CN101341402B - 提高毛细管区带电泳灵敏度的方法和仪器 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及提高毛细管区带电泳(CZE)灵敏度的新方法和仪器。本发明尤其关注包含含有在线溶胶-凝胶的柱子形成的通道的用于浓缩毛细管区带电泳样品的装置和本装置提高毛细管区带电泳的灵敏度的用途。

Description

提高毛细管区带电泳灵敏度的方法和仪器
与相关申请交互参考
本申请要求美国专利申请序列号60/693047(2005年6月23日提交)的优先权，该申请在此被完整引用。
发明领域
本发明涉及提高毛细管区带电泳(CZE)灵敏度的新方法和仪器。本发明尤其关注由包括在线溶胶-凝胶柱的通道组成的可以浓缩毛细管电泳样品的仪器，以及使用该仪器提高毛细管区带电泳的灵敏度。
发明背景
对生物分子包括蛋白质、多肽和DNA进行分析的需求日益增长。毛细管电泳(CE)是一种基于分子的大小和电荷进行分离的方法。在毛细管电泳中，分子进入液体填充的毛细管并受到电场的作用(见Kemp，G.(1998)“CAPILLARY ELECTROPHORESIS：A VERSATILE FAMILYOF ANALYTICAL TECHNIQUES(毛细管电泳：一类多功能分析技术)，”Biotechnol.Appl.Biochem.27：9-17；Wu，D.等.(1992)。Schwartz，H等人对毛细管电泳技术进行了综述(“SEPARATION OF PROTEINS ANDPEPTIDES BY CAPILLARY ELECTROPHORESIS：APPLICATION TO ANALYTICALBIOTECHNOLOGY(蛋白和肽的毛细管电泳分离：分析型生物及栓的应用)，”Beckman BioResearch Literature No.727484)。
由于可以实现快速、高效的样品分离并且需要的样品体积最小，毛细管电泳(CE)已成为传统的平板凝胶电泳分离生物分子的一个非常具有吸引力的替代方法(Monton，M.R.(2005)“RECENTDEVELOPMENTS IN CAPILLARY ELECTROPHORESIS-MASS SPECTROMETRYOF PROTEINS AND PEPTIDES(蛋白质和肽的毛细管电泳-质谱分析的新进展)，”Anal Sci.21(1)：5-13)。人们之前描述了许多进行毛细管电泳的方法(例如见美国专利：RE37,606；6,440,284；6,436,646；6,410,668；6,372,353；6,358,385；6,355,709；6,316,201；6,306,273；6,274,089；6,235,175；6,153,073；6,129,826；6,107,044；6,074,542；6,068,752；6,042,710；6,033,546；6,001,232；5,989,399；5,976,336；5,964,995；5,958,694；5,948,227；5,916,426；5,891,313；5,846,395；5,840,388；5,777,096；5,741,411；5,728,282；5,695,626；5,665,216；5,582,705；5,580,016；5,567,292；5,552,028；5,545,302；5,534,123；5,514,543；5,503,722；5,423,966；5,421,980；5,384,024；5,374,527；5,370,777；5,364,520；5,332,481；5,310,462；5,292,416；5,292,372；5,264,101；5,259,939；5,139,630；5,120,413；5,112,460；5,015,350；4,865,706)。在CE中通常使用的分离机制有两种：根据被分析物的分子大小进行分离和根据被分析物电荷密度(电荷/质量比)的差异进行分离。
“毛细管凝胶电泳”(“CGE”)根据分子大小差异分离分析物。典型的CGE中使用具有一定孔径的凝胶基质。不同大小的分子穿透凝胶基质的能力不同从而实现分离。由于小分子穿过分离胶的速度大于大分子所以可以实现按分子大小分离。为了将CGE应用于多肽和蛋白质的分离需将所述分子变性(例如使用十二烷基硫酸钠(SDS))，这样所有的分析物就具有相同的有效电荷密度。以下文献均对CGE进行了讨论：Bean，S.R.等(1999)(“SODIUM DODECYL SULFATE CAPILLARY ELECTROPHORESIS OF WHEAT PROTEINS.1.UNCOATEDCAPILLARIES(小麦蛋白的十二烷基硫酸钠毛细管电泳.1.未包被毛细管)，”J.Agric.Food Chem 47(10)：4246-55)；Wu，D.等.(1992)(“SODIUM DODECYL SULFATE-CAPILLARY GEL ELECTROPHORESIS OFPROTEINS USING NON-CROSS-LINKED POLYACRYLAMIDE(使用非交联聚丙烯酰胺分析蛋白的十二烷基硫酸钠-毛细管凝胶电泳)，”J.Chromatogr.608：349-356)；Lausch，R.等(1993)(“RAPID CAPILLARYGEL ELECTROPHORESIS OF PROTEINS，”J.Chromatogr.654：190-195)；Manabe，T.等.(1998)(“SIZE SEPARATION OF SODIUM DODECYLSULFATE COMPLEXES OF HUMAN PLASMA PROTEINS BY CAPILLARYELECTROPHORESIS EMPLOYING LINEAR POLYACRYLAMIDE AS A SIEVINGPOLYMER(采用线性聚丙烯酰胺作为筛分聚合物对人血浆蛋白的十二烷基硫酸钠复合体进行分子大小分离)，”Electrophoresis19：2308-2316)；and Ganzler，K.等.(1992)(“High-PerformanceCapillary Electrophoresis of SDS-Protein Complexes UsingUV-Transparent Polymer Networks(使用UV-透光聚合物网络的SDS-蛋白复合体的高效毛细管电泳)，”Anal.Chem.64：2665-2671)。
相反的是，毛细管区带电泳(“CZE，”也被称为自由溶液CE(FSCE))根据电荷密度的差异分离分析物。这些差异引起不同的电泳迁移率，因此出现不同的迁移速度。总体来说，CZE包括将样品加入毛细管筒(tube)并将该毛细管筒置于电场中。电场推动样品穿过毛细管筒，并将各组份分离(即，样品的每一种组份具有各自的电泳迁移率；电泳迁移率大的组份比迁移率小的组分可以更快地通过毛细管筒)。结果，在穿过毛细管筒的过程中所述样品的不同组份被分离至不连续的区带中。在线检测器可以持续监控分离过程并提供不连续区带中各组份的数据。检测器在特定波长下检测每一组份的吸光度；不同的组分吸光度不同，正是由于这一点才可以将不同组份区分开来。
