CN101654476A - 用于个人护理的基于肽的体表试剂 - Google Patents

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CN101654476A CN200910164983A CN200910164983A CN101654476A CN 101654476 A CN101654476 A CN 101654476A CN 200910164983 A CN200910164983 A CN 200910164983A CN 200910164983 A CN200910164983 A CN 200910164983A CN 101654476 A CN101654476 A CN 101654476A
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Abstract

本发明涉及用于个人护理的基于肽的体表试剂。已经鉴别出了以高亲和力结合体表的肽，所述体表例如毛发、皮肤、指甲、牙齿、牙龈、角膜组织和口腔表面。描述了通过将体表结合肽与有益试剂相偶联形成的基于肽的体表试剂。基于肽的体表试剂包括基于肽的毛发调理剂、毛发着色剂、皮肤调理剂、皮肤着色剂、指甲着色剂和口腔护理剂。基于肽的毛发调理剂和毛发着色剂包含分别偶联到毛发调理剂或着色剂上的毛发结合肽。基于肽的皮肤调理剂和皮肤着色剂包含分别偶联到皮肤调理剂或着色剂上的皮肤结合肽。在所有这些组合物中，肽可以直接与活性试剂偶联，或者可以通过间隔基来偶联。还描述了包含这些基于肽的调理剂和着色剂的个人护理组合物。

Description

用于个人护理的基于肽的体表试剂
本申请是申请日为2005年3月8日的中国专利申请200580030052.2“用于个人护理的基于肽的体表试剂”的分案申请。
本专利申请是2004年9月7日提交的美国专利申请10/935642的部分继续申请，后者要求享有现在已经终止的2003年9月8日提交的美国临时申请60/501498的利益.
技术领域
本发明涉及个人护理产品领域.更具体地，本发明涉及基于特异性的皮肤结合肽、毛发结合肽和指甲结合肽的皮肤调理剂、毛发调理剂、毛发着色剂、指甲着色剂和皮肤着色剂.
背景技术
成膜物质作为调理剂和保湿剂，被广泛应用于进行皮肤和毛发护理的组合物中，以保护皮肤和毛发避免环境的和化学的伤害。这些物质吸附在皮肤或毛发上，和/或被皮肤或毛发吸收，从而形成保护层。常用的成膜物质包括合成的聚合物，例如硅酮、聚乙烯吡咯烷酮、丙烯酸聚合物，和多糖，以及蛋白，例如胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白、酪蛋白、丝蛋白和豆蛋白.已知许多蛋白是非常有效的成膜试剂.因为它们在皮肤和毛发护理产品使用的条件下的低溶解度，蛋白通常以蛋白水解后所形成的肽的形式使用.
在毛发护理和毛发着色组合物中，成膜物质用于在毛发表面形成保护膜，以保护毛发免受由于修饰和定型、洗发和暴露于紫外线和永久性卷发剂、毛发着色产品、漂白剂和毛发拉直剂中常用的活性化学品所导致的损害，上述化学品能够使毛发角蛋白变性。此外，这些成膜物质能够增强毛发的弹性。已经应用于毛发护理产品中的成膜物质包括蛋白，例如角蛋白、胶原蛋白、豆蛋白和丝蛋白以及它们的水解产物，和聚合材料，例如聚丙烯酸酯、长链烷基季铵化胺、和硅氧烷聚合物。例如，在美国专利号6,013,250中，Cannell等描述了一种毛发护理组合物，其用于处理毛发，使之免受化学和紫外线损害.该组合物包含水解蛋白，其具有丰富的阴离子氨基酸，尤其是含硫的氨基酸和二价阳离子。该公开内容提示，水解蛋白的阴离子成分通过阳离子桥的方式结合到毛发上.氨基酸和它们的衍生物也已经被应用于毛发护理组合物中，以调节毛发并增强其强度.例如，在WO 0051556中，O’Toole等描述了包含四种或更多种选自下述的氨基酸化合物的毛发护理组合物：组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸化合物。
成膜物质还被应用于皮肤护理组合物中，在皮肤上形成保护膜。这些膜能够润滑皮肤，并在皮肤上形成涂层，以被动地防止皮肤水分的蒸发，并且使皮肤光滑和柔软.在皮肤护理组合物中常用的成膜物质包括水解的动物和植物蛋白(Puchalski等，美国专利号4,416,873，El-Menshawy等，美国专利号4,482,537，和Kojima等，JP02311412)和丝蛋白(Philippe等，美国专利号6,280,747和Fahnestock等，共同未决的美国专利申请号10/704337).在皮肤护理组合物中也已经使用氨基酸和衍生物作为调理剂.例如，JP06065049中，Kojima等描述了包含氨基酸和/或其衍生物和二十二碳六烯酸、其盐或其酯的皮肤护理组合物.
毛发着色剂可分为三类，具体地分为永久性的、半永久性的或直接的、和临时的。永久性毛发染料通常是氧化染料，其能够使毛发的色彩维持约四到六周.这些氧化毛发染料由两部分组成，一部分除其它成分之外包含氧化染料，第二部分包含氧化剂，例如过氧化氢.在使用前，将两种组分立即混合在一起.氧化剂会氧化染料前体，氧化后的产物在毛干内结合，形成巨大的带有颜色的分子。虽然氧化性毛发染料能够使色彩长时间维持，但是其中所包含的氧化剂会造成毛发损害。半永久性或直接的毛发染料是预先形成的染料分子，它们施用到毛发上，会使色彩维持约六到十二次洗发.这种类型的毛发染料因为不含过氧化物，因此对于毛发来说比较温和，但是毛发色彩维持的时间不够长。如Hensen等在WO 01045652中所述，通过使用粒径为10至500nm的纳米颗粒毛发着色材料，能够提高色彩的耐久性。这些纳米颗粒毛发着色物质是常规的直接毛发染料，经处理，获得纳米级的尺寸，并表现出提高的毛发吸收.临时毛发染料是施用到毛发表面上并经一次洗发就能去掉的着色剂.现在需要开发一种不使用会损伤毛发的氧化剂就能够提供永久性毛发染料的耐久性的毛发着色剂。
在当前皮肤护理和毛发护理组合物、非氧化性毛发染料以及指甲着色剂中，存在的主要问题是，它们缺乏维持长期效果所需的耐久性。因此，已经尝试增强化妆品试剂对毛发、皮肤或指甲的结合能力.例如，Richardson等在美国专利号5,490,980中和Green等在美国专利号6,267,957中，描述了化妆品试剂(如皮肤调理剂、毛发调理剂、着色剂、防晒剂和香水)利用转谷氨酰胺酶向毛发、皮肤和指甲的共价结合。该酶将化妆品试剂上的胺部分交联到皮肤、毛发和指甲里的谷氨酰胺残基上.类似地，Green等在WO0107009中描述了使用赖氨酸氧化酶将化妆品试剂共价结合到毛发、皮肤和指甲上.
在另一种方法中，已经将化妆品试剂共价结合到蛋白或蛋白水解产物上。例如，Lang等在美国专利号5,192,332中描述了包含动物或植物蛋白或其水解产物的临时着色组合物，其包含嫁接到蛋白链上的染料分子残基。在那些组合物中，蛋白用作调理剂，且不会增强化妆品试剂向毛发、皮肤或指甲的结合。Horikoshi等在JP 08104614中和Igarashi等在美国专利号5,597,386中，描述了由共价结合到染料或色素上的抗-角蛋白抗体组成的毛发着色剂。抗体结合到毛发上，从而增强了毛发着色剂向毛发的结合。类似地，Kizawa等在JP 09003100描述了一种能够识别毛发表层的抗体及其处理毛发的应用.还描述了一种由偶联到有色乳胶颗粒上的抗-毛发抗体组成的毛发着色剂。使用抗体来增强染料与毛发的结合，会有效地提高毛发着色的耐久性，但是这些抗体在生产上难度较大，并且比较昂贵。Terada等在JP2002363026中描述了缀合物在皮肤和毛发护理组合物中的应用，该缀合物由单链抗体、优选抗-角蛋白抗体组成，该抗体与染料、配体和化妆品试剂相偶联.尽管可以使用基因工程技术来制备上述单链抗体，但是因为是大分子，所以在制备上仍然比较困难和昂贵.Findlay在WO 00048558中描述了萼状蛋白(例如β-乳球蛋白)在调理剂、染料和香水中的应用，其包含化妆品试剂的结合结构域，和另一个结合毛发纤维表面或皮肤表面的至少一部分的结合结构域.这些蛋白还是太大，而在制备上困难和昂贵.
Linter在美国专利号6,620,419中描述了嫁接到脂肪酸链上的肽，并描述了它们在化妆品和皮肤药物方面的用途。选择在上述公开内容中所述的肽，因为它们会刺激胶原的合成；它们不是会增强毛发和皮肤调理剂、和毛发、指甲和皮肤着色剂的耐久性的特异性结合肽.
自从1985年引入以来，噬菌体展示被广泛地用于发现多种用于药物靶的配体，包括肽、蛋白和小分子(Dixit，J.of Sci&Ind.Research，57：173-183(1998)).该用途已经被扩展到其它领域，例如研究蛋白折叠、新的催化活性、具有新特异性的DNA-结合蛋白、和用于组织工程的新的基于肽的生物材料支架(Hoess，Chem.Rev.101：3205-3218(2001)和Holmes，Trends Biotechnol.20：16-21(2002))。Whaley等(Nature 405：665-668(2000))公开了噬菌体展示筛选方法在鉴别肽序列中的用途，所述肽序列可以特异性地结合到无机半导体基质的不同晶体形式上.
描述了一种修改的筛选方法，其包括将肽文库与抗靶物(anti-target)接触，以去掉结合到抗靶上的肽，然后将未结合的肽与靶物接触(Estell等WO 0179479，Murray等美国专利申请公开号2002/0098524，和Janssen等美国专利申请公开号2003/0152976).使用该方法，鉴别出了如SEQ ID NO：1所示的结合毛发但不结合皮肤的肽序列，和如SEQ ID NO：2所示的结合皮肤但不结合毛发的肽序列。使用相同的方法，Janssen等(WO 04048399)鉴别出了其它皮肤结合肽和毛发结合肽，以及几种结合基序.尽管在那些公开内容中已经提示了这些肽在个人护理用品方面的潜在应用，但是没有描述这些肽与着色剂和调理剂的偶联，以制备高亲和力毛发调理剂、皮肤调理剂、毛发着色剂、指甲着色剂和皮肤着色剂.在这些公开内容中，还描述了一种鉴别高亲和力噬菌体-肽克隆的方法。该方法包含，使用PCR来鉴别酸洗脱后仍然保持结合靶物的肽.
Reisch(Chem.Eng.News 80：16-21(2002))报道，在个人护理用品中已开发了一族用于靶向特定人组织成分的肽.然而，在该文献中没有描述基于肽的调理剂或着色剂.
如SEQ ID NO：3所示的本发明的一种肽结合序列，已经被报道用于几个其它目的.例如，Hupp等在WO 02065134中公开了肽序列SEQID NO：3作为一种用于调节p53多肽与p300多肽的结合的肽，其可用于调节哺乳动物细胞周期或诱导或防止细胞死亡.Liu等在美国专利号6,344,443公开了相同的肽序列在抑制肿瘤坏死因子α与它的受体结合方面的应用，以预防或逆转患有关节炎和其它炎性疾病的患者的炎性变化.在WO 03102020中，Jagota等已将如SEQ ID NO：4所示的本发明的另一个肽结合序列报道为碳纳米管结合肽.
综上所述，需要毛发和皮肤调理剂、以及毛发、指甲和皮肤着色剂，其能为持久效果提供提高的耐久性，并且制备上容易和价格低廉.
申请人通过使用噬菌体展示筛选方法，鉴别出能以高亲和力特异性地结合体表(例如，毛发、皮肤、指甲、牙齿、牙龈、角膜组织和口腔表面)的肽序列，并使用它们设计基于肽的体表试剂，例如毛发调理剂、皮肤调理剂、毛发着色剂、指甲着色剂、皮肤着色剂和口腔护理剂，从而满足了所述需要.
发明内容
本发明提供了与毛发、皮肤和指甲以高亲和力结合的肽序列。本发明还提供了用于毛发、皮肤和指甲的基于肽的调理剂和着色剂.在一个实施方案中，基于肽的调理剂和着色剂是二嵌段(diblock)组合物。
因此，本发明提供了一种毛发结合肽，其选自SEQ ID NO：5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，64，66，69，和70.
类似地，本发明提供了SEQ ID NO：60所示的指甲结合肽.
在另一个实施方案中，本发明提供了SEQ ID NO：61所示的皮肤结合肽。
在一个实施方案中，本发明提供了二嵌段的、基于肽的体表试剂，其具有通式结构(BSBP)n-BA，其中
a)BSBP是体表结合肽；
b)BA是有益试剂；且
c)n的范围为1至约10,000.
或者，本发明提供了三嵌段的、基于肽的体表试剂，其具有通式结构[(BSBP)m-S]n-BA，其中
a)BSBP是体表结合肽；
b)BA是有益试剂；
c)S是间隔基；
d)m的范围为1至约50；且
e)n的范围为1至约10,000.
在另一个实施方案中，本发明提供了二嵌段的、基于肽的毛发调理剂，其具有通式结构(HBP)n-HCA，其中
a)HBP是毛发结合肽；
b)HCA是毛发调理剂；且
c)n的范围为1至约1000.
类似地，本发明提供了二嵌段的、基于肽的皮肤调理剂，其具有通式结构(SBP)n-SCA，其中
a)SBP是皮肤结合肽；
b)SCA是皮肤调理剂；且
c)n的范围为1至约1000.
在一个替代实施方案中，本发明提供了二嵌段的、基于肽的毛发着色剂，其具有通式结构(HBP)n-C，其中
a)HBP是毛发结合肽；
b)C是着色剂；且
c)n的范围为1至约10,000.
在另一个实施方案中，本发明提供了二嵌段的、基于肽的指甲着色剂，其具有通式结构(NBP)n-C，其中
a)NBP指甲结合肽；
b)C是着色剂；且
c)n的范围为1至约10,000.
在另一个实施方案中，本发明提供了二嵌段的、基于肽的皮肤着色剂，其具有通式结构(SBP)n-C，其中
a)SBP是皮肤结合肽；
b)C是着色剂；且
c)n的范围为1至约10,000.
在一个类似的实施方案中，本发明提供了三嵌段的、基于肽的毛发调理剂，其具有通式结构[(HBP)m-S]n-HCA，其中
a)HBP是毛发结合肽；
b)HCA是毛发调理剂；
c)S是间隔基；
d)m的范围为1至约50；且
e)n的范围为1至约1000。
或者，本发明提供了三嵌段的、基于肽的皮肤调理剂，其具有通式结构[(SBP)m-S]n-SCA，其中
a)SBP是毛发结合肽；
b)SCA是皮肤调理剂；
c)S是间隔基；
d)m的范围为1至约50；且
e)n的范围为1至约1000.
类似地，本发明提供了三嵌段的、基于肽的毛发着色剂，其具有通式结构[(HBP)m-S]n-C，其中
a)HBP是毛发结合肽；
b)C是着色剂；
c)S是间隔基；
d)m的范围为1至约50；且
e)n的范围为1至约10,000.
在另一个实施方案中，本发明提供了三嵌段的、基于肽的指甲着色剂，其具有通式结构[(NBP)m-S]n-C，其中
a)NBP是毛发结合肽；
b)C是着色剂；
c)S是间隔基；
d)m的范围为1至约50；且
e)n的范围为1至约10,000。
在另一个实施方案中，本发明提供了三嵌段的、基于肽的皮肤着色剂，其具有通式结构[(SBP)m-S]n-C，其中
a)SBP是毛发结合肽；
b)C是着色剂；
c)S是间隔基；
d)m的范围为1至约50；且
e)n的范围为1至约10,000。
在一个替代实施方案中，本发明提供了二嵌段的、基于肽的口腔护理剂，其具有通式结构(OBP)n-OBA，其中
a)OBP是口腔表面结合肽；
b)OBA是口腔护理有益试剂；且
c)n的范围为1至约10,000.
类似地，本发明提供了三嵌段的、基于肽的口腔护理剂，其具有通式结构[(OBP)m-S]n-OBA，其中
a)OBP是口腔表面结合肽；
b)OBA是口腔护理有益试剂；
c)S是间隔基；
d)m的范围为1至约50；且
e)n的范围为1至约10,000.
另外，本发明提供了产生高亲和力体表结合肽的方法，包含：
a)提供组合产生的噬菌体-肽的文库；
b)使(a)的文库接触体表样品，形成反应溶液，其包含：
(i)噬菌体-肽-体表样品复合物；
(ii)未结合的体表样品，和
(iii)未形成复合物的肽；
c)分离(b)的噬菌体-肽-体表样品复合物；
d)从(c)的分离的噬菌体-肽复合物，洗脱微弱结合的噬菌体-肽；
e)用经过步骤(d)后保留下来的噬菌体-肽-体表样品复合物，直接感染细菌宿主细胞；
f)在合适的生长培养基中，生长步骤(e)的受感染的细胞；和
g)从步骤(f)的生长细胞，分离和鉴别噬菌体-肽，其中所述噬菌体-肽具有对体表的高结合亲和力.
在一个优选的实施方案中，本发明提供了在毛发上形成基于肽的调理剂的保护层的方法，包含将本发明的组合物施用于毛发，使所述的保护层形成。
类似地，本发明提供了在皮肤或嘴唇上形成基于肽的调理剂的保护层的方法，包含将本发明的组合物施用于皮肤或嘴唇，使所述的保护层形成.
在一个实施方案中，本发明提供了将有益试剂施用于体表的方法，包含在体表结合肽附着体表的条件下，使体表接触权利要求4或5的基于肽的体表试剂，其包含体表结合肽和有益试剂.
在另一个实施方案中，本发明提供了使毛发、眉毛、皮肤或指甲着色的方法，包含将本发明的毛发、眉毛、皮肤或指甲着色组合物施用于毛发、眉毛、皮肤或指甲，持续足以使毛发、眉毛、皮肤或指甲着色的时间.
在一个优选的实施方案中，本发明提供了使毛发、眉毛或睫毛着色的方法，包含下述步骤：
a)提供毛发着色组合物，其包含选自下述的毛发着色剂：
i)(HBP)n-C；和
ii)[(HBP)m-S]k-C
其中
1)HBP是毛发结合肽；
2)C是着色剂；
3)n的范围为1至约10,000；
4)S是间隔基；
5)m的范围为1至约50；且
6)k的范围为1至约10,000；
且其中通过包含下述步骤的方法选择毛发结合肽：
A)提供组合产生的噬菌体-肽的文库；
B)使(A)的文库接触毛发样品，形成反应溶液，其包含：
(i)噬菌体-肽-毛发复合物；
(ii)未结合的毛发，和
(iii)未形成复合物的肽；
C)分离(B)的噬菌体-肽-毛发复合物；
D)从(C)的分离的肽复合物，洗脱微弱结合的肽；
E)如下鉴别仍然结合的噬菌体-肽：使用经过步骤(D)后保留下来的噬菌体-肽-毛发复合物直接进行聚合酶链式反应，或用经过步骤(D)后保留下来的噬菌体-肽-毛发复合物直接感染细菌宿主细胞，在合适的生长培养基中生长感染的细胞，并从生长细胞中分离和鉴别噬菌体-肽，其中噬菌体-肽具有约7至约25个氨基酸，并且对毛发具有以MB50计等于或小于10-5M的结合亲和力；和
b)将(a)的毛发着色剂施用于毛发、眉毛或睫毛，持续足以使基于肽的着色剂结合毛发、眉毛或睫毛的时间.
在另一个实施方案中，本发明提供了在毛发上形成基于肽的调理剂的保护层的方法，包含下述步骤：
a)提供毛发护理组合物，其包含选自下述的毛发调理剂：
i)(HBP)n-HCA和
ii)[(HBP)m-S]k-HCA
其中
1)HBP是毛发结合肽；
2)HCA是毛发调理剂；
3)n的范围为1至约1,000；
4)S是间隔基；
5)m的范围为1至约50；且
6)k的范围为1至约1,000；
且其中通过包含下述步骤的方法选择毛发结合肽：
A)提供组合产生的噬菌体-肽的文库；
B)使(A)的文库接触毛发样品，形成反应溶液，其包含：
(i)噬菌体-肽-毛发复合物；
(ii)未结合的毛发，和
(iii)未形成复合物的肽；
C)分离(B)的噬菌体-肽-毛发复合物；
D)从(C)的分离的肽复合物，洗脱微弱结合的肽；
E)如下鉴别仍然结合的噬菌体-肽：使用经过步骤(D)后保留下来的噬菌体-肽-毛发复合物直接进行聚合酶链式反应，或用经过步骤(D)后保留下来的噬菌体-肽-毛发复合物直接感染细菌宿主细胞，在合适的生长培养基中生长感染的细胞，并从生长细胞中分离和鉴别噬菌体-肽，其中噬菌体-肽具有约7至约25个氨基酸，并且对毛发具有以MB50计等于或小于10-5M的结合亲和力；和
b)将(a)的毛发调理剂施用于毛发，使所述的保护层形成。
或者，本发明提供了在皮肤或嘴唇上形成保护层的方法，包含下述步骤：
a)提供皮肤护理组合物，其包含选自下述的皮肤调理剂：
i)(SBP)n-SCA；和
ii)[(SBP)m-S]k-SCA
其中
1)SBP是皮肤结合肽；
2)SCA是皮肤调理剂；
3)n的范围为1至约1,000；
4)S是间隔基；
5)m的范围为1至约50；且
6)k的范围为1至约1,000；
且其中通过包含下述步骤的方法选择皮肤结合肽：
A)提供组合产生的噬菌体-肽的文库；
B)使(A)的文库接触皮肤样品，形成反应溶液，其包含：
(i)噬菌体-肽-皮肤复合物；
(ii)未结合的皮肤，和
(iii)未形成复合物的肽；
C)分离(B)的噬菌体-肽-皮肤复合物；
D)从(C)的分离的肽复合物，洗脱微弱结合的肽；
E)如下鉴别仍然结合的噬菌体-肽：使用经过步骤(D)后保留下来的噬菌体-肽-皮肤复合物直接进行聚合酶链式反应，或用经过步骤(D)后保留下来的噬菌体-肽-皮肤复合物直接感染细菌宿主细胞，在合适的生长培养基中生长感染的细胞，并从生长细胞中分离和鉴别噬菌体-肽，其中噬菌体-肽具有约7至约25个氨基酸，并且对皮肤具有以MB50计等于或小于10-5M的结合亲和力；和
b)将(a)的皮肤调理剂施用于皮肤或嘴唇，使所述的保护层形成.
