CN101379195B - 含有不同长度回文片段的回文免疫调节性寡核苷酸(imotm)的免疫刺激活性 - Google Patents

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Abstract

本发明提供回文免疫调节性核酸。本发明还提供用于产生、增强和修饰免疫应答的方法，所述免疫应答由用于免疫治疗应用的回文免疫调节性化合物引起。

Description

含有不同长度回文片段的回文免疫调节性寡核苷酸(IMOTM)的免疫刺激活性
相关申请
本申请要求2005年12月20日提交的美国临时申请流水号60/752,336的权益。将上述申请教导的全部内容并入本文作为参考。
发明背景
发明领域
本发明涉及化学修饰的回文寡核苷酸类似物的免疫刺激。
相关领域概述
Kuramoto et al.，Jpn.J.Cancer Res.83：1128-1131(1992)教导了包含带有CpG二核苷酸的回文结构的磷酸二酯寡核苷酸能够诱导α干扰素和γ干扰素的合成，并可增强天然杀伤活性(natural killer activity)。Tokunaga et al.，J.Natl.Cancer Inst.72(1984)955-96.Pisetsky et al.；Reich et al.，Mol.Biol.Rep.18(1993)217-221；Krieg et al.，Yi et al.，Nature 374(1995)546-549和Sato et al.，Science 273(1996)352-354教导在特定的序列背景中含有未甲基化CpG二核苷酸的细菌DNA、合成寡脱氧核苷酸和DNA疫苗(CpG DNA)能活化脊椎动物免疫系统。
Toll-样受体(TLR)作为感染的感应器发挥功能，诱导先天性和适应性免疫应答的活化。TLR识别多种配体，称为病原体相关性分子图式(pathogen-associated molecular pattern；PAMP)。一旦识别了保守的病原体相关性分子产物，TLR通过它们的胞内信号传导结构域——Toll/白细胞介素-1受体(TIR)结构域和下游适配体蛋白MyD88来活化宿主防御应答。树突细胞和巨噬细胞通常响应于(它们也会产生)Toll-样受体(TLR)配体和细胞因子(例如，白细胞介素-1β；IL-6和肿瘤坏死因子，TNF)；天然杀伤(NK)细胞和T细胞还参与促炎回路(pro-inflammatory circuit)。在细菌化合物刺激TLR之后，天然免疫细胞释放一系列细胞因子和趋化因子。一些TLR配体的实例包括，但不限于，脂蛋白；肽聚糖、酵母聚糖(TLR2)、双链RNA、聚I：聚C(TLR3)、脂多糖、热激蛋白、紫杉醇(TLR4)、鞭毛蛋白(TLR5)和咪唑喹啉-R848、瑞喹莫德、咪喹莫特；ssRNA(TLR7/8)、β-淋巴细胞(TLR10)和profilium样分子和尿病原性大肠杆菌(uropathogenic E.coli)(TLR11)。
Krieg et al.，Annu.Rev.Immunol.20(2002)709-760；Dalpke et al.，Biol.Chem.383(2002)1491-1500和Kandimalla et al.，Curr.Opin.Mol.Ther.4(2002)122-129教导CpG DNA诱导天然免疫细胞产生Th1细胞因子，Th1细胞因子促进细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，并且促进B细胞产生免疫球蛋白。CpGDNA的免疫刺激特性使得它们不但可以在免疫治疗中用作佐剂，还可以用作治疗剂，用于广谱的疾病适应征，包括癌症、病毒和细菌感染、炎性病症。
除化学修饰之外，许多结构上的修饰影响CpG DNA的活性。Kandimallaet al.，Nucleic Acids Res.30(2002)4460-4469教导，通过3’-3’-联结的、含有两个游离的易接近5’端的CpG DNA与含有多个拷贝CpG基序和单一5’端的常规CpG DNA相比具有较高的活性。
Kandimalla et al，Biochem.Biophys.Res.Commun.306(2003)948-953教导，CpG DNA中二级结构的存在显著影响它们的活性，这依赖于二级结构的位置和性质，5’-端发夹结构的存在消除了刺激活性，而位于3’-端的相同结构对免疫活性影响不显著，但是导致IL-6分泌的降低，并且有助于提高核酸酶的稳定性。
本领域技术人员会认为，将回文结构引入免疫刺激性寡核苷酸可能产生具有不良的蛋白结合特性的分子。例如，Liang et al.，Mol.Cell.Biol.16(7)：3773-3780(1996)显示，对于GAL4而言，在17-bp DNA识别位点末端的回文CGG三联体对紧密结合至关重要，而GAL4的相关分子PPR1也可识别其12-bp DNA识别序列末端的回文CGG三联体。另外，Nguyen et al.，J Biol Chem.275：15466-15473(2000)显示，hNQO1 ARE/EpRE DNA识别基序内的回文序列对于结合Nrf2/MafK异源二聚体是必要的，并且不会被rGSTA2的ARE/EpRE序列(其不含回文序列)竞争。在将那些寡核苷酸用于免疫刺激组合物时，这种蛋白对寡核苷酸的结合被认为是限制因素。然而，通过将化学修饰的回文结构引入免疫调节性寡核苷酸和/或3’-3’连接化学修饰的回文免疫调节性寡核苷酸，能够产生具有理想的免疫调节特性的分子，而没有天然的线性回文结构的不足。
因此，仍需要开发这样的含有回文结构的化合物，其通过TLR调节免疫应答，但是不受含有未修饰回文片段的线性寡核苷酸的问题困扰。
发明简述
在第一个方面，本发明提供免疫调节性寡核苷酸，其具有选自如下所列的结构：
5’-TCG1TCG1TTCTC-Y-G1CTTG1CAAG1CT-5’，
5’-TCG1TCG1TTCTC-Y-GAG1CTTG1CAAG1CTCT-5’，
5’-TCG1TCG1TTCTC-Y-GAGAG1CTTG1CAAG1CTCTCT-5’，
5’-TCG1TCG1TTCTC-Y-GCCGCGCGGC-5’，
5’-TCG1TCG1TTAGA-Y-TG1CTG1CT-5’，或
5’-TCG1TCG1TTC-Y-G1CTTG1CAAG1CT-5’；
其中X是甘油接头，Y是C3-接头，G1是7-脱氮鸟苷。
在第二个方面，本发明提供药物组合物。这些组合物包含本发明公开的任意组合物和可药用载体。
在第三个方面，本发明提供用于在脊椎动物中产生免疫应答的方法。这种方法包括对脊椎动物单独或组合地施用本发明第一个和第二个方面公开的任意一种组合物。本文公开的组合物可通过任何合适的施用途径来施用，包括但不限于非消化道、口服、舌下、经皮、局部、粘膜、吸入、鼻内、气溶胶、眼内、气管内、直肠内、阴道、基因枪、皮肤贴片、滴眼剂和漱口剂。
在第五个方面，本发明提供用于治疗患有癌症、自身免疫病症、气道炎症、炎性病症、皮肤病症、变态反应、哮喘或病原体引起的疾病的脊椎动物的方法。这种方法包括对脊椎动物以药理有效量单独或组合地施用本发明第一个和第二个方面公开的任意一种组合物。本文公开的组合物可通过任何合适的施用途径来施用，包括但不限于非消化道、口服、舌下、经皮、局部、粘膜、吸入、鼻内、气溶胶、眼内、气管内、直肠内、阴道、基因枪、皮肤贴片、滴眼剂、滴耳剂和漱口剂。
