CN101300470A - 用于进行化验的微机械系统和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种微机械系统，用于进行化验以确定样品中的一种或多种选定的分析物的存在。该装置包括基体和一次性测试片，该一次性测试片具有至少一个反应腔和一个能够移动流体和部分通过所形成的反应腔中流体的可移动部件，该反应室和/或可移动件中的试剂与样品发生反应，生产可物理检测的变化。可移动部件能够运动并因此混合、移动反应组分、交换或有次序地向支架上的目标提供试剂。设置基体中的传感器以检测反应腔中样品和样品中分析物的存在或对其定量。把信号转换成在该基体外部上的可视显示器窗口上的输出。

Description

用于进行化验的微机械系统和方法

本申请要求2003年10月29日提交的美国临时专利申请60/515,731号的权益，该申请的整个内容结合于此供参考。

技术领域

本发明涉及一种用于进行化验以确定样品中的一种或多种选定分析物的存在性的微流体系统。

背景技术

定性和定量的免疫和化学化验作为医疗和食品行业中的一种重要工具已经获得认可。这种方法已经用于疾病诊断、待分析物的检测以及用于检测诸如细菌的微生物。这些诊断方法已经产生效果，并且这些方法已经使外科医生对做各种形式治疗的病人的监控和管理变得比较容易。

传统上，诊断化验在医院和诊所进行，并且涉及复杂和昂贵设备的使用，这些设备需要经过专门训练的人员进行操作。而且，在对病人进行取样之后的若干天或若干周之后还不能得到化验结果。因此现有的诊断化验费用高、耗时长，并且不方便。

对低费用化验技术的开发已经进行过尝试。例如，对于通常的用于检测血液成分的家用自测试，需要用消过毒的采血针对病人穿刺手指，将样品血滴施加到一次性测试片(strip)上的样品施加区，然后等待结果。使用诸如尿的其他体液的化验基本上以类似的方式进行。构造这类装置，使得非专业人士不需要多少训练就能够正确地进行化验。但是这些化验系统通常的缺点是精度低，或需要许多预备性的步骤，这些预备性的步骤会损害测试结果，并且因此不方便。

授予Allen Michael的美国专利5,580,794号公开了一种单一用途的电子化验装置，用于化验给定样品中的特定待分析物。授予Greenquist的美国专利4,806,312号公开了一种具有可检测信号浓度区的多区域分析元件。授予Garcia等人的美国专利4,627,445号公开了一种手持便携式医疗诊断系统，用于检查血糖、尿氮、血红蛋白或血液成分的指标，其中一次性针管或采血针探针包带有诸如血液反应化学物的化学试剂测试片，还有可视读出装置和计算机系统。

授予A.Rosenberg的美国专利4,197,734号公开了一种设备，其能够测量血液的凝结时间。该设备包括用于支撑含有血液样品的注射器的支撑框架和旋转的转台。来自注射器的血液滴在转台上，其中凝结时间由在转台上旋转的图纸自动用图示出。该设备也能够用于确定血浆和其他液体的粘性变化。

授予Greiner等人的美国专利3,486,859号公开了一种设备，其具有双臂保持器，该保持器具有经由微细的毛细管相互连通的血液试剂腔室。设有用于对试剂腔室之一施加压力变化的空气泵，以影响经由该毛细管的液体的周期性混合。还包括指示装置，用于血液凝结时检测毛细管的逐渐变化的流体阻力。

上述方法具有严重的缺陷，使得它们在用于家用时非常困难。其中一些方法需要专门的血液制备和处理，适合于拥有训练有素的医务人员的中心诊所，而另一些则价格昂贵或不精确。因此，需要一种用于检测待分析物的化验系统，它们精确、方便并且不昂贵。

发明内容

本发明提供一种用于进行分析以确定样品中的一种或多种预先选定的待分析物的存在性的方法和微技术系统。该设备包括能够插入便携式手持测试分析机中的一次性的塑料测试片。该测试片把样品隔离使它不与该机器接触并且该样品不被污染。