根据毛细管筒的填充物可大致将CZE分为两大类。在“凝胶”CZE中，毛细管筒中填充的是合适的凝胶，例如聚丙烯酰胺凝胶。对样品组份的分离部分取决于穿过凝胶基质的组份的大小和电荷。在“开放式”CZE中，毛细管筒中填充的是导电性缓冲液。当毛细管发生电离时，毛细管壁的负电荷从缓冲液中吸引一层正离子。由于这些离子向负极移动，在电势的影响下，总体溶液(缓冲液和其中被分析的样品)也必须向这一方向移动以保持电中性。这一电渗流提供了一个可驱动中性样品和离子样品向负极移动的固定速度分量，与所带电荷无关。毛细管使用的材料主要是熔炼石英，因为该物质可以承受CZE中相对较高的电压而且熔炼石英的内壁可以电离产生负离子引起所需要的电渗流(例如见WO9310258A1)。
为了使CZE达到最佳分离效果，使用均质缓冲液并在毛细管的整个长度保持恒定的电场强度是非常重要的。分离主要依赖于溶质酸性基团的pH依赖型解离或是溶质碱性功能基团的质子化作用。因此，可以通过改变缓冲系统的pH值或改变其离子强度提高CZE分离分析物的能力和分离的程度或范围。通常情况下，开放式CZE中使用的缓冲液的pH都是以样品组份的等电点(pI)为参考进行选择。
以下文献中均对CZE进行了讨论：Quirino，J.P.等.(2001)(“SAMPLE STACKING OF CATIONIC AND ANIONIC ANALYTES INCAPILLARY ELECTROPHORESIS(毛细管电泳中阳离子和阴离子分析物的样品堆叠)，”J Chromatogr A.902(1)：119-135)；Kasicka，V.(2004)(“RECENT ADVANCES IN CAPILLARY ELECTROPHORESIS AND CAPILLARYELECTROCHROMATOGRAPHY OF PEPTIDES(肽的毛细管电泳和毛细管色谱新进展)，”Electrophoresis 24(22-23)：4013-4046)；Kasicka，V.(2001)(“RECENT ADVANCES IN CAPILLARY ELECTROPHORESIS OF PEPTIDES(肽的毛细管电泳新进展)，”Electrophoresis 22(19)：4139-4162)；Bossuyt，X.(2003)(“SEPARATION OF SERUM PROTEINS BY AUTOMATED CAPILLARYZONE ELECTROPHORESIS(自动毛细管区带电泳对血清蛋白的分离)，”Clin Chem Lab Med.41(6)：762-772)；and Monton，M.R.(2005)(“RECENT DEVELOPMENTS IN CAPILLARY ELECTROPHORESIS-MASSSPECTROMETRY OF PROTEINS AND PEPTIDES(蛋白和肽的毛细管电泳质谱新进展)，”Anal Sci.21(1)：5-13)，见美国专利申请2002/0029968(Tan等)；2002/0055184(Naylor等)；2002/0119482(Nelson等)；2003/0057092(Chien等)；2003/0217923(Harrison等)；2003/0224436(Nelson等)；U.S.Patents Nos.4,483,773(Yang)；4,793,920(Cortes等)；5,120,413(Chen等)；5,139,630(Chen)；5,145,567(Hseih等)；5,164,055(Dubrow)；5,202,006(Chen)；5,264,095(Hseih等)；5,310,462(Chen)；5,340,452(Brenner等)；5,348,658(Fuchs等)；5,405,782(Kohn等)；5,423,966(Wiktorowicz)；5,453,382(Novotny等)；5,571,680(Chen)；5,593,559(Wiktorowicz)；5,599,433(Keo等)；5,753,094(Alter等)；5,766,435(Liao等)；5,770,029(Nelson等)；5,999,681(Grabbe等)；6,007,690(Nelson等)；6,074,541(Srinivasan等)；6,074,827(Nelson等)；6,344,326(Nelson等)；6,416,642(Alajoki等)；6,428,666(Singh等)；6,432,290(Harrison等)；6,475,362(Gorfinkel等)；6,475,363(Ramsey)；6,613,525(Nelson等)；6,664,104(Pourahmadi等)；6,686,035(Jiang等)；6,695,009(Chien等)；6,759,126(Malik等)；6,764,817(Schneider)；6,770,201(Shepodd等)；and6,787,016(Tan等)；欧洲专利文件EP0852007A1；EP0572604A1；EP0518475A1；和EP0517370A1；以及PCT公开WO9310258A1。
高峰容量(即，每单位时间可分离的峰数)使CZE成为一种分析各种生物分子的有效方法，包括蛋白质和多肽(Kasicka，V.(2004)“RECENT ADVANCES IN CAPILLARY ELECTROPHORESIS AND CAPILLARYELECTROCHROMATOGRAPHY OF PEPTIDES(肽的毛细管电泳和毛细管色谱新进展)，”Electrophoresis 24(22-23)：4013-4046；Kasicka，V.(2001)“RECENT ADVANCES IN CAPILLARY ELECTROPHORESIS OF PEPTIDES(肽的毛细管电泳新进展)，”Electrophoresis 22(19)：4139-4162；Bossuyt，X.(2003)“SEPARATION OF SERUM PROTEINS BY AUTOMATED CAPILLARYZONE ELECTROPHORESIS(自动毛细管区带电泳对血清蛋白的分离)，”Clin Chem Lab Med.41(6)：762-772)；Monton，M.R.(2005)“RECENTDEVELOPMENTS IN CAPILLARY ELECTROPHORESIS-MASS SPECTROMETRYOF PROTEINS AND PEPTIDES(蛋白和肽的毛细管电泳质谱新进展)，”Anal Sci.21(1)：5-13)；核酸分子(Mitchelson，K.R.(2001)“THEAPPLICATION OF CAPILLARY ELECTROPHORESIS FOR DNAPOLYMORPHISM ANALYSIS(毛细管电泳分析DNA多形性的应用)，”Methods Mol Biol.162：3-26)；药物(Hilhorst，M.J.