CN101939648B - 生物靶标的免疫磁性捕获和成像 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于对复杂基质样品中具有统计学显著数目的生物细胞或其它目的生物分析物进行标记、分离、检测和/或计数的方法和系统。通过免疫磁性分离从样品混合物中分离目的生物靶标。向成像腔室引入样品后，捕获复合物(生物靶标-磁性捕获剂)将被磁场吸引并会位于成像系统焦平面中的腔室表面上。

Description

生物靶标的免疫磁性捕获和成像
发明背景
本申请要求2008年1月7日提交的美国临时专利申请序列号No.61/019,482的优先权。上述引用的公开内容作为整体通过引用并入本文。
A.技术领域
本发明一般地涉及检测生物分析物例如细胞、孢子(spore)或细菌。更特别地，本发明涉及免疫磁性分离以及荧光检测这样的生物分析物，其可以广泛的浓度范围存在，并且可位于复杂的生物或环境样品基质中。
B.相关领域的描述
对生物细胞进行研究、表征和统计总是依赖于成像工具的使用，其允许对肉眼无法直接看到的事物进行观察。自从1665年罗伯特虎克(The Cell-A molecular approach；Geoffrey M.Cooper.ASM Press.1997)首次报道了对细胞的科学观察，显微术领域便成就了细胞生物学领域。从基础的早期明视场光学显微镜到最近的扫描电子显微镜，细胞生物学家们利用了这些技术日益提高的放大倍率和分辨力。如今，这些功能强大的显微镜与数字成像的整合更加扩大了这一领域的范围。现在，显微术可与功能强大的图像处理技术结合，以用于快速且自动化地分析多种样品。
尽管显微镜的成像能力已经过几个世纪的发展，然而样品制备通常仍是成像前单独进行的工作。通常，将样品中的目的靶标元件(细胞的细胞核或细胞的膜等)进行染色或着色，以使其能够进行观察。尚没有整合的设备可分析所需的所有步骤，例如样本制备、靶细胞成像和表征，以及然后在样品分析后成像腔室的再生。显微镜玻璃载玻片和盖玻片由于使用简便且成本低廉仍被广泛用于承载样品。许多芯片式实验室(lab-on-a-chip)技术使用某种形式的显微术(明视场或荧光显微术)和成像方法作为检测器；但常常缺少紧凑型成像腔室的整合性。在这方面，许多芯片式实验室装置仍处于其起步阶段。扫描电子显微镜(SEM)仪器同样缺乏样品制备自动化，每个样品均需要在分析前单独地装载到样品台上并用金属包被。因此，显微术系统通量较低。样品制备、将样品置于焦平面上以及定位于目的区域仍然是耗时费力的工作。
对细胞(大小、形状)进行表征以及对细胞表面标志物进行表征可通过流式细胞术来实现。20世纪70年代末以来，流式细胞术已协助科学家实现对多种细胞类型的分析，并较之其它基于细胞的技术提供了诸多优势，包括：速度、细胞生存力和细胞功能的保持以及同时测量多个细胞参数。
流式细胞术的吸引人之处在于荧光技术的灵活性和灵敏度，以及该技术的高速性和强大的数据整合能力。流式细胞术是目前分选和分析细胞的黄金标准方法(Bioinformatics Market Research 2006Report#06-030：″influencing brand preference in the flow cytometry market″)。尽管流式细胞仪改善了细胞分析的通量，然而它们价格昂贵而且操作技术复杂。即使最便宜的流式细胞仪型号其价格也超过10万美元，而更高端型号的价格则超过30万美元。此外，流式细胞仪需要训练有素的操作人员，并且他们对光学校准中的偏移非常敏感。因此，这些仪器的整个购买和操作成本使许多实验室无法承受，特别是那些位于资源匮乏国家的实验室。另外，流动系统通常被设计为一次测量单个颗粒，因此收集多个颗粒的图像需要更长的时间。
发明概述
在一个实施方案中，本发明提供了用于固定和检测样品中生物靶标的方法，其包括(a)将样品与磁性捕获剂相接触，所述磁性捕获剂针对可能存在于样品中的生物靶标上的特定表位具有特异性亲和力；(b)将所述样品与第一标记试剂相接触，所述第一标记试剂针对所述生物靶标上的特定表位具有特异性亲和力；(c)将样品等分试样引入腔室中；(d)向所述腔室施加磁场以吸引磁性捕获剂至腔室表面；(e)对通过与磁性捕获剂结合而被固定在腔室表面上并通过与标记试剂结合而被标记的生物靶标进行检测和计数；以及(f)对经固定且经标记的生物靶标进行检测和计数。在一些实施方案中，所述方法还包括确定是否有统计学显著数目的经标记生物靶标被固定于腔室表面上，以及将另外一份或多份样品引入腔室中直至有统计学显著数目的经标记生物靶标被固定于腔室表面上。在一些实施方案中，所述方法还包括确定固定于腔室表面上的经标记生物靶标的数目是否超过最大阈值，如果超过最大阈值的话，则清洗成像腔室并向腔室引入一份或多份更小的样品等分试样直至固定于腔室表面上的经标记生物靶标的数目为统计学显著的同时低于最大阈值。在一些实施方案中，所述方法还包括记录所检测生物靶标的数目。
所述磁性捕获剂和标记试剂可以对同一表位或不同表位具有特异性亲和力。可以在将样品引入腔室之前或者在将样品引入腔室之后使样品与磁性捕获剂接触。可以在将样品引入腔室之前或者在将样品引入腔室之后使样品与标记试剂接触。在本发明的某些方面中，可以将样品与另外的磁性捕获剂(例如，针对与第一捕获剂不同的表位具有特异性亲和力的第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第二十、第五十或更多的磁性捕获剂)接触。所述不同的表位可位于所述第一捕获剂所识别之表位的同一生物靶标上，或者可位于不同的生物靶标上。在本发明的一些方面中，可以将样品与另外的标记试剂(例如，针对生物靶标上的特定表位具有特异性亲和力的第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多标记试剂)接触，其中所述另外的标记试剂通过不同于所述第一标记试剂之标记物的标记物进行标记。在一些实施方案中，所述第一标记试剂与所述第二、第三、第四、第五等标记试剂针对存在于不同生物靶标群上的不同表位具有特异性亲和力。
在另一实施方案中，本发明提供了用于固定和检测样本中一个或多个生物靶标群和/或亚群的方法，其包括：(a)将样品与磁性捕获剂相接触，所述磁性捕获剂针对可能存在于样品中的生物靶标群上的特定表位具有特异性亲和力；(b)将所述样品与第一标记试剂相接触，所述第一标记试剂针对所述生物靶标群上的特定表位具有特异性亲和力；(c)将所述样品与第二标记试剂相接触，所述第二标记试剂针对生物靶标群中第一生物靶标亚群上的特定表位具有特异性亲和力；(d)将所述样品与第三标记试剂相接触，所述第三标记试剂针对生物靶标群中第二生物靶标亚群上的特定表位具有特异性亲和力；(e)将样品等分试样引入腔室中；(f)向所述腔室施加磁场以吸引磁性捕获剂至腔室表面；(g)对通过与磁性捕获剂结合而被固定在腔室表面上并通过与所述第一标记试剂结合而被标记的生物靶标进行检测和计数；(h)对用所述第一、第二和第三标记试剂之每一种标记的经固定生物靶标进行检测和计数。在一些实施方案中，所述方法还包括确定是否有统计学显著数目的经标记生物靶标被固定于腔室表面上，以及将另外一份或多份样品引入腔室中直至有统计学显著数目的经标记生物靶标被固定于腔室表面上。
在一些方面中，所述方法还包括将所检测出的生物靶标数与样品中的生物靶标数建立关联。这种关联可包括例如确定样品中生物靶标的浓度和/或确定样品中生物靶标的总数。当测定两种或更多种不同的生物靶标时，所述方法还可包括确定生物靶标之第一群或亚群与生物靶标之第二群或亚群的比值。所述方法还可包括计算第一生物靶标亚群在生物靶标群中的百分比。所述方法还可包括计算第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多细胞亚群在细胞群中的百分比。
在一些实施方案中，所述方法还包括在成像腔室中检测和计数生物靶标之前的清洗步骤，以除去未被磁场固定的样品组分。所述清洗步骤可以在样品加载过程中每次检测和计数之前进行，也可以仅在最后的检测和计数步骤之前进行。
所述生物靶标可以是任何感兴趣的生物靶标。在一些特定的实施方案中，所述生物靶标是细胞。所述细胞可以是例如真核细胞或原核细胞。真核细胞包括但不限于哺乳动物细胞、鱼类细胞、两栖动物细胞、鸟类细胞、爬行动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或真菌细胞。在本发明的一些方面中，所述细胞是淋巴细胞、白细胞或单核细胞。所述原核细胞可以是例如细菌细胞或细菌芽孢，或本领域技术人员已知的任何其它生物分析物。当所述生物靶标是细胞时，被捕获剂和标记试剂所检测的表位优选是位于细胞表面上的表位。例如，如果生物靶标是T细胞，则表位可以是CD3、CD4、CD8、CD45、CD38和/或CD70中的一种或多种。
所述生物靶标可以存在于样品中。样品可以是含有细胞或怀疑含有细胞的任何组合物。在本发明的一些方面中，所述样品可以是从对象(例如人)获得的体液(包括但不限于全血、血清、唾液、尿液、精液)。在本发明的一些方面中，所述对象患有或怀疑患有疾病。例如，所述对象可能患有由细菌或病毒感染引起的疾病。在一个实施方案中，所述对象已被或怀疑被HIV感染。在本发明的另一些方面中，所述样品是环境样品，例如土壤、水或空气样品，或者是在人周围发现的其它物质。
所述捕获剂可以是抗体、适配体(aptamer)、核酸探针(例如但不限于DNA或RNA)、蛋白质或者与目的生物靶标特异性结合的任何其它天然或合成的分子。所述捕获剂通过与磁性颗粒偶联而具有磁性响应。例如，所述捕获剂可与羧基官能化的磁性颗粒偶联。所述磁性颗粒可以是磁性的、顺磁性的或超顺磁性的。可在生物靶标周围使用多单位的捕获剂，从而产生能被设备之磁场吸引的磁性复合物。所述捕获剂策略可包括捕获大于目的生物靶标群的生物靶标群。
所述标记试剂可以是抗体、适配体、核酸探针(例如但不限于DNA或RNA)、蛋白质或者与目的靶标分析物特异性结合的任何其它天然或合成的分子。所述标记试剂可被检测设备所检测到，因为它们与报告分子(例如荧光分子或本领域已知的其它生物标记物)相偶联。被捕获剂和磁场捕获的某些生物靶标不必要由任意标记试剂所显示。