在第六个方面，本发明提供用于在脊椎动物中预防癌症、自身免疫病症、气道炎症、炎性病症、皮肤病症、变态反应、哮喘或病原体引起的疾病的方法。这种方法包括对脊椎动物以药理有效量单独或组合地施用本发明第一个和第二个方面公开的任意一种组合物。本文公开的组合物可通过任何合适的施用途径来施用，包括但不限于非消化道、口服、舌下、经皮、局部、粘膜、吸入、鼻内、气溶胶、眼内、气管内、直肠内、阴道、基因枪、皮肤贴片、滴眼剂、滴耳剂和漱口剂。
附图简述
图1描述了适用于本发明的回文免疫调节性寡核苷酸的线性合成的一组典型的小分子接头。
图2描述了用于本发明的回文免疫调节性寡核苷酸的线性合成的合成方案。
图3描述了在C57BL/6小鼠脾细胞培养物中，本发明的范例回文免疫调节性寡核苷酸对IL-12的诱导。更一般地说，图3证明了改变回文免疫调节性寡核苷酸的长度、碱基组成和/或化学修饰将产生截然不同的IL-12诱导，各种回文免疫调节性寡核苷酸在各种浓度均产生了独特的IL-12诱导。用对应于所示SEQ ID NO的寡核苷酸以标明的剂量来处理C57BL/6小鼠脾细胞。Med＝对照/培养基处理组。
图4描述了在C57BL/6小鼠脾细胞培养物中，本发明的范例回文免疫调节性寡核苷酸对IL-6的诱导。更一般地说，图4证明了改变回文免疫调节性寡核苷酸的长度、碱基组成和/或化学修饰将产生截然不同的IL-6诱导，各种回文免疫调节性寡核苷酸在各种浓度均产生了独特的IL-6诱导。用对应于所示SEQ ID NO的寡核苷酸以标明的剂量来处理C57BL/6小鼠脾细胞。Med＝对照/培养基处理组。
图5描述了在人pDC培养物中，本发明的范例回文免疫调节性寡核苷酸对IFN-α的诱导。更一般地说，图5证明了改变回文免疫调节性寡核苷酸的长度、碱基组成和/或化学修饰将产生截然不同的IFN-α诱导。用对应于所示SEQ ID NO的寡核苷酸以10μg/mL来处理人pDC。Med＝对照/培养基处理组。
图6描述了在人PBMC培养物中，本发明的范例回文免疫调节性寡核苷酸对IFN-α的诱导。更一般地说，图6证明了改变回文免疫调节性寡核苷酸的长度、碱基组成和/或化学修饰将产生截然不同的IFN-α诱导。用对应于所示SEQ ID NO的寡核苷酸以10μg/mL来处理人PBMC。Med＝对照/培养基处理组。
图7描述了在人PBMC培养物中，本发明的范例回文免疫调节性寡核苷酸对IL-6的诱导。更一般地说，图7证明了改变回文免疫调节性寡核苷酸的长度、碱基组成和/或化学修饰将产生截然不同的对IL-6的诱导。用对应于所示SEQ ID NO的寡核苷酸以10μg/mL来处理人PBMC。Med＝对照/培养基处理组。
图8描述了在人PBMC培养物中，本发明的范例回文免疫调节性寡核苷酸对IL-10的诱导。更一般地说，图8证明了改变回文免疫调节性寡核苷酸的长度、碱基组成和/或化学修饰将产生截然不同的IL-6诱导。用对应于所示SEQ ID NO的寡核苷酸以10μg/mL来处理人PBMC。Med＝对照/培养基处理组。
图9(a)描述了在人PBMC培养物中，本发明的范例回文免疫调节性寡核苷酸对IFN-α的诱导。更一般地说，图9(a)证明了改变回文免疫调节性寡核苷酸的长度、碱基组成和/或化学修饰将产生截然不同的对IFN-α的诱导。用对应于所示SEQ ID NO的寡核苷酸以10μg/mL来处理人PBMC。Med＝对照/培养基处理组。
图9(b)描述了在人PBMC培养物中，本发明的范例回文免疫调节性寡核苷酸对IL-6的诱导。更一般地说，图9(b)证明了改变回文免疫调节性寡核苷酸的长度、碱基组成和/或化学修饰将产生截然不同的IL-6诱导。用对应于所示SEQ ID NO的寡核苷酸以10μg/mL来处理人PBMC。Med＝对照/培养基处理组。
图9(c)描述了在人pDC培养物中，本发明的范例回文免疫调节性寡核苷酸对IFN-α的诱导。更一般地说，图9(c)证明了改变回文免疫调节性寡核苷酸的长度、碱基组成和/或化学修饰将产生截然不同的IFN-α诱导。用对应于所示SEQ ID NO的寡核苷酸以10μg/mL来处理人PBMC。Med＝对照/培养基处理组。
优选实施方式详述
本文通过提述并入本文引用的授权专利、专利申请和参考文献的全部内容，如同具体地和个别地写明将它们通过提述并入本文一样。在此处引用的任意文献的任意教导与本说明书不一致的情况下，说明书应优先用于本发明的目的。
本发明涉及回文寡核苷酸作为免疫调节剂用于免疫治疗应用的治疗用途。本发明还提供用于产生、增强和修饰由回文免疫调节性化合物引起的免疫应答的方法，所述回文免疫调节性化合物用于免疫治疗应用，例如，但不限于，在成体和幼体的人类和兽医应用中治疗和/或预防癌症、自身免疫病症、哮喘、呼吸变态反应、食物过敏，以及细菌、寄生物和病毒感染。变应性哮喘是本方法和化合物所治疗的特定具体病症。因此，本发明进一步提供用于免疫治疗的具有最优水平的回文免疫调节效果的化合物，以及用于制备和使用这类化合物的方法。另外，本发明的回文免疫调节性寡核苷酸可作为佐剂与DNA疫苗、抗体、变态反应原、化疗剂和反义寡核苷酸联用。
术语“回文免疫调节性寡核苷酸”概括地指包含回文序列的回文免疫调节性寡核苷酸，在该回文序列内含有CG二核苷酸。在特定的实施方式中，回文序列内CG二核苷酸的胞嘧啶和/或鸟苷是经过修饰的，条件是与线性的、未经修饰的回文寡核苷酸相比，该回文免疫调节性寡核苷酸在仍然保留免疫应答，甚至定制(costumize)免疫应答的同时，无遭受不期望的蛋白结合之嫌。回文免疫调节性寡核苷酸可包含修饰的寡核苷酸和寡核苷，或者它们的组合。回文免疫调节性寡核苷酸可以是线性的或分支的，核酸是核苷通过例如磷酸二酯、硫代磷酸酯或其它联结而连接的聚合物。回文免疫调节性寡核苷酸可由共价附接于核糖残基的嘌呤(腺嘌呤(A)、肌苷(I)或鸟嘌呤(G)，或其衍生物)或嘧啶(胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，或其衍生物)碱基或其衍生物组成。
在第一个方面，本发明提供根据SEQ ID NO：1、2、3、4、10或11的回文免疫调节性寡核苷酸化合物。本发明人发现，针对线性回文免疫调节性寡核苷酸的回文序列和3’-3’连接内CG二核苷酸的胞嘧啶和/或鸟苷的修饰将影响回文序列的免疫调节能力。不希望受到任何具体理论的限制，本发明人预期这种修饰能改变回文部分，使回文免疫调节性寡核苷酸的活性与未修饰的回文寡核苷酸相比，不会因不期望的蛋白结合而改变，同时仍然保留免疫应答，甚至定制免疫应答。
在这个方面本发明提供回文免疫调节性核酸，其具有包含选自CpG*、C*pG和C*pG*的至少一个二核苷酸的核酸序列，其中C是胞嘧啶或2’-脱氧胞嘧啶，G是鸟苷或2’-脱氧鸟苷，C*是2’-脱氧胸苷、1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2’-双脱氧-5-卤代胞嘧啶、2’-双脱氧-5-硝基胞嘧啶、阿糖胞苷(arabinocytidine)、2′-脱氧-2′-取代阿糖胞苷、2′-O-取代阿糖胞苷、2′-脱氧-5-羟基胞苷、2′-脱氧-N4-烷基-胞苷、2′-脱氧-4-硫代尿苷或其它嘧啶核苷类似物，G*是2′-脱氧-7-脱氮鸟苷、2′-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2′-脱氧-2′取代-阿糖鸟苷、2′-O-取代-阿糖鸟苷、2′-脱氧肌苷或其它嘌呤核苷类似物，并且p是选自磷酸二酯、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯的核苷间联结。
