CN101711257A - 用于高通量化学反应的装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了进行大量的同时化学反应的装置、系统、芯片和方法。本发明的芯片包括可编址的单元，其可以根据所进行的反应的温度编址。所述装置、系统和芯片尤其适于在数以千计的核酸序列上进行聚合酶链反应，最多可达到和包括感兴趣的生物体的全基因组的序列。

Description

用于高通量化学反应的装置
交叉引用
本申请要求2007年1月22日提交的美国临时申请第60/886,067号和2007年12月21日提交的美国临时申请第61/016,377号的优先权，本文完整引入这些申请作为参考。
发明背景
聚合酶链反应(PCR)自1983年出现和后来的发展通过极大地扩展其鉴定、操作和复制DNA的能力已彻底改变了分子生物学。已开发了利用PCR的许多不同的应用，如科学研究、临床诊断、法医鉴定和环境研究。
继对人类基因组测序之后，对估计30,000个人类基因的基因组分析已成为基础和应用生物化学和药物学研究的主要焦点。可以从基因的分析和操作开发用于多种疾病的诊断、药物和治疗。诊断设备经常利用来自患者的小样品。为诊断目的收集的患者样品典型地具有有限的数量和体积，因而在单一样品上只可以进行少量的测试。因此，需要能够对来自单一小样品的大量基因或核酸序列进行分析的小型化的设备。
开发基于基因的疗法也已经成为研究人员和制药公司的主要焦点。为了开发新的治疗方法和识别新的治疗靶标，理想的是利用生物体全基因组的大部分(如果不是全部)进行高通量筛选。另外，测序和扩增来自个体样品的全基因组的能力可以为个性化医学的发展铺平道路。
目前可得到的许多PCR微板和热循环仪不能以合理的成本进行大量的PCR。在许多反应中，用来分析各个单序列所需要的样品体积是微升的级别。当对数以千计的基因进行测序或扩增时，所需要的来自个体或个体组的样品的量通常是不可能得到的。另外，当处理大量的序列时，反应的灵敏度和特异性成为进行PCR时的主要关注点。序列PCR扩增必需的退火温度在不同的序列之间的变化可能达15℃之多。为了对来自相对小的样品的数以千计的基因进行测序，热循环装置需要适应不同温度的范围。
近年来，纳米制造技术的进步使得能够生产整合了电学元件、光学元件、化学元件或机械元件的小型化的设备。技术体现为众多的制造技术，包括低压气相沉积、光刻术和蚀刻。基于这些技术，已经提出了包含与纳米加热器偶联的硅通道的小型化设备(参见，例如，美国专利第6,962,821、6,054,263、5,779,981和5,525,300号)。尽管基于通道或室的设计原则上减少了热质量和反应体积，它仍然具有其它的实际缺陷。特别地，设计的通道或室在控制温度和蒸发方面受到限制。
这样的设备或系统将大大利于诊断测试、药物开发和个人医疗。本发明满足这种需要，而且还提供了相关的优势。
发明概述
总的说来，一方面，本发明提供包含至少一个设置为与芯片形成热接触的加热元件的装置，所述芯片包括片基和纳米孔阵列，其中，该至少一个加热元件设置为可相对于芯片移动。
在一种实施方式中，加热元件从芯片的上面和下面与芯片形成热接触，而且其中，从芯片下面形成热接触的加热元件的温度设定得比从芯片上面形成热接触的加热元件的温度低。在另一种实施方式中，芯片包括上表面和下表面，并且其中，第一系列的纳米孔沿上表面上的一个方向排列，第二系列的纳米孔垂直于第一系列的纳米孔定向。加热元件可以位于包括纳米孔阵列的静止芯片的上面或下面，且加热元件可以是能够加热和冷却的。
在一种实施方式中，该装置包括对应于多个温度带的多个加热元件。该多个温度带可以在大约52℃-大约95℃的范围之内。在另一种实施方式中，该多个温度带提供了温度梯度。温度带中的至少一个可以设定为处于大约52℃-大约65℃范围的温度，而且至少一个另外的温度带可以设定为处于大约90℃-大约95℃范围的温度。在进一步的实施方式中，至少一个另外的温度带设定为处于大约68℃-大约72℃范围的延伸温度。
在特定的实施方式中，该至少一个加热元件设置为提供包括温度随时间变化的尖峰波形的输出。
在一种实施方式中，所述阵列中的单个纳米孔具有长度为大约250μm、宽度为大约250μm和深度为大约525μm的尺寸或者更小。
在另一种实施方式中，芯片可操作地与检测光学信号的光学系统偶联。光学系统可以包括多个光学检测器。
在一种实施方式中，纳米孔的数目大于大约30,000。在另一种实施方式中，纳米孔设置为容纳大约100nl的体积。
总的说来，另一方面，本发明提供了进行化学反应的方法，包括提供设置为容纳反应样品的芯片；提供至少一个可相对于芯片定位的加热元件以在该至少一个加热元件和芯片之间提供热接触；和通过改变芯片的温度在反应样品中进行化学反应，其中，所述改变温度通过相对于芯片移动该至少一个加热元件以使得加热元件与芯片形成热接触而实现。
在一种实施方式中，化学反应是核酸扩增反应。
在另一种实施方式中，该至少一个加热元件的移动受到可操作地连接芯片的温度传感器产生的信号的控制。
在进一步的实施方式中，反应样品能够产生光学信号，并且其中，芯片可操作地与设置为检测从反应样品发射的光学信号的光学系统偶联。光学信号可以与化学反应的产物量成比例。
在一种实施方式中，通过移动多个加热元件实现改变温度，各个加热元件设定为处于不同的温度。在另一种实施方式中，至少一个加热元件设定为处于大约52℃-大约65℃范围的温度，且至少一个另外的加热元件设定为处于大约90℃-大约95℃范围的温度。
总的来说，另一方面，本发明提供了进行反应的芯片，包括可编址的(addressable)单元的阵列，各个单元设置用于化学反应，其中，可编址单元的阵列设置为对应于预定的温度带，并且其中，所述阵列中单个单元的尺寸设计为容纳小于大约1μl的化学反应混合物。在一种实施方式中，所述装置包括多个阵列。在另一种实施方式中，所述装置包括各对应于不同的温度带的多个阵列。在一种实施方式中，至少一个阵列设定为处于用于支持核酸扩增反应的退火温度，和至少一个另外的阵列设定为处于用于支持核酸扩增反应的变性温度。
在特定的实施方式中，对温度带编址以表明预定的温度带。在另一种实施方式中，可编址单元的阵列设置为对应于6个或更多个预定的温度带。
在一种实施方式中，芯片与加热元件形成热接触。
总的来说，另一方面，本发明提供了用于进行需要在至少两个温度水平循环的化学反应的装置，包括：(a)用于进行反应的包含可编址单元的阵列的芯片，各个单元设置用于化学反应，其中，可编址单元的阵列设置为对应于预定的温度带，并且其中，所述阵列中的单个单元的尺寸设计为容纳小于大约1μl的化学反应混合物；和(b)与芯片热接触的加热元件。
在一种实施方式中，可编址单元的阵列大于大约30,000。
在特定的实施方式中，所述装置进一步包括：(c)可操作地与芯片偶联的光学系统，其中，光学系统检测来自编址的可热控制的单元的光学信号。在一种实施方式中，光学系统包括多个光学检测器。
在一种实施方式中，所述装置进一步包括多个加热元件。在特定的实施方式中，所述多个加热元件包括6个或更多个加热元件。在一种实施方式中，阵列中的单个单元包括用于容纳并限制样品的纳米孔，所述孔在填充样品后被密封。在另一种实施方式中，化学反应是核酸扩增反应。在一种实施方式中，单元的预定温度设置为从化学反应产生至少90％的同质产物。
总的来说，在另一方面，本发明提供了进行涉及多个反应样品并需要在至少两个温度水平上循环的反应的方法，包括：(a)提供进行反应的包括可编址单元的阵列的芯片，各个单元设置用于化学反应，其中，可编址单元的阵列设置为对应于预定的温度带，并且其中，所述阵列中单个单元的尺寸设计为容纳小于大约1μl的化学反应混合物；(b)根据预定温度的设置将多个反应样品放置于芯片的单元中；和(c)控制加热元件以实现至少两个温度水平的循环。
在一种实施方式中，芯片的阵列中的单个单元包括用于容纳并限制样品的纳米孔，所述孔在填充样品后被密封。在另一种实施方式中，化学反应是核酸扩增反应。在进一步的实施方式中，单元的预定温度设置为从化学反应产生至少90％的同质产物。
总的来说，在再另一方面，本发明提供了用于进行涉及在至少两个温度水平上的循环的反应的装置，包括：(a)设置为容纳芯片的主体，芯片包括多个用于容纳化学反应物的纳米孔；和(b)提供第一温度的第一加热器和提供第二温度的第二加热器；其中，第一加热器和第二加热器设置为可在第一和第二方位(orientation)之间移动，且其中，第一方位使加热器与样品座形成热接触，和第二方位不使加热器与样品座形成热接触。
在一种实施方式中，多个纳米孔是可编址的，其中，根据预定的温度设置排列纳米孔以使得至少一个纳米孔编址为表明用于在所述纳米孔内进行化学反应的预定温度。在特定的实施方式中，多个纳米孔包括超过大约30,000个纳米孔。
在一种实施方式中，第一加热器包括多个温度带。在另一种实施方式中，所述温度带包括6个或更多个温度带。在进一步的实施方式中，多个温度带对应于预定的温度设置，可热控制的单元按照该温度设置形成阵列。在一种实施方式中，第一加热器和第二加热器根据方案在第一和第二方位之间移动。
在进一步的实施方式中，所述装置包括用于在第一和第二方位之间移动第一加热器和第二加热器的电动机。
在一种实施方式中，第一加热器可以提供温度梯度。在另一种实施方式中，所述装置进一步包括与第一加热器热接触的散热器(heatsink)。在不同的实施方式中，所述装置进一步包括与第二加热器热接触的散热器。
在某些实施方式中，所述装置进一步包括用于从散热器除去热量的风扇。在其它实施方式中，所述装置进一步包括多个可操作地连接芯片的温度传感器。在一种实施方式中，多个温度传感器具有至少一个指定用于测量各个温度带的温度的温度传感器。
参考文献的引入
在本说明书中提到的所有出版物和专利申请引入本文作为参考，如同各单独的出版物或专利申请具体地和单独地表明引入作为参考一样。
附图简述
在所附的权利要求书中特别说明了本发明的新型特征。通过参考下面阐明示例性的实施方式的详细说明书和附图可以获得对于本发明的特征和优势的更好的理解，所述实施方式利用了本发明的原理：
图1说明本发明的芯片的示例性的实施方式，其包括6个较小的芯片或6个代表不同的编址预定温度的可编址单元的阵列。
图2是圆形片基上的一个示例性的芯片布局的顶视图。
图3是显示芯片上的纳米孔的一个示例性的芯片布局的顶视图。
图4是示例性的纳米孔芯片的侧视纵剖面图。
图5说明包括一系列较小芯片的本发明的示例性的芯片，各个较小芯片代表不同的温度带。
图6描述具有至少一个带有纳米孔芯片的加热元件的说明性的装置设计。
图7是具有超过一个温度带的本发明的一个实施方式的装置的示意图。
图8是本发明的具有顶部安装的加热元件和光学扫描器的实施方式的一个装置实施方式的侧视图。
图9是描绘装置的温度(y-轴)在不同时间(x-轴)的变化的曲线图。
图10描述一系列能够由弧光灯产生的热温度分布图。各个温度分布图显示芯片对加热元件的响应。上面一行(a)的曲线图显示温度(y-轴)随时间(x-轴)的变化。下面一行(b)的曲线图显示芯片的温度(y-轴)随芯片的深度(x-轴)的变化。
图11a-c代表热循环装置的不同加热元件配置的例子。
图12显示热循环装置的示例性的实施方式，其中，两个加热器可在第一方位和第二方位之间移动，其中在第一方位中加热器与样品座形成热接触。
图13显示当加热器处于与具有可编址单元的芯片热接触的第一方位时，图12的实施例的第一加热器的侧视图。
图14显示由本发明具有分为不同温度带的加热器的热循环装置提供的温度分布。
图15显示本发明的示例性的装置或系统，其中，所述装置包括顶端盖片和能够提供将芯片或化学反应物与顶端盖片形成光接触和/或热接触的力的加热器。
图16是本发明的热循环系统的一个实施方式的示意图。
图17说明本发明的示例性的系统，包括芯片、加热装置和用于分析反应结果的光学系统。
图18说明本发明的示例性的系统，包括光学系统、加热装置和用于进行化学反应的芯片。
图19是方框示意图，显示与本发明的特定实施方式的系统进行通讯的逻辑设备的代表性的例子。
发明详述
本发明提供进行多个化学反应和用于单个分子的多重分析的芯片、热循环装置、系统及方法。本发明也提供允许精确控制反应物质、条件和温度的操作的小型化、高度自动化的设备和方法。
本发明可能涉及用于同时分析生物体的全基因组的方法、芯片和装置。许多方法涉及使用在非常小的反应体积中进行的聚合酶链反应或类似的扩增方法对核苷酸的基因组混合物进行的定性和/或定量分析。
预计的30,000人类基因的分析可以提供用于应用药物研究和开发对于许许多多疾病的诊断、药物和治疗方法。例如，通过认识正常和患病个体之间的遗传差异，可以确定细胞和组织的生物化学组成和功能之间的差异，并确认适当的治疗干预。
在一种实施方式中，基因组可以来自人类、哺乳动物、小鼠、拟南芥(Arabidopsis)或任何其它植物、细菌、真菌或动物种类。本发明可以用于药物发现和用于特定个体、动物或植物的诊断。
在许多情况下，可能需要从生物体的所有基因的测试确定基因表达谱。这样的测试也可以用于从来自单一个体的DNA或RNA筛选与相同的或不同的基因的不同突变(例如，单核苷酸多态性或″SNPs″)有关的序列变异，或筛选作为来自亲本的不同染色体片段的遗传性标记的序列变异。这样的测试也可以用于例如，预测疾病的易感性，确定个体是否为遗传突变的载体，确定个体是否对某些药物的副作用敏感或对于某些药物耐受，或用于其它诊断、治疗或研究目的。
芯片
本发明的芯片的总体大小可以变化，且它的厚度范围可以是从几微米到几厘米，宽度或长度范围可以是从几厘米到50厘米。典型地，整个芯片的大小，宽度和/或长度范围是大约10mm-大约200mm，厚度范围是大约1mm-大约10mm。在某些实施方式中，芯片是大约40mm宽，大约40mm长，大约3mm厚。
芯片也可以是一系列较小的芯片。例如，芯片可以包括6个较小的芯片(例如，6个可编址单元的阵列)，在各个较小的芯片之间有热缓冲。作为较小芯片系列的芯片在本文也被称为板(plate)。在该实施例的一种实施方式中，6个较小芯片各对应于不同的预定温度，整个芯片中的单元阵列相对于不同的预定温度编址。
芯片上的单元的总数随采用所述芯片的特定应用的不同而变化。芯片表面上的单元的密度随特定的应用变化。单元的密度(例如，片基每单位表面积的室数)及单元的大小和体积随需要的应用和如本发明的方法采用的生物体种类这样的因素而变化。
大量的单元可以引入本发明的芯片中。在各种实施方式中，芯片上的单元的总数是大约1000-大约200,000，更优选大约5000-大约100,000。在其它实施方式中，芯片包括较小的芯片，其中各较小的芯片包括大约5,000-大约20,000个单元。因此，如果较大的芯片包括大约3-大约20个较小的芯片，那么它包括大约15,000-大约400,000单元。在一定的实施方式中，芯片包括大约100,000单元。
例如，方形芯片可以包括125×125个纳米孔，纳米孔具有0.1mm的直径。表I显示本发明的特定的示例性芯片的孔排列格式的某些例子。板相当于包括本文所述的多个较小芯片的芯片。在表I的例子中，板包括6个较小的芯片。
表I.
