CN101282705A

CN101282705A - 增强着色剂和调理剂的效果的方法

Info

Publication number: CN101282705A
Application number: CNA2006800355356A
Authority: CN
Inventors: W·A·贝克; J·P·奥布里恩; H·王
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2005-09-28
Filing date: 2006-09-28
Publication date: 2008-10-08
Also published as: BRPI0617535A2; US7964180B2; US7427656B2; WO2007038733A1; US7795382B2; JP2009512639A; US20100189670A1; US20080206809A1; CA2620051A1; US20090048428A1; KR20080055954A; EP1928397A1; RU2008116680A; WO2007038704A1; EP2335780A1; US20070067924A1; US7736633B2; EP2332512A1; RU2436564C2

Abstract

提供了增强多种有益试剂与毛发和皮肤结合的耐久性的方法。分别用毛发或皮肤结合肽的组合物改进传统和非传统着色剂和调理剂的施用。毛发或皮肤结合肽组合物的存在增加在毛发或皮肤上施用的着色剂或调理剂的耐久性。

Description

增强着色剂和调理剂的效果的方法

本申请要求2005年9月28日提交的美国临时专利申请No.60/721329的优先权。

发明领域

本发明涉及个人护理领域，特别涉及毛发和皮肤的处理。更具体地，本发明提供通过施用基于肽的密封剂增强传统和非传统着色剂、调理剂和其它有益试剂的效果的方法。

发明背景

毛发和皮肤调理剂和着色剂是公知的，并且常用于个人护理产品。目前的调理剂和非氧化着色剂的主要问题是缺乏长期持续效果需要的耐久性。氧化染发剂提供长期持续的颜色，但它们含有的氧化剂导致毛发损害。为了改进这些毛发和皮肤护理组合物的耐久性，开发了基于肽的毛发调理剂、毛发着色剂和其它有益试剂(Huang等人的共同未决和共同拥有的美国专利申请公开No.2005/0050656和美国专利申请公开No.2005/0226839)。也描述了基于肽的遮光剂(Buseman-Williams等人的共同未决和共同拥有的美国专利申请No.2005/0249682；和Lowe等人的共同未决和共同拥有的美国专利申请No.60/737042)。基于肽的有益试剂是通过将对毛发或皮肤具有高结合亲和力的特异性肽序列与有益试剂，如调理剂或着色剂偶联而制备的。肽部分结合于毛发或皮肤，从而强烈附着于有益试剂。这些基于肽的有益试剂提供了改进的耐久性，但需要结合肽与有益试剂的偶联。

用噬菌体展示筛选技术鉴定了与毛发具有高结合亲和力的肽(Huang et al.，supra；Estell et al.WO 0179479；Murray et al.，美国专利申请公开No.2002/0098524；Janssen et al.，美国专利申请公开No.2003/0152976；和Janssen et al.，WO 04048399)。此外，报道了实验制备的基于带正电氨基酸的毛发和皮肤结合肽(Rothe et.，WO2004/000257)。

Cornwell等人(美国专利No.6,551,361)描述了减少氧化染发剂处理的毛发的颜色损失的方法，包括在用氧化染发剂处理之前或之后，使毛发接触有机氨基化合物，如碱性氨基酸、尿素、胍及其盐或混合物。但是，该公开内容没有描述将特异性毛发结合或皮肤结合肽或包含偶联于有益试剂的毛发结合肽或皮肤结合肽的缀合物用作着色剂和调理剂的密封剂。

因此，要解决的问题是提供增强毛发和皮肤调理剂和着色剂的耐久性的替代方法，该方法是简单并且容易实施的。

申请人发现了通过施用基于肽的密封剂，增强了传统和非传统着色剂、调理剂和其它有益试剂的效果，从而解决了上述问题。

发明概述

本发明涉及新的基于肽的密封剂，其用于增强传统和非传统毛发和皮肤着色剂、调理剂和其它有益试剂的耐久性。本发明的密封剂是短肽，是根据它们特异性结合毛发或皮肤的能力而选择的。这些毛发结合肽(HBP)或皮肤结合肽(SBP)是与着色剂、调理剂或一些其它有益试剂联合施用于毛发或皮肤。

因此，本发明提供了将有益试剂施用于毛发的方法，包括以下步骤：

a)提供对毛发具有亲和力的毛发有益试剂；

b)提供包含毛发结合肽的组合物；

c)将所述有益试剂和包含毛发结合肽的组合物施用于毛发，持续足够毛发有益试剂和毛发结合肽结合于毛发的时间。

任选地，所述包含毛发结合肽的组合物可以根据需要重新施用。在一种替代实施方案中，本发明的方法也可以采用聚合物密封剂，以便进一步增强有益试剂与毛发的结合。

类似地，本发明提供了将有益试剂施用于皮肤的方法，包括以下步骤：

a)提供对皮肤具有亲和力的皮肤有益试剂；

b)提供包含皮肤结合肽的组合物；

c)将所述有益试剂和包含皮肤结合肽的组合物施用于皮肤，持续足够皮肤有益试剂和皮肤结合肽结合于皮肤的时间。

此外，本发明提供了包含毛发着色剂和毛发结合肽的毛发着色剂组合物，以及包含毛发调理剂和毛发结合肽的毛发调理组合物。类似地，本发明提供了包含皮肤调理剂和皮肤结合肽的皮肤调理组合物，以及包含皮肤着色剂和皮肤结合肽的皮肤着色组合物。

在一种特定实施方案中，本发明提供了选自SEQ ID NOs：16、17、18、19、20和21的毛发结合肽。

序列描述

通过以下的详细说明所附的序列描述，可以更充分地理解本发明，其中序列描述也是本申请的一部分。

以下的序列符合37C.F.R.1.821-1.825(“包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请所必备的条件-序列条款”)，并符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)，以及EPO和PCT(5.2条和49.5(a-bis)条，和使用说明208部分和附件C)的序列表要求。在核苷酸和氨基酸序列数据中所使用的符号和格式均符合37 C.F.R.§1.822的规定。

SEQ ID NOs：1-6和53-62是毛发结合肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7和63-74是皮肤结合肽的氨基酸序列。

SEQ ID NOs：8-12是实验制备的毛发和皮肤结合肽的氨基酸序列。

SEQ ID NOs：13-15是肽间隔基的氨基酸序列。

SEQ ID NOs：16-21是多拷贝毛发结合肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：22是随机肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：23是多拷贝毛发结合肽HC77607的编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：24是肽TBP1的氨基酸序列。

SEQ ID NOs：25-29是实施例5描述的用于制备TBP1基因的寡核苷酸的核酸序列。

SEQ ID NO：30是合成的DNA片段TBP1的核酸序列。

SEQ ID NOs：31-36是实施例5描述的用于制备pINK1表达质粒的寡核苷酸引物的核酸序列。

SEQ ID NO：37是实施例5描述的TBP101肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：38是INK101的编码序列的核酸序列。

SEQ ID NO：39是实施例5描述的肽TBP101-DP的氨基酸序列。

SEQ ID NOs：40和41是实施例5描述的用于质粒pINK101的定点诱变中的寡聚物的核酸序列。

SEQ ID NO：42是质粒pINK101-DP的核酸序列。

SEQ ID NO：43是肽IBT3的氨基酸序列。

SEQ ID NOs：44、45和48-51是实施例5描述的用于定点诱变中的寡核苷酸的核酸序列。

SEQ ID NOs：46和47是实施例5描述的用于扩增类固醇异构酶片段的引物的核酸序列。

SEQ ID NO：52是毛发结合肽的氨基酸序列，该毛发结合肽的C末端添加了半胱氨酸残基。

发明详述

本发明涉及用作为密封剂的毛发或皮肤结合肽增强着色剂、调理剂和其它有益试剂的效果的方法。本发明是有用的，因为该方法可以用于染色或调理毛发和皮肤，与常规方法相比，提供增强的耐久性。

此处采用如下定义，其用于解释权利要求书和说明书。

本文用的术语“发明”或“本发明”是非限制性的术语，并且不意欲表示特定发明的单个实施方案，而是包括说明书和权利要求中描述的所有可能的实施方案。

“HBP”表示毛发结合肽。

“SBP”表示皮肤结合肽。

“HCA”表示毛发调理剂。

“SCA”表示皮肤调理剂。

“BA”表示有益试剂。

术语“肽”是指通过肽键或修饰的肽键彼此连接在一起的两个或多个氨基酸。

术语“毛发结合肽”是指以高亲和力结合于毛发的肽序列。本发明的毛发结合肽的长度是大约7个氨基酸-大约50个氨基酸，更优选大约7个氨基酸-大约25个氨基酸，最优选大约7个氨基酸-大约25个氨基酸。

术语“皮肤结合肽”是指以高亲和力结合于皮肤的肽序列。本发明的皮肤结合肽的长度是大约7个氨基酸-大约50个氨基酸，更优选大约7个氨基酸-大约25个氨基酸，最优选大约7个氨基酸-大约25个氨基酸。

术语“有益试剂”是表示当施用于皮肤或毛发时提供美容或预防效果的试剂的通用术语。有益试剂典型地包括调理剂、着色剂、香料、增白剂、防晒剂等，以及通常用于个人护理工业的其它物质。

如本文所使用的，术语“毛发”是指人毛发、眉毛和睫毛。

如本文所使用的，如本文所使用的，术语“皮肤”是指人皮肤或人皮肤的替代物，如猪皮、

和EpiDerm^TM。在此用作体表的皮肤通常包含上皮细胞层，另外可以包含内皮细胞层。

如本文所使用的，术语“偶联”和“偶联的”指任意的化学缔合，包括共价的和非共价的相互作用。

如应用于本发明毛发结合肽和皮肤结合肽的选择时所使用的，术语“严格性”指用于从毛发或皮肤上洗脱肽的洗脱试剂(通常为去污剂)的浓度。更高的洗脱试剂浓度会提供更严格的条件。

术语“肽-毛发复合物”表示一种结构，其包含通过肽上的结合位点与毛发纤维结合的肽。

术语“肽-皮肤复合物”表示一种结构，其包含通过肽上的结合位点与皮肤结合的肽。

术语“肽-底物复合物”指肽-毛发或肽-皮肤复合物。

在本文中将术语“纳米颗粒”定义为具有1至500nm的平均粒径的颗粒。优选地，颗粒的平均粒径是约1至200nm。如本文所使用的，“粒度”和“粒径”具有相同的含义。纳米颗粒包括但不限于，金属、半导体、聚合物或其它有机或无机颗粒。

术语“氨基酸”指蛋白或多肽的基本化学结构单元。在本文中使用如下的缩写来代表特定的氨基酸：

氨基酸三字母缩写单字母缩写

丙氨酸 Ala A

精氨酸 Arg R

天冬酰胺 Asn N

天冬氨酸 Asp D

半胱氨酸 Cys C

谷氨酰胺 Gln Q

谷氨酸 Glu E

甘氨酸 Gly G

组氨酸 His H

异亮氨酸 Ile I

亮氨酸 Leu L

赖氨酸 Lys K

甲硫氨酸 Met M

苯丙氨酸 Phe F

脯氨酸 Pro P

丝氨酸 Ser S

苏氨酸 Thr T

色氨酸 Trp W

酪氨酸 Tyr Y

缬氨酸 Val V

“基因”指表达特定蛋白的核酸片段，包括编码序列之前的调控序列(5’非编码序列)和之后的调控序列(3’非编码序列)，“天然基因”指在天然状态下发现的带有自身调控序列的基因。“嵌合基因”指非天然基因的任意基因，其包含在天然状态下不会同时发现的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可能包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者包含源自相同来源、但排列方式不同于天然状态的调控序列和编码序列。“外源”基因指在宿主生物体中通常不存在、而是通过基因转移引入到宿主生物体的基因。外源基因可以包含插入非天然生物体中的天然基因，或嵌合基因。

使用本领域中技术人员已知的方法，可以将化学合成的寡核苷酸结构单元装配成“合成的基因”。连接这些结构单元并退火，形成基因片段，然后再酶促地装配它们，构建完整的基因。当涉及DNA序列时，“化学合成的”表示在体外装配组分核苷酸。DNA的人工化学合成，可以使用充分确立的技术来完成，或自动化学合成可以使用许多市售仪器之一来进行。因此，可以根据反映宿主细胞密码子偏倚的核苷酸序列最优化，对基因进行裁剪，进行最佳的基因表达。如果密码子选择偏向宿主偏爱的那些密码子，本领域技术人员能够意识到成功的基因表达的可能性。基于对源自可得到序列信息的宿主细胞的基因的分析，可以确定出优选的密码子。

术语“噬菌体(phage或bacteriophage)”指能感染细菌的病毒。变化形式的噬菌体也能用于本发明目的。优选的噬菌体源自叫做M13的“野生”噬菌体。M13系统可以在细菌内生长，因此不会破坏它所感染的细胞，只是使它不断地制造新的噬菌体。它是单链DNA噬菌体。