在另一个实施方案中，本发明提供了使皮肤或嘴唇着色的方法，包含下述步骤：
a)提供化妆品组合物，其包含选自下述的皮肤着色剂：
i)(SBP)n-C；和
ii)[(SBP)m-S]k-C
其中
1)SBP是皮肤结合肽；
2)C是着色剂；
3)n的范围为1至约10,000；
4)S是间隔基；
5)m的范围为1至约50；and
6)k的范围为1至约10,000；
且其中通过包含下述步骤的方法选择皮肤结合肽：
A)提供组合产生的噬菌体-肽的文库；
B)使(A)的文库接触皮肤样品，形成反应溶液，其包含：
(i)噬菌体-肽-皮肤复合物；
(ii)未结合的皮肤，和
(iii)未形成复合物的肽；
C)分离(B)的噬菌体-肽-皮肤复合物；
D)从(C)的分离的肽复合物，洗脱微弱结合的肽；
E)如下鉴别仍然结合的噬菌体-肽：使用经过步骤(D)后保留下来的噬菌体-肽-皮肤复合物直接进行聚合酶链式反应，或用经过步骤(D)后保留下来的噬菌体-肽-皮肤复合物直接感染细菌宿主细胞，在合适的生长培养基中生长感染的细胞，并从生长细胞中分离和鉴别噬菌体-肽，其中噬菌体-肽具有约7至约25个氨基酸，并且对皮肤具有以MB50计等于或小于10-5M的结合亲和力；和
b)将(a)的皮肤着色剂施用于皮肤或嘴唇.
或者，本发明提供了使指甲着色的方法，包含下述步骤：
a)提供指甲油组合物，其包含选自下述的指甲着色剂：
i)(NBP)n-C；和
ii)[(NBP)m-S]k-C
其中
1)NBP指甲结合肽；
2)C是着色剂；
3)n的范围为1至约10,000；
4)S是间隔基；
5)m的范围为1至约50；and
6)k的范围为1至约10,000；
且其中通过包含下述步骤的方法选择指甲结合肽：
A)提供组合产生的噬菌体-肽的文库；
B)使(A)的文库接触指甲样品，形成反应溶液，其包含：
(i)噬菌体-肽-指甲复合物；
(ii)未结合的指甲，和
(iii)未形成复合物的肽；
C)分离(B)的噬菌体-肽-指甲复合物；
D)从(C)的分离的肽复合物，洗脱微弱结合的肽；
E)如下鉴别仍然结合的噬菌体-肽：使用经过步骤(D)后保留下来的噬菌体-肽-指甲复合物直接进行聚合酶链式反应，或用经过步骤(D)后保留下来的噬菌体-肽-指甲复合物直接感染细菌宿主细胞，在合适的生长培养基中生长感染的细胞，并从生长细胞中分离和鉴别噬菌体-肽，其中噬菌体-肽具有约7至约25个氨基酸，并且对指甲具有以MB50计等于或小于10-5M的结合亲和力；和
b)将(a)的指甲着色剂施用于指甲.
在另一个实施方案中，本发明提供了将口腔护理有益试剂施用于口腔表面的方法，包含下述步骤：
a)提供选自下述的口腔护理剂：
i)(OBP)n-OBA；和
ii)[(OBP)m-S]k-OBA
其中
1)OBP是口腔表面结合肽；
2)OBA是口腔护理有益试剂；
3)n的范围为1至约10,000；
4)S是间隔基；
5)m的范围为1至约50；且
6)k的范围为1至约10,000；
且其中通过包含下述步骤的方法选择口腔表面结合肽：
A)提供组合产生的噬菌体-肽的文库；
B)使(A)的文库接触口腔表面样品，形成反应溶液，其包含：
(i)噬菌体-肽-口腔表面样品复合物；
(ii)未结合的口腔表面样品，和
(iii)未形成复合物的肽；
C)分离(B)的噬菌体-肽-口腔表面样品复合物；
D)从(C)的分离的肽复合物，洗脱微弱结合的肽；
E)如下鉴别仍然结合的噬菌体-肽：使用经过步骤(D)后保留下来的噬菌体-肽-口腔表面样品复合物直接进行聚合酶链式反应，或用经过步骤(D)后保留下来的噬菌体-肽-口腔表面样品复合物直接感染细菌宿主细胞，在合适的生长培养基中生长感染的细胞，并从生长细胞中分离和鉴别噬菌体-肽，其中噬菌体-肽具有约7至约25个氨基酸，并且对口腔表面样品具有以MB50计等于或小于10-5M的结合亲和力；和
b)将(a)的口腔护理有益试剂施用于口腔表面，持续足以使基于肽的口腔护理试剂结合口腔表面的时间。
序列描述的简要说明
通过以下的详细说明和所附的序列描述，可以更充分地理解本发明，其中序列描述也是本申请的一部分。
以下的序列符合37C.F.R.1.821-1.825(“包含核苷酸序列和/或氨基酸序列的专利申请所必备的条件-序列条款”)，并符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)，以及EPO和PCT(5.2条和49.5(a-bis)条，和使用说明208部分和附件C)的序列表要求.在核苷酸和氨基酸序列数据中所使用的符号和格式均符合37C.F.R.§1.822的规定.
SEQ ID NO：1是毛发结合肽的氨基酸序列.
SEQ ID NO：2是皮肤结合肽的氨基酸序列.
SEQ ID NO：3-52、54-59是本发明毛发结合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：53是本发明毛发结合肽和指甲结合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：60是本发明指甲结合肽的氨基酸序列.
SEQ ID NO：61是本发明皮肤结合肽的氨基酸序列.
SEQ ID NO：62是用于噬菌体DNA测序的寡核苷酸引物.
SEQ ID NO：63是在ELISA结合测定中作为对照的肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：64是半胱氨酸连接的毛发结合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：65是胱天蛋白酶3剪切位点的氨基酸序列。
SEQ ID NO：66、69和70是抗洗发水的毛发结合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：67和68是实施例8中所描述的用于扩增抗洗发水的、毛发结合噬菌体肽的引物的核苷酸序列.
SEQ ID NO：71-74是实施例9中使用的生物素化的毛发结合肽和皮肤结合肽的氨基酸序列.
SEQ ID NO：75是实施例16中使用的完全保护的D21肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：76-98是毛发结合肽的氨基酸序列.
SEQ ID NO：99-104是皮肤结合肽的氨基酸序列。
具体实施方式
本发明提供了以高亲和力特异性地结合人体表的肽序列，所述的人体表例如毛发、皮肤、指甲、牙齿、牙龈等.另外，本发明提供了基于肽的体表试剂，其包含与赋予体表益处的多种有益试剂相偶联的体表结合肽.典型的本发明的组合物是基于肽的毛发和皮肤调理剂，和具有提高的耐久性的毛发、指甲和皮肤着色剂.
本发明的基于肽的体表试剂提供超过个人护理产品开发的现有技术的益处和进步。因为试剂是基于肽的，它们能强烈地结合来自水性环境的表面，因而在许多情况下是水溶性的和耐水的.另外，因为试剂的水性性质，无需使用产生气味的化学试剂，即可从体表去除它们。本发明的试剂会几乎立即结合目标体表，不需要长时间干燥，后者是大多数个人护理用品需要的.另外，本发明的试剂的亲和力是体表特异性的，无需分离它们对特定表面的应用.因而，结合毛发以进行着色的试剂不会结合皮肤，反之亦然.最重要的是，试剂的肽性质使得它们实际上对暴露的体表无毒且无刺激，所述体表例如皮肤，和眼和嘴的膜。
本说明书中采用如下定义，其用于解释权利要求书和说明书.
“HBP”表示毛发结合肽。
“SBP”表示皮肤结合肽.
“NBP”表示指甲结合肽.
“OBP”表示口腔表面结合肽。
“TBP”表示牙齿结合肽.
“HCA”表示毛发调理剂。
“SCA”表示皮肤调理剂。
“C”表示毛发、皮肤或指甲着色剂.
“OBA”表示口腔有益试剂.
“S”表示间隔基。
“BSBP”表示体表结合肽.
“BA”表示有益试剂.
术语“肽”指通过肽键或修饰的肽键彼此连接在一起的两个或多个氨基酸。
术语“体表”表示可以用作结合携带有益试剂的肽的底物的任何人体表面。典型的体表包括但不限于毛发、皮肤、指甲、牙齿、牙龈和角膜组织.
术语“有益试剂”是应用于可以偶联用于体表的结合肽的化合物或物质的通用术语。有益试剂典型地包括调理剂，着色剂，芳香剂，增白剂等，以及在个人护理产业中常用的其它物质.
如本文所使用的，术语“毛发”指人毛发、眉毛和睫毛.
如本文所使用的，术语“皮肤”指人皮肤或猪皮肤、用作人皮肤替代品的Vitro-
Figure G2009101649831D00161
和EpiDermTM.在此用作体表的皮肤通常包含上皮细胞层，另外可以包含内皮细胞层。
如本文所使用的，术语“指甲”指人手指甲和脚趾甲.
如本文所使用的，术语″偶联″和″偶联的″指任意的化学缔合，包括共价的和非共价的相互作用.
如应用于本发明毛发结合肽、皮肤结合肽和指甲结合肽的选择时所使用的，术语“严格性”指用于从毛发、皮肤或指甲上洗脱肽的洗脱试剂(通常为去污剂)的浓度.更高的洗脱试剂浓度会提供更严格的条件。
术语“肽-体表样品复合物”表示一种结构，其包含通过肽上的结合位点与体表样品结合的肽.
术语“肽-毛发复合物”表示一种结构，其包含通过肽上的结合位点与毛发纤维结合的肽.
术语“肽-皮肤复合物”表示一种结构，其包含通过肽上的结合位点与皮肤结合的肽.
术语“肽-指甲复合物”表示一种结构，其包含通过肽上的结合位点与手指甲或脚趾甲结合的肽.
术语“肽-底物复合物”指肽-毛发、肽-皮肤或肽-指甲复合物.
术语“MB50”指，如实施例9所述，当产生基于ELISA的结合测定中得到的最大信号的50％的信号时的结合肽的浓度.MB50指示复合物各组分的结合相互作用强度或亲和力.MB50值越低，肽与它的相应底物的相互作用越强.
术语“结合亲和力”指结合肽与它各自的底物的相互作用强度.在本申请中，结合亲和力用基于ELISA的结合测定中所测得的MB50值来表示。
在本文中将术语″纳米颗粒″定义为具有1至100nm的平均粒径的颗粒。优选地，颗粒的平均粒径是约1至40nm.
如本文所使用的，″粒度″和″粒径″具有相同的含义.纳米颗粒包括但不限于，金属、半导体、聚合物或二氧化硅颗粒.
术语“氨基酸”指蛋白或多肽的基本化学结构单元。在本文中使用如下的缩写来代表特定的氨基酸：
氨基酸    三字母缩写    单字母缩写
丙氨酸    Ala            A
精氨酸    Arg            R
天冬酰胺  Asn            N
天冬氨酸  Asp            D
半胱氨酸  Cys            C
谷氨酰胺  Gln            Q
谷氨酸    Glu            E
甘氨酸    Gly            G
组氨酸    His            H
异亮氨酸  Ile            I
亮氨酸    Leu    L
赖氨酸    Lys    K
甲硫氨酸  Met    M
苯丙氨酸  Phe    F
脯氨酸    Pro    P
丝氨酸    Ser    S
苏氨酸    Thr    T
色氨酸    Trp    W
酪氨酸    Tyr    Y
缬氨酸    Val    V
“基因”指表达特定蛋白的核酸片段，包括编码序列之前的调控序列(5’非编码序列)和之后的序列(3’非编码序列)，“天然基因”指在天然状态下发现的带有自有调控序列的基因。“嵌合基因”指非天然基因的任意基因，其包含在天然状态下不会同时发现的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可能包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者包含源自相同来源、但排列方式不同于天然状态的调控序列和编码序列。“外源基因”指在宿主生物体中通常不存在、而是通过基因转移引入到宿主生物体的基因.外源基因可以包含插入非天然生物体中的天然基因，或嵌合基因.
使用本领域中技术人员已知的方法，可以将化学合成的寡核苷酸结构单元装配成“合成的基因”。连接这些结构单元并退火，形成基因片段，然后再酶促地装配它们，构建完整的基因.当涉及DNA序列时，“化学合成的”表示在体外装配组分核苷酸。DNA的人工化学合成，可以使用充分确立的技术来完成，或自动化学合成可以使用许多市售仪器之一来进行。因此，可以根据反映宿主细胞密码子偏倚的核苷酸序列最优化，对基因进行裁剪，进行最佳的基因表达。如果密码子选择偏向宿主偏爱的那些密码子，本领域技术人员能够意识到成功的基因表达的可能性。基于对源自可得到序列信息的宿主细胞的基因的分析，可以确定出优选的密码子。
“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列.“适当的调控序列”指位于编码序列上游(5’非编码序列)、其中或下游(3’非编码序列)的核苷酸序列，其会影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调控序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应物结合位点和茎环结构.
“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的DNA序列。一般来说，编码序列位于启动子序列的3’.启动子可以整体地源自天然基因，或包含源自不同天然启动子的不同元件，或者甚至包含合成的DNA片段.本领域技术人员应当理解，不同的启动子可以指导基因表达，后者发生在不同组织或细胞类型中，或在不同的发育阶段，或对不同环境或生理条件作出的反应.导致基因在大多数细胞类型中在大多数时间下表达的启动子，一般称为“组成型启动子”.进一步认识到，因为在大多数情况下不能完全确定调控序列的确切界限，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性.
如本文所使用的，术语“表达”指源自本发明的核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定累积.表达还可以指mRNA翻译为多肽。
术语“转化”指将核酸片段转移到宿主生物体的基因组中，导致遗传上稳定的遗传特性.包含转化的核酸片段的宿主生物体也称作“转基因的”或“重组的”或“转化的”生物体.
术语“宿主细胞”指已经或能被外源多核苷酸序列转化或转染的细胞。
术语“质粒”、“载体”和“盒”指经常携带基因的染色体外元件，所述基因不是细胞中心代谢的一部分，并且通常是环状双链DNA分子形式.这样的元件可以是任意来源的单链或双链DNA或RNA的线状或环状自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列已经结合或组合在独特的结构中，该结构能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列连同适当的3’非翻译序列引入细胞中。“转化盒”指一种特殊的载体，其包含外源基因，除外源基因外还具有促进特定宿主细胞的转化的元件。“表达盒”指一种特殊的载体，其包含外源基因，除外源基因外还具有增强该基因在外源宿主中的表达的元件.
术语“噬菌体(phage或bacteriophage)”指能感染细菌的病毒.变化形式的噬菌体也能用于本发明目的.优选的噬菌体源自叫做M13的“野生”噬菌体.M13系统可以在细菌内生长，因此不会破坏它所感染的细胞，只是使它不断地制造新的噬菌体.它是单链DNA噬菌体.
术语“噬菌体展示”指在噬菌体或噬菌粒颗粒表面上所进行的功能性外源肽或小蛋白的展示.可以使用基因工程化的噬菌体，将肽展示为它们的天然表面蛋白的片段.具有不同基因序列的噬菌体群可以产生肽文库。
“PCR”或“聚合酶链式反应”是用于扩增特定DNA片段的技术(美国专利号4,683,195和4,800,159).
本文所使用的标准重组DNA和分子克隆技术，是本领域众所周知的技术，且记载在：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文称作”Maniatis”)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory ColdPress Spring Harbor，NY(1984)；和Ausubel，F.M.等，Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing Assoc，和Wiley-Interscience出版(1987).
本发明包含特异性的毛发结合肽、皮肤结合肽和指甲结合肽，以及它们在毛发、皮肤和指甲的调理剂和着色剂中的应用.
体表
本发明的体表是将用作结合肽的底物的任意人体表面.典型的体表包括但不限于毛发、皮肤、指甲、牙齿、牙龈、角膜组织和口腔组织.在许多情况下，本发明的体表会暴露于空气，但是在有些情况下，(例如口腔)表面是内部的.因此，体表可以包括上皮和内皮细胞层.
体表的样品可从许多来源得到.例如，人毛发样品是市售的，例如从International Hair Importers and Products(Bellerose，NY)购得，有不同的颜色，如棕色、黑色、红色和金色，有各种类型，如非裔美籍人的、高加索人的和亚洲人的.另外，毛发样品可以进行处理，例如使用过氧化氢进行处理，得到漂白后的毛发.猪皮可以从屠宰店和超市买到，可从IMS Inc.(Milford，CT)得到的Vitro-
Figure G2009101649831D00201
可从MatTek Corp.(Ashland，MA)得到的EpiDermTM，均是人皮肤的良好的替代品.人手指甲和脚趾甲可从志愿者得到.拔出的人牙和假牙可从牙科诊所得到。另外，可以多种形成从例如Berkeley AdvancedBiomaterials，Inc.(San Leandro，CA)得到的羟基磷灰石可以用作人牙齿的模型。
体表结合肽
如本文所定义的体表结合肽是以高亲和力特异性地结合特定体表的肽序列，所述体表包括但不限于，例如，毛发、皮肤、指甲、牙齿、舌头、面颊、嘴唇、牙龈、角膜组织和口腔组织.本发明的体表结合肽是约7个氨基酸至约45个氨基酸，更优选地，约7个氨基酸至约20个氨基酸.本发明的结合肽对它们各自的底物具有以MB50值计小于或等于约10-2M、小于或等于约10-3M、小于或等于约10-4M、小于或等于约10-5M、优选地小于或等于约10-6M且更优选地小于或等于约10-7M的结合亲和力。
使用本领域众所周知的方法，可以选择合适的体表结合肽序列.随机地产生本发明的肽，然后基于它们对目标表面的结合亲和力，针对特定体表进行选择，所述体表例如毛发、皮肤、指甲或口腔表面样品。随机的肽文库的产生是众所周知的，且可以通过许多技术来实现，包括，细菌展示(Kemp，D.J.；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(7)：4520-4524(1981)，和Helfman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1)：31-35，(1983))，酵母展示(Chien等，Proc Natl Acad Sci USA 88(21)：9578-82(1991))，组合固相肽合成(美国专利号5,449,754，美国专利号5,480,971，美国专利号5,585,275,美国专利号5,639,603)，和噬菌体展示技术(美国专利号5,223,409，美国专利号5,403,484，美国专利号5,571,698，美国专利号5,837,500).产生这样的生物肽文库的技术，记载在Dani，M.，J.ofReceptor&Signal Transduction Res.，21(4)：447-468(2001).
随机产生肽的一个优选的方法是利用噬菌体展示.噬菌体展示是一种体外选择技术，其中将肽或蛋白遗传地融合到噬菌体外壳蛋白上，从而在噬菌体病毒体的外部形成融合肽展示，而编码融合体的DNA停留在病毒体内。展示肽和其编码DNA之间的这种物理连接，允许通过称作“生物淘选(biopanning)”的简单体外选择过程，筛选大量肽变体，每个变体均与相应的DNA序列连接.生物淘选中最简单的形式是，将噬菌体-展示的变体库与已经固定化在平板或珠子上的目标靶物一起温育，洗去未结合的噬菌体，并通过破坏噬菌体与靶物之间的结合相互作用，洗脱特异性地结合的噬菌体。然后，体内扩增洗脱的噬菌体，重复该过程，得到逐步浓缩的有利于最紧密结合序列的噬菌体库.经过3轮或更多轮的选择/扩增，通过DNA测序对单个克隆进行表征.
在已经生产出合适的肽文库后，然后使它们与适量的试验底物(更具体地，体表样品)相接触.将肽文库溶解在合适的溶液中，以接触试验底物。体表样品可以悬浮在溶液中，或可以固定在平板或珠子上.优选的溶液是包含表面活性剂的盐水缓冲液.合适的溶液是含有0.5％
Figure G2009101649831D00221
20的Tris缓冲盐水(TBS).可以通过任意方式进一步搅拌该溶液，以便提高肽向体表样品的传质速率，从而缩短达到最大结合所需要的时间。
接触后，许多随机产生的肽会立即结合到体表样品上，形成肽-体表复合物，例如肽-毛发、肽-皮肤、肽-指甲或肽-口腔表面复合物.可以通过洗涤去除未结合的肽。在将所有未结合的材料去掉后，可以通过在具有不同严格性的缓冲液中的选择性洗涤，将对试验表面具有不同程度结合亲和力的肽分级分离.提高使用的缓冲液的严格性，会提高肽-体表复合物中肽和体表之间的结合所需的强度.
可以使用许多物质来改变肽选择中的缓冲溶液的严格性，包括但不限于，酸性pH(1.5-3.0)；碱性pH(10-12.5)；高盐浓度，如MgCl2(3-5M)和LiCl(5-10M)；水；乙二醇(25-50％)；二噁烷(5-20％)；硫氰酸盐(1-5M)；胍(2-5M)；脲(2-8M)；和各种浓度的不同表面活性剂，如SDS(十二烷基硫酸钠)、DOC(脱氧胆酸钠)、Nonidet P-40、Triton X-100、
Figure G2009101649831D00222
20，其中优选
Figure G2009101649831D00223
20。可以在缓冲溶液中制备这些物质，所述缓冲溶液包括但不限于Tris-HCl、Tris-缓冲盐水、Tris-硼酸盐、Tris-乙酸、三乙胺、磷酸盐缓冲液、和甘氨酸-HCl，其中优选Tris-缓冲盐水溶液.
应当认识到，通过使用严格性不断提高的缓冲液重复选择过程，可以洗脱对体表底物具有高结合亲和力的肽.洗脱的肽用本领域已知的任意方法进行鉴别和测序.