在一些实施方式中，回文免疫调节性寡核苷酸的长度是大约2到大约50个核苷酸。在特定实施方式中，回文免疫调节性寡核苷酸的长度是大约11到大约30个核苷酸。在一些实施方式中，回文免疫调节性寡核苷酸是大约3到大约35个核苷残基，或大约4到大约30个核苷残基，或大约7至大约19个核苷残基。在一些实施方式中，回文免疫调节性寡核苷酸具有大约5至大约18，或大约7至大约11个核苷残基。此处所用的术语“大约”表示精确数目并不是关键的。因此，寡核苷酸中核苷残基的数目并不是关键的，少1个或2个核苷残基的回文免疫调节性寡核苷酸，或者多1个到数个核苷残基的回文免疫调节性寡核苷酸被视作上述的每个实施方式的等同物。在一些实施方式中，回文免疫调节性寡核苷酸中的一种或多种具有11个核苷酸。
在这个方面另外的实施方式中，本发明提供包含至少两个免疫调节性寡核苷酸的免疫调节性寡核苷酸，它们通过它们的3’-端或核苷间联结或官能化核碱基或糖藉由非核苷酸接头连接，其中至少一个免疫调节性寡核苷酸的序列含有回文免疫调节性寡核苷酸。在本发明这个方面的实施方式中，至少一个回文免疫调节性寡核苷酸含有选自CpG*、C*pG和C*pG*的至少一种二核苷酸，其中C是胞嘧啶或2’-脱氧胞嘧啶，G是鸟苷或2’-脱氧鸟苷，C*是2’-脱氧胸苷、1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2’-双脱氧-5-卤代胞嘧啶、2’-双脱氧-5-硝基胞嘧啶、阿糖胞苷、2′-脱氧-2′-取代阿糖胞苷、2′-O-取代阿糖胞苷、2′-脱氧-5-羟基胞苷、2′-脱氧-N4-烷基-胞苷、2′-脱氧-4-硫代尿苷或其它嘧啶核苷类似物，G*是2′-脱氧-7-脱氮鸟苷、2′-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2′-脱氧-2′取代-阿糖鸟苷、2′-O-取代-阿糖鸟苷、2′-脱氧肌苷或其它嘌呤核苷类似物，并且p是选自磷酸二酯、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯的核苷间联结。
术语“非核苷酸接头”概括地指能够以通过含磷联结之外的方式连接至或被连接至寡核苷酸的任意联结或模块(moiety)。优选这类接头长度从大约2埃到大约200埃。术语“核苷酸联结”泛指这样的直接3’-5’联结，其通过含磷联结将两个核苷的3’和5’羟基直接连接起来。
在一些实施方式中，非核苷酸接头是小分子、大分子或活质分子(biomolecule)，包括，但不限于，多肽、抗体、类脂、抗原、变态反应原和寡糖。在一些其它实施方式中，非核苷酸接头是小分子。就本发明而言，小分子是分子量小于1,000Da的有机模块。在一些实施方式中，小分子的分子量小于750Da。
在一些实施方式中，小分子是脂肪烃或芳烃，所述脂肪烃或芳烃可任选地包括位于连接寡核糖核苷酸的直链中或附接于其上的一种或多种官能团，所述官能团包括，但不限于羟基、氨基、硫醇、硫醚、醚、酰胺、硫代酰胺、酯、脲或硫脲。小分子可以是环状或非环状的。小分子接头的实例包括，但不限于，氨基酸、糖、环糊精、金刚烷、胆固醇、半抗原和抗生素。然而，为描述非核苷酸接头的目的，术语“小分子”意图不包括核苷。
在一些实施方式中，非核苷酸接头是烷基接头或氨基接头。烷基接头可以是分支化或无分支的，环状或非环状的，取代或未取代的，饱和或不饱和的，手性、非手性或外消旋混合物。烷基接头可具有大约2到大约18个碳原子。在一些实施方式中，这类烷基接头具有大约3个到大约9个碳原子。一些烷基接头包括一种或多种官能基团，所述官能基团包括，但不限于羟基、氨基、硫醇、硫醚、醚、酰胺、硫代酰胺、酯、脲和硫醚。这些烷基接头可包括，但不限于，1，2-丙二醇、1，2，3-丙三醇、1，3-丙二醇、三甘醇、六甘醇(hexaethylene glycol)、聚乙二醇接头(例如[-O-CH2-CH2-]n(n＝1-9))、甲基接头、乙基接头、丙基接头、丁基接头或己基接头。在一些实施方式中，这类烷基接头可包括肽或氨基酸。
在一些实施方式中，小分子接头是如式HO-(CH2)o-CH(OH)-(CH2)p-OH所示的甘油或甘油同系物，其中o和p独立地是从1到大约6，从1到大约4或者从1到大约3之间的整数。在一些其它实施方式中，小分子接头是1，3-二氨基-2-羟基丙烷的衍生物。一些这类衍生物具有通式HO-(CH2)m-C(O)NH-CH2-CH(OH)-CH2-NHC(O)-(CH2)m-OH，其中m是从0到大约10，从0到大约6，从2到大约6，或者从2到大约4之间的整数。
一些本发明的非核苷酸接头允许附接超过两个寡核苷酸。例如，小分子接头甘油具有三个羟基基团，寡核苷酸可以共价附接于所述羟基基团。因此，一些本发明的回文免疫调节性寡核苷酸包含两个或更多个与核苷酸接头或非核苷酸接头连接的寡核苷酸。将这类回文免疫调节性寡核苷酸称为“分支的”。
回文免疫调节性寡核苷酸化合物可包含非共价连接的至少两个寡核苷酸，所述非共价连接例如通过静电相互作用、疏水性相互作用、π堆积相互作用、氢键键合和它们的组合。这种非共价联结的非限定性实例包括Watson-Crick碱基配对、Hoogsteen碱基配对和碱基堆积。
在本研究中作为本发明的范例使用的回文免疫调节性寡核苷酸包括，但不限于，表1所示的那些。回文免疫调节性寡核苷酸含有相同的或不同的寡核苷酸序列区段，这些区段通过它们的3’-末端经由非核苷接头互相连接或联结，所述非核苷接头包括但不限于，甘油、C3-接头、C3-烷基接头或丙二醇。IMO 6-9(SEQ ID NO 6-9)含有两个相同的序列片段，而IMO 1-5和10-11(SEQ ID NO 1-5和10-11)含有两个不相同的序列片段。第二回文免疫调节性寡核苷酸片段在其长度、碱基组成和/或纳入的化学修饰方面不同于第一片段。
表1.回文免疫调节性寡核苷酸范例
Figure G2006800531201D00091
Figure G2006800531201D00101
X＝甘油接头；Y＝C3接头；G1＝7-脱氮-dG；G2＝AraG
本领域技术人员将认识到，回文免疫调节性寡核苷酸的互补序列允许分子间氢键键合，由此形成回文免疫调节性寡核苷酸二级结构。此处所用术语“二级结构”是指分子间氢键键合。分子间氢键键合导致双链核酸分子的形成。额外的回文免疫调节性寡核苷酸可以结合在一起，由此产生本发明的回文免疫调节性寡核苷酸的链或多聚体。
“回文序列”应指反向重复序列(即，如ABCDEE′D′C′B′A′的序列，其中A和A′、B和B′等是能够形成常规Watson-Crick碱基对的碱基)。在适当的条件下，如生理盐度和pH条件下，这些序列可形成双链结构。在一个实施方式中，免疫调节性核酸含有回文序列。在此语境中使用的“回文序列”指这样的回文序列，其中CpG是该回文序列的一部分。在一些实施方式中，CpG是回文序列的中心。