本发明的一次性的测试片可以具有多个形成在固体支撑上的腔(well)。这些腔能够通过毛细通道相连。所述腔和毛细通道的表面可以用试剂涂覆以有助于把液体样品从样品腔抽进反应腔中。在至少一个反应室里面至少有一个磁性搅拌棒，它能够被该测试分析机中设置在所述测试片外面的磁力运动装置磁性地吸附并驱动。该磁性搅拌棒能够执行运动来混合反应组分、移动反应组分、交换或向支架上的目标系统化地提供试剂等。

该测试片能够放置在具有传感器的便携手持机器上，该传感器构造成可检测和/或定量该测试片的反应腔中的待分析物的存在，同时与物理检测变化相对应，产生与样品中选定的待分析物的存在和/或分析物的量相关的信号。所述试剂可以包括检测系统，因此检测结果的产生与分析物的存在相关。该信号能够转换成基体(base)外部上的可视显示窗口上的输出。

为了测试样品，该一次性的测试片能够插入该基体，并且样品液滴能够被置于该测试片的样品施加腔中。该样品通过内部通道能够被吸进反应腔中。随着样品被吸进反应腔中，传感器检测该运动并在适当的时候激活磁性搅拌棒，该棒混合该样品腔内的试剂。为了定时化验，当电的或光的传感器监控测试片的各部分以获得特定待分析物的响应，包含在该基体内的微处理器开始计时。当检测和/或定量分析时，在该基体上的显示窗口中以适当的单位定性或定量地报告结果。

所述运动和传感器都可以由微处理器来控制。该基体内的用于诸如凝结测试的温度敏感化验的加热装置能够被激活，并且该温度在整个化验期间可以保持恒定或按照预定的方式变化。

在本发明的一个方面描述了一种一次性测试片，所述一次性的测试片包括：第一固体基片，该第一固体基片包括样品收集腔、参考腔和反应腔，其中这些腔经由第一毛细通道流体地连通；和第二固体基片，该第二固体基片包括孔，其中该第一固体基片和第二固体基片接合并且所述各孔与所述各腔连通。

在本发明的另一方面描述了一种一次性测试片，该一次性的测试片包括：第一固体基片，该第一固体基片包括样品施加腔、参考腔和反应腔，其中这些腔经由毛细通道流体地连通，并且其中该参考腔包括第一细胞溶解剂，而反应腔包括第二细胞溶解剂；第二固体基片，该第二固体基片包括孔，其中该第一固体基片和第二固体基片接合并且所述各孔与所述各腔连通；以及具有捕获区的薄膜，该薄膜经由第二毛细通道与所述反应腔连接。

在又一方面，本发明涉及一种方法，用于确定作为HbA1c的血红蛋白的百分比，该方法包括：提供一次性的测试片，该一次性的测试片包括：第一固体基片，该第一固体基片包括样品腔、参考腔和反应腔，其中这些腔经由第一毛细通道流体地连通，并且其中该参考腔包括第一细胞溶解剂，而反应腔包括第二细胞溶解剂、HbA1c专用抗体以及搅拌棒；第二固体基片，该第二固体基片包括孔，其中该第一固体基片和该第二固体基片接合并且所述各孔与所述各腔连通；和具有捕获区的薄膜，该薄膜经由第二毛细通道与所述反应腔连接；把样品放置在所述样品施加腔中；向所述样品施加腔添加稀释剂；由所述参考腔确定血红蛋白总量并由所述捕获区确定HbA1c总量；用所述血红蛋白总量除所述HbA1c总量，获得HbA1c血红蛋白的百分比。

参考下面的详细描述，本发明的这些和其他方面将变得很明了。此外，还叙述了各种参考文献，其中更详细地描述某些过程和组成，并且将这些参考文献结合于此供参考。

附图说明

图1示出一次性测试片的图示，该测试片具有一组相互连通的反应室和其中一个室中的可移动件。

图2示出该一次性测试片的另一个视图，其包括所组装的一组薄膜，用以隔离血液组分，并将所希望的待分析物引导到适当的捕获区。

图3示出该基体装置的主要组成部分的图示，下面将对其进行详细描述。

具体实施方式

1.定义

除非另有说明，在本申请中使用的术语，包括说明书中使用的术语和权利要求书中使用的术语，具有下面给出的定义。应当注意，正如在说明书和权利要求书中所用的，除非从上下文中清楚地规定之外，单数形式的名词也包括指代复数。