因此，使用下面的生产本发明的体表结合肽的方法，所述体表结合肽例如毛发结合肽、皮肤结合肽、指甲结合肽或口腔表面结合肽.将组合产生的噬菌体肽文库与目标体表相接触，形成噬菌体肽-体表复合物.从未形成复合物的肽和未结合的底物分离噬菌体-肽-体表复合物，并从复合物洗脱来自噬菌体-肽-体表复合物的结合的噬菌体-肽，优选通过酸处理。然后，对洗脱的肽进行鉴别和测序.为了鉴别出与一种底物结合而不与另一种底物结合的肽序列，例如与毛发结合但不与皮肤结合的肽，或与皮肤结合但不与毛发结合的肽，在该方法中加入了扣除淘选步骤.更具体地，首选使组合产生的噬菌体-肽的文库与非-靶物相接触，去掉结合它的噬菌体-肽.然后，使未结合的噬菌体-肽与所需底物相接触，继续上述过程.或者，可以使组合产生的噬菌体-肽文库同时与非-靶物和所需底物相接触.然后，从噬菌体-肽-非-靶物复合物分离噬菌体-肽-体表复合物，对所需噬菌体-肽-体表复合物实施上述方法.
本发明的一个实施方案提供了修改的噬菌体展示筛选方法，用于分离对体表具有较高亲和力的肽。在该修改的方法中，首先如上所述形成噬菌体-肽-体表复合物.然后，用洗脱缓冲液处理这些复合物.可以使用任意的上述洗脱缓冲液.优选地，洗脱缓冲液是酸性溶液.然后，将剩下的抗-洗脱的噬菌体-肽-体表复合物直接用于感染细菌宿主细胞，如大肠杆菌ER2738.在合适的生长培养基(例如LB(Luria-Bertani)培养基)中培养感染的宿主细胞，然后将培养物涂布到琼脂上，琼脂包含合适的生长培养基，例如含有IPTG(异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷)和S-GalTM的LB培养基.生长后，挑取噬菌斑用于DNA分离和测序，以鉴别出对目标体表具有高结合亲和力的肽序列.
在另一个实施方案中，可以使用PCR技术来鉴别由上述修改的噬菌体展示筛选方法得到的抗-洗脱的噬菌体-肽，该技术使用合适的引物将上述噬菌体-肽-体表复合物直接进行PCR，如Janssen等在本申请中引作参考的美国专利申请公开号2003/0152976中所述.
使用上述方法，已经鉴别出了毛发结合肽、皮肤结合肽和指甲结合肽.更具体地，所分离的对普通棕色毛发具有高亲和力的结合肽是SEQ ID NO：3-18、28-38、40-56和64；对普通棕色毛发具有高亲和力并抗洗发水的结合肽是SEQ ID NO：66、69和70；对漂白的毛发具有高亲和力的结合肽是SEQ ID NO：7、8、19-27、38-40、43、44、47、57、58和59；对手指甲具有高亲和力的结合肽的是SEQ ID NO：53和60；对皮肤具有高亲和力的结合肽是SEQ ID NO：61.另外，发现手指甲结合肽能够与漂白的毛发结合，因此可以用于本发明的基于肽的毛发调理剂和毛发着色剂中。漂白的毛发结合肽能够与手指甲结合，且可以应用于本发明的基于肽的指甲着色剂中。
结合肽的生产
可以使用本领域公知的标准的肽合成方法来制备本发明的结合肽(参见例如Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis，Pierce ChemicalCo.，Rockford，IL，1984；Bodanszky，Priniciples of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，New York，1984；和Pennington等，Peptide SynthesisProtocols，Humana Press，Totowa，NJ，1994).另外，许多公司能够提供定做肽合成服务。
或者，可以使用重组DNA和分子克隆技术来制备本发明的肽。可以在异源宿主细胞(尤其是微生物宿主细胞)中生成编码毛发结合肽、皮肤结合肽或指甲结合肽的基因。用于表达本发明结合肽的优选异源宿主细胞是微生物宿主，其广泛地存在于真菌或细菌家族中，并能够在宽温度、pH值和溶剂耐受性范围内生长。因为转录、翻译和蛋白质生物合成装置均同样地与细胞原料供给无关，因此功能性基因的表达与用于生成细胞生物量的碳原料供给无关.宿主菌株的实例包括但不限于，真菌或酵母物种，如曲霉属(Aspergillus)、木霉菌属(Trichoderma)、糖酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)，或细菌物种，如沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基细菌属(Methylobacter)、产碱菌属(Alcaligenes)、集胞蓝细菌属(Synechocystis)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、硫杆菌属(Thiobacillus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、和克雷伯氏菌属(Klebsiella)。
可以使用多种表达系统来生产本发明的肽.这样的载体包括但不限于，染色体型载体、附加型载体和病毒衍生型载体，如源自细菌质粒、噬菌体、转座子、插入元件、酵母附加体和病毒(如杆状病毒、逆转录病毒)的载体，以及上述载体组合后得到的载体，如源自质粒和细菌噬菌体遗传元件的载体，如粘粒和噬菌粒.表达系统构建体可以包含调控区，其调节和引起表达。通常，在这点上来说，任何适合在宿主细胞中维持、繁殖或表达多核苷酸或多肽的系统或载体都可以用于表达。微生物表达系统和表达载体包含调控序列，该调控序列能够指导外源蛋白相对于宿主细胞的生长进行高水平的表达.
调控序列对于本领域技术人员来说是公知的，实例包括但不限于，在对化学或物理刺激的反应中造成基因开启或关闭的调控序列，包括存在于载体中的调控元件，如增强子序列.可以使用它们中的任一种来构建嵌合基因，用于生产本发明的任意结合肽.然后，将这些嵌合基因通过转化引入到合适的微生物中，提供肽的高水平表达。
用于转化适当宿主细胞的载体或盒是本领域公知的.典型地，载体或盒包含指导相关基因的转录和翻译的序列、一个或多个选择标记、和允许自主复制或染色体整合的序列。适合的载体包含携带转录起始控制区的基因的5’区域，和控制转录终止的DNA片段的3’区域。尽管本领域技术人员均清楚，这样的控制区没有必要源自选为生产宿主的特定物种的天然基因，但是最优选地，两个控制区都源自与转化的宿主细胞同源的基因.选择标记基因会为转化的宿主细胞的选择提供表型性状，如大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性.
能够用于驱动嵌合基因在目标宿主细胞中的表达的起始控制区或启动子有多种，并为本领域技术人员所熟知.实际上任意能够驱动基因的启动子都适合用于生产本发明的结合肽，包括，但不限于：CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在糖酵母属中的表达)；AOX1(用于在毕赤氏酵母属中的表达)；和lac、ara、tet、trp、IPL、IPR、T7、tac和trc(用于在大肠杆菌中的表达)；以及用于在芽孢杆菌属中表达的amy、apr、npr启动子和各种噬菌体启动子。
终止控制区也可以来自优选宿主的各种天然基因。任选地，没有必要必须包含终止位点，但是最优选地包含终止位点.
可以使用包含上述合适的DNA序列以及合适的启动子或控制序列的载体，来转化合适的宿主，以使宿主表达本发明的肽.也可以使用源自本发明DNA构建体的RNA，使用无细胞翻译系统来生产这样的肽.任选地，可能需要以转化的宿主的分泌产物的形式来生产本发明的基因产物.将所需的蛋白分泌到培养基中，有利于简化纯化过程并降低成本.本领域熟知，分泌信号序列常被用于促进可表达的蛋白穿过细胞膜的主动运输.通过整合编码在生产宿主中起作用的分泌信号的DNA序列，可以建立能分泌的转化的宿主.选择合适的信号序列的方法在本领域中是已知的(参见例如EP 546049和WO 9324631)。分泌信号DNA或促进子(facilitator)可以位于表达-控制DNA和本发明基因或基因片段之间，并且与后者处于相同的阅读框中.
基于肽的毛发调理剂
将毛发结合肽(HBP)与毛发调理剂(HCA)相偶联，形成本发明基于肽的毛发调理剂。调理剂的毛发结合肽部分能够很强地与毛发结合，从而使调理剂结合在毛发上，维持持久的调节效果。毛发结合肽包括但不限于，通过上述筛选方法选择出的毛发结合肽，包括SEQ IDNO：3-59、64、66、69和70所示的本发明的毛发结合肽序列，最优选SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：66所示的肽，它们强烈地结合毛发，但不结合皮肤。另外，可以使用任意已知的毛发结合肽，包括但不限于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：76-98，它们分别描述在本申请中引作参考的下列文献中：Janssen等，美国专利申请公开号2003/0152976和Janssen等，WO04048399。对于漂白的毛发，也可以使用SEQ ID NO：60所示的手指甲结合肽。
在本文中定义的毛发调理剂指能够改善毛发外观、质地和光泽度，以及增加毛发体或柔度的试剂。毛发调理剂，包括但不限于，发型辅助剂，毛发拉直辅助剂，毛发强化辅助剂，和膨胀(voluminizing)试剂，例如纳米颗粒.在本发明的基于肽的毛发调理剂中，可以使用任何已知的毛发调理剂.毛发调理剂在本领域是公知的，参见例如本申请引作参考的文献Green等(WO 0107009)，其可以通过各种途径购买到.合适的毛发调理剂的例子包括，但不限于：阳离子聚合物，如阳离子化的瓜耳胶、二烯丙基季铵盐/丙烯酰胺共聚物、季铵化的聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物、和各种聚季铵化合物；阳离子表面活性剂，如硬脂基二甲基苄基氯化铵(steralkonium chloride)、centrimonium chloride、和Sapamin hydrochloride；脂肪族醇，如二十二醇；脂肪族胺，如硬脂族胺；蜡；酯；非离子聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、和聚乙二醇；硅酮；硅氧烷，如十甲基环戊硅氧烷；聚合物乳剂，如氨基封端二甲基硅酮(amodimethicone)；和纳米颗粒，如二氧化硅纳米颗粒和聚合物纳米颗粒.本发明优选的毛发调理剂包含胺或羟基功能基团，以促进与毛发结合肽的偶联，如在下面所述。优选的调理剂的实例是辛胺(CAS No.111-86-4)、硬脂胺(CAS No.124-30-1)、二十二醇(CAS No.661-19-8，Cognis Corp.，Cincinnati，OH)、乙烯基封端的硅氧烷、乙烯基封端的硅酮(CAS No.68083-19-2)、乙烯基封端的甲基乙烯基硅氧烷、乙烯基封端的甲基乙烯基硅酮(CAS No.68951-99-5)、羟基封端的硅氧烷、羟基封端的硅酮(CAS No.80801-30-5)、氨基修饰的硅酮衍生物、[(氨乙基)氨基]丙基羟基二甲基硅氧烷、[(氨乙基)氨基]丙基羟基二甲基硅酮、α-十三烷基-ω-羟基-聚(氧基-1，2-乙烷二基)(CAS No.24938-91-8)。
通过使特异性的毛发结合肽直接地或通过任选的间隔基偶联到毛发调理剂上，可以制备本发明基于肽的毛发调理剂.偶联相互作用可以是共价键或非共价相互作用，例如氢键，静电相互作用，疏水相互作用，或范德华相互作用。在非共价相互作用的情况下，可以通过混合肽和调理剂以及任选的间隔基(如果使用)，并允许足以发生相互作用的时间，制备基于肽的毛发调理剂.使用本领域已知的方法，例如，凝胶渗透色谱，可以从得到的基于肽的毛发调理剂分离未结合的物质.
也可以通过使特异性的毛发结合肽直接地或通过间隔基共价地结合到毛发调理剂上，制备本发明的基于肽的毛发调理剂.可以使用任意已知的肽或蛋白缀合化学，制备本发明的基于肽的毛发调理剂.缀合化学在本领域是已知的(参见例如Hermanson，BioconjugateTechniques，Academic Press，New York(1996)).合适的偶联剂包括但不限于，碳二亚胺偶联剂、二价(dicuid)氯化物、二异氰酸酯和其它双功能偶联剂，其中双功能偶联剂既能与肽的末端胺和/或羧酸末端基团反应，又能与毛发调理剂的胺、羧酸或醇基团反应.优选的偶联剂是碳二亚胺偶联剂，如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N，N，-二环己基-碳二亚胺(DCC)，其可用于活化与醇偶联的羧酸基团，和胺基团.另外，可能需要保护对肽上的反应性胺或羧酸基团，以产生基于肽的毛发调理剂的预期结构.本领域公知氨基酸的保护基团、如叔丁氧羰基(t-Boc)的应用(参见例如上述Stewart等的文献；上述Bodanszky的文献；和上述Pennington等的文献).在某些情况下，可能需要在毛发调理剂上引入反应基团，如羧酸、醇、胺或醛基，以偶联毛发结合肽.可以使用本领域公知的常规化学方法，如氧化、还原等，完成这些修饰.
也可能希望使毛发结合肽通过间隔基与毛发调理剂相偶联.间隔基将肽和调理剂分隔开，以确保调理剂不干扰肽对毛发的结合.间隔基可以是任意类型的分子，如烷基链、苯基化合物、乙二醇、酰胺、酯等.优选的间隔基是亲水性的，链长从1至约100个原子，更优选地，链长从2至约30个原子.优选的间隔基的实例包括但不限于，乙醇胺、乙二醇、链长为6个碳原子的聚乙烯、具有3-6个重复单元的聚乙二醇、苯氧乙醇、丙醇酰胺、丁二醇、丁二醇酰胺、丙基苯基链、和乙基烷基链、丙基烷基链、己基烷基链、甾醇基(steryl)烷基链、十六烷基烷基链和棕榈酰基烷基链.可以使用任意上述的偶联化学，使间隔基共价结合到肽和毛发调理剂上.为了促进间隔基的整合，可以使用双功能交联剂，其包含间隔基和处于两末端的反应基团，以偶联肽和调理剂。合适的双功能交联剂在本领域中是公知的，包括但不限于：二胺，如1，6-二氨基己烷；二醛，如戊二醛；双N-羟基琥珀酰亚胺酯，如乙二醇-双(琥珀酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)、双琥珀酰亚胺基戊二酸酯、双琥珀酰亚胺基辛二酸酯、和乙二醇-双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)；二异氰酸酯，如1，6-己二异氰酸酯；双环氧乙烷，如1，4亚丁基二环氧甘油醚；二羧酸，如琥珀酰双水杨酸酯等.也可以使用异双功能交联剂，其在每个末端含有一个不同的反应基团.异双功能交联剂的实例包括但不限于，具有如下结构的化合物：
Figure G2009101649831D00281
其中：R1是H或是取代基，如-SO3Na、-NO2、或-Br；R2是间隔基，如-CH2CH2(乙基)、-(CH2)3(丙基)或-(CH2)3C6H5(丙基苯基)。这样的异双功能交联剂的实例是3-马来酰亚胺基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。这些试剂的N-羟基琥珀酰亚胺酯基团与调理剂上的胺或醇基反应，而马来酰亚胺基团与肽上的巯基反应.通过在结合肽序列的至少一个末端(即，C-末端或N-末端)添加半胱氨酸基团，可以将巯基掺入肽中。可以在结合肽序列和末端半胱氨酸之间掺入几种间隔氨基酸残基，如甘氨酸，以将反应性巯基与结合序列分隔开.
另外，间隔基可以是由任意种类的氨基酸及其混合物组成的肽.优选的肽间隔基由甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸及其混合物组成.另外，肽间隔基可以包含特异性酶剪切位点，如蛋白酶半胱天冬酶3位点(SEQID NO：65所示)，其用于酶促地从毛发上去除调理剂。肽间隔基可以是从1至约50个氨基酸，优选从1至约20个氨基酸.可以通过本领域已知的任何方法，将这些肽间隔基连接到结合肽序列上.例如，可以使用前面所述的标准的肽合成技术，制备完整的结合肽-肽间隔基二嵌段物。另外，还可以使用碳二亚胺偶联剂(参见例如Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，New York(1996))、二价氯化物、二异氰酸酯和能与肽上的末端胺和/或羧酸末端反应的其它双功能偶联剂，连接结合肽序列和肽间隔基.或者，可以使用前面所描述的重组DNA和分子克隆技术，制备完整的结合肽-肽间隔基二嵌段物。间隔基也可以是肽间隔基和有机间隔基分子的组合，其可以通过上述方法制备。
还可能需要偶联到毛发调理剂上的多个毛发结合肽，以增强基于肽的毛发调理剂和毛发之间的相互作用。可以使用相同毛发结合肽的多个拷贝，或不同毛发结合肽的组合.在大调理颗粒(如颗粒乳剂)的情况下，可以在调理剂上偶联大量的毛发结合肽，即至多约1,000个。可以将小量毛发结合肽偶联到较小的调理剂分子上，即至多约50个。因此，在本发明的一个实施方案中，基于肽的毛发调理剂是二嵌段组合物，其由毛发结合肽(HBP)和毛发调理剂(HCA)组成，通式为(HBP)n-HCA，其中n的范围为1至约1,000，优选从1至约约50.在另一个实施方案中，基于肽的毛发调理剂包含上述将毛发结合肽与毛发调理剂分隔开的间隔基(S).可以将毛发结合肽的多个拷贝偶联到一个间隔基分子上。在该实施方案中，基于肽的毛发调理剂是三嵌段组合物，其由毛发结合肽、间隔基和毛发调理剂组成，其具有通式结构[(HBP)m-S]n-HCA，其中n的范围为1至约1,000，优选地n从1至约50，且m从1至约50，优选地m从1至约10。
应当理解，如本文所使用的，HBP是通用命名，不是指单个的毛发结合肽序列。当上面使用的n或m大于1时，也在本发明的范围内，以提供一系列不同序列的毛发结合肽可以形成组合物的一部分的情形.另外，应当理解，这些结构不一定代表着肽、毛发调理剂和任选的间隔基之间的共价键.如上所述，肽、毛发调理剂和任选的间隔基之间的偶联相互作用可以是共价的或非共价的.
可以将本发明的基于肽的毛发调理剂用于毛发护理的组合物中。还应当认识到，毛发结合肽本身也能作为调理剂来处理毛发。在本文中将毛发护理组合物定义为用于处理毛发的组合物，包括但不限于：洗发水、调理剂、洗剂、气雾剂、凝胶、摩丝和毛发染料，其在化妆上可接受的介质中包含有效量的基于肽的毛发调理剂或由不同的基于肽的毛发调理剂组成的混合物。在本文中将用于毛发护理组合物的基于肽的毛发调理剂或毛发结合肽的有效量定义为：相对于组合物的总重量，按重量计约0.01％至约10％、优选约0.01％至约5％的比例.毛发护理组合物的化妆上可接受的介质的成分记载在，Philippe等，美国专利号6,280,747和Omura等，美国专利号6,139,851和Cannell等，美国专利号6,013,250，上述文献在本申请中引作参考.例如，这些毛发护理组合物可以是水溶液、醇溶液或水-醇溶液，对于水-醇溶液，优选的醇是乙醇或异丙醇，比例是总重量的约1至约75％。另外，毛发护理组合物可以包含一种或多种常规的化妆品或皮肤病学添加剂或佐剂，包括但不限于：抗氧化剂、防腐剂、填料、表面活性剂、UVA和/或UVB防晒剂、芳香剂、增稠剂、湿润剂和阴离子的、非离子的或两性的聚合物、和染料或色素。
基于肽的皮肤调理剂
通过将皮肤结合肽(SBP)与皮肤调理剂(SCA)相偶联，形成本发明的基于肽的皮肤调理剂.调理剂的皮肤结合肽部分能够有力地结合到皮肤上，从而使调理剂在皮肤上保持结合，产生持久的调节效果。皮肤结合肽包括但不限于，通过上述筛选方法选择的皮肤结合肽，包括SEQ ID NO：61所示的本发明的皮肤结合肽序列.另外，可以使用任意已知的皮肤结合肽，包括但不限于SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：99-104，其分别描述在：Janssen等，美国专利申请公开号2003/0152976和Janssen等，WO 04048399.如本文所定义的皮肤调理剂包括，但不限于：能够使皮肤变紧的收敛剂；能够去除皮肤死细胞的剥落剂(exfoliant)；能够保持光滑、柔软、柔韧表现的润肤剂；能够增加皮肤表层含水量的吸湿剂；能够减慢水分从皮肤表面蒸发的封闭剂(occlusive)；和能够增强干燥或损伤皮肤外观或减少脱皮和恢复柔度的混和化合物.在本发明的基于肽的皮肤调理剂中，可以使用任何已知的皮肤调理剂.皮肤调理剂在本领域中是已知分，参见例如Green等(WO 0107009)，并且可以通过各种途径购买到。合适的皮肤调理剂的实例包括，但不限于：α-羟基酸、β-羟基酸、多元醇、透明质酸、D，L-泛醇、聚水杨酸酯、维生素A棕榈酸酯、维生素E乙酸酯、甘油、山梨糖醇、硅酮、硅酮衍生物、羊毛脂、天然油和甘油三酯.本发明优选的皮肤调理剂是聚水杨酸酯、丙二醇(CAS No.57-55-6，Dow Chemical，Midland，MI)、甘油(CAS No.56-81-5，Proctor&Gamble Co.，Cincinnati，OH)、羟基乙酸(glycolic acid)(CASNo.79-14-1，DuPont Co.，Wilmington，DE)、乳酸(CAS No.50-21-5，Alfa Aesar，Ward Hill，MA)、苹果酸(CAS No.617-48-1，Alfa Aesar)、柠檬酸(CAS No.77-92-9，Alfa Aesar)、酒石酸(CAS No.133-37-9，Alfa Aesar)、葡糖二酸(CAS No.87-73-0)、半乳糖二酸(CASNo.526-99-8)、3-羟基戊酸(CAS No.10237-77-1)、水杨酸(CASNo.69-72-7，Alfa Aesar)和1，3丙二醇(CAS No.504-63-2，DuPont Co.，Wilmington，DE)。根据在本申请中引作参考的White等在美国专利号4,855,483所描述的方法，可以制备聚水杨酸酯.使用Merbouh等描述的方法，可以合成葡糖二酸(Carbohydr.Res.336：75-78(2001).可以按照Bramucci在WO 02012530中所描述的方法，制备3-羟基戊酸.