  m(大约)   n(大约)   深度(mm)   ～孔/芯片(大约)   孔/板(大约)
  125   125   0.1   15743   94459
  122   122   0.11   14790   88742
  118   118   0.12   13921   83527
  115   115   0.13   13126   78756
  111   111   0.14   12397   74381
  108   108   0.15   11726   70358
  105   105   0.16   11108   66651
  103   103   0.17   10538   63228
  100   100   0.18   10010   60060
  98   98   0.19   9521   57124
  95   95   0.2   9066   54396
  93   93   0.21   8643   51858
  91   91   0.22   8249   49492
  89   89   0.23   7881   47283
  87   87   0.24   7536   45218
  85   85   0.25   7214   43285
  83   83   0.26   6912   41472
在表I中，m是沿水平轴方向的孔的近似数，n是沿垂直轴方向的孔的近似数，深度以mm计量，且孔数/芯片和孔数/板是近似的。
芯片可以是任意大小，或具有任何数量的单元。在一种实施方式中，接收本发明的芯片的使用者或消费者对大小、单元和单元是否包括纳米孔进行选择。在优选的实施方式中，当用本发明的芯片上的单元进行核酸扩增化学反应时，使用者可以根据需要对物种的整个基因组测序的基因数目选择单元的数目。
图1中说明包括6个较小芯片110的实施方式的示例性的芯片100。较小芯片110的面积是38mm×39.5mm，且包括6个较小芯片110的芯片100的总体尺寸是大约85mm×129mm的面积。在本实施例中，较小芯片110包括大约400μm的较大的孔尺寸(在图中不是按比例显示)。较小芯片110可以包括如表I所示的一系列m×n个纳米孔120。在本实施方式中，t-mm的壁厚122可以确定芯片上的纳米孔的数目。各较小芯片110可以代表整体芯片100的预定温度，而且因此，各较小芯片110可以根据在各个纳米孔120中进行的反应的温度编址。另外，总的较大的芯片100中采用多个较小芯片110时，热绝缘框架130可以相互热隔离各个可编址的预定温度区域。在本实施例中，热绝缘框架130厚度为3mm，且可以由云母、聚乙烯或本领域的技术人员显而易见的任何其它绝缘材料制造。
在一种实施方式中，对于全基因组高通量基因表达实时PCR，芯片可以进行33,750项分析。
纳米孔可以制成任何方便的大小、形状或体积。孔的长度可以是大约100μm-大约1mm，宽度可以是大约100μm-大约1mm，和深度可以是大约100μm-大约1mm。在各种实施方式中，各个纳米孔具有大约1-大约4的深宽比(深度和宽度的比)。在一种实施方式中，各个纳米孔具有大约2的深宽比。横截面可以是圆形、椭圆形、卵形、圆锥形、矩形、三角形、多边形或任何其它形状。孔在任何给定深度的横截面积也可以随大小和形状变化。
在一种实施方式中，纳米孔可以具有大约1nl-大约1μl的体积。纳米孔典型地具有小于1μl的体积，优选小于500nl的体积。体积可以是小于200nl，或甚至小于100nl。在一种实施方式中，纳米孔的体积是大约100nl。需要时，可以制造纳米孔以增加表面积与体积的比例，从而促进经过单元的热转换，其可以减少热循环的斜面变化时间(ramptime)。
各个纳米孔的空腔可以采取各种构型。例如，纳米孔中的空腔可以通过线性或弯曲的壁分割以形成分离但相邻的隔室，或通过圆形壁分割以形成内和外环形隔室。
可以用材料涂覆具有高内表面-体积比的纳米孔，以减少其中包含的反应物与孔的内表面相互作用的可能性。如果试剂倾向于不利地与内表面相互作用或附着于内表面，那么涂层尤其有用。根据反应物的性质，可以选择疏水或亲水涂层。各种合适的涂层材料是本领域中可得的。某些材料可以共价附着于表面，其它可以经非共价相互作用附着于表面。涂层材料的非限制性的例子包括硅烷化试剂，如二甲基氯硅烷、二甲基二氯硅烷、六甲基二硅氮烷或三甲基氯硅烷、聚马来酰亚胺，和硅化试剂，如氧化硅、AquasilTM和SurfasilTM。另外的合适的涂层材料是封闭剂，如氨基酸或包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、多聚腺苷酸和聚马来酰亚胺的聚合物。
一定的涂层材料可以经广泛的加热、辐射和通过化学反应与表面交联。本领域的技术人员了解用于涂覆芯片的纳米孔的其它合适的方法，或者能够不需要过多实验确定这样的方法。
在一种实施方式中，芯片的单个单元包括用于容纳和限制样品的纳米孔，所述孔在填充样品后被密封。
阵列中的单个单元可以通过抗液体通过的物理屏障彼此分隔。一方面，这些单元可以包括称为纳米孔的锯齿状的区域。纳米孔可以是顶部开放的，但与其它孔物理地分离以限制液体通过。因此，纳米孔具有至少一个适于容纳并限制反应样品的空腔。为了将一个纳米孔与环境分离以限制液体通过，可以密封纳米孔。在优选的实施方式中，密封纳米孔的方法是将矿物油沉积于孔中的样品的顶部，以封闭样品。矿物油可以是纳米分配的。可以通过本领域的技术人员显而易见的任何方法密封纳米孔。
在许多应用中，需要密封纳米孔以防止液体蒸发，因而在整个热循环中保持优选的反应浓度。因此，可以采用密封纳米孔阵列的技术。有用的密封技术考虑了几种因素。首先，该方法应该顺应于大量纳米孔的高通量处理。其次，该方法应该允许单个纳米孔的选择性密封。如此，该方法可以以任何需要的类型或模式产生包含散布于密封的纳米孔间的开放纳米孔的芯片。开放的和/或未填充的孔不仅可以允许被动热消散，而且可以减少邻近的纳米孔之间的热传递。
一种可替代的密封方法导致含有至少一个开放孔的纳米孔阵列。该方法可以包括以下步骤：(a)沿限定该至少一个开放的纳米孔的开放表面的外周维度应用可辐射固化的粘合剂；(b)放置盖子以涵盖限定待密封的该至少一个开放的纳米孔的开放表面的外周维度；和(c)将阵列暴露于辐射线以实现密封。
如本文所用，“可辐射固化的粘合剂”指在暴露于辐射线时而不需要深度加热就固化和结合到粘附表面的任何组合物。“辐射线”指电磁波能量，按频率的递增顺序包括红外辐射、可见光、紫外线(UV)、X-射线和γ射线。大量的辐射固化粘合剂可商购得到(参见，例如，来自
Figure G2008800091361D00121
的网站的销售辐射固化粘合剂和辐射系统的公司的列表)。这样的材料包括各种丙烯酸树脂、丙烯酸酯、聚氨酯(PUR)、聚酯、乙烯基、乙烯酯类，和大量通过各种频率的辐射线固化的环氧树脂类。这些和其它辐射固化材料以液体或如糊剂、粉末、树脂和带的固体的形式商业供应。
辐射固化粘合剂的选择取决于构成待附着的表面的材料。前述种类的粘合剂适于将芯片片基附着于由各种材料制成的盖子。例如，丙烯酸树脂和环氧树脂类可用于辐射密封任两个由选自玻璃、陶瓷、类金属(metalloids)、半导体(例如，硅、硅酸盐、氮化硅、二氧化硅、石英和砷化镓)、塑料和其它有机聚合材料的任一种材料制成的表面。显示低使用温度和快速固化时间的性质的辐射固化材料对于密封所述芯片可能是需要的。这些材料允许快速密封以避免对于芯片中包含的化学或生物试剂的辐射损伤。
可以通过任何机械方法沿限定纳米孔的开放表面的外周维度应用辐射固化粘合剂。“外周维度”可以是芯片片基或盖子上的边界。在任一情况下，粘合剂一旦固化，外周维度结合片基或盖子的相应的附着表面。可以使用任何合适的工具在外周维度上涂覆、印刷、分配或喷雾辐射固化粘合剂。机械方法可以在外周维度上产生均匀的粘合剂层。提供均一分布的一种方法是使用在有孔的印网掩模(screen mask)上的涂刷器直接将粘合剂涂布到开放孔的外周维度上。或者，可以直接在已经使用有孔的印网掩模以外周维度标记的盖子上应用辐射固化粘合剂。在除去掩模时，获得均一的粘合剂层。
一经应用辐射固化粘合剂，在纳米孔上放置盖子以包围限定孔的开放表面的外周维度。通常由允许辐射线通过的材料制造合适的盖子。用如玻璃、石英、塑料、本领域的技术人员已知的任何合适的有机聚合材料或其任意组合的透明材料制造优选的盖子。
可以通过将孔暴露于辐射线完成密封覆盖的纳米孔。取决于选择的粘合剂的类型，辐射线可以来自常规的白炽光源、激光器、激光二极管、UV灯泡、X-射线仪或γ-射线仪等。需要时，允许来自辐射源的辐射线仅到达纳米孔阵列上的所选择的位置，使得仅特定的所选择孔被密封。经常通过使用以纳米孔位置形成图案的光掩模实现选择性的密封。为光掩模提供分别对应于待密封的和保持开放的纳米孔的透明的位置和不透明的位置。辐射线自由通过透明区域，但被不透明区域反射或吸收。因此，仅所选择的纳米孔暴露于光线，因此通过固化粘合剂进行密封。光掩模可以形成图案以使得没有两个邻接的开放纳米孔被密封。光掩模可以形成图案以使得产生的纳米孔阵列包含交替密封和未密封的孔。本领域的技术人员可以形成具有任何模式的不限数量的光掩模，以产生包含任何形式的开放和密封的纳米孔的芯片。本领域中已良好地建立了制造这样的光掩模的方法，因而本文不再详述。
图2是由硅晶片200制成的可选择的芯片300的代表性示意图。优选的硅芯片的整体大小为厚度大约500微米且取决于需要的纳米孔的数目，可以具有任何宽度或长度。这样的硅晶片200直径为6英寸(150mm)，厚度为626μm。可以从这样的晶片200制造芯片300，这样的芯片沿一侧210为大约85.48mm，沿另一侧220为127.76mm，和沿芯片的对角线250的长度为150mm。制造时，芯片是SBS顺应性(compliant)的qPCR芯片。在芯片上制造的纳米孔的总数随采用所述芯片的特定应用而变化。为了适应同时进行大量反应的需要，所述芯片一般包括至少100个纳米孔，更通常为超过30,000个纳米孔。芯片表面上的纳米孔的密度可以随特定的应用而变化。例如，芯片表面上的纳米孔的密度可以是大约1-大约1000个纳米孔/mm2。在另一实施例中，芯片上的纳米孔的密度可以是大约10-大约100个纳米孔/mm2。
图3是具有代表性的纳米孔302的芯片300的顶面的示意图。在一种示例性的实施方式中，芯片300的纳米孔302为长度0.25mm、宽度0.25mm，且纳米孔302的中心间隔0.348mm。可以想见，纳米孔302的中心按需要间隔，包括例如间隔2mm-0.01mm。以横越或遍布芯片表面的任何形式使所述芯片的纳米孔形成阵列，如以排和列的形式形成栅格，以特定的图案形式等，如在图3中可见的。在优选的实施方式中，纳米孔以与已存在的用于分配试剂和/或读数分析的仪器相容的形式形成阵列，以至于不需要对可商购获得的液体操作设备进行工程处理。如同图3中的实施例，芯片可以具有至少246个纳米孔，更优选至少367个纳米孔，更优选至少45,141个纳米孔，甚至更优选至少90,282个纳米孔。尽管芯片的纳米孔的数目可以多达90,282或更多，但是可以预计，纳米孔的数目通常不超过大约1,444,512个纳米孔。芯片的优选实施方式的纳米孔的数目足够各列容纳一式三份的82个基因，所有的行足够容纳一式三份的30,094个基因。如同这样的一种优选实施方式，孔的数目足够一式三份地筛选整个人类基因组。可以预计，芯片上的纳米孔的数目也可以包括用于扩增其它生物体的基因组中表达基因的完整集合的充足的反应孔。
图4是如图3所示的示例性的芯片300的第二层的横截面侧视图。图4显示厚度为0.625mm的芯片300的非限制性的例子。图4也显示尺寸为长度和宽度0.25mm(250μm)的单孔302。如图所示，纳米孔深度可以为0.525mm(525μm)，在给定的孔之下留下0.1mm的芯片。可以预计，纳米孔的开口可以包括如圆形、方形、矩形或任意其它希望的几何形状的形状。例如，纳米孔可以包括大约100μm-大约1mm的直径或宽度，大约150μm-大约1mm的孔距(pitch)或宽度和大约10μm-大约1mm的深度。所制得的各纳米孔的空腔采取各种构型。例如，纳米孔中的空腔可以通过线性或弯曲的壁分割，以形成分隔但相邻的隔室。