在本发明这个方面的一些实施方式中，回文序列是自身互补的，在合适地排列时，该回文序列可在G-C、G*-C、G*-C*、G-C*、I-C、A-T、A-U和/或G-U摆动配对之间形成分子内碱基配对，或者，更通常地，形成分子间碱基配对。在一个实施方式中，自身互补的程度是至少50％。例如，至少50％自身互补的8聚体可具有能够形成4、5、6、7或8个G-C、A-T、A-U和/或G-U摆动碱基对的序列。这些碱基对可以包括但是并非必须包括位于自身互补回文免疫调节性寡核苷酸的任一末端的碱基。如果核酸稳定化对回文免疫调节性寡核苷酸可能是重要的，通过碱基配对或者通过其它合适的手段将双链核酸的一端或两端“夹”在一起可能是有利的做法。自身互补的程度可以依赖于回文免疫调节性寡核苷酸之间的排列，这种排列可以包括或者不包括单核苷或多核苷的突出端。在其它实施方式中，自身互补的程度是至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，或者甚至100％。
类似的考量也适用于碱基序列不同的回文免疫调节性寡核苷酸之间的分子间碱基配对。因此，当共同使用多个回文免疫调节性寡核苷酸时，所述多个回文免疫调节性寡核苷酸可以包括但是不必要包括彼此至少部分互补的序列。在一个实施方式中，多个回文免疫调节性寡核苷酸包括具有第一序列的回文免疫调节性寡核苷酸和具有第二序列的回文免疫调节性寡核苷酸，其中第一序列和第二序列至少50％互补。例如，在至少50％互补的两个8聚体之间，它们可以形成4、5、6、7或8个G-C、A-T、A-U和/或G-U摆动碱基对。这些碱基对可以包括但不必要包括位于互补回文免疫调节性寡核苷酸的任一末端的碱基。互补的程度可能依赖于回文免疫调节性寡核苷酸之间的排列，这种排列可以包括或者不包括单核苷或多核苷的突出端。在其它实施方式中，自身互补的程度是至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，或者甚至100％。
此处所用的术语“互补”的意思是具有与核酸杂交的能力。这种杂交通常是互补链间氢键键合(优选键合形成Watson-Crick碱基对或Hoogsteen碱基对)的结果，尽管其它模式的氢键键合以及碱基堆积也能够导致杂交。
就本发明而言，术语“寡核苷酸”是指由大量连接的核苷单位形成的多聚核苷(polynucleoside)。这些寡核苷酸可以从现有的核酸来源，包括基因组或者cDNA来源获得，但优选地通过合成方法产生。在一些实施方式中，每个核苷单位包括杂环碱基和呋喃戊糖基(pentofuranosyl)、2’-脱氧呋喃戊糖基、海藻糖、阿拉伯糖、2’-脱氧-2’-取代阿拉伯糖、2’-O-取代阿拉伯糖或己糖糖基团。核苷残基可以通过很多任意已知的核苷间联结彼此偶联。这些核苷间联结包括但不限于，磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、烷基硫代膦酸酯(alkylphosphonothioate)、磷酸三酯、亚磷酰胺、硅氧烷、碳酸酯、烷氧羰基(carboalkoxy)、乙酰胺化物(acetamidate)、氨基甲酸酯、吗啉代、borano、硫醚、桥联亚磷酰胺、桥联亚甲基膦酸酯、桥联硫代磷酸酯、和砜核苷间联结。术语“寡核苷酸”还包括具有一种或多种立体特异核苷间联结(例如，(RP)-或(SP)-硫代磷酸酯，烷基膦酸酯或磷酸三酯联结)的多聚核苷。此处所用的术语“寡核苷酸”和“二核苷酸”明确意图包括具有任何这样的核苷间联结的多聚核苷和二核苷，无论该联结是否包括磷酸基团。在特定的实施方式中，这些核苷间联结可以是磷酸二酯，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯联结，或者它们的组合。
术语“寡核苷酸”还包含具有其它取代基的多聚核苷，包括但不限于，蛋白基团，亲脂性基团，插入剂(intercalating agents)，二胺，叶酸，胆固醇和金刚烷。术语“寡核苷酸”还包括任意其它包含核碱基的聚合物，包括但不限于具有磷酸基团的肽核酸、锁定核酸(LNA)、吗啉代-骨架寡核苷酸和具有包括烷基接头或氨基接头的骨架区段的寡核苷酸。
本发明的回文免疫调节性寡核苷酸可以包括天然存在的核苷，修饰的核苷，或它们的混合物。此处所用的术语“修饰的核苷”是指包括修饰的杂环碱基、修饰的糖模块或它们的组合的核苷。在一些实施方式中，修饰的核苷是如本文所述的非天然嘧啶或嘌呤核苷。在一些实施方式中，修饰的核苷是2′-取代核糖核苷、阿糖核苷或2′-脱氧-2′-取代-阿拉伯糖苷。
就本发明而言，术语“2′-取代核糖核苷”或“2’-取代阿拉伯糖苷”包括这样的核糖核苷或阿糖核苷，其中戊糖模块的2′位的羟基被取代产生2’-取代的或2′-O-取代的核糖核苷。在特定的实施方式中，这些取代是用包含1-6个饱和或不饱和的碳原子的低级烷基，或者用具有6-10个碳原子的芳基取代，其中这种烷基或芳基可以是未取代的，或者可以是取代的，例如用卤素、羟基、三氟甲基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、烷氧基、羧基、烷氧羰基或氨基取代。2′-O-取代核糖核苷或2′-O-取代-阿拉伯糖苷的实例包括但不限于2′-O-甲基核糖核苷或2′-O-甲基阿拉伯糖苷和2′-O-甲氧基乙氧基核糖核苷或2′-O-甲氧乙氧基阿拉伯糖苷。
术语“2′-取代核糖核苷”或“2’-取代阿拉伯糖苷”还包括这样的核糖核苷或阿糖核苷，其中2′-羟基被替换为包含1-6个饱和或不饱和碳原子的低级烷基，或者替换为氨基或卤素基团。这类2’-取代核糖核苷或2’-取代阿拉伯糖苷的实例包括但不限于，2’-氨基、2’-氟代、2’-烯丙基和2’-炔丙基核糖核苷或阿拉伯糖苷。
术语“寡核苷酸”包括杂合寡核苷酸和嵌合寡核苷酸。“嵌合寡核苷酸”是指具有超过一种类型的核苷间联结的寡核苷酸。这种嵌合寡核苷酸的一个非限定性实例是这样的嵌合寡核苷酸，它包含硫代磷酸酯、磷酸二酯或二硫代磷酸酯区域和非离子联结例如烷基磷酸酯或烷基硫代膦酸酯(alkylphosphonothioate)联结(参见例如，Pederson等人美国专利5,635,377和5,366,878)。
“杂合寡核苷酸”是具有超过一种类型的核苷的寡核苷酸。这种杂合寡核苷酸的一个非限定性实例包含核糖核苷酸或2′-取代核糖核苷酸区域，以及脱氧核糖核苷酸区域(参见，例如，Metelev和Agrawal，美国专利5,652,355、6,346,614和6,143,881)。
在第二个方面，本发明提供药物组合物。这些组合物包含本发明公开的任意组合物和可药用的载体。
此处所用的术语“可药用的”指材料不干扰本发明第一、第二和第三方面的组合物的有效性，并且与生物系统例如细胞、细胞培养物、组织或生物体相容。在特定实施方式中，生物系统是活的生物，例如脊椎动物。
此处所用的术语“载体”包括任意赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、类脂或本领域公知的用于药物制剂的其它材料。应了解载体、赋形剂或稀释剂的性质将取决于针对具体应用的施用途径。包含这些材料的药学上可接受的制剂的制备描述于，例如，Remington’sPharmaceutical Sciences，18th Edition，ed.A.Gennaro，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990，ISBN：0-912734-04-3。