如下制备本发明的基于肽的皮肤调理剂：将特异性的皮肤结合肽直接地或通过间隔基偶联到皮肤调理剂上.可以使用任意已知的上述偶联方法。如上面所述，可能需要在皮肤调理剂上引入反应基团，如羧酸、醇、胺或醛基，以偶联毛发结合肽.还可能希望将多个皮肤结合肽偶联到皮肤调理剂上，以增强基于肽的皮肤调理剂与皮肤之间的相互作用.可以使用相同皮肤结合肽的多个拷贝，或不同皮肤结合肽的组合.在大调理颗粒的情况下，可以在调理剂上偶联大量的皮肤结合肽，即最多约1,000个.可以将小量的皮肤结合肽偶联到较小的调理剂分子上，即最多约50个。因此，在本发明的一个实施方案中，基于肽的皮肤调理剂是二嵌段组合物，其由皮肤结合肽(SBP)和皮肤调理剂(SCA)组成，其具有通式结构(SBP)n-SCA，其中n的范围为1至约1,000，优选从1至约50。
在另一个实施方案中，基于肽的皮肤调理剂包含上述将皮肤结合肽与皮肤调理剂分隔开的间隔基(S).可以将皮肤结合肽的多个拷贝偶联到一个间隔基分子上。在该实施方案中，基于肽的皮肤调理剂是三嵌段组合物，其由皮肤结合肽、间隔基和皮肤调理剂组成，其具有通式结构[(SBP)m-S]n-SCA，其中n的范围为1至约1,000，优选n从1至约50，m从1至约50，优选m从1至约10.
应当理解，如本文所使用的，HBP是通用命名，不是指单个的皮肤结合肽序列。当上面使用的n或m大于1时，也在本发明的范围内，以提供一系列不同序列的皮肤结合肽可以形成组合物的一部分的情形。另外，应当理解，这些结构不一定代表着肽、皮肤调理剂和任选的间隔基之间的共价键。如上所述，肽、皮肤调理剂和任选的间隔基之间的偶联相互作用可以是共价的或非共价的.
可以将本发明的基于肽的皮肤调理剂用于皮肤护理组合物中.还应当认识到，皮肤结合肽本身也能作为皮肤的调理剂来使用.在本文中将皮肤护理组合物定义为，在化妆上可接受的介质中包含有效量的基于肽的皮肤调理剂或由不同的基于肽的皮肤调理剂组成的混合物的组合物。这些组合物的用途包括，但不限于：皮肤护理、皮肤清洁、化妆和抗皱纹产品.在本文中将用于皮肤护理组合物的基于肽的皮肤调理剂或皮肤结合肽的有效量定义为：相对于组合物的总重量，按重量计为约0.001％至约10％、优选为约0.01％至约5％的比例.该比例可以随皮肤护理组合物的类型而变.化妆上可接受介质的合适的组合物在上述Philippe等的文献中有所描述.例如，化妆上可接受介质可以是无水的组合物，其包含按重量计占组合物总重量的比例通常约10％到90％的脂肪物质，其中脂相包含至少一种液体、固体或半固体脂肪物质.脂肪物质包括，但不限于：油、蜡、树胶和所谓的糊状脂肪物质。或者，组合物可以是稳定的分散系的形式，如油包水或水包油乳剂。另外组合物可以包含一种或多种常规的化妆品或皮肤病学添加剂或佐剂，包括但不限于：抗氧化剂、防腐剂、填料、表面活性剂、UVA和/或UVB防晒剂、芳香剂、增稠剂、湿润剂和阴离子、非离子或两性聚合物、和染料或色素.
基于肽的毛发着色剂
通过将毛发结合肽(HBP)与着色剂(C)相偶联，形成本发明的基于肽的毛发着色剂.基于肽的毛发着色剂的毛发结合肽部分可以与毛发有力地结合，从而能够使着色剂在毛发上保持，产生持久的毛发着色效果。毛发结合肽包括但不限于，通过上述筛选方法选择的毛发结合肽，其中包括SEQ ID NO：3-59、64、66、69和70给出的本发明的毛发结合肽序列，最优选SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：66所示的肽，它们强烈结合毛发，但对皮肤则不然.另外，可以使用任意已知的毛发结合肽，包括但不限于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：76-98，其分别描述在：Janssen等，美国专利申请公开号2003/0152976和Janssen等，WO04048399。对于漂白的毛发，也可以使用SEQ ID NO：60所示的手指甲结合肽.
在本文中定义的着色剂是，能够用于改变毛发、皮肤或指甲的颜色的任何染料和色素等.在本发明的基于肽的毛发着色剂中，可以使用任何已知的着色剂.毛发着色剂在本领域是公知的(参见上述Green等的文献，CFTA International Color Handbook，2nd ed.，Micelle Press，England(1992)和Cosmetic Handbook，US Food and DrugAdministration，FDA/IAS Booklet(1992))，并且可以通过各种途径购买到(例如Bayer，Pittsburgh，PA；Ciba-Geigy，Tarrytown，NY；ICI，Bridgewater，NJ；Sandoz，Vienna，奥地利；BASF，Mount Olive，NJ；和Hoechst，Frankfurt，德国).
合适的毛发着色剂包括，但不限于：染料，如4-羟丙基氨基-3-硝基苯酚、4-氨基-3-硝基苯酚、2-氨基-6-氯代-4-硝基苯酚、2-硝基-对苯二胺、N，N-羟乙基-2-硝基-苯二胺、4-硝基-吲哚、指甲花、HC Blue 1、HC Blue 2、HC Yellow 4、HC Red 3、HC Red 5、Disperse Violet 4、Disperse Black 9、HC Blue 7、HC Blue 12、HC Yellow 2、HC Yellow 6、HC Yellow 8、HC Yellow 12、HC Brown 2、D&C Yellow 1、D&C Yellow3、D&C Blue 1、Disperse Blue 3、Disperse violet 1、伊红衍生物如D&CRed No.21和卤化荧光素衍生物如D&C Red No.27、与D&C Red No.21和D&C Orange No.10组合的D&C Red Orange No.5；和色素，如D&CRed No.36和D&C Orange No.17、D&C Red No.7、11、31和34的钙色淀、D&C Red No.12的钡色淀、D&C Red No.13的锶色淀、FD&CYellow No.5、FD&C Yellow No.6、D&C Red No.27、D&C Red No.21和FD&C Blue No.1的铝色淀、氧化铁、锰紫(manganese violet)、氧化铬、二氧化钛、氧化锌、氧化钡、群青蓝、柠檬酸铋和炭黑颗粒.本发明优选的毛发着色剂是D&C Tekkow 1和3、HC Yellow 6和8、D&CBlue 1、HC Blue 1、HC Brown 2、HC Red 5、2-硝基对苯二胺、N，N-羟乙基-2-硝基-苯二胺、4-硝基-吲哚和炭黑。
金属和半导体纳米颗粒也可以用作毛发着色剂，因为它们具有强发光作用(Vic等，美国专利申请公开号2004/0010864).金属纳米颗粒包括，但不限于：金、银、铂、钯、铱、铑、锇、铁、铜、钴的颗粒和由上述金属组成的合金。在本文中将“合金”定义为两种或多种金属的均一混合物.“半导体纳米颗粒”包括，但不限于：硒化镉、硫化镉、硫化银、硫化镉、氧化锌、硫化锌、硒化锌、硫化铅、砷化镓、硅、氧化锡、氧化铁和磷化铟的颗粒.使用合适的有机包衣或单层，可以使纳米颗粒稳定并具备水溶性.如本文所使用的，单层-保护的纳米颗粒是一类稳定化的纳米颗粒.制备稳定化的、水溶的金属和半导体纳米颗粒的方法是本领域众所周知的，且记载在：在此引作参考的Huang等，共同未决的美国专利申请号10/622889.纳米颗粒的颜色取决于颗粒尺寸.因此，通过控制纳米颗粒的尺寸，可以获得不同的颜色。例如，ZnS-包衣的CdSe纳米颗粒在颗粒尺寸为2到6nm内时，其颜色覆盖整个可见光光谱.更具体地，CdSe纳米颗粒核心尺寸分别为2.3、4.2、4.8和5.5nm时，其发射光的波长分别集中为485、565、590和625nm.使用上述Huang的尺寸分级方法，可以从较宽尺寸分布的纳米颗粒中，获得不同尺寸的水溶的纳米颗粒.该方法包含在存在电解质的情况下，有调节地向纳米颗粒溶液中加入易溶于水的有机溶剂。易溶于水的有机溶剂所加入的量越大，所得到的纳米颗粒沉淀的尺寸就越小。金属的和半导体纳米颗粒也可以用作膨胀试剂，如上所述。
特别有用的是二氧化钛纳米颗粒，其不但可以用作着色剂，而且另外可以用于阻断有害的紫外线辐射.合适的二氧化钛纳米颗粒记载在美国专利号5,451,390；5,672,330；和5,762,914.二氧化钛P25是可从Degussa得到的合适的商业产品.二氧化钛纳米颗粒的其它商业供应商包括Kemira，Sachtleben和Tayca.
二氧化钛纳米颗粒典型地具有小于100纳米(nm)的平均粒径，如通过测量颗粒在液体悬浮系中的粒度分布的动态光散射所测得的.颗粒典型地是约3nm至约6000nm的聚集物.可以使用本领域已知的任何方法，制备这样的颗粒。该方法可以包含卤化钛的气相氧化或从可溶的钛复合物的溶液沉淀，只要能生成二氧化钛纳米颗粒。
制备二氧化钛纳米颗粒的一种优选的方法是通过将氧和卤化钛(优选地，四氯化钛)注射进高温反应区，典型地从400至2000℃.在反应区的高温条件下，形成的二氧化钛纳米颗粒具有高表面积和狭窄的尺寸分布。反应器中的能量来源可以是任何热源，如等离子炬.
另外，着色剂可以是有色的聚合微球.示例性的聚合微球包括但不限于，聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯基甲苯、苯乙烯/丁二烯共聚物和胶乳的微球.为了用于本发明，微球具有约10纳米至约2微米的直径。通过将任意的合适的染料(例如上述的那些)偶联到微球上，可以使微球着色。可以将染料偶联到微球的表面上，或吸附到多孔微球的孔结构内。可以从Bang Laboratories(Fishers，IN)等公司得到合适的微球，包括未染色和染色微球，其被官能化，以实现共价结合。
通过将特异性的毛发结合肽直接地或通过间隔基偶联到着色剂上，可以制备本发明的基于肽的毛发着色剂.可以使用上述任意的偶联方法。可能需要在着色剂上引入反应基团，如羧酸、醇、胺或醛基，以偶联毛发结合肽.可以使用本领域公知的常规化学，实现上述修饰.例如，可以使用硝酸、过氧化物如过氧化氢、或无机起始物如过硫酸铵，氧化炭黑颗粒的表面，产生功能基团.优选地，使用Carrasco-Marin等描述的方法(J.Chem.Soc.，Faraday Trans.93：2211-2215(1997))过硫酸铵，氧化炭黑表面.使用无机起始物，如2，2’-偶氮二(2-甲基丙酰胺)-二盐酸化物，可以在炭黑表面引入氨基功能团.无机色素和纳米颗粒也可以通过类似的方法进行衍生化，以引入羧酸或氨基功能团。
另外，使用色素结合肽，可以将毛发结合肽偶联到色素上。合适的色素结合肽序列是本领域众所周知的.例如，Nomoto等在EP1275728中描述了能结合炭黑、铜酞菁、二氧化钛和二氧化硅的肽.O′Brien等在共同未决的且共有的美国专利申请号10/935254中描述了能结合炭黑、Yellow、
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Magenta和Blue的肽.使用任一种上述的筛选方法，可以鉴别出其它色素结合肽.使用任一种上述的偶联方法，可以将色素结合肽直接地或通过间隔基偶联到毛发结合肽上.使毛发结合肽-色素结合肽二嵌段或三嵌段(如果使用间隔基)接触色素，使其结合到色素结合肽上.
也可能需要将多个毛发结合肽偶联到着色剂上，以增强基于肽的毛发着色剂与毛发之间的相互作用.可以使用相同毛发结合肽的多个拷贝，或不同毛发结合肽的组合.在较大色素颗粒的情况下，可以在色素上偶联大量的毛发结合肽，即最多约10,000个.可以将小量毛发结合肽偶联到小染料分子上，即最多约50个.因此，在本发明的一个实施方案中，基于肽的毛发着色剂是二嵌段组合物，其由毛发结合肽(HBP)和着色剂(C)组成，其具有通式结构(HBP)n-C，其中n的范围为1至约10,000，优选n从1至约500.
在另一个实施方案中，如上面所述，基于肽的毛发着色剂包含间隔基(S)，其将结合肽和毛发着色剂分隔开.可以在一个间隔基分子上结合上多个拷贝的毛发结合肽。在该实施方案中，基于肽的毛发着色剂是三嵌段的组合物，其由毛发结合肽、间隔基和着色剂组成，其具有通式结构[(HBP)m-S]n-C，其中n的范围为1至约10,000，优选n从1至约500，并且m从1至约50，优选m从1至约10.
应当理解，如本文所使用的，HBP是通用命名，不是指单个的毛发结合肽序列。当上面使用的n或m大于1时，也在本发明的范围内，以提供一系列不同序列的毛发结合肽可以形成组合物的一部分的情形。另外，应当理解，这些结构不一定代表着肽、着色剂和任选的间隔基之间的共价键。如上所述，肽、着色剂和任选的间隔基之间的偶联相互作用可以是共价的或非共价的.
本发明的基于肽的毛发着色剂可以用于毛发着色组合物中进行染发。在本文中将毛发着色组合物定义为用于毛发着色、染色或漂白的组合物，其在化妆上可接受的介质中包含有效量的基于肽的毛发着色剂或不同基于肽的毛发着色剂的组合.在本文中将在毛发着色组合物中使用的基于肽的毛发着色剂的有效量定义为，按重量计占组合物总重量的约0.001％至约20％.在毛发着色组合物中所使用的化妆上可接受介质的成分记载在：Dias等，美国专利号6,398,821和Deutz等，美国专利号6,129,770，上述文献在此引作参考.例如，毛发着色组合物可以包含鳌合剂、稳定剂、增稠剂、缓冲液、载体、表面活性剂、溶剂、抗氧化剂、聚合物和调理剂.调理剂可以包括本发明的基于肽的调理剂和毛发结合肽，其按重量计占毛发着色组合物总重量的约0.01％至约10％，优选约0.01％至约5％.
本发明的基于肽的毛发着色剂还可以作为着色剂用于化妆组合物中，其中化妆组合物是施用到睫毛或眉毛上的，包括但不限于，睫毛膏和眉笔.它们可以是包含化妆上可接受介质的无水化妆产品，该介质所包含的脂肪物质按重量计通常占组合物总重量的约10％至约90％，其中脂相包含至少一种液体、固体或半固体脂肪物质，如上所述。脂肪物质包括但不限于，油、蜡、树胶和所谓的糊状脂肪物质.或者，如上所述，这些组合物可以是稳定化的分散系形式，如油包水或水包油乳剂。在这些组合物中，基于肽的毛发着色剂的比例通常是按重量计占组合物总重量的约0.001％至约20％.
基于肽的指甲着色剂
通过将指甲结合肽(NBP)与着色剂(C)相偶联，形成本发明的基于肽的指甲着色剂.基于肽的指甲着色剂的指甲结合肽部分可以与手指甲或脚趾甲有力地结合，从而能够使着色剂在指甲上保持结合，产生持久的着色效果.指甲结合肽包括，但不限于通过上述筛选方法选择出的指甲结合肽，其中包括SEQ ID NO：53和60给出的本发明的指甲结合肽序列，最优选SEQ ID NO：60所示的肽.另外，还可以使用SEQ ID NO：7、8、19-27、38、39、40、43-45、47、57、58和59所示的漂白毛发结合肽。
如下制备本发明的基于肽的指甲着色剂：使用任一种上述的偶联方法，将特异性的指甲结合肽直接地或通过间隔基偶联到着色剂上.在本发明的基于肽的指甲着色剂中，可以使用前面所述的任意着色剂。在本发明的基于肽的指甲着色剂中使用的优选的着色剂包括D&C RedNo.8、10、30和36，D&C Red No.6、9、和12的钡色淀，D&C Red No.7、11、31和34的钙色淀，D&C Red No.30、D&C Orange No.17和D&CBlue No.6的锶色淀。
还可能希望将多个指甲结合肽偶联到着色剂上，以增强基于肽的指甲着色剂与指甲之间的相互作用.可以使用相同指甲结合肽的多个拷贝，或不同指甲结合肽的组合.在大色素颗粒的情况下，可以在色素上偶联大量的指甲结合肽，即最多约1,000个。可以将小量的指甲结合肽偶联到较小的染料分子上，即最多约50个.因此，在本发明的一个实施方案中，基于肽的指甲着色剂是二嵌段组合物，其由指甲结合肽(NBP)和着色剂(C)组成，其具有通式结构(NBP)n-C，其中n的范围为1至约10,000，优选地n是1至约500。
在另一个实施方案中，如上面所述，基于肽的指甲着色剂包含间隔基(S)，其将结合肽和着色剂分隔开.可以在一个间隔基分子上偶联多个拷贝的指甲结合肽.在该实施方案中，基于肽的指甲着色剂是三嵌段的组合物，其由指甲结合肽、间隔基和着色剂组成，其具有通式结构[(NBP)m-S]n-C，其中n的范围为1至约10,000，优选地n是1至约500，且m的范围为1至约50，优选地m是1至约10.
应当理解，如本文所使用的，NBP是通用命名，不是指单个的指甲结合肽序列.当上面使用的n或m大于1时，也在本发明的范围内，以提供一系列不同序列的指甲结合肽可以形成组合物的一部分的情形。另外，应当理解，这些结构不一定代表着肽、着色剂和任选的间隔基之间的共价键.如上所述，肽、着色剂和任选的间隔基之间的偶联相互作用可以是共价的或非共价的。
本发明的基于肽的指甲着色剂可以用于将手指甲和脚趾甲着色的指甲油组合物中。在本文中将指甲油组合物定义为用于处理和将指甲着色的组合物，其在化妆上可接受基质中包含有效量的基于肽的指甲着色剂或不同的基于肽的指甲着色剂组成的混合物.在本文中将用于指甲油组合物的基于肽的指甲着色剂的有效量定义为：相对于组合物的总重量，按重量计为约0.001％至约20％的比例。上述Philippe等的文献描述了用在指甲油组合物中的化妆上可接受介质的成分指甲油组合物典型地包含溶剂和成膜物质，如纤维素衍生物、聚乙烯衍生物、丙烯酸类聚合物或共聚物、乙烯类共聚物和聚酯类聚合物。另外，指甲油组合物中还可以包含增塑剂，如磷酸三甲苯酯、苯甲酸苄酯、磷酸三丁酯、乙酰蓖酸丁酯、柠檬酸三乙酯、乙酰柠檬酸三丁酯、邻苯二甲酸二丁酯或樟脑.
基于肽的皮肤着色剂
通过将皮肤结合肽(SBP)与着色剂(C)相偶联，形成本发明的基于肽的皮肤着色剂.基于肽的皮肤着色剂的皮肤结合肽部分可以与皮肤有力地结合，从而能够使着色剂在皮肤上保持结合，产生持久的皮肤着色效果.皮肤结合肽包括，但不限于通过上述筛选方法选择出的皮肤结合肽，包括SEQ ID NO：61给出的本发明的皮肤结合肽序列.另外，还可以使用任何已知的皮肤结合肽，包括但不限于：SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：99-104，上述肽分别描述在：Janssen等，美国专利申请公开号2003/0152976和Janssen等，WO04048399.
如下制备本发明的基于肽的皮肤着色剂：使用任一种上述的偶联方法，将特异性的皮肤结合肽直接地或通过间隔基偶联到着色剂上.可以使用上述的任意着色剂.在本发明的基于肽的皮肤着色剂中使用的优选的着色剂包括下述染料：伊红衍生物如D&C Red No.21和卤化荧光素衍生物如D&C Red No.27、与D&C Red No.21和D&C OrangeNo.10组合的D&C Red Orange No.5；和色素：二氧化钛、二氧化肽纳米颗粒、氧化锌、D&C Red No.36和D&C Orange No.17、D&C RedNo.7、11、31和34的钙色淀、D&C Red No.12的钡色淀、D&C Red No.13的锶色淀、FD&C Yellow No.5的铝色淀、FD&C Yellow No.6的铝色淀、D&C Red No.27的铝色淀、D&C Red N0.21的铝色淀和FD&C BlueNo.1的铝色淀、氧化铁、锰紫、氧化铬、群青蓝和炭黑.着色剂还可以是不晒太阳的褐色化剂(tanning agent)，如二羟基丙酮，其能够使皮肤不经过日晒就能够获得褐色外表。
还可能希望将多个皮肤结合肽偶联到着色剂上，以增强基于肽的皮肤着色剂与皮肤之间的相互作用.可以使用相同皮肤结合肽的多个拷贝，或不同皮肤结合肽的组合.在大色素颗粒的情况下，可以在色素上偶联大量的皮肤结合肽，即最多约10,000个.可以将小量的皮肤结合肽偶联到较小的染料分子上，即最多约50个.因此，在本发明的一个实施方案中，基于肽的皮肤着色剂是二嵌段组合物，其由皮肤结合肽(SBP)和着色剂(C)组成，其具有通式结构(SBP)n-C，其中n的范围为1至约10,000，优选地n是1至约500.
在另一个实施方案中，如上面所述，基于肽的皮肤着色剂包含间隔基(S)，其将结合肽和着色剂分隔开.可以在一个间隔基分子上偶联多个拷贝的皮肤结合肽.在该实施方案中，基于肽的皮肤着色剂是三嵌段的组合物，其由皮肤结合肽、间隔基和着色剂组成，其具有通式结构[(SBP)m-S]n-C，其中n的范围为1至约10,000，优选地n是1至约500，且m的范围为1至约50，优选地m是1至约10.