标记试剂(也可称为“报告物”)是辅助检测出与其相连之分子的分子。直接报告分子包括荧光团、生色团和放射团(radiophore)。非限制性的荧光团实例包括：红色荧光方酸菁染料(squarine dye)(例如，2，4-双[1，3，3-三甲基-2-亚吲哚啉基甲基]cyclobutenediylium-1，3-dioxolate(2，4-Bis[1，3，3-trimethyl-2-indolinylidenemethyl]cyclobutenediylium-1，3-dioxolate))、红外染料(例如，2，4-双[3，3-二甲基-2-(1H-苯并[e]亚吲哚啉基甲基)]cyclobutenediylium-1，3-dioxolate(2，4-Bis[3，3-dimethyl-2-(1H-benz[e]indolinylidenemethyl)]cyclobutenediylium-1，3-dioxolate))或橙色荧光方酸菁染料(例如2，4-双[3，5-二甲基-2-吡咯]cyclobutenediylium-1，3-diololate(2，4-Bis[3，5-dimethyl-2-pyrrolyl]cyclobutenediylium-1，3-diololate))。荧光团的另一些非限制性实例包括量子点(quantum dot)、Alexa
Figure BPA00001190304600051
染料、AMCA、
Figure BPA00001190304600052
630/650、
Figure BPA00001190304600053
650/665、
Figure BPA00001190304600054
Figure BPA00001190304600055
Cascade
Figure BPA00001190304600056
CyDyeTM(包括但不限于Cy2TM、Cy3TM和Cy5TM)、DNA嵌入染料、6-FAMTM、荧光素、HEXTM、6-JOE、Oregon
Figure BPA00001190304600057
Oregon
Figure BPA00001190304600058
500、Oregon
Figure BPA00001190304600059
Pacific BlueTM、REG、藻胆蛋白(包括但不限于藻红蛋白和别藻蓝蛋白)、Rhodamine GreenTM、RhodamineRedTM、ROXTM、TAMRATM、TETTM、四甲基罗丹明或Texas
Figure BPA000011903046000510
可使用信号放大试剂(例如酪胺(PerkinElmer))来增强荧光信号。间接报告分子包括生物素，其必须与另一分子例如链霉亲和素-藻红蛋白结合以用于检测。还可使用成对的标记物，例如荧光共振能量转移对或染料-淬灭剂对。
本发明还提供了试剂盒，其提供了可用于本文公开之方法中的各种组分。在一个实施方案中，所述试剂盒可包含一种或多种磁性捕获剂以及一种或多种标记试剂。在一些方面中，所述试剂盒包含针对生物靶标上特定表位具有特异性亲和力的磁性抗体以及针对生物靶标上特定表位具有特异性亲和力的标记试剂。
在一个实施方案中，本发明提供了用于对生物靶标进行免疫捕获和成像的系统。在一些方面中，所述系统包含：成像系统、适于引入成像系统的标记试剂和磁性捕获剂、针对生物靶标上特定表位具有特异性亲和力的标记试剂和磁性捕获剂、将磁场选择性地引入成像系统的磁体(其用于固定磁性捕获剂以及与磁性捕获剂结合的任何生物靶标和标记试剂)。
应当理解，本文所述的任何方法或组合物的实施可与本文所述的任何其它方法或组合物相关联。
权利要求中使用的术语“或”用于指“和/或”，指明仅择一选择或者备选方案之间互相排斥除外，然而本公开内容支持择一选择以及“和/或”的定义。
在本申请中，术语“约”用于表示数值包含由于测定该数值所应用的装置或方法所导致的标准差。
根据现行专利法，无数量词修饰的词语当与“包括/包含”一起在说明书和权利要求中使用时，是指一个(种)或多个(种)，特别指明除外。
根据以下的详细描述，本发明的其它目的、特征和优点将显而易见。然而，应该理解，该详细描述和具体实施例(即本发明的具体实施方案)仅通过举例说明的方式给出，因为根据该详细描述，在本发明精神和范围内的各种变化和改动对于本领域技术人员来说均是显而易见的。
附图说明
以下附图构成了本申请说明书的一部分，其进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多幅并结合本文中具体实施方案的详细描述，可更好地理解本发明。
图1A、1B和1C显示流体处理系统的框图。
图2显示成像装置之光学构造的框图。
图3显示成像系统的框图。
图4显示成像系统的框图。
图5显示成像系统的框图。
图6是成像系统侧视图的示意图。
图7示意在样品加载期间不同时间点的成像系统视野。
图8A、8B和8C示意从三个检测通道获得的图像。
图9是采用分类通道获取的倒像，其显示经标记的珠。
图10是采用报告通道获取的倒像，其显示经标记的CD4+细胞和经标记的珠。
图11是一系列倒像，其显示随着向成像腔室引入额外的样品等分试样，视野中目标物密度的增加。
图12是一系列倒像，其显示高浓度样品的成像。等分试样1的浓度过大以至于不能很好地进行分析。在彻底清洗成像腔室后，将第二等分试样(其量为等分试样1的三分之一)加载到腔室中。等分试样2的浓度过大以至于不能很好地进行分析。在又一次彻底清洗成像腔室后，将第三等分试样(其量为第一等分试样的六分之一)加载到腔室中。等分试样3使得腔室中的目标物浓度适于进行进一步处理。
发明详述
本发明涉及用于对存在于复杂基质样品中的具有统计学显著数目的生物细胞或其它目的生物分析物进行标记、分离、检测和/或计数的方法和系统。从样品混合物中分离目的生物靶标通过免疫磁性分离来实现。将针对目的生物靶标上特定表位具有特异性亲和力的磁性捕获剂与生物靶标结合，以使其具有磁性响应。当向设备的成像腔室引入样品后，所述捕获复合物(生物靶标-磁性捕获剂)将被磁场所吸引并位于成像系统焦平面中的腔室表面上。优选地，将其余的样品(非磁性的)从成像腔室中洗去。所述方法可利用成像系统(例如本文所述的成像系统)以及专利申请序列号No.11/757,841(名称为“Systems and methods forperforming measurements of one or more materials”，其已通过引用并入本文中)所述的设备来实施。
还使用检测试剂(例如荧光标记的抗体)在样品中直接标记生物靶标。对生物靶标的标记允许使用设备的光学和成像功能对所捕获的生物靶标进行观察。由于设备具有多重能力(多种激发光源和多个检测通道)，使得鉴定多种生物靶标群成为可能，例如具有多种标记物的生物靶标(该生物靶标属于多个群或亚群)或具有独特标记物的不同生物靶标(每种生物靶标属于独特的群或亚群)。
对经分离且经标记的生物靶标进行计数通常通过将荧光目标物区别于成像腔室中的暗背景并通过应用图像处理算法来实现，从而基于尺寸、半径、圆度和其它相关测量值来鉴定以及计数生物靶标。
向成像腔室中引入样品可进行实时监测。所述设备的这种功能使得能够调整样品量，从而分离出具有统计学显著数目的生物靶标。与一般样品相比，向成像腔室中加载的含有低浓度生物靶标的样品的量更大。或者，含有高浓度生物靶标的样品的加载量更小。当完成样品加载步骤后，使用图像处理算法对所有靶向的生物靶标群进行计数。需要的话，在分析结束时，撤除磁场以便于对成像腔室进行彻底的清洗和再生。
可如下计算样品中生物靶标的浓度：通过了解设备中所加载样品的总体积、视野面积与成像腔室总面积的比值以及捕获效率来对成像腔室视野中的生物靶标计数。一旦生物靶标被加载至成像腔室中，由于磁场的存在，它们将被捕获。对于一个特定的应用，所述系统和方法需要具有如下特征，即设备对于目的生物靶标的捕获效率是已知的。此外，所述成像腔室也需要具有如下特征，即成像视野相对于腔室总表面积的比例是已知的。所述图像处理算法使得能够对视野内的细胞进行计数，并且所述算法将根据所检测到的细胞数来执行加载额外的样品或者执行清洗程序。
捕获效率表示腔室中捕获的生物靶标占腔室中所加载之生物靶标总数的百分比。有许多因素影响捕获效率。当生物靶标是细胞时，这些因素可包括：目的细胞表面上可用的受体(或标志物)的数目；结合到表面的磁性颗粒的数目、捕获试剂(例如抗体)针对特定受体的亲和力以及孵育时间和试剂浓度；磁场强度；腔室的大小和深度；样品的粘度；以及样品通过腔室时的速度。
有两个独立的目标与捕获效率相关--最大化和进行表征。使捕获效率最大化将使得能够使用较小的样品量。这对于定性测定(其目标是检测样品中是否存在某一细胞、细菌或孢子，而并非对样品中的浓度进行定量，例如检测环境样品中的炭疽芽孢)来说会降低检出限。通过将样品加载到较小的成像腔室中，在视野中存在目的分析物的概率提高，则检出限得以改善。对于定量测定来说，其目标不仅是检测是否存在某一靶标，还是对样品中靶标物的浓度进行定量。在这种情形中，需要对捕获效率进行表征并使之保持一致，以便能使所检出的靶标(例如细胞)数与样品中实际的靶标(例如细胞)数量相关联。可通过如下方式对捕获效率进行表征和测量：使用含有已知量生物靶标(例如特定的细胞群)的标准样品，将所述样品加载至成像腔室中，并测量可被检出的生物靶标数。然后，可将所检出的生物靶标数与生物靶标的实际数目进行比较以计算捕获效率。
基于常规的“增加体积(the added volumes)”分析方法，替代性的方法包括：制备样品等分试样，并在进行任何样品处理步骤之前向每个等分试样加入已知量的生物靶标。对每个等分试样中生物靶标的测量使得能够得到标准曲线，该标准曲线涵盖了属于其固有参数的捕获效率(以及在样品处理步骤中或来自样品的任何其它变化)。对样品中生物靶标的测量值继而可外推至该标准曲线，从而计算样品中的细胞浓度。这种方法对于如下情形中的样品特别有意义，即所述样品中的细胞浓度非常低，即使加载全部样品也不足以捕获到具有统计学显著数目的细胞。通过加入已知量的细胞并制作标准曲线，该方法能够测量比常规方法所定义之阈值浓度低的样品。
所述成像腔室也对有效捕获生物靶标的能力产生影响，对其的设计针对具体应用而定。对于总样品量很小以及可供捕获之生物靶标的潜在数量很低的应用，需要尽可能高的捕获效率并且可使用尽可能小尺寸的成像腔室。成像腔室的宽度和长度较小意味着所捕获的生物靶标将分散于较小的成像表面上，这将增加视野内的细胞密度。此外，薄的腔室将使生物靶标接受的磁场力梯度较小并且会使所有样品均更接近于磁体。生物靶标越接近磁体，磁场的引力会越强，捕获效率也将越高。对于样品量可能非常大以及足以进行定量响应的应用，可以将成像腔室设计成较大的尺寸，从而在同一时间内处理更多的样品，而无需增加样品引入速度。