等(2001)“CAPILLARYELECTROKINETIC SEPARATION TECHNIQUES FOR PROFILING OF DRUGSAND RELATED PRODUCTS(药物及相关产物图谱的毛细管电动力学分离技术)，”Electrophoresis 22(12)：2542-2564)，农业化合物(Menzinger，F.等(2000)“ANALYSIS OF AGROCHEMICALS BY CAPILLARYELECTROPHORESIS(农业化学品的毛细管电泳分析)，”J Chromatogr A.891(1)：45-67)甚至细菌和病毒(Kremser，L.等(2004)“CAPILLARYELECTROPHORESIS OF BIOLOGICAL PARTICLES：VIRUSES，BACTERIA，ANDEUKARYOTIC CELLS(生物学颗粒的毛细管电泳分析：病毒、细菌和真核生物细胞)，”Electrophoresis 25(14)：2282-2291)。
虽然CZE具有许多优点，但是CZE基于浓度的检测限远小于HPLC并且还不足以满足很多实际应用的要求。CZE的局限性反应出毛细管筒流动室中极短(通常是HPLC流动室路径长度的1％)的毛细管内路径长度(即，检测窗)。较短的路径长度意味着必须有更高的分析物浓度才可以被检测到(Shihabi，Z.K.(2000)“STACKING INCAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS(毛细管区带电泳中的堆叠)，”JChromatogr A.902(1)：107-117)。
在某些情况下，样品中分析物的浓度可能会太低而不能使用CZE进行分离。虽然可以使用传统方法将这些样品浓缩，但是浓缩后体积变小，阻碍对样品的操作，并且这一处理可能会引起分析物的损失。在某些情况下，使用电动进样可以降低对样品离子化曲线的要求，但是精确度差。样品中的高盐浓度也可能导致较高的局部电流并引起不必要的发热。
一种提高CZE灵敏度的方法涉及到对毛细管检测窗的调节(Quirino，J.P.等(2001)“SAMPLE STACKING OF CATIONIC AND ANIONICANALYTES IN CAPILLARY ELECTROPHORESIS(毛细管电泳中阳离子和阴离子分析物的样品堆叠)，”J Chromatogr A.902(1)：119-135)。这种调节可以将反应提高10倍。强化检测方法也被应用于解决分析稀释的样品时遇到的问题。这些方法包括质谱分析、光学荧光、电化学氧化或还原、等离子体共振、放射性、折光率和电导率。即使使用最敏感的已知检测方法也还是无法检测非常稀的分析物。
另一种提高对稀释分析物的检测能力的方法是在分离之前或在分离时对样品进行浓缩。分离前或分离过程中的浓缩方法加上使用敏感的检测方法可以大大增加CE的可用性和有效性。但是目前的离线式分离前浓缩方法不但耗时而且可能存在很多样品处理上的风险，例如污染或由于溢出或与容器壁的吸附引起的样品损失。针对这些问题开发了各种在线浓缩方法。一种解决这一问题的方法包括控制样品和背景溶液的组成使被分析物分子“堆叠”。当位于低导电率区域的离子化的分析物分子向毛细管筒中高导电率区域运动时就会发生堆叠现象。由于低电导率区域的电场将高于高电导率区域，低电导率区域的分析物分子将会迅速迁移至两个区域之间的阻隔，使检测灵敏度增加了10至1000多倍。(Quirino，J.P.等(2001)“SAMPLE STACKING OFCATIONIC AND ANIONIC ANALYTES IN CAPILLARY ELECTROPHORESIS(毛细管电泳中阳离子和阴离子分析物的样品堆叠)，”J Chromatogr A.902(1)：119-135；Shihabi，Z.K.(2000)“STACKING IN CAPILLARY ZONEELECTROPHORESIS(毛细管区带电泳中堆叠)，”J Chromatogr A.902(1)：107-117；Gebauer，P.等(2003)“THEORY OF SYSTEM ZONES INCAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS(毛细管区带电泳中的系统区带理论)，”Electrophoresis 23(12)：1779-1785；Beckers，J.L.等(2000)“SAMPLE STACKING IN CAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS：PRINCIPLES，ADVANTAGES AND LIMITATIONS(毛细管区带电泳中的样品堆叠：原理、进展和限制)，”Electrophoresis 21(14)：2747-2767；Beckers，J.L.等(2001)“SYSTEM ZONES IN CAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS(毛细管区带电泳中的系统区带)，”Electrophoresis Oct；22(17)：3648-3658).
虽然这种堆叠有一些益处，但是也存在一些明显的缺陷。很显著的是，虽然堆叠可以提高检测分析物的能力，但是它也提高了污染分析物的浓度。只有在目标分析物的浓度低于背景电解质的浓度时才可能发生堆叠。(Beckers，J.L等(2000)“SAMPLE STACKING INCAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS：PRINCIPLES，ADVANTAGES ANDLIMITATIONS(毛细管区带电泳中的样品堆叠：原理、进展和限制)，”Electrophoresis 21(14)：2747-2767)。而且，在CZE分辨两种分析物的能力直接与他们各自的迁移时间差异的二分之一成正比，与分析物峰标准差的总和成反比。因此，由于样品体积可以影响分析物峰的大小所以使用较大的样品体积可以反向影响峰分辨率(Beckers，J.L.等(2000)“SAMPLE STACKING IN CAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS：PRINCIPLES，ADVANTAGES AND LIMITATIONS(毛细管区带电泳中的样品堆叠：原理、进展和限制)，”Electrophoresis 21(14)：2747-2767)。Shihabi，Z.k.(2000)(“STACKING IN CAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS(毛细管区带电泳中堆叠)，”J Chromatogr A.902(1)：107-117)对进行堆叠的方法进行了讨论。因此该技术也被认为可以提高CZE的灵敏度。