应当理解，如本文所使用的，SBP是通用命名，不是指单个的皮肤结合肽序列。当上面使用的n或m大于1时，也在本发明的范围内，以提供一系列不同序列的皮肤结合肽可以形成组合物的一部分的情形。另外，应当理解，这些结构不一定代表着肽、着色剂和任选的间隔基之间的共价键.如上所述，肽、着色剂和任选的间隔基之间的偶联相互作用可以是共价的或非共价的.
本发明的基于肽的皮肤着色剂可以作为着色剂用于化妆产品中，包括但不限于，粉底、腮红(blush)、唇膏、唇线笔(lip liner)、润唇膏、眼影膏和眼线膏.它们可以是包含化妆上可接受介质的无水化妆产品，其中介质中包含了脂肪物质，或者它们是如上所述的稳定化的分散系形式，如油包水或水包油乳剂.在这些组合物中，基于肽的皮肤着色剂的比例通常是按重量计占组合物总重量的约0.001％至约40％.
基于肽的口腔护理剂
通过将口腔表面结合肽(OBP)与口腔护理有益试剂(OBA)相偶联，形成本发明的基于肽的口腔护理剂。口腔表面结合肽包括但不限于，牙齿结合肽(TBP)，皮肤结合肽(SBP)，牙龈、牙齿和舌头结合肽。基于肽的口腔护理剂的肽部分强结合牙齿、牙龈、面颊、舌头或口腔的其它表面，从而能够使有益试剂保持结合，产生持久的效果.上述的皮肤结合肽可以用于结合牙龈、面颊或舌头.优选地，使用上述的筛选方法，鉴别感兴趣的特定口腔表面的结合肽.
通过使用任一种上述的偶联方法，将口腔表面结合肽直接地或通过间隔基偶联到口腔护理有益试剂上，制备基于肽的口腔护理剂。口腔护理有益试剂是本领域众所周知的(参见例如这里引作参考的White等，美国专利号6,740,311；Lawler等，美国专利号6,706,256；和Fuglsang等，美国专利号6,264925).示例性的口腔有益试剂包括但不限于，白色料，增白剂，酶，抗斑剂，防污剂，抗微生物剂，抗龋剂，调味剂，冷却剂，和促唾液剂.
可以用于基于肽的牙齿增白剂中的合适的白色料包括但不限于，白色素例如二氧化钛，二氧化钛纳米颗粒；和白色矿物质例如羟基磷灰石，和锆石(硅酸锆).合适的酶可以是天然产生的或重组的酶，包括但不限于，氧化酶，过氧化物酶，蛋白酶，脂酶，糖苷酶，酯酶，和多糖水解酶。抗斑剂包括但不限于，氟离子源和抗微生物剂.合适的抗微生物剂包括但不限于，抗微生物肽，例如Haynie在美国专利号5,847,047中所述的那些，爪蟾抗菌肽，和杀菌肽；杀微生物剂例如三氯森，氯己定，季铵化合物，氯二甲酚，氯氧基乙醇(chloroxyethanol)，酞酸及其盐，和瑞香草分.合适的调味剂包括但不限于，冬青油，薄荷油，留兰香油，薄荷醇，水杨酸甲酯，桉叶素和香草醛.
还可能希望将多个口腔表面结合肽偶联到口腔有益试剂上，以增强基于肽的口腔护理剂与口腔表面之间的相互作用。可以使用相同口腔表面结合肽的多个拷贝，或不同口腔表面结合肽的组合.在大色素颗粒的情况下，可以在色素上偶联大量的口腔表面结合肽，即最多约10,000个.可以将小量口腔表面结合肽偶联到较小的口腔有益试剂分子上，即最多约50个.因此，在本发明的一个实施方案中，基于肽的口腔护理剂是二嵌段组合物，其由口腔表面结合肽(OBP)和口腔有益试剂(OBA)组成，其具有通式结构(OBP)n-OBA，其中n的范围为1至约10,000，优选地n是1至约500.
在另一个实施方案中，如上面所述，基于肽的口腔护理剂包含间隔基(S)，其将结合肽和口腔有益试剂分隔开.可以在一个间隔基分子上偶联多个拷贝的口腔表面结合肽。在该实施方案中，基于肽的口腔护理剂是三嵌段的组合物，其由口腔表面结合肽、间隔基和口腔有益试剂组成，其具有通式结构[(OBP)m-S]n-OBA，其中n的范围为1至约10,000，优选地n是1至约500，且m的范围为1至约50，优选地m是1至约10。
应当理解，如本文所使用的，OBP是通用命名，不是指单个的皮肤结合肽序列.当上面使用的n或m大于1时，也在本发明的范围内，以提供一系列不同序列的口腔表面结合肽可以形成组合物的一部分的情形。另外，应当理解，这些结构不一定代表着肽、口腔有益试剂和任选的间隔基之间的共价键.如上所述，肽、口腔有益试剂和任选的间隔基之间的偶联相互作用可以是共价的或非共价的。
本发明的基于肽的口腔护理剂可以用于口腔护理产品中，其可以具有任何合适的物理形式，例如粉末，糊剂，凝胶，液体，软膏剂，或片剂。示例性的口腔护理产品包括但不限于，牙膏，牙霜，凝胶或牙粉，口腔洗剂，呼吸清凉剂，和牙线。口腔护理产品包含有效量的在口服可接受的载体介质中的本发明的基于肽的口腔护理剂.用于口腔护理产品中的基于肽的口腔护理剂的有效量可以随产品的种类而变。典型地，基于肽的口腔护理剂的有效量是按重量计占总产品组合物的约0.001％至约90％的比例.口腔护理产品可以含有一种类型的基于肽的口腔护理剂或不同的基于肽的口腔护理剂的混合物。
上面的White等，Lawler等，和Fuglsang等的文献中，描述了口服可接受的载体介质的成分.例如，除了本发明的基于肽的口腔护理剂之外，口腔护理产品可以含有一种或多种下述成分：磨蚀剂，表面活性剂，螯合剂，氟化物源，增稠剂，缓冲剂，溶剂，湿润剂，载体，填充剂，和其它口腔有益试剂，如上所述.
使用本领域众所周知的标准技术，可以制备本发明的口腔护理产品。如果组合物包含超过一个相，典型地分开制备不同的相，以任意的次序加入类似的相分配物质。通过充分混合，合并两相，形成多相系统(例如，乳状液或分散系).
处理毛发、皮肤、指甲和口腔的方法
在另一个实施方案中，提供了用本发明的基于肽的调理剂和着色剂处理毛发、皮肤和指甲的方法.更具体地，本发明还包含如下在皮肤、毛发或嘴唇上形成基于肽的调理剂的保护膜的方法：将上述包含有效量的基于肽的皮肤调理剂或基于肽的毛发调理剂的组合物施用到皮肤、毛发或嘴唇上，使之形成保护膜.可以通过各种方法，包括但不限于，喷雾、刷涂和用手施用，将本发明的组合物施用到皮肤、毛发或嘴唇上。使基于肽的调理剂组合物与皮肤、毛发或嘴唇接触足以形成保护膜的时间，优选至少约0.1到60分钟.
本发明还提供了如下将毛发着色的方法：通过上述的方法，将包含有效量基于肽的毛发着色剂的毛发着色组合物施用到毛发上.使毛发着色组合物与毛发接触足以使毛发着色的时间，优选约5秒钟到约50分钟，更优选约5秒钟到约60秒，然后将毛发着色组合物从毛发上洗掉。
本发明还提供了如下对皮肤或嘴唇进行着色的方法：通过上述的方法，将包含有效量基于肽的皮肤着色剂的皮肤着色组合物施用到皮肤或嘴唇上。
本发明还提供了如下对手指甲或脚趾甲进行着色的方法：通过上述的方法，将包含有效量基于肽的指甲着色剂的指甲油组合物施用到手指甲或脚趾甲上.
本发明还提供了如下对眉毛和睫毛进行着色的方法：通过上述的方法，将包含有效量基于肽的毛发着色剂的化妆组合物施用到眉毛和睫毛上。
本发明还提供了如下增白牙齿的方法：将包含基于肽的增白剂的口腔护理产品组合物施用到牙齿上，持续足以允许基于肽的增白剂结合牙齿的时间。然后从牙齿洗掉组合物。使用任一种合适的方法，包括但不限于，刷涂、漱口，和使用涂有组合物的棉棍或牙线，可以将口腔护理产品组合物施用到牙齿上。
本发明还提供了如下使呼吸新鲜的方法：将包含基于肽的呼吸清凉剂的口腔护理产品施用给口腔.口腔护理产品可以作为漱口液、牙膏、喷雾剂、口香糖或糖果来施用.
上面的将结合剂应用于体表的方法的特征在于，所述试剂结合在水性环境中的表面和迅速地(通常在从第一次施用时开始的5至约60秒内)结合的能力。本发明的试剂是具有多种用途的多用生物粘合剂，但是在它们的耐水性、快速且牢固结合的特征方面是统一的。
实施例
在下面的实施例中对本发明作进一步的详细说明。应当理解，这些实施例是本发明优选的实施方案，仅用作实例.根据上述描述和这些实施例，本领域技术人员能够确定本发明的基本特征，在不脱离本发明精神和范围内，能够对本发明作出各种改变和修改，以满足各种应用和需要。
使用的缩写的含义如下：“min”表示分钟，“sec”表示秒，“h”表示小时，“μL”微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“nm”表示纳米，“mm”表示毫米，“cm”表示厘米，“μm”表示微米，“mM”表示毫摩尔，“M”表示摩尔，“mmol”表示毫摩尔，“μmole”表示微摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克，“mg”表示毫克，“g”表示重力常数，“rpm”表示每分钟的转数，“pfu”表示蚀斑形成单位，“BSA”表示牛血清白蛋白，“ELISA”表示酶联免疫吸附测定法，“IPTG”表示异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷，“A”表示吸光度，“A450”表示在450nm波长测得的吸光度，“TBS”表示Tris-缓冲盐水，“TBST-X”表示包含20的Tris缓冲盐水，其中“X”是
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20的重量百分比，“Xgal”表示5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷，“SEM”表示平均值的标准误，“ESCA”表示化学分析的电子光谱，“eV”表示电子伏特，“TGA”表示热重量分析法，“GPC”表示凝胶渗透色谱法，“MW”表示分子量，“MW”表示重量平均分子量，“vol％”表示体积百分比，“NMR”表示核磁共振分光检定法，且“MALDI质谱法”表示基质辅助的激光解吸离子化质谱法.
一般方法：
实施例中所使用的标准重组DNA技术和分子克隆技术是本领域中公知的，且记载在，Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY 1989；T.J.Silhavy，M.L.Bennan，和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1984；和Ausubel，F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience，N.Y.，1987.
适用于细菌培养物的维持和生长的材料和方法也是本领域中公知的.适用于下面实施例的技术参见：Manual of Methods for GeneralBacteriology，Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Kriey和G.Briggs Phillips，eds.，American Society for Microbiology，Washington，DC.，1994，或者Thomas D.Brock，Biotechnology：A Textbook of IndustrialMicrobiology，Second Edition，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA，1989。除非另有说明，所有的试剂、限制酶和用于生长和维持细菌细胞的材料均购自Aldrich Chemicals(Milwaukee，Wl)、BDDiagnostic Systems(Sparks，MD)、Life Technologies(Rockville，MD)、或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO).
实施例1
使用标准的生物淘选技术选择毛发结合噬菌体肽
该实施例的目的是利用标准噬菌体展示生物淘选技术来鉴别能够与普通毛发和经漂白的毛发结合的毛发结合噬菌体肽.
噬菌体展示肽文库：
本发明所使用的噬菌体文库，Ph.D.-12TM噬菌体展示肽文库试剂盒和Ph.D.-7TM噬菌体展示文库试剂盒，均购自New England BioLabs(Beverly，MA)。这些试剂盒是随机肽7或12聚体的组合文库，所述随机肽融合到噬菌体M13的一个较小的外壳蛋白(pIII)上。所展示的肽在pIII的N-末端表达，因此在切除信号肽后，外壳蛋白的首位残基即是所展示的肽的第一位残基.Ph.D.-7和Ph.D.-12文库分别由大约2.8×109和2.7×109个序列组成.对于每个肽序列来说，10μL的上述文库包含大约55个拷贝.每次试验的第一轮均使用制造商提供的起始文库，目的是为了避免给试验结果造成偏差.
毛发样品的制备：
用作普通毛发的样品为6-英寸的中等棕色的人毛发，来自International Hair Importers and Products(Bellerose，NY)。将毛发放置在90％的异丙醇中，室温放置30分钟，然后用去离子水洗涤5次，每次10分钟.将处理后的毛发室温风干过夜.
为了制备漂白的毛发样品，将中等棕色的人毛发放置在6％的H2O2中，所述H2O2预先用氢氧化铵将pH值调到10.2，室温放置10分钟，然后用去离子水洗涤5次，每次10分钟。将处理后的毛发室温风干过夜。
将普通毛发样品和漂白的毛发样品剪成0.5-1厘米的长度，然后将大约5-10mg毛发样品放置于定做的24孔生物淘选装置的孔中，该装置的底部有一层猪皮。留出相同数量的带有猪皮底的空孔.该带有猪皮底的装置用作减法操作，以去除对皮肤具有亲和力的噬菌体-肽。该装置是通过修改斑点印迹装置(来自Schleicher&Schuell，Keene，NH)而生成的，以适应生物淘选过程的需要.更具体地，将斑点印迹装置上部的96孔平板换成24孔平板.在24孔平板在放置一块4X 6英寸的经处理的猪皮，然后将该装置绷紧，形成底部带有猪皮的淘选孔.猪皮购自当地的一家超市，储存在-80℃。在使用前，将猪皮放置在去离子水中解冻，然后用纸巾吸干。用90％的异丙醇擦拭猪皮表面，然后用去离子水漂洗。将24孔装置注满封闭缓冲液，其组成为：在含有0.5％的
Figure G2009101649831D00461
20的TBST(TBST-0.5％)中的1mg/mL BSA，在4℃温育1小时.用TBST-0.5％洗涤孔和毛发5次.向每个孔加入1毫升含有1mg/mL BSA的TBST-0.5％。然后，向带有猪皮底的不含有毛发样品的孔中加入10μL起始噬菌体文库(2×1011 pfu)(12聚体文库、或者7聚体文库)，噬菌体文库在室温温育15分钟.然后将没有结合的噬菌体转移到含有毛发样品的带猪皮底的孔中，并在室温温育15分钟.将毛发样品和孔用TBST-0.5％洗涤10次.然后将毛发转移到洁净的24孔平板的塑料底孔中，每孔中加入1mL的非特异性洗脱缓冲液，该缓冲液组成为：1mg/mL BSA的0.2M甘氨酸-HCl溶液，pH为2.2，然后温育10分钟以洗脱结合噬菌体。然后，每孔中加入160μL中和缓冲液，缓冲液组成为：1M Tris-HCl，pH为9.2.将每孔中洗脱后的噬菌体转移到新的试管中，用于滴度测定和测序.
为了测定结合噬菌体的滴度，将洗脱后的噬菌体用SM缓冲液(100mM NaCl，12.3mM MgSO4-7H2O，50mM Tris-HCl，pH 7.5，0.01wt/vol％明胶)稀释，以制备101到104的连续10倍稀释液.每种稀释液取10μL等分试样，与200μL对数中期的大肠杆菌ER2738(NewEngland BioLabs)一起温育，在LB培养基上生长20分钟，然后在45℃下与3mL上层琼脂糖(含有5mM MgCl2和0.7％琼脂糖的LB培养基)混合.将混合物涂布到S-GalTM/LB琼脂板上(Sigma Chemical Co.)，在37℃培养过夜.S-GalTM/LB琼脂混和物包含5g的胰蛋白胨、2.5g的酵母提取物、5g的氯化钠、6g的琼脂、150mg的3，4-环乙烯七叶亭(cydohexeno-esculetin)-β-吡喃型半乳糖苷(S-GalTM)、250mg的柠檬酸铁铵和15mg的异丙醇β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，溶解在500mL的蒸馏水中。在制备平板时，将上述S-GalTM/LB在121-124℃高压灭菌15-20分钟.随机挑选单个的黑色噬菌斑用于DNA分离和序列分析。
剩余的洗脱后的噬菌体通过与稀释后的大肠杆菌ER2738一起培养来扩增，在37℃培养4.5小时，其中的大肠杆菌ER2738是以1∶100的比例稀释在LB培养基中过夜培养获得的.之后，将细胞培养物离心30秒，将上层80％的上清液转移到一个新试管中，加入1/6体积的PEG/NaCl(20％的聚乙二醇-800、2.5M的氯化钠)，在4℃过夜，使噬菌体沉淀。在4℃、10,000x g下离心，收集沉淀物，将收集到的沉淀重悬浮在1mL的TBS中。这即为第一轮的扩增原液.然后根据与上述相同的方法测定第一轮噬菌体扩增原液的滴度.在第二轮的生物淘选中，使用多于2×1011pfu的第一轮噬菌体原液。根据试验的需要，重复3-6次上述生物淘选过程.
根据制造商(New England Labs)的使用说明书来制备单噬菌斑裂解物，并使用QIAprep Spin M13试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化噬菌体单链基因组DNA，并使用96gIII测序引物(5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’)在DuPont测序仪上测序，其中引物的序列如SEQ ID NO：62所示。所要展示的肽紧挨在基因III信号肽的后面。
在第五轮生物淘选中分离到的来自12聚体文库的洗脱的普通毛发结合噬菌体肽的氨基酸序列，显示在表1中.在第五轮生物淘选中分离到的来自12聚体文库的洗脱的漂白毛发结合噬菌体肽的氨基酸序列，显示在表2中。在第三轮生物淘选中分离到的来自95个随机选择的克隆的7聚体文库的洗脱的普通毛发结合噬菌体肽的重复氨基酸序列，显示在表3中。
表1
来自12聚体文库的洗脱的普通毛发结合噬菌体肽的氨基酸序列
  克隆序号   氨基酸序列   SEQ ID NO：   频率1
  1   RVPNKTVTVDGA   5   5
  2   DRHKSKYSSTKS   6   2
  3   KNFPQQKEFPLS   7   2
  4   QRNSPPAMSRRD   8   2
  5   TRKPNMPHGQYL   9   2
  6   KPPHLAKLPFTT   10   1
  7   NKRPPTAHRIHA   11   1
  8   NLPRYQPPCKPL   12   1
  9   RPPWKKPIPPSE   13   1
  10   RQRPKDHFFSRP   14   1
  11   SVPNKXVTVDGX   15   1
  12   TTKWRHRAPVSP   16   1
  13   WLGKNRIKPRAS   17   1
  14   SNFKTPLPLTQS   18   1
  15   SVSVGMKPSPRP   3   1
1频率代表在23个测序的克隆中所出现的相同序列的数目.
表2
来自12聚体文库的洗脱的漂白毛发结合噬菌体肽的氨基酸序列
  克隆序号   氨基酸序列   SEQ ID NO：   频率1
  1   KELQTRNVVQRE   19   8
  2   QRNSPPAMSRRD   8   5
  3   TPTANQFTQSVP   20   2
  4   AAGLSQKHERNR   21   2
  5   ETVHQTPLSDRP   22   1
  6   KNFPQQKEFPLS   7   1
  7   LPALHIQRHPRM   23   1
  8   QPSHSQSHNLRS   24   1
  9   RGSQKSKPPRPP   25   1
  10   THTQKTPLLYYH   26   1
  11   TKGSSQAILKST   27   1
1频率代表在24个测序的克隆中所出现的相同序列的数目。
表3
来自7聚体文库的洗脱的普通毛发结合噬菌体肽的氨基酸序列
  克隆序号   氨基酸序列   SEQ ID NO：
  A   DLHTVYH   28
  B   HIKPPTR   29
  D   HPVWPAI   30
  E   MPLYYLQ   31
  F1   HITVPWRGGGSAVPFYSHSQITLPNH   32
  G1   GPHDTSSGGVRPNLHHTSKKEKRENRKVPFYSHSVTSRGNV   33
  H   KHPTYRQ   34
  I   HPMSAPR   35
  J   MPKYYLQ   36
1在这些克隆中插入了多重DNA片段.
实施例2
使用修改的方法选择具有高亲和力的毛发结合噬菌体肽.
本实施例的目的是鉴别具有较高结合亲和力的毛发结合噬菌体肽。
按照实施例1中所描述的，用酸性洗脱缓冲液处理毛发，用洗脱缓冲液洗涤时，比实施例1多洗涤3次，然后用TBST-0.5％洗涤3次.将抗酸的噬菌体肽仍然结合在其上的这些毛发直接感染500μL对数中期的细菌宿主细胞大肠杆菌ER2738(New England BioLabs)，然后在LB培养基上培养20分钟，然后在45℃下与3mL上层琼脂糖(含有5mM MgCl2和0.7％琼脂糖的LB培养基)混合.将混合物涂布到LB培养基/IPTG/S-GalTM板上(LB培养基中含有15g/L的琼脂、0.05g/L的IPTG和0.04g/L的S-GalTM)，在37℃培养过夜.对单个黑色噬菌斑进行计数，以计算噬菌体滴度.按照实施例1所描述地，随机挑取单个黑色噬菌斑用于DNA分离和序列分析.按照实施例1中所描述地，对用7聚和12聚噬菌体展示文库筛选出的普通毛发样品和漂白毛发样品分别进行上述过程.这些具有高亲和力的毛发结合噬菌体肽的氨基酸序列，显示在表4-7中.
表4
从7聚体文库中筛选到的具有高亲和力的普通毛发结合噬菌体肽的氨基酸序列
  克隆序号   氨基酸序列   SEQ ID NO：
  D5   GPHDTSSGGVRPNLHHTSKKEKRENRKVPFYSHSVTSRGNV1   33
  A36   MHAHSIA   37
  B41   TAATTSP   38
1在这些克隆中插入了多重DNA片段.