对于大小不同的细胞、孢子或细菌的检测，可以改变和优化所述仪器的放大倍率：分析物越大，所需的放大倍率越低。检测靶标的限制因素是整个光路的分辨率。为了使图像处理算法能够鉴定目标并根据其大小、形状或半径有效地进行表征，所述目标的大小优选为至少5×5像素。
所述图像处理算法根据视野的原始图像确定生物靶标的数目。相对于背景信号，将视野中的每一个荧光目标物鉴定出来。然后，对每个目标的大小(像素的长和宽)、圆度(定义为目标周长的平方除以(4×π×目标面积)的比值)和/或其它认为必要的目的测量值(直径、面积、半径等)进行表征。使用这种方法，任意大小和形状的非特异性荧光目标物将被排除在从总计数之外。所有其余的目标物则计入生物靶标数中。
一旦开始进行检测和计数过程，就可能要不断重复该过程，直到计算出样品中的细胞终浓度。这样，所计数的靶标(例如珠、细胞或其它生物靶标)数目可超出某一阈值，因而被认为是统计学显著的。常使用的阈值下限是30，因为正态分布的统计分析可以在样品量大于30时进行。但是，也可以使用其它阈值下限(例如35、40、45或50)，从而尽可能地使图像处理和测量误差的影响最小。作为上限，阈值可以定义为预定的靶标数(例如100、200、300、400、500或1000个靶标)。阈值还可根据视野中存在的双联体数来定义：随着视野中靶标数的增加，两个靶标重叠的概率将增加，于是双联体的出现更加频繁。当双联体的出现频率不再与所加载样品量呈线性关系时，刚可视为已达到阈值上限。
当靶标数低于阈值下限时，所述图像处理算法会在再次计数之前指示加载额外的样品。这一过程将重复进行，直到视野中的靶标数到达预先设定的阈值下限但仍低于阈值上限时。或者，在各次计数之间彻底清洗成像腔室，可以将分别计数的数目保存，继而进行加和，直至达到阈值下限。如果超过阈值上限，则可以将磁场从成像腔室撤除，对成像腔室进行清洁(例如，利用旁通管路倒入驱动/清洗流体并流过腔室)，然后将更小的样品等分试样加载至成像腔室。最后的计数步骤将作为其它进一步计算细胞浓度的依据。
虽然最小阈值和最大阈值策略因其简便性而具有吸引力，但是也可以定义和实施另一些策略或另一些条件，以确定所检测目标的数目是否足够。例如，可同时测量所计数目标的大小(而非通过定义阈值上限)来获得最大计数。高浓度的样品会导致大量靶标目标的显著重叠。多个无法分辨的重叠目标会被计数为单一目标，而其大小会被表征为大的聚集体。因此，对超过特定大小的目标计数以及定义这些大目标的最大数目也可用于鉴定浓度过高的样品。
由于使用了例如精确的注射泵从而将样品推入样品环并将其注射入主驱动流体管路，因此加载到腔室中的样品总体积是可知的。这种双管路方法使得能够对样品进行实时稀释，从而减慢样品的引入并且降低了样品的粘度，从而改善了捕获效率。所述驱动流体含有能够稀释样品的缓冲溶液。所述驱动流体可以与清洗缓冲液是同一缓冲液。通过将样品管路与主驱动流体管路合并，所述驱动流体将有效地稀释样品并将其运送至成像腔室。改变样品并入主驱动流体管路的速度将会得到不同的稀释系数。这使得能够有效地加载不同体积的样品，特别是小体积的样品。
如果同时分析生物靶标的多个群和/或亚群，则可使用多种荧光标记物或其它报告分子以区分不同的生物靶标群和/或亚群。对于每个所用的检测通道以及对于生物靶标的每个群和/或亚群，重复先前段落中所述的计算。在每次计算中，生物靶标的捕获效率可以相同或不同。在任何情况下(如在单独(single-plex)模式中)，捕获效率需要表征为使得能够计算样品中生物靶标的浓度。
为了验证所述系统的持续稳定性，可以在分析样品之前使用并测试一系列对照。这样的对照可包括一系列荧光磁性微球，例如LuminexMagPlex珠。所述一系列对照通过制备具有不同含量磁石制备的微球来构建。为了区分它们，系列中的每个微球可使用例如标准Luminex染色方法来进行独特编码。本领域技术人员还可以使用其它的编码技术(例如但不限于大小差异、光散射特征、光发射、光吸收)来制备不同的微球系列。而后，每个系列将通过其编码和预期的捕获效率进行定义，并且可以校准所述仪器从而使实际捕获效率与预期捕获效率相匹配。
所述微球对照系列还可用于表征生物靶标的磁化作用。通过比较靶标的捕获效率与微球对照的捕获效率，可通过所述对照的磁石含量来估计靶标周围的磁石含量。随后，可对孵育时间进行优化以确保靶标周围具有足够的磁石含量，同时仍使整个测定在合理的时间内完成。
A.成像系统
图1-6示意可进行本发明方法的多种设备。值得注意的是，这些图并非按比例绘制。特别地，为了强调某些元件的特征，附图中这些元件的比例被夸大了。使用同样的附图标记来标识那些在多幅图中出现并且配置类似的元件。需要进一步注意的是，对这些设备的描述只是示例性的，并出于教导本领域技术人员以一般方式实施本发明的目的。根据本说明书，实施进一步修改和替代性实施方案对于本领域技术人员来说是显而易见的。
图1A、1B、1C和2中所示的实施方案一般性地涉及配置用于将一种或多种材料从一个或多个容器转移到测量装置的成像空间(imagingvolume)的系统。该系统包含三个主要组成部分：流体处理、光学配置和颗粒固定化子系统。图1A-C显示三种配置中的流体处理子系统的功能组件，而图2则示意光学子系统的功能组件。
在图1A-C的流体处理子系统中，样品从样品储存容器12转移到测量装置的成像腔室10中。所述成像空间可被配置为成像腔室10，其还可具有本领域已知的任何合适的配置。储存容器12可被配置为Vacutainer管、离心管、注射器、微量滴定板或本领域已知的任何其它合适的样品容器。
所述系统还包含双向泵14，其配置用于将流体吸入储库，之后再将流体从储库排出并进入腔室10的成像空间。泵14可具有本领域已知的任何合适的配置。如本文进一步所述，由于生物靶标在暴露期间是基本上被固定的，因此不需要无脉冲流动(例如由昂贵的注射泵获得的无脉冲流动)。在泵14和样品阀18之间的管16的长度可构成足够用的储库。这样的储库常称作“样品环(sample loop)”。该管还可具有任何合适的配置。样品阀18的功能是当从样品储存容器12吸气时将样品探头15与储库(样品环16)连接起来，以及当分配时将储库与成像腔室10连接起来。样品阀18可包括本领域已知的任何合适的阀。
泵阀20用在储库(样品环16)的泵末端。在图1A中，泵阀20连接到驱动溶液储存容器和清洗溶液储存容器。这种配置可用于需要使用不同组成之驱动溶液和清洗溶液的情况下。然而，驱动溶液和清洗溶液可使用同样的溶液，在该情况下，可以使用一个储存容器。图1B和1C显示泵阀20连接到驱动/清洗溶液储存容器。图1C显示旁通管路(by-pass line)17，其允许在引入部分样品后清洗成像腔室10，而不必使用储存有剩余样品的样品环16。因此，旁通管路实现了依次加载来自样品环16中相同样品的等分试样，从而适应于不同的样品浓度，以扩展本方法的可用范围。如果没有旁通管路17，则清洗而后将额外的样品加载至成像腔室10中涉及彻底冲洗样品环16，然后再一次从样品储存容器12获取样品以重新加载样品环16。尽管这种方法是可用的，但相比采用旁通管路来说其是低效且浪费的。泵阀20可包括本领域已知的任何合适的阀。在一些替代性的实施方案中，可以将所述泵阀和清洗阀合并为单个阀。泵14也可配置用来将成像腔室10中的一种或多种材料和任何其它流体运送至废物容器24。废物容器24可具有本领域已知的任何合适的配置。
运行图1A-C示意的流体处理子系统有三种主要模式来将样品加载至成像腔室10，即包括样品清洗的加载程序、不包括样品清洗的加载程序和重复加载程序。在图1A所示的流体处理子系统中，不包括样品清洗的加载程序一般如下进行：
清洁系统：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移向位置3。
5)移动磁体262使其远离成像腔室10。
6)推入驱动溶液使其穿过腔室，以清洁腔室10。
7)样品阀18，由位置1移向位置2。
8)推入驱动溶液使其穿过探头15，以清洁探头。
加载样品：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移向位置2。
5)放低探头15使之进入样品储存容器12。
6)将样品加载至样品环16中。
7)抬高探头15并拔出，直到样品阀18中具有空气并且全部样品均在样品环16中。
8)样品阀18，由位置1移向位置3。
9)移动磁体262使其靠近成像腔室10。
10)将样品从样品环16推入成像腔室10中，捕获磁性捕获剂以及与其结合的任何生物靶标和检测试剂(捕获复合物)。
11)获取固定的捕获复合物的图像。
清洁系统：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移向位置3。
5)移动磁体262使其远离成像腔室10。
6)推入驱动溶液使其穿过腔室10，以清洁腔室。
7)样品阀18，由位置1移向位置2。
8)推入驱动溶液使其穿过探头15，以清洁探头。
在图1A所示的流体处理子系统中，包括样品清洗的加载程序一般如下实施：
清洁系统：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移向位置3。
5)移动磁体262使其远离腔室10。
6)推入驱动溶液使其穿过腔室10，以清洁腔室。
7)样品阀18，由位置1移向位置2。
8)推入驱动溶液使其穿过探头15，以清洁探头。
预加载清洗溶液：
1)泵阀20移向位置b。
2)加载清洗溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移向位置3。
5)推入清洗溶液使其穿过腔室。
6)样品阀18，由位置1移向位置2。
7)推入清洗溶液使其穿过探头15(用清洗溶液预加载样品环16和探头15)。
加载样品：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移向位置2。
5)放低探头15使之进入容器12。
6)将样品加载至样品环16中。
7)抬高探头15并拔出，直到样品阀中具有空气并且全部样品均在样品环16中。
8)样品阀18，由位置1移向位置3。