各种机械措施都被用于提高分析物的浓度。Guzman(美国专利号.5202010)公开了一种分析物浓缩器，该浓缩器包含一个含有液体可渗透性薄板和许多覆盖了可以与被分析样品中的目标分析物结合的抗体或其他化学实体的小体的管状结构。操作时，在与样品分析物接触之后冲洗毛细管以去除多余的样品，被结合的目的分析物就被浓缩在这一结构的小体上，然后将其解离并经过处理后用于研究。大家都可以理解这里需要大量对分析物的处理工作。Guzman(美国专利号6,406,604)公开了一种效率更高的分析物浓缩器。这一被公开的仪器包含一个孔径相对较大的并与许多小孔径的分离毛细管相连的运输毛细管。大孔径毛细管中的分析物在大孔径毛细管与分离毛细管之间的结合处被捕获和富集。Naylor等.(美国专利号5,800,692)描述了一种用于毛细管电泳的分离前处理器。所述处理器包括一个浓缩或化学处理样品或催化化学反应的样品处理材料，优选薄膜、凝胶或填充小球的形式。该专利声明所描述仪器尤其适用于浓缩稀释样品或纯化被污染的样品。Zare等(美国专利号6,136,187)公开了一种熔融-渐小(frit-less)毛细管分离装置，在该装置中颗粒被包埋在多孔的甲硅烷溶胶-凝胶基质中。带电荷和不带电荷的分子被包埋在溶胶-凝胶基质中。挥发性的组份可以蒸发并形成硬质多孔玻璃。不同官能团化或衍生化的溶胶-凝胶前体可用于制备具有不同物理性质的溶胶-凝胶玻璃，例如不同的孔径或表面电荷。这种玻璃的多孔性允许质子和其他中性或离子样品扩散，但是阻止了大量的色谱颗粒离开玻璃基质。虽然Zare等人(美国专利号.6,136,187)的方法有一些优点，但是制备所述毛细管筒需要花费大量的时间而且在基质凝固之前包埋样品这一要求降低了峰分辨率。
因此，虽然已有之前的这些进展但是我们仍然需要可以解决分析低浓度样品中存在的问题并且使CET可应用于分析低浓度样品的方法和仪器。
发明概述
详细而言，本发明提供了一种包含由含有色谱吸附颗粒的聚合烷基硅酸盐凝胶基质块材料形成的毛细管筒的通道的溶胶-凝胶浓缩装置，该装置中的凝胶基质在允许溶剂蒸发而不影响该块材料稳定性的条件下聚合。
本发明尤其关注这种溶胶-凝胶浓缩装置的应用，这种装置中的通道可以是一种微通道、一种毛细管筒或一种柱子等。本发明尤其关注这样一种装置的应用，其中的凝胶基质在毛细管筒中聚合，该毛细管筒与多孔玻璃粘结并且微通道包埋在碎片或板中。
本发明也关注这样一种溶胶-凝胶浓缩装置的应用，该装置中的烷基硅酸盐凝胶基质为四乙基原硅酸盐凝胶，并且/或该溶胶-凝胶的聚合经过分步、多步温育。
本发明尤其关注这样一种溶胶-凝胶浓缩装置的应用，其中的分步、多步温育包括在适于促进硅胶块材料聚合并不引起溶剂显著蒸发的条件下加热，然后在足以促进溶剂从聚合硅胶块材料中挥发的条件下温育，然后在足以固化烷基硅酸盐凝胶基质的条件下温育。本发明尤其关注这样一种溶胶-凝胶浓缩装置的应用，其中该装置应用于分析或制备过程以促进对样品中分析物的浓缩。
本发明还关注这样一种溶胶-凝胶浓缩装置的应用，其中的分析或制备方法选自液相色谱、毛细管区带电泳、毛细管电泳、毛细管电色谱法、反相色谱法、离子交换色谱、吸附色谱和正相色谱。
本发明尤其关注这样一种溶胶-凝胶浓缩装置的应用，其中的分析或制备方法选自免疫测定法和酶促反应，并且/或其中的分析物选自蛋白质、肽、核酸分子、药物、农业化合物、细菌和病毒。
本发明还进一步提供了浓缩分析或制备过程中样品分析物的方法，其中该方法包括使用由含有色谱吸附颗粒的聚合烷基硅酸盐凝胶基质组成的溶胶-凝胶浓缩装浓缩分析物，其中所述凝胶基质在足以允许溶剂挥发而且不显著影响硅胶块材料稳定性的条件下聚合。
本发明尤其关注这样一种方法的应用，其中所述装置在毛细管筒中聚合并被多孔玻璃粘结，其中的烷基硅酸盐凝胶基质是四乙基原硅酸盐(tetraethylorthosilicate)凝胶基质，其中的色谱吸附颗粒为十八烷基硅胶(octadecylsilica)颗粒，并且/或其中的溶胶-凝胶的聚合经过分步或多步温育。
本发明还关注这些方法的应用，其中的分步、多步温育包括在适合促进硅胶块材料聚合并且不会引起溶剂显著蒸发的条件下加热，然后在足以促进溶剂从聚合硅胶块材料中挥发的条件下温育，然后在适于固化烷基硅酸盐凝胶基质的条件下温育。
本发明尤其关注这样一些方法的应用，其中所述装置被应用于分析或制备方法中以促进对样品分析物的浓缩。
本发明还关注这样一些方法的应用，其中的分析或制备方法选自液相色谱、毛细管区带电泳、毛细管电泳、毛细管电色谱法、反相色谱法、离子交换色谱(CEC)、吸附色谱和正相色谱。
本发明尤其关注这样一些方法的应用，其中的分析或制备方法是选自免疫测定法和酶促反应。
本发明尤其关注这样一些方法的应用，其中的分析物选自蛋白质、肽、核酸分子、药物、农业化合物、细菌和病毒。
附图简述
图1显示了本发明一个优选实施方案中的TEOS水解和聚合。
图2显示了本发明的一个浓缩装置。
图3显示了使用本发明的一个浓缩装置进行分析物浓缩、洗脱和分离的过程。
图4显示了使用CZE对一种样品的解析。
图5A显示了使用本发明获得的增强的分离效果。图5B显示了
本发明分离马细胞色素C(Hcytc)消化产物峰的能力，该样品浓度低至8000皮摩尔/毫升。
图6显示了本发明浓缩装置分离绵羊细胞色素C(ShCytc)和猪细胞色素C(PcCytc)消化产物的能力，这两种样品具有相同的氨基酸序列。
图7显示了使用本发明浓缩装置分离分析物的重现性。所显示的为含有被还原和烷基化的Hcytc样品在另一台仪器上进样15次后的1-10次进样分离曲线。
图8显示了分析Hcytc消化产物的重现性。
图9显示了本发明的方法和仪器分离酵母己糖激酶肽消化产物的能力。
图10显示了多次分析酵母己糖激酶消化产物的重现性。
图11显示了本发明装置检测极低浓度分析物的能力。图形显示了使用溶胶-凝胶毛细管在不同时间间隔得到的牛己糖激酶消化产物的电泳图：进样0.2皮摩尔(picomoles)(pmoles)并用1.0pmoles/μl洗脱(曲线A)；进样6.25pmoles并用89fmoles/μl洗脱(曲线B)；进样1.25fmoles并用17.8fmoles/μl洗脱(曲线C)。
优选实施方案简述：
本发明涉及提高分析和制备技术(例如毛细管区带电泳(CZE)等)灵敏度的全新方法和装置，尤其满足了将该技术拓展应用于分析样品中低浓度分析物的要求。本发明尤其关注由包含在线溶胶-凝胶柱的通道组成的浓缩装置。
正如这里所使用的，“通道”这一词语意在广泛地包括一种分析物可以流经的装置。这种通道和它们内部的柱子可以是各种长度或几何形状(如圆柱状、“V”形、开放式槽和封闭式管道等等)。这种装置可能包含一种被多孔玻璃粘结的多孔柱填充材料。可用的通道可能是制备型或分析型的柱子(例如内部横断层直径大于2mm的通道)，毛细管(例如内部横断层直径在20μm-2mm的通道)或微管道(例如内部横断层直径小于20μm的通道)等。