可以使用通常已知的光刻技术形成芯片的纳米孔。可以使用湿KOH蚀刻技术或各向异性干蚀刻技术形成纳米孔。
可以用材料涂覆具有高的内表面和体积比例的纳米孔，以减少其中包含的反应物与纳米孔的内表面相互作用的可能性。也可以用电阻加热材料制造芯片。材料的非限制性的例子包括金属板，例如铝和不锈钢基质，如SS-316。当所用的基质是金属时，通常优选用绝缘层涂覆表面，以防止腐蚀和/或在液体样品的操作期间样品成分的电泳现象。在非金属加热材料的情况下，涂层通常不是必需的。可得到多种保护涂层，包括那些由SiO2、Si3N4和特氟纶(Teflon)制成的涂层。图4显示芯片300，其中，单个孔302用KOH蚀刻，并用SiO2涂层。
图4也显示包括至少两个相对的纳米孔阵列的说明性的芯片。在该图中，芯片300具有顶面360和底面362。沿顶面364排列一个阵列，而沿底面368排列另一个相对的阵列。底面阵列的纳米孔以倒置的方式排列，使得各个单元的开放表面指向芯片的相对单元的开放表面的相反方向。可以排列两个相对的阵列，使得各纳米孔的基部与相对阵列的基部直接相对。
尽管图4中没有具体描述，但是顶面364阵列和/或底面368阵列中的任何纳米孔可以是密封或非密封的。另外，顶面阵列的任何纳米孔可以用或不用反应样品填充或不填充。接着通过将芯片与外部加热元件接触，所述芯片与加热元件形成热接触。
可以进一步改变本发明的芯片的纳米孔的表面以建立反应试剂的吸附位点。这些位点可以包括用于连接生物或化学化合物(如简单的或复杂的有机或无机分子、肽、蛋白质(例如，抗体)或多核苷酸)的连接体部分。本领域的技术人员可以理解：有许多建立固定化学或生物反应物的吸附位点的方法。例如，许多技术可用于经共价键或非共价键将核酸和氨基酸直接固定在芯片上，将它们锚定(anchoring)于连接体部分上，或将它们连接(tethering)于固定部分上(参见，例如，MethodsMol.Biol.Vol.20(1993)，Beier等人，Nucleic Acids Res.27：1970-1-977(1999)，Joos等人，Anal.Chem.247：96-101(1997)，Guschin等人，Anal.Biochem.250：203-211(1997))。纳米孔的表面可以进行等离子体蚀刻以允许固定探针或引物。
如本文所用，术语“化学反应”指包括物质的化学性质改变的任何过程。这样的过程包括涉及生物分子(如蛋白质、糖蛋白、核酸、脂质)和无机化学物或其任意组合的形形色色的反应。所述芯片在需要不同温度的化学和生物学应用中具有广泛的用途。化学反应也可以包括核酸分子之间、蛋白质之间、核酸和蛋白质之间、蛋白质和小分子之间的相互作用。通过酶催发生的过程也称为“酶促反应”。
所述芯片和其它装置在进行酶促反应中尤其有用，因为大部分酶只在一定温度下发挥功能。尤其依赖温度的代表性的酶促反应包括，但不限于核酸扩增(如定量聚合酶链反应(qPCR))、核酸测序、逆向转录和核酸连接。在一种实施方式中，在本发明的芯片上进行的核酸扩增反应是实时聚合酶链反应。在另一种实施方式中，核酸扩增反应是逆转录偶联的聚合酶链反应。
本发明的芯片提供经济的用于扩增核酸的方法。不同于常规的微滴定板和热循环仪，所述芯片高度小型化，能够在小体积中和在独立的热程序下进行大量的目标核酸的快速扩增。
如本文所用，术语“核酸扩增”指其中目标核酸副本数目增加的酶促反应。这样的增加可以以线性或几何方式发生。可以通过天然或重组的DNA聚合酶(如Taq聚合酶、Pfu聚合酶、T7DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶的克林诺片段(Klenow fragment))和/或RNA聚合酶(如逆转录酶)进行扩增。
一般地，聚合酶链反应(PCR)的目的是制造大量与初始供应的少量目标或种子DNA相同的DNA。该反应包括复制DNA的链，然后使用这些副本在随后的循环中产生另外的副本。各循环使存在的DNA量加倍，因而导致反应混合物中存在的目标DNA链的副本量成几何级数增长。
PCR的一般过程在美国专利第4,683195号(Mullis)和第4,683,202号(Mullis等人)中有记载。简单地说，通过PCR的核酸扩增包括以下的重复循环：DNA的热变性，使两个引物退火结合到与待扩增的目标核酸片段侧邻的序列，和用聚合酶延伸退火的引物。引物与目标核酸的相反链杂交并定向，以使得聚合酶的合成跨越引物之间的片段进行，从而有效地倍增目标片段的量。而且，因为延伸产物也与引物互补并能够结合引物，各个后续的循环基本上加倍前一循环中合成的目标核酸的量。这导致特定的目标核酸以大约2n的速度指数累积，其中，n是循环的次数。
典型的常规PCR热循环方案包括以下的30个循环：(a)90℃-95℃范围内的变性，(b)在50℃-68℃的温度范围退火，和(c)在68℃-75℃延伸。使用所述芯片，热循环时间可以急剧地减少，部分是由于小的反应体积、小的加热质量和有效散热特征的设计。
可以在逆转录PCR反应(RT-PCR)中采用所述芯片。RT-PCR是常规PCR的另一种变型，其中逆转录酶首先将RNA分子转化为双链的cDNA分子，其随后在聚合酶链反应中用作后续扩增的模板。在进行RT-PCR时，一般地在目标核酸加热变性之后，将逆转录酶加到反应样品中。然后在适当的温度下(例如，30-45℃)保持反应足够长的时间(例如，5-60分钟)，以在预定的扩增循环发生之前产生cDNA模板。这样的反应尤其用于检测其遗传信息储存于RNA分子中的生物实体。这类型的生物实体的非限制性的例子包括RNA病毒，如HIV和导致肝炎的病毒。通过本发明实施的RT-PCR的另一种重要的应用是基于在测试样品中检测到的mRNA水平对生物实体进行同步定量。本领域的技术人员可以理解：如果需要定量结果，那么必须注意使用保持或控制扩增的核酸的相对副本的方法。
核酸“定量”扩增的方法是本领域的技术人员熟知的。例如，定量PCR(qPCR)可以包括使用同样的引物同时共扩增已知量的对照序列。这提供了可以用来校准PCR反应的内标。其它进行qPCR的方法是本领域已知的。
一般使用扩增试剂进行核酸扩增。扩增试剂典型地包括酶、水性缓冲液、盐、引物、目标核酸和三磷酸核苷。根据环境设置，扩增试剂可以是完全的或不完全的扩增反应混合物。
包含在本发明的芯片中的试剂取决于待进行的反应。在一种实施方式中，可编址单元的阵列的至少一个单元包含用于进行核酸扩增反应的试剂。试剂可以是用于免疫分析、核酸检测分析(包括但不限于核酸扩增)的试剂。试剂在芯片单元中可以处于干燥状态或液体状态。
在一种实施方式中，能够进行核酸扩增反应的芯片的可编址单元阵列中的至少一个单元包含以下的至少一种：探针、聚合酶和dNTP。在另一种实施方式中，芯片的纳米孔包含包括探针、引物和聚合酶的溶液。在各种实施方式中，各个室包括：(1)用于所述标准基因组内的聚核苷酸靶标的引物，和(2)与所述引物有关的探针，如果引物结合所述靶标，探针发射浓度依赖性的信号。
在各种实施方式中，各单元包括用于基因组内的聚核苷酸靶标的引物和与引物有关的探针，如果引物结合所述靶标，探针就发射浓度依赖性的信号。
在另一种实施方式中，芯片的至少一个单元包含包括正向PCR引物、反向PCR引物和至少一个FAM标记的MGB淬火的PCR探针(FAMlabeled MGB quenched PCR probe)的溶液。
在一种实施方式中，将引物对分配到单元中，然后干燥，如通过冷冻。然后使用者可以选择性地分配(如纳米分配(nano-dispense))样品、探针和/或聚合酶，。
在本发明的其它实施方式中，纳米孔可以包含干燥形式的任何上述溶液。在本实施方式中，这种干燥形式可以涂覆到孔上，或引导到孔的底部。使用者可以在分析前向各个孔加入水和样品的混合物。
在本实施方式中，包含干燥(dried down)的反应混合物的芯片可以用衬里(liner)密封，存储或运送到另一个地点。衬里可整体剥离而不会损害粘合剂的均匀性。衬里视觉上不同于盖子，以有助于辨认和易于处理。选择衬里的材料以使从粘合剂剥离衬里时静电荷的产生最小化。当使用者准备使用芯片时，破坏密封，除去衬里，并向芯片的单元中加入样品。然后，可以密封芯片，并使其接触加热元件。
在许多应用中，需要密封单元(例如，纳米孔)以防止液体蒸发，并因此在整个热循环过程中保持优选的反应浓度。
芯片可以用于确定基因型(genotyping)、基因表达或通过PCR进行其它DNA测试。在板中进行的分析不限于DNA分析(如Taqman、Invader、Taqman Gold、SYBR gold和SYBR green)，也包括其它分析(如受体结合、酶和其它高通量筛选分析)。在某些实施方式中，使用ROX标记的探针作为内标。
本发明也提供了使用包括多个预加载的纳米孔的芯片进行PCR分析的方法，该方法包括：将样品置于纳米孔中以产生反应混合物；用矿物油或另一种密封机构密封芯片的纳米孔；将芯片置于热循环系统；循环该系统；并分析结果。
根据本发明，芯片的单元包括可操作进行多重PCR的溶液。在优选的实施方式中，单元能够根据化学性质和包括在溶液中的探针在各个单独的单元中进行多重PCR反应。“多重PCR”是在同一单元中使用超过一个引物对。该方法可以用于相对定量，其中，一个引物对扩增目标，而另一个引物对扩增内部基准(endogenous reference)。可以使用包括标准曲线方法或比较Ct方法的各种方法进行多重反应。
可以使用以下探针，如FAM，其是羧基荧光素，具有大约485nm的激发波长和大约510-520nm的发射波长；SYBR Green 1，其通常用于RT-PCR，且具有大约488纳米的激发波长和大约510纳米的发射波长；TET，具有大约517纳米到大约538纳米的发射波长；选自HEX、JOE和VIC的探针，其具有525-535nm到大约546-556nm的发射波长；TAMRA，其是羧基四甲基若丹明，且具有大约556纳米到大约580纳米的发射波长；ROX，其是羧基-x-若丹明，具有大约575-585nm到大约605-610nm的发射波长；ALEXA，具有大约350纳米到大约440纳米的发射范围；TEXAS RED，具有大约580-585nm到大约600-610nm的发射波长；Cy3，具有大约545纳米到大约568纳米的发射波长；Cy5，具有大约635-655nm到大约665-675nm的发射波长；Cy7，具有大约715纳米到大约787纳米的发射波长。优化的干涉滤波器精确地对各个荧光团匹配激发和发射波长，以排除(block out)来自光谱邻近的荧光团的不希望的干扰(cross-talk)。
用于核酸扩增的引物的选择取决于目标核酸序列。用于本发明的引物一般是寡核苷酸，通常是长度为几个核苷酸的脱氧核糖核苷酸，其可以通过聚合酶链反应以模板特异性的方式延伸。用于扩增目标核酸的合适的引物的设计可以由本领域的技术人员确定。
对于源自PCR或者上文所述的或本领域已知的任何其它核酸扩增反应的扩增核酸的常规检测，可以将引物与可检测的标记偶联。适用于本发明中的可检测的标记包括任何可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测的成分。本领域的技术人员已知许多种合适的可检测标记，其包括发光的标记、酶或其它配体。在优选的实施方式中，技术人员很可能希望采用荧光标记或酶标签，如洋地黄毒苷(digoxigenin)、β-半乳糖苷酶、脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶、抗生物素蛋白/生物素复合物。
可以通过本领域的技术人员熟知的许多种方法中的任何一种引入标记。一个方面，在扩增步骤过程中同时引入标记。因此，例如，采用具有标记的引物或标记的核苷酸的PCR可以提供标记的扩增产物。在独立的一个方面中，其中使用标记的核苷酸(例如，荧光素-标记的UTP和/或CTP)或标记的引物将RNA转化为DNA的转录反应将可检测的标记引入转录的核酸中。