术语“噬菌体展示”指在噬菌体或噬菌粒颗粒表面上所进行的功能性外源肽或小蛋白的展示。可以使用基因工程化的噬菌体，将肽展示为它们的天然表面蛋白的片段。具有不同基因序列的噬菌体群可以产生肽文库。

“PCR”或“聚合酶链式反应”是用于扩增特定DNA片段的技术(美国专利No.4,683,195和4,800,159)。

本文所使用的标准重组DNA和分子克隆技术，是本领域众所周知的技术，且记载在：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文称作“Maniatis”)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory Cold Press Spring Harbor，NY(1984)；和Ausubel，F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc，和Wiley-Interscience出版(1987)。

本发明提供了用作为密封剂的毛发或皮肤结合肽增强着色剂、调理剂和其它有益试剂的效果的方法。毛发和皮肤结合肽分别对毛发或皮肤具有结合亲和力，并且可以用组合方法，例如噬菌体展示进行鉴定，或可以实验制备。此外，包含偶联于有益试剂的毛发或皮肤结合肽的缀合物可以用作密封剂。在本发明的方法中，基于肽的密封剂可以与有益试剂的施用同时施用、在有益试剂施用之后施用，或在有益试剂施用之前施用，以便将有益试剂密封于毛发或皮肤。

鉴定毛发结合肽和皮肤结合肽

本文定义的毛发结合肽(HBPs)和皮肤结合肽(SBPs)是分别以高亲和力特异性结合毛发或皮肤的肽序列。毛发或皮肤结合肽对有益试剂不具有特异性亲和力，但是可能与一些有益试剂非特异性相互作用，特别是有极性的那些。本发明的毛发结合肽和皮肤结合肽长度是约7个氨基酸-约50个氨基酸，更优选约7个氨基酸-约25个氨基酸，最优选约7-约20个氨基酸。合适的毛发或皮肤结合肽可以用本领域公知的方法选择或可以实验制备。

毛发皮肤结合肽或皮肤结合肽可以随机制备，然后按照Huang等人的共同未决和共同拥有的美国专利申请No.2005/0050656中的描述，基于它们对感兴趣的底物的结合亲和力，针对特定毛发或皮肤样品进行选择，上述专利申请在此全文引入作为参考。随机的肽文库的制备是众所周知的，且可以通过许多技术来实现，包括，细菌展示(Kemp，D.J.；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(7)：4520-4524(1981)，和Helfman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1)：31-35，(1983))，酵母展示(Chien等，Proc Natl Acad Sci USA 88(21)：9578-82(1991))，组合固相肽合成(美国专利No.5,449,754，美国专利No.5,480,971，美国专利No.5,585,275，美国专利No.5,639,603)，和噬菌体展示技术(美国专利No.5,223,409，美国专利No.5,403,484，美国专利No.5,571,698，美国专利No.5,837,500)。产生这样的生物肽文库的技术是本领域公知的。示例的方法记载在Dani，M.，J.of Receptor & Signal Transduction Res.，21(4)：447-468(2001)，Sidhu et al.，Methods in Enzymology 328：333-363(2000)，和Phage Display of Peptides and Proteins，A LaboratoryManual，Brian K.Kay，Jill Winter，以及John McCafferty，eds.；AcademicPress，.NY，1996。此外，可以从商业来源如New England Biolabs(Beverly，MA)购买噬菌体展示文库。

随机产生肽的一个优选的方法是利用噬菌体展示。噬菌体展示是一种体外选择技术，其中将肽或蛋白遗传地融合到噬菌体外壳蛋白上，从而在噬菌体病毒体的外部形成融合肽展示，而编码融合体的DNA停留在病毒体内。展示肽和其编码DNA之间的这种物理连接，允许通过称作“生物淘选”的简单体外选择过程，筛选大量肽变体，每个变体均与相应的DNA序列连接。生物淘选中最简单的形式是，将噬菌体-展示的变体库与目标靶一起温育，洗去未结合的噬菌体，并通过破坏噬菌体与靶之间的结合相互作用，洗脱特异性地结合的噬菌体。然后，体内扩增洗脱的噬菌体，重复该过程，得到逐步富集的有利于最紧密结合序列的噬菌体库。经过3轮或更多轮的选择/扩增，通过DNA测序对单个克隆进行表征。

具体地，毛发或皮肤结合肽可以用以下方法选择。用上文描述的方法制备合适的肽文库，或从供应商购买文库。制备肽文库后，随后使文库与适量的测试底物，具体是毛发或皮肤样品接触。将肽文库溶解在合适的溶液中，用于接触样品。测试底物可以悬浮在溶液中或可以固定在板或珠上。优选的溶液是含有表面活性剂的缓冲盐水溶液中。合适的溶液是含有0.5％

20的Tris缓冲的盐水(TBS)。可以通过任何方法额外地搅拌溶液，以便增加肽到测试底物的质量转移速度，从而缩短达到最大结合所需的时间。

接触后，许多随机产生的肽将结合于测试底物，形成肽-底物复合物(即肽-毛发或肽-皮肤复合物)。可以通过洗涤除去未结合的肽。除去所有未结合的材料后，可以通过在具有各种严格性的缓冲液中进行选择的洗涤，分级分离对测试底物具有不同程度结合亲和力的肽。增加使用的缓冲液的严格性，可以增加肽-底物复合物中肽与测试底物之间的键所需的强度。

可以使用许多物质来改变肽选择中的缓冲溶液的严格性，包括但不限于，酸性pH(1.5-3.0)；碱性pH(10-12.5)；高盐浓度，如MgCl₂(3-5M)和LiCl(5-10M)；水；乙二醇(25-50％)；二噁烷(5-20％)；硫氰酸盐(1-5M)；胍(2-5M)；脲(2-8M)；和各种浓度的不同表面活性剂，如SDS(十二烷基硫酸钠)、DOC(脱氧胆酸钠)、Nonidet P-40、Triton X-100、

20，其中优选

20。可以在缓冲溶液中制备这些物质，所述缓冲溶液包括但不限于Tris-HCl、Tris-缓冲盐水、Tris-硼酸盐、Tris-乙酸、三乙胺、磷酸盐缓冲液、和甘氨酸-HCl，其中优选Tris-缓冲盐水溶液。

可以理解，通过使用严格性不断提高的缓冲液重复选择过程，可以洗脱对测试底物具有增加的结合亲和力的肽。洗脱的肽用本领域已知的任意方法进行鉴定和测序。

在一种实施方案中，可以使用下面的生产本发明的毛发结合肽或皮肤结合肽。将组合产生的噬菌体-肽的文库与感兴趣的测试底物接触，形成噬菌体肽-底物复合物。从未复合的肽和未结合的底物分离噬菌体-肽-底物复合物，并从复合物洗脱来自噬菌体-肽-底物复合物的结合的噬菌体-肽，优选通过酸处理。然后，对洗脱的噬菌体-肽进行鉴定和测序。为了鉴定出与一种底物结合而不与另一种底物结合的肽序列，例如与毛发结合但不与皮肤结合的肽，或与皮肤结合但不与毛发结合的肽，在该方法中加入了扣除淘选步骤。具体地，首先使组合产生的噬菌体-肽的文库与非靶接触，以便去掉结合它的噬菌体-肽。然后，使未结合的噬菌体-肽与所需底物相接触，继续上述过程。或者，可以使组合产生的噬菌体-肽的文库同时与非靶和所需底物相接触。然后，从噬菌体-肽-非靶复合物分离噬菌体-肽-底物复合物，对所需噬菌体-肽-毛发或噬菌体-肽-皮肤复合物实施上述方法。

或者，可以使用修改的噬菌体展示筛选方法，用于分离对毛发或皮肤具有较高亲和力的肽。在该修改的方法中，首先如上所述形成噬菌体-肽-底物复合物。然后，用洗脱缓冲液处理这些复合物。可以使用任意的上述洗脱缓冲液。优选地，洗脱缓冲液是酸性溶液。然后，将剩下的抗洗脱的噬菌体-肽-底物复合物直接用于感染细菌宿主细胞，如大肠杆菌ER2738。在合适的生长培养基，例如LB(Luria-Bertani)培养基中培养感染的宿主细胞，然后将培养物涂布到琼脂上，琼脂包含合适的生长培养基，例如含有IPTG(异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷)和S-Gal^TM的LB培养基。生长后，挑取噬菌斑用于DNA分离和测序，以鉴定出对目标体表具有高结合亲和力的肽序列。或者，可以使用PCR来鉴定由上述修改的噬菌体展示筛选方法得到的抗洗脱的噬菌体-肽，该技术使用合适的引物将上述噬菌体-肽-底物复合物直接进行PCR，如Janssen等在本申请中引作参考的美国专利申请公开号2003/0152976中所述。

可以用O’Brien等人在本申请中引作参考的共同未决和共同拥有的美国专利申请No.2006/0073111中描述的修改的生物淘选方法选择抗洗发液的毛发结合肽。类似地，可以用Wang等(共同未决和共同拥有的美国专利申请No.11/359163)和Wang等(共同未决和共同拥有的美国专利申请No.11/359162)描述的方法鉴定抗毛发调理剂的毛发结合肽和抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽。在这些方法中，将噬菌体肽的起始文库溶解于感兴趣的基质(即洗发液基质、毛发调理剂基质或皮肤护理组合物基质)中，用于与底物接触，或在通过按照上文使底物与噬菌体肽的文库结合形成噬菌体-肽底物复合物后，使噬菌体-肽底物复合物与感兴趣的基质结合。随后按照上文的描述进行生物淘选方法。洗发液基质、毛发调理剂基质或皮肤护理组合物基质可以是完全强度商品或其稀释液。

可以用本文描述的方法制备合适的毛发结合肽和皮肤结合肽。此外，可以使用已知的毛发结合肽或皮肤结合肽，如Huang等(共同未决和共同拥有的美国专利申请公开No.2005/0050656，和美国专利申请公开No.2005/0226839)，Estell等(WO 0179479)；Murray等(美国专利申请公开No.2002/0098524)；Janssen等(美国专利申请公开 No.2003/0152976)；Janssen等(WO 04048399)，O’Brien等(共同未决和共同拥有的美国专利申请公开No.2006/0073111)，Wang等(共同未决和共同拥有的美国专利申请No.11/359163)和Wang等(共同未决和共同拥有的美国专利申请No.11/359162)报道的那些，在此引入所有上述文献作为参考。合适的毛发结合肽和皮肤结合肽的非限定性实例示于表1。

或者，可以按照Rothe等(WO 2004/000257)的描述，通过设计包含能够通过静电相互作用结合毛发和皮肤的带正电的氨基酸的肽，实验制备毛发和皮肤结合肽序列。实验制备的毛发和皮肤结合肽具有大约7个氨基酸-大约50个氨基酸，并且包含至少约40摩尔％的带正电的氨基酸，如赖氨酸、精氨酸和组氨酸。含有三肽基序，如HRK，RHK，HKR，RKH，KRH，KHR，HKX，KRX，RKX，HRX，KHX和RHX的肽序列是最优选的，其中X可以是任何天然氨基酸，但最优选选自中性侧链氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸。此外，应该理解，肽序列必须满足终端使用的其它功能要求，包括溶解度、粘度和与制剂化的产物中其它成分的相容性，并且因此将根据使用的需要而改变。在一些情况下，肽可以含最多60摩尔％的不包括组氨酸、赖氨酸或精氨酸的氨基酸。合适的实验制备的毛发结合肽和皮肤结合肽包括但不限于SEQ ID NOs：8-12(参见表1)。

使用不同毛发结合肽或皮肤结合肽的混合物也可能是有益的。需要选择混合物中的肽，使得不存在减少有益效果的肽之间的相互作用。本领域技术人员可以采用常规实验确定毛发结合肽或皮肤结合肽的合适混合物。此外，可能需要将两个或多个毛发结合肽或皮肤结合肽直接或通过间隔基连接在一起，以增强肽与底物的相互作用。下文描述了制备多个肽组合物和合适的间隔基的方法。非限制性实例示于表1。