正如这里所使用的，“凝胶”这一词语意指至少包含两种组份的体系，其中一种组份提供足够的结构框架以维持一定的硬度，其他组份填充在结构单元或结构空间之间的间隙(见The Encyclopedia ofChemistry，4th Edition(Considine等，Van Nostrum Reinhold，New York(1984)，page 272)。“凝胶”这一词语常指交联聚合物而不是包括缠绕在一起的单体(例如见Hjerten，S.等(1989)“HIGH-PERFORMANCEELECTROPHORESIS OF ACIDIC AND BASIC LOW-MOLECULAR-WEIGHTCOMPOUNDS AND PROTEINS IN THE PRESENCE OF POLYMERS ANDNEUTRAL SURFACTANTS(酸性和碱性低分子量化合物和蛋白质在聚合物和中性表面活性剂存在下的高效电泳)，”J.LIQUID CHROMATOG.12：2471-2499)在内的线性或分支状的聚合物(例如葡聚糖)，但是在毛细管电泳中使用的非交联葡聚糖和聚丙烯酰胺基质也被认为是“凝胶”(例如见Kemp，G.(1998)“CAPILLARY ELECTROPHORESIS：A VERSATILE FAMILY OF ANALYTICAL TECHNIQUES(毛细管电泳：一类多功能分析技术)，”Biotechnol.Appl.Biochem.27：9-17，Wu，D.等(1992)(“SODIUM DODECYL SULFATE-CAPILLARY GEL ELECTROPHORESIS OFPROTEINS USING NON-CROSS-LINKED POLYACRYLAMIDE(使用非交联聚丙烯酰胺分析蛋白的十二烷基硫酸钠-毛细管凝胶电泳)，”J.Chromatogr.608：349-356)。本发明的凝胶可以是交联或非交联聚合物。
这里所使用的“溶胶-凝胶”这一词语意指一种无机的具有催化活性的氧化硅胶，包含悬浮在一种聚合基质(“凝胶”)中的小颗粒(“sols”)。本发明浓缩装置的溶胶-凝胶优选二氧化硅溶胶-凝胶塞，尤其优选经过热聚合形成一块连续的聚合基质(“块材料”)的溶胶-凝胶颗粒。在一个优选的实施方案中，本发明使用一种金属醇盐溶胶-凝胶方法。金属醇盐溶胶-凝胶方法是一种通过水解由水、乙醇、和金属醇盐组成的溶液制备金属氧化物玻璃的方法。如C.J.Brinker等在Sol-Gel Science，Academic Press，Inc.，New York，N.Y.，1990所述，这些金属氧化物或甲硅烷的来源都是RnSi(OR′)4-n的烷氧化合物。虽然也可以使用其他一些化合物例如钛酸盐和锆酸盐，但是这些化合物中最常用的是四乙基原硅酸盐(Si(OC2H5)4)(“TEOS”)。图1显示了本发明一个优选实施方案的TEOS水解和聚合。当这些物质聚合时溶液发生凝胶化。如果湿凝胶中的挥发性溶剂可以蒸发，凝胶就会收缩、变硬并形成硬质的多孔玻璃。最优选生产这种塞的方法是将一种混合物引入毛细管筒然后加热该混合物形成一种凝胶形式。该混合物含有：(a)一种含有三个烃氧基和一个烃基链或双(三烷氧基甲硅烷基)化合物的烷基硅氧烷等，例如烷基硅酸盐(例如四乙基原硅酸盐)，(b)一种有机溶剂(例如乙醇、甲醇、丙醇、甲苯等)和(c)一种无机酸(例如盐酸、磷酸和硝酸等，优选硝酸)。
在优选的实施方案中，溶胶-凝胶柱中的溶胶中含有一种颗粒，例如聚苯乙烯、胶乳、离子交换树脂、聚丙烯酰胺、尼龙、聚乙烯吡咯烷酮或十八烷基硅胶(ODS)颗粒例如Ultrasphere颗粒(BeckmanCoulter，Inc.)。这些颗粒可以具有任何所需的大小并且优选多孔性的、具有各种所需要的孔径，孔径大小取决于被分离分析物的大小(例如100
Figure 2006800309343_0
，500
Figure 2006800309343_1
、3μm、5μm、10μm等)。优选用甲硅烷涂渍这些颗粒，尤其优选含有4、8或18个碳的甲硅烷。优选使用有机或无机官能团对这些颗粒的表面进行修饰。有机聚合物(例如聚乙二醇)也可包括在内。可以通过改变吸附颗粒的大小或所使用的水和有机溶剂的比例来控制孔径大小(Martin，J.等.(2001)“MECHANICAL AND ACOUSTICALPROPERTIES AS A FUNCTION OF PEG CONCENTRATION IN MACROPOROUSSILICA GELS，”J.Non-Crystalline Solids 285：222-229)。
本发明浓缩装置中溶胶-凝胶柱可用组合物的范围较宽。例如，可以使用0.1M至1.0M的硝酸。在另一个例子中，一种合适的组合物可包括TEOS(例如356μl 99.9％TEOS)而不需要加入有机溶剂。使用这类组合物的不同相对浓度的组分可以改变所形成的溶胶-凝胶块材料的性质，例如多孔性和机械强度。在一个示范性组合物中包括溶解在约156μl 99.5％乙醇中的约200μl 99.9％TEOS并与258μ摩尔硝酸混合(例如258μl 1.0N HNO3)。在这种凝胶组份中约使用485mg的颗粒(形成75％w/v的组成)。可以放大或缩小这类组合物以调节所需要的溶胶-凝胶体积。
本发明装置的溶胶-凝胶柱优选加热聚合尤其优选分步、多步的加热过程。在一个优选的多步过程中，所述溶胶-凝胶组份在适合加速凝胶材料聚合而不引起乙醇显著蒸发的条件下加热。在这一加热过程中，如果乙醇的蒸发影响了块材料的稳定性，就认为这种蒸发是显著的。温育适于在35°-60℃进行。更优选使用两步过程，起始温度约为35°-45℃然后加热至45°-55℃。一个示范性两步过程中包括在约40℃下加热溶胶-凝胶约18小时然后在约50℃下温育约1小时。
经过这样的处理之后，优选将溶胶-凝胶材料在足以促进乙醇蒸发的温度下继续加热(例如60°-80℃)。在一个示范性过程中包括在约70℃下将溶胶-凝胶加热16-18小时。由于聚合物网状结构(基质)已开始形成所以乙醇的挥发不会在很大程度上将块材料去稳定化。如这里所用，如果本发明中的块材料出现了依据本发明目的妨碍其用作浓缩装置的裂缝、开裂或其他缺陷那么就称本发明的块材料已被实质性去稳定化。
因此，使用多步温育过程(通过将乙醇的蒸发延迟至聚合物网状结构开始形成之后)可以得到强度足以在乙醇挥发过程中将块材料聚在一起的聚合物网状结构。因此，可以重复性生成精确长度的块材料。现有技术(Zare等，美国专利号6,136,187)在形成高强度基质前使用的一步100℃加热会产生高乙醇蒸汽压力，因此使块材料去稳定化并将破碎成小块。
经过这样的处理之后，优选在足以固化烷基硅酸盐凝胶基质的温度下对溶胶-凝胶进一步加热。适宜的温育温度在90°-130℃。更优选使用两步过程，起始温度约为90°-110℃然后加热至110°-130℃。在一个示范性两步过程中包括在约100℃下加热溶胶-凝胶至少约1小时然后在约120℃下温育约2小时。也可以温育更长的时间。
在一个优选的多步过程中，将所述溶胶-凝胶组份在25℃下加热1小时，然后在40℃下加热16-18小时，然后50℃加热1小时，然后70℃加热16-18小时，然后100℃加热1小时，然后120℃加热2小时。