本发明也提供了适于进行本发明的多核苷酸扩增方法的试剂和试剂盒。这样的试剂和试剂盒可以模仿适于进行常规的PCR、RT-PCR和其它扩增反应的试剂和试剂盒。这样的试剂盒包括本发明的芯片和选自扩增试剂、检测试剂及其组合的试剂。试剂盒可以包括用于多重扩增产物的下游或后续分析的包装试剂。包括在单个单元中的引物彼此独立地可以是相同或不同包括多个多重扩增引物的引物组。
在另一种实施方式中，寡核苷酸探针适于检测单核苷酸多态性，这是本领域中公知的。这样的探针的具体的例子包括4个寡核苷酸探针的组，除一个核苷酸位置之外，其序列是相同的。
4个探针在该位置各包括不同的核苷酸(A，G，C和T/U)。可以用能够产生可彼此区别开的不同检测信号的标记物标记探针，如能够在不同的、可光谱分辨的波长处发射光的不同荧光团(例如，4种不同颜色的荧光团)。
可以通过化学合成、重组体克隆或其组合获得用于本发明的引物对。本领域中熟知化学多核苷酸合成的方法，因而不需在本文中描述。本领域的技术人员可以通过采用DNA合成仪或从商业服务定购，使用目标序列获得需要的引物对。
核酸扩增需要在与用于扩增靶标的酶相容的缓冲液中的目标核酸。用于本发明的目标核酸包括任何怀疑包含目标序列的反应样品。本发明并不意图限制反应样品的来源或其制备方式。一般地，测试样品可以是生物样品和/或环境样品。生物样品可以源自人类、其它动物或植物、体液、实体组织样品、组织培养物或由其得到的细胞及其后代，或从这些来源中的任何一种制备的部分或涂片、或任何其它怀疑包含目标核酸的样品。优选的生物样品是体液，包括但不限于血液、尿液、脊髓液、脑脊液、滑液(sinovial fluid)、含氨的液体、精液和唾液。其它类型的生物样品可以包括食物制品和如蔬菜、牛奶制品(dairy items)、肉、肉副产品(meat by-products)和废料的成分。环境样品源自环境物质，包括但不限于土壤、水、污水、化妆品、农业和工业样品。
可以根据本领域中的标准方法或所述的程序进行包含在测试样品中的核酸的制备。简单地说，可以使用各种溶胞酶或化学溶液根据Sambrook等人(″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″)提出的程序分离DNA和RNA，或按照生产商提供的说明书通过核酸结合树脂提取DNA和RNA。
反应样品中的核酸可以是cDNA、基因组DNA或病毒DNA。但是，本发明也可以使用如mRNA、核糖体RNA、病毒RNA的其它核酸实施。这些核酸可以以各种拓扑学结构(topologies)存在。例如，核酸可以是单链、双链、环状、线性的或串联体(concatamers)的形式。本领域的技术人员可以认识到：无论核酸的性质如何，只要通过对所用的方法进行合适的且良好确认的改良就可以进行扩增。
本发明的一方面，用于进行反应的芯片包括可编址单元的阵列，各个单元设置用于化学反应。根据用于运行单元中的化学反应的预定温度设置排列芯片的可编址单元。至少一个单元编址为表明用于进行单元中的化学反应的预定温度。
在一种实施方式中，多个单元被编址以表明用于进行化学反应的预定温度。在另一种实施方式中，各个单元是单独编址以表明用于进行所述单元中的化学反应的预定温度。
本发明的芯片的单元的预定温度可以设置为由化学反应产生至少90％的同质产物。如果优化退火温度，基于预设的反应温度的可编址芯片的配置可以明显地提高反应产物的产量和质量。当使用者意图用本发明的芯片和装置分析如生物体的全基因组的大量核酸时，这可能是重要的。在一种实施方式中，当用作医学诊断仪器时，提高的反应产量在本发明的芯片、装置或系统的应用中发挥重要的作用。
图5说明本发明的示例芯片500，包括一组较小的芯片510。这组较小的芯片510，也称作板500，接触热绝缘框架530。各个较小的芯片510代表本实施例的不同的温度带，如图5所标记的，带1、2、3、4、5和6。在一种实施方式中，温度带对应于用于在芯片500的纳米孔520中进行聚合酶链反应的预定退火温度设置。通过将整体芯片500划分成不同的温度带，使用者可以提高纳米孔520中的反应的特异性。例如，当分析物种的完基因组时，多个温度带可以允许对基因组进行更准确的测定。
所述芯片可以包含一个或多个在芯片的底侧蚀刻的沟槽。一般地，沟槽是允许气体通过的底沟(under-trenches)、开放的通道或路径。沟槽减少芯片的热质量，增加表面积，因而提高芯片的热性能。沟槽可以制成任何形状，包括但不限于圆形、椭圆形、卵形、圆锥形、矩形、三角形和多边形。沟槽可以进一步被线性或弯曲的壁分割，以形成分隔但邻近的通道，或通过圆形壁分割以形成内和外的环形通道。沟槽的尺寸规格取决于芯片的总体大小和深度。沟槽的深度可以是芯片深度的大约1/10-大约9/10。其它尺寸(即宽度和长度)可能更短、更长或与芯片的相应尺寸相当。尤其，L型的沟槽围绕单元的基底。随着空气流过由任一沟槽形成的通路，它通过被动的热逸散从单元的表面除去热量，因而增加热循环的速度。
几种因素关系到合适的芯片片基的选择。片基经常是良好的热导体。良好的热导体一般具有高于1W/m-1K-1的热传导率，优选高于100W/m-1K-1，更优选高于140W/m-1K-1。尽管材料的热传导率可以是250W/m-1K-1或更高，它通常不超过500W/m-1K-1。第二，片基必须是相对惰性和化学稳定的。这样的片基一般显示与用于意图的应用中的反应样品反应的低水平倾向。另外，也应该根据在其上或其邻近整合热控制元件的能力或可行性选择材料。多种材料满足这些标准。示例性的材料包括但不限于，类金属或半导体，如硅、硅酸盐、氮化硅、二氧化硅、磷化镓、砷化镓或其任何组合。其它可能的材料是玻璃、陶瓷(包括结晶和非结晶的硅酸盐和非硅酸盐基的陶瓷)、金属或合金，包含掺杂剂(例如，提高热导率的氧化铝)的复合聚合物，或本领域可获得的许多种塑料和有机聚合材料中的任一种。在一种实施方式中，在包括Al或SS-316以及类似的其它物质的这样的片基中制备纳米孔。
在一种实施方式中，使用导热聚合物制造芯片。例如，可以使用聚碳酸酯、聚丙烯或本领域的技术人员已知的任何其它导热聚合物制备芯片。
可以使用本领域的技术人员显而易见的任何方法制备芯片。制备本发明的芯片的方法的例子包括但不限于：微型打孔法、放电法、热模压印(hot embossing)和使用从以水作为光导制备的工具的热模压印。
或者，可以使用在集成电路(IC)和微机电系统(MEMS)工业中沿用已久的技术制备本发明的芯片。通常通过以下步骤进行制造过程：选择芯片片基，接着使用适当的IC处理方法和/或MEMS微机械加工技术构建和集成各种元件。
可以根据IC处理和/或MEMS微机械加工的标准技术进行所述芯片的制造。所述芯片可以制造为多层结构。该过程一般通过构建底层进行。然后，采用包括但不限于光刻术、化学气相沉淀或物理气相沉淀、干或湿蚀刻技术的组合来构建位于其上或植入其中的结构。例如，气相沉淀能够在其它材料上制造极薄和均一的涂层，而蚀刻容许较大芯片结构的大量生产。其它有用的技术，如离子注入、等离子灰化、粘合和电镀，也可以用来改善芯片的表面性质或集成芯片的各种元件。下面参考附图中描述的示例性的芯片设计详述制造过程。同样的一般过程及其明显的变型适用于制造本文所描述的所述芯片的任一种。
图4是示例性的芯片设计的一部分的截面图(cross-section view)。在这种实施方式中，将纳米孔嵌入分别由第一和第二(或底面和顶面)层的片基组成的主体中。该过程以提供一般是耐热材料(如玻璃、耐热玻璃晶片(Pyrex wafer)或本文所述的或本领域已知的任何其它合适的材料的第一层片基开始。下一步是产生形成单元的基础的纳米孔。纳米孔一般位于通常是硅晶片(参见，例如，图4)的第二层中。硅晶片可以在贴附在第一层上之前经过几个处理步骤。例如，硅晶片可以附在光致抗蚀剂层上，以使得表面在光刻处理的过程中暴露于紫外光之后更易进行化学蚀刻。光致抗蚀剂层通过光掩模的精确对齐限定通过随后的蚀刻步骤形成的纳米孔的大小和位置。然后通过多种本领域已知的方法蚀刻硅晶片以形成孔腔。普遍实用的蚀刻技术包括除去硅晶片以形成需要的形状的化学制品的使用，例如，氢氧化钾(KOH)。
一旦制造了所述芯片的纳米孔，那么可以改善它们的表面性质以适应特定的应用。在需要大的表面积的地方，可以通过等离子体蚀刻器进一步蚀刻纳米孔的壁以获得非常细的硅枝状晶体(dendrites)，其通常称为“黑硅(black silicon)”。黑硅的存在可以急剧增加有效的加热表面积。在纳米孔的基部制造的黑硅也可以用作感光(photon-sensing)设备、温度传感器和其它控制元件的支座(anchor)。
如本文所讨论，可以用材料涂覆具有高的内表面积-体积比的纳米孔，以减少其中包含的反应物与孔的内表面相互作用的可能性。应用涂层材料的方法的选择取决于所用的涂层材料的类型。一般地，通过直接向纳米孔涂覆材料，接着通过洗去过量的未结合的涂层材料进行涂覆。某些涂层材料可以经过广泛的加热、辐射和通过化学反应而与表面交联。本领域的技术人员了解其它合适的用于在芯片上涂覆制造的纳米孔的方法，或者能够无需过多的实验而确定这些方法。
样品制备然后包括将PCR反应样品混合物、标记的引物和样品与可以单独地纳米分配以防止蒸发的油滴结合。然后样品使用压力分配器和露点(dew point)分配技术分配到单独的纳米孔中。
为防止水性反应样品的蒸发，可以将样品应用到处于露点或其附近的纳米孔中。如本文所用，“露点”指小滴的大小不会明显变化的温度范围。处于露点时，在水从样品滴蒸发的速度与水从芯片上方的潮湿空气凝结到样品滴上的速度之间达到平衡。当实现该平衡时，据说相对于芯片平面的空气达到饱和。在一个大气压力下，露点是大约14℃。因此，优选在露点之上不超过大约1℃-大约5℃的温度下进行水性反应样品的分配。本领域的技术人员清楚的是：露点温度随外部压力增加而升高。因此，在需要时，技术人员可以在加压环境中分配反应样品以防止蒸发。
可以通过一系列方法检测所述芯片中存在的扩增的核酸，包括但不限于：(a)例如通过将扩增的产物与可检测的标记结合形成可检测的复合物；和(b)电泳解析扩增的产物与反应物和扩增反应的其它成分。
在一定的实施方式中，用如荧光DNA结合染料的可检测标记物使扩增的产物可视化。因为插入双链DNA分子的染料的量通常与扩增的DNA产物的量成比例，技术人员可以通过使用本发明的光学系统或本领域的其它合适的设备定量插入染料的荧光，方便地测定扩增的DNA产物的量。适于这一应用的DNA结合染料包括SYBR green、SYBRblue、DAPI、碘化丙啶(propidium iodine)、Hoeste、SYBR gold、溴化乙锭(ethidium bromide)、吖啶(acridines)、原黄素(proflavine)、吖啶橙(acridine orange)、吖啶黄素(acriflavine)、fluorcoumanin、玫瑰树碱(ellipticine)、道诺霉素(daunomycin)、氯奎(chloroquine)、偏端霉素D(distamycin D)、色霉素(chromomycin)、二胺乙基苯菲啶(homidium)、光辉霉素(mithramycin)、钌多吡啶(rutheniumpolypyridyls)、氨茴霉素(anthramycin)等。
除了各种荧光DNA结合染料外，其它发光的标记(如序列特异性的探针)也可以用于扩增反应，以利于扩增产物的检测和定量。基于探针的定量扩增依赖于所需扩增产物的序列特异性的检测。不同于基于染料的定量方法，它利用发光的靶标特异性的探针(例如，探针)，导致特异性和灵敏度增加。本领域中良好地建立了用于进行基于探针的定量扩增的方法，且在美国专利第5,210,015号中有记载。
在各种实施方式中，芯片另外包括定位特征(alignment feature)，其可进行操作以将盖子与芯片对齐或将其附在芯片上，或将芯片与加热元件对齐或将其附在加热元件上。在各种实施方式中，这样的特征包括凹形或凸形特征。这样的特征包括销钉(pins)、隆脊(ridges)、搭锁(snaps)、螺钉(screws)及其组合。
在各种实施方式中，芯片组件包括温度控制元件，其有助于反应室温度的监测或控制。这样的温度控制元件包括但不限于有助于加热气体或冷却气体流动通过组件的通道或其它结构。