本发明的药物组合物还可包括癌症疫苗，包括选自EFG、抗独特型癌症疫苗、Gp75抗原、GMK黑素瘤疫苗、MGV神经节苷脂偶联物疫苗、Her2/new、Ovarex、M-Vax、O-Vax、L-Vax、STn-KHL癌疫苗(theratope)、BLP25(MUC-1)、脂质体独特型疫苗、黑素瘤疫苗(Melacine)、肽抗原疫苗、毒素/抗原疫苗、基于MVA的疫苗、PACIS、BCG疫苗、TA-HPV、TA-CIN、DISC-病毒和ImmunCyst/TheraCys的癌症疫苗。
回文免疫调节性寡核苷酸和/或疫苗可以任选地连接于免疫原性蛋白，例如钥孔血蓝蛋白(KLH)、霍乱毒素B亚基、或任意其它免疫原性载体蛋白或非免疫原性载体蛋白。可以使用多种佐剂中的任何种，包括但不限于，弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、KLH、单磷酰类脂A(MPL)、明矾和皂苷，包括QS-21、咪喹莫特、R848或它们的组合。
在本发明的多种实施方式中，本发明第一个方面或第二个方面的组合物可以与抗原共价连接，或者与抗原以其它方式可操作地结合(operativelyassociated)。此处所用的术语“与...可操作地结合”是指保持本发明第一、第二或第三方面的组合物和抗原二者之活性的任意结合(association)。这样的“可操作结合”的非限制性实例包括构成同一脂质体或其它此类递送载体或试剂的部分(being part of the same liposome or other such delivery vehicle orreagent)。在本发明的第一、第二或第三方面的组合物共价连接于抗原的实施方式中，这类共价联结位于本发明第一、第二或第三方面的组合物上除了回文免疫刺激性寡核苷酸易接近的5′端之外的任意位置。例如，抗原可以附接于核苷间联结或可以附接到非核苷酸接头。此外，抗原本身可以是非核苷酸接头。
在本发明的多种实施方式中，本发明第一方面或第二方面的组合物可以包括具有反义活性的回文免疫调节性寡核苷酸。此处所用的“反义活性”的意思是在将回文免疫调节性寡核苷酸被引入细胞或动物时，其导致与之互补的基因的表达减少。
在本发明的多种实施方式中，本发明第一方面或第二方面的组合物可以包括作为适体的回文免疫调节性寡核苷酸序列。适体是基于它们与其它分子结合的能力从随机库(random pool)中选择出来的核酸分子。人们已经选出了结合核酸，蛋白，小有机化合物，以及甚至完整生物体的适体。这些新分子在医学和技术中具有许多潜在的用途(参见，例如，Burgstaller P.，et al.CurrOpin Drug Discov Devel.5：690-700(2002))。
本发明的药物组合物可以通过任何合适的途径来施用，包括但不限于非消化道、口服、舌下、经皮、局部、粘膜、吸入、鼻内、气溶胶、眼内、气管内、直肠内、阴道、基因枪、皮肤贴片，或者采用滴眼剂或漱口剂形式。可使用已知的程序，以有效获得期望效果的剂量和时程来递送药物组合物，所述期望效果例如治疗癌症、治疗感染和治疗自身免疫疾病。当全身给药时，以足够剂量施用药物组合物以便本发明第一、第二和/或第三方面的组合物的血液水平达到从大约0.0001微摩尔/升(micromolar)到大约10微摩尔/升。对于局部施用，比这低得多的浓度也可能是有效的，而高得多的浓度也可能是可耐受的。在特定实施方式中，回文免疫调节性寡核苷酸的总剂量从大约0.0001mg每个患者每天到大约200mg每千克体重每天。最好同时或连续地对个体施用治疗有效量的一种或多种本发明的治疗组合物作为单一治疗段落。
使用以下用于合成的方案来制备本发明的范例回文免疫调节性寡核苷酸。利用如图2示意图所示的自动化合成仪和亚磷酰胺方法，可以方便地合成本发明的回文免疫调节性寡核苷酸。在一些实施方式中，通过线性合成方法合成回文免疫调节性寡核苷酸。用于这种合成的典型接头示于图1。此处所用术语“线性合成”指从回文免疫调节性寡核苷酸的一端开始，线性推进到另一端的合成。线性合成允许在回文免疫调节性寡核苷酸中掺入(就长度、碱基组成和/或掺入的化学修饰而言)相同或不同的单体单元。
在合成结束时，如果掺入了修饰核苷的话，可以方便地利用浓的氨溶液或根据亚磷酰胺供应商的推荐对本发明的回文免疫调节性寡核苷酸进行脱保护。优选对产物回文免疫调节性寡核苷酸利用反相HPLC纯化，脱三苯甲基，脱盐和透析。
本发明第一个方面和第二个方面中公开的组合物可以包含单独的回文免疫调节性寡核苷酸，或者作为回文免疫调节性寡核苷酸偶联物的回文免疫调节性寡核苷酸。回文免疫调节性寡核苷酸偶联物包含如上所述的回文免疫调节性寡核苷酸和偶联于回文免疫调节性寡核苷酸中不同于易接近的5′端的位置的化合物。在一些实施方式中，化合物偶联于非核苷酸接头。在一些其它实施方式中，化合物与回文免疫调节性寡核苷酸在不同于其5′端的位置偶联。能够与本发明的回文免疫调节性寡核苷酸偶联的合适化合物包括，但不限于，胆固醇、不同长度的聚乙二醇、肽、抗体、蛋白、疫苗、类脂、抗原和任意的免疫刺激小分子，例如，但不限于，咪喹莫特(imiquimod)、R848、洛索立宾(loxoribine)、艾沙托利宾(isatorbin)以及化疗剂。可以按照下文讨论的方法施用单独的或者作为回文免疫调节性寡核苷酸偶联物的回文免疫调节性寡核苷酸或免疫聚合体(immunomer)(参见美国专利申请20040097719)。
抗原任选地选自与病原体相关的抗原，与癌症相关的抗原，与自身免疫病症相关的抗原，和与其他疾病(例如但不限于兽医或儿科疾病，或者其中抗原是变态反应原的疾病)相关的抗原。在一些实施方式中，抗原产生疫苗效应。就本发明而言，术语“与...相关的”表示当病原体、癌症、自身免疫病症、食物过敏、皮肤过敏、呼吸变态反应、哮喘或其它疾病存在时，抗原也存在，但当病原体、癌症、自身免疫病症、食物过敏、皮肤过敏、呼吸变态反应或疾病不存在时，抗原不存在或减量存在。
回文免疫刺激性寡核苷酸与抗原共价连接，或者它与抗原以其它方式可操作地结合。此处所用的术语“与...可操作地结合”是指保持回文免疫刺激性寡核苷酸和抗原二者活性的任意结合。这种“可操作地结合”的非限制性实例包括构成同一脂质体或其它此类投递载体或试剂的部分。在回文免疫刺激性寡核苷酸共价连接到抗原的实施方式中，这类共价联结优选位于回文免疫刺激性寡核苷酸上的任意位置，除了回文免疫刺激性寡核苷酸易接近的5′端之外。例如，抗原可以附接于核苷间联结处或可以与非核苷酸接头附接。此外，抗原本身可以是非核苷酸接头。
在第三个方面，本发明提供在脊椎动物中产生和/或调节免疫应答的方法，该方法包括对脊椎动物施用本发明的回文免疫调节性寡核苷酸或偶联物。在一些实施方式中，脊椎动物是哺乳动物。就本发明而言，术语“哺乳动物”明确地意图包括人。在特定的实施方式中，对需要免疫调节的脊椎动物施用回文免疫调节性寡核苷酸或偶联物。
此处所用的术语“调节性”或“调节”表示相对于亲本回文免疫调节性核酸的免疫调节活性，增加或减少回文免疫调节性核酸的免疫调节活性。
在本发明这个方面的方法中，回文免疫调节性寡核苷酸的施用可以通过任何合适的途径，包括，但不限于，非消化道、口服、舌下、经皮、局部、粘膜、吸入、鼻内、肌内、腹膜内(intraperitonal)、皮下、皮内、气溶胶、眼内、气管内、直肠内、阴道、通过基因枪、皮肤贴片或采用滴眼液或漱口剂形式。可使用已知的程序，以有效减少疾病的症状或替代标记物的剂量和时程进行免疫聚合体(immunomer)治疗组合物的施用。当全身给药时，优选施用足够剂量的治疗组合物以便回文免疫调节性寡核苷酸的血液水平达到大约0.0001微摩尔/升(micromolar)到大约10微摩尔/升。对于局部施用，比这低得多的浓度也可能是有效的，而高得多的浓度也可能是可耐受的。优选地，回文免疫调节性寡核苷酸的总剂量从大约0.001mg每个患者每天到大约200mg每千克体重每天。最好同时或连续地对个体施用治疗有效量的一种或多种本发明的治疗组合物作为单一治疗段落。