表1

毛发结合肽和皮肤结合肽序列的实例

体表	SEQ ID NO：	序列
体表	SEQ ID NO：	序列	毛发(抗洗发液)	1	TPPELLHGDPRS
毛发(抗洗发液)	2	NTSQLST	毛发(抗洗发液)	1	TPPELLHGDPRS
毛发(抗洗发液)	2	NTSQLST	毛发	3	RTNAADHP
毛发	4	RTNAADHPAAVT	毛发	3	RTNAADHP
毛发	4	RTNAADHPAAVT	毛发	5	IPWWNIRAPLNA
毛发	6	DLTLPFH	毛发	5	IPWWNIRAPLNA
毛发	6	DLTLPFH	毛发和皮肤(实验)	8	KRGRHKRPKRHK
毛发和皮肤(实验)	9	RLLRLLR	毛发和皮肤(实验)	8	KRGRHKRPKRHK
毛发和皮肤(实验)	9	RLLRLLR	毛发和皮肤(实验)	10	HKPRGGRKKALH
毛发和皮肤(实验)	11	KPRPPHGKKHRPKHRPKK	毛发和皮肤(实验)	10	HKPRGGRKKALH
毛发和皮肤(实验)	11	KPRPPHGKKHRPKHRPKK	毛发和皮肤(实验)	12	RGRPKKGHGKRPGHRARK
毛发(多拷贝)	16	PNTSQLSTGGGRTNAADHPKCGGGNTSQLSTGGGRTNAADHPKCGGGNTSQLSTGGG RTNAADHPKC	毛发和皮肤(实验)	12	RGRPKKGHGKRPGHRARK
毛发(多拷贝)	16		毛发(多拷贝)	17	PRTNAADHPAAVTGGGCGGGRTNAADHPAAVTGGGCGGGRTNAADHPAAVTGGGC
毛发(多拷贝)	18	PRTNAADHPAAVTGGGCGGGIPWWNIRAPLNAGGGCGGGDLTLPFHGGGC	毛发(多拷贝)	17	PRTNAADHPAAVTGGGCGGGRTNAADHPAAVTGGGCGGGRTNAADHPAAVTGGGC
毛发(多拷贝)	18	PRTNAADHPAAVTGGGCGGGIPWWNIRAPLNAGGGCGGGDLTLPFHGGGC	毛发(多拷贝)	19	PRTNAADHPGGGTPPELLHGDPRSKCGGGRTNAADHPGGGTPPELLHGDPRSKCGGGRTNAADHPGGGTP

		PELLHGDP RSKC
		PELLHGDP RSKC	毛发(多拷贝)	20	PTPPTNVLMLATKGGGRTNAADHPKCGGGTPPTNVLMLATKGGGRTNAADHPKCGGGTPPTNVLMLATKGGGRTNAADHPKC
毛发(多拷贝)	21	PRTNAADHPGGGTPPTNVLMLATKKCGGGRTNAADHPGGGTPPTNVLMLATKKCGGGRTNAADHPGGGTPPTNVLMLATKKC	毛发(多拷贝)	20
毛发(多拷贝)	21		毛发(C末端具有半胱氨酸)	52	TPPELLHGDPRSC
毛发	53	EQISGSLVAAPW	毛发(C末端具有半胱氨酸)	52	TPPELLHGDPRSC
毛发	53	EQISGSLVAAPW	毛发	54	TDMQAPTKSYSN
毛发	55	ALPRIANTWSPS	毛发	54	TDMQAPTKSYSN
毛发	55	ALPRIANTWSPS	毛发	56	LDTSFPPVPFHA
毛发(抗洗发液)	57	TPPTNVLMLATK	毛发	56	LDTSFPPVPFHA
毛发(抗洗发液)	57	TPPTNVLMLATK	毛发(调理剂抗性)	58	STLHKYKSQDPTPHH
毛发(洗发液和调理剂抗性)	59	GMPAMHWIHPFA	毛发(调理剂抗性)	58	STLHKYKSQDPTPHH
毛发(洗发液和调理剂抗性)	59	GMPAMHWIHPFA	毛发(洗发液和调理剂抗性)	60	HDHKNQKETHQRHAA
毛发(洗发液和调理剂抗性)	61	HNHMQERYTDPQHSPSVNGL	毛发(洗发液和调理剂抗性)	60	HDHKNQKETHQRHAA
毛发(洗发液和调理剂抗性)	61	HNHMQERYTDPQHSPSVNGL	毛发(洗发液和调理剂抗性)	62	TAEIQSSKNPNPHPQRSWTN
皮肤	7	TPFHSPENAPGS	毛发(洗发液和调理剂抗性)	62	TAEIQSSKNPNPHPQRSWTN
皮肤	7	TPFHSPENAPGS	皮肤(浴液抗性)	63	TMGFTAPRFPHY
皮肤(浴液抗性)	64	SVSVGMKPSPRP	皮肤(浴液抗性)	63	TMGFTAPRFPHY
皮肤(浴液抗性)	64	SVSVGMKPSPRP	皮肤(浴液抗性)	65	NLQHSVGTSPVW
皮肤(浴液抗性)	66	QLSYHAYPQANHHAP	皮肤(浴液抗性)	65	NLQHSVGTSPVW

皮肤(浴液抗性)	67	SGCHLVYDNGFCDH
皮肤(浴液抗性)	67	SGCHLVYDNGFCDH	皮肤(浴液抗性)	68	ASCPSASHADPCAH
皮肤(浴液抗性)	69	NLCDSARDSPRCKV	皮肤(浴液抗性)	68	ASCPSASHADPCAH
皮肤(浴液抗性)	69	NLCDSARDSPRCKV	皮肤(浴液抗性)	70	NHSNWKTAADFL
皮肤(浴液抗性)	71	SDTISRLHVSMT	皮肤(浴液抗性)	70	NHSNWKTAADFL
皮肤(浴液抗性)	71	SDTISRLHVSMT	皮肤(浴液抗性)	72	SPYPSWSTPAGR
皮肤(浴液抗性)	73	DACSGNGHPNNCDR	皮肤(浴液抗性)	72	SPYPSWSTPAGR
皮肤(浴液抗性)	73	DACSGNGHPNNCDR	皮肤(浴液抗性)	74	DWCDTIIPGRTCHG

生产毛发和皮肤结合肽

可以使用本领域公知的标准的肽合成方法来制备本发明的毛发和皮肤结合肽(参见例如Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis，PierceChemical Co.，Rockford，IL，1984；Bodanszky，Priniciples of PeptideSynthesis，Springer-Verlag，New York，1984；和Pennington等，Peptide Synthesis Protocols，Humana Press，Totowa，NJ，1994)。另外，许多公司能够提供提供常规肽合成服务。

或者，可以使用重组DNA和分子克隆技术来制备本发明的肽。可以在异源宿主细胞(尤其是微生物宿主细胞)中生产编码毛发结合肽或皮肤结合肽的基因，如Huang等(美国专利申请公开No.2005/0050656)的描述和本文实施例5的举例说明。当通过重组DNA和分子克隆制备肽时，所述肽可以包含位于N末端的脯氨酸(P)残基，并任选包含位于C末端的天冬氨酸(D)残基。用DP切割位点分开需要的肽序列与促进包含体形成并且位于肽序列的串联重复之间的肽标记，得到这些额外的残基。

毛发有益试剂

可以将本领域已知的任何合适的毛发有益试剂用于本发明的方法中。毛发有益试剂对毛发具有亲和力。如本文用到的，“对毛发具有亲和力”表示有益试剂吸附在毛发的表面或吸附在毛发中。合适的毛发有益试剂包括但不限于毛发着色剂和毛发调理剂。

在本文中定义的毛发着色剂是，能够用于改变毛发的颜色的任何染料、色素、纳米颗粒等。毛发着色剂在本领域是公知的(参见Green等，WO 0107009，在此引入作为参考，CFTA International Color Handbook，2^nd ed.，Micelle Press，England(1992)和Cosmetic Handbook，US Foodand Drug Administration，FDA/IAS Booklet(1 992))，并且可以通过各种途径购买到(例如Bayer，Pittsburgh，PA；Ciba-Geigy，Tarrytown，NY；ICI，Bridgewater，NJ；Sandoz，Vienna，奥地利；BASF，Mount Olive，NJ；和Hoechst，Frankfurt，德国)。合适的毛发着色剂包括，但不限于：染料，如4-羟丙基氨基-3-硝基苯酚、4-氨基-3-硝基苯酚、2-氨基-6-氯代-4-硝基苯酚、2-硝基-对苯二胺、N，N-羟乙基-2-硝基-苯二胺、4-硝基-吲哚、2-硝基-5-甘油基甲基苯胺、3-甲基氨基-4-硝基苯氧基乙醇、3-硝基-对羟乙基氨基苯酚，羟基蒽醌氨基丙基甲基吗啉硫酸二甲酯、指甲花染料、HC Blue 1、HC Blue 2、HC Yellow 4、HC Red 3、HC Red 5、HC Red 7、HC Violet 1、HC Violet 2、HC Blue 7、HC Blue 10、HC Blue 12、HC Yellow 2、HC Yellow 6、HC Yellow 8、HCYellow 12、HC Orange 2、HC Orange 3、HC Brown 2、D&C Yellow 1、D&C Yellow 3、D&C Blue 1、Disperse Blue 3、Disperse Violet 1、DisperseOrange、Disperse Violet 4、Disperse Black 9、Basic Orange 31、Basic Yellow57、Basic Yellow 87、HC Yellow No.9、Basic Blue 26、Basic Blue 7、Basic Blue 99、Basic Violet 14、Basic Violet 2、Basic Brown 16、BasicBrown 17、Basic Red 2、Basic Red 51、Acid Red 33、Brilliant Black 1、伊红衍生物如D&C Red No.和卤化荧光素衍生物如D&C Red No.27、与D&C Red No.21和D&C Orange No.10组合的D&C Red Orange No.5；和色素，如D&C Red No.36、D&C Red No.30、D&C Orange No.17、Green3 Lake、Ext.Yellow 7 Lake、Orange 4 Lake和Red 28 Lake；D&C RedNo.7、11、31和34的钙色淀、D&C Red No.12的钡色淀、D&C Red No.13的锶色淀、FD&C Yellow No.5的铝色淀、FD&C Yellow No.6的铝色淀、FD&C No.40的铝色淀、D&C Red Nos.21，22，27和28的铝色淀、FD&CBlue No.1的铝色淀、D&C Orange No.5的铝色淀、D&C Yellow No.10的铝色淀、D&C Red No.33的锆色淀；

Yellow 131AK(Ciba Specialty Chemicals)、

Magenta 122(Sun Chemical)和

Blue 15:3(Sun Chemical)、氧化铁、碳酸钙、氢氧化铝、硫酸钙、高岭土、亚铁氰化铁铵、碳酸镁、洋红、硫酸钡、云母、氯氧化铋、硬脂酸锌、锰紫(manganese violet)、氧化铬、二氧化钛、二氧化钛纳米颗粒、氧化锌、氧化钡、群青蓝、柠檬酸铋和白色矿物质如羟磷灰石和锆石(硅酸锆)以及炭黑颗粒。

金属和半导体纳米颗粒也可以用作毛发着色剂，因为它们具有强发光作用(Vic等，美国专利申请公开No.2004/0010864)。金属纳米颗粒包括，但不限于：金、银、铂、钯、铱、铑、锇、铁、铜、钴的颗粒和由上述金属组成的合金。在本文中将“合金”定义为两种或多种金属的均一混合物。“半导体纳米颗粒”包括，但不限于：硒化镉、硫化镉、硫化银、硫化镉、氧化锌、硫化锌、硒化锌、硫化铅、砷化镓、硅、氧化锡、氧化铁和磷化铟的颗粒。使用合适的有机包衣或单层，可以使纳米颗粒稳定并具备水溶性。如本文所使用的，单层-保护的纳米颗粒是一类稳定化的纳米颗粒。制备稳定化的、水溶的金属和半导体纳米颗粒的方法是本领域众所周知的，且记载在：在此引作参考的Huang等，共同未决的美国专利申请公开No.2004/0115345。纳米颗粒的颜色取决于颗粒尺寸。因此，通过控制纳米颗粒的尺寸，可以获得不同的颜色。

另外，可以将附着、吸附或吸收了染料的有机和无机纳米颗粒用作毛发着色剂。例如，毛发着色剂可以是有色的聚合物纳米颗粒。示例性的聚合物纳米颗粒包括但不限于，包含诸如聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯基甲苯、苯乙烯/丁二烯共聚物和胶乳的材料的微球。为了用于本发明，微球具有约10纳米至约2微米的直径。通过将任意的合适的染料(例如上述的那些)偶联到微球上，可以使微球着色。可以将染料偶联到微球的表面上，或吸附到多孔微球的孔结构内。可以从BangLaboratories(Fishers，IN)等公司得到合适的微球，包括未染色和染色微球，其被官能化，以实现共价结合。