9)移动磁体262使其靠近腔室10。
10)将样品从样品环16推入腔室10，捕获磁性捕获剂以及与其结合的任何生物靶标和检测试剂(捕获复合物)。
11)在样品之后将清洗溶液推入样品环16中，流过捕获复合物从而“清洗”所述捕获复合物。
12)获取固定的捕获复合物的图像。
清洁系统：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移向位置3。
5)移动磁体262使其远离腔室10。
6)推入驱动溶液使其穿过腔室10，以清洁腔室。
7)样品阀18，由位置1移向位置2。
8)推入驱动溶液使其穿过探头15，以清洁探头。
在图1A所示的流体处理子系统中，所述重复加载程序一般如下实施：
清洁系统：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移向位置3。
5)移动磁体262使其远离腔室10。
6)推入驱动溶液使其穿过腔室10，以清洁腔室。
7)样品阀18，由位置1移向位置2。
8)推入驱动溶液使其穿过探头15，以清洁探头。
预加载清洗溶液：
1)泵阀20移向位置b。
2)加载清洗溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移向位置3。
5)推入清洗溶液使其穿过腔室。
6)样品阀18，由位置1移向位置2。
7)推入清洗溶液使其穿过探头15(用清洗溶液预加载样品环16和探头15)。
加载样品：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移向位置2。
5)放低探头15使之进入容器12。
6)将样品加载至样品环16中。
7)抬高探头15并拔出，直到样品阀中具有空气并且全部样品均在样品环16中。
8)样品阀18，从位置1移向位置3。
9)移动磁体262使其靠近腔室10。
10)将样品从样品环16推入腔室10，捕获磁性捕获剂以及与其结合的任何生物靶标和检测试剂(捕获复合物)。
11)在样品之后将清洗溶液推入样品环16中，流过捕获复合物从而“清洗”所述捕获复合物。
12)获取固定的捕获复合物的图像。
13)使用图像分析算法处理图像并确定是否需要进一步加载样品。如果需要进一步加载样品，则再次从步骤1启动加载样品程序。如不需要进一步加载样品，则进行“清洁系统”程序。
清洁系统：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移向位置3。
5)移动磁体262使其远离腔室10。
6)推入驱动溶液使其穿过腔室10，以清洁腔室。
7)样品阀18，由位置1移向位置2。
8)推入驱动溶液使其穿过探头15，以清洁探头。
在图1B所示的流体处理子系统中，不包括样品清洗的加载程序一般如下实施：
清洁系统：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动/清洗溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移动至位置3。
5)移动磁体262使其远离成像腔室10。
6)推入驱动/清洗溶液使其穿过腔室，以清洁腔室10。
7)样品阀18，由位置1移向位置2。
8)推入驱动/清洗溶液使其穿过探头15，以清洁探头。
加载样品：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动/清洗溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，从位置1移向位置2。
5)放低探头15使之进入样品储存容器12。
6)将样品加载至样品环16中。
7)抬高探头15并拔出，直到样品阀18中具有空气并且全部样品均在样品环16中
8)样品阀18，从位置1移向位置3。
9)移动磁体262使其靠近成像腔室10。
10)将样品从样品环16推入成像腔室10，捕获磁性捕获剂以及与其结合的任何生物靶标和检测试剂(捕获复合物)。
11)获取固定的捕获复合物的图像。
清洁系统：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动/清洗溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，从位置1移向位置3。
5)移动磁体262使其远离成像腔室10。
6)推入驱动/清洗溶液使其穿过腔室10，以清洁腔室。
7)样品阀18，从位置1移向位置2。
8)推入驱动/清洗溶液使其穿过探头15，以清洁探头。
在图1B所示的流体处理子系统中，包括样品清洗的加载程序一般如下实施：
清洁系统：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动/清洗溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移向位置3。
5)移动磁体262使其远离腔室10。
6)推入驱动/清洗溶液使其穿过腔室10，以清洁腔室。
7)样品阀18，由位置1移向位置2。
8)推入驱动溶液使其穿过探头15，以清洁探头。
加载样品：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动/清洗溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移向位置2。
5)放低探头15使之进入容器12。
6)将样品加载至样品环16中。
7)抬高探头15并拔出，直到样品阀中具有空气并且全部样品均在样品环16中。
8)样品阀18，由位置1移向位置3。
9)移动磁体262使其靠近腔室10。
10)将样品从样品环16推入腔室10，捕获磁性捕获剂以及与其结合的任何生物靶标和检测试剂(捕获复合物)。
11)在样品之后将驱动/清洗溶液推入样品环16中，流过捕获复合物从而“清洗”所述捕获复合物。
12)获取固定的捕获复合物的图像。
清洁系统：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动/清洗溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移向位置3。
5)移动磁体262使其远离腔室10。
6)推入驱动/清洗溶液使其穿过腔室10，以清洁腔室。
7)样品阀18，由位置1移向位置2。
8)推入驱动溶液使其穿过探头15，以清洁探头。
在图1B所示的流体处理子系统中，重复加载程序一般如下实施：
清洁系统：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动/清洗溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移向位置3。
5)移动磁体262使其远离腔室10。
6)推入驱动/清洗溶液使其穿过腔室10，以清洁腔室。
7)样品阀18，由位置1移向位置2。
8)推入驱动/清洗溶液使其穿过探头15，以清洁探头。
加载样品：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动/清洗溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移向位置2。
5)放低探头15使之进入容器12。
6)将样品加载至样品环16中。
7)抬高探头15并拔出，直到样品阀中具有空气并且全部样品均在样品环16中。
8)样品阀18，由位置1移向位置3。
9)移动磁体262使其靠近腔室10。
10)将样品从样品环16推入腔室10，捕获磁性捕获剂以及与其结合的任何生物靶标和检测试剂(捕获复合物)。
11)在样品之后将驱动/清洗溶液推入样品环16中，流过捕获复合物从而“清洗”所述捕获复合物。
12)获取固定的捕获复合物的图像。
13)使用图像分析算法处理图像并确定是否需要进一步加载样品。如果需要进一步加载样品，则再次从步骤1启动加载样品程序。如不需要进一步加载样品，则进行“清洁系统”程序。
清洁系统：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动/清洗溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移向位置3。
5)移动磁体262使其远离腔室10。
6)推入驱动/清洗溶液使其穿过腔室10，以清洁腔室。
7)样品阀18，由位置1移向位置2。
8)推入驱动/清洗溶液使其穿过探头15，以清洁探头。
在图1C所示的流体处理子系统中，不包括样品清洗的加载程序一般如下实施：
清洁系统：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动/清洗溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移向位置3。
5)移动磁体262使其远离成像腔室10。
6)推入驱动/清洗溶液使其穿过腔室，以清洁腔室10。
7)样品阀18，由位置1移向位置2。
8)推入驱动/清洗溶液使其穿过探头15，以清洁探头。
加载样品：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动/清洗溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，从位置1移向位置2。
5)放低探头15使之进入样品储存容器12。
6)将样品加载至样品环16中。
7)抬高探头15并拔出，直到样品阀18中具有空气并且全部样品均在样品环16中。
8)样品阀18，从位置1移向位置3。
9)移动磁体262使其靠近成像腔室10。
10)将样品从样品环16推入腔室10，捕获磁性捕获剂以及与其结合的任何生物靶标和检测试剂(捕获复合物)。
11)获取固定的捕获复合物的图像。
清洁系统：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动/清洗溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，从位置1移向位置3。
5)移动磁体262使其远离成像腔室10。
6)推入驱动/清洗溶液使其穿过腔室10，以清洁腔室。