无论是前面或后面所引用的所有的公开、专利和专利申请文件，其整个内容结合于此供参考。

正如这里所使用的，术语“受验者(object)”包括哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不限于哺乳动物纲的任何成员：人，诸如黑猩猩、其他猿和猴子的非人类灵长目；诸如牛、马、绵羊、山羊、猪的家畜；诸如兔子、狗和猫的驯养动物；包括诸如老鼠、耗子和豚鼠的啮齿类动物等；非哺乳动物的例子包括但不限于鸟、鱼等。该术语不指特定的年龄或性别。

正如这里所使用的，术语“抗体”包括但不限于大体上由特异性结合并识别分析物(抗原)的免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因组、或由其片断编码的多肽。“抗体”还包括但不限于大体上由特异性结合并识别由响应暴露于毛滴属抗体的宿主产生的抗体的特异性抗原结合区(原型)的免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因组、或由其片断编码的多肽物质。例子包括多细胞系的、单细胞系的、嵌合体的、人源化的以及单链抗体等。免疫球蛋白片断包括Fab片断和由表达库产生的片断，包括噬菌体展示。关于抗体结构和术语，例如可参见Paul的《Fundamental Immunology》，第三版，1993，纽约Raven Press出版社。

术语“特异性结合(specially binds to)”或“特异性免疫性反应(specially immunoreactive with)”是指在有蛋白质和其他生物异类种群的情况下确定目标分析物存在的结合反应。因此，在指定的化验条件下，特异性结合部分(moiety)优先结合于特定的目标分析物，并且不大量结合于测试样品中存在的其他组分。在这种条件下，为了其特定目标分析物的特异性，特异性结合于目标分析物可能要求选定的结合部分。可以利用免疫测定形式的多样性来选择与特定抗原的特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定通常用于选择特异性免疫反应于待分析物的单细胞系抗体。对于免疫测定形式和能够用于确定特异性免疫反应的条件的说明例如参见Harlow和Lace(1988)《Antibodies，A Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor Publication，New York。典型地，特异性的或选择性的反应将提供至少两倍于背景的信噪比，更典型地，提供超过10到100倍于背景的信噪比。

正如这里所使用的，术语“标记(lable)”和“可检测标记(detectable)”是指可检测下述内容的分子，包括但不限于，放射性同位素、荧光增白剂、化学荧光剂、载色体、酶、酶基片、酶抑制剂、载色体、染色剂、金属离子、金属溶液、配合基(例如，维生素H、抗生物素蛋白、连锁状抗生物蛋白或半抗原)等。

正如这里所使用的，术语“固态支撑”是指诸如塑料板、磁珠、胶乳珠、微量测试孔盘(microtiter plate well)、玻璃板、尼龙、琼脂胶糖、丙稀酰氨等的固体表面。

在谈及两种分子或分子与分子复合体的结合的时候，“特异性(specific)”是指彼此的特异性识别以及稳定复合体的形成，相比较地，不大识别另外的分子并缺少与这些另外分子的稳定复合体的形成。特异性结合的例子是抗体-抗原相互作用、酶-基质相互租用、多核甙酸杂化作用和/或双重的形成、细胞受体-配合基相互作用，等等。

II概述

本发明涉及能够进行定性和定量的免疫化验和化学化验的一次性测试片。在该测试片上至少有三个腔，其中这些腔经由毛细通道相互流体连通。一个腔中放置用于分析的样品，优选为液体样品。该样品流体经由毛细通道流入另两个腔。其中一个腔可用作测量样品中的待分析物总量的标准。另一个腔可用作能够识别样品各组分的反应腔。该一次性的测试片能够放置在分析器(这里也称作“基体”)中，该分析器检测样品的各组分和样品中的待分析物总量。该分析器包括能够显示分析结果以及在化验操作中提供命令的显示系统。