优选在该装置所需要的通道(例如毛细管、微通道等)中进行全部或部分聚合。因此，将柱中未聚合的材料、部分聚合的材料或完全聚合的材料引入或应用于该装置形成所需要的通道。优选在使用前将所形成的通道柱冲洗并平衡。可以将样品放入或注入所述柱并通过压力、从出口抽真空和电动方法等将样品浓缩至柱。包括盐在内的杂质可能损害MS分析仪，可以在洗脱样品之前将其冲洗出去。然后用一种缓冲液洗脱样品分析物，该缓冲液含有例如一种可以洗脱一部分，优选可以洗脱全部的吸附在薄层浓缩样品塞上的分析物的有机溶剂。施加分离电压可以通过CZE达到对各组分的分离。由于分析物已被浓缩所以检测更准确。
在优选的情况下，溶胶-凝胶/颗粒基质应该具备使用最小体积的溶剂就可以解吸大部分分析物的性质。在一个优选的实施方案中使用毛细管通道，将柱子牢固地固定在(或锚定)毛细管壁附近，使其可以承受进样时的反复增压过程。在第二种优选的实施方案中使用微型通道，将柱子中填入碎片或薄板从而形成所需要的微型通道。本发明装置中的溶胶-凝胶基质和色谱颗粒优选化学稳定、允许样品分析物重复、相似的吸附和解吸从而可以重复使用的物质。另一个选择就是设计用于一次性分析的该种装置。
在优选的实施方案中，柱子的尺寸在长度上不得超过5mm，内径在约25μm至约360μm的范围内。当然也可以使用更大或是更小的柱子。优选具有足量吸附剂并对所选分析物具有一定结合容量的柱尺寸，当分析物解吸时对于所进行的分析具有足够的可检测性和分离度。虽然本发明尤其适用于毛细管区带电泳，但是应当理解的是本发明的溶胶-凝胶组合物和装置可包含任何直径或长度的柱子并且可包括适用于更大范围分析或制备过程(例如液相色谱(例如微米或纳米液相色谱)、毛细管电泳、毛细管电色谱(CEC)、反相液相色谱、离子交换色谱、亲和色谱、正相色谱和酶反应等)的微米孔或纳米孔柱子。
本发明的浓缩装置可以用于广泛的各式各样的生物分子的分析，包括蛋白质和肽、核酸分子、药物、农业化合物、细菌和病毒。
使用上述溶胶-凝胶浓缩装置有助于分析低浓度样品。之后注入的小体积洗脱液可以快速洗脱高度浓缩并常常是纯化后状态的样品。通过毛细管电泳系统的传统操作甚至可以处理最小体积的样品。由于在被小体积洗脱溶剂解吸之前样品中含有的分析物被逐渐浓缩至微型柱上，所以该装置也可应用于大体积样品。可以通过压力、真空或电压将样品浓缩。
本发明的组合物和方法尤其适用于自动或半自动毛细管电泳系统(例如与美国专利6,001,230；5,320,730等的内容一致)。一种尤其优选的该种电泳系统包括配置有可选择波长的UV/Vis(例如，200、214、254和280nm)检测器、UV光源、双波长激光诱导的荧光检测器、488nm氩离子激光模块、温度可控的存样模块和配置在IBM个人电脑上的32 Karat软件(Beckman-Coulter)。
本发明的组合物和方法也尤其适用于使用微型通道的分析方法。下列文章中描述了形成和使用微型通道的方法：Backhouse，C.J.等(2003)(“IMPROVED RESOLUTION WITH MICROCHIP-BASED ENHANCEDFIELD INVERSION ELECTROPHORESIS，Electrophoresis 24(11)：1777-1786)，Bharadwaj，R.等(2002)(“DESIGN AND OPTIMIZATION OF ON-CHIPCAPILLARY ELECTROPHORESIS，Electrophoresis 23(16)：2729-2744)，Bromberg，A.等(2004)(“MULTICHANNEL HOMOGENEOUSIMMUNOASSAY FOR DETECTION OF 2，4，6-TRINITROTOLUENE(TNT)USINGA MICROFABRICATED CAPILLARY ARRAY ELECTROPHORESIS CHIP，Electrophoresis 25(12)：1895-1900)，Chen，G.等(2004)(“FAST ANDSIMPLE SAMPLE INTRODUCTION FOR CAPILLARY ELECTROPHORESISMICROSYSTEMS，Analyst 129(6)：507-511(Epub 2004 Apr 20))，Chen，S.H.等(2002)(“FLOW-THROUGH SAMPLING FORELECTROPHORESIS-BASED MICROCHIPS AND THEIR APPLICATIONS FORPROTEIN ANALYSIS，Anal.Chem.74(19)：5146-5153)，Doherty，E.A.等(2003)(“MICROCHANNEL WALL COATINGS FOR PROTEIN SEPARATIONSBY CAPILLARY AND CHIP ELECTROPHORESIS，Electrophoresis24(1-2)：34-54)，Du，Y.等(2005)(“MICROCHIP CAPILLARYELECTROPHORESIS WITH SOLID-STATE ELECTROCHEMILUMINESCENCEDETECTOR，Anal.Chem.77(24)：7993-7997)，Futterer，C.等(2004)(“INJECTION AND FLOW CONTROL SYSTEM FOR MICROCHANNELS，LabChip.4(4)：351-356(Epub 2004 May 11))，Griffiths，S.K.等(2002)(“DESIGN AND ANALYSIS OF FOLDED CHANNELS FOR CHIP-BASEDSEPARATIONS，Anal.Chem.74(13)：2960-2967)，Hong，J.W.等(2001)(“MICROFABRICATED POLYMER CHIP FOR CAPILLARY GELELECTROPHORESIS，Biotechnol.Prog.17(5)：958-962)，Jung，B.等(2006)(“ON-CHIP MILLIONFOLD SAMPLE STACKING USING TRANSIENTISOTACHOPHORESIS，Anal.Chem.78(7)：2319-2327)，Lee，G.B.等(2005)(“ON THE SURFACE MODIFICATION OF MICROCHANNELS FORMICROCAPILLARY ELECTROPHORESIS CHIPS，Electrophoresis26(24)：4616-4624)，Li，H.F.等(2004)(“A COMPACTLY INTEGRATEDLASER-INDUCED FLUORESCENCE DETECTOR FOR MICROCHIPELECTROPHORESIS，Electrophoresis 25(12)：1907-1915)，Li，M.W.