7)样品阀18，从位置1移向位置2。
8)推入驱动/清洗溶液使其穿过探头15，以清洁探头。
在图1C所示的流体处理子系统中，包括样品清洗的加载程序一般如下实施：
清洁系统：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动/清洗溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移向位置3。
5)移动磁体262使其远离腔室10。
6)推入驱动/清洗溶液使其穿过腔室10，以清洁腔室。
7)样品阀18，由位置1移向位置2。
8)推入驱动溶液使其穿过探头15，以清洁探头。
加载样品：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动/清洗溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移向位置2。
5)放低探头15使之进入孔12。
6)将样品加载至样品环16中。
7)抬高探头15并拔出，直到样品阀中具有空气并且全部样品均在样品环16中。
8)样品阀18，由位置1移向位置3。
9)移动磁体262使其靠近腔室10。
10)将样品从样品环16推入腔室10，捕获磁性捕获剂以及与其结合的任何生物靶标和检测试剂(捕获复合物)。
11)泵阀20移向位置a。
12)加载驱动/清洗溶液。
13)泵阀20移向位置b。
14)推入驱动/清洗溶液使其穿过旁通管路17，并流过成像腔室10中的捕获复合物以“清洗”所述捕获复合物。
15)获取固定的捕获复合物的图像。
清洁系统：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动/清洗溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移向位置3。
5)移动磁体262使其远离腔室10。
6)推入驱动/清洗溶液使其穿过腔室10，以清洁腔室。
7)样品阀18，由位置1移向位置2。
8)推入驱动溶液使其穿过探头15，以清洁探头。
在图1C所示的流体处理子系统中，重复加载程序一般如下实施：
清洁系统：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动/清洗溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移向位置3。
5)移动磁体262使其远离腔室10。
6)推入驱动/清洗溶液使其穿过腔室10，以清洁腔室。
7)样品阀18，由位置1移向位置2。
8)推入驱动/清洗溶液使其穿过探头15，以清洁探头。
加载样品：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动/清洗溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移向位置2。
5)放低探头15使之进入孔12。
6)将样品加载至样品环16中。
7)抬高探头15并拔出，直到样品阀中具有空气并且全部样品均在样品环16中。
8)样品阀18，由位置1移向位置3。
9)移动磁体262使其靠近腔室10。
10)将样品从样品环16推入腔室10，捕获磁性捕获剂以及与其结合的任何生物靶标和检测试剂(捕获复合物)。
11)泵阀20移向位置a。
12)加载驱动/清洗溶液。
13)泵阀20移向位置b。
14)推入驱动/清洗溶液使其穿过旁通管道17，并流过成像腔室10中的捕获复合物以“清洗”所述捕获复合物。
15)获取固定的捕获复合物的图像。
16)使用图像分析算法处理图像并确定是否需要进一步加载样品。如果需要进一步向腔室10加载样品，则在样品环16中仍存有额外样品的情况下再次从步骤10启动加载样品程序，或者在需要首先向样品环16中加载样品的情况下再次从步骤1启动加载样品程序。如果腔室10中不需要另外的样品，则进行“清洁系统”程序。
清洁系统：
1)泵阀20移向位置a。
2)加载驱动/清洗溶液。
3)泵阀20移向位置c。
4)样品阀18，由位置1移向位置3。
5)移动磁体262使其远离腔室10。
6)推入驱动/清洗溶液使其穿过腔室10，以清洁腔室。
7)样品阀18，由位置1移向位置2。
8)推入驱动/清洗溶液使其穿过探头15，以清洁探头。
使用样品清洗和样品被“清洗”的重复加载程序的优势在于，从溶液中除去不与生物靶标结合的检测试剂。为了便于操作，一些测定中不包括清洗步骤，当测量来自生物靶标的测定响应时，这通常导致较高的“背景”信号。
图2泛泛地示意了光学子系统8。子系统8包括磁性元件262，其位于与系统中光学部件相对的成像腔室10一侧。磁性元件262可包括本领域已知的任何合适的磁性元件，例如永久磁铁或可用于产生适当磁场的电磁铁。在这方面，使用由位于腔室一侧的磁性元件262产生的磁场，与磁性捕获复合物结合的生物靶标可基本上被固定于成像腔室10。虽然图2中显示磁性元件262与成像腔室10挨着，但是磁性元件可以与成像腔室10偶联、整合于成像腔室10中或者与成像腔室10间隔开。此外，虽然图2显示了一个磁性元件位于成像腔室附近，应理解，所述系统可包括多于一个的磁性元件。
通过测量装置获取信号之后，可去除磁场(例如，通过使用螺线管来移除永久磁铁来实现，或者通过调节电磁铁的开关来实现)，继而生物靶标可离开成像腔室10。
最简单的成像腔室10设计为这样的成像腔室，其在靠近磁性元件的一侧具有相对平滑的内表面，从而当磁体262将珠拉至该内表面时，所述珠随机地沿内表面分布。然而，成像腔室10还可如下设计：当施加磁场时，成像腔室10在特定点“把持”捕获复合物，如本文所详述地。
当捕获复合物固定于腔室10之后，运行照明模块(LED 44、46)以激发检测试剂，在本实施方案中检测试剂标记有荧光团。图像传感器(CCD)72捕获图像，并对图像进行处理(参见例如，美国专利申请序列号No.11/534,166，名称为“Methods and Systems for Image DataProcessing”，由Roth于2006年9月21日提交，其已通过引用并入本文中)。磁体262释放样品，然后清洁设备。
根据本发明，所述图像传感器72相对于LED 44、46、腔室10和磁体262的位置可进行调整以用于对生物靶标成像。在这一实施方案中，检测试剂具有独特的特征，即与该检测试剂连接的染料(其吸收和再次发射无方向偏好(针对所有角度均一致)的光子)。选择LED 44、46的照明位置和成像传感器(CCD 72)的位置以优化图像传感器(CCD 72)的视野(field of view，FOV)中与生物靶标结合的任何检测试剂的“角空间(angle space)”。由于磁体262位于腔室10的背面，因此照明和成像系统可用的角空间是磁铁上方的半球体。照明光学部件(LED 44、46)的光照角空间覆盖面越大，则成像过程中对检测试剂的作用越强。类似地，收集角度(数值孔径)与光照角空间相比越高，则成像透镜52(图2)可收集并传输至成像感应器72(CCD检测器)的通量越大。因而，必须对分配给成像传感器的角度和照明系统的角度作出平衡。
为了降低制造成本，所述成像透镜52数值孔径的实用范围是0.3左右，以实现4倍放大。对于更高的放大倍率，可以增加成像透镜52的数值孔径，同时维持同样的成本。影响透镜52成本的其它因素还有视野和波段宽度。数值孔径为0.3时大约相当于35度全角。
对于照明模块(例如LED 44、46)的放置，其限制可能是LED的亮度以及激发滤光镜47的成本。LED的光学扩展量(etendue)将决定需要何种检测试剂角空间以提供通过视野(FOV)的最大LED通量。(光学扩展量是光源的面积乘以光源的立体角：它定义了发射通量的几何特征。)如果FOV相对较大，则需要较低的角空间，因此可使用更多LED。
根据本发明的所述系统的另一实施方案如图3所示。在该实施方案中，将样品从储存容器12转移至成像空间10。该系统还包括一个双向泵14，其配置用于将流体吸入储库，以及之后将流体从储库排出至成像空间中。泵14可具有本领域已知的任何合适的配置。如本文进一步所述，由于捕获复合物在暴露期间基本上被固定，因此本发明所述的系统实施方案不需要无脉冲流动(例如可由昂贵的注射泵获得的无脉冲流动)。在泵14和样品阀18之间的管16的长度可构成足够用的储库。这样的储库常称作“样品环”。在储库的泵端使用泵阀20从而允许新鲜的水(或其它合适的试剂)从储存容器22流向成像空间。泵阀20可包括本领域已知的任何合适的阀。值得注意的是，所述样品阀和泵阀可合并为单个阀(未显示)。泵14还可配置用来将成像空间10中的一种或多种材料和任何其它流体转移至废物容器24。废物容器24可具有本领域已知的任何合适的配置。
图4所示系统的另一实施方案，其配置用于将一种或多种材料从一个或多个储存容器转移至测量装置的成像空间。在该配置中，所述系统包括泵26，其配置用于将流体从样品容器12直接吸入至成像空间10中，然后排出至废物容器24。泵26可包括本领域已知的任何合适的泵，例如蠕动泵。成像空间10、样品容器12和废物容器24可如上述进行配置。可以在样品容器12和清洗流体容器22和成像空间10之间配置任选的阀28，用于根据是否将样品转移至成像空间或者将清洗液转移至成像空间(例如，是否进行清洗功能)来改变位置。阀28可包括本领域已知的任何合适的阀。此外，储存容器22可如上进行配置。图4中所示的实施方案不同于图3中所示的实施方案，因为前者中不包括临时储库，而且少一个阀，并使用配置用于仅单向转移流体的泵。
图5显示系统的另一实施方案，其被配置用于将一种或多种材料从一个或多个储存容器转移至测量装置的成像空间。该实施方案的配置与图4中所示之实施方案的配置类似，不同仅在于图4所示实施方案中的样品/清洗阀28被替换为阀30和阀32这两个阀。阀30和阀32可包括本领域已知的任何合适的阀。例如，阀30和阀32可包括开/关型的阀，其分别被配置用于使流体从储存容器12和22分开或同时地转移至成像空间10。储存容器12和22及成像空间10可如本文所述进行配置。
以这种方式提供分开的清洗和样品通路(即，一条通路从储存容器12至成像空间10，另一分开的通路从储存容器22至成像空间10)使得实现图4所示实施方案的所有方面成为可能，并且增加了如下能力，即随着样品被转移至成像空间10，将清洗流体和/或一种或多种试剂与待测量样品混合。随着样品被转移至成像空间将清洗流体和/或一种或多种试剂与样品混合可用于进行样品稀释，从而使成像空间中的捕获复合物分散地更开(例如，在成像腔室表面上分得更开)。