在本文中定义的毛发调理剂指能够改善毛发外观、质地和光泽度，以及增加毛发体或柔度的试剂。毛发调理剂，包括但不限于，发型辅助剂，毛发拉直辅助剂，毛发强化辅助剂，和膨胀(voluminizing)试剂，例如纳米颗粒。在本发明的基于肽的毛发调理剂中，可以使用任何已知的毛发调理剂。毛发调理剂在本领域是公知的，参见例如本申请引作参考的文献Green等，上文所述，并且可以通过各种途径购买到。合适的毛发调理剂的例子包括，但不限于：阳离子聚合物，如阳离子化的瓜耳胶、二烯丙基季铵盐/丙烯酰胺共聚物、季铵化的聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物、和各种聚季铵化合物；长链烷基(即C₈-C₂₄)、阳离子表面活性剂，如硬脂基二甲基苄基氯化铵(steralkonium chloride)、centrimoniumchloride、和Sapamin hydrochloride；脂肪醇，如二十二醇；脂肪胺，如硬脂胺；蜡；酯；非离子聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、和聚乙二醇；硅酮；硅氧烷，如十甲基环戊硅氧烷；聚合物乳剂，如amodimethicone；和纳米颗粒，如二氧化硅纳米颗粒和聚合物纳米颗粒。本发明优选的毛发调理剂包含胺或羟基官能团，以促进与毛发结合肽的偶联，如在下面所述。优选的调理剂的实例是辛胺(CAS No.111-86-4)、硬脂胺(CAS No.124-30-1)、二十二醇(CAS No.661-19-8，Cognis Corp.，Cincinnati，OH)、乙烯基封端的硅氧烷、乙烯基封端的硅酮(CAS No.68083-19-2)、乙烯基封端的甲基乙烯基硅氧烷、乙烯基封端的甲基乙烯基硅酮(CAS No.68951-99-5)、羟基封端的硅氧烷、羟基封端的硅酮(CAS No.80801-30-5)、氨基修饰的硅酮衍生物、[(氨乙基)氨基]丙基羟基二甲基硅氧烷、[(氨乙基)氨基]丙基羟基二甲基硅酮、α-十三烷基-ω-羟基-聚(氧基-1，2-乙烷二基)(CAS No.2493 8-91-8)。

皮肤有益试剂

可以将本领域已知的任何合适的皮肤有益试剂用于本发明的方法中。皮肤有益试剂对皮肤具有亲和力。如本文用到的，“对皮肤具有亲和力”表示有益试剂吸附在皮肤的表面。合适的皮肤有益试剂包括但不限于皮肤着色剂、皮肤调理剂和遮光剂。

在本文中定义的皮肤着色剂是，能够用于改变皮肤的颜色的任何染料、色素、纳米颗粒等。上文描述的任何染料、色素或纳米颗粒都可以用作皮肤着色剂。皮肤着色剂也可以是无须日光的增黑剂，如二羟基丙酮，它使得皮肤展示晒黑的外观，而无须暴露于日光。

本文中的皮肤调理剂包括但不限于，使皮肤收紧的收敛剂；去除死皮细胞的表皮脱落剂；有助于保持光滑、柔软、柔韧外观的润滑剂；增加皮肤上层水含量的保湿剂；延迟水分从皮肤表面蒸发的闭塞剂；健康促进剂，以及改进干燥或受损皮肤的外观或减少脱落和恢复补充的多种化合物。在本发明的方法中，可以使用任何合适的已知皮肤调理剂。皮肤调理剂在本领域是公知的，参见例如本申请引作参考的文献Green等，上文所述，并且可以通过各种途径购买到。合适的皮肤调理剂的例子包括，但不限于：α-羟酸、β-羟酸、多元醇、透明质酸、D，L-泛醇、聚水杨酸酯、维生素A棕榈酸酯、维生素E乙酸酯、甘油、山梨糖醇、硅酮、硅酮衍生物、羊毛脂、天然油和甘油三酯。本发明的优选的皮肤调理剂是聚水杨酸酯、丙二醇(CAS No.57-55-6，Dow Chemical，Midland，MI)、甘油(CAS No.56-81-5，Proctor & Gamble Co.，Cincinnati，OH)、乙醇酸(CAS No.79-14-1，DuPont Co.，Wilmington，DE)、乳酸(CAS No.50-21-5，Alfa Aesar，Ward Hill，MA)、苹果酸(CAS No.617-48-1，AlfaAesar)、柠檬酸(CAS No.77-92-9，Alfa Aesar)、酒石酸(CAS NO.133-37-9，Alfa Aesar)、葡糖二酸(CAS No.87-73-0)、半乳糖二酸(CAS No.526-99-8)、3-羟基戊酸(CAS No.10237-77-1)、水杨酸(CAS No.69-72-7，Alfa Aesar)和1，3丙二醇(CAS No.504-63-2，DuPont Co.，Wilmington，DE)。可以通过White等人在美国专利No.4,855,483中描述的方法制备聚水杨酸酯，在此引入作为参考。可以用Merbouh等人描述的方法合成葡糖二酸(Carbohydr.Res.336：75-78(2001)。可以按照Bramucci在WO02/012530中描述的方法制备3-羟基戊酸。

遮光剂是吸收、反射或散射波长为290-400纳米的紫外光的物质。用于本发明中的遮光剂可以是有机遮光剂或无机遮光剂。有机遮光剂在本文中定义为吸收波长为290-400纳米的紫外光的有机化学物质。有机遮光剂是本领域公知的(参见例如Woddin等，美国专利No.5,219,558，在此引入作为参考，特别是第3栏35行-第4栏23行)。合适的实例包括但不限于对-氨基苯甲酸(PABA)、对-氨基苯甲酸乙酯、对-氨基苯甲酸戊酯、对-氨基苯甲酸辛酯、对-氨基苯甲酸乙基己基二甲酯(PadimateO)、水杨酸乙二醇酯、水杨酸苯酯、水杨酸辛酯、水杨酸苄酯、水杨酸丁基苯酯、水杨酸高薄荷酯(Homosalate)、水杨酸乙基己酯(Octisalate)、TEA-水杨酸酯(Trolamine salicylate)、肉桂酸苄酯、对甲氧基肉桂酸2-乙氧基己酯(例如，可购自Givaudan-Roure Co.的

)、甲氧基肉桂酸乙基己酯(Octinoxate)、对-甲氧基肉桂酸辛酯、甘油基一(2-己酸乙酯)二对-甲氧基肉桂酸酯、对-甲氧基肉桂酸异丙酯、尿刊酸、尿刊酸乙酯、羟基甲氧基苯甲酮(Benzophenone-3)、羟基甲氧基苯酮磺酸(Benzophenone-4)及其盐、二羟基甲氧基苯酮(Benzophenone-8)、二羟基甲氧基苯酮二磺酸钠、二羟基苯酮、四羟基苯酮、4-叔丁基-4’-甲氧基二苯甲酰基甲烷(Avobenzone)。苯基苯并咪唑磺酸(Ensulizole)、2，4，6-三苯胺基-对-(碳-2’-乙基己基-1’-氧基)-1，3，5-三吖嗪、氢双苯丙烯酸辛酯、邻氨基苯甲酸薄荷酯(Meradimate)和2-(2-羟基-5-甲基苯基)苯并三唑。

无机UV遮光剂材料典型是无机色素和金属氧化物，包括但不限于二氧化钛(如可以从Cognis Co.购买的SunSmart)、氧化锌和氧化铁。优选的遮光剂是二氧化钛纳米颗粒。合适的二氧化钛纳米颗粒描述于美国专利Nos.5,451,390；5,672,330；和5,762,914。二氧化钛P25是可以从Degussa(Parsippany，NJ)获得的合适商业产品的实例。二氧化钛纳米颗粒的其它供应商包括Kemira(芬兰赫尔辛基)，Sachtleben(德国杜伊斯堡)和Tayca(日本大阪)。

二氧化钛纳米颗粒典型地具有小于100纳米(nm)的平均粒径，如通过测量颗粒在液体悬浮系中的粒度分布的动态光散射所测得的。颗粒典型地是约3nm至约6000nm的聚集物。可以使用本领域已知的任何方法，制备这样的颗粒。该方法可以包含卤化钛的气相氧化或从可溶的钛复合物的溶液沉淀，只要能生成二氧化钛纳米颗粒。

制备二氧化钛纳米颗粒的一种优选的方法是通过将氧和卤化钛(优选地，四氯化钛)注射进高温反应区，典型地从400至2000℃。在反应区的高温条件下，形成的二氧化钛纳米颗粒具有高表面积和狭窄的尺寸分布。反应器中的能量来源可以是任何热源，如等离子炬。

包含偶联于有益试剂的毛发或皮肤结合肽的缀合物

在另一实施方案中，将包含偶联于有益试剂的毛发或皮肤结合肽的缀合物用作本发明的基于肽的密封剂。偶联相互作用可以是共价键或非共价相互作用，例如氢键，静电相互作用，疏水相互作用，或范德华相互作用。在非共价相互作用的情况下，可以通过混合肽和有益试剂以及任选的间隔基，并允许足以发生相互作用的时间，制备基于肽的缀合物。使用本领域已知的方法，例如，凝胶渗透色谱，可以从得到的基于肽的缀合物分离未结合的材料。

也可以通过使特异性的毛发结合肽或皮肤结合肽直接地或通过间隔基共价地结合到有益试剂上，制备本发明的基于肽的缀合物，如Huang等人在美国专利申请公开No.2005/0050656中的描述。无机遮光剂和有机遮光剂与皮肤结合肽的共价偶联分别描述于Buseman-Williams，上文所述和Lowe等，上文所述。

可以使用任意已知的肽或蛋白缀合化学，制备本发明的基于肽的缀合物。缀合化学在本领域是已知的(参见例如Hermanson，BioconjugateTechniques，Academic Press，New York(1996))。合适的偶联剂包括但不限于，碳二亚胺偶联剂、酸氯化物、异氰酸酯、环氧化物、马来酰亚胺和其它功能性偶联剂，其中功能性偶联剂与肽的末端胺和/或羧酸基团以及肽上的巯基反应。另外，可能需要保护对肽上的反应性胺或羧酸基团，以产生基于肽的密封剂的预期结构。本领域公知氨基酸的保护基团、如叔丁氧羰基(t-Boc)的应用(参见例如上述Stewart等的文献；上述Bodanszky的文献；和上述Pennington等的文献)。在某些情况下，可能需要在有益试剂上引入反应基团，如羧酸、醇、胺、异氰酸酯或醛基，以偶联毛发结合肽或皮肤结合肽。可以使用本领域公知的常规化学方法，如氧化、还原等，完成这些修饰。

也可能希望使毛发结合肽或皮肤结合肽通过间隔基与有益试剂相偶联。间隔基将肽和有益试剂分隔开，以确保有益试剂不干扰肽对毛发或皮肤的结合。间隔基可以是任意类型的分子，如烷基链、苯基化合物、乙二醇、酰胺、酯等。可以使用任意上述的偶联化学，使间隔基共价结合到肽和有益试剂上。为了促进间隔基的掺入，可以使用双功能交联剂，其包含间隔基和处于两末端的反应基团，以偶联肽和有益试剂。

另外，间隔基可以是包含任意氨基酸及其混合物的肽。优选的肽间隔基包含脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸及其混合物。另外，肽间隔基可以包含特异性酶切割位点，如蛋白酶半胱天冬酶3位点，其用于酶促地从毛发上去除有益试剂。肽间隔基的长度可以是从1至约50个氨基酸，优选从1至约20个氨基酸。肽间隔基的实例包括但不限于SEQ ID NOs：13-15。可以通过本领域已知的任何方法，将这些肽间隔基连接到结合肽序列上。例如，可以使用前面所述的标准的肽合成技术，制备完整的结合肽-肽间隔基二嵌段物。另外，还可以使用碳二亚胺偶联剂(参见例如Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，New York(1996))、二价氯化物、二异氰酸酯和能与肽上的末端胺和/或羧酸基团反应的其它双功能偶联剂，连接结合肽和肽间隔基段。或者，可以使用前面所描述的重组DNA和分子克隆技术，制备完整的结合肽-肽间隔基二嵌段物。间隔基也可以是肽间隔基和有机间隔基分子的组合，其可以通过上述方法制备。

还可能需要将多个毛发结合肽或皮肤结合肽与有益试剂偶联，以增强基于肽的有益试剂和毛发或皮肤之间的相互作用，如Huang等人的描述(美国专利申请公开No.2005/0050656)。可以使用多个拷贝的相同毛发结合肽或皮肤结合肽，或不同毛发结合肽或皮肤结合肽的组合。多拷贝的毛发和皮肤结合肽可以包含上文所述的各种间隔基。示例的多拷贝毛发结合肽包括但不限于SEQ ID NOs：16-21。

包含毛发结合肽的组合物

可以将毛发结合肽在各种组合物中施用于毛发。例如，可以将毛发结合肽在含有毛发结合肽的水溶液中施用于毛发。或者，毛发结合肽可以在毛发护理组合物中施用于毛发。在本文中将毛发护理产品组合物定义为用于处理毛发的组合物，包括但不限于：洗发液、调理剂、冲洗液、洗剂、气雾剂、凝胶、摩丝和染发剂。毛发结合肽在组合物中使用的浓度是相对于组合物的总重量，按重量计约0.01％至约10％、优选约0.01％至约5％。此外，包含毛发结合肽的组合物可以进一步包含毛发有益试剂。该比例可以作为毛发护理组合物类型的函数而改变。此外，包含毛发结合肽的组合物可以进一步包含毛发有益试剂。如果该组合物包含毛发有益试剂，则有益试剂可以按照上文的描述与毛发结合肽偶联。肽相对于有益试剂的浓度可能需要优化，以得到最佳结果。合适的毛发结合肽，包括多拷贝的毛发结合肽描述于上文。此外，不同毛发结合肽的混合物也可以用于组合物中。混合物中的毛发结合肽需要选择，使得肽之间不存在使有益效果减弱的相互作用。本领域技术人员采用常规实验可以确定合适的毛发结合肽混合物。如果组合物中使用毛发结合肽的混合物，则肽的总浓度是相对于组合物总重量，按重量计约0.01％-约10％。