等(2006)(“DESIGN AND CHARACTERIZATION OFPOLY(DIMETHYLSILOXANE)-BASED VALVES FOR INTERFACINGCONTINUOUS-FLOW SAMPLING TO MICROCHIP ELECTROPHORESIS，AnalChem.78(4)：1042-1051)，Lichtenberg，J.等(2002)(“A MICROCHIPELECTROPHORESIS SYSTEM WITH INTEGRATED IN-PLANE ELECTRODESFOR CONTACTLESS CONDUCTIVITY DETECTION，Electrophoresis23(21)：3769-3780)，Liu，J.等(2004)(“SURFACE-MODIFIEDPOLY(METHYL METHACRYLATE)CAPILLARY ELECTROPHORESISMICROCHIPS FOR PROTEIN AND PEPTIDE ANALYSIS，Anal.Chem.76(23)：6948-6955)，Liu，Y.等(2005)(“STACKING DUE TO IONICTRANSPORT NUMBER MISMATCH DURING SAMPLE SWEEPING ONMICROCHIPS，Lab Chip 5(4)：457-465(Epub 2005 Mar 7))，Pallandre，A.等(2006)(“SURFACE TREATMENT AND CHARACTERIZATION：PERSPECTIVES TO ELECTROPHORESIS AND LAB-ON-CHIPS，Electrophoresis27(3)：584-610)，Petsev，D.N.等(2005)(“MICROCHANNEL PROTEINSEPARATION BY ELECTRIC FIELD GRADIENT FOCUSING，Lab Chip5(6)：587-597(Epub 2005 Apr 15))，Richards，P.等(2002)(“FUNCTIONALPROTEOMICS USING MICROCHANNEL PLATE DETECTORS，”PROTEOMICS，2(3)：256-261)，Rossier，J.等(2002)(“POLYMER MICROFLUIDIC CHIPSFOR ELECTROCHEMICAL AND BIOCHEMICAL ANALYSES，Electrophoresis23(6)：858-867)，Scherer，J.R.等(2001)(“HIGH-PRESSURE GEL LOADERFOR CAPILLARY ARRAY ELECTROPHORESIS MICROCHANNEL PLATES，Biotechniques 31(5)：1150-1152，1154)，Wang，K.等(2006)(“MICROCHANNEL-ELECTRODE ALIGNMENT AND SEPARATIONPARAMETERS COMPARISON IN MICROCHIP CAPILLARY ELECTROPHORESISBY SCANNING ELECTROCHEMICAL MICROSCOPY，J.Chromato gr.A.1110(1-2)：222-226(Epub 2006 Feb 3))，and Xuan，X.等(2005)(“ACCELERATED PARTICLE ELECTROPHORETIC MOTION AND SEPARATIONIN CONVERGING-DIVERGING MICROCHANNELS，Anal.Chem.77(14)：4323-4328)。
本发明的组合物和方法也可与分析过程(例如，免疫分析等；参见美国专利5,863,401)协同使用，从而达到对多种分析物的同时分析。同样的，本发明的组合物和方法也可用于定量液体中总蛋白的各蛋白组份浓度(见美国专利号5,490,909)。
在优选的实施方案中，本发明的浓缩装置也可以对样品脱盐。在高度优选的实施方案中可以调节所述浓缩装置以同时达到对样品分析物的浓缩和被分析样品的脱盐。依据本发明，可以使用单个浓缩装置或多个装置(串联或平行排列)。
与现有技术相比，上述溶胶-凝胶浓缩装置具有多种优点。本发明所述溶胶-凝胶浓缩装置不必与毛细管部件连接。可以用硝酸取代盐酸。由于盐酸与硝酸不同，它可以溶解二氧化硅所以优选硝酸。使用0.1M HCl的又一个缺点是其降低pH值的能力不如硝酸，因此导致在聚缩作用之前的水解不完全从而形成机械强度较弱的基质。相反的是，本发明中形成的基质可以承受很大的压力(例如2000psi或更高)。此外，与现有技术相比本发明的溶胶-凝胶浓缩装置可以使用更少的乙醇和更多的颗粒。这些特点使本发明的溶胶-凝胶块材料不易裂缝和破裂。本发明可以避免使用无涂层硅胶柱(因此避免了基础化合物带来的问题例如基础蛋白和肽的不可逆吸附)。此外，使用分步加热法有利于保护块，并可避免形成不连续片。
在对本发明进行了大致描述后，可通过下列实施例对这些相同的内容有更多的理解。这些实施例只是一些举例说明，除非有特定说明，它们并不限制本发明的应用。
实施例1
使用优选浓缩装置进行CZE分析
根据本发明的原理制成一个柱浓缩装置。这一柱子由内径为25-360nm的毛细管制备而来。柱子的材料是：四乙基原硅酸盐(200μl)、乙醇(156μl)、1.0M硝酸(258μl)和具有不同大小和孔径的色谱颗粒(例如455mg 5μm Ultrasphere
Figure 2006800309343_2
颗粒(Beckman Coulter，Inc.))。
使用下列填柱过程：将200μl四乙基原硅酸盐短时涡旋溶解在156μl乙醇中。然后加入258μl 1.0M硝酸并漩涡混合直至溶液清澈均匀。缓慢加入颗粒并仔细地将颗粒与溶液漩涡混合直至所有的颗粒都被适当润湿。短时超声处理浆状物质去除颗粒周围夹带的空气。通过Teflon
Figure 2006800309343_3
隔膜向装有浆状物质的管形瓶中插入毛细管直至毛细管的末端没入浆状物质。使用氮气罐调节器施加约20lbs/in2(psi)的压力直至约5-10cm的毛细管被填充了浆状物质。
使用下列程序生成硅酸盐溶胶-凝胶：将所有的毛细管平放在烘箱内的托盘上。在室温下(25℃)温育毛细管1.0小时，然后根据下列温度程序加热毛细管筒：400℃加热16-18小时，然后50℃加热1.0hour，然后70℃加热16-18小时，然后100℃加热1小时，然后120℃加热2小时。
图2显示了本发明的一个浓缩装置。图3显示了使用本发明的一个浓缩装置进行分析物浓缩、洗脱和分离的过程。如图3所示，在含有所需CEZ基质的毛细管筒中安装了一个浓缩装置(浓缩器)。加入样品后样品可以与浓缩装置的基质结合。用洗脱缓冲液洗脱后可以得到浓缩的样品。施加电场后可进行电泳并将样品分析物分离。
图4显示了使用本发明的浓缩装置得到的分离曲线。
图5A显示了使用本发明得到的增强的分离效果。如图5A所示，在未进行预浓缩(0.2psi 2秒或1.0psi 5秒)的情况下没有得到任何对马心脏细胞色素C(Hcytc)消化产物的有用分离。50psi时使用0.5cm的ultrasphere(Beckman Coulter，Inc.)溶胶-凝胶塞浓缩3、6或9分钟可以得到分离度更好的峰。图5B显示了本发明分离Hcytc消化产物峰的能力，该样品的浓度低至8000picomol/ml。