在一种应用中，能够确定人体红血球中的作为血红蛋白A1c(HbA1c)的血红蛋白总量的百分率。来自受验者的血液可被沉淀于样品腔中。该血液经由毛细通道流动到另外两个腔中。在参考腔中可放置溶解细胞的试剂，从而使得从红血球中释放血红蛋白。在参考腔中的血红蛋白的浓度能够用红外或紫外测量法来测量。在反应腔中可放置溶胞物，已知量的特异于HbA1c的抗体，以及磁搅拌器。当血液流入反应腔中时，磁力搅拌该腔中的液体从而使它们很好地混合。溶胞物溶解细胞，而抗体结合于HbA1c。在规定的时间段之后，该显示器能够指示操作者对反应腔添加稀释剂。该稀释剂将反应室中的液体通过毛细通道推向一个或多个捕获区。这些捕获区只把结合于所限定抗体复合体的抗原固定在其上，而把结合于所有抗体的其他抗原固定在该区域的不同部分。抗体-HbA1c复合体能够被该捕获区的第一部分中的抗原捕获，并且所有的抗体能够被该捕获区后一部分中的抗原捕获。可使用检测系统来检测结合在该捕获区的第一和第二部分的抗体。两个区域的比例和/或总量可用于确定出现在样品中的HbA1c的量。第一区域与参考腔中血红蛋白总量的比能够提供血液样品中的HbA1c的百分比。这个结果能够在显示系统中显示。

III.微机械系统

本发明涉及一种一次性的测试片，一种便携式手持机器(即基体)以及包括这种测试片和这种基体的结合体。该测试片可放置在该机器中，用于进行化验，用于检测分析物，并显示诸如命令和结果的信息。该一次性测试片的一个方面示于图1。该一次性测试片通过把两个或更多个固体支撑连接在一起而形成，这些固体支撑的其中至少一个具有槽。所述固体支撑可以是矩形、圆形、椭圆形或任何其他形状。该支撑可以选用性质合适的材料制造，例如良好的热传导性、光传输的透明性、便于焊接的机械特性、能够均匀涂覆和试剂稳定性的表面特性，以及能够防止干扰化验的对液体介质的中性。为此，例如包括高自由表面能量和低吸水性的合适的塑料，包括PETG，聚酯

聚碳酸酯聚氯乙烯、聚苯乙烯、SAN、丙稀腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)，尤其是由Borg Warner按商标Cyclac供给的特定ABS。当固体支撑是疏水塑料时，可以用本领域已知的方法，例如等离子体蚀刻和电晕处理，进行处理以赋予其表面亲水性。可选地和等效地，可以利用商业上可得到的模制固体支撑来实践本发明。

为了说明，本发明的实施例通过参考连接两个固体支撑而形成的一次性测试片来进行描述。至少该固体支撑其中之一具有用作反应室5和7的槽或凹腔以及毛细通道2和8。该槽可以是任何几何形状，并且优选为圆形。该槽的尺寸应当具有足够的容积以容纳样品并且能够发生反应。因此，圆形槽的直径根据支撑材料的宽度和长度在0.01mm到100mm之间，而其深度根据支撑材料的厚度在约0.001到约4mm。槽的直径和深度很容易由本领域的技术人员确定。在本发明的一方面。支撑件之一具有钻通至该槽的孔，其中该孔用作通气孔3和6。而且，该孔使得能够到达放置样品的腔，例如样品施加腔1。在这两个件连接之前，可移动件4可以插入所希望的反应室5中。

在模制过程中，至少在靠近两个塑料件至少其中之一的槽的周边邻近处的轮廓线上需要有能量引导隆起。当超声焊接时，两个塑料件沿着绕所述室和通道形成气密密封的能量隆起胶接在一起，从反应室到外部的通路只有通气孔和样品施加腔。反应室的表面可选地是稍稍具有纹理的，用于与可移动件一起使用。该纹理可调节膨胀压力∏。在两个板浸入介质中的情况下，∏是必须施加到所述板之间的介质上以维持给定间隔的超过外部压力的压力。在这种情况下，∏在数值上就是该可移动件和该反应室表面之间在每单位面积上的吸力或推力。该可移动件越宽，该表面之间的压力越大，并且该纹理消除该可移动件在该反应室壁上的任何不希望的吸附。膨胀压力更一般的定义是

$\mathrm{\Π}=-1/A(\∂G/\∂x)A,T,V$ 其中

A是面积

T是温度

V是容积

G是吉伯(Gib)自由能量

可移动件4可以用不锈钢或不锈钢与任何其他所希望的材料的组合来制造以使得它能够被外部的磁移动装置吸引或驱动。该材料可以是任何可磁化合金的形式，用不锈钢覆盖以防止腐蚀，或用于结合特殊分子的特殊涂覆。可移动件的厚度根据反应室深度确定，它足够小以适合于在该反应室中并自由移动。对于深度为0.01英寸的反应室空腔，可移动件的厚度在0.007到0.008英寸之间。

把样品施加于反应室的方式，以及把诸如盐、糖等溶液的其他试剂施加于通道的方式，包括喷射、涂刷、冻干、蒸发、吸附、共价结合等。对于具有大微粒组分的试剂，喷射涂刷或冻干比较适合。当在室温下进行分配时，由于液滴的尺寸，皮米滴尺寸的生物沉淀作用导致瞬时的干燥。

组装后的一次性测试片示于图2，其中5是吸收垫，7是内参考薄膜条，9是毛细通道，11是反应室，13是毛细通道，15是样品容器，17是样品施加口，19是反应室，21是可移动件，23是基薄膜25上的捕获区。

图3是分析器的主要部件的图示，在施加测试样品之前，把一次性测试片插入其中。该一次性测试片可以安置在该基体上的46。该测试片可以放置在加热器组件44的顶上，该加热器组件可以容纳埋入其中或附近的传感器(发射器或检测器)，但是设置成使信号通过所述反应室。另一组传感器也可以用作发射器、检测器，或都可以设置在该一次性测试片的另一侧(未示出)。应当理解，根据所使用的检测机构，这种反射光束装置、检测器和发射器也可以在该测试片的同一侧。检测机构不限于光学检测方法，也可以用诸如电的、放射性的和其他方法。电子显示窗口30可以是但不限于液晶显示器LCD。28表示薄膜上的开关或键，用于从LCD上所显示的菜单中的功能项中做选择。电路板36包括控制分析器的操作和机构的微处理器。电能可以用电池38或任何其他交流电源供给。电机40驱动磁铁42，两者可用连杆连接。该电机和磁铁形成的运动模式负责建立可移动件在该一次性测试片的一个或多个反应室中的相应的运动。32表示到外部电源的连接器，34表示用于数据输出的连接器。

利用本发明的一次性测试片和相关方法来使用的用于自动检测的检测系统的例子包括激励源、单色光镜(或能够光谱分辨光成分的任何装置或一组窄带滤光片)和检测器阵列。该激励源能够包括红外、蓝或紫外(UV)波长并且该激励波长可以比待检测的发射波长更短。该检测系统可以是：一个宽带紫外(UV)光源，例如前面有滤光片的氘灯；氙灯或者氘灯之类的白光源经过单色仪之后提取到所期望波长的输出；或者若干连续波气体激光器中的任何一种，包括但是不限于氩离子激光线(457，458，514nm等等)或者氦镉(HeCd)激光器；处于蓝光段的固体二极管激光器，例如氮化镓基和砷化镓基(双基)激光器，或者YAG基或者YLF基激光器的二倍频或者三倍频输出；或者具有以蓝光输出的任何一种脉冲激光器。

从样品或反应腔中的反应物发射的光可以利用提供用于基片的光谱信息的装置来检测，例如光栅分光计、棱镜分光计、成像分光计等，或使用干涉(带通)滤光片。利用诸如CCD照相机的两维区域成像器，许多物体可以同时成像。通过经由不同的带通、长通或短通滤光片(干涉滤光片，或电调谐滤光片是合适的)收集多于一个的成像的信息，可以生产光谱信息。可使用多于一个的成像器通过专用滤光片来同时收集数据，或者可以在单个成像器的前面改变滤光片。基于成像的系统，如生物特征成像(biometric imaging)系统，扫描表面来发现有荧光的信号。

适于本系统的其他实施例包括利用试剂涂覆薄膜系统作为该测试片的一部分，设置成使得样品流可在整个测试片系统内连续并被引导。传感器系统设置成能够监控用于被测试的分析物或反应的该测试片的薄膜部分。

IV.操作

图3所示的该装置的一般操作模式包括将图1和图2所示的一次性测试片插入接受器中，使得该测试片只在一个位置。为了在特定的温度下进行化验，加热器组件44把该一次性测试片加热到由微处理器所控制的希望温度。在测试片插入并且分析器启动之后，LCD提示简单的步骤，操作者可以按照这些步骤来操作，包括把样品添加到样品接收器中。该装置可选择地具有用于确定反应室中足够量样品存在的传感器，和起动、停止化验定时的机构。该传感器检测来自该反应完成的信号，例如测量通过该反应室的壁发射并引导的光信号的传输。

所施加的样品经由毛细通道正确地分布在各反应室中。安置这些反应室使得在各反应室中可以独立地进行反应，即便它们共享来自同一池的共用样品。可运动件形成的运动模式确保试剂与样品混合物适当的混合并且还促进室中的试剂和样品的交流。对于需要对分析物进行定量化验的情况，传感器系统监控一个或多个反应室中的变化、薄膜系统或可移动件，直到到达所希望的结束点。对于只要求确定分析物存在的化验，传感器系统在适当的时间段监控该测试片的规定部分。微处理器计算定量或定性的结果，把结果显示在显示器上。然后在化验结束后可以抽出该测试片并清除掉。

因此，操作者将测试片插入分析器的测试片接收器中。然后操作者按下起始按钮，该按钮也能够被该测试片本身自动起动，等待提示以添加样品滴，然后根据化验的类型通常在数分钟或数秒钟内从显示器得到结果。

V.检测血红蛋白A1c(HbA1c)

糖化血红蛋白指的是次要血红蛋白组分(minor hemoglobincomponents)序列，是通过葡萄糖附着在血红蛋白分子上而形成的。人的红血球自由地透过葡萄糖。每个红血球内，糖化血红蛋白按照与周围葡萄糖的浓度成正比的速度形成。环绕红血球的血红蛋白总量的约97％是血红蛋白A。血红蛋白A由四种多肽链构成，两种a-链，两种b-链。血红蛋白A的糖化通过葡萄糖与每个b-肽链N端纈氨酸氨基酸的共价连接而发生。起初形成不稳定的席夫碱(醛亚氨)，然后经受不可逆转的阿马多里重排反应形成稳定的氨基酮，即血红蛋白A1c(HbA1c)。

包含红血球的血红蛋白A的寿命平均为120天。糖化血红蛋白A对HbA1c的百分比与红血球暴露于葡萄糖的时间和遇到的葡萄糖的平均浓度成正比。HbA1c部分的测定给出红血球半寿命期、即最后60天内的平均血糖浓度的整体情况。HbA1c的水平通常表示为血红蛋白总量的百分比。

在正常的受验者中，HbA1c通常在血红蛋白总量的3-6％的范围。在葡萄糖升高的病人中，即在I型和II型糖尿病中可以上升到正常人上限的两倍或以上。

对糖尿病患者的葡萄糖量的长期控制是很重要的。长年血液中太多的葡萄糖能够危害眼睛、肾和神经。同时也增加心脏和血管疾病的危险。作为血红蛋白总量的百分比的HbA1c的测量提供评价葡萄糖量的长期控制的有用手段，同时也构成识别I型和II型糖尿病患者的重要的风险指标。

来自受验者的血液样品能够在该一次性测试片(图2)的样品腔15中以沉淀的形式得到。血液经由毛细通道13流到反应室11和19。反应室11可用作参考室，在此测量血红蛋白总量。反应室19测量血液样品的HbA1c。HbA1c对血红蛋白总量的比值提供了作为HbA1c的血红蛋白总量的百分比。

两个反应室包含细胞溶解剂。该细胞溶解剂溶解整个血液样品，从而释放血红蛋白。该细胞溶解剂通常是表面活化剂，优选是非离子表面活化剂，例如，TRITON^TM X-100。反应室19另外还包含能够检测HbA1c的抗体。该抗体可以是单克隆的或多克隆的抗体(Ab)，或包含抗原结合部位或互补确定区(CDR)的Ab片断，例如F(ab’)₂或Fab片断。可检测的一部分或标记可以是放射性的、有荧光的或化学发光的物质，或酶。可替换地，也可以使用识别第一Ab的特定类的Fc片断的带标记的第二Ab。而且，该抗体可以用可检测的标记来作标记。

在一方面，可检测的标记是发荧光的分子。合适荧光标记的例子包括荧光素(FITC)，5，6-基羧甲荧光素，得克萨斯红，硝基苯-2-氧-1，3-二嗪磷-4-基(NBC)，香豆素(邻羧基肉桂酸内酯)，丹磺酰氯，罗丹明，4’-6-罗丹明-2-苯基吲哚(DAPI)以及菁染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。优选的发荧光的标记是荧光素(5-羧甲基荧光素-N-羧基琥珀酰亚氨酯)、罗丹明(5，6-四甲基罗丹明)、代用罗丹明化合物以及菁染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。对于这些荧光团吸收和发射最多的分别是：FITC(490nm；520nm)，Cy3(554nm；568nm)，Cy3.5(581nm；588nm)，Cy5(652nm；672nm)，Cy5.5(6820nm；703nm)和Cy7(755nm；778nm)，因此，能够同时检测它们。荧光标记能够从各种商业源得到，包括Molecular Probes、Eugene、OR和Research Organics，Cleveland，Ohio。作为另一种选择，代替添加的标记，所结合的血红蛋白本身，由于其类过氧物酶的性质，能够产生可检测的信号。这通过添加过氧化氢，添加或不添加其他基质(例如异鲁米)来完成。

在两个反应腔中的细胞被溶解。在参考腔11中，可通过分光镜法得到血红蛋白的总量，例如测量UV区或红外区。分光设备在本领域是已知的，并且包含在所述便携式手持机器中。更具体地说，能够按880nm和580nm进行测量。在反应腔19中，抗体结合于HbA1c。为了确保完全反应，反应腔中的液体可进行磁搅拌并且可选地加热到较高的温度。

当反应完成后，可把稀释剂加到样品腔15中。该稀释剂使19中的反应物能够通过毛细通道9移动到捕获区23。该捕获区可以是抗原，或是能够特异性结合于抗体-HbA1c复合体、任何抗体等或其组合物的其他合成物。因此，在一方面，第一捕获区包含特异性结合于抗体-HbA1c复合体的抗原，而第二捕获区包含结合于抗体以及抗体-HbA1c复合体的抗原。吸收垫5吸收所有的液体并且能够有助于通过薄膜抽吸液体。

利用上述的检测系统能够确定在每个捕获区的物质的量。与化验一起工作的校准器或标准器提供校准(或标准)曲线，由此利用测量信号确定样品中的HbA1c的百分数。所有捕获区的总和优选等于放置在反应腔中的抗体的量，并且能够提供内部控制以确定已经发生的反应的百分比。抗体-HbA1c复合体的浓度能够从第一捕获区的读数中确定。血液样品中的HbA1c的百分数能够用血红蛋白的总浓度除抗体-HbA1c复合体的浓度来确定。

在另一方面，参考薄膜7(图2)可以包含在一次性测试片中。当已知抗原-抗体-HbA1c复合体的浓度和抗体-抗原的浓度时，该参考薄膜可以具有沉淀。形成该参考薄膜的分光光度计的测量能够用于校准来自该主动薄膜25的读数。

虽然已经参考优选实施例和各种可选实施例具体示出和描述了本发明，本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神实质和范围的情况下，在形式和细节上能够进行各种变换。因而与本申请相关的所有公开的专利和申请其整个内容结合于此供参考。

Claims (27)

1.一种一次性测试片，包括：

第一固体基片，该第一固体基片包括样品收集腔、参考腔和反应腔，其中这些腔经由第一毛细通道流体地连通；和

第二固体基片，该第二固体基片包括孔，其中所述第一固体基片和所述第二固体基片接合并且所述孔与所述各腔连通。

2.如权利要求1所述的一次性测试片，其中所述第一基片和所述第二基片是矩形的。

3.如权利要求1所述的一次性测试片，其中所述基片是从塑料、玻璃、尼龙、金属和其组合所构成的组中选出的。

4.如权利要求3所述的一次性测试片，其中所述基片是塑料的。

5.如权利要求1所述的一次性测试片，还包括所述反应室中的搅拌棒。

6.如权利要求1所述的一次性测试片，还包括沉淀在反应腔中的抗体。

7.如权利要求6所述的一次性测试片，其中所述抗体是HbA1c特异性的。

8.如权利要求1所述的一次性测试片，其中所述参考腔和所述反应腔包括细胞溶解剂。

9.如权利要求1所述的一次性测试片，其中所述细胞溶解剂是非离子表面活性剂。

10.如权利要求1所述的一次性测试片，还包括具有捕获区的薄膜，其中该薄膜通过第二毛细通道与所述反应腔连接。

11.如权利要求10所述的一次性测试片，其中所述薄膜设置在吸收垫和所述反应腔之间。

12.一种一次性测试片，包括：

第一固体基片，该第一固体基片包括样品施加腔、参考腔和反应腔，其中这些腔经由毛细通道流体地连通，并且其中所述参考腔包括第一细胞溶解剂，所述反应腔包括第二细胞溶解剂、抗体以及搅拌棒；

第二固体基片，该第二固体基片包括孔，其中所述第一固体基片和所述第二固体基片接合并且所述孔与所述腔连通；以及

具有捕获区的薄膜，其中该薄膜经由第二毛细通道与所述反应腔连接。

13.如权利要求12所述的一次性测试片，其中所述第一基片和所述第二基片是矩形的。

14.如权利要求1所述的一次性测试片，其中所述基片选自由塑料、玻璃、尼龙、金属和其组合构成的组。

15.如权利要求14所述的一次性测试片，其中所述基片是塑料的。

16.如权利要求12所述的一次性测试片，其中所述第一和第二细胞溶解剂是非离子表面活性剂。

17.如权利要求12所述的一次性测试片，其中所述抗体是HbA1c特异性的。

18.一种用于确定作为HbA1c的血红蛋白的百分比的方法，该方法包括：

提供一次性测试片，该一次性的测试片包括：第一固体基片，该第一固体基片包括样品腔、参考腔和反应腔，其中这些腔经由第一毛细通道流体地连通，并且其中所述参考腔包括第一细胞溶解剂，所述反应腔包括第二细胞溶解剂、HbA1c特异性抗体和搅拌棒；第二固体基片，该第二固体基片包括孔，其中所述第一固体基片和所述第二固体基片接合并且所述孔与所述各腔连通；以及具有捕获区的薄膜，所述薄膜经由第二毛细通道与所述反应腔连接；

把样品放置在所述样品施加腔中；

向所述样品施加腔添加稀释剂；

由所述参考腔确定血红蛋白总量并由所述捕获区确定HbA1c总量；

所述HbA1c总量除以所述血红蛋白总量，获得作为HbA1c的血红蛋白的百分比。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述第一基片和所述第二基片是矩形的。

20.如权利要求18所述的方法，其中所述基片选自由塑料、玻璃、尼龙、金属和其组合构成的组。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述基片是塑料的。

22.如权利要求18所述的方法，其中所述细胞溶解剂是非离子表面活性剂。

23.如权利要求18所述的方法，其中所述薄膜包括两个或更多个捕获区。

24.如权利要求23所述的方法，其中一个捕获区包括特异性结合于抗体-HbA1c复合体的抗原，而另外的捕获区包括结合于所述抗体的抗原。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述HbA1c总量通过UV测量来确定。

26.如权利要求18所述的方法，其中所述血红蛋白总量通过UV、IR或其组合来确定。

27.如权利要求18所述方法，所述血红蛋白总量用580nm和880nm的光来分光光度地确定。

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