本发明这个方面的方法可用于免疫系统的模型研究。这些方法还可用于人或者动物疾病的预防或者治疗。例如，这些方法可用于儿科用和兽用疫苗应用。
在第四个方面，本发明提供治疗性处理患有疾病或病症的脊椎动物的方法，这种方法包括对脊椎动物施用本发明的回文免疫调节性寡核苷酸或偶联物。在多种实施方式中，待治疗的疾病或病症是癌症、自身免疫病症、气道炎症、炎性病症、变态反应、哮喘或病原体引起的疾病。病原体包括细菌、寄生物、真菌、病毒、类病毒和朊病毒。按照本发明第三个方面的描述进行施用。
就本发明而言，术语“变态反应”包括，但不限于，食物过敏、特应性皮炎、变应性鼻炎(也称作干草热(hay fever))、变应性结膜炎、荨麻疹(urticaria)(也称为荨麻疹(hives))、呼吸系统变态反应和对其它物质例如乳胶、药物和昆虫叮咬的变态反应，或通常由变应性鼻炎-鼻窦炎、中耳炎和COPD产生的问题。术语“气道炎症”包括，但不限于，哮喘。哮喘的具体实例包括，但不限于，变应性哮喘、非变应性哮喘、运动引起的哮喘(exercised-induced asthma)、职业性哮喘和夜发性哮喘。
变应性哮喘的特征在于与变态反应相关的气道梗阻，由称为变态反应原的物质引起变应性哮喘。变应性哮喘的引发物(trigger)包括，但不限于，空气播散的花粉、霉菌、动物毛屑、房尘螨和蟑螂排泄物(cockroach dropping)。非变应性哮喘由可刺激鼻和气道的病毒感染、特定药物或空气中的刺激物引起。非变应性哮喘的引发物包括，但不限于，气载颗粒(例如，煤、粉笔灰)、空气污染物(例如，烟草烟雾、木材烟雾)、强烈的气味或喷雾剂(例如，香水(perfumes)、家用清洁剂、烹饪油烟、涂料或清漆)、病毒感染(例如，感冒、病毒性肺炎、鼻窦炎、鼻息肉)、阿司匹林敏感性和胃食管返流疾病(GERD)。运动引起的哮喘(EIA)由剧烈身体运动引起。EIA的症状在多数哮喘患者中均有不同程度的发生，在运动时呼吸了寒冷而干燥的空气后很有可能引发EIA的症状。EIA的引发因素包括，但不限于，在运动时吸入空气播散的花粉，在运动时吸入空气污染物，在患有呼吸道病毒感染时运动，以及在寒冷而干燥的空气中运动。职业性哮喘直接与存在于工作场所的吸入性刺激物和其它潜在的有害物质有关。职业性哮喘的引发物包括，但不限于，烟雾、化学物质、气体、树脂、金属、粉尘、蒸气和杀虫剂。
此处所用的术语“自身免疫病症”是指“自身”蛋白遭受免疫系统攻击的病症。该术语包括自身免疫哮喘。
在第五个方面，本发明提供用于在脊椎动物中预防癌症、自身免疫病症、气道炎症、炎性病症、皮肤病症、变态反应、哮喘或病原体引起的疾病的方法。这种方法包括对脊椎动物单独或联合施用任意本发明公开的组合物。病原体包括细菌、寄生物、真菌、病毒、类病毒和朊病毒。如本发明第三个方面所述来进行施用。
在本发明的任意方法中，可将回文免疫调节性寡核苷酸或其偶联物与有用于治疗疾病或病症而不降低回文免疫调节性寡核苷酸的免疫调节作用的任意其它试剂联合施用。就本发明的这个方面而言，术语“与...联合”意思是在治疗相同患者的相同疾病的过程中，包括以任意顺序施用回文免疫调节性寡核苷酸和某种试剂，包括同时施用，和以任意时间上分隔的顺序施用，例如，从一次紧接着另一次的连续施用直至相隔数天的施用。这种联合治疗还可以包括施用回文免疫调节性寡核苷酸和独立地施用试剂分别多于一次。回文免疫调节性寡核苷酸和试剂可以通过相同或不同的途径施用。
在本发明的任意方法中，可将回文免疫调节性寡核苷酸或回文免疫调节性寡核苷酸偶联物与有用于治疗或预防疾病或病症而不降低回文免疫调节性寡核苷酸的免疫刺激作用的任意其它试剂联合施用。在本发明的任意方法中，有用于治疗疾病或病症的试剂包括，但不限于，增强免疫应答的特异性或程度的疫苗、抗原、抗体、细胞毒剂、变态反应原、抗生素、反义寡核苷酸、肽、蛋白、基因治疗载体、DNA疫苗和/或佐剂，或共刺激分子例如细胞因子、趋化因子、蛋白配体、反式激活因子、肽和包含修饰氨基酸的肽。例如，在癌症的治疗中，预期可将回文免疫调节性寡核苷酸或回文免疫调节性寡核苷酸偶联物与化疗化合物或单克隆抗体联合施用。或者，所述试剂可包括编码抗原或变态反应原的DNA载体。在这些实施方式中，本发明的回文免疫调节性寡核苷酸可作为佐剂以不同方式发挥作用和/或产生直接的免疫调节作用。
本发明的方法中使用的优选化疗剂包括，但不限于吉西他滨(Gemcitabine)、氨甲蝶呤、长春新碱、阿霉素、顺铂、非含糖的氯乙基亚硝基脲类、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、博来霉素、多柔比星(doxorubicin)、达卡巴嗪(dacarbazine)、紫杉醇(taxol)、弗拉吉林(fragyline)、葡甲胺GLA(MeglamineGLA)、戊柔比星(valrubicin)、亚硝脲氮芥(carmustaine)和聚苯丙生(poliferposan)、MMI270、BAY 12-9566、RAS法尼基转移酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂、MMP、MTA/LY231514、LY264618/洛美曲索(Lometexol)、格拉默来(Glamolec)、CI-994、TNP-470、和美新(Hycamtin)/托泊替康(Topotecan)、PKC412、伐司朴达(Valspodar)/PSC833、能灭瘤(Novantrone)/米托蒽醌(Mitroxantrone)、苏拉明六钠盐(Metaret)/苏拉明(Suramin)、巴马司他(Batimastat)、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、Incel/VX-710、VX-853、ZD0101、ISI641、ODN 698、TA 25 16/马米司他(Marmistat)、BB2516/马米司他(Marmistat)、CDP 845、D2163、PD183805、DX8951f、乳杆菌制剂DP 2202(Lemonal DP 2202)、FK 317、溶链菌制剂(Picibanil)/OK-432、AD 32/戊柔比星、氯化锶(Metastron)/锶衍生物(strontiumderivative)、泰道(Temodal)/替莫唑胺(Temozolomide)、阿霉素脂质体(Evacet)/多柔比星脂质体、优他散(Yewtaxan)/帕利他塞(Placlitaxel)、紫杉醇/帕利他塞(Paclitaxel)、希罗达(Xeload)/卡培他滨(Capecitabine)、氟铁龙(Furtulon)/去氧氟尿苷(Doxifluridine)、西克罗派(Cyclopax)/口服紫杉酚、口服紫杉烷(OralTaxoid)、SPU-077/顺铂、HMR 