本发明的另一方面公开了进行涉及多个反应样品且需要在至少两个温度水平循环的反应的方法，且该方法包括：提供包含可编址单元的阵列的芯片，各个单元设置为进行化学反应，其中，根据用于进行单元的化学反应的预定温度设置安排单元，使得至少一个单元编址为表明用于进行所述单元内的化学反应的预定温度；根据预定的温度设置将多个反应样品放入芯片的单元中；和控制加热元件以实现至少两个温度水平的循环。一方面，进行化学反应的方法可以包括提供本文所述的芯片，其中，芯片设置为容纳反应样品。可以提供可相对于芯片定位的加热元件以在至少一个加热元件和芯片之间提供热接触。可以通过改变芯片的温度在反应样品中进行化学反应。例如，可以通过相对于芯片移动至少一个的加热元件使得加热元件与芯片形成热接触来实现改变芯片的温度。
本方法使用本发明的芯片和本发明的热循环装置。典型地，在生物体的完整基因组的分析中，在不同的退火温度下优化不同基因或核酸序列的扩增。这些不同的退火温度可以归合到共同的带中以提高分析的灵敏度和特异性。因此本发明的芯片可以按照退火温度带之一进行编址。
退火温度的选择是对于优化PCR反应的特异性是关键的部分。可以以多种方式确定不同核酸序列扩增的退火温度。一种方法是确定核酸序列的熔点(Tm)。熔点是一半DNA双链体解离并变为单链的温度。当设计核酸扩增时，引物长度和序列对于设计成功的扩增的参数是重要的。例如，DNA的熔点随其长度和鸟嘌呤和胞嘧啶含量的增加而增加，鸟嘌呤和胞嘧啶含量可使用简单公式估计。
选择用于PCR反应的退火温度直接取决于引物的长度和组成。退火温度(Ta)可以选择为低于所用的引物对的最低Tm大约5℃(Innis和Gelfand，1990)。计算退火温度的另一个示例性的方法是：
TaOpt＝0.3x(引物Tm)+0.7x(产物Tm)-25
其中，引物Tm是较不稳定的引物模板对的熔点，而产物Tm是PCR产物的的熔点(Rychlik等人，1990)。
如果PCR反应的退火温度过低，引物可能与真正的靶标以外的序列退火结合，且可以导致非特异性的扩增和所需要的产物产量的随之减少。过高的退火温度的后果是将产生太少的产物，原因是引物退火的可能性降低。需要考虑的另一方面是具有非常不同的退火温度的引物对可能从不产生适当量的单一产物，也可能无意间导致最有效引发的产物链的不对称的或单链的扩增。
在PCR热循环中，对于各不同的引物对的最佳Ta和最大Ta在一定范围内变动并可以以连续的方式在不同基因之间变化。典型地，对于给定的引物对产生高质量退火的退火温度是在1-3℃的范围内。如果退火温度较高，PCR退火步骤可能慢下来；如果退火温度较低，引物可能在所希望的位置以外的位置结合DNA，或结合其它物质。
一种方法是使基因分析“单元化(bin)”；给定分析的温度分配给具有最接近该给定的基因分析的Ta的温度的芯片的可编址部分。例如，如果装置或芯片具有3个温度带60、62.5和65℃，最佳性能Ta＝64℃的分析分配在65℃的带中。
PCR反应的退火步骤典型地在40秒或更短时间内发生，部分取决于待扩增的序列的长度。
尽管PCR通常在低于引物熔点(Tm)的计算温度以下5℃的温度开始，但最佳温度经常比计算温度高得多。在某些实施方式中，必须根据经验测试退火温度。例如，可以进行具有逐渐升高的温度的多个PCR反应，直至确定最佳退火温度。
基因组中的许多基因序列可以归合到温度带中。在一种实施方式中，本发明的芯片的单元代表不同的退火温度带，例如，温度带在54-68℃的范围内的增量是2℃。然后根据PCR反应的退火步骤发生的预定温度对单元进行编址。
在根据预定温度对单元编址之后，可以将样品分配到芯片中。可以通过本文所公开的各种方法将样品加到芯片中。
在各种实施方式中，系统或芯片可以另外包括装填设备，其可进行操作以有助于将扩增试剂或样品填充到芯片的可编址单元中。本文有用的装填设备包括物理和化学器械，其指引、引导、传送或以其它方式填充试剂或样品到可编址的单元中。
在各种实施方式中，芯片可以包括凸起的或凹陷的区域，例如，有助于液体在芯片表面上的分布和流动的特征，如屏障或沟。在一种实施方式中，填充系统包括毛细通道。这些特征的尺寸规格是可变化的，取决于一些因素，如避免组件上的气泡及机械上的便利性和可行性。
填充系统包括有助于扩增试剂或样品在芯片表面上放置的任何装置，优选实现这样的试剂或样品在可编址的单元中放置的装置。本发明可用的这样的装置包括用于将试剂或样品倾注在表面上，以基本上覆盖整个表面的装置。在一种实施方式中，填充系统包括用于移液操作、点样或喷射试剂到特定反应室中(例如，通过压电泵)的设备。填充系统可以是纳米分配器。在另一种实施方式中，填充装置包括可操作地填充芯片的反应室的真空泵。填充系统也可以包括用于向芯片施加离心力的设备。在一种实施方式中，填充系统密切接近芯片中的填充装置或与其形成液体连通。填充系统可以自动或根据来自计算机的程序运转。
装置
本发明的一个方面是设置为容纳小型化芯片的装置的设计，所述小型化芯片设计为用于单个分子的多重分析和/或用于同时进行大量化学反应。在一种实施方式中，本发明提供了高度自动化、小型化的分析仪器，其允许以多重方式进行具有温度、蒸发、小体积试剂的递送和/或产物检测的精确控制的操作。
本发明一个方面的装置包括至少一个用于加热或冷却芯片的加热元件。可以理解：在加热元件设置为降低芯片的温度的情况中，该部件基本上作为冷却元件发挥功能。
在一种实施方式中，所述装置包括基座，具有位于基座上的至少一个加热元件。加热元件可以提供可用温度的范围。例如，加热元件可以设置为按照需要提供大约-20℃-大约120℃范围内的温度。
加热元件可以设置为容纳芯片。在各种实施方式中，加热元件可以位于芯片下面或芯片上面。在只存在一个加热元件的特定实施方式中，加热元件可以相对于芯片移动。需要时，芯片可以是静止的。
图6是所述装置一种实施方式的示意图的非限制性的例子。图6描述基座600，具有至少一个位于基座600上的加热元件602。加热元件602适合容纳芯片650，这样的芯片能够在芯片650上的一个纳米孔652中包含并限制反应样品。装置的加热元件602可以相对于芯片650在两个位置间移动。
图6中所示的加热元件602可以分为图7中所示的不同的温度带。图7是位于芯片700下面的用于控制和/或改变芯片温度的加热元件的示意图。在一种实施方式中，加热元件的温度范围对于变性温度可以是90℃-95℃的范围，对于引物退火阶段可以是52℃-65℃的范围，和对于引物依赖性延伸阶段可以是68℃-75℃的范围。加热元件700的非限制性的例子如图7所示。这个例子中的加热元件700是具有分别用于PCR的变性、引物退火阶段和引物依赖性延伸阶段的95℃(702)、52℃(704)和72℃(706)的温度带的加热元件。加热元件700的各个温度带的尺寸规格可以发生大小变化。在图7描述的一种实施方式中，位于芯片实例下面的加热元件是大约9英寸长×9英寸宽。
然后将适合包含和限制反应样品的芯片放在适合容纳芯片的装置的加热元件700上。使用位于图7的芯片下面的加热元件700，然后物理移动加热元件使得芯片接触95℃的块，接着是52℃的块，然后是72℃的块。由于加热元件上的较大表面积，加热元件相对于芯片的移动使得关键的斜面下降速度快得多。由于芯片在温度之间的转移，较大的表面积也使得能够从芯片背侧冷却。该技术也使得芯片以比传统的在循环之间简单地冷却的方式快得多的速率加热和冷却。
另一种用于控制和/或改变芯片800的温度的方法如图8所述。图8是位于芯片800上面的加热元件850的非限制性的例子。如图8所示，加热元件可以是位于芯片800上面的一系列开/关电弧卤素灯852。热反射器854位于各卤素灯852周围，以确保由加热灯852获得均一的热源。电弧灯852的高输出功率和输出与硅的光谱匹配提供了电弧灯852的非常快的“斜面上升(ramp up)”速度。灯是电弧灯的事实意味着电弧灯852的关闭实际上是瞬时的。图8也显示芯片800也可以用辐射固化粘合剂802密封，以帮助防止反应样品的蒸发。在反应循环之后，在一个非限制性的实施例中，芯片随后用扫描仪860扫描，例如，高光谱(hyper spectral)或CCD扫描器。在某些方面，这样的光耦合系统在扩增过程中在多个时间点将激发光束传送到包含反应样品的孔中，并在循环之间的多个时间点中的各时间点监测来自纳米孔的光学信号。
图9图示地显示开/关电弧灯以摄氏度计的温度(y-轴)相对于以秒计的时间(x-轴)的变化。从图9可见，电弧灯的卤素灯斜面上升速度对于95+/-0.5℃的温度是在少于大约2秒的时间内20℃-100℃/秒，并且同样少于大约2秒的时间内对于65+/-0.5℃的温度具有20℃-100℃的斜面下降速度。电弧灯的温度在PCR反应过程中从大约65℃变换到大约95℃。
需要时，所述设备设计为使脉冲热量进入可选择芯片中由铝/硅制造的纳米孔中的移动最小化。一种使脉冲热量最小化的方式是减少Al/Si在最高温度下花费的时间，从而减少“热预算”。“斜面上升”和“冷却”速度的加速和提供从加热到冷却的最快可能的转换，或者因此“转向”是重要的。这种加热和冷却芯片的方法也确保芯片加热的均匀性。这样的均匀性防止由于可能导致纳米孔性能的变化的几度的温度差异产生的应力。
从图10可见，有几种电弧灯能够传送的温度输出分布。沿(a)行的曲线图显示温度(y-轴)相对于时间变化(x-轴)的变化。相应地，沿(b)行的曲线图显示芯片对于(a)行中所述的快速热处理(RTP)分布的响应。响应于温度随时间的较缓慢的变化，如尖峰或脉冲的光学加热器分布中，芯片温度在芯片的整个深度保持恒定。响应于温度随时间的较快速的变化，如激光或闪光辅助的加热器的分布中，芯片温度随芯片相对于热源的深度而变化。
非受具体理论的限制，图10举例说明许多对应于本发明的温度输出分布。如图10(a)(1)所示，特征在于圆形的热分布的尖峰加热器分布产生如图10(b)(1)所示的类似于热源温度的芯片响应温度。在特征在于成峰的热分布的脉冲加热器分布(图10(a)(2))中，热源的温度快于对热源作出响应的芯片的温度，但芯片的温度在芯片相对于距热源的距离的整个深度上仍然保持相对均一(图10(b)(2))。对于如图10(a)(3)所示的特征在于锐利尖峰分布的激光加热器分布，热源比芯片作用快得多。因此，仅芯片的表面层被加热(图10(b)(3))。芯片的深度越深，温度分布越低。最后，对于特征在于初始进行大部加热，接着是对表面退火的闪光处理的闪光辅助分布(图10(a)(4))，芯片的响应类似于芯片对激光分布的响应(图10(b)(4))。
本发明的另一方面，描述了用于进行需要在至少两个温度水平循环的化学反应的装置，包括：用于进行反应的包括可编址单元的阵列的芯片，各个单元设置为进行化学反应，其中，单元根据用于进行单元中的化学反应的预定温度设置进行排列，使得至少一个单元编址为表明用于进行所述单元中的化学反应的预定温度；和热接触芯片的加热元件。
在一种优选的实施方式中，芯片的可编址单元设置为进行核酸扩增反应，包括但不限于实时PCR。单元可以是包括试剂、探针、引物、dNTP或其组合的纳米孔。预定温度可以是用于进行PCR反应的不同的退火温度。
加热元件可以是简单的加热器，如包括电阻加热器或热电加热器的盘，或精细的热循环装置。在某些实施例中，加热元件热接触散热器，以在芯片热接触加热元件时使得芯片能够发生快速温度变化。风扇也可以与加热元件结合，以提供对于快速热循环的更多的控制。加热元件的其它例子包括薄膜加热器，其可以通过传导快速加热或具有加入到膜中的电磁加热器。尤其适于制造薄膜加热器的材料是铟锡氧化物(ITO)。ITO是具有非常高的导电率的透明陶瓷材料。因为ITO可以大量或以薄层的形式制备，它作为集成的或外部的加热元件尤其有用。
在另一种实施方式中，加热元件在大小和构型方面与芯片相容。在一种实施方式中，所述装置进一步包括多个加热元件。可以将加热元件作为可拆分的单元邻近芯片放置、放置在其底部和/或在其顶部。在优选的实施方式中，为了最小化加热元件边缘的边缘效应，加热元件的面积明显大于芯片面积。