图6显示了本发明浓缩装置分离绵羊细胞色素C(ShCytc)和猪细胞色素C(PcCytc)消化产物的能力，这两种样品具有相同的氨基酸序列。如图6所示，用本发明的浓缩装置进行2分钟的预浓缩使被分离的肽片段可以被检测，在相同的情况下，未经预浓缩的样品无法被检测。
图7显示了使用本发明浓缩装置分离分析物的重现性。所显示的为消化之前被还原和烷基化的Hcytc样品的分离曲线。该75μ的毛细管中含有由5μl溶胶-凝胶组成的0.5cm的塞。电泳电压为167v/cm，5kv。用0.5M的乙酸上样然后用60％的乙腈(ACN)上样缓冲液洗脱。图8显示了分析Hcytc消化产物的重现性(7pmole/μ；运行76-91；进样：于25psi，0.4min)。
图9显示了本发明的方法和仪器分离酵母己糖激酶肽消化产物的能力。使用溶胶-凝胶浓缩装置浓缩酵母己糖激酶(5飞摩尔(femtomole)/μl)用于在200nm处检测吸附。图10显示了多次分析酵母己糖激酶消化产物的重现性(10纳摩尔(nanomole)/μl；运行2-10，进样：于25psi，0.4min)。
图11显示了使用本发明装置可以得到的极高检测灵敏度。使用溶胶-凝胶毛细管以不同的时间间隔浓缩牛己糖激酶消化产物(52kDaMW；50飞摩尔(fentomoles)(fmoles))。曲线A表示进样0.2picomoles(pmoles)并用1.0pmoles/μl洗脱得到的电泳图。曲线B表示进样6.25pmoles并用89fmoles/μl洗脱得到的电泳图。曲线C表示进样1.25fmoles并用17.8fmoles/μl洗脱得到的电泳图。
本说明书中提到的出版物和专利在这里的引用相当于明确和单独指明将单个的出版物或专利应用在本文以文献形式引用。
虽然本发明与特定的实施方案一起描述，应当理解的是可以对本发明进行近一步的修改，所以本发明包括任何变体、应用或总体上根据本发明的原理对本发明进行的调整并包括本发明所属技术领域已知的或常规的对本申请公开内容的偏离和对上文中提到的本质特征的应用。

Claims (24)

1.一种溶胶-凝胶浓缩装置，其中所述装置包含含有色谱吸附颗粒的聚合烷基硅酸盐凝胶基质块材料柱子形成的通道，所述凝胶基质在足以使溶剂蒸发的条件下聚合而成，所述凝胶基质通过分步、多步温育法聚合而成，所述装置用于在分析或制备过程中促进对样品分析物的浓缩，其中所述分步、多步温育法包括：
a) 将溶胶-凝胶组合物分步加热到35℃-60℃之间的温度，以加速所述溶胶-凝胶组合物的聚合；
b) 将得自a)的组合物加热至60℃-80℃之间的温度，以蒸发所述溶剂；和
c) 在90℃-130℃之间的温度固化加热的组合物。
2.根据权利要求1所述的溶胶-凝胶浓缩装置，其中所述烷基硅酸盐凝胶基质为四乙基原硅酸盐凝胶基质。
3.根据权利要求1所述的溶胶-凝胶浓缩装置，其中所述色谱吸附颗粒为十八烷基硅胶颗粒。
4.根据权利要求1所述的溶胶-凝胶浓缩装置，其中所述分步、多步温育法包括在适于促进块材料聚合而不会引起溶剂显著蒸发的条件下加热，然后在足以促进溶剂从聚合块材料中蒸发的条件下温育，接着在足以固化烷基硅酸盐凝胶基质的条件下温育。
5.根据权利要求1所述的溶胶-凝胶浓缩装置，其中所述分析或制备过程选自液相色谱、毛细管区带电泳、毛细管电泳、毛细管电色谱法（CEC）、反相色谱法、离子交换色谱、吸附色谱和正相色谱。
6.根据权利要求1所述的溶胶-凝胶浓缩装置，其中所述分析或制备过程选自免疫分析法和酶促反应。
7.根据权利要求1所述的溶胶-凝胶浓缩装置，其中所述分析物选自蛋白质、肽、核酸分子、药物、农业化合物、细菌和病毒。
8.根据权利要求1 所述的溶胶-凝胶浓缩装置，其中所述装置的通道为碎片或薄板型微型通道。
9.根据权利要求1所述的溶胶-凝胶浓缩装置，其中在35-60℃之间加热所述凝胶基质时，使所述凝胶基质聚合。
10.根据权利要求9所述的溶胶-凝胶浓缩装置，其中在第1步骤中在35-45℃之间并在第2步骤中在45-55℃之间加热所述凝胶基质时，使所述凝胶基质聚合。
11.根据权利要求10所述的溶胶-凝胶浓缩装置，其中将所述凝胶基质在第1步骤中在40℃下加热18小时，并在第2步骤中在50℃下加热1小时。
12.根据权利要求1所述的溶胶-凝胶浓缩装置，其中所述块材料能够承受至少2000psi的压力。
13.一种对分析或制备过程中的样品中分析物进行浓缩的方法，其中所述方法包括使用溶胶-凝胶浓缩装置浓缩所述分析物，所述装置包含聚合烷基硅酸盐凝胶基质块材料柱子形成的通道，所述凝胶基质含有色谱吸附颗粒，其中所述凝胶基质在足以使溶剂蒸发的条件下聚合而成，所述凝胶基质通过分步、多步温育法聚合而成，所述装置用于在分析或制备过程中促进对样品分析物的浓缩，所述分步、多步温育法包括：
a) 将溶胶-凝胶组合物分步加热到35℃-60℃之间的温度，以加速所述溶胶-凝胶组合物的聚合；
b) 将得自a)的组合物加热至60℃-80℃之间的温度，以蒸发所述溶剂；和
c) 在90℃-130℃之间的温度固化加热的组合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述烷基硅酸盐凝胶基质为四乙基原硅酸盐凝胶基质。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述色谱吸附颗粒为十八烷基硅胶颗粒。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述分步、多步温育法包括在适于促进块材料聚合而不会引起溶剂显著蒸发的条件下加热，然后在足以促进溶剂从聚合块材料中蒸发的条件下温育，然后在足以固化烷基硅酸盐凝胶基质的条件下温育。
17.根据权利要求13所述的方法，其中所述分析或制备过程选自液相色谱、毛细管区带电泳、毛细管电泳、毛细管电色谱法（CEC）、反相色谱法、离子交换色谱、吸附色谱和正相色谱。
18.根据权利要求13所述的方法，其中所述分析或制备过程选自免疫分析法和酶促反应。
19.根据权利要求13所述的方法，其中所述分析物选自蛋白质、肽、核酸分子、药物、农业化合物、细菌和病毒。
20.根据权利要求13所述的方法，其中所述装置的通道为碎片或薄板型微型通道。
21.根据权利要求13所述的方法，其中在35-60℃之间加热所述凝胶基质时，使所述凝胶基质聚合。
22.根据权利要求21所述的方法，其中在第1步骤中在35-45℃之间并在第2步骤中在45-55℃之间加热所述凝胶基质时，使所述凝胶基质聚合。
23.根据权利要求22所述的方法，其中将所述凝胶基质在第1步骤中在40℃下加热18小时，并在第2步骤中在50℃下加热1小时。
24.根据权利要求14所述的溶胶-凝胶浓缩装置，其中所述块材料能够承受至少2000psi的压力。
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