1275/夫拉平度(Flavopiridol)、CP-358(774)/EGFR、CP-609(754)/RAS癌基因抑制剂、BMS-182751/口服铂、UFT(替加氟(Tegafur)/尿嘧啶)、左旋咪唑(Ergamisol)/左旋咪唑(Levamisole)、恩尿嘧啶(Eniluracil)/776C85/5FU增强剂、依立替康(Campto)/左旋咪唑、盐酸伊立替康和山梨醇注射剂(Camptosar)/依立替康(Irinotecan)、图莫得(Tumodex)/雷利特塞(Ralitrexed)、克拉立平(Leustatin)/克拉屈滨(Cladribine)、Paxex/紫杉酚、盐酸多柔比星脂质体(Doxil)/多柔比星脂质体、楷莱(Caelyx)/多柔比星脂质体、氟达华(Fludara)/氟达拉滨(Fludarabine)、表阿霉素(Pharmarubicin)/表柔比星(Epirubicin)、脂质体阿糖胞苷注射剂(DepoCyt)、ZD1839、LU 79553/双-萘二甲酰亚胺(Bis-Naphtalimide)、LU 103793/海兔毒素(Dolastain)、楷替(Caetyx)/多柔比星脂质体、注射用盐酸吉西他滨(Gemzar)/双氟去氧胞苷(Gemcitabine)、ZD 0473/Anormed、依托度酸接种(lodine seeds)、CDK4和CDK2抑制剂、PARP抑制剂、D4809/Dexifosamide、Ifes/美钠针剂(Mesnex)/Ifosamide、威猛(Vumon)/尼泊苷(Teniposide)、卡铂(Paraplatin)/碳铂(Carboplatin)、顺铂(Plantinol)/顺铂、依托泊苷(Vepeside)/依托泊苷(Etoposide)、ZD 9331、泰索帝(Taxotere)/多西紫杉醇(Docetaxel)、鸟嘌呤阿糖苷前体药物、紫杉烷类似物、亚硝基脲、烷化剂例如苯丙氨酸氮芥(melphelan)和环磷酰胺、氨鲁米特(Aminoglutethimide)、天冬酰胺酶、白消安(Busulfan)、碳铂、Chlorombucil、盐酸阿糖胞苷(CytarabineHCl)、更生霉素(Dactinomycin)、盐酸柔红霉素(Daunorubicin HCl)、磷雌氮芥(Estramustine phosphate sodium)、依托泊苷(VP16-213)、氟尿苷(Floxuridine)、氟尿嘧啶(5-FU)、氟他胺(Flutamide)、羟基脲(Hydroxyurea)(羟基尿素(hydroxycarbamide))、异环磷酰胺(Ifosfamide)、干扰素α-2a、α-2b、醋酸亮丙瑞林(Leuprolide acetate)(LHRH-释放因子类似物)、洛莫司汀(Lomustine)(CCNU)、盐酸双氯乙基甲胺(Mechlorethamine HCl)(氮芥)、巯嘌呤、巯乙磺酸钠(Mesna)、米托坦(Mitotane)(邻对滴滴滴(o.p′-DDD))、盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone HCl)、奥曲肽(Octreotide)、普卡霉素(Plicamycin)、盐酸丙卡巴肼(Procarbazine HCl)、链佐星(Streptozocin)、枸橼酸他莫昔芬(Tamoxifencitrate)、硫代鸟嘌呤、塞替派(Thiotepa)、长春碱(Vinblastine sulfate)、安吖啶(Amsacrine)(胺苯吖啶(m-AMSA))、阿扎胞苷(Azacitidine)、Erthropoietin、六甲蜜胺(Hexamethylmelamine)(HMM)、白细胞介素2、米托胍腙(Mitoguazone)(甲基-GAG；丙酮双脒腙(methyl glyoxal bis-guanylhydrazone)；MGBG)、喷司他丁(Pentostatin)(2’-脱氧考福霉素(2′deoxycoformycin))、司莫司汀(Semustine)(甲基-CCNU)、替尼泊苷(Teniposide)(VM-26)、硫酸长春地辛(Vindesinesulfate)、酪氨酸激酶抑制剂，例如EGFR和VEGF抑制剂，包括但不限于，拉帕替尼(Lapatinib)(EGFR和ErbB-2(Her2/neu)双重酪氨酸激酶抑制剂(GSK))、吉非替尼(Gefitinib)(ZD1839/易瑞沙(Iressa)(AstraZeneca))、埃洛替尼(Erlotinib)(他赛瓦(Tarceva)-EGFR/HER1抑制剂(Genentech))、沙利度胺(Thalidomide)((沙利度胺)-抗血管新生药物)、伊马替尼(Imatinib)(Glivec)和瓦他拉尼(Vatalanib)(VEGFR酪氨酸激酶抑制剂)、索拉非尼(Sorafenib)(Raf激酶抑制剂(Bayer))、VX-680(Aurora激酶抑制剂)、索坦(Sutent)(受体酪氨酸激酶(RTKs)抑制剂(Pfizer))、硼替佐米(Bortezomib)((Velcade)蛋白酶体抑制剂)、替莫唑胺(Temozolomide)(泰道(Temodal)烷基化剂)和干扰素α(干扰能(Intron A)，罗扰素(Roferon A))。
人们针对抗体，特别是单克隆抗体形式的被动免疫治疗作为抗癌剂进行了大量的研究和开发。此处所用的术语“单克隆抗体”是指具有单一分子组成的抗体分子。单克隆抗体组合物呈现对特定表位单一的结合特异性和亲和性。因此，术语“人单克隆抗体”指呈现单一结合特异性的抗体，其具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。抗癌剂的实例包括，但不限于，单抗17-1A(Panorex)(Glaxo-Welicome)、B细胞单克隆抗体(Rituxan)(IDEC/Genentech/Hoffman la Roche)、麦罗塔(Mylotarg)(Wyeth)、坎帕斯(Campath)(Millennium)、泽娃灵(Zevalin)(IDEC and Schering AG)、百克沙(Bexxar)(Corixa/GSK)、爱必妥(Erbitux)(Imclone/BMS)、阿瓦斯丁(Avastin)(Genentech)、赫赛汀(Herceptin)(Genentech/Hoffman la Roche)、西妥昔单抗(Cetuximab)(Imclone)和帕尼单抗(Panitumumab)(Abgenix/Amgen)。抗体也可应用在利用抗独特型抗体的主动免疫治疗中，其似乎(在免疫学意义上)模仿癌抗原。单克隆抗体可通过重组DNA技术领域的技术人员已知的方法来制备。
下面的实施例旨在进一步说明本发明的特定实施方式，而不是意图限定本发明的范围。
实施例
实施例1：具有不同序列区段的硫代磷酸酯CpR回文免疫调节性寡核苷酸的合成和纯化