在图11a-c中说明了加热元件结构和设置的一些实施例。在这些实施例中，加热元件1100结合散热器1110和风扇1120，以改善对于温度变化和热循环的斜面上升时间的控制。可以在加热元件1110和样品(或芯片)1140之间使用金属热块1130，其与元件1100和芯片1140形成密切的热接触。即使芯片1140不具有高的热导率，块1130也可以具有高的热导率，以产生具有重现性的温度变化。如果多个加热元件用来限定一个温度带或多个温度带，任何小的热干扰(例如，微风)可能产生温度的明显变化。如果使用热块使阻抗降低，不同带之间的热转移会变得平稳。另外，金属热块可以在顶面上容纳温度传感器。温度传感器可以对应于各个带，或可以是芯片本身的一部分。热块也可以提供真空通道，以利用真空保持芯片与块和/或加热元件的紧密热接触。如图11a-c所示，加热元件1100可以包括一个或多个热电加热元件1150或电阻加热元件1160或二者的组合。
加热元件可以提供温度梯度。本文的温度梯度可以是在单一加热元件上一部分的温度高于另一部分的温度。例如，电阻加热器或热电加热器可以设置为在加热元件上产生热梯度。热梯度也可以定义为芯片上一部分的温度高于另一部分的温度。例如，如果使用多个加热元件，一个加热元件可以向芯片的一侧或一端传送较高的温度，而第二加热元件可以向芯片的一侧或一端传送不同的温度，从而产生热梯度。
所述装置可以进一步包括可操作地偶联芯片的光学系统，其中，光学系统检测来自单元的光学信号。在一种示例性的实施方式中，芯片、加热元件和光学系统组成本发明的系统。
一方面，本发明的公开包括用于进行涉及至少两个温度水平的循环的化学反应的装置，其包括：设置为容纳用于容纳化学反应的样品座的主体；包含多个温度带的第一加热器；和提供均一温度的第二加热器，其中，第一加热器和第二加热器设置为可在第一方位和第二方位之间移动，并且其中第一方位使得加热器热接触样品座，而第二方位不使得加热器热接触样品座。
样品座可以是用于进行反应的芯片，其包括可编址单元的阵列，各个单元设置为进行化学反应，其中，单元根据用于进行单元的化学反应的预定温度设置排列，使得至少一个单元编址为表明用于进行所述单元内的化学反应的预定温度。在一种实施方式中，多个温度带对应于单元排列所依据的预定温度设置。
在装置和样品座设置为进行PCR反应的实施方式中，预定的温度带对应于可以进行多重PCR反应的不同退火温度。在进一步的实施方式中，为了扩增基因组的大部分，如果不是全部的话，装置和样品座能够进行一系列PCR反应。在本实施例中，整个基因组需要多种退火温度以获得需要的反应特异性。例如，根据不同核苷酸序列的退火温度，这些温度可以归合成2℃的温度带。样品座的单元可以根据进行单元中的反应所处的温度带进行编址。在一种实施方式中，装置容纳样品座，其包括具有根据与所述装置的第一加热器上的6个不同温度带对应的6种不同的退火温度带编址的单元的芯片。
在优选的实施方式中，第一和第二加热器根据方案在第一和第二方位之间移动。所述装置可以进一步包括用于在第一和第二方位之间移动第一加热器和第二加热器的电动机。加热器可以通过任何本领域的技术人员显而易见的方法来移动。
第一方位使加热器热接触样品座。在一种实施方式中，样品座用来进行PCR反应。第一加热器具有多个温度带，且当第一加热器热接触样品座时，第一加热器可以用来提供PCR反应退火步骤所需的温度。在一种实施方式中，当第二加热器处于第一方位且热接触样品座时，第二加热器提供PCR反应过程中核酸的延伸或变性所需的温度。
在本发明的装置和方法的实施例中，移动第二加热器到第一方位以与PCR反应的样品座热接触。为了使包含在样品座的样品中的核酸变性，第二加热器传递大约95℃的温度。在变性步骤之后，移动第二加热器到第二方位，并移动第一加热器到第一方位以热接触样品座。第一加热器向样品座提供用于使引物与样品的核酸序列退火的温度。进行变性步骤接着退火步骤的过程可以重复或循环，直至获得需要的扩增产物。
图12说明本发明的热循环装置1200的示例性的实施方式。在本实施例中，装置1200包括具有对应于芯片1250的6种不同可编址预定温度的6个不同温度带的第一加热器。可以移动第一加热器1210以与芯片1250热接触或脱离热接触，如图12中的顶视图所示。为了加热芯片1250的6个不同的可编址预定温度区域到相同的温度，第二加热器1220在整个加热器上提供均一的温度。例如，第二加热器1220可以向本发明的芯片提供用于所进行PCR的变性和延伸步骤的均一温度，而第一加热器1210可以提供多种退火温度以提高进行大量反应的特异性。用于分析该许多反应的成像源1260可以位于与加热器的第一方位相对的芯片的对侧。
图13显示了当加热器1210处于与具有可编址单元的芯片1250热接触的第一方位时，来自图12的实施例的第一加热器1210的侧视图。例如，加热器的各个温度带1212、1214可以由不同的热电加热元件1216、1218提供，且某些实施例的细节如图13所示。
在一种实施方式中，第一加热器可以提供温度梯度。用于第一加热器和第二加热器的加热器类型的例子包括，但不限于电阻加热器和热电加热器。
在进一步的实施方式中，所述装置包括热接触第一加热器、第二加热器或这两者的散热器。
为了监测温度，所述装置也可以包括多个温度传感器。在一种实施方式中，多个温度传感器具有至少一个指定为测量装置的各个温度带的温度的温度传感器。温度传感器可以是热电偶或本领域可以获得的任何其它的传感器。
加热元件可以经过电引线连接到电源，电源在元件上提供电压并实现随后的单元加热。加热元件也可以与监测并调节单元温度的温度传感器偶联。温度传感器可以控制单元阵列的温度，并因此控制单元阵列的热分布。将芯片和/或第一加热器分成不同的温度带为需要不同的热循环分布的化学反应的平行进行提供了额外的灵活性。或者，温度传感器可以与单个单元或带偶联，使得各个单元或带的温度可独立地控制。温度传感器可以作为邻近单元基部或处于单元基部的可分离的单元而被包括。它也可以整合到单元的内表面或外表面。更进一步，可以制造温度传感器作为加热元件的组成部分。
由本发明的热循环装置提供的温度分布如图14所示。在本实施例中，第一加热器的6个不同温度带由比第二加热器提供的95℃的均一温度更低的独立温度所代表。例如，当用本发明的芯片、系统和装置扩增整个人类基因组时，为了扩增基因组的每个基因(大约30,000)，可以在少于大约15分钟、10分钟或甚至5分钟的时间内进行40个循环。
用于提供至少两个温度水平的循环的装置的主体设置为容纳样品座。通过包括真空力的各种方法，样品座可以保持在主体中的正确位置。在一种实施方式中，主体包括用于将样品座稳固地保持在原位的真空吸盘，使得加热器热接触样品座。对于本领域的技术人员显而易见的，夹子、销钉、粘合剂、狭槽或任何其它固定方法可以用于设置为容纳样品座的主体。
所述装置也可以进一步包括测定加热元件相对样品座的第一和第二方位的位置的传感器。
本发明的另一方面，用于进行涉及至少两个温度水平的循环的反应的装置，包括：设置为容纳芯片的主体，芯片包括多个用于容纳化学反应物的纳米孔；和提供第一温度的第一加热器和提供第二温度的第二加热器，其中，第一加热器和第二加热器设置为可在第一和第二方位之间移动，且其中，第一方位使加热器热接触样品座，和第二方位不使加热器热接触样品座。
在一种实施方式中，多个纳米孔是可编址的，其中，纳米孔根据预定温度设置排列，使得至少一个纳米孔编址为表明用于进行所述纳米孔内的化学反应的预定温度。
在另一种实施方式中，第一加热器包括多个温度带。多个温度带可以对应于预定的温度设置，单元根据该温度设置形成阵列。
第一加热器和第二加热器可以根据方案在第一和第二方位之间移动。在一种实施方式中，所述装置可以进一步包括用于在第一和第二方位之间移动第一加热器和第二加热器的电动机。
在一种实施方式中，第一加热器可以提供温度梯度。用于第一加热器和第二加热器的加热器类型的例子包括，但不限于电阻加热器和热电加热器。
在进一步的实施方式中，所述装置包括热接触第一加热器、第二加热器或这两者的散热器。
为了监测温度，所述装置也可以包括多个温度传感器。在一种实施方式中，多个温度传感器具有至少一个指定为测量装置的各温度带的温度的温度传感器。
本发明的示例性装置和系统1500如图15所示。芯片1510可加载于用于进行涉及至少两个温度水平的循环的化学反应的装置中。芯片1510可以通过能够保持它们定位的任何方法，如真空或夹子，设置定位。芯片也可以通过将芯片滑入紧靠使芯片对准合适位置的制动器或壁的位置而放置在装置中。芯片可以放置在能够上下移动的样品座1520上。样品座可以设置为与装置1500的加热器1530偶联。
在一种实施方式中，芯片1510和/或芯片的孔通过薄塑料盖1512密封，例如，用于覆盖芯片或纳米孔板的标准PCR带。PCR带可以由如聚乙烯的透明材料制成，且是可移动的和有时是可更换的。透明的油也可以用于覆盖芯片1510的孔和/或表面。在一种实施方式中，芯片1510和/或孔被油和盖子覆盖。
在一种实施方式中，在将芯片置于本发明的热循环装置中之前，不除去覆盖芯片1510的盖子1512。在芯片在装置中入位之后，加热器1530可以向芯片1510提供使芯片1510与顶端盖片1540形成光学接触或热接触的力。顶端盖片1540可以由透明材料或任何允许光学器件观察芯片的反应的材料制成。可以用作顶端盖片的材料包括，但不限于玻璃、硅石、硅和本领域的技术人员明显了解的聚合物或塑料。
顶端盖片1540也可以包括加热器1542，如铟锡氧化物(ITO)加热器，其可以加热芯片1510的顶部或芯片1512和/或孔的盖子。顶端盖片的加热器1542可以用于平衡芯片表面的温度，使得不会在芯片上的单元的表面或开口处发生冷凝。例如，当进行PCR反应时，试剂和/或样品的液体组分可能加热到它们在反应单元或反应孔的表面或盖子上冷凝的点。冷凝可以干扰用于监测单元中的反应的光学系统。在本发明的实施方式中，如图15所示，装置的加热器1530可以提供使芯片1510与包括加热器1542的顶端盖片1540形成热接触的力，加热器1542可以平衡芯片1510表面的温度以防止冷凝。也如图15所示，顶端盖片1540可以通过一对弹簧或压缩装置1552与装置的桥体1550连接。弹簧或其它装置1552可以释放顶端盖片1540上由加热器1530对抗芯片1510的力产生的部分压力，从而使得装置和系统更加稳固。任何用于压力缓冲的方法或装置可以用来偶联顶端盖片与装置的桥体。
在图15的示例性的系统和装置中，可以通过热循环装置1500的侧面卸载或加载芯片1510。然后可以移动装置的加热器1530到与芯片1510形成热接触的方位，加热器1530也提供了使芯片热接触顶端盖片1540的力。在图15中，芯片具有覆盖孔的塑料盖子1512。也在图15中，顶端盖片1540包括熔融SiO2/石英材料，还包括ITO加热器1542。ITO加热器1542通过如图15所示连接到ITO加热器上的电引线1544操作。顶端盖片1540然后通过在系统中提供应力释放的压缩弹簧1522连接装置的桥体1550。弹簧1522也可以发挥作用以改善芯片1510与装置的加热器1530和顶端盖片1540的加热器的热接触。
实践中，可以通过处理储存在与加热元件可操作地连接的计算机可读介质上的预先设定的算法来实现加热元件控制并进而控制反应样品的温度。加热元件的移动也可以受方案或算法的控制，其可以由计算机提供或存储在计算机可读介质上。其它方面，控制步骤可以包括基于储存在可读介质上的方案处理从可操作地连接样品座或芯片的单元的温度传感器元件得到的温度或运动传感信号。这可以通过采用可以处理模拟信号或数字信号的用于温度控制的常规电子元件来实现。优选地，在反馈控制电路上运行电子元件。它们可以控制一个单元的温度，但更经常控制共同形成一个温度带的多个单元的温度或温度带自身的温度。在一定的实施方式中，分别控制不同带的温度。热循环分布和持续时间取决于采用所述芯片的特定的应用。
系统
可以向所述芯片提供能够检测和/或监测在芯片中发生的化学反应的结果或进程的光学系统。这样的光学系统通过首先光学激发反应物，接着收集和分析来自芯片的反应物的光学信号来实现这些功能。可应用于本发明的光学系统包括3种元件，即光学激发元件、光学传输元件和感光元件。光学系统也可以任选地包括光学选择元件。