表5
从7聚体文库中筛选到的具有高亲和力的漂白毛发结合噬菌体肽的氨基酸序列
  克隆序号   氨基酸序列   SEQ ID NO：
  D39   LGIPQNL   39
  B1   TAATTSP   38
表6
从12聚体文库中筛选到的具有高亲和力的普通毛发结合噬菌体肽的氨基酸序列
  克隆序号   氨基酸序列   SEQ ID NO：
  C2   AKPISQHLQRGS   40
  A3   APPTPAAASATT   41
  F9   DPTEGARRTIMT   42
  A19   EQISGSLVAAPW   43
  F4   LDTAFPPVPFHA   44
  F35   LPRIANTWSPS   45
  D21   RTNAADHPAAyT   46
  C10   SLNWVTIPGPKI   47
  C5   TDMWAPTKSYSN   48
  D20   TIMTKSPSLSCG   49
  C18   TPALDGLRQPLR   50
  A20   TYPASRLPLLAP   51
  C13   AKTHKHPAPSYS   52
  G-D20   YPSFSPTYRPAF   53
  A23   TDPTPFSISPER   54
  F67   SQNWQDSTSYSN   55
  F91   WHDKPQNSSKST   56
  G-F1   LDVESYKGTSMP   4
表7
从12聚体文库中筛选到的具有高亲和力的漂白毛发结合噬菌体肽的氨基酸序列
  克隆序号   氨基酸序列   SEQ ID NO：
  A5   EQISGSLVAAPW   43
  C4   NEVPARNAPWLV   57
  D30   NSPGYQADSVAIG   58
  C44   AKPISQHLQRGS   40
  E66   LDTSFPPVPFHA   44
  C45   ALNWVTIPGPKI   47
  E18   TQDSAQKSPSPL   59
实施例3
选择具有高亲和力的手指甲结合噬菌体肽
本实施例的目的是鉴别对手指甲具有高度结合亲和力的噬菌体肽。使用实施例2中所描述的修改的生物淘选方法，来鉴别具有高亲和力的手指甲结合噬菌体-肽克隆.
从受试者收集人手指甲.用肥皂溶液刷洗干净手指甲，用去离子水漂洗，然后在室温风干。将手指甲在液氮中研成粉末，在96孔过滤板的每个孔中分别加入10mg的手指甲.用封闭缓冲液处理手指甲样品，时间为1小时，其中封闭缓冲液由1mg/mL BSA的TBST-0.5％溶液组成，然后用TBST-0.5％洗涤。将手指甲样品与噬菌体文库(Ph.D-12噬菌体展示肽文库试剂盒)一起温育，然后洗涤10次，条件与实施例1描述的相同.按照实施例1所描述地，在酸洗脱步骤后，用洗脱缓冲液对手指甲样品多洗涤3次，然后用TBST-0.5％再洗涤3次。经过上述酸处理的手指甲，抗酸的噬菌体肽仍然结合在手指甲上，按照实施例2所描述地，将上述手指甲直接感染大肠杆菌ER2738细胞。上述生物淘选过程重复进行3次.随机挑取总共75个单个黑色噬菌斑用于DNA分离和序列分析，其中经鉴别有两个重复克隆.这些噬菌体肽的氨基酸序列列于表8中.也发现这些手指甲结合肽也能与漂白的毛发很好地结合。
表8
具有高亲和力的手指甲结合噬菌体肽的氨基酸序列
  克隆序号   氨基酸序列   SEQ ID NO：   频率1
  F01   ALPRIANTWSPS   60   15
  D05   YPSFSPTYRPAF   53   26
1频率代表在75个测序的克隆中所出现的相同序列的数目.
实施例4
具有高亲和力的皮肤结合噬菌体肽的选择
本实施例的目的是鉴别对皮肤具有高度结合亲和力的噬菌体肽.使用实施例2和4所描述的修改的生物淘选方法，来鉴别具有高亲和力的皮肤结合噬菌体-肽克隆.在本方法中，猪皮作为人皮肤的模型。
按照实施例1所描述的方法制备猪皮。按照实施例4所描述的相同方法用定做的猪皮底的生物淘选装置筛选3轮.随机挑取总共28个单个黑色噬菌斑用于DNA分离和序列分析，其中经鉴别有1个重复克隆。该噬菌体肽的氨基酸序列表示为SEQ ID NO：61，该序列在28个序列中出现了9次，序列为：TPFHSPENAPGS。
实施例5
定量表征毛发结合噬菌体克隆的结合亲和力.
本实施例的目的是利用滴度测定法和ELISA来定量测定噬菌体克隆的结合亲和力。
毛发结合噬菌体克隆的滴度测定：
将展示出特异性肽的噬菌体克隆用于比较不同肽序列的结合特性。利用基于滴度的测定试验来定量噬菌体的结合能力.该试验测定了10mg毛发表面所保留的输出量pfu，信噪比为103到104.所有噬菌体克隆的输入量为1014pfu.应当强调的是，该试验测定的是表达肽的噬菌体颗粒，而不是结合肽的噬菌体颗粒.
将普通毛发剪成0.5cm长的小段，取其中10mg至于96孔过滤板(Qiagen)的每个孔中。然后，给每孔注入封闭缓冲液，缓冲液包含1mg/mL BSA的TBST-0.5％溶液，并在4℃温育1小时。毛发用TBST-0.5％洗涤5次.然后将孔中注入1mL包含1mg/mL BSA的的TBST-0.5％溶液，然后向每孔中加入纯化的噬菌体克隆(1014pfu).毛发样品在室温温育15分钟，然后用TBST-0.5％溶液洗涤10次.将毛发转移到洁净的孔中，在每个孔中加入1.0mL的非特异性洗脱缓冲液，缓冲液组成为1mg/mL BSA的0.2M甘氨酸-HCl溶液，pH为2.2.样品温育10分钟，然后在每个孔中加入160μL的中和缓冲液(1MTris-HCl，pH 9.2).将每孔中洗脱后的噬菌体转移到新的试管中，用于滴度测定和序列分析.
为了测定结合噬菌体的滴度，将洗脱后的噬菌体用SM缓冲液稀释，以制备101到108的10倍连续稀释液.每种稀释液取10μL等分试样，与200μL对数中期的大肠杆菌ER2738(New England BioLabs)一起温育，在LB培养基上生长20分钟，然后在45℃下与3mL上层琼脂糖(含有5mM MgCl2和0.7％琼脂糖的LB培养基)混合.将混合物涂布到LB培养基/IPTG/Xgal板上(含有15g/L琼脂、0.05g/LIPTG和0.04g/L Xgal的LB培养基)，在37℃培养过夜.对蓝色噬菌斑进行计数，以计算出噬菌体的滴度，上述试验结果显示在表9中.
表9
毛发结合噬菌体克隆的滴度
  克隆序号   SEQ ID NO：   噬菌体滴度
  A   28   7.50×104
  B   29   1.12×105
  D   30   8.20×104
  E   31   1.70×105
  F   32   1.11×106
  G   33   1.67×108
  H   34   1.30×106
  I   35   1.17×106
  J   36   1.24×106
通过ELISA表征毛发结合噬菌体克隆：
利用酶联免疫吸附测定(ELISA)来评价所选择出的噬菌体-肽克隆对毛发结合的特异性.扩增实施例1和2中所鉴别出的噬菌体-肽克隆，还有随机抽取的对照G-F9，对照的序列为KHGPDLLRSAPR(SEQID NO：63).向预先已经进行了封闭的毛发表面加入超过1014pfu的噬菌体.作为对照，向预先进行了封闭的猪皮表面也加入等量的噬菌体，以证明其对于毛发的结合特异性。
在Minifold I Dot-Blot System(Schleicher&Schuell，Inc.，Keene，NH)的上层96孔平板的底部加上一层然后在该
Figure G2009101649831D00552
层的上面结合上毛发或一层无毛的猪皮，最后将该装置绷紧，从而形成了独特的以毛发或猪皮为底的96孔装置.对于每个试验克隆来说，覆盖毛发的孔用200μL封闭缓冲液在室温温育1小时，其中缓冲液组成为2％脱脂奶粉(Schleicher&Schuell，Inc.)的TBS溶液。同时用封闭缓冲液处理第二种以猪皮为孔底的Minifole系统，以作为对照。通过翻转系统去除封闭缓冲液，并用纸巾将其吸干。上述系统用洗涤缓冲液洗涤6次，缓冲液组成为TBST-0.05％.向孔中注入200μL包含1mg/mL BSA的TBST-0.5％溶液，然后向每孔中加入10μL(超过1012拷贝)纯化的噬菌体原液。将上述样品在37℃温育15分钟，同时缓慢摇动.用TBST-0.5％洗涤孔10-20次，以除去未结合的噬菌体。然后，向每个孔中加入100μL的辣根过氧化物酶/抗-M13抗体缀合物(Amersham USA，Piscataway，NJ)，其中上述缀合物是以1∶500的比例在封闭缓冲液中稀释地，在室温温育1小时.去除缀合物溶液，并用TBST-0.05％溶液将孔洗涤6次。向每个孔中加入购自PierceBiotechnology(Rockford，IL)的TMB体表，室温保持5-30分钟，一般为10分钟，以显示颜色。然后，向每个孔中加入终止溶液(200μL的2M H2SO4)，将溶液转移到96孔平板上，并使用微量培养板分光光度计(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)测定溶液的A450值.以至少三个重复测定平均值报道的结果所得吸光度值和平均标准误差列于表10中。
表10
皮肤和毛发的ELISA测定结果
  克隆序号   SEQ ID NO：   毛发A450   SEM   猪皮A450   SEM
  G-F9(对照)   63   0.074   0.057   -0.137   0.015
  D21   46   1.051   0.16   0.04   0.021
  D39   39   0.685   0.136   0.086   0.019
  D5   33   0.652   0.222   0.104   0.023
  A36   37   0.585   0.222   0.173   0.029
  C5   48   0.548   0.263   0.047   0.037
  C10   47   0.542   0.105   0.032   0.012
  A5   43   0.431   0.107   0.256   0.022
  B1   38   0.42   0.152   0.127   0.023
  D30   58   0.414   0.119   0.287   0.045
  C13   52   0.375   0.117   0.024   0.016
  C18   50   0.34   0.197   0.132   0.023
从表10的数据可以看出，所有的毛发结合克隆对毛发的结合亲和力显著高于对照。另外，毛发结合克隆对毛发和猪皮表现出不同程度的选择特性。克隆D21对毛发的选择性最高，对毛发具有非常强的亲和力，而对猪皮的亲和力非常低.
实施例6
肽结合特异性和亲和力的验证
本实施例的目的是使用竞争性ELISA，来测定毛发结合肽D21的肽结合位点的特异性和亲和力。仅对保持与毛发表面结合的噬菌体颗粒进行ELISA测定.因此，如果合成肽与噬菌体颗粒竞争毛发表面的相同的结合位点，则向ELISA体系中加入合成肽将显著降低ELISA值，这是肽竞争所导致的结果.
SEQ ID NO：46所示的毛发结合合成肽D21，是通过SynPep(Dublin，CA)合成的.作为对照，向该体系中引入了SEQ ID NO：61所示的不相关的皮肤结合合成肽.试验条件类似于实施例5中所描述的ELISA方法所用的条件。首先，向96孔过滤板的每个孔中加入100μL的结合缓冲液(1×TBS，含有0.1％的
Figure G2009101649831D00571
20和1mg/mL的BSA)和1011pfu的纯化的D21噬菌体颗粒，其中孔中含有普通毛发样品.然后向每个孔中加入合成肽(100μg，相应的浓度为0.8mM)。反应在室温进行1小时，同时轻轻摇动，然后用TBST-0.5％洗涤5次.其它的步骤与实施例5所描述的ELISA方法相同.ELISA结果，以450nm下的吸光度值(A450)表示，列于表11中.每个单独的ELISA试验重复进行三次，表11的值是三次测定结果的平均值.
表11
肽竞争性ELISA的结果
  样品   A450   SEM
  抗体-缀合物   0.199   0.031
  噬菌体D21   1.878   0.104
  噬菌体D21和D21肽   1.022   0.204
  噬菌体D21和对照肽   2.141   0.083
上述结果表明合成肽D21确实与噬菌体克隆D21竞争毛发表面的相同结合位点.
实施例7
使用生物淘选来选择抗洗发水的毛发结合噬菌体-肽
本实施例的目的是使用生物淘选来选择抗洗发水的毛发结合噬菌体-肽，方法中使用洗发水洗涤.
为了选择抗洗发水的毛发结合肽，按照实施例2所描述的方法，使用抗普通毛发和漂白毛发的12聚噬菌体肽文库淘选进行生物淘选试验。不同之处在于，不再使用普通的TBST缓冲液洗涤掉未结合的噬菌体，而是用10％、30％和50％的洗发水溶液(Pantene Pro-V shampoo，Sheer Volume，Proctor&Gamble，Cincinnati，OH)洗涤复合了噬菌体的毛发，每个反应管洗涤5分钟，之后用TBS缓冲液洗涤6次.按照实施例2所描述的修改的生物淘选方法，将洗涤后的毛发直接感染宿主细菌细胞。
在该方法中存在一个潜在的问题，也就是洗发水可能影响噬菌体感染细菌宿主细胞的能力.在对照试验中，将已知量的噬菌体颗粒加入到10％的洗发水溶液中，保持5分钟，然后取一部分溶液感染细菌细胞.洗发水处理后的噬菌体的滴度比未处理的噬菌体低90％.用30％和50％洗发水处理更加严重损害了噬菌体感染宿主细胞的能力。不过，还是鉴别出了两种抗洗发水的毛发结合噬菌体-肽，结果显示在表12中。
表12
使用生物淘选方法鉴别出的抗洗发水毛发结合噬菌体-肽的肽序列。
  克隆   序列   靶   SEQ ID NO：
  I-B5   TPPELLHGDPRS   普通毛发和漂白毛发   66
  H-B1   TPPTNVLMLATK   普通毛发   69
实施例8
使用PCR技术选择抗洗发水的毛发结合噬菌体-肽
本实施例的目的是使用PCR方法选择抗洗发水的毛发结合噬菌体-肽，以避免洗发水对噬菌体造成损害的问题。PCR方法的原理是噬菌体颗粒内的DNA片段能够使用PCR方法进行回收，而不需要考虑噬菌体的生存力，并且回收的DNA片段，对应于毛发结合肽的序列，能够被克隆返回到噬菌体载体中，并包装成健康的噬菌体颗粒.
按照实施例1的方法，使用抗普通毛发和漂白毛发的7聚体和12聚体噬菌体-肽文库进行生物淘选试验.在最后一次洗涤后，用洗发水洗涤噬菌体处理后的毛发，洗涤5分钟，之后用TBS缓冲液洗涤6次.将洗发水洗涤后的毛发置于带有1mL水的新试管中，煮沸15分钟，以释放出DNA。煮沸的含有DNA的溶液用作PCR反应的DNA模板。PCR反应所使用的引物如下：M13KE-1412正向引物5’-CAAGCCTCAGCGACCGAATA-3’(SEQ ID NO：67)和M13KE-1794反向引物5’-CGTAACACTGAGTTTCGTCACCA-3’(SEQ ID NO：68).PCR反应条件是：96℃变性3分钟，之后进行35个循环，每个循环为94℃30秒，50℃30秒和60℃2分钟.PCR产物(～400bp)和M13KE载体(New England BioLabs)用限制性内切酶Eag I和Acc65I消化.应用Ph.D.TM Peptide Display Cloning System(New England Biolabs)所描述的连接和转化条件.所得到的抗洗发水毛发结合噬菌体-肽的氨基酸序列是NTSQLST(SEQ ID NO：70).
实施例9
毛发结合肽和皮肤结合肽亲和力的测定
本实施例的目的是测定毛发结合肽和皮肤结合肽分别对各自体表的测定亲和力，使用ELISA测定，以MB50值来表示.
毛发结合肽和皮肤结合肽是利用Synpep Inc.(Dublin，CA)来合成的.为了利于检测，在肽氨基酸结合序列的C-末端附加了一个生物素化的赖氨酸残基，从而使肽生物素化，并且在序列的C-末端附加了酰胺化的半胱氨酸.接受试验的肽的氨基酸序列是SEQ ID NO：71-74，如表13所示.
对于毛发样品，所用方法如下。所使用的表面特异性96孔系统的设置与实施例5所述的相同.简言之，将带有毛发或猪皮表面的96孔用封闭缓冲液(SuperBlockTM，购自Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)进行封闭，在室温进行1小时，之后用TBST-0.5％溶液室温洗涤6次，每次2分钟.向每个孔中加入不同浓度的生物素化的结合肽，在37℃温育15分钟，然后用TBST-0.5％室温洗涤6次，每次2分钟.然后，向每孔中加入链霉抗生物素-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物(PierceChemical Co.)(每孔1.0μg)，室温温育1小时.温育后，用TBST-0.5％溶液室温洗涤孔6次，每次2分钟.最后，按照实施例5所描述的那样产生颜色，并进行测定.
使用如下的方法检测肽-皮肤复合物的MB50值.首先，处理猪皮，以封闭皮上的内源性生物素.该过程是通过向封闭缓冲液中加入链霉抗生物素来完成的。在完成猪皮样品的封闭后，将皮用D-生物素进行处理，以封闭过量的链霉抗生物素结合位点。其它的步骤与毛发样品相同.
使用GraphPad Prism 4.0(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)软件将结果以不同肽浓度下所对应的A450值作图.从斯卡查德图计算出MB50值，结果总结在表13中.该结果表明毛发结合肽(D21，F35和I-B5)和皮肤结合肽(SEQW ID NO：61)分别对各自的体表具有很高的结合亲和力，但是毛发结合肽(D-21，和I-B5)对皮肤的结合亲和力则相对要低.
表13
毛发和皮肤结合肽的MB50值总结
  结合肽   用于试验的肽的序列＊   体表   MB50，M
  D21   SEQ ID NO：71   普通毛发   2×10-6
  F35   SEQ ID NO：72   漂白毛发   3×10-6
  I-B5   SEQ ID NO：73   普通毛发和漂白毛发   3×10-7
  D21   SEQ ID NO：71   猪皮   4×10-5
  I-B5   SEQ ID NO：73   猪皮   ＞1×10-4
  SEQ ID NO：   SEQ ID NO：74   猪皮   7×10-7
＊用于试验的肽是在氨基酸结合序列的C-末端进行了生物素化，并在结合序列的C-末端附加了酰胺化半胱氨酸的肽。
实施例10
基于肽的炭黑毛发着色剂的制备
本实施例的目的是制备基于肽的炭黑毛发着色剂，其是通过将毛发结合肽D21(SEQ ID NO：46)与炭黑颗粒的表面共价连接来完成的.通过与2，2’-偶氮二(2甲基丙酰胺)-二盐酸化物反应，引入游离的氨基，从而使炭黑颗粒的表面官能化.然后将官能化的炭黑颗粒共价连接到特定的毛发结合肽上.
炭黑表面的官能化：
将炭黑(
Figure G2009101649831D00601
160-IQ，购自Degussa，Allendale，NJ)，2.0g和1.0g的2，2’-偶氮二(2甲基丙酰胺)-二盐酸化物(Aldrich，Millwaukee，WI)加入到100mL的圆底烧瓶中，并加入30mL的二氧六环.用氮将烧瓶清洗5分钟.然后用胶乳隔膜将烧瓶密封，然后将反应混合物在65℃下搅拌14小时.之后，向反应混合物中加入50mL的去离子水，其中去离子水是用Nanopure纯化系统(Barnstead/Thermolyne，Dubuque，IA)制备的。将稀释后的溶液进行离心，收集官能化的炭黑颗粒，并去除有机溶剂和未反应的试剂.用去离子水洗涤炭黑颗粒，并离心.洗涤和离心步骤再重复2次.然后将官能化的炭黑颗粒进行冷冻干燥.
来自噬菌体克隆D21的t-Boc保护的毛发结合肽的合成：
此反应的目的是保护毛发结合肽的氨基末端基团。在25mL的圆底烧瓶中，将来自噬菌体克隆D21的毛发结合肽(0.25g，SEQ IDNO：46，纯度为95％，来自SynPep，Dublin，CA)与2.5mL的去离子水混合.然后，加入20mg的NaOH和0.25mL的叔丁醇.将混合物搅拌2分钟，之后逐滴加入0.12g的二叔丁基碳酸氢盐(t-Boc酐)(Aldrich).烧瓶用胶乳隔膜密封，且反应混合物在室温搅拌过夜.反应混合物在反应开始时是澄清地，之后慢慢变浑浊，在1小时后出现沉淀。向反应混合物中加入水(10mL)后，反应混合物形成乳白色的乳剂，然后用5mL份的二氯甲烷提取三次。用5mL份的去离子水将有机层洗涤二次.将澄清的水层收集在一起并冷冻干燥，得到0.20g的白色疏松粉末(得率为80％).使用液相层析-质谱分析法(LC-MS)分析所得到的产物，发现其分子量为1323g/mol，纯度为90重量％.
氨基-官能化的炭黑与t-Boc-D21-肽的偶联：
在3mL四氢呋喃(THF)中，加入氨基-官能化的炭黑(87mg)、t-Boc-D21-肽(80mg)和二环己基碳二亚胺(22mg).将二甲基氨基吡啶(17μL)溶解在几滴THF中的溶液逐滴加入到上述混合物中，边加入边搅拌。将所得到的黑色悬浮液在40℃加热6小时，同时进行搅拌，之后室温搅拌过夜.向产物中加入三氟乙酸(0.6mL)，并将混合物继续搅拌6小时。然后，向反应混合物中加入5mL去离子水。混合物在3,500rpm下离心2分钟，并轻轻倾倒出上清液。用去离子水洗涤离心管中的固体残留物，并再次离心.重复进行洗涤步骤，直到上清液的pH值接近6.0.然后将黑色的残渣用冷冻干燥机干燥2天，得到黑色的粉末.
实施例11
使用基于肽的炭黑毛发着色剂对毛发进行染色
本实施例的目的是使用实施例10制备的基于肽的炭黑毛发着色剂对天然白色毛发样品进行染色。
将一束天然白色毛发(约100根)(购自International HairImporters and Products，Inc.，Bellerose，NY)通过与10mL的50％异丙醇混合30分钟来进行清洗，然后用去离子水至少洗涤5次.毛发变干后，将洗净的毛发浸入下列溶液中30分钟，该溶液是将50mg实施例10所述的毛发结合D21肽-炭黑毛发染色剂溶解在10mL去离子水中所形成的溶液.染色完成后，将毛发用去离子水至少洗涤5次.开始时的天然白色毛发变得黑亮.将染后的毛发用30％的洗发水(Pantene Pro-V洗发水)洗涤三次，方法是将毛发浸入洗发水中并用玻璃移液管搅拌.然后将毛发用蒸馏水漂洗至少10次.天然白色毛发经过染色处理后的最终颜色非常黑亮.