利用β-氰乙基亚磷酰胺化学法，在PerSeptive Biosystem的8909 ExpediteDNA合成仪上，以1-2μtmol规模合成回文免疫调节性寡核苷酸。附接于CPG固相支持物的Di-DMT保护的甘油基接头和DMT-丙二醇亚磷酰胺接头获自ChemGenes Corporation(Wilmington，MA)。装载了5’-CPG的T单体、5’-亚磷酰胺和7-脱氮-2’-脱氧鸟苷3’-亚磷酰胺获自ChemGenes。dA、dG、dC和T的3′-亚磷酰胺获自Proligo。使用Beaucage试剂作为氧化剂来获得硫代磷酸酯骨架修饰。对5’-亚磷酰胺和7-脱氮-2’-脱氧鸟苷3’-亚磷酰胺使用经改变的偶联方案。在合成之后，将免疫聚合体使用标准方法脱保护，使用RP-HPLC纯化，脱三苯甲基，再相对于美国药典(United States Pharmacopea)质量的冲洗用无菌水(Braun)进行透析。将回文免疫调节性寡核苷酸冻干，再次溶解在蒸馏水中，通过测量260nm处的UV吸光度来测定浓度。通过变性PAGE测定合成的所有回文免疫调节性寡核苷酸的纯度，通过MALDI-TOF质谱表征一些回文免疫调节性寡核苷酸的分子质量。全部回文免疫调节性寡核苷酸的合成和纯化都在内毒素污染最小化的相同条件下进行。
实施例2：小鼠脾细胞培养物和细胞因子测量
制备来自4-8周龄C57BL/6小鼠的脾细胞，培养在RPMI完全培养基中。将小鼠脾细胞以5×106细胞/ml接种在24孔培养皿中。向细胞培养物中添加溶于TE缓冲液(10mM Tris-HCL，pH7.5，1mM EDTA)的回文免疫调节性寡核苷酸至终浓度为0.1、0.3、1.0、3.0或10μg/ml。然后将细胞在37℃孵育24小时，收集上清用于ELISA分析。通过夹心ELISA测定上清中IL-12和IL-6的水平。所需试剂，包括细胞因子抗体和标准品，均购自BD PharMingen。链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶和底物获自KPL。结果示于图3和图4。
实施例3：人细胞培养物和细胞因子分析
利用Ficoll密度梯度离心法(Histopaque-1077，Sigma)从新鲜采集的健康志愿者血液(CBR Laboratories，Boston，MA)中分离外周血单个核细胞(PBMC)。使用BDCA4细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)根据制造商的说明书通过正向选择从PBMC分离类浆细胞DC。将人PBMC以5×106细胞/ml接种在48孔平板中。将pDC以1×106细胞/ml接种在96孔培养皿中。向细胞培养物中添加溶于DPBS(pH7.4；Mediatech)的回文免疫调节性寡核苷酸至终浓度为10.0μg/ml。然后将细胞在37℃孵育24小时(IFN-α和IL-6)或48小时(IL-10)，收集上清用于ELISA分析。实验一式三孔进行。通过夹心ELISA测量IFN-α、IL-6和/或IL-10的水平。所需试剂，包括细胞因子抗体和标准品，均购自BDPharMingen。结果示于图5-9。
等同物
尽管为了清楚和理解的目的，已经对上述发明进行了一定程度的详细描述，但通过阅读本文本领域技术人员应当了解在形式和细节方面可以做出不脱离本发明和附属权利要求实质范围的各种变化。

Claims (13)

1.一种回文免疫调节性寡核苷酸，其由选自如下所列的结构组成：
5’-TCG1TCG1TTCTC-Y-G1CTTG1CAAG1CT-5’，
5’-TCG1TCG1TTCTC-Y-GAG1CTTG1CAAG1CTCT-5’，
5’-TCG1TCG1TTCTC-Y-GAGAG1CTTG1CAAG1CTCTCT-5’，
5’-TCG1TCG1TTCTC-Y-GCCGCGCGGC-5’，
5’-TCG1TCG1TTAGA-Y-TG1CTG1CT-5’，或
5’-TCG1TCG1TTC-Y-G1CTTG1CAAG1CT-5’；
其中Y是C3-接头，G1是7-脱氮鸟苷。
2.一种组合物，其包括根据权利要求1的寡核苷酸，以及选自抗体、反义寡核苷酸、蛋白、抗原、变态反应原、化疗剂或佐剂的组分。
3.一种药物组合物，其包含权利要求1的回文免疫调节性寡核苷酸和生理上可接受的载体。
4.根据权利要求3的药物组合物，还包括抗体、反义寡核苷酸、蛋白、抗原、变态反应原、化疗剂或佐剂。
5.回文免疫调节性寡核苷酸在制备用于治疗患有癌症、自身免疫病症、气道炎症、炎性病症、皮肤病症、变态反应、哮喘或病原体引起的疾病的脊椎动物的药物中的用途，所述回文免疫调节性寡核苷酸由选自如下所列的结构组成：
5’-TCG1TCG1TTCTC-Y-G1CTTG1CAAG1CT-5’，
5’-TCG1TCG1TTCTC-Y-GAG1CTTG1CAAG1CTCT-5’
5’-TCG1TCG1TTCTC-Y-GAGAG1CTTG1CAAG1CTCTCv5’，
5’-TCG1TCG1TTCTC-Y-GCCGCGCGGC-5’，
5’-TCG1TCG1TTAGA-Y-TG1CTG1CT-5’，或
5’-TCG1TCG1TTC-Y-G1CTTG1CAAG1CT-5’；
其中Y是C3-接头，G1是7-脱氮鸟苷。
6.根据权利要求5的用途，其中所述药物是通过选自非消化道、口服、舌下、经皮、局部、粘膜、吸入、鼻内、气溶胶、眼内、气管内、直肠内、阴道、基因枪、皮肤贴片、滴眼剂和漱口剂的途径施用的药物。
7.根据权利要求5的用途，其中所述药物是与抗体、反义寡核苷酸、蛋白、抗原、变态反应原、化疗剂或佐剂联用的药物。
8.回文免疫调节性寡核苷酸在制备用于在脊椎动物中产生免疫应答的药物中的用途，所述回文免疫调节性寡核苷酸由选自如下所列的结构组成：
5’-TCG1TCG1TTCTC-Y-G1CTTG1CAAG1CT-5’，
5’-TCG1TCG1TTCTC-Y-GAG1CTTG1CAAG1CTCT-5’，
5’-TCG1TCG1TTCTC-Y-GAGAG1CTTG1CAAG1CTCTCT-5’，
5’-TCG1TCG1TTCTC-Y-GCCGCGCGGC-5’，
5’-TCG1TCG1TTAGA-Y-TG1CTG1CT-5’，或
5’-TCG1TCG1TTC-Y-G1CTTG1CAAG1CT-5’，
其中Y是C3-接头，G1是7-脱氮鸟苷。
9.根据权利要求8的用途，其中所述药物是通过选自非消化道、口服、舌下、经皮、局部、粘膜、吸入、鼻内、气溶胶、眼内、气管内、直肠内、阴道、基因枪、皮肤贴片、滴眼剂和漱口剂的途径施用的药物。
10.根据权利要求8的用途，其中所述药物是与抗体、反义寡核苷酸、蛋白、抗原、变态反应原、化疗剂或佐剂联用的药物。
11.回文免疫调节性寡核苷酸在制备用于在脊椎动物中预防癌症、自身免疫病症、气道炎症、炎性病症、皮肤病症、变态反应、哮喘或病原体引起的疾病的药物中的用途，所述回文免疫调节性寡核苷酸由选自如下所列的结构组成：
5’-TCG1TCG1TTCTC-Y-G1CTTG1CAAG1CT-5’，
5’-TCG1TCG1TTCTC-Y-GAG1CTTG1CAAG1CTCT-5’，
5’-TCG1TCG1TTCTC-Y-GAGAG1CTTG1CAAG1CTCTCT-5’，
5’-TCG1TCG1TTCTC-Y-GCCGCGCGGC-5’，
5’-TCG1TCG1TTAGA-Y-TG1CTG1CT-5’，或
5’-TCG1TCG1TTC-Y-G1CTTG1CAAG1CT-5’，
其中Y是C3-接头，G1是7-脱氮鸟苷。
12.根据权利要求11的用途，其中所述药物是通过选自非消化道、口服、舌下、经皮、局部、粘膜、吸入、鼻内、气溶胶、眼内、气管内、直肠内、阴道、基因枪、皮肤贴片、滴眼剂和漱口剂的途径施用的药物。
13.根据权利要求11的用途，其中所述药物是与抗体、反义寡核苷酸、蛋白、抗原、变态反应原、化疗剂或佐剂联用的药物。
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