图16是显示实验设置中的设备的典型实例的方块图。图16显示连接作为光学激发元件的典型实例的激光器1610的计算机系统(或数字设备)1600。光学激发元件作为用于光学激发包含在纳米孔中的反应物的激发光束而发挥作用。该元件包括产生不同波长、强度和/或相干性质的光束的多种光源。这样的光学激发源的典型实例包括，但不限于激光器、发光二极管(LED)、紫外灯泡和/或白光源。
用于本发明的光学传输元件发挥两个功能。第一，它向芯片纳米孔中的反应物汇集和/或引导光学激发源。第二，它向感光元件传输和/或引导由芯片纳米孔中的反应物发射的光学信号。适用于本发明的光学传输元件包括各种引导光从一个位点到另一个位点的光学装置。这样的光学传输装置的非限制性的例子包括光纤、光多路复用器(MUX)和解复用器(DE-MUX)、衍射光栅、阵列波导光栅(AWG)、光学开关、反射镜、透镜、准直仪(collimator)和任何其它引导光传输通过适当的折射指数和几何形状的设备。
感光元件分析来自纳米孔中的反应物的光学信号的光谱。合适的感光元件可以在给定的波长检测光学信号的强度，且优选可以同时测量整个波长范围的光学信号的强度。优选元件也可以提供光谱数据分析，以显示光谱峰的波长、光谱峰的宽度和背景光谱噪音测量值。用于本发明的合适的感光元件的典型实例是雪崩光二极管(APD)、电荷耦合装置(CCD)、电子倍增电荷耦合装置(EMCCD)、光电倍增管(PMT)、光电倍增阵列、门敏感FET、纳米管FET和P-I-N二极管。如本文所用，CCD包括常规CCD、电子倍增电荷耦合装置(EMCCD)和其它形式的强化的CCD。
尽管可以使用各种元件的许多组合装配所述光学系统，用于分析激发的反应物的光谱的有用组件包括光学传输元件和感光元件。这样的组件本文也称为“光谱分析器”。
需要时，本发明的光学系统可以包括光学选择元件。在激发光到达包含在纳米孔中的反应物之前，该元件选择和/或改进它们的光学性质。光学选择元件也可以用于在信号到达感光元件之前选择和/或改进来自纳米孔中的反应物的光学信号。合适的光学选择元件可以选择并改变许多的光学性质，包括，但不限于偏振、光强度、波长、多种光线之间的相差、多种光线之间的时间延迟。这样的光学选择元件的典型实例是偏振滤波器、光学衰减器、波长滤波器(低通、带通或高通)、波板和延迟线。
前述的光学元件可以采取各种构型。它们可以形成所述芯片的组成部分或保持为单独的单元。所有这些元件是可商购的。因此，在一种实施方式中，本发明提供了其中光学传输元件和感光元件制成芯片片基的芯片。一方面，感光元件整合到待监测芯片上的各个纳米孔中。另一方面，超过一种类型的感光元件整合到纳米孔中以提高检测能力或效率。另一方面，可以沿纳米孔侧面或在纳米孔的基部制造感光元件，或者制造感光元件成为纳米孔盖子的部分。适合这样的构型的感光元件包括，但不限于雪崩光二极管、电荷耦合装置(包括常规CCD、电子倍增电荷耦合装置(EMCCD)和其它形式的强化CCD)、门敏感的FET、纳米管FET、P-I-N二极管。尤其优选雪崩光二极管，因为它允许通过电子转移的雪崩过程扩增信号而检测单光子。使用本文所述的或本领域已知的标准IC处理技术可以制造这些元件与支持电路一起作为所述芯片的部分。
在另一种实施方式中，本发明提供了其中芯片和光学系统保持为单独的单元的装置。本实施方式的一个方面包括用于进行需要在至少两个温度水平循环多个循环周期的化学反应或生物反应的装置。所述装置包括本发明的芯片和可操作地连接芯片并检测来自纳米孔的光学信号的光学系统。优选地，检测的光学信号与在纳米孔中发生的化学反应的产物量相关。
图16说明这方面的示例性的光学系统。在示例性的实施方式中，该系统包括受计算机或其它数字设备1600控制的光学传输元件，如可调谐激光器1610或氙气灯。然后使用Powell透镜1620、望远镜1630和/或线性聚焦激光器1640进一步聚焦激光以提供在所有纳米孔上的均一分布。来自芯片上的纳米孔的光学信号通过透镜1690(如管透镜(tubelen))校准，并经过可调滤波器1690(低通或高通)或陷波滤波器传送到电荷耦合装置(CCD)1615用于光谱分析。这种特定的实施方式提供了用于监测在芯片上制造的纳米孔中发生的化学反应的进程和/或结果的低成本解决方案。
在进一步的实施方式中，光学传输元件可移动以放置于如图16的选项1所示的X-Y阶段。在可选择的实施方式中，芯片放置于如图16的选项2所示的X-Y阶段。
在进一步的实施方式中，提供反馈控制或自我学习(self learning)以在片基的特定纳米孔实现优化的化学反应。例如，使用包括纳米孔阵列的固定位置的片基与可移动的光学传输元件和感光元件结合，在用一个或多个光学传输单元加热(或提供一系列加热和/或冷却步骤)之后，感光元件可以检测特定纳米孔中希望的化学反应的结果。在基于检测步骤分析给定的纳米孔中的各化学反应后，可以在随后的加热和/或冷却的循环轮次中实现合适的校正(例如提高或降低反应温度或反应循环的持续时间)以按照需要优化化学反应。可以使传输元件和敏感元件重复通过在各种纳米孔位置来重复进行该过程，直至在各个纳米孔中检测到化学反应的需要的结果。以这种方式，可以顺序监测和操作给定的纳米孔的化学反应，以提供用于给定的纳米孔的优化的化学反应。基于个别反应的独特的性质(例如，在PCR反应中使用不同的引物和模板)，在不同的纳米孔位置可能需要不同的条件。因此，可以结合指向中个纳米孔位置的反馈回路过程使用本发明的装置，以优化片基上的各个位置的化学反应。
在示例性的实施方式中，可以使用Chungara系列CCD照相机。Chungara CCD照相机可以用于大多数要求低噪音和长暴露成像的应用，如在天文学和光谱学的领域。Chungara CCD控制器能够阅读多种CCD，因为它基于模块性和共同的硬件结构。例如，可以使用的CCD的例子范围从1536x1024 Kodak KAF-1602CCD到4096x4096 KodakKAF-16801 CCD。照相机可以经过以太网或无线连接来连接主机，从而允许计算机和CCD照相机之间存在大的距离。
在另一种实施方式中，本发明提供了其中芯片、装置和光学系统是单独的单元的系统。在一种实施方式中，本发明的装置、系统、芯片，本发明的热循环装置或加热元件，及可操作地与芯片偶联并检测来自芯片的可编址单元的光学信号的光学系统。优选地，检测的光学信号与在单元中发生的化学反应的产物量相关。
在另一种优选的实施方式中，通过可操作地与芯片偶联的所述光学系统检测所述芯片中的扩增的核酸。光学系统能够向扩增反应中的反应物传输合适的激发光，收集并分析来自反应物的发射的光学信号。优选地，检测的光学信号表示多循环期间在扩增反应中扩增的核酸的量。在某些方面，光学系统在扩增过程中的多个时间点传输激发光到包含反应样品的孔中，并在各个时间点监测来自纳米孔的光学信号。通过分析光学信号的相对强度，优选在多循环期间，技术人员可以定量地监测扩增反应的进程。典型地，被监测的光学信号是荧光信号。一旦开始扩增，可以进行检测和/或监测扩增产物而无需打开纳米孔。
图17说明具有热循环装置1710和具有基于预定温度的可编址单元阵列的芯片1720的本发明的示例性的系统1700，所述热循环装置1710具有可以在第一和第二方位之间移动的第一加热器1712和第二加热器1714。在本实施例中，光学系统1730可操作地与芯片1720偶联，且装置1710是Chungara CCD照相机1732。如图17中的侧视图所示，加热器1712、1714可以独立地移动，并热接触本发明的芯片1720以提供如整个基因组的PCR扩增反应的大量化学反应的快速热循环。
图18说明本发明的示例系统1800，包括光学系统1810、加热装置1820和用于进行化学反应的芯片1830。系统的加热装置1820可以是用于进行PCR反应的热循环设备。如图18所示，加热装置可以包括用于进行PCR的变性块1822和退火块1824。加热装置1820也可以如图18中的箭头所示沿水平和垂直方向移动。芯片1830插在可以垂直移动的样品座1840上。芯片1830和/或芯片的纳米孔可以被塑料盖1832覆盖或不覆盖。加热器1820可以迫使样品座1840热接触包括薄膜ITO加热器1852的顶端盖片1850。顶端盖片1850通过压缩弹簧1854连接系统1800，以允许系统的样品座1840和加热器1820、1852之间形成更好的热接触。系统1800也可以包括死制动块(dead stop)1856，以防止顶端盖片1850压入光学系统1810中。
在图18中，光学系统1810包括CCD照相机1812、激发光源1814、光学器件1816和光学滤波器1818。系统可以包括多个光学系统。在另一种实施方式中，系统包括多个CCD照相机、激发光源、光学器件或光学滤波器。当芯片1830热接触加热装置1820时，光学系统1810可以发挥接收来自在芯片1830中发生的化学反应的信息的功能。
图19是显示逻辑设备的典型实例的方块图，通过所述逻辑设备可以实现检查或分析与本发明相关的数据。这样的数据可能与个体的基因型、遗传组成或疾病、障碍或状态有关。图19显示连接装置1920的计算机系统(或数字设备)1900，其与装置1924一起使用以例如产生结果。计算机系统1900可以理解为可以从介质1911和/或网络端口1905读取指令的逻辑装置，网络端口1905可以任选地连接具有固定介质1912的服务器1909。如图19显示的系统包括CPU 1901、磁盘驱动1903、如键盘1915和/或鼠标1916的任选输入设备和任选的监视器1907。可以通过指明的通讯介质实现与本地或远程服务器1909的数据通信。通讯介质可以包括任何传输和/或接收数据的手段。例如，通讯介质可以是网络连接、无线连接或因特网连接。这样的连接提供环球网上的通讯。可以设想：与本发明相关的数据可以通过这样的网络或连接传输以由某一方1922接收和/或检查。接收方或使用者1922可以是患者、卫生保健提供者或卫生保健管理者。在一种实施方式中，计算机可读介质包括适于传输生物样品的分析结果的介质。该介质可以包括关于受试者的基因型、遗传组成或疾病条件或状态的结果，其中，这样的结果使用本文所述的方法得到。
本发明的用途
用于热循环的所述芯片和装置在需要可控制的温度的化学和生物学应用中具有广泛的用途。优选本发明的方法、芯片和装置与有助于将该方法的一个或多个步骤结合的设备一起执行，所述步骤包括芯片的操作、热循环和成像。因此，本发明提供了用于相对于所述物种的标准基因组的物种同时测定从单个成员获得的生物样品的遗传表达谱的系统。
在一种实施方式中，本发明可以用于改变和/或维持反应样品的温度。在多种情况下需要改变和/或维持反应样品的温度，包括但不限于鉴别蛋白质-蛋白质相互作用、检查DNA或RNA杂交和进行酶促反应。该方法包括将反应样品置于在与加热元件热接触的芯片中制造的纳米孔中，并向加热元件施加电压。
在另一种实施方式中，用于热循环的所述芯片装置用来进行涉及多个反应样品并需要至少两个温度水平的循环的化学反应。该方法包括：(a)提供包含本文所述的单元阵列的芯片；(b)将多个反应样品置于芯片的单元中；和(c)控制加热元件以实现至少两个温度水平的循环。
实施所述方法一般通过将反应样品置于热接触加热元件的所述芯片的纳米孔中进行。需要时，可以通过可操作地连接所述芯片的分配系统应用反应样品。从手动操作的移液管到自动化的机器人系统的各种分配器具都是本领域可获得的。优选的分配器具包括压电纳米分配器。
所述芯片和装置尤其适于进行定量的核酸扩增。因此，本发明提供了用于监测核酸扩增反应产物的形成的方法，优选实时监测。在一定的优选实施方式中，通过整合到芯片中的感光元件直接监测包含的扩增核酸。感光元件记录反映扩增反应过程中任何检查时间的扩增核酸的量的光学信号强度。光学信号可以是在用合适的入射光激发标记的反应物时发射的任何种类的荧光信号。
扩增并检测目标核酸的所述方法例如，在药物筛选、疾病诊断、系统发生分类、确定个体基因型和亲子鉴定中具有广泛用途。
在一种实施方式中，本发明的系统、芯片、装置或方法可以用于发现治疗相关的生物标志物。例如，本发明可以用来鉴定用于慢性阻塞性肺病(COPD)和肺癌的生物标志物。
在更基础的水平时，目标核酸的扩增和检测可以用于鉴定和定量患病和正常的组织之间、在不同类型的组织和细胞之间、处于不同发育阶段或不同的细胞周期点的细胞之间和受到各种不同环境刺激或先导药物影响的细胞之间的差别基因表达。