在另一实施方案中，毛发结合肽可以作为上文所述的包含偶联于毛发有益试剂的毛发结合肽的缀合物存在于组合物中。例如，有益试剂可以是染发剂，并且缀合物可以包含偶联于毛发调理剂的毛发结合肽。此外，有益试剂可以是染发剂，缀合物可以包含偶联于相同染发剂或另一种毛发着色剂的毛发结合肽。所有这些和其它可能的组合都在本发明的范围内。

包含毛发结合肽的组合物可以进一步包含用于毛发护理组合物的化妆上可接受的介质，其例子记载在，例如Philippe等，美国专利号6,280,747和Omura等，美国专利号6,139,851和Cannell等，美国专利号6,013,250，在此引入上述文献作为参考。例如，这些毛发护理组合物可以是含水的、含醇的或含水-含醇溶液，醇优选是乙醇或异丙醇，其比例是相对于含水-含醇溶液的总重量，按重量计约1-约75％。此外，毛发护理组合物可以包含一种或多种常规的化妆或皮肤添加剂或佐剂，包括但不限于抗氧化剂、防腐剂、填料、表面活性剂、UVA和/或UVB遮光剂、香料、增稠剂、润湿剂和阴离子、非离子或两性聚合物，以及染料或色素。

包含皮肤结合肽的组合物

可以将皮肤结合肽在各种组合物中施用于皮肤。例如，可以将皮肤结合肽在含有皮肤结合肽的水溶液中施用于皮肤。或者，皮肤结合肽可以在皮肤护理组合物中施用于皮肤。在本文中将皮肤护理产品组合物定义为用于处理皮肤的组合物，包括但不限于：护肤品、皮肤清洁剂、化妆品和抗皱产品。皮肤结合肽在组合物中使用的浓度是相对于组合物的总重量，按重量计约0.01％至约10％、优选约0.01％至约5％。该比例可以作为皮肤护理组合物类型的函数而改变。此外，包含皮肤结合肽的组合物可以进一步包含皮肤有益试剂。如果该组合物包含皮肤有益试剂，则有益试剂可以按照上文的描述与皮肤结合肽偶联。皮肤结合肽相对于有益试剂的浓度可能需要优化，以得到最佳结果。合适的皮肤结合肽，包括多拷贝的皮肤结合肽描述于上文。此外，不同皮肤结合肽的混合物也可以用于组合物中。混合物中的皮肤结合肽需要选择，使得肽之间不存在使有益效果减弱的相互作用。本领域技术人员采用常规实验可以确定合适的皮肤结合肽混合物。如果组合物中使用皮肤结合肽的混合物，则肽的总浓度是相对于组合物总重量，按重量计约0.01％-约10％。

在另一实施方案中，皮肤结合肽可以作为上文所述的包含偶联于皮肤有益试剂的皮肤结合肽的缀合物存在于组合物中。例如，有益试剂可以是皮肤调理剂，并且缀合物可以包含偶联于相同或不同皮肤调理剂的皮肤结合肽。有益试剂可以是皮肤着色剂，缀合物可以包含偶联于皮肤调理剂的皮肤结合肽。此外，有益试剂可以是皮肤调理剂，缀合物可以包含偶联于遮光剂的皮肤结合肽。所有这些和其它可能的组合都在本发明的范围内。

包含皮肤结合肽的组合物可以进一步包含用于皮肤护理组合物的化妆上可接受的介质，其例子记载在，例如Philippe等，上文所述。例如，化妆上可接受的介质可以是无水组合物，其含有比例通常是组合物总重量的约10-约90重量％的脂肪物质，其中脂肪相含有至少一种液体、固体或半固体脂肪物质。脂肪物质包括但不限于油、蜡、树胶和所谓的糊状脂肪物质。或者，这些组合物可以是稳定的分散系形式，如油包水或水包油乳剂。此外，组合物可以包含一种或多种常规的化妆品或皮肤病学添加剂或佐剂，包括但不限于：抗氧化剂、防腐剂、填料、表面活性剂、UVA和/或UVB防晒剂、香料、增稠剂、润湿剂和阴离子、非离子或两性聚合物，以及染料或色素。

将有益试剂施用于毛发的方法

用本发明的基于肽的密封剂增强常规毛发有益试剂，例如着色剂或调理剂的耐久性。可以用任何合适的组合物将毛发有益试剂施用于毛发。毛发有益试剂可以以上文描述的与毛发结合肽形成的缀合物形式存在于组合物中。在一种实施方案中，在常规毛发护理组合物，例如临时染发剂或毛发调理剂中将毛发有益试剂施用于毛发。这些毛发护理组合物是本领域公知的，合适的组合物描述于上文。

在一种实施方案中，将毛发有益试剂施用于毛发，持续足够毛发有益试剂与毛发结合的时间，典型是约5秒-约60分钟。任选地，可以冲洗毛发，以除去未结合于毛发的有益试剂。然后，将包含毛发结合肽的组合物施用于毛发，持续足够毛发结合肽与毛发结合的时间，典型是约5秒-约60分钟。可以从毛发上冲洗掉包含毛发结合肽的组合物，或保留在毛发上。

在另一实施方案中，将包含毛发结合肽的组合物施用于毛发，持续足够毛发结合肽与毛发结合的时间，典型是约5秒-约60分钟。任选地，可以冲洗毛发，以除去未结合于毛发的毛发结合肽组合物。然后，将毛发有益试剂施用于毛发，持续足够有益试剂与毛发结合的时间，典型是约5秒-约60分钟。可以从毛发上冲洗掉未结合的毛发有益试剂，或保留在毛发上。

在另一实施方案中，将毛发有益试剂和包含毛发结合肽的组合物一起施用于毛发，持续足够有益试剂和毛发结合肽与毛发结合的时间，典型是约5秒-约60分钟。任选地，可以冲洗毛发，以便从毛发上除去未结合的有益试剂和包含毛发结合肽的组合物。

在另一实施方案中，毛发有益试剂提供为包含毛发结合肽的组合物的一部分。在该实施方案中，将包含毛发有益试剂和毛发结合肽的组合物施用于毛发，持续足够毛发有益试剂和毛发结合肽与毛发结合的时间，典型是约5秒-约60分钟。可以从毛发上冲洗掉包含毛发有益试剂和毛发结合肽的组合物，或保留在毛发上。

在任何上述方法中，可以任选在施用毛发有益试剂和包含毛发结合肽的组合物后将包含毛发结合肽的组合物重新施用于毛发，以便进一步增强有益试剂的耐久性。

此外，在上述任何方法中，可以任选在施用毛发有益试剂和包含毛发结合肽的组合物后将包含聚合物密封剂的组合物施用于毛发，以便进一步增强有益试剂的耐久性。包含聚合物密封剂的组合物可以是水溶液或包含聚合物密封剂的毛发护理组合物。典型地，聚合物密封剂在组合物中存在的浓度是组合物总重量的约0.25重量％-约10重量％。聚合物密封剂是个人护理产品领域公知的，包括但不限于聚(烯丙胺)、聚丙烯酸酯、丙烯酸酯共聚物、聚氨酯、卡波姆、聚乙二醇、蜂蜡、methicones、amodimethicones、硅氧烷等。聚合物密封剂的选择取决于使用的特定有益试剂和毛发结合肽。本领域技术人员采用常规实验可以容易地确定最佳聚合物密封剂。

将有益试剂施用于皮肤的方法

用本发明的基于肽的密封剂增强常规皮肤有益试剂，例如着色剂、调理剂、遮光剂、香料等的耐久性。可以用任何合适的组合物将皮肤有益试剂施用于皮肤。皮肤有益试剂可以以上文描述的与皮肤结合肽形成的缀合物形式存在于组合物中。在一种实施方案中，在常规皮肤护理组合物，例如皮肤着色剂、皮肤调理剂、遮光剂等中将皮肤有益试剂施用于皮肤。

在一种实施方案中，将皮肤有益试剂施用于皮肤，持续足够皮肤有益试剂与皮肤结合的时间，典型是约5秒-约60分钟。任选地，可以冲洗皮肤，以除去未结合于皮肤的有益试剂。然后，将包含皮肤结合肽的组合物施用于皮肤，持续足够皮肤结合肽与皮肤结合的时间，典型是约5秒-约60分钟。可以从皮肤上冲洗掉包含皮肤结合肽的组合物，或保留在皮肤上。

在另一实施方案中，将包含皮肤结合肽的组合物施用于皮肤，持续足够皮肤结合肽与皮肤结合的时间，典型是约5秒-约60分钟。任选地，可以冲洗皮肤，以除去未结合于皮肤的皮肤结合肽组合物。然后，将皮肤有益试剂施用于皮肤，持续足够有益试剂与皮肤结合的时间，典型是约5秒-约60分钟。可以从皮肤上冲洗掉未结合的皮肤有益试剂，或保留在皮肤上。

在另一实施方案中，将皮肤有益试剂和包含皮肤结合肽的组合物一起施用于皮肤，持续足够有益试剂和皮肤结合肽与皮肤结合的时间，典型是约5秒-约60分钟。任选地，可以冲洗皮肤，以便从皮肤上除去未结合的有益试剂和包含皮肤结合肽的组合物。

在另一实施方案中，皮肤有益试剂提供为包含皮肤结合肽的组合物的一部分。在该实施方案中，将包含皮肤有益试剂和皮肤结合肽的组合物施用于皮肤，持续足够皮肤有益试剂和皮肤结合肽与皮肤结合的时间，典型是约5秒-约60分钟。可以从皮肤上冲洗掉包含皮肤有益试剂和皮肤结合肽的组合物，或保留在皮肤上。

在任何上述方法中，可以任选在施用皮肤有益试剂和包含皮肤结合肽的组合物后将包含皮肤结合肽的组合物重新施用于皮肤，以便进一步增强有益试剂的耐久性。

此外，在上述任何方法中，可以任选在施用皮肤有益试剂和包含皮肤结合肽的组合物后将包含聚合物密封剂的组合物施用于皮肤，以便进一步增强有益试剂的耐久性。包含聚合物密封剂的组合物可以是水溶液或包含聚合物密封剂的皮肤护理组合物。典型地，聚合物密封剂在组合物中存在的浓度是组合物总重量的约0.25重量％-约10重量％。聚合物密封剂是个人护理产品领域公知的，包括但不限于聚(烯丙胺)、丙烯酸酯、丙烯酸酯共聚物、聚氨酯、卡波姆、聚乙二醇、蜂蜡、methicones、amodimethicones、硅氧烷等。聚合物密封剂的选择取决于使用的特定有益试剂和皮肤结合肽。本领域技术人员采用常规实验可以容易地确定最佳聚合物密封剂。

实施例

在下面的实施例中对本发明作进一步的详细说明。应当理解，这些实施例是本发明优选的实施方案，仅用作实例。根据上述描述和这些实施例，本领域技术人员能够确定本发明的基本特征，在不脱离本发明精神和范围内，能够对本发明作出各种改变和修改，以满足各种应用和需要。

使用的缩写的含义如下：“min”表示分钟，“h”表示小时，“sec”表示秒，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“nm”表示纳米，“mm”表示毫米，“cm”表示厘米，“μm”表示微米，“mM”表示毫摩尔浓度，“M”表示摩尔浓度，“mol”表示摩尔，“mmol”表示毫摩尔，“μmol”表示微摩尔，“pmol”表示皮摩尔“g”表示克，“μg”表示微克，“mg”表示毫克，“wt％”表示重量百分比，”vol％”表示体积百分比，“MALDI”表示基质辅助的激光解吸电离，“OD₆₀₀”表示在600 nm波长测得的光密度，“rpm”表示每分钟的转数，“atm”表示气压，“kPa”表示千帕斯卡，“SLPM”表示每分钟的标准升，“psi”表示每平方英寸的磅数，“RCF”表示相对离心场。

实施例1

用组合制备的毛发结合肽作为密封剂进行染发

本实施例的目的是证明用染发剂与作为密封剂的毛发结合肽组合染发。用Huang等人(美国专利申请公开No.2005/0050656)的噬菌体展示筛选鉴定用于本实施例中使用的毛发结合肽。

从SynPep(Dublin，CA)获得在C末端添加了半胱氨酸残基的毛发结合肽IB5，其表示为SEQ ID NO：52。将该肽(25mg)加入溶于水的10g 1wt％Basic Violet#2(Aldrich，Milwaukee，WI；CAS 3248-91-7)储液，将溶液搅拌过夜。将天然白发样品(International Hair Importers & Products Inc.，Bellerose，NY)插入13mm×100mm试管中，将8mL肽/染料混合物注入试管。用磁力搅棒搅拌毛发样品，使其与着色剂溶液接触30分钟；然后取出并且在空气中干燥30分钟。