实施例12
基于肽的毛发调理剂的制备
本实施例的目的是制备基于肽的毛发调理剂，其中使用碳二亚胺偶联将毛发结合D21肽(SEQ ID NO：46)与二十二醇共价连接.
在25mL的圆底烧瓶中，将81.7mg的二十二醇(Aldrich)和62.0mg的二环己基碳二亚胺(DCC)溶解在2.0mL的THF中.向上述混合物中加入下列溶液，该溶液是将0.25g 9-芴基甲基氧羰基(Fmoc)N-末端保护的SEQ ID NO：46(纯度为95％，来自SynPep，Dublin，CA)溶解在2.0mL的二甲基甲酰胺(DMF)中所形成的溶液.然后，向反应混合物中加入50μL的二甲基氨基吡啶(DMAP).将反应混合物在40℃保持3小时，并不断搅拌，然后置于室温过夜.然后将溶剂在室温真空蒸发4小时.之后，将混合物溶解在25mL的乙酸乙酯中，然后用水提取未反应的肽3次，每次提取使用10mL去离子水.分离乙酸乙酯相，并使用旋转式汽化器将乙酸乙酯蒸发掉.将所得到的固体产物溶解在下列溶剂中，该溶剂由2.5mL的THF和2.5mL的DMF组成，然后加入1.5mL的哌啶，以使D21肽的氨基基团去封闭.将混合物在室温搅拌2小时，然后使用旋转式汽化器在真空下将溶剂蒸发掉。通过LC/MS表征所得到的最终产物.
实施例13
基于肽的毛发调理剂的制备
本实施例的目的是制备基于肽的毛发调理剂，其中使用双异官能团交联剂3-马来酰亚胺基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯将结合了半胱氨酸的毛发结合D21肽(SEQ ID NO：64)与辛胺共价连接.
辛胺购自Aldrich(Milwaukee，WI)，取其中11.6mg稀释到0.3mL的DMF中。将稀释后的溶液搅拌着加入到置于5mL圆底烧瓶中的下列溶液中，该溶液是将25mg的3-马来酰亚胺基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Aldrish)和5mg的二异丙基乙胺(Aldrish)溶解在0.2mL的DMF中所形成的溶液.反应混合物立即变浑浊，然后在几分钟之后变澄清。将溶液继续搅拌4小时.然后将溶液在高度真空下干燥.使用柱层析纯化结合了辛胺的马来酰亚胺丙酸酯，所使用的柱子是硅胶60(购自EMD Chemicals，以前叫做Science，Gibbstown，NJ)，洗脱液是DMF/醚。
将约12mg的上述产物置于5mL的圆底烧瓶中，加入50mg结合了半胱氨酸的D21肽(来自SynPep，Dublin，CA，SEQ ID NO：64)和0.5mL 0.1M pH 7.2的磷酸盐缓冲液.结合了半胱氨酸的D21肽具有3个甘氨酸残基，并在毛发结合D21肽(SEQ ID NO：46)的肽结合序列的末端结合了半胱氨酸.将混合物在室温继续搅拌6小时.使用水/醚提取纯化到最终产物，即C8-D21肽毛发调理剂.
实施例14
基于肽的炭黑毛发着色剂的制备
本实施例的目的是制备基于肽的炭黑毛发着色剂，其中所使用的炭黑是用乙醇胺进行了官能化的.使用化学分析方法估计出了结合到炭黑表面上的肽的数量。
酸官能化的炭黑颗粒的制备：
在1,000mL的烧杯中，加入25.5g的炭黑(Nipex-160-IQ，购自Degussa)、100g的过二硫酸铵[(NH4)2S2O8](纯度为98％，购自Aldrich)、333mL的1.0M的H2SO4(纯度为98％，GR级，购自EMDChemicals).将混合物在室温用磁力搅拌盘搅拌24小时.之后，将反应混合物转移到500mL的塑料离心管中，并在8,500rpm下离心20分钟。将澄清后的上清液去掉.产物用去离子水洗涤6次，每次洗涤后进行离心，收集产物.最终得到的产物是中性的(pH＝6.0)，然后进行冷冻干燥24小时.所得到的官能化炭黑颗粒的平均大小是100nm，是通过粒径分析仪测定的(Microtrac Ultrafine Particle Analyzer，Microtrac Inc.，Montgomeryvile，PA).
使用乙醇胺制备氨基官能化的炭黑：
将2g干燥的酸官能化炭黑、25mL的乙醇胺(纯度为99％，购自Aldrich)，和1mL的浓硫酸(H2SO4，纯度为98％，GR级，购自EMDChemicals)在100mL的圆底烧瓶中混合.用磁力搅拌器快速搅拌上述混合物，并回流6小时.在混合物冷却到室温后，向混合物中加入足够量的氢氧化铵(NH3含量为28.0-30.0％，购自EMD Chemicals)，以中和上述混合物.然后，按照实施例6所述的方法，将混合物离心，并用水洗涤。最终得到的产物是中性的(pH＝6.0)，并冷冻干燥24小时.该干燥的氨基官能化的炭黑易于在水中分散.
在DuPont Corporate Center for Analytical Science，使用ESCA法对官能化炭黑颗粒表面的成分进行了分析.在ESCA方法中，单能X-射线聚焦到材料的表面，激发表面原子.具有表面上部10nm内的元素能量特性的核和价层电子被喷射出来，分析它们的能量特性，从而获得表面成分的定性或定量信息.激发电子的动能提供了有关功能基团和表面种类氧化状态的信息.在该实施例中，所使用的X-射线源是镁阳极，能量为1253.6eV。样品在45度的出口角进行分析(样品厚度大约5-10nm).ESCA分析结果显示在表14中。乙醇胺官能化的炭黑表面主要组成为未反应的-COOH基团和-C(＝O)-OCH2CH2NH2基团.为了计算胺(y)与羧酸基团(x)的比例，对乙醇胺使用了一个简单的方程式，更具体地是y/(x+y)＝(N％/14)/(O％/32)。结果列于表14中。
表14
官能化炭黑的ESCA分析结果
  样品   C％   O％   N％   S％   -NH2/-COOH
  酸官能化炭黑   89   10   ND＊   0.1   0
  乙醇胺官能化炭黑   87   10   2.6   ND   1.47
＊ND表示未检测出
氨基官能化的炭黑与t-Boc-D21-肽的偶联：
然后将氨基官能化的炭黑与特定的毛发结合肽D21(SEQ IDNO：46)进行共价连接.按照实施例10所述的方法合成t-Boc保护的D21肽.然后，将氨基官能化炭黑(87mg)、t-Boc-D21-肽(80mg)和二环己基碳二亚胺(DCC)(22mg)加入到3mL的四氢呋喃(THF)中.将二甲基氨基吡啶(DMAP)(17μL)溶解在几滴THF中的溶液逐滴加入到上述混合物中，同时进行搅拌.将所得到的黑色悬浮液加热到40℃，保持6小时，并伴随着搅拌，然后在室温继续搅拌过夜.为了去除D21肽上的t-Boc保护基团，向上述产物中加入三氟乙酸(TFA)(0.6mL)，然后将混合物继续搅拌6小时.然后，向反应混合物中加入5mL去离子水.混合物在3,500rpm下离心2分钟，并将上清液轻轻倒出.用去离子水洗涤离心管中的固体残留物，并再次离心.重复进行洗涤步骤，直至上清液的pH值接近6.0.将黑色的残渣用冷冻干燥仪干燥2天，得到黑色粉末.
使用ESCA、元素分析、和TGA(热解重量分析法)分析了氨基官能化的炭黑颗粒和连接了肽的炭黑颗粒.分析结果表明用乙醇胺修饰的炭黑的有机层占总重量的大约12％.在D21肽与炭黑颗粒结合后，肽的重量百分比为18％-30％.因此，对于粒径为100nm的炭黑颗粒来说，在与乙醇胺反应后，在颗粒表面结合上了总量为9.5×104的分子，在与肽反应后，在颗粒表面结合上了总量为7,700的D21肽分子。计算在炭黑表面的肽密度，结果表明每个D21肽占4nm2的空间，这与结合于噬菌体的肽密度形成对比，后者约为12nm2。
实施例15
基于肽的炭黑毛发着色剂的特异性
本实施例的目的是验证D21肽-炭黑毛发着色剂的特异性.
按照实施例14所述的方法制备D21肽-炭黑着色剂.
将一块猪皮(10cm×10cm，购自当地超市)通过与30mL 30％的异丙醇混合10分钟进行清洗，然后用蒸馏水洗涤至少5次.风干后，将干净的猪皮浸入带有多个孔的平板固定器中，该容器中盛有下列溶液，50mg的D21肽-炭黑着色剂溶解在10mL的蒸馏水中.应用着色剂15分钟后，将猪皮用30％的洗发水溶液(Pantene Pro-V洗发水)洗涤3次，方法是将洗发水溶液滴入孔中，然后再将其倒出.最后将猪皮用蒸馏水漂洗5次.
按照上述处理猪皮的方法对一束普通白色毛发样品(购自International Hair Importers and Products，Bellerose，NY)，进行了相同的处理.
在进行完洗涤步骤后，猪皮的黑色非常轻，可以忽略不计，而毛发则是非常黑亮.上述结果表明D21肽-炭黑着色剂对毛发具有结合特异性，对皮肤则没有。
实施例16
肽-聚硅氧烷毛发调理剂的制备
本实施例的目的是合成D21肽-聚硅氧烷毛发调理剂.将D21肽(SEQ ID NO：46)的侧链反应功能团完全保护，以使得聚硅氧烷仅与肽的C-末端基团反应.另外，在结合序列的C-末端加上了一个三肽间隔基，该三肽间隔基由甘氨酸残基组成。
在5mL的圆底烧瓶中，将50mg完全被保护的D21肽：Fmoc-R(Pbf)T(tBu)N(Trt)AAD(OtBu)H(Trt)PAAVT(tBu)GGG(其中Fmoc表示芴基甲氧基羰基；Pbf表示2，2，6，4，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；tBu表示叔丁基；Trt表示三苯甲基；Otbu表示叔丁氧基)(分子量为2522，0.02mmol，纯度为95％，来自SynPep，Dublin，CA)(SEQ ID NO：78)溶解在1mL的二甲基甲酰胺(DMF，购自E.Merck，Darmstadt，德国)。在样品小瓶中，将聚硅氧烷流体2-8566(77mg)(N％＝0.875％，0.024mmol-NH2，购自Dow Corning，Midland，MI)溶解在2mL的THF(购自E.Merck)中，然后转移到含有肽溶液的圆底烧瓶中。然后，向烧瓶中加入5mg的二环己基碳二亚胺(DCC，0.024mmol)和5μL的二甲基氨基吡啶(DMAP)。用胶乳塞将烧瓶密封，然后在50℃将反应混合物搅拌5小时，之后在室温过夜.在反应完成后，将溶剂在真空下抽空。干燥后，得到122mg的固体产物。得率大约是90％.
将固体产物溶解在N，N-二甲基乙酰胺(DMAC，购自EMDChemicals)中，制得产物为5mg/mL的DMAC溶液，用于GPC(凝胶渗透色谱法)分析，进行折射率检测，从而确定分子量。最初的聚硅氧烷(Dow Corning 2-8566)是不溶于DMCA的，因此在层析谱的分离区内不能发现。D21肽是一个尖的低分子量峰，产物样品包含2个峰，一个是没有连接D21肽的峰，另一个是宽的峰，是聚硅氧烷嫁接上了D21肽的结果.以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)为标准计算了重量平均分子量(MW).D21肽和肽-聚硅氧烷调理剂的MW分别是4.7×103和4.4×104.
使用了切割试剂来切割D21肽侧链功能团的保护基团，切割试剂(称作试剂K)具有如下组成：三氟乙酸/H2O/苯硫基甲烷/乙二硫醇/酚(85∶5∶5∶2.5∶2.5体积比).首先将试剂K(1mL)预冷到-20℃，然后加入100mg的D21肽-聚硅氧烷调理剂.将混合物室温搅拌3-4小时，然后在高度真空下去掉试剂K.向混合物中加入61.2mg占DMF体积20％的哌啶DMF溶液，并搅拌30分钟，去除肽N-末端的Fmoc保护基团，之后在高真空下抽空。最终的产物在THF、DMF或DMAC中不能完全溶解。因为溶解度较低，因此不能对最终产物进行GPC分析。
实施例17
基于肽的毛发调理剂的效力
本实施例的目的是验证基于肽的毛发调理剂在降低人毛发纤维摩擦力方面的效力，并与市售的调理剂进行比较.对于毛发纤维集合(即多根纤维)来说，其梳理的性能在很大程度上取决于毛发纤维的摩擦.单根毛发纤维的摩擦力特性与毛发集合的梳理特性相关.纤维之间的摩擦研究表明施用调理剂能够改善毛发表面.纤维间的摩擦越小，则毛发看上去越光滑，感觉上也越光滑，并且在梳理时更加容易.在本实施例中所使用的测定纤维间摩擦的方法是几种毛发纤维试验的，该方法能够给出确定的定量数据，是工业上常用的方法.
将实施例12所述的由毛发结合肽(SEQ ID NO：46)与二十二醇共价连接组成的基于肽的毛发调节剂用于如下制剂中，该制剂由溶于蒸馏水中的0.25％的基于肽的调节剂和重量百分比为1.5％的PerformixTM卵磷脂(ADM Lecithin，Decatur，IL)组成.将上述水溶液在7000rpm下混合4分钟，使用的仪器是Silverson L4RT-A HighShear Laboratory Mixer(Silverson Machines，Inc。，East Longmeadow，MA)，混合时使用一个常规用途的裂解头(disintegrating uead)和一个0.95cm的微型管形支架。制备含量为0.5％的Dow Dow
Figure G2009101649831D00671
929阳离子乳剂(Dow Corning Corp.，Midland，MI)(市售的调理剂)蒸馏水溶液，混合条件与上述方法相同.
在试验前将欧洲人黑棕色毛发假发(International Hair Importersand Products)进行清洗，方法为将毛发浸入异丙醇中30分钟，然后用蒸馏水洗涤10次.将这些假发的单根毛发纤维送到Textile ResearchInstitute(TRI)，Princeton，NJ作摩擦测试.在TRI，将毛发纤维浸入调理剂溶液中5分钟，温度大约为35℃，不要搅拌.之后，在微温的水中漂洗1分钟，然后在21℃、65％相对湿度下过夜干燥.
按照Kamath等(J.Appl.Polymer Sci.，85：394-414(2002))的方法，使用单根纤维摩擦仪通过纤维间摩擦试验，对经过处理的毛发纤维作摩擦力测量.使用Instron拉伸测试仪(Tensile Testing machine)，在高正交力(高负荷)(0.74g)下估计了毛发纤维对镀铬钢丝的摩擦力，十字头速度是1mm/分钟.使用TRI/ScanTM Surface Force Analyzer(Textile Research Institute)在低正交力(低负荷)(8.5mg)下，测量对另外一根毛发纤维的摩擦力.该仪器能够用
Figure G2009101649831D00681
微量天平测量出很小的力(质量分辨率为0.1mg)并且有一个计算机控制平台.测试结果显示在表15中.
表15
摩擦力测量结果
两种情况下的结果表明，使用基于肽的调理剂处理后的毛发，其平均摩擦力小于用Dow
Figure G2009101649831D00683
929阳离子乳剂调理剂处理的毛发.随后，对用1.5％卵磷脂调理后的样品进行了纤维摩擦力测试(低负荷)，平均摩擦力为3.366mg，这表明基于肽的调理剂所具有的调理效果不是因为在制剂中存在卵磷脂的原故。该结果验证了本发明的基于肽的毛发调理剂所具有的效果.
实施例18
基于肽的毛发着色剂的制备
本实施例的目的是，通过使D21毛发结合肽(SEQ ID NO：46)共价结合到Disperse Orange 3染料上，制备基于肽的毛发着色剂.首先用异氰酸酯官能化染料，然后与D21肽反应。
Disperse Orange 3的官能化：
在干燥箱中，将14.25g Disperse Orange 3(Aldrich)悬浮于在加料漏斗中的400mL干THF中.将200mL干甲苯装入含有磁力搅棒的2-升、四颈反应烧瓶(Corning Inc.，Corning，NY；part no.1533-12).给烧瓶配备冷指形冷凝管(Corning Inc.，part no.1209-04)和具有加料漏斗的第二个冷指形冷凝管，并置于通风柜中的油浴上.
在室温，将光气(25.4mL)浓缩在反应烧瓶中.添加完光气后，使油浴的温度升高到80℃，经2小时，以100mL的增量，将Disperse Orange3悬浮液逐滴加入反应烧瓶，同时监视反应温度和洗涤器排出的气体。在加料过程中，将温度维持在64℃或低于64℃.完成加料后，将反应物在64℃加热1小时，然后搅拌过夜，冷却至室温.
将反应溶剂真空蒸馏至干燥，同时将内容物维持在40℃或低于40℃，并将真空另外维持1小时.将反应烧瓶转移至干燥箱；收集产物，过夜干燥(15.65g)。通过质子NMR，证实目标产物.
将异氰酸酯官能化的染料与D21毛发结合肽相偶联：
将如上所述制备的异氰酸酯官能化的Disperse Orange 3[(2-(4-异氰酸基苯基)-1-(4-硝基苯基)二氮烯)(16mg)溶于5mL DMF中，并加入含有75mg未保护的D21肽(SEQ ID NO：46)的溶液中，所述D21肽购自SynPep，且溶解在10mL DMF中。在室温搅拌溶液24小时.蒸发溶剂，产生91mg紫色粉末.通过MALDI质谱法分析产物，发现具有1766g/mol的分子量，这与染料分子与肽的共价结合相一致。
实施例19
使用生物淘选选择牙齿结合肽
本预示实施例的目的是，描述如何鉴别以高亲和力结合牙齿的噬菌体肽.
如下清洗可以从牙科诊所得到的拔出的人牙齿：用肥皂溶液刷涂，用去离子水漂洗，并在室温晾干.将牙齿置于15mL离心试管(CorningInc.，Acton，MA)中，每个试管一个牙齿.用由在TBST-0.5％中的1mg/mL BSA组成的封闭缓冲液，处理牙齿样品1h，然后用TBST-0.5％洗涤.将牙齿样品与噬菌体文库(Ph.D-12噬菌体展示肽文库试剂盒)一起温育，并使用与实施例1所述相同的条件，洗涤10次。实施例1所述的酸洗脱步骤后，用洗脱缓冲液再洗涤牙齿样品3次，然后用TBST-0.5％洗涤3次。使用酸处理的、仍然结合抗酸的噬菌体肽的牙齿，直接感染实施例2所述的大肠杆菌ER2738细胞.使扩增的和分离的噬菌体接触新鲜的牙齿样品，再重复生物淘选过程2次.第三轮生物淘选后，使用酸处理的牙齿直接感染大肠杆菌ER2738细胞，并如实施例1所述培养细胞。随机挑选单个的黑色噬菌斑用于DNA分离和序列分析。如实施例1所述，根据制造商(New England Labs)的使用说明书来制备单噬菌斑裂解物，使用QIAprep Spin M13试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化噬菌体单链基因组DNA，并使用96gIII测序引物进行测序.
鉴别出的肽序列对牙齿具有结合亲和力.如实施例6所述，确定鉴别出的牙齿结合肽的结合特异性和亲和力.
实施例20
基于肽的牙齿增白剂的制备
本预示实施例的目的是，描述如何通过将牙齿结合肽与白色素，即二氧化钛相偶联，制备基于肽的牙齿增白剂.
用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(可从Aldrich得到)在无水丙酮中的溶液，处理平均粒度小于2μm的干二氧化钛(可从E.I.du Pont deNemours和Co.，Wilmington，DE得到)，以将氨基共价结合到二氧化钛表面上。在离心沉降颗粒后，通过倾析去除多余的试剂.然后用足够的戊二醛(可从Sigma Chemical Co.得到)处理得到的颗粒，以与表面结合的氨基反应。
使用实施例19所述的方法鉴别出的牙齿结合肽，是从SynPep得到.牙齿结合肽序列在C-末端以1-5个赖氨酸残基封端.然后，将牙齿结合肽加入戊二醛-处理的二氧化钛颗粒，并通过肽上的胺基，共价偶联到戊二醛的不含侧基的醛基上.
序列表
<110>E.I.du Pont de Nemours and Company
<120>用于个人护理的基于肽的体表试剂
<130>CL2296
<160>104
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>1
Leu Glu Ser Thr Pro Lys Met Lys
1               5
<210>2
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤结合肽
<400>2
Phe Thr Gln Ser Leu Pro Arg
1               5
<210>3
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>3
Ser Val Ser Val Gly Met Lys Pro Ser Pro Arg Pro
1               5                   10
<210>4
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>4
Leu Asp Val Glu Ser Tyr Lys Gly Thr Ser Met Pro
1               5                   10
<210>5
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽.