图6示意如下系统的一个实施方案，所述系统配置用于在测量装置的成像空间中对一种或多种材料进行成像。这一系统的实施方案包括检测器34、36和38。检测器34、36和38可以是CCD照像机或本领域已知的任何其它合适的成像装置。每个所述检测器可具有同样的配置或不同的配置。每个所述检测器可配置为检测不同波长或波段的光(例如，在由成像腔室10所定义的成像空间中的捕获复合物40发出的荧光)。此外，每个所述检测器可配置为生成成像腔室10中捕获复合物40的图像或“捕获荧光图片”。
所述系统还包括光源44和46，其配置用于发射具有不同波长或不同波段的光(例如，其中一个光源可配置用于发射红光，而另一光源可配置用于发射绿光)。由光源44和46发射的光可包括例如紫外线、可见光、近红外波长光谱中任意部分的光。光源44和46可包括LED或本领域已知的任何其它合适的光源。光源44和46被安放在成像腔室10周围的上方。此外，光源被安放在成像腔室的上方使得每个光源以不同方向将光发射至成像腔室10中的捕获复合物40。
所述系统还包括分别与光源44和46偶联的滤光镜48和50。滤光镜48和50可以是带通滤光镜或本领域已知的任何其它合适的光谱滤光镜。以这种方式，所述系统可使用光源44和46以及滤光镜48和50并依次使用不同波长或不同波段的光来照射所述捕获复合物。
所述系统还可包括位于照明“环”中心(或大致为中心)的透镜52。透镜52可包括本领域已知的任何合适的折射光学元件。透镜52配置用于通过一个或多个光学元件将从捕获复合物散射的光和/或发出的荧光成像于一个或多个单色CCD检测器(例如，检测器34、36和38)上，所述光学元件可包括一个或多个二色滤光镜(dichroic filter)以及一个或多个光学带通滤光镜。例如，从透镜52发出的光射向二色滤光镜54，所述二色滤光镜可包括本领域已知的任何合适的二色光学元件。二色滤光镜54配置用于反射一个波长或波段的光并使其它波长或波段的光通过。被二色滤光镜54反射的光射向滤光镜56，后者可以是带通滤光镜或其它合适的光谱滤光镜。从滤光镜56发出的光射向检测器34。
从透镜52投射的光也可射向二色滤光镜58，其可包括本领域已知的任何合适的二色光学元件。二色滤光镜58可配置用于反射一个波长或波段的光并使其它波长或波段的光通过。从二色滤光镜58透射的光射向滤光镜60，其可以是带通滤光镜或其它合适的光谱滤光镜。从滤光镜60发出的光射向检测器36。被二色滤光镜58反射的光射向滤光镜62，其可以是带通滤光镜或其它合适的光谱滤光镜。从滤光镜62发出的光射向检测器38。此外，尽管图6中所示的系统包含两个光源，但是应理解，所述系统可包含任何合适数目的光源。另外，尽管图6中所示的系统包含三个检测器(其配置用于使不同波长或波段的从捕获复合物散射的光和/或发出的荧光成像)，但是可以理解，所述系统可包含两个或多个检测器。例如，所述系统可包含两个或更多个CCD检测器(以及任选地固定滤光镜)，其可被用于同时测量分类通道和报告通道，从而提供更高的测量通量。
因此，图6中所示的系统配置用于生成代表捕获复合物40以若干目的波长之荧光发射的多个或一系列图像。此外，所述系统可配置用于向处理器(即处理引擎(processing engine))提供代表捕获复合物之荧光发射的多个或一系列数字图像。所述系统可以包括或不包括所述处理器(未显示)。所述处理器可配置用于获取(例如，接收)来自检测器34、36和38的图像数据。例如，所述处理器可通过本领域已知的任何合适方式(例如，通过将检测器之一与所述处理器偶联的传输介质(未显示)来实现，通过将检测器之一与所述处理器偶联的一个或多个电子组件(未显示)例如模拟-数字转换器来实现，等等)与检测器34、36和38偶联)。
所述处理器可配置用于处理和分析这些图像，从而例如对捕获的生物靶标进行分类和计数。此信息可由处理器以任何合适的格式(例如针对每个捕获复合物各波长荧光强度条目的数据阵列)输出。具体来说，所述处理器可配置用于执行处理和分析图像之方法的一个或多个步骤。通过系统(例如图6所示的系统)处理和分析图像之方法的实例已在美国专利申请序列号No.11/534,166(名称为“Methods and Systems forImage Data Processing”，由Roth于2006年9月21日提交)中举例说明，其已通过引用并入本文中。本文所述的系统还可如本发明申请所述进行配置。此外，本文所述的方法可包括本发明申请所述任何方法的任何步骤。
例如，在一个实施方案中，所述处理器可配置用于分析图像以检测和计数生物靶标(例如细胞)，其通过与捕获试剂(例如磁性抗体)结合而被固定于腔室表面上并通过与检测试剂(例如经标记的抗体)结合而被标记，并用于确定是否有统计学显著数目的经标记生物靶标固定于腔室的表面上。配置处理器，使其在没有统计学显著数目之经标记生物靶标固定于腔室表面上时提示向腔室添加更多额外的样品。所述处理器重复检测、计数、确定以及样品添加过程，直至有统计学显著数目的经标记生物靶标被固定于腔室的表面上。然后，所述处理器执行另外的图像处理和分析。如上所述，配置处理器，使其没有统计学显著数目之经标记生物靶标固定于腔室表面上时提示向腔室添加更多额外的样品。所述处理器可通过提示(例如通过有声或可视信号)使用者手动注入或操控泵从而向腔室运送额外的样品来提示向腔室添加更多额外的样品。或者，所述泵可以受处理器控制，从而使泵在接收来自处理器之信号向腔室运送额外的样品。
所述处理器可以是这样的处理器，例如常包含于典型的个人计算机、大型计算机系统、工作站等中的处理器。一般地，术语“计算机系统”可广泛地定义为涵盖具有一个或多个处理器的设备，所述处理器执行来自存储介质的指令。所述处理器可使用任何其它合适的功能性硬件来执行。例如，所述处理器可包括具有固件中之固定程序的数字信号处理器(digital signal processor，DSP)、现场可编程门阵列(fieldprogrammable gate array，FPGA)或采用高级编程语言(例如超高速集成电路(Very high speed integrated circuits，VHSIC)硬件描述语言(VHDL))顺序逻辑“编写”的其它可编程逻辑器件(programmablelogic device，PLD)。在另一实例中，在处理器上可执行的、用于执行上文引用之专利申请中所述的计算机执行方法中一个或多个步骤的程序指令(未显示)可使用高级语言(例如C#(需要时包括C++的部分)、ActiveX控件、JavaBeans、Microsoft基础类(Microsoft FoundationClasses，“MFC”))或根据需要使用其它技术或方法进行编码。所述程序指令可通过多种方式中的任意方式来执行，包括基于程序的技术、基于组件的技术和/或面向对象的技术等。
执行例如上文引用之专利申请中所述的方法的程序指令可包含在计算机可读介质中，例如只读存储器、随机存取存储器、磁盘或光盘、或磁带。
B.抗体
制备和表征抗体的方法是本领域所熟知的。简言之，通过使用包含目的多肽的免疫原免疫动物并从该免疫动物中收集抗血清来制备多克隆抗体。许多动物物种都可用于生产抗血清。通常，用于生产抗血清的动物是非人动物，包括兔、小鼠、大鼠、仓鼠、猪、山羊或马。因为兔的血量相对较大，所以兔是生产多克隆抗体的优选选择。
通过使用非特异性免疫应答刺激剂(称为“佐剂”)可加强特定免疫原组合物的免疫原性。示例性的佐剂包括完全弗氏佐剂(一种含有灭活结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的非特异性免疫应答刺激剂)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。
生产多克隆抗体所使用的免疫原组合物的量根据免疫原的性质以及用于免疫的动物而有所不同。可使用多种途径(皮下、肌内、皮内、静脉内和腹膜内)来施用免疫原。可通过在免疫后多个时间点对免疫动物取血样来监测多克隆抗体的产生。还可施加第二(加强)注射。重复加强免疫和测效价过程，直至达到合适的效价。当获得期望的免疫原性水平时，可对免疫动物放血，分离并储存血清和/或可使用该动物产生单克隆抗体。
通过使用众所周知的技术(例如美国专利4,196,265中所述的技术，其已通过引用并入本文中)很容易制备单克隆抗体。通常，该技术包括用选定的免疫原组合物对合适的动物进行免疫。所述免疫组合物以有效刺激抗体产生细胞的方式进行施用。啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)常被用于单克隆抗体生产。
免疫后，选择具有产生抗体之潜能的体细胞(特别是B淋巴细胞(B细胞))用于单克隆抗体生产步骤。这些细胞可取自活检的脾、扁桃体或淋巴结，或者取自外周血样品。脾细胞和外周血细胞是优选的，选择前者是因为它们富含处于分裂中的浆母细胞期(dividingplasmablast stage)的抗体产生细胞，而选择后者是因为外周血便于获取。通常，对一组动物进行免疫，并将抗体效价最高之动物的脾取出，用注射器对脾进行匀浆以获得脾淋巴细胞。通常，免疫小鼠的脾脏包含约5×107～2×108个淋巴细胞。
然后，将来自免疫动物的产生抗体的B淋巴细胞与永生的骨髓瘤细胞(一般与被免疫的动物属于同一物种)融合。适用于产生杂交瘤之融合方法的骨髓瘤细胞系优选为不产生抗体、具有较高的融合效率并且具有酶缺陷(这使其不能在仅支持期望融合细胞(杂交瘤)生长的特定选择培养基中生长)。
制备产生抗体的脾或淋巴结细胞以及骨髓瘤细胞的杂交体的方法通常包括：在促进细胞膜融合的试剂(化学试剂或电试剂)存在下，将体细胞与骨髓瘤细胞按2∶1的比例混合，然而该比例可以从约20∶1至约1∶1的范围变化。通常，融合方法以低频率产生有活力的杂交体。但是，这并不是问题，因为通过在选择培养基中培养即可将有活力的融合杂交体从未融合的亲本细胞(特别是未融合的骨髓瘤细胞，其通常会继续无限分裂)中区分出来。所述选择培养基一般是包含阻止核苷酸在该组织培养基中从头合成的试剂的培养基。示例性的试剂包括氨基喋呤、甲氨蝶呤和偶氮丝氨酸。氨基喋呤和甲氨蝶呤阻止嘌呤和嘧啶的从头合成，而偶氮丝氨酸仅阻止嘌呤的合成。当使用氨基喋呤或甲氨蝶呤时，向培养基补充次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸的来源(HAT培养基)。当使用偶氮丝氨酸时，向培养基补充次黄嘌呤。