然后用大量去离子水冲洗毛发样品，然后在几天的时间中进行5次洗发液处理。洗发液处理包括如下给毛发施用商购的洗发液PantenePro-V Sheer Volume(Proctor & Gamble，Cincinnati，OH)。将四分之一大小的洗发液滴均匀分布在毛发样品上，然后用力将其按摩到毛发中30秒，此后用水冲洗毛发样品，以除去洗发液。然后在室温下干燥毛发样品。

重复上文描述的过程，但是不加入毛发结合肽密封剂，从而作为对照。用以下等级，肉眼观察与对照相比的颜色保留，从而对颜色耐久性进行定性分级：

“相同”：表明与对照相同量的颜色损失；

“尚可”：表明与对照相比，颜色保留的小改进

“好”：表明与对照相比，颜色保留的大改进

“非常好”：表明最少的颜色损失。

洗发液处理后，用染料和毛发结合肽密封剂处理的毛发样品的颜色评价为“非常好”，表明洗发液处理后颜色损失最少。不用毛发结合肽处理的对照在洗发液处理后显示显著的颜色损失。这些结果证明毛发结合肽作为染发剂的密封剂的有效性。

用浓度为0.75wt％或0.50wt％的Basic Violet#2储液代替上文描述的1.0wt％浓度，重复该实验。采用0.75wt％染料浓度，用染料和毛发结合肽密封剂处理的毛发样品的颜色评价为“尚可”，表明与对照相比，颜色保留有小改进。当使用0.50wt％染料浓度时，用染料和毛发结合肽密封剂处理的毛发样品的颜色评价为“相同”，表明颜色损失与对照相同。这些结果证明染料的浓度和染料与毛发结合肽的比例需要优化，以得到最佳结果。

实施例2

用实验制备的毛发结合肽作为密封剂进行染发

本实施例的目的是证明用染发剂与作为密封剂的毛发结合肽组合染发。用于本实施例的毛发结合肽是实验制备的。

从SynPep(Dublin，CA)获得实验制备的毛发结合肽，其表示为SEQID NO：8。将该肽(27mg)加入溶于水的10g 0.5wt％Basic Violet#2(Aldrich，Milwaukee，WI；CAS 3248-91-7)储液，将溶液搅拌过夜。将天然白发样品(International Hair Importers & Products Inc.，Bellerose，NY)插入13mm×100mm试管中，将8mL肽/染料混合物注入试管。用磁力搅棒搅拌毛发样品，使其与着色剂溶液接触30分钟；然后取出并且在空气中干燥30分钟。

然后用大量去离子水冲洗毛发样品，然后在几天的时间中进行8次洗发液处理。洗发液处理包括如下给毛发施用商购的洗发液PantenePro-V Sheer Volume(Proctor & Gamble，Cincinnati，OH)。将四分之一大小的洗发液滴均匀分布在毛发样品上，然后用力将其按摩到毛发中30秒，此后用水冲洗毛发样品，以除去洗发液。然后在室温下干燥毛发样品。

重复上文描述的过程，但是不加入毛发结合肽密封剂，从而作为对照。用实施例1描述的等级，肉眼观察与对照相比的颜色保留，从而对颜色耐久性进行定性分级。

洗发液处理后，用染料和毛发结合肽密封剂处理的毛发样品的颜色评价为“尚可”，表明与对照相比，颜色保留有小改进。

实施例3

用包含偶联于毛发调理剂的毛发结合肽的缀合物作为密封剂进行染发

本实施例的目的是证明用染发剂与作为密封剂的包含共价结合于毛发调理剂的毛发结合肽的缀合物组合染发。

制备十八烷基-毛发结合肽缀合物

将异氰酸十八烷酯(70mg，Aldrich，CAS No.112-96-9)溶解于5mL N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入在C末端添加了半胱氨酸残基的未受保护的HCP.1肽(示于SEQ ID NO：52)的溶液中，该肽(150mg)溶解于10mL DMF中。加入三乙胺(30mg)，用于催化反应。室温下将溶液搅拌120小时。蒸发溶剂，得到191mg米色晶体粉末产物。通过气相色谱-MALDI质谱法分析产物，发现含有分子量为1717和2013g/mol的两种成分，其分别与1和2个十八烷基单位一致，其共价连接于肽。

染发

将十八烷基-毛发结合肽缀合物(28mg)加入溶于水的10g 0.5wt％Basic Violet#2(Aldrich，Milwaukee，WI；CAS 3248-91-7)储液，将溶液搅拌过夜。将天然白发样品(International Hair Importers & Products Inc.，Bellerose，NY)插入13mm×100mm试管中，将8mL缀合物/染料混合物注入试管。用磁力搅棒搅拌毛发样品，使其与着色剂溶液接触30分钟；然后取出并且在空气中干燥30分钟。

重复上文描述的过程，但是不加入缀合物密封剂，从而作为对照。用实施例1描述的等级，肉眼观察与对照相比的颜色保留，从而对颜色耐久性进行定性分级。

洗发液处理后，用染料和十八烷基-毛发结合肽密封剂处理的毛发样品的颜色评价为“好”，表明与对照相比，颜色保留有大改进。

实施例4

用不同毛发结合肽的混合物作为密封剂进行染色

本实施例的目的是证明用染发剂与作为密封剂的两种不同毛发结合肽的混合物组合染发。使用了两种不同的单拷贝毛发结合肽的混合物。

用于本实施例的毛发结合肽是SEQ ID NO：52所示的在C末端添加了半胱氨酸残基的IB5和SEQ ID NO：2所示的KF11，这两者都获自SynPep。每种肽的使用浓度是0.125wt％。采用实施例1描述的程序，其中使用浓度为0.50wt％的Basic Violet#2，不同之处是进行8次洗发液洗涤，而不是实施例1中使用的5次洗发液洗涤。

洗发液处理后，染料和毛发结合肽混合物处理的毛发样品的颜色评价为“非常好”，表明洗发液处理后颜色损失最少。未使用毛发结合肽的对照在洗发液处理后显示显著的颜色损失。这些结果表明通过使用不同毛发结合肽的混合物，可以改进毛发颜色保留。

用毛发结合肽KF11(SEQ ID NO：2)和实施例2中使用的实验制备的肽(SEQ ID NO：8)的混合物重复该实验。采用这两种肽，与对照相比，洗发液处理后的颜色保留没有改进。该结果表明，当使用两种不同的毛发结合肽的混合物时，必须小心确保肽之间没有减弱有益效果的相互作用。认为高摩尔的实验制备的肽与KF11肽相互作用，从而消除了密封剂效果。

实施例5

多拷贝毛发结合肽的生物生产

本实施例的目的是使用重组DNA和分子克隆技术，制备SEQ IDNO：16所示的多拷贝毛发结合肽。多拷贝毛发结合肽包含6个由肽间隔基隔开的毛发结合肽序列，KF11(SEQ ID NO：2)和D21’(SEQ ID NO：3)各3个拷贝。肽在大肠杆菌中表达为包含体。将额外的氨基酸序列(即肽标记)与多拷贝的毛发结合肽序列融合，以促进包含体形成。

构建HC77607基因：

编码SEQ ID NO：16所示的肽HC77607的氨基酸序列的DNA序列是由GenScript公司(Scotch Plains，NJ)设计的，设计中使用了私有的向后翻译算法，其优化密码子选择，以便在大肠杆菌中高水平表达，并且避免重复序列和RNA二级结构。编码DNA序列如SEQ ID NO：23所示。在该编码序列中，将内切核酸酶BamHI的识别位点包括在N末端，两个终止密码子加上内切核酸酶AscI和HindIII的识别位点附加在C末端。由GenScript公司从合成寡核苷酸组装该编码DNA序列，并且克隆在质粒载体pUC57中的BamHI和HindIII位点之间，得到质粒pUC57/HC77607。由GenScript公司证实DNA序列。

构建表达载体pLX121：

克隆TBP101肽的基因：

设计68个氨基酸的合成肽，称作TBP1，并且如SEQ ID NO：24所示。肽TBP1的基因称作TBP1，它是从合成的寡核苷酸(获自Sigma-Genosys，Woodlands，TX)组装的，如表2所示。

表2

用于制备TBP1基因的寡核苷酸

寡核苷酸名称	序列	SEQ IDNO：
寡核苷酸名称	序列	SEQ IDNO：	TBP1(+)1	GGATCCATCGAAGGTCGTTTCCACGAAAACTGGCCGTCTGGTGGCGGTACCTCTACTTCCAAAGCTTCCACCACTACGACTTCTAGCAAAACCACCACTACAT	25
TBP1(+)2	CCTCTAAGACTACCACGACTACCTCCAAAACCTCTACTACCTCTAGCTCCTCTACGGGCGGTGGCACTCACAAGACCTCTACTCAGCGTCTGCTGGCTGCATAA	26	TBP1(+)1		25
TBP1(+)2		26	TBP1(-)1	TTATGCAGCCAGCAGACGCTGAGTAGAGGTCTTGTGAGTGCCACCGCCCGTAGAGGAGCTAGAGGTAGT	27
TBP1(-)2	AGAGGTTTTGGAGGTAGTCGTGGTAGTCTTAGAGGATGTAGTGGTGGTTTTGCTAGAAGTCGTAGTGGT	28	TBP1(-)1		27
TBP1(-)2		28	TBP1(-)3	GGAAGCTTTGGAAGTAGAGGTACCGCCACCAGACGGCCAGTTTTCGTGGAAACGACCTTCGATGGATCC	29

采用T4多核苷酸激酶，用ATP将每个寡核苷酸磷酸化。混合得到的寡核苷酸，煮沸5分钟，然后缓慢冷却到室温。最后，用T4 NDA连接酶连接退火的寡核苷酸，得到如SEQ ID NO：30所示的合成的DNA片段TBP1，其编码TBP101肽。

构建pINK1表达质粒：

将TBP1整合到Gateway^TM Technology系统中，用于根据制造商的说明书进行蛋白超量表达(Invitrogen，Carlsbad，CA)。在第一步中，按照标准PCR方案，将TBP1连接混合物用于pfu DNA聚合酶(Stratagene，LaJolla，CA)催化的PCR反应中。将SEQ ID NO：31所示的引物5’TBP1(5’-CAC CGG ATC CAT CGA AGG TCG T-3’)和SEQ ID NO：32所示的引物3’TBP1(5’-TCA TTA TGC AGC CAG CAG CGC-3’)用于扩增TBP1片段。由于这些引物的设计，在扩增的片段的5’和3’末端添加额外的CACC序列和另一个终止密码子TGA。

用Invitrogen的pENTR方向性

克隆试剂盒，将扩增的TBP1直接克隆到pENTR/D-TOPO载体中，得到Gateway进入质粒pENTR-TBP1。该进入质粒在One Shot TOP10大肠杆菌株(Invitrogen)中增殖。通过在DuPont测序工具中的DNA测序确定PCR扩增和克隆的准确性。

采用Stratagene的

II定点诱变试剂盒(Stratagene LaJolla，CA；目录号200523)，根据制造商的说明书通过定点诱变进一步修饰质粒pENTR-TBP1，以建立内切核酸酶NgoMI(GCCGGC)和KasI(GGCGCC)的识别位点。为了建立内切核酸酶NgoMI的识别位点，在诱变中使用SEQ ID NO：33所示的引物AGG-1-F和SEQ ID NO：34所示的引物AGG-1-R。为了建立Kasi位点，在诱变中使用SEQ ID NO：35所示的引物GGA-1-F和SEQ ID NO：36所示的引物GGS-1-R。诱变得到了质粒pENTR-TBP101，其编码68个氨基酸的合成肽，称作TBP101，如SEQID NO：37所示。

最后，将进入质粒与pDEST17混合。通过LR Clonase^TM(Invitrogen)催化LR重组反应。构建目的质粒pINK101，并且在DH5α大肠杆菌株中增殖。通过DNA测序确定重组反应的准确性。用Gateway^TMTechnology试剂盒在Invitrogen的大肠杆菌表达系统中提供LR重组反应的所有试剂。

得到的质粒包含重组蛋白INK101的编码区6H-TBP1，所述蛋白是11.6kDa的蛋白。该蛋白序列包括6xHis标记和包括TBP101肽序列前的因子Xa识别位点的肽接头。限制位点NdeI和AscI之间的INK101的编码区如SEQ ID NO：38所示。

可以通过用NdeI和BamHI限制酶消化，从pINK101切除6xHis标记和随后的接头(28-aa)的编码区。

为了测试6H-TBP1编码序列的表达，将表达质粒pINK101转化到BL21-AI大肠杆菌株(Invitrogen目录号C6070-03)中。为了生产重组蛋白，将一个菌落的转化细菌接种到50mL LB-氨苄青霉素培养液(10g/L细菌用胰蛋白胨，5g/L细菌用酵母提取物，10g/L NaCl，100mg/L氨苄青霉素，pH 7.0)中，37℃下振荡培养物，直到OD₆₀₀达到0.6。通过在培养物中加入0.5mL 20％L-阿拉伯糖并且继续振荡额外的4小时，温育表达。通过聚丙烯酰酰胺凝胶电泳分析细胞蛋白，证明了TBP101肽的生产。