<400>5
Arg Val Pro Asn Lys Thr Val Thr Val Asp Gly Ala
1               5                   10
<210>6
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>6
Asp Arg His Lys Ser Lys Tyr Ser Ser Thr Lys Ser
1               5                   10
<210>7
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>7
Lys Asn Phe Pro Gln Gln Lys Glu Phe Pro Leu Ser
1               5                   10
<210>8
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>8
Gln Arg Asn Ser Pro Pro Ala Met Ser Arg Arg Asp
1               5                   10
<210>9
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>9
Thr Arg Lys Pro Asn Met Pro His Gly Gln Tyr Leu
1               5                   10
<210>10
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>10
Lys Pro Pro His Leu Ala Lys Leu Pro Phe Thr Thr
1               5                   10
<210>11
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>11
Asn Lys Arg Pro Pro Thr Ser His Arg Ile His Ala
1               5                   10
<210>12
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>12
Asn Leu Pro Arg Tyr Gln Pro Pro Cys Lys Pro Leu
1               5                   10
<210>13
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>13
Arg Pro Pro Trp Lys Lys Pro Ile Pro Pro Ser Glu
1               5                   10
<210>14
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>14
Arg Gln Arg Pro Lys Asp His Phe Phe Ser Arg Pro
1               5                   10
<210>15
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa＝Thr或Pro
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>Xaa＝Glu或Ala
<400>15
Ser Val Pro Asn Lys Xaa Val Thr Val Asp Gly Xaa
1               5                   10
<210>16
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>16
Thr Thr Lys Trp Arg His Arg Ala Pro Val Ser Pro
1               5                   10
<210>17
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>17
Trp Leu Gly Lys Asn Arg Ile Lys Pro Arg Ala Ser
1               5                   10
<210>18
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>18
Ser Asn Phe Lys Thr Pro Leu Pro Leu Thr Gln Ser
1               5                   10
<210>19
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>19
Lys Glu Leu Gln Thr Arg Asn Val Val Gln Arg Glu
1               5                   10
<210>20
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>20
Thr Pro Thr Ala Asn Gln Phe Thr Gln Ser Val Pro
1               5                   10
<210>21
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>21
Ala Ala Gly Leu Ser Gln Lys His Glu Arg Asn Arg
1               5                   10
<210>22
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>22
Glu Thr Val His Gln Thr Pro Leu Ser Asp Arg Pro
1               5                   10
<210>23
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>23
Leu Pro Ala Leu His Ile Gln Arg His Pro Arg Met
1               5                   10
<210>24
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>24
Gln Pro Ser His Ser Gln Ser His Asn Leu Arg Ser
1               5                   10
<210>25
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>25
Arg Gly Ser Gln Lys Ser Lys Pro Pro Arg Pro Pro
1               5                   10
<210>26
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>26
Thr His Thr Gln Lys Thr Pro Leu Leu Tyr Tyr His
1               5                   10
<210>27
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>27
Thr Lys Gly Ser Ser Gln Ala Ile Leu Lys Ser Thr
1               5                   10
<210>28
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>28
Asp Leu His Thr Val Tyr His
1               5
<210>29
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>29
His Ile Lys Pro Pro Thr Arg
1               5
<210>30
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>30
His Pro Val Trp Pro Ala Ile
1               5
<210>31
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>31
Met Pro Leu Tyr Tyr Leu Gln
1               5
<210>32
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>32
His Leu Thr Val Pro Trp Arg Gly Gly Gly Ser Ala Val Pro Phe Tyr
1               5                   10                  15
Ser His Ser Gln Ile Thr Leu Pro Asn His
            20                  25
<210>33
<211>41
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>33
Gly Pro His Asp Thr Ser Ser Gly Gly Val Arg Pro Asn Leu His His
1               5                   10                  15
Thr Ser Lys Lys Glu Lys Arg Glu Asn Arg Lys Val Pro Phe Tyr Ser
            20                  25                  30
His Ser Val Thr Ser Arg Gly Asn Val
        35                  40
<210>34
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>34
Lys His Pro Thr Tyr Arg Gln
1               5
<210>35
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>35
His Pro Met Ser Ala Pro Arg
1               5
<210>36
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>36
Met Pro Lys Tyr Tyr Leu Gln
1               5
<210>37
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>37
Met His Ala His Ser Ile Ala
1               5
<210>38
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>38
Thr Ala Ala Thr Thr Ser Pro
1               5
<210>39
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>39
Leu Gly Ile Pro Gln Asn Leu
1               5
<210>40
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>40
Ala Lys Pro Ile Ser Gln His Leu Gln Arg Gly Ser
1               5                   10
<210>41
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>41
Ala Pro Pro Thr Pro Ala Ala Ala Ser Ala Thr Thr
1               5                   10
<210>42
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>42
Asp Pro Thr Glu Gly Ala Arg Arg Thr Ile Met Thr
1               5                   10
<210>43
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>43
Glu Gln Ile Ser Gly Ser Leu Val Ala Ala Pro Trp
1               5                   10
<210>44
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>44
Leu Asp Thr Ser Phe Pro Pro Val Pro Phe His Ala
1               5                   10
<210>45
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>45
Leu Pro Arg Ile Ala Asn Thr Trp Ser Pro Ser
1               5                   10
<210>46
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>46
Arg Thr Asn Ala Ala Asp His Pro Ala Ala Val Thr
1               5                   10
<210>47
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>47
Ser Leu Asn Trp Val Thr Ile Pro Gly Pro Lys Ile
1               5                   10
<210>48
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>48
Thr Asp Met Gln Ala Pro Thr Lys Ser Tyr Ser Asn
1               5                   10
<210>49
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>49
Thr Ile Met Thr Lys Ser Pro Ser Leu Ser Cys Gly
1               5                   10
<210>50
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>50
Thr Pro Ala Leu Asp Gly Leu Arg Gln Pro Leu Arg
1               5                   10
<210>51
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>51
Thr Tyr Pro Ala Ser Arg Leu Pro Leu Leu Ala Pro
1               5                   10
<210>52
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>52
Ala Lys Thr His Lys His Pro Ala Pro Ser Tyr Ser
1               5                   10
<210>53
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽和指甲结合肽
<400>53
Tyr Pro Ser Phe Ser Pro Thr Tyr Arg Pro Ala Phe
1               5                   10
<210>54
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>54
Thr Asp Pro Thr Pro Phe Ser Ile Ser Pro Glu Arg
1               5                   10
<210>55
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>55
Cys Ala Ala Gly Cys Cys Thr Cys Ala Gly Cys Gly Ala Cys Cys Gly
1               5                   10                  15
Ala Ala Thr Ala
            20
<210>56
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>56
Trp His Asp Lys Pro Gln Asn Ser Ser Lys Ser Thr
1               5                   10
<210>57
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>57
Asn Glu Val Pro Ala Arg Asn Ala Pro Trp Leu Val
1               5                   10
<210>58
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>58
Asn Ser Pro Gly Tyr Gln Ala Asp Ser Val Ala Ile Gly
1               5                   10
<210>59
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>59
Thr Gln Asp Ser Ala Gln Lys Ser Pro Ser Pro Leu
1               5                   10
<210>60
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>指甲结合肽
<400>60
Ala Leu Pro Arg Ile Ala Asn Thr Trp Ser Pro Ser
1               5                   10
<210>61
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤结合肽
<400>61
Thr Pro Phe His Ser Pro Glu Asn Ala Pro Gly Ser
1               5                   10
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>62
ccctcatagt tagcgtaacg    20
<210>63
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>控制肽
<400>63
Lys His Gly Pro Asp Leu Leu Arg Ser Ala Pro Arg
1               5                   10
<210>64
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>半胱氨酸连接的毛发结合肽
<400>64
Arg Thr Asn Ala Ala Asp His Pro Ala Ala Val Thr Gly Gly Gly Cys
1               5                   10                  15
<210>65
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>胱天蛋白酶3剪切位点
<400>65
Leu Glu Ser Gly Asp Glu Val Asp
1               5
<210>66
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>66
Thr Pro Pro Glu Leu Leu His Gly Asp Pro Arg Ser
1               5                   10
<210>67
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>67
caagcctcag cgaccgaata    20
<210>68
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>68
cgtaacactg agtttcgtca cca    23
<210>69
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>69
Thr Pro Pro Thr Asn Val Leu Met Leu Ala Thr Lys
1               5                   10
<210>70
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>70
Asn Thr Ser Gln Leu Ser Thr
1               5
<210>71
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>生物素化的毛发结合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>生物素化的
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>酰胺化的
<400>71
Arg Thr Asn Ala Ala Asp His Pro Ala Ala Val Thr Lys Cys
1               5                   10
<210>72
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>生物素化的毛发结合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>生物素化的
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>酰胺化的
<400>72
Ala Leu Pro Arg Ile Ala Asn Thr Trp Ser Pro Ser Lys Cys
1               5                   10
<210>73
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>生物素化的毛发结合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>生物素化的
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>酰胺化的
<400>73
Thr Pro Pro Glu Leu Leu His Gly Asp Pro Arg Ser Lys Cys
1               5                   10
<210>74
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>生物素化的皮肤结合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>生物素化的
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>酰胺化的
<400>74
Thr Pro Phe His Ser Pro Glu Asn Ala Pro Gly Ser Lys Cys
1               5                   10
<210>75
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>完全保护的毛发结合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>芴基甲氧基羰基(Fmoc)-保护的
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>2，2，6，4，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>叔丁基
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>三苯甲基
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>叔丁氧基
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>三苯甲基
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>叔丁基
<400>75
Arg Thr Asn Ala Ala Asp His Pro Ala Ala Val Thr Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
<210>76
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>76
Asn Thr Pro Lys Glu Asn Trp
1               5
<210>77
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>77
Asn Thr Pro Ala Ser Asn Arg
1               5
<210>78
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>78
Pro Arg Gly Met Leu Ser Thr
1               5
<210>79
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>79
Pro Pro Thr Tyr Leu Ser Thr
1               5
<210>80
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>80
Thr Ile Pro Thr His Arg Gln His Asp Tyr Arg Ser
1               5                   10
<210>81
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>81
Thr Pro Pro Thr His Arg Leu
1               5
<210>82
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>82
Leu Pro Thr Met Ser Thr Pro
1               5
<210>83
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>83
Leu Gly Thr Asn Ser Thr Pro
1               5
<210>84
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>84
Thr Pro Leu Thr Gly Ser Thr Asn Leu Leu Ser Ser
1               5                   10
<210>85
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>85
Thr Pro Leu Thr Lys Glu Thr
1               5
<210>86
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>86
Gln Gln Ser His Asn Pro Pro
1               5
<210>87
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>87
Thr Gln Pro His Asn Pro Pro
1               5
<210>88
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>88
Ser Thr Asn Leu Leu Arg Thr Ser Thr Val His Pro
1               5                   10
<210>89
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>89
His Thr Gln Pro Ser Tyr Ser Ser Thr Asn Leu Phe
1               5                   10
<210>90
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>90
Ser Leu Leu Ser Ser His Ala
1               5
<210>91
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>91
Gln Gln Ser Ser Ile Ser Leu Ser Ser His Ala Val
1               5                   10
<210>92
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>92
Asn Ala Ser Pro Ser Ser Leu
1               5
<210>93
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>93
His Ser Pro Ser Ser Leu Arg
1               5
<210>94
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝His，Arg，或Asn
<400>94
Lys Xaa Ser His His Thr His
1               5
<210>95
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝His，Arg，或Asn
<400>95
Glu Xaa Ser His His Thr His
1               5
<210>96
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>96
Leu Glu Ser Thr Ser Leu Leu
1               5
<210>97
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>97
Thr Pro Leu Thr Lys Glu Thr
1               5
<210>98
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发结合肽
<400>98
Lys Gln Ser His Asn Pro Pro
1               5
<210>99
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤结合序列
<400>99
Lys Gln Ala Thr Phe Pro Pro Asn Pro Thr Ala Tyr
1               5                   10
<210>100
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤结合肽
<400>100
His Gly His Met Val Ser Thr Ser Gln Leu Ser Ile
1               5                   10
<210>101
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤结合肽
<400>101
Leu Ser Pro Ser Arg Met Lys
1               5
<210>102
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤结合肽
<400>102
Leu Pro Ile Pro Arg Met Lys
1               5
<210>103
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤结合肽
<400>103
His Gln Arg Pro Tyr Leu Thr
1               5
<210>104
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤结合肽
<400>104
Phe Pro Pro Leu Leu Arg Leu
1               5

Claims (33)

1.如SEQ ID NO：61所述的皮肤结合肽。
2.二嵌段的、基于肽的体表试剂，其具有通式结构(BSBP)n-BA，其中
a)BSBP是体表结合肽；
b)BA是有益试剂；且
c)n的范围为1至约10,000。
3.三嵌段的、基于肽的体表试剂，其具有通式结构[(BSBP)m-S]n-BA，其中
a)BSBP是体表结合肽；
b)BA是有益试剂；
c)S是间隔基；
d)m的范围为1至约50；且
e)n的范围为1至约10,000。
4.根据权利要求2或3的体表试剂，其中所述体表结合肽结合皮肤。
5.根据权利要求4的体表试剂，其中所述体表包含上皮细胞层。
6.根据权利要求4的体表试剂，其中所述体表包含内皮细胞层。
7.根据权利要求2或3的体表试剂，其中所述有益试剂选自着色剂，和调理剂。
8.根据权利要求7的体表试剂，其中所述调理剂选自收敛剂，剥脱剂；软化剂；湿润剂，和闭塞剂。
9.根据权利要求7的体表试剂，其中所述调理剂是选自下述的皮肤调理剂：α-羟基酸、β-羟基酸、多元醇、透明质酸、D，L-泛醇、聚水杨酸酯、维生素A棕榈酸酯、维生素E乙酸酯、甘油、山梨糖醇、硅酮、硅酮衍生物、羊毛脂、天然油和甘油三酯。
10.二嵌段的、基于肽的皮肤调理剂，其具有通式结构(SBP)n-SCA，其中
a)SBP是皮肤结合肽；
b)SCA是皮肤调理剂；且
c)n的范围为1至约1,000。
11.二嵌段的、基于肽的皮肤着色剂，其具有通式结构(SBP)n-C，其中
a)SBP是皮肤结合肽；
b)C是着色剂；且
c)n的范围为1至约10,000。
12.三嵌段的、基于肽的皮肤调理剂，其具有通式结构[(SBP)m-S]n-SCA，其中
a)SBP是毛发结合肽；
b)SCA是皮肤调理剂；
c)S是间隔基；
d)m的范围为1至约50；且
e)n的范围为1至约1,000。
13.三嵌段的、基于肽的皮肤着色剂，其具有通式结构[(SBP)m-S]n-C，其中
a)SBP是毛发结合肽；
b)C是着色剂；
c)S是间隔基；
d)m的范围为1至约50；且
e)n的范围为1至约10,000。
14.根据权利要求10-13中的任一项的调理剂或着色剂，其中所述皮肤结合肽具有约7至约25个氨基酸，并且对皮肤具有以MB50计等于或小于10-5M的结合亲和力。
15.根据权利要求14的调理剂或着色剂，其中通过包含下述步骤的方法分离所述皮肤结合肽：
(i)提供组合产生的噬菌体-肽的文库；
(ii)使(i)的文库接触皮肤样品，形成反应溶液，该溶液包含：
(A)噬菌体-肽-皮肤复合物；
(B)未结合的皮肤，和
(C)未形成复合物的肽；
(iii)分离(ii)的噬菌体-肽-皮肤复合物；
(iv)从(iii)的分离的肽复合物，洗脱微弱结合的肽；
(v)通过如下方法鉴别仍然结合的噬菌体-肽：用经过步骤(iv)后保留下来的噬菌体-肽-皮肤复合物直接进行聚合酶链式反应，或用经过步骤(iv)后保留下来的噬菌体-肽-皮肤复合物直接感染细菌宿主细胞，在合适的生长培养基中生长感染的细胞，并从生长细胞中分离和鉴别噬菌体-肽。
16.权利要求10-13中的任一项的基于肽的调理剂或着色剂，其中所述肽具有约7至约45个氨基酸。
17.权利要求10-13中的任一项的基于肽的调理剂或着色剂，其中所述肽具有约7至约20个氨基酸。
18.权利要求10-13中的任一项的基于肽的调理剂或着色剂，其中所述肽还包含在该肽序列的至少一个末端上的半胱氨酸残基。
19.权利要求10-13的基于肽的皮肤调理剂或基于肽的皮肤着色剂，其中所述皮肤结合肽具有选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO：2，61，99-103，和104。
20.权利要求10或12的基于肽的皮肤调理剂，其中所述皮肤调理剂选自：聚水杨酸酯、丙二醇、甘油、羟基乙酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、葡糖二酸、半乳糖二酸、3-羟基戊酸、水杨酸、二氧化钛纳米颗粒，和1，3丙二醇。
21.权利要求11或13的基于肽的皮肤着色剂，其中所述着色剂选自D&C Red No.21，D&C Red No.27，D&C Red Orange No.5，D&CRed No.21，D&C Orange Nos.10，二氧化钛，氧化锌，D&C Red No.36，D&C Orange No.17，D&C Red Nos.7、11、31和34的钙色淀，D&C RedNo.12的钡色淀，D&C Red No.13的锶色淀，FD&CYellow No.5的铝色淀，FD&CYellow No.6的铝色淀，D&C Red No.27的铝色淀，D&CRed No.21的铝色淀，FD&C Blue No.1的铝色淀，氧化铁，二氧化钛纳米颗粒，锰紫，氧化铬，群青蓝，炭黑，和二羟基丙酮。
22.权利要求12或13的基于肽的调理剂或着色剂，其中所述间隔基选自：乙醇胺、乙二醇、链长为6个碳原子的聚乙烯、具有3-6个重复单元的聚乙二醇、苯氧乙醇、丙醇酰胺、丁二醇、丁二醇酰胺、丙基苯基链、乙基烷基链、丙基烷基链、己基烷基链、甾醇基烷基链、十六烷基烷基链和棕榈酰基烷基链。
23.权利要求12或13的基于肽的调理剂或着色剂，其中所述间隔基是包含选自下述的氨基酸的肽：甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，和其混合物。
24.权利要求12或13的基于肽的调理剂或着色剂，其中所述间隔基是包含如SEQ ID NO：65所述的氨基酸序列的肽。
25.皮肤护理组合物，其包含有效量的权利要求10或12的基于肽的皮肤调理剂。
26.化妆品组合物，其包含有效量的权利要求11或13基于肽的皮肤着色剂。
27.产生高亲和力皮肤结合肽的方法，包含：
a)提供组合产生的噬菌体-肽的文库；
b)使(a)的文库接触体表样品，形成反应溶液，该溶液包含：
(i)噬菌体-肽-皮肤样品复合物；
(ii)未结合的皮肤样品，和
(iii)未形成复合物的肽；
c)分离(b)的噬菌体-肽-皮肤样品复合物；
d)从(c)的分离的噬菌体-肽复合物，洗脱微弱结合的噬菌体-肽；
e)用经过步骤(d)后保留下来的噬菌体-肽-皮肤样品复合物，直接感染细菌宿主细胞；
f)在合适的生长培养基中，生长步骤(e)的受感染的细胞；和
g)从步骤(f)的生长细胞，分离和鉴别噬菌体-肽，其中所述噬菌体-肽具有对体表的高结合亲和力。
28.在皮肤或嘴唇上形成基于肽的调理剂的保护层的方法，包含将权利要求25的组合物施用于皮肤或嘴唇，使所述的保护层形成。
29.使皮肤或嘴唇着色的方法，包含将权利要求26的化妆品组合物施用于皮肤或嘴唇。
30.权利要求29的方法，其中所述组合物施用于皮肤或嘴唇约5秒至约60秒。
31.在皮肤或嘴唇上形成保护层的方法，包含下述步骤：
a)提供皮肤护理组合物，其包含选自下述的皮肤调理剂：
i)(SBP)n-SCA；和
ii)[(SBP)m-S]k-SCA
其中
1)SBP是皮肤结合肽；
2)SCA是皮肤调理剂；
3)n的范围为1至约1,000；
4)S是间隔基；
5)m的范围为1至约50；且
6)k的范围为1至约1,000；
且其中通过包含下述步骤的方法选择皮肤结合肽：
A)提供组合产生的噬菌体-肽的文库；
B)使(A)的文库接触皮肤样品，形成反应溶液，该溶液包含：
(i)噬菌体-肽-皮肤复合物；
(ii)未结合的皮肤，和
(iii)未形成复合物的肽；
C)分离(B)的噬菌体-肽-皮肤复合物；
D)从(C)的分离的肽复合物，洗脱微弱结合的肽；
E)通过如下方法鉴别仍然结合的噬菌体-肽：使用经过步骤(D)后保留下来的噬菌体-肽-皮肤复合物直接进行聚合酶链式反应，或用经过步骤(D)后保留下来的噬菌体-肽-皮肤复合物直接感染细菌宿主细胞，在合适的生长培养基中生长感染的细胞，并从生长细胞中分离和鉴别噬菌体-肽，其中噬菌体-肽具有约7-约25个氨基酸，并且对皮肤具有以MB50计等于或小于10-5M的结合亲和力；和
b)将(a)的皮肤调理剂施用于皮肤或嘴唇，使所述的保护层形成。
32.使皮肤或嘴唇着色的方法，包含下述步骤：
a)提供化妆品组合物，其包含选自下述的皮肤着色剂：
i)(SBP)n-C；和
ii)[(SBP)m-S]k-C
其中
1)SBP是皮肤结合肽；
2)C是着色剂；
3)n的范围为1至约10,000；
4)S是间隔基；
5)m的范围为1至约50；且
6)k的范围为1至约10,000；
且其中通过包含下述步骤的方法选择皮肤结合肽：
A)提供组合产生的噬菌体-肽的文库；
B)使(A)的文库接触皮肤样品，形成反应溶液，该溶液包含：
(i)噬菌体-肽-皮肤复合物；
(ii)未结合的皮肤，和
(iii)未形成复合物的肽；
C)分离(B)的噬菌体-肽-皮肤复合物；
D)从(C)的分离的肽复合物，洗脱微弱结合的肽；
E)通过如下方法鉴别仍然结合的噬菌体-肽：使用经过步骤(D)后保留下来的噬菌体-肽-皮肤复合物直接进行聚合酶链式反应，或用经过步骤(D)后保留下来的噬菌体-肽-皮肤复合物直接感染细菌宿主细胞，在合适的生长培养基中生长感染的细胞，并从生长细胞中分离和鉴别噬菌体-肽，其中噬菌体-肽具有约7至约25个氨基酸，并且对皮肤具有以MB50计等于或小于10-5M的结合亲和力；和
b)将(a)的皮肤着色剂施用于皮肤或嘴唇。
33.根据权利要求31-32中的任一项的方法，其中组合产生的噬菌体-肽的文库选自Ph.D.-12噬菌体展示文库和Ph.D.-7噬菌体展示文库。
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