T0、T1和T2的识别。如图7所示，T0处的DD信道脉冲落在可接受的范围内，即在界限64与66之间，因此确认了校准微粒飞行时间检测。如图8所示，微粒现在可以从DD、CL1和CL2信号中提取。在图8中，第一微粒与信道DD、CL1和CL2上如附图标记70所示的一系列连续信号脉冲相关联。第二微粒与信道上由附图标记72表示的不同脉冲系列相关联，而第三微粒与信道上由附图标记74表示的另一脉冲系列相关联。每一个此类信号脉冲系列都与前面计算的校准微粒通过流式细胞仪的飞行时间、以及与包括信道DD、CL1和CL2的各个采集装置相关联的询问点的相对位置相一致。在所示实施例中，该过程要求缓冲DD信道信号，因为T0时间点将会在校准微粒信号触发飞行时间计算过程之前出现。 
相信在很多情况下，微粒通过流式细胞仪的速率变化足以导致频繁的校准。在这种情况下，飞行时间校准微粒以相对于其他微粒足量的方式混合到样本中，以确保飞行时间校准能够在给定的时间段内(例如一秒内很多次)多次完成，从而确保考虑了微粒速率的任何干扰。如果检测到新的飞行时间校准微粒，则利用新值重新计算并更新dt，随后使用新值识别微球体。 
图9-11示出了概述此处描述的系统和方法可采用的过程的较全范围的流程图。特别地，图9示出了用于检测和确定校准微粒的飞行时间、以及随后基于计算得到的飞行时间和流式细胞仪中询问点的相对位置来精确定位和分配信号脉冲的一般过程。图10示出了可用于执行校准过程的示例性指令集。图11示出了可用于基于参照图10所描述的校准过程将从多个询问区域产生的脉冲与特定微粒相关联的示例性指令集。需要注意的是，此处描述的方法和系统不一定限于参照图9-11所述的过程。特别地，在某些实施例中，这些过程可包括没有在流程图中描述的附加步骤。此外，如下文所述，参照图9-11所描述的一个或多个过程是可选的，因而可以在某些实施例中省去。 
如图9中的框80所示，此处描述的方法和系统可配置成从流式细胞仪的多个采集器接收数据信号。此外，此处描述的方法和系统可设置成将在至少两个采集器处接收的信号和与特定微粒集(例如一个校准微粒集)相关联的预定信号范围进行比较，如框82中所述。在某些情况下，与用于检测校准微粒的参数无关的信号在这点处基本上可被忽略。更具体地，不需要监控信号，更不用说存储在内存中。这样的情况可帮助减少流式细胞仪检查系统的处理和/或存储器需求。在其他实施例中，与用于检测校准微粒参数无关的信号可被监控和/或存储。 
在任一情况下，一旦检测分别符合与校准微粒集相关联的预定信号范围内的信号脉冲，就计算对应于两个检测信号的微粒的飞行时间。此处使用的术语“飞行时间”一般是指微粒穿过已知距离所花费的时间，诸如流式细胞仪中两个询问点之间的距离。在某些实施例中，飞行时间仅包括从两个检测器接收的信号脉冲之间的时间差。在这些情况下，对应于检测器的两个询问点之间的已知距离通过流式细胞仪中的所有检测器之间的相等间距推出，或者通过流式细胞仪中的检测器之间的已知成比例间距推出。在后面的实施例中，“已知的成比例间距”一般是指连续排列的询问点之间的距离彼此成比例。例如，参照图4，采集器58与52之间的间距用距离Y表示。代替在微粒流动通道44中等距，采集器54和56可具有与相对距离Y成比例的间距。例如，采集器56可与采集器58相距1/2Y的间距，而采集器54可以与采集器56相距2Y的间距。也可以考虑其他成比例距离，从而此处描述的方法和系统并不限于上述示例。 
在另一些情况下，飞行时间可包括微粒速率。在这些实施例中，每个检测 器之间的距离是已知的确定数值，不管每个检测器之间的距离是相同还是不同。当询问点在流式细胞仪的整个询问区中不是平均分布时、和/或所讨论的询问点不是连续排列在流式细胞仪的询问区内时，微粒速率的计算尤其适用(但不限于这些情况)。 
在某些情况下，框84中的信号脉冲检测可包括将对应于两个检测信号的微粒识别为特定微粒集中的微粒。在这些情况下，该方法可遵循两个路线之一，这两个路线中的一个是确定微粒是否确实是框88-94所概述的特定微粒集中的部分，而另一个是跳过这些过程和将该方法直接路由至框96和98，以给不同微粒集中的微粒分配其他信号脉冲。图9包括在框86和96之间的点划线，表示后面的实施例是可选的。鉴于这两个选择，框82-86中概述的过程和框82-94中概述的过程都可称为使用具有唯一信号的校准微粒来校准流式细胞仪，以确定流过流式细胞仪的微粒的飞行时间。选择每种选择的优点都将在下文中详细叙述。 
由于试样中微粒聚集的敏感性，有可能参照框84所检测的两个信号是由于微粒的聚集而不是校准微粒集中的单个微粒。假定根据流式细胞仪中微粒的流动速率和流式细胞仪的询问点之间的间距，聚集微粒与单个微粒的速率之差略微相同，因此，微粒聚集的飞行时间可用于将从多个询问区域产生的脉冲与特定微粒相关联。同样，在某些实施例中，方法直接继续至框96和98，以将其他信号脉冲分配给不同微粒集的微粒，不管校准微粒或微粒聚集是否已被检测。这样的选择可避免验证另一采集器处的检测的额外步骤(下文参照框88-94更详细描述的过程)，因此，可简化此处描述的方法和系统的程序指令。 
理论上也认为，在其他实施例中(一般是其中使用相关的较高速率和/或询问点之间的较窄间距的情况)，聚集微粒与单个微粒之间的速度差可能显著不同。在这种情况下，可根据微粒聚集计算出不准确的飞行时间，且关联来自微粒聚集的脉冲可能不可行。同样，在某些实施例中，检验参照框84所检测到的两个信号是否确实是单个校准微粒是有利的。在这种情况下，图9中概述的过程路由至框88，以基于参照框86所描述的两个数据信号的检测和计算出的飞行时间来计算在不同预定范围内的数据信号在另一个采集器处产生的时间点。具体而言，该时间根据计算出的飞行时间和对应于另一采集器的询问点相对于对应于两个采集器的询问点的位置的位置来计算。这样的时间计算可针对相对于 两个或多个用于识别校准微粒的询问点定位于上游或下游的询问点。在针对位于上游的询问点计算该时间的情况下，此处描述的方法和系统可配置成存储与其他询问点相关联的信号，然后在两个或多个询问点处询问校准微粒之后参照所存储的信号，以确定校准微粒的识别。 
在任何情况下，用于验证过程的采集器可包括任何信道，该信道设置成产生用于区分单个微粒和微粒团的信号。设置成基于光从被分析物(例如DD信道)散射的光产生信号的采集器是可行的，因为散射光一般表明物体的尺寸。如图9的框90所示，确定来自另一采集器的数据信号是否符合预设信号范围。如框92所示，一旦从其他采集器采集的数据信号不在不同的预设范围内，则检测到的两个数据信号被拒绝为表示特定微粒集(即校准微粒)的微粒，且过程返回框82以继续将接收到的数据信号和与特定微粒集相关联的预定信号范围进行比较。然而，一旦确定从另一采集器采集的数据信号在不同的预定范围内，则如框94中所示，验证微粒被识别为特定微粒集的一部分。 
图10说明了用于校准流式细胞仪的示例性流程图，具体而言是识别校准微粒、计算校准微粒的飞行时间、以及验证校准微粒是单个微粒而不是微粒团。需要注意的是，图10是示例性的，从而可采用实现图9的框80-84中所概述的过程的其他方式。例如，图10特别地要求计算用于计算微粒飞行时间的时间差(dt)。然而，如上所述，计算飞行时间可替代地包括计算微粒速度。对图10中所示指令的其它变化也可或替代地基于上述讨论使用或选择使用。如图10所示，校准过程包括读取dt_calc_threshold的框100。将这一过程与图9中的框82相关联，参数“dt_calc_threshold”指的是与专属于用于校准流式细胞仪的两个或多个信道的校准集相关联的预定信号范围。对于图10中所概述的实施例，将来自两个信道(称为信道1和信道2)的信号与dt_calc_threshold的值进行比较。 
如图10中的框102和104所指出的，读取来自信道1的信号并与该信道的dt_calc_threshold进行比较。如果来自信道1的信号小于该信道的dt_calc_threshold，则该过程返回框102以继续检测来自信道1的信号。但是，当来自信道1的信号大于或等于该信道的dt_calc_threshold时，该过程继续到框106以将该信号的定时(即当前时间t)赋值给变量T1。之后，在框108中读取最小时间延迟(min_delay)，并在框110确定当前时间t是否等于或大于T1+最小时间延迟。一般而言，最小时间延迟表示基于流过流式细胞仪的预期流体流 动速率和询问点间距而预期出现在询问点之间的最小时间量。考虑这样的延迟有助于避免可能在询问点之间连续流动的不同校准微粒的检测，而这将导致计算一个错误的飞行时间。如图10指出的，如果当前时间t不等于或不大于T1+最小延迟时间，那么过程将指回框110直到完成这样的确定。 
此后，在框112，读取从信道2产生的信号。至于信道1的框104和106，读取从信道2产生的信号并分别与框112和114处的信道的dt_calc_threshold进行比较。如果来自信道2的信号小于该信道的dt_calc_threshold，则过程返回框112以继续监控来自信道2的信号。然而，当来自信道2的信号大于或等于该信道的dt_calc_threshold时，该过程继续至框116以将该信号的定时(即当前时间t)赋值给变量T2。接着，在框118中产生信号定时之间的时间差(dt)。然后，在框120中，通过从T1中减去时间差来计算不同预定范围内的数据信号在与信道1相等间距的另一个采集器(即信道0)处预期产生的时间(T0)。如框122所示，读取在时间(T0)在信道0中产生的信号。在框124中，确定信道0处产生的信号是否有效(即符合信道0的校准微粒集的预定信号范围)。一旦确定该信号无效，则过程返回框102以试图重新校准流式细胞仪。相反地，如果在信道0处产生的信号在确认飞行时间校准微粒的可接受的界限内，那么如框126所示，变量dt_valid被设定为1。当dt计算出并有一个有效值的时候，dt_valid是一个为1的布尔变量，而当dt还没计算出来的时候，dt_valid为0。为清楚起见，用于图10和11的流程图的常量、变量和过程将在下文中进行限定。 
返回图9，不管识别校准微粒是通过框86-94验证还是该过程从框86直接到框96，如框96所示，此处描述的方法和系统都可设置成根据计算出的飞行时间和对应于采集器的相应询问点的相对位置来精确定位从各个采集器接收且在不同时间点产生的其他信号脉冲。如框98所示，其他信号脉冲然后与不同微粒集的微粒相关联。这种过程顺序可选择地描述为将第一采集器的信道上的脉冲分配给特定微粒、根据飞行时间和对应于第一、第二采集器的询问点之间的间距识别在不同的第二采集器的信道上在一时间点产生的脉冲、将该第二采集器的信道上的该脉冲分配给特定微粒。另外，方法和系统进一步包括根据飞行时间和对应于第一、第二以及一个或多个其他采集器的询问点的间距识别在一个或多个其他采集器的信道上产生的脉冲、并将这一个或多个其他采集器的信道上的脉冲分配给特定微粒。如图9所示，该过程还可返回框96以识别从采集器 接收的其他信号脉冲，并将这些脉冲分配给微粒。此外，方法可继续进行到框99，以基于相关信号脉冲确定微粒特征。 
如上所述，相信在很多情况下，通过流式细胞仪的微粒速率的变化足以导致频繁的重新校准。同样，如连接框98和82的箭头所示，方法可包括在将相关信号脉冲分配给特定微粒之后，使用流过流式细胞仪的不同校准微粒来重新校准流式细胞仪。需要注意的是，这种重新校准过程可在通过检测分别符合校准微粒集的预定信号范围内的两个信号脉冲而检测到校准微粒时自动启动。在这检测之前，信号脉冲的若干其他集合可被识别并分配给微粒。也就是说，框96-99中概述的过程可不断重复直到检测到校准微粒。 
图11示出用于基于计算的微粒的飞行时间和询问点间的间距将从特定微粒的多个询问点产生的脉冲与特定微粒相关联的示例性流程图。需要注意的是，图11是示例性的，因此也可以使用实现图9中的框96和98中概述的过程的其他方式。例如，图11特别要求使用相同的时间差(dt)来关联在不同询问点产生的脉冲，并因此呈现具有等距的询问区的流式细胞仪配置。然而，如上所述，询问点可选择不均匀分布在询问区中，因此用于关联脉冲的时间差在询问点中可变化。基于上述讨论，在图11中给出的指令的其他变形同样可以选用或替代地采用。如图11的框130所示，该过程可包括读取通过图10概述的过程建立的布尔变量dt_valid。在框132中，确定dt_valid是否等于1，且如果dt_valid不等于1，则过程行进至框134以运行dt_calculation过程，例如参照图10所描述的过程。 
一旦确定dt_valid等于1，该过程进行至框136，在框136检测到有效信号脉冲(即在最小阈值之上的脉冲，其表明来自待测试样中的微粒的任何子集都在对应于信道0的询问点处)。此后，在框138中发生时间延迟，因此当前时间t等于T0+dt(即：在信道0检测到信号的时间加上流过流式细胞仪的校准微粒的飞行时间计算值)。在该时间延迟后，信道1处的信号如框140中所示。在框142，进行与在信道1处读取的信号相关的两个确定。具体而言，确定信号是否大于或等于“dt_calc_threshold”(即与信道1专属的校准微粒集相关联的预定信号范围)或者确定信号是否小于“min_detect”(即表明来自被检查的试样中的任何微粒子集中的至少一个微粒在与信道1相对应的询问点处的最小阈值)。 
如果进行任意一个确定，该过程可返回框134以运行dt_calculation过程并 建立校准微粒的新飞行时间和相应的dt，以将多个询问点处的脉冲与一个微粒相关联。具体而言，如果从信道1产生的信号大于或等于“dt_calc_threshold”，则这样的信号可表明校准微粒或微粒团，因此可基于检测到该信号而要求对流式细胞仪进行重新校准。相反的，如果从信道1产生的信号小于min_detect，则这样的信号可表明流式细胞仪中的微粒的飞行时间相对于针对通过询问区的大多数最近的校准微粒确定的飞行时间已经变化，从而需要对流式细胞仪进行重新校准。需要注意的是，代替在检测到框142中给出的任一情形之后将该过程返回框134以重新校准流式细胞仪，在某些实施例中，该方法可替代地返回框136，并启动检测信道0上的有效信号的子过程。具体而言，可能需要在每次检测到框142中给出的情形之一时重新校准流式细胞仪。在某些实施例中，该过程的路线可基于框142中给出的情形的检测进行选择。 
无论如何，当在框142中未检测到两种情况中的任一种时，该过程可继续至框146，并在框144规定的时间延迟后读取信道2中产生的信号。如框148和150所示，这样的过程可能重复n次，n是流式细胞仪中询问点的个数。在某些情况下，在读取一个或多个信道处的信号之后，决策框可纳入该过程中，以确定信号是否如框142中描述地等于或大于相应信道的min_detect。如果信号小于min_detect，这样的信号可能表明流式细胞仪中微粒的飞行时间相对于经确定的最近通过询问区的大多数校准微粒的飞行时间已经发生变化，并且因此，可能需要在这个点处进行再校准。这另外的过程没有在图11中示出以简化附图，但是框146和148之间的三个连接点可推出这个结论。为了清楚说明，在图11和图10中使用的常量、变量和过程将在下文进行定义。 
本领域技术人员在了解本发明内容的情况下将能理解，本发明旨在提供用于将从流式细胞仪的多个询问区域产生的脉冲与流过流式细胞仪的特定微粒相关联的方法、存储介质和系统。根据本说明书，本发明的多个方面的进一步修改和替代实施例对本领域技术人员将是显而易见的。因此，这种描述被解释为仅仅是说明性的，并且是为了教授本领域技术人员执行本发明的一般方式。需要理解的是此处示出和描述的本发明的形式作为当前的优选实施例。此处示出和描述的元件和材料可替换，部分和过程可颠倒，发明的特定零件可以单独使用，这些对获得本发明所描述的有益效果的本领域技术人员都是显而易见的。在不背离以下权利要求中描述的本发明的精神和范围的情况下，此处描述的元 件可以改变。 
变量和常量的定义 
以下是在图10和11的流程图中使用的常量和变量： 
Channel0(信道0)：这是“DD”的一般名称。 
Channel1(信道1)：这是“CL1”的一般名称。 
Channel2(信道2)：这是“CL2”的一般名称。 
Channeln(信道n)：这是表明检测信道的数量不受限制的一般名称。 
Channel0_signal(信道0_信号)：这是被赋值信道0上的信号的幅度的变量。 
Channel1_signal(信道1_信号)：这是被赋值信道1上的信号的幅度的变量。 
Channel2_signal(信道2_信号)：这是被赋值到信道2上的信号的幅度的变量。 
min_delay(最小_延迟)：这是包含连续信道脉冲之间的最小延迟的常量。这个常量的使用避免了对可能在询问点之间连续流动的不同校准微粒的检测。 
dt：微球在询问点之间的穿行时间，因此也是连续信道上的脉冲之间的时间。 
dt_valid：布尔变量，其中1表示已经利用“dt_calculation”确定dt，而0说明dt包含未知量，不能被信任。 
dt_calc_threshold：这是设定“信道1_信号”和“信道2_信号”必须跨越以被当作校准微球体的阈值的常量。 
min_detect：最小阈值，其表明来自被检查的试样内的任何微粒子集的至少一个微粒在询问点处。 
t：包含运行时标的变量。 
T0：包含当“信道0_信号”跨越较低阈值时的时标的变量。 
T1：包含在过程dt_calculation”中使用的信道1峰值的时标的变量。 
T2：包含在过程“dt_calculation”中使用的信道2峰值的时标的变量。 
过程的定义 
此处所列是在图10和11的流程图中使用的过程： 
Microsphere_peak_detect(微球_体峰_值检测)：关联多个信道上的信号脉 冲以产生微球体检测事件的过程。 
dt_calculation(dt_计算)：计算dt并设置dt_valid为1的子过程。 
Channel0_peak_detect(信道0_峰值_检测)：在信道0上寻找有效信号脉冲的子过程。 
Channel1_detect(信道1_检测)：在信道1上读取信号的子过程。 
Channel2_detect(信道2_检测)：在信道2上读取信号的子过程。 
Channeln_detect(信道n_检测)：在信道n上读取信号的子过程。 

Claims (21)

1.一种流式细胞仪，包括：
微粒流动通道；
照明系统，所述照明系统被配置成将光导向所述微粒流动通道的多个不同询问点；
多个采集器，所述多个采集器分别被配置成从包括所述询问点的询问区域采集光，并进一步被设置成产生表示所采集的光的程度的信号；以及
检查系统，所述检查系统用于：
接收所述信号；
将从至少两个采集器接收的信号与和一特定微粒集相关的预定信号范围进行比较；
一旦检测到分别符合所述预定信号范围的信号脉冲，则识别所述特定微粒集的微粒；
计算所述微粒的飞行时间；
根据所计算出的飞行时间和对应于所述至少两个采集器的相应询问点的相对位置来精确定位从所述至少两个采集器中的每一个接收并在不同时间点产生的其它信号脉冲；以及
将所述其它信号脉冲关联到不同于所述特定微粒集的微粒集的微粒。
2.如权利要求1所述的流式细胞仪，其特征在于，所述检查系统进一步用于基于关联到不同于所述特定微粒集的微粒集的微粒的信号脉冲确定所述不同于所述特定微粒集的微粒集的所述微粒的特征。
3.如权利要求1所述的流式细胞仪，其特征在于，所述检查系统进一步用于：一旦识别所述特定微粒集的微粒，就验证从另一采集器接收的数据信号在预定信号范围内，其中从所述另一采集器接收的所述信号脉冲在一时间点处，所述时间点是根据所计算的飞行时间和对应于所述另一采集器的询问点相对于对应于所述两个采集器的询问点的位置的位置来确定的。
4.如权利要求1所述的流式细胞仪，其特征在于，所述多个不同询问点之间的距离已知，并且其中所述检查系统进一步用于确定所述微粒的速率。
5.如权利要求1所述的流式细胞仪，其特征在于，所述多个不同询问点沿所述微粒流动通道等距。
6.如权利要求1所述的流式细胞仪，其特征在于，所述多个不同询问点沿所述微粒流动通道不均匀分布。
7.如权利要求1所述的流式细胞仪，其特征在于，对应于所述两个采集器的所述两个询问点沿所述微粒流动通道连续排列。
8.如权利要求1所述的流式细胞仪，其特征在于，至少一个询问点插入对应于所述两个采集器的所述两个询问点之间。
9.一种将从流式细胞仪中的多个询问区域产生的脉冲关联到一特定微粒的方法，包括：
使用具有独特信号的校准微粒来校准所述流式细胞仪，以确定流过所述流式细胞仪的微粒的飞行时间；
将第一采集器的信道上的脉冲分配给流过所述细胞仪的与所述校准微粒不同的一特定微粒；
根据所述飞行时间和对应于所述第一和不同的第二采集器的所述流式细胞仪的询问点之间的间距来识别在所述第二采集器的信道上在一时间点产生的脉冲；以及
将所述第二采集器的所述信道上的所述脉冲分配给所述特定微粒。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，进一步包括：
根据所述飞行时间和对应于所述第一、第二以及一个或多个其他采集器的询问点的间距来识别在一个或多个其他采集器的信道上在多个时间点产生的脉冲；以及
将所述一个或多个其它采集器的信道上的所述脉冲分配给所述特定微粒。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，进一步包括基于所分配的脉冲确定所述微粒的特定特征。
12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，校准所述流式细胞仪的所述步骤包括询问所述流式细胞仪中的已知位置处的两个或多个询问点处的校准微粒。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，校准所述流式细胞仪的所述步骤进一步包括：
询问相对于所述两个或多个询问点位于上游的另一个询问点处的校准微粒；
存储与另一询问点相关联的信号；以及
在询问所述两个或多个询问点处的校准微粒之后，参照所存储的信号以确认对所述校准微粒的识别。
14.如权利要求9所述的方法，其特征在于，进一步包括在校准所述流式细胞仪的所述步骤之前，将具有多个校准微粒的复合试样注入所述流式细胞仪中，其中所述复合试样包括足够的微粒浓度，以使沿所述流式细胞仪的询问区流动的微粒的间距等于或小于所述询问区内的至少某些询问点之间的间距。
15.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述校准微粒的独特信号包括阈值信号值，所述阈值信号值高于为流过所述流式细胞仪的其它微粒集的相应信道而设置的信号范围。
16.如权利要求9所述的方法，其特征在于，进一步包括在将所述第一和第二采集器的信道上的脉冲分配给所述特定微粒的所述步骤之后，使用流过所述流式细胞仪的不同校准微粒重新校准所述流式细胞仪，其中重新校准所述流式细胞仪的所述步骤包括计算随后流过所述流式细胞仪的微粒的新飞行时间。
17.一种用于识别流中的微粒的系统，包括：
用于当微粒流过流式细胞仪时，监控对应于所述微粒的可测量参数的数据信号的装置；
用于检测从所述流式细胞仪的不同采集器产生的两个数据信号的装置，其中所述两个数据信号具有分别符合特定微粒集的预定范围的值；
用于计算所检测到的两个数据信号之间的时间差的装置；
用于基于对所述两个数据信号的检测和计算得到的所述两个数据信号的时间差，计算不同预定范围内的数据信号预期在另一采集器处产生的时间点的装置；以及
用于随后执行两个决定性动作中的一个的装置，所述两个决定性动作包括：
一旦确定从另一采集器采集的所述数据信号在不同的预定范围内，就验证所述特定微粒集中的微粒已被识别；以及
一旦确定从另一采集器采集的所述数据信号不在不同的预定范围内，就拒绝所检测到的两个数据信号作为所述特定微粒集的微粒的代表。
18.如权利要求17所述的系统，其特征在于，所述数据信号从包括散射信号、报告标签信号、荧光信号、磁信号以及电磁谐振信号的组中选出。
19.如权利要求17所述的系统，其特征在于，所述两个数据信号都是荧光信号。
20.如权利要求17所述的系统，其特征在于，从另一采集器采集的所述数据信号是散射信号。
21.如权利要求17所述的系统，其特征在于，所述系统还包括用于执行以下动作的装置：
一旦验证所述特定微粒集的微粒已被识别，就根据所述微粒的飞行时间和对应于所述不同采集器的相应询问点的相对位置来检测从所述不同采集器接收且在不同时间点产生的其他信号脉冲；
将所述其他信号脉冲关联到不同微粒集中的微粒；以及
基于所关联的信号脉冲确定所述不同微粒集中的微粒的特征。
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