在TBP101的氨基酸序列中引入DP切割位点

在低pH下特别不稳定的DP肽键(M.Landon，Methods Enzymol.47：145-9(1977))用作酸切割位点，以分隔要生产的肽与稳定化标记。因此，改变了SEQ ID NO：37所示的TBP101的氨基酸序列，在上游接头编码的区域和TBP101序列之间引入对酸不稳定的DP序列，得到SEQ IDNO：39所示的TBP101-DP。

通过定点诱变，将位于6H-TBP1基因起始处的编码EG二肽序列的两个密码子改变为编码DP二肽的密码子，从而修饰质粒pINK101的序列。用Stratagen的II定点诱变试剂盒(Stratagene La Jolla，CA；目录号200523)按照制造商的说明书加入DP酸切割位点。用于进行定点诱变的寡核苷酸如SEQ ID NO：40(上链)和SEQ ID NO：41(下链)所示。

将得到的质粒转化到化学感受态TOP 10细胞(Invitrogen；目录号C4040-06)。通过测序证实用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA)和定点突变制备的质粒DNA。TBP101的32和33位的氨基酸，即谷氨酸(E)和甘氨酸(G)，通过改变四个核苷酸残基(GAA改变为GAT，并且GGT改变为CCA)而分别改变为天冬氨酸(D)和脯氨酸(P)。得到的质粒称作pINK101-DP，如SEQ ID NO：42所示。

按照上文的描述评估从质粒pINK101-DP的肽生产。pINK101-DP如同亲本pINK101质粒一样，导致以包含体形式生产不溶的肽。

标记IBT3的设计：

编码具有SEQ ID NO：43所示序列的肽并且称作IBT3的DNA序列是从具有互补序列的SEQ IN NOs：44和45所示的两个合成寡核苷酸(Sigma Genosys)组装的。每个寡核苷酸中包括突出端，以制备与限制位点NdeI和BamHI相容的粘端。通过在99℃下将寡核苷酸的混合物(在去离子水中各100pmol)加热10分钟，然后使混合物缓慢冷却到室温，使两个寡核苷酸退火。

在缓冲液2(New England Biolabs，Beverly，MA)中用NdeI和BamHI限制酶(New England Biolabs Beverly，MA)消化质粒pINK101-DP，以释放90bp的片段，其相应于6xHis标记和来自亲本pDEST17质粒的包括gateway克隆系统的att位点的接头。通过琼脂糖凝胶电泳分离来自消化的质粒的NdeI-BamHI片段，用Qiagen

凝胶提取试剂盒(QIAGEN；目录号28704)纯化载体。12℃下用T4 DNA连接酶(NewEngland Biolabs；目录号M0202)将稀释的退火的寡核苷酸(大约0.2pmol)连接于NdeI-BamHI消化的、凝胶纯化的质粒(大约50ng)，持续18小时。分析从大肠杆菌TOP10转化体分离的质粒DNA，通过测序证实预期质粒的序列。命名为pLX121的质粒编码称作IBT3-TBP101的肽。按照上文所述，对完成的、序列证实的构建体的表达进行测试。

构建KSI(EP，S)融合配偶体

商购的质粒载体pET-31b(+)(Novagen/EMD Biosciences，Madison，WI)提供了编码类固醇异构酶(KSI)的片段的序列。KSI的该片段在与感兴趣的肽融合时倾向于在大肠杆菌中形成不溶的包含体。为了适于该融合配偶体序列，采用质粒pET-31b(+)作为模板并且采用SEQ ID NOs：46和47所示的寡核苷酸引物，通过PCR扩增KSI片段。

用内切核酸酶NdeI和BamHI消化得到的PCR产物，并且克隆到大肠杆菌DH108中的也用NdeI和BamHI消化的质粒pLX121。最终的构建体命名为KSI-101DP，含有其的质粒命名为pINK101_DP_KSI。

然后通过定点诱变(QuickChange；Stratagene)修饰质粒pINK101_DP_KSI，从KSI蛋白产物除去酸不稳定的DP序列，将其改变为EP，并且除去KSI序列中唯一的C残基，同时将其改变为S。为此目的，同时使用表示为SEQ ID NOs：48和49以及SEQ ID NOs：50和51的两对引物。得到的质粒命名为pINK101_DP_KSI(EP，S)。

构建KSI-HC77607和KSI(EPS)-HC77607基因融合体

用内切核酸酶BamHI和AscI消化DNA质粒pINK101_DP_KSI和pINK101_DP_KSI(EP，S)，用来自质粒pUC57/HC77607(描述于上文)的编码HC77607的BamHI-AscI片段替代编码TBP101的片段。得到的质粒编码KSI-HC77607和KSI(EP，S)融合蛋白，其可操作性连接于T7基因10启动子。首先在非表达株，即大肠杆菌TOP10中克隆这些质粒，然后转移到表达株，即大肠杆菌BL21-AI。

发酵

在6升发酵中使上文描述的重组大肠杆菌菌株生长，发酵最初是成批模式，然后是补料分批模式进行。发酵培养基的组成示于表3。发酵培养基的pH是6.7。通过高压灭菌给发酵培养基灭菌，此后加入以下灭菌的成分：盐酸硫胺素(4.5mg/L)、葡萄糖(22.1g/L)、微量元素，参见表4(10mL/L)、氨苄青霉素(100mg/L)和接种物(种菌)(125mL)。根据需要用氢氧化铵(20vol％)或磷酸(20vol％)调节pH。通过高压灭菌或过滤，对添加的成分进行灭菌。

表3

发酵培养基的组成

成分	浓度
成分	浓度	KH₂PO₄	9g/L
(NH₄)₂HPO₄	4g/L	KH₂PO₄	9g/L
(NH₄)₂HPO₄	4g/L	MgSO₄·7H₂O	1.2g/L
柠檬酸	1.7g/L	MgSO₄·7H₂O	1.2g/L
柠檬酸	1.7g/L	酵母提取物	5.0g/L
Mazu DF 204 消泡剂	0.1mL/L	酵母提取物	5.0g/L

表4

微量元素

成分	浓度，mg/L
成分	浓度，mg/L	EDTA	840
CoCl₂·H₂O	250	EDTA	840
CoCl₂·H₂O	250	MnCl₂·4H₂O	1500
CuCl₂·2H₂O	150	MnCl₂·4H₂O	1500
CuCl₂·2H₂O	150	H₃BO₃	300
Na₂MoO₄·2H₂O	250	H₃BO₃	300
Na₂MoO₄·2H₂O	250	Zn(CH₃COO)₂·H₂O	1300
柠檬酸铁	10000	Zn(CH₃COO)₂·H₂O	1300

发酵的操作条件概括于表5。葡萄糖的初始浓度是22.1g/L。当初始的残留葡萄糖耗尽后，起始了预先计划的、指数葡萄糖补料，从而开始发酵的补料-分批阶段。葡萄糖补料(参见表6和7)含有500g/L葡萄糖，并且补充了5g/L酵母提取物。通过高压灭菌或过滤，对补料培养基的成分进行灭菌。目标是保持0.13h^-1的单位生长速度，假定产率系数(生物量比葡萄糖)是0.25g/g，并且将发酵容器中的乙酸水平维持在非常低的值(即小于0.2g/L)。继续进行葡萄糖补料，直到发酵结束。在选定时间(即发酵15小时)用2g/L L-阿拉伯糖团块起始诱导。在以下时间向发酵容器中加入送递每升发酵培养液5g酵母提取物的团块：诱导后1小时，诱导时，和诱导后1小时。发酵19.97小时后和诱导4.97小时后终止发酵。

表5

发酵操作条件

条件	起始	最小	最大
条件	起始	最小	最大	搅拌	220rpm	220rpm	1200rpm
空气流	3SLPM	3SLPM	30SLPM	搅拌	220rpm	220rpm	1200rpm
空气流	3SLPM	3SLPM	30SLPM	温度	37℃	37℃	37℃
pH	6.7	6.7	6.7	温度	37℃	37℃	37℃
pH	6.7	6.7	6.7	压力	0.500atm(50.7kPa)	0.500atm(50.7kPa)	0.500atm(50.7kPa)
溶解的O₂ ^*	20％	20％	20％	压力	0.500atm(50.7kPa)	0.500atm(50.7kPa)	0.500atm(50.7kPa)

^*级联搅拌器，然后是空气流。

表6

补料培养基的组成

成分	浓度
成分	浓度	MgSO₄·7H₂O	2.0g/L
葡萄糖	500g/L	MgSO₄·7H₂O	2.0g/L
葡萄糖	500g/L	氨苄青霉素	150mg/L
(NH₄)₂HPO₄	4g/L	氨苄青霉素	150mg/L
(NH₄)₂HPO₄	4g/L	KH₂PO₄	9g/L
酵母提取物	5.0g/L	KH₂PO₄	9g/L
酵母提取物	5.0g/L	微量元素-补料(表7)	10mL/L

表7

微量元素-补料

成分	浓度，mg/L
成分	浓度，mg/L	EDTA	1300
CoCl₂·H₂O	400	EDTA	1300
CoCl₂·H₂O	400	MnCl₂·4H₂O	2350
CuCl₂·2H₂O	250	MnCl₂·4H₂O	2350
CuCl₂·2H₂O	250	H₃BO₃	500
Na₂MoO₄·2H₂O	400	H₃BO₃	500
Na₂MoO₄·2H₂O	400	Zn(CH₃COO)₂·H₂O	1600
柠檬酸铁	4000	Zn(CH₃COO)₂·H₂O	1600

肽HC77607的分离和纯化

完成发酵后，以12,000psi(82,700kPa)使全部发酵培养液通过高APV 2000型Gaulin型匀浆器三次。在每次匀浆前，将培养液冷却到5℃以下。立即使匀浆过的培养液通过600mL/min和12,000RCF的WestfaliaWhisperFuge^TM(Westgslia Separator Inc.，Northvale，NJ)层叠盘离心机，以便将包含体从悬浮的细胞碎片和溶解的杂质中分离出来。将回收的糊以15g/L(干重)重悬于水中，并且用NaOH将pH调节到10.0。使悬浮液以12,000psi(82,700kPa)通过高APV 2000 Gaulin型匀浆器一次，以提供剧烈混合。立即使匀浆过的pH 10悬浮液在Westfalia WhisperFuge^TM层叠盘离心机中以600mL/min和12,000RCF处理，以便将洗涤过的包含体从悬浮的细胞碎片和溶解的杂质中分离出来。将回收的糊以15g/L(干重)重悬于纯水中。使悬浮液以12,000psi(82,700kPa)通过高APV2000 Gaulin型匀浆器一次，以提供剧烈洗涤。立即使匀浆过的悬浮液在Westfalia WhisperFuge^TM层叠盘离心机中以600mL/min和12,000RCF处理，以便将洗涤过的包含体从残留的悬浮细胞碎片和NaOH中分离出来。

将回收的糊以25g/L(干重)重悬于纯水中，并且用HCl将混合物的pH调节到2.2。加入二硫苏糖醇(DTT，10mM)，以破坏二硫键。将酸化的悬浮液加热到70℃，持续14小时，以便将分隔融合蛋白的DP位点从产物肽上完全切除。将产物冷却到5℃，保持12小时。以9000RCF将混合物离心30分钟，倒去上清液。然后用0.2μm的膜过滤上清液。

将过滤的产物加入22×250mm反相色谱柱，其中含有10μm C18介质，所述介质用含有0.1vol％三氟乙酸(TFA)的10％乙腈、90％水预先调节。通过用水和乙腈的成分(10-25％乙腈水溶液，含有0.1vol％的TFA)洗脱柱子，以纯化的状态回收产物。收集含有产物肽的洗脱液，并且通过2∶1的因数真空蒸发浓缩，然后冻干。用220nm处的分光光度计检测对产物肽的洗脱进行监测和示踪。

实施例6

用多拷贝毛发结合肽作为密封剂进行染色

本实施例的目的是证明用染发剂与作为密封剂的多拷贝毛发结合肽组合染发。本实施例中使用的多拷贝毛发结合肽按照实施例5的描述制备。

染发

将SEQ ID NO：16所示的多拷贝毛发结合肽(28mg)加入溶于水的10g 0.5wt％Basic Violet#2(Aldrich，Milwaukee，WI；CAS 3248-91-7)储液，将溶液搅拌过夜。将天然白发样品(International Hair Importers &Products Inc.，Bellerose，NY)插入13mm×100mm试管中，将8mL肽/染料混合物注入试管。用磁力搅棒搅拌毛发样品，使其与着色剂溶液接触30分钟；然后取出并且在空气中干燥30分钟。

洗发液处理后，用染料和多拷贝毛发结合肽密封剂处理的毛发样品的颜色评价为“非常好”，表明颜色损失最少。

实施例7-12

用毛发结合肽作为密封剂进行染发

本实施例的目的是证明用染发剂与作为密封剂的多种毛发结合肽组合染发。用分光光度测量技术对颜色保留进行定量。

用浓度为0.07wt％的Red Dye No.33(CAS No.3567-66-6，获自Abbey Color，Philadelphia，PA)按照实施例1的描述进行染发。采用表8列出的多种毛发结合肽。染发后，用去离子水冲洗1次，然后给予一次洗发液处理，如实施例1的描述。