在本发明的各种配置中，公开了提供用于获得结构基因组信息(如一种或多种单核苷酸多态性(SNP)的存在与否)和功能性基因组信息(如一个或多个基因的表达或表达量)的消费者分析的方法。如此，该分析可以设置为检测生物样品中的遗传物质的存在或表达。该方法包括提供设置为用于接收批量分析(stock assay)的命令的使用者界面，提供设置为用于接收对于惯常分析的设计要求和用于指令所述分析的使用者界面，和响应于消费者的惯常分析或批量分析的指令向消费者传送至少一个惯常分析或批量分析。在特定的其它方面，本发明包括系统、装置、芯片和方法，用于构建为消费者提供设置为检测遗传物质的存在或表达的分析方法的系统。在一种实施方式中，可以根据使用者的需要定制芯片。
本发明提供了用于容纳并处理少量液体的设备和方法，包括用于在含有多核苷酸的液体样品上进行扩增反应的设备和方法。本发明的实施方式包括用于在液体样品中进行包括多核苷酸的热循环扩增反应的化学反应的芯片。
所述芯片和其它设备在需要可控制的温度的许多其它化学和生物学应用中具有实用性。这样的应用包括各种反应，如氧化还原反应、水解、磷酸化和聚合反应。另外的应用涉及鉴别包括生物分子(如蛋白质、糖蛋白、核酸和脂质)以及无机化学品或其组合的相互作用。化学反应也可以包括核酸分子之间、核酸和蛋白质之间、蛋白质和小分子之间的相互作用。化学反应可以在引入所述芯片的纳米孔中的细胞外或细胞内发生。
在检测特定的蛋白质-蛋白质相互作用的存在方面的应用具有特别的意义。这样的应用一般采用置于所述芯片的单元中的蛋白质探针和靶标蛋白质。
在本实施方式的一个方面，蛋白质-蛋白质相互作用是在靶标蛋白质(例如，抗原)和对于该靶标特异性的抗体之间。另一方面，蛋白质-蛋白质相互作用是在细胞表面受体和其相应配体之间。在更另外的一方面，蛋白质-蛋白质相互作用涉及细胞表面受体和免疫脂质体或免疫毒素；在其它方面，蛋白质-蛋白质相互作用可以涉及胞质蛋白质、核蛋白质、伴随蛋白质或锚定于其它细胞内膜结构上的蛋白质。
用于细胞蛋白质的术语“膜”、“胞质”、“核”和“分泌的”指胞蛋白质大部、主要或优选定位的细胞外和/或亚细胞位置。
“细胞表面受体”代表能够结合其各自的配体的膜蛋白质的亚群。细胞表面受体是锚定在细胞质膜上或插入其中的分子。它们构成蛋白质、糖蛋白、多糖和脂质的大家族，其不仅作为质膜的结构组成，也作为控制各种生物功能的调节元件发挥作用。
通常通过在允许蛋白质探针和靶标之间形成复合物的条件下将探针与靶标蛋白质接触进行反应。如反应温度、反应持续时间、缓冲液条件等的条件取决于待研究的特定的相互作用。一般地，优选在生理相关的温度和缓冲液条件下进行反应。生理相关的温度范围是从大致室温到大约37℃。这可以通过调节所述芯片的加热元件来实现。典型地，生理缓冲液包含生理浓度的盐，并调节到范围是大约6.5-大约7.8、优选大约7.0-大约7.5的中性pH。在Sambrook等人(1989)，同上中列出各种生理缓冲液，本文不再详述。
根据本领域的标准方法或本文所述的方法可以直接或间接检测复合物的形成。在直接检测方法中，与可检测的标记一起提供探针，且当复合物形成时，探针发射与未反应的探针的光学信号明显不同的光学信号。理想的探针一般不会干扰靶标结合或干扰产生的靶标-探针复合物的稳定性。如上所述，本领域的技术人员已知各种适于这样的应用的标记，其中大部分是荧光探针。可以通过标准的定量分析或使用上述的光学系统的定量方法定量在结合反应过程中形成的探针-靶标复合物的量。
本文所述的实施例和其它实施方式是示例性的，且不打算限于描述本发明的装置、系统、组合物、材料和方法的全部范围。可以在本发明的范围内进行具体实施方式、装置、系统、组合物、材料和方法的等价改变、修饰、变化而具有基本上类似的结果。这样的改变、修饰或变化不认为是背离本发明的精神和范围。

Claims (57)

1.一种包含至少一个设置为与芯片形成热接触的加热元件的装置，所述芯片包括片基和纳米孔阵列，其中，该至少一个加热元件设置为相对于芯片移动。
2.如权利要求1所述的装置，其中，所述至少一个加热元件从芯片的上面和下面与芯片形成热接触，而且其中，从芯片下面热接触的加热元件的温度设定得比从芯片上面热接触的加热元件的温度低。
3.如权利要求1所述的装置，其中，所述芯片包括上表面和下表面，并且其中，第一系列的纳米孔在沿上表面上的一个方向排列，第二系列的纳米孔垂直于第一系列的纳米孔定向。
4.如权利要求1所述的装置，其中，所述加热元件位于包括纳米孔阵列的静止芯片的上面或下面。
5.如权利要求1所述的装置，其中，所述加热元件能够加热和冷却。
6.如权利要求1所述的装置，包括对应于多个温度带的多个加热元件。
7.如权利要求6所述的装置，其中，所述多个温度带在大约52℃-大约95℃的范围。
8.如权利要求7所述的装置，其中，所述多个温度带提供温度梯度。
9.如权利要求6所述的装置，其中，至少一个温度带设定为处于大约52℃-大约65℃范围的温度，而且至少一个另外的温度带设定为处于大约90℃-大约95℃范围的温度。
10.如权利要求9所述的装置，进一步包括至少一个设定为处于大约68℃-大约72℃范围的温度的另外的温度带。
11.如权利要求1所述的装置，其中，所述至少一个加热元件设置为提供包括温度随时间变化的尖峰波形的输出。
12.如权利要求1所述的装置，其中，所述阵列中的单个纳米孔具有长度为大约250μm、宽度为大约250μm和深度为大约525μm的尺寸或者更小。
13.如权利要求1所述的装置，其中，所述芯片可操作地与检测光学信号的光学系统偶联。
14.如权利要求13所述的装置，其中，所述光学系统包括多个光学检测器。
15.如权利要求1所述的装置，其中，所述纳米孔的数目大于大约30,000。
16.如权利要求1所述的装置，其中，所述纳米孔设置为容纳大约100nl的体积。
17.一种进行化学反应的方法，包括：
提供设置用于容纳反应样品的芯片；
提供至少一个可相对于芯片定位的加热元件，以在该至少一个加热元件和芯片之间提供热接触；和
通过改变芯片温度在反应样品中进行化学反应，其中，通过相对于芯片移动该至少一个加热元件以使得加热元件与芯片形成热接触，从而实现所述温度改变。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述化学反应是核酸扩增反应。
19.如权利要求17所述的方法，其中，所述至少一个加热元件的移动受到可操作地与芯片连接的温度传感器产生的信号控制。
20.如权利要求18所述的方法，其中，所述反应样品能够产生光学信号，并且其中，芯片可操作地与设置为检测反应样品发射的光学信号的光学系统偶联。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述光学信号与化学反应产物的量成比例。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述改变温度通过移动多个加热元件实现，各加热元件设定在不同的温度。
23.如权利要求21所述的方法，其中，至少一个加热元件设定为处于大约52℃-大约65℃范围的温度，至少一个另外的加热元件设定为处于大约90℃-大约95℃范围的温度。
24.一种进行反应的芯片，包括可编址的单元的阵列，各单元设置为进行化学反应，其中，可编址单元的阵列设置为对应于预定的温度带，并且其中，所述阵列中的单个单元的尺寸设计为容纳小于大约1μl的化学反应混合物。
25.如权利要求24所述的芯片，包括多个阵列。
26.如权利要求24所述的芯片，包括各对应于不同的温度带的多个阵列。
27.如权利要求24所述的芯片，包括多个阵列，其中，至少一个阵列设定为处于用于支持核酸扩增反应的退火温度，和至少一个另外的阵列设定为处于用于支持核酸扩增反应的变性温度。
28.如权利要求24所述的芯片，其中，对所述带编址以表明预定的温度带。
29.如权利要求24所述的芯片，其中，所述可编址单元的阵列设置为对应于6个或更多个预定的温度带。
30.如权利要求24所述的芯片，其中，所述芯片与加热元件形成热接触。
31.一种用于进行需要在至少两个温度水平循环的化学反应的装置，包括：
(a)用于进行反应的包含可编址单元的阵列的芯片，各单元设置为用于化学反应，其中，可编址单元的阵列设置为对应于预定的温度带，并且其中，所述阵列中的单个单元的尺寸设计为容纳小于大约1μl的化学反应混合物；和
(b)与芯片形成热接触的加热元件。
32.如权利要求24或权利要求31所述的装置，其中，所述可编址单元的阵列大于大约30,000。
33.如权利要求31所述的装置，进一步包括：(c)可操作地与芯片偶联的光学系统，其中，所述光学系统检测来自编址的可热控制的单元的光学信号。
34.如权利要求33所述的装置，其中，所述光学系统包括多个光学检测器。
35.如权利要求31所述的装置，进一步包括多个加热元件。
36.如权利要求35所述的装置，其中，所述多个加热元件包括6个或更多个加热元件。
37.如权利要求24或权利要求31所述的装置，其中，所述阵列中的单个单元包括用于容纳和限制样品的纳米孔，所述孔在填充样品后被密封。
38.如权利要求24或权利要求31所述的装置，其中，所述化学反应是核酸扩增反应。
39.如权利要求38所述的装置，其中，单元的预定温度设置为从化学反应产生至少90％的同质产物。
40.一种进行涉及多个反应样品并需要在至少两个温度水平循环的反应的方法，包括：
(a)提供进行反应的芯片，包括可编址单元的阵列，各个单元设置为用于化学反应，其中，可编址单元的阵列设置为对应于预定的温度带，并且其中，所述阵列中的单个单元的尺寸设计为容纳小于大约1μl的化学反应混合物；
(b)根据预定温度的设定，将多个反应样品放置于芯片的单元中；和
(c)控制加热元件以实现至少两个温度水平的循环。
41.如权利要求40所述的方法，其中，所述芯片的阵列中的单个单元包括用于容纳并限制样品的纳米孔，所述孔在填充样品后被密封。
42.如权利要求40所述的方法，其中，所述化学反应是核酸扩增反应。
43.如权利要求42所述的方法，其中，单元的预定温度设置为从化学反应产生至少90％的同质产物。
44.一种用于进行涉及至少两个温度水平的循环的反应的装置，包括：
(a)设置为容纳芯片的主体，所述芯片包括多个用于容纳化学反应物的纳米孔；和
(b)提供第一温度的第一加热器和提供第二温度的第二加热器；
其中，第一加热器和第二加热器设置为可在第一和第二方位之间移动，且其中，第一方位使加热器与样品座形成热接触，和第二方位不使加热器与样品座形成热接触。
45.如权利要求44所述的装置，其中，所述多个纳米孔是可编址的，其中，纳米孔按照预定的温度设置排列，使得至少一个纳米孔编址为表明用于在所述纳米孔内进行化学反应的预定温度。
46.如权利要求44所述的装置，其中，所述多个纳米孔包括超过大约30,000纳米孔。
47.如权利要求44所述的装置，其中，所述第一加热器包括多个温度带。
48.如权利要求47所述的装置，其中，所述温度带包括6个或更多个温度带。
49.如权利要求48所述的装置，其中，所述多个温度带对应于预定的温度设置，可热控制的单元根据该温度设置形成阵列。
50.如权利要求44所述的装置，其中，所述第一加热器和第二加热器按照方案在第一和第二方位之间移动。
51.如权利要求44所述的装置，进一步包括用于在第一和第二方位之间移动第一加热器和第二加热器的电动机。
52.如权利要求44所述的装置，其中，所述第一加热器提供温度梯度。
53.如权利要求44所述的装置，进一步包括与第一加热器形成热接触的散热器。
54.如权利要求44所述的装置，进一步包括与第二加热器形成热接触的散热器。
55.如权利要求53或权利要求54所述的装置，进一步包括用于从散热器散热的风扇。
56.如权利要求44所述的装置，进一步包括多个可操作地与芯片连接的温度传感器。
57.如权利要求56所述的装置，其中，所述多个温度传感器具有至少一个指定为测量各温度带的温度的温度传感器。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20100519