这种培养方式提供了一群杂交瘤，从该杂交瘤群中可选出特异性的杂交瘤。通常，通过在微量滴定板中培养经过单克隆稀释的细胞来选择杂交瘤，随后(约两至三周后)测试各克隆上清液的期望反应性。所述测定应灵敏、简便和快速，例如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、空斑测定、斑点免疫结合测定等。
然后，对选定的杂交瘤进行连续稀释，并克隆成单独的抗体产生细胞系，该克隆继而可无限繁殖从而提供单克隆抗体。可通过两种基本方式利用该细胞系生产单克隆抗体。可将一种杂交瘤样品注射入(通常注射入腹膜腔中)组织相容性的动物类型中，该动物提供了最初融合的体细胞和骨髓瘤细胞。该经注射动物产生分泌由融合细胞杂交体产生之特异性单克隆抗体的肿瘤。然后，可利用所述动物的体液(例如血清或腹水)来提供高浓度的单克隆抗体。所述单独的细胞系也可在体外培养，其中单克隆抗体被自然地分泌到培养基中，从该培养基中可容易地获得高浓度的单克隆抗体。需要时，可使用过滤、离心和多种色谱方法(例如HPLC或亲和层析)对任一方法生产的单克隆抗体进一步纯化。
C.适配体
适配体是这样的核酸序列，其通过重复多轮筛选以结合不同的分子靶标(例如小分子、蛋白质、核酸以及细胞、组织和生物体)来设计。适配体提供了与抗体相当的分子识别性能。此外，适配体提供了优于抗体的优势，因为它们可以完全在体外进行改造，很容易通过化学合成而生产并且具有理想的储存特性。适配体通常通过SELEX(指数富集配体的系统进化，Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment)方法及其变型形式产生。SELEX方法描述于例如美国专利No.5,270,163和5,475,096中(二者均通过引用并入本文中)。
D.试剂盒
本发明所述的任何组合物均可包含在试剂盒中。例如，所述试剂盒可包含本发明的经适当分装的磁性抗体和/或经标记抗体组合物，以可用于分离、分开或检测靶细胞或靶细胞群。其还可包含一种或多种缓冲液，例如杂交缓冲液或清洗缓冲液。所述试剂盒的组分可以在水性介质中或以冻干形式进行包装。所述试剂盒的容器装置一般包括至少一个小瓶/管、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器装置，其中可放置组分(优选经适当分装的组分)。当试剂盒中包含多于一种组分时，所述试剂盒一般还包含第二、第三或其它另外的容器，其中可单独放置所述另外的组分。然而，也可将各组分的不同组合包含于一个小瓶/管中。本发明的试剂盒还典型地包括包含抗体的装置，以及用于市售的处于密闭状态(in close confinement)的任何其它试剂容器。这样的容器可包括厚纸板或者注塑或吹塑的塑性容器，其中放置所需的小瓶/管、瓶等。
当所述试剂盒的组分以一种或多种液体溶液的形式提供时，该液体溶液可以是水溶液，特别优选地为无菌水溶液。
然而，所述试剂盒的某些组分可以干燥粉末的形式提供。当试剂和/或组分以干燥粉末的形式提供时，该粉末可通过加入适当溶剂重溶。应料想到，所述溶剂还可以另一种容器方式提供。
试剂盒还可包含使用该试剂盒组分的说明。说明可包括能够实现的变通方式。
E.实施例
以下实施例表明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应理解，在所述实施例中公开的技术体现了本发明人发现的代表性技术，其在本发明的实施中效果良好，因而可被认为构成实现本发明的优选方式。然而，本领域技术人员应理解，根据本发明的公开内容，可以在不背离本发明的精神和范围的前提下对所公开的特定实施方案进行多种改动而仍然得到类似的或相近的结果。
实施例1.CD4细胞计数
在本实施例中，磁性捕获抗体是抗CD4抗体，其捕获所有CD4淋巴细胞以及所有CD4单核细胞。检测抗体是缀合有荧光标记的同样抗体或另一种抗CD4抗体。实时分析过程监测成像腔室中的CD4细胞群。在样品加载步骤结束时，被计数的所有CD4细胞对应于被所述捕获抗体捕获并被所述检测抗体标记的所有CD4淋巴细胞和CD4单核细胞。
收集全血样品并储存于含有2mM EDTA(作为抗凝剂)的BDVacutainer(BD Biosciences#366452)中。将20μL样品移至1.5mL离心管中。将5μL磁性抗CD4捕获抗体(IMagTM抗人CD4颗粒-BDBiosciences，货号557767)直接加入含有20μL血样的离心管中。将5μL经藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记的抗CD4检测抗体(R-PE缀合的小鼠抗人单克隆抗体-BD Biosciences货号555347地直接加入含有20μL血样的离心管中。使用移液器适当混合样品。将该样品静置孵育20分钟。使用1mL PBS/BSA溶液(预包装的PBS/BSA：Sigma P3688)稀释该样品，并将所述样品注入成像腔室中。
一开始引入样品，便启用设备的磁场。连续观察样品以及引入新的样品等分试样，使得能够决定是继续加载更多样品等分试样还是结束该步骤。一旦完成加载步骤，即对成像腔室视野中的细胞进行计数，并根据样品加载体积、视野大小与磁场控制下成像腔室之表面的大小的比值以及设备的捕获效率来计算每微升样品中的细胞数。
实施例2.通过减法策略对CD4淋巴细胞计数
在本实施例中，磁性捕获抗体是抗CD4抗体，其捕获所有CD4淋巴细胞以及所有CD4单核细胞。检测抗体混合物包含缀合有一种荧光标记物(标记物1)的抗CD4抗体以及缀合有另一种荧光标记物(标记物2)的抗CD14抗体。实时分析过程监测成像腔室中的CD4细胞群。在样品加载步骤结束时，被计数的所有CD4细胞对应于样品中被所述捕获抗体捕获的所有CD4淋巴细胞和CD4单核细胞。被计数的所有CD14细胞仅对应于样品中被所述捕获抗体捕获的单核细胞群。CD4淋巴细胞数被计算为从总CD4数中扣除单核细胞数。
收集全血样品并储存于含有2mM EDTA(作为抗凝剂)的BDVacutainer(BD Biosciences#366452)中。将20μL样品移至1.5mL离心管中。将5μL磁性抗CD4捕获抗体直接加入到盛有20μL血液样品的离心管中。将5μL标记有荧光分子(其与读取设备相容)的抗CD4检测抗体也直接加入含有20μL血样的离心管中。将5μL标记有荧光分子(其与前一荧光分子不同且也与读取设备相容)的抗CD14检测抗体也直接加入含有20μL血样的离心管中。使用移液器适当混合样品。将该样品静置孵育20分钟。使用1mL PBS/BSA溶液(预包装的PBS/BSA：Sigma P3688)稀释该样品，并转移至于读取装置的注射器。将所述样品的等分试样注入成像腔室中。
一开始引入样品，便启用设备的磁场。连续观察样品(使用针对CD4荧光标记物的检测通道)以及引入新的样品等分试样，使得能够决定是继续加载更多样品等分试样还是结束该步骤。一旦完成加载步骤，便使用所述没备的两个检测通道依次进行对成像腔室视野中CD4和CD14细胞的计数。根据样品加载体积、视野大小与磁场控制下成像腔室之表面的大小的比值以及设备的捕获效率来计算每微升样品中的细胞数。
实施例3.测量CD3细胞、CD4细胞和CD8细胞的临床相关计数
在本实施例中，磁性捕获抗体是抗CD3抗体，其捕获所有淋巴细胞。检测抗体混合物包含缀合有一种荧光标记物(标记物1)的抗CD3抗体、缀合有另一种荧光标记物(标记物2)的抗CD4抗体以及缀合有第三种荧光标记物(标记物3)的抗CD8抗体。实时分析过程监测成像腔室中的CD3细胞群。图7示意使用“标记物1”检测通道的成像系统视野，其检测在时间点T1、T2、...Tn和T最终)的CD3群(即所有淋巴细胞)。重复进行对捕获细胞的检测和计数，直到成像处理算法计量的细胞数超过特定阈值。一旦视野内的细胞数达到所定义的阈值，则结束样品加载程序。在样品加载步骤结束时，对针对三种荧光团之一的三个检测通道中的每一个进行读数。针对荧光标记物1的标记物1检测通道将计数所有CD3细胞，其对应于所有淋巴细胞，如图8A所示。所述标记物2检测通道将计数淋巴细胞中的CD4亚群，如图8B所示。最后，所述标记物3检测通道将计数淋巴细胞中的CD8亚群，如图8C所示。CD4与CD8的比值以及CD3细胞的百分比(以及CD4细胞的百分比)可根据上述三个测量值计算得出。
收集全血样品并储存于含有2mM EDTA(作为抗凝剂)的BDVacutainer(BD Biosciences#366452)中。将20μL样品移至1.5mL离心管中。将5μL磁性抗CD3捕获抗体直接加入含有20μL血样的离心管中。将5μL标记有荧光分子(标记物1，其与读取设备相容)的抗CD3检测抗体也直接加入含有20μL血样的离心管中。将5μL标记有第二荧光分子(标记物2，其与前一荧光分子不同且也与读取设备相容)的抗CD4检测抗体也直接加入含有20μL血样的离心管中。将5μL标记有第三荧光分子(其与前两种荧光分子不同且也与读取设备相容)的抗CD8检测抗体也直接加入含有20μL血样的离心管中。使用移液器适当混合样品。将该样品静置孵育20分钟。使用1mL PBS/BSA溶液(预包装的PBS/BSA：Sigma P3688)稀释该样品，并转移至读取装置的注射器。将所述样品的等分试样注入成像腔室中。
一开始引入样品，便启用设备的磁场。连续观察样品(使用针对CD3荧光标记物的检测通道)以及引入新的样品等分试样，使得能够决定是继续加载更多样品等分试样还是结束该步骤。一旦完成加载步骤，便使用所述没备的三个检测通道依次对成像腔室视野中CD3、CD4和CD8细胞进行计数。根据样品加载体积、视野大小与磁场控制下成像腔室之表面的大小的比值以及设备的捕获效率来计算每微升样品中的细胞数。
实施例4.分离和检测来自全血的CD4细胞
将1mL PBS/BSA加至含有2mM EDTA(作为抗凝剂)的BDVacutainer(BD Biosciences#366452)。将20μL PBS/BSA/EDTA移至1.5mL离心管中。使用无菌手指针(finger prick)，直接收集1或2滴血液至1.5mL离心管中。将1或5μL磁性抗CD4捕获抗体(IMagTM抗人CD4颗粒-BD Biosciences，货号557767)加入含有血样的离心管中。将1或5μL标记有荧光分子的抗CD4检测抗体(R-PE缀合的小鼠抗人单克隆抗体-BD Biosciences货号555347，其与读取设备相容)也加入含有血样的离心管中。使用移液器适当混合样品。将该样品静置孵育20～25分钟。使用1mL、400μL或200μL的PBS/BSA溶液(预包装的PBS/BSA：Sigma P3688)稀释该样品，并转移至读取装置的注射器。将所述样品的等分试样注入成像腔室中。所述样品准备矩阵示于表1中。
表1
  样品编号  1  2  3
  血液  1滴  1滴  2滴
  EDTA缓冲液  30μl  10μl  20μl
  捕获抗体  1μl  5μl  5μl
  检测抗体  1μl  5μl  5μl
 孵育时间   25分钟   25分钟   20分钟
 PBS缓冲液   1ml   200μl   400μl
所述成像装置使用校准珠进行初始化，所述校准珠是由Luminex根据Chandler等(美国专利#6,632,526)先前描述的方法开发的。这些校准珠在每个检测通道发出荧光信号，使该系统自动对焦。清洗程序后，一些珠仍留在腔室中，并用于定位视野中的特定区域。一开始引入样品，便启用该设备的磁场。尽管样品粘度很高，但是细胞被磁性捕获抗体充分磁化，从而被磁场吸引并被固定于成像腔室表面上。使用绿色激发LED和报告检测通道对经标记细胞进行成像。存留在成像腔室中的珠也使用绿色LED和报告检测通道成像。此外，使用红色LED作为激发光源以及CLI检测通道对珠进行成像。由于珠包含分类和报告染料，所以其可以在两种图像中显现出来。CD4特异性细胞只在报告通道中显现。来自分类通道和报告通道的倒像分别示于图9和图10中。样品1中未检测到CD4细胞的信号，而在样品2和3中检出了CD4细胞的信号。
该研究表明，所述成像系统能够通过将细胞与包被有磁性纳米颗粒(大小为100～400nM)抗体结合而吸引具有磁性响应的细胞。直接在样品基质中使用捕获抗体和检测抗体对细胞进行标记，而且几乎不需增加结合动力学特性。只有当加入抗体以及使用移液器功能使样品与试剂混合物混合时进行混合。
实施例5.依次加载多个样品等分试样
为了演示依次加载多个样品等分试样，准备了浓度为每毫升29,900珠的荧光珠溶液。最初加载的等分试样为50μL。一旦将第一等分试样加入腔室中并在磁场的影响下，便使用旁通管道(by-pass line)对样品基质进行清洗。然后，成像系统收集样品图像。无需从腔室中除去第一等分试样，向腔室中再引入50μL第二等分试样，并再次使用旁通管路对样品基质进行清洗。重复这一过程，直到向腔室注入了8个等分试样份。图11显示了针对等分试样1、3、6和8所收集图片的放大的一小部分。当向成像腔室注入另一50μL等分试样时，可看到珠计数增加。最终，如样品8的图片所示，过多的样品导致在靶标物的重叠，其呈现为大聚集体。这表明需要阈值上限，以防止样品过量加载。
实施例6.高浓度样品的加载
为了演示对高浓度样品的处理，准备了浓度为每毫升2.99×107个珠的荧光珠溶液。最初加载的等分试样为50μL。一旦将第一等分试样加入腔室中并在磁场的影响下，便使用旁通管路对样品基质进行清洗。然后，成像系统收集样品图像。图12显示了针对等分试样1、2和3所收集的图片以及各等分试样之间腔室中图像的放大的一小部分。由于第一等分试样浓度过高，所以撤除磁场，彻底清空腔室并利用旁通管路清洗腔室。与此同时，样品环中未使用的样品部分仍未受影响。图12下方的图像刚好取自该再生步骤之后，其证实了腔室已被彻底清洗。然后，再次施加磁场并将较小的等分试样(17μL)注入腔室中。使用旁通管道对样品基质进行清洗。该等分试样的浓度亦过高。撤除磁场，并使用旁通管路再次彻底清洗腔室，而其余的样品则留在样品环中(图12下方右侧图像显示清洗效率)。最后，再次施加磁场并将更小的第三等分试样(8μL)从样品环注入腔室中。该等分试样使腔室中包含足以进行精确分析和计数的珠。
本文公开并主张权利的所有组合物和方法均可根据本公开内容实现和执行，而无需过度的实验。虽然本发明的组合物和方法以优选实施方案来进行描述，然而对本领域技术人员来说显而易见的是，在不背离本发明的构思、精神和范围的前提下可以对所述组合物和方法以及本文所述方法的步骤或步骤顺序进行改变。更特别地，显而易见的是，可以用化学和生理学相关的某些试剂来替代本文所述的试剂，同时会得到同样的或类似的结果。对本领域技术人员来说显而易见的所有这些类似替代物和修改被认为在通过所附权利要求书所定义的本发明精神、范围和构思内。
参考文献
以下参考文献通过引用具体地并入本文中，这些参考文献为本文阐述的内容提供了示例的方法性或其它细节补充。
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美国专利5,475,096
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美国专利申请11/534,166
美国专利申请11/757,841

Claims (22)

1.用于固定和检测样品中的细胞的方法，其包括：
(a)将样品与磁性抗体相接触，所述磁性抗体针对可能存在于所述样品中的第一细胞上的特定表位具有特异性亲和力；
(b)将所述样品与第一标记抗体相接触，所述第一标记抗体针对所述细胞上的特定表位具有特异性亲和力；
(c)将所述样品的等分试样引入腔室中；
(d)向所述腔室施加磁场以吸引所述磁性抗体至所述腔室的表面；
(e)清洗所述腔室，以除去所述样品中未固定于所述腔室表面上的部分；
(f)对通过与所述磁性抗体结合而被固定在所述腔室表面上并通过与所述经标记抗体结合而被标记的细胞进行检测和计数；
(g)确定是否有统计学显著数目的经标记细胞固定于所述腔室的表面上；
(h)重复步骤(c)至(g)，直至统计学显著数目的经标记细胞固定于所述腔室的表面上；以及
(i)对经固定且经标记的细胞进行检测和计数。
2.权利要求1的方法，其中所述样品是体液。
3.权利要求1的方法，其中所述样品是环境样品。
4.权利要求1的方法，其中所述细胞是淋巴细胞、白细胞或单核细胞。
5.权利要求1的方法，其中所述细胞是细菌细胞、孢子或真菌细胞。
6.权利要求1的方法，其中所述磁性抗体和经标记抗体针对同一表位具有特异性亲和力。
7.权利要求1的方法，其中所述磁性抗体和经标记抗体针对不同表位具有特异性亲和力。
8.权利要求1的方法，其中在将所述样品引入腔室之前使所述样品与所述经标记抗体相接触。
9.权利要求1的方法，其中在将所述样品引入腔室之后使所述样品与所述经标记抗体相接触。
10.权利要求1的方法，其中所述经标记抗体是经荧光标记的抗体。
11.权利要求1的方法，其还包括将所检出的细胞数与所述样品中的细胞数建立关联。
12.权利要求1的方法，其还包括使所述样品与第二经标记抗体相接触，所述第二经标记抗体针对所述细胞上的特定表位具有特异性亲和力，其中所述第二经标记抗体用不同于所述第一经标记抗体上标记物的标记物进行标记。
13.权利要求12的方法，其中所述第一经标记抗体和所述第二经标记抗体针对存在于不同细胞群上的不同表位具有特异性亲和力。
14.权利要求1的方法，其还包括：
将样品与多种不同的磁性抗体相接触，所述多种不同磁性抗体针对可能存在于所述样品中的多种不同细胞上的特定表位具有特异性亲和力；以及
将所述样品与多种不同的经标记抗体相接触，所述多种不同经标记抗体针对所述多种不同细胞上的特定表位具有特异性亲和力。
15.用于固定和检测样品中的一种或多种细胞群和/或亚群的方法，其包括：
(a)将样品与磁性抗体相接触，所述磁性抗体针对可能存在于所述样品中的细胞群上的特定表位具有特异性亲和力；
(b)将所述样品与第一经标记抗体相接触，所述第一经标记抗体针对所述细胞群上的特定表位具有特异性亲和力；
(c)将所述样品与第二经标记抗体相接触，所述第二经标记抗体针对所述细胞群中第一细胞亚群上的特定表位具有特异性亲和力；
(d)将所述样品与第三经标记抗体相接触，所述第三经标记抗体针对所述细胞群中第二细胞亚群上的特定表位具有特异性亲和力；
(e)将所述样品的等分试样引入腔室中；
(f)向所述腔室施加磁场以吸引所述磁性抗体至腔室表面；
(g)清洗所述腔室，以除去所述样品中未固定于所述腔室表面上的部分；
(h)对通过与所述磁性抗体结合而被固定在所述腔室表面上并通过与所述第一经标记抗体结合而被标记的细胞进行检测和计数；
(i)确定是否有统计学显著数目的经标记细胞固定于所述腔室表面上；
(j)重复步骤(e)至(i)，直至统计学显著数目的经标记细胞固定于所述腔室的表面上；
(k)对分别标记有所述第一、第二和第三经标记抗体的经固定细胞进行检测和计数。
16.权利要求15的方法，其还包括确定所述第一细胞亚群与所述第二细胞亚群的比值。
17.权利要求15的方法，其还包括计算所述第一细胞亚群在所述细胞群中的百分比。
18.权利要求15的方法，其还包括计算所述第二细胞亚群在所述细胞群中的百分比。
19.权利要求15的方法，其还包括确定所述样品中所述细胞群的浓度。
20.权利要求15的方法，其还包括：
将所述样品与第四经标记抗体相接触，所述第四经标记抗体针对所述细胞群中第三细胞亚群上的特定表位具有特异性亲和力；以及
对标记有所述第四经标记抗体的经固定细胞进行检测和计数。
21.权利要求20的方法，其还包括：
将所述样品与第五经标记抗体相接触，所述第五经标记抗体针对所述细胞群中第四细胞亚群上的特定表位具有特异性亲和力；
将所述样品与第六经标记抗体相接触，所述第六经标记抗体针对所述细胞群中第五细胞亚群上的特定表位具有特异性亲和力；
将所述样品与第七经标记抗体相接触，所述第七经标记抗体针对所述细胞群中第六细胞亚群上的特定表位具有特异性亲和力；
将所述样品与第八经标记抗体相接触，所述第八经标记抗体针对所述细胞群中第七细胞亚群上的特定表位具有特异性亲和力；以及
对标记有所述第五、第六、第七以及第八经标记抗体的经固定细胞进行检测和计数。
22.权利要求21的方法，其还包括计算所述第三、第四、第五、第六和第七细胞亚群在所述细胞群中的百分比。
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