通过将着色的毛发样品放置在光电传感器中并且计算代表光度计反应的L^*、a^*和b^*参数，用

SP78^TM球形分光光度计(X-Rite，Inc.，Grandville，MI)测量洗发液处理后的颜色强度。对染色的毛发测量最初的基线L^*值，并且所有测量值都是三次独立测定的平均值。用下面的公式1计算δE值：

δE＝((L^* ₁ L^* ₂)²+(a₁-a₂)²+(b₁-b₂)²)^1/2 (1)

其中L^*＝明亮度变量，a^*和b^*是国际照明委员会(CIE)定义的CIELAB色隙的色度坐标(Minolta，Precise Color Communication-Color ControlFrom Feeling to Instrumentation，Minolta Camera Co.，1996)。较大的δE表明较好的颜色保留。结果概括于表8。

表8

洗发液处理后的颜色保留结果

样品	肽	SEQ IDNO：	肽浓度wt％	δE
样品	肽	SEQ IDNO：	肽浓度wt％	δE	7	A09	5	0.95％	34.8
8	A09	5	0.25％	25.6	7	A09	5	0.95％	34.8
8	A09	5	0.25％	25.6	9	HC77607	16	0.25％	19.8
10	IB5-Cys	52	0.25％	20.4	9	HC77607	16	0.25％	19.8
10	IB5-Cys	52	0.25％	20.4	11，比较的	随机	22	0.25％	10.8
12，比较的	无	--	--	8.09	11，比较的	随机	22	0.25％	10.8

从表8的结果可以看出，通过δE值测量出用毛发结合肽作为染料的密封剂，比使用单独的染料(实施例12)或使用随机肽作为密封剂(实施例11)提供了显著更佳的毛发颜色保留。

实施例13

用不同毛发结合肽的混合物作为密封剂进行染色

本实施例的目的是证明用染发剂与作为密封剂的两种不同的毛发结合肽的混合物组合染发。使用了单拷贝毛发结合肽和多拷贝毛发结合肽的混合物。

本实施例中使用的毛发结合肽是获自SynPep的如SEQ ID NO：52所示的在C末端添加了半胱氨酸残基的IB5，和实施例5制备的如SEQID NO：16所示的多拷贝毛发结合肽HC77607。每种肽的使用浓度都是0.125wt％。采用实施例4描述的程序，其中采用浓度为0.50wt％的Basic Violet#2。

由8次洗发液洗涤组成的洗发液处理后，用染料和毛发结合肽混合物处理的毛发样品的颜色评价为“非常好”，表明洗发液处理后颜色损失最少。无毛发结合肽的对照在洗发液处理后显示显著的颜色损失。这些结果表明，通过使用不同毛发结合肽的混合物，可以改进毛发颜色保留。

序列表

<110>E.I.du Pont de Nemours and Co.

<120>增强着色剂和调理剂的效果的方法

<130>CL3139 PCT

<160>74

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>毛发结合肽

<400>1

Thr Pro Pro Glu Leu Leu His Gly Asp Pro Arg Ser

1 5 10

<210>2

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>毛发结合肽

<400>2

Asn Thr Ser Gln Leu Ser Thr

1 5

<210>3

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>毛发结合肽

<400>3

Arg Thr Asn Ala Ala Asp His Pro

1 5

<210>4

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>毛发结合肽

<400>4

Arg Thr Asn Ala Ala Asp His Pro Ala Ala Val Thr

1 5 10

<210>5

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>毛发结合肽

<400>5

Ile Pro Trp Trp Asn Ile Arg Ala Pro Leu Asn Ala

1 5 10

<210>6

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>毛发结合肽

<400>6

Asp Leu Thr Leu Pro Phe His

1 5

<210>7

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>皮肤结合肽

<400>7

Thr Pro Phe His Ser Pro Glu Asn Ala Pro Gly Ser

1 5 10

<210>8

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>实验制备的毛发和皮肤结合肽

<400>8

Lys Arg Gly Arg His Lys Arg Pro Lys Arg His Lys

1 5 10

<210>9

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>实验制备的毛发和皮肤结合肽

<400>9

Arg Leu Leu Arg Leu Leu Arg

1 5

<210>10

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>实验制备的毛发和皮肤结合肽

<400>10

His Lys Pro Arg Gly Gly Arg Lys Lys Ala Leu His

1 5 10

<210>11

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>实验制备的毛发和皮肤结合肽

<400>11

Lys Pro Arg Pro Pro His Gly Lys Lys His Arg Pro Lys His Arg Pro

1 5 10 15

Lys Lys

<210>12

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>实验制备的毛发和皮肤结合肽

<400>12

Arg Gly Arg Pro Lys Lys Gly His Gly Lys Arg Pro Gly His Arg Ala

1 5 10 15

Arg Lys

<210>13

<211>37

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽间隔基

<400>13

Thr Ser Thr Ser Lys Ala Ser Thr Thr Thr Thr Ser Ser Lys Thr Thr

1 5 10 15

Thr Thr Ser Ser Lys Thr Thr Thr Thr Thr Ser Lys Thr Ser Thr Thr

20 25 30

Ser Ser Ser Ser Thr

35

<210>14

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽间隔基

<400>14

Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly

1 5 10 15

Gly Leu Gly Gly Gln Gly

20

<210>15

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽间隔基

<400>15

Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln

1 5 10

<210>16

<211>67

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>多拷贝毛发结合肽

<400>16

Pro Asn Thr Ser Gln Leu Ser Thr Gly Gly Gly Arg Thr Asn Ala Ala

1 5 10 15

Asp His Pro Lys Cys Gly Gly Gly Asn Thr Ser Gln Leu Ser Thr Gly

20 25 30

Gly Gly Arg Thr Asn Ala Ala Asp His Pro Lys Cys Gly Gly Gly Asn

35 40 45

Thr Ser Gln Leu Ser Thr Gly Gly Gly Arg Thr Asp Ala Ala Asp His

50 55 60

Pro Lys Cys

65

<210>17

<211>55

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>多拷贝毛发结合肽

<400>17

Pro Arg Thr Asn Ala Ala Asp His Pro Ala Ala Val Thr Gly Gly Gly

1 5 10 15

Cys Gly Gly Gly Arg Thr Asn Ala Ala Asp His Pro Ala Ala Val Thr

20 25 50

Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Arg Thr Asn Ala Ala Asp His Pro Ala

35 40 45

Ala Val Thr Gly Gly Gly Cys

50 55

<210>18

<211>50

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>多拷贝毛发结合肽

<400>18

Pro Arg Thr Asn Ala Ala Asp His Pro Ala Ala Val Thr Gly Gly Gly

1 5 10 15

Cys Gly Gly Gly Ile Pro Trp Trp Asn Ile Arg Ala Pro Leu Asn Ala

20 25 30

Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Pro Phe His Gly Gly

35 40 45

Gly Cys

50

<210>19

<211>82

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>多拷贝毛发结合肽

<400>19

Pro Arg Thr Asn Ala Ala Asp His Pro Gly Gly Gly Thr Pro Pro Glu

1 5 10 15

Leu Leu His Gly Asp Pro Arg Ser Lys Cys Gly Gly Gly Arg Thr Asn

20 25 30

Ala Ala Asp His Pro Gly Gly Gly Thr Pro Pro Glu Leu Leu His Gly

35 40 45

Asp Pro Arg Ser Lys Cys Gly Gly Gly Arg Thr Asn Ala Ala Asp His

50 55 60

Pro Gly Gly Gly Thr Pro Pro Glu Leu Leu His Gly Asp Pro Arg Ser

65 70 75 80

Lys Cys

<210>20

<211>82

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>多拷贝毛发结合肽

<400>20

Pro Thr Pro Pro Thr Asn Val Leu Met Leu Ala Thr Lys Gly Gly Gly

1 5 10 15

Arg Thr Asn Ala Ala Asp His Pro Lys Cys Gly Gly Gly Thr Pro Pro

20 25 30

Thr Asn Val Leu Met Leu Ala Thr Lys Gly Gly Gly Arg Thr Asn Ala

35 40 45

Ala Asp His Pro Lys Cys Gly Gly Gly Thr Pro Pro Thr Asn Val Leu

50 55 60

Met Leu Ala Thr Lys Gly Gly Gly Arg Thr Asn Ala Ala Asp His Pro

65 70 75 80

Lys Cys

<210>21

<211>82

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>多拷贝毛发结合肽

<400>21

Pro Arg Thr Asn Ala Ala Asp His Pro Gly Gly Gly Thr Pro Pro Thr

1 5 10 15

Asn Val Leu Met Leu Ala Thr Lys Lys Cys Gly Gly Gly Arg Thr Asn

20 25 30

Ala Ala Asp His Pro Gly Gly Gly Thr Pro Pro Thr Asn Val Leu Met

35 40 45

Leu Ala Thr Lys Lys Cys Gly Gly Gly Arg Thr Asn Ala Ala Asp His

50 55 60

Pro Gly Gly Gly Thr Pro Pro Thr Asn Val Leu Met Leu Ala Thr Lys

65 70 75 80

Lys Cys

<210>22

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>随机肽序列

<400>22

Lys Ser Lys Pro Tyr Pro Tyr Pro Pro Pro Leu Pro Val Arg Pro Trp

1 5 10 15

Thr

<210>23

<211>230

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>多拷贝毛发结合肽HC77607的编码序列

<400>23

ggatccgatc cgaacaccag tcagctgagt accggcggcg gccgcaccaa cgccgcggat 60

catccgaaat gtggcggcgg caacaccagc cagctgagca ccggtggcgg ccgtaccaat 120

gcggcggatc atccgaaatg tggtggtggc aatacctctc agctgagcac gggcggcggc 180

cgtaccaatg ccgcggatca tccgaaatgc taataaggcg cgccaagctt 230

<210>24

<211>68

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>TBP1肽

<400>24

Gly Ser Tle Glu Gly Arg Phe His Glu Asn Trp Pro Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Thr Ser Thr Ser Lys Ala Ser Thr Thr Thr Thr Ser Ser Lys Thr Thr

20 25 30

Thr Thr Ser Ser Lys Thr Thr Thr Thr Thr Ser Lys Thr Ser Thr Thr

35 40 45

Ser Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Thr His Lys Thr Ser Thr Gln Arg

50 55 60

Leu Leu Ala Ala

65

<210>25

<211>103

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸TBP(+)1

<400>25

ggatccatcg aaggtcgttt ccacgaaaac tggccgtctg gtggcggtac ctctacttcc 60

aaagcttcca ccactacgac ttctagcaaa accaccacta cat 103

<210>26

<211>104

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸TBP(+)2

<400>26

cctctaagac taccacgact acctccaaaa cctctactac ctctagctcc tctacgggcg 60

gtggcactca caagacctct actcagcgtc tgctggctgc ataa 104

<210>27

<211>69

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸TBP(-)1

<400>27

ttatgcagcc agcagacgct gagtagaggt cttgtgagtg ccaccgcccg tagaggagct 60

agaggtagt 69

<210>28

<211>69

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸TBP(-)2

<400>28

agaggttttg gaggtagtcg tggtagtctt agaggatgta gtggtggttt tgctagaagt 60

cgtagtggt 69

<210>29

<211>69

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸TBP(-)3

<400>29

ggaagctttg gaagtagagg taccgccacc agacggccag ttttcgtgga aacgaccttc 60

gatggatcc 69

<210>30

<211>207

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA片段TBP1

<400>30

ggatccatcg aaggtcgttt ccacgaaaac tggccgtctg ccggcggtac ctctacttcc 60

aaagcttcca ccactacgac ttctagcaaa accaccacta catcctctaa gactaccacg 120

actacctcca aaacctctac tacctctagc tcctctacgg gcggcgccac tcacaagacc 180

tctactcagc gtctgctggc tgcataa 207

<210>31

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>31

caccggatcc atcgaaggtc gt 22

<210>32

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>32

tcattatgca gccagcagcg c 21

<210>33

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>33

gaaaactggccgtctgccgg cggtacctct acttc 35

<210>34

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>34

gaagtagagg taccgccggc agacggccagttttc 35

<210>35

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>35

ctcctctacg ggcggcgcca ctcacaagac ctc 33

<210>36

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>36

gaggtcttgt gagtggcgcc gcccgtagag gag 33

<210>37

<211>68

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>TBP101肽

<400>37

Gly Ser Ile Glu Gly Arg Phe His Glu Asn Trp Pro Ser Ala Gly Gly

1 5 10 15

Thr Ser Thr Ser Lys Ala Ser Thr Thr Thr Thr Ser Ser Lys Thr Thr

20 25 30

Thr Thr Ser Ser Lys Thr Thr Thr Thr Thr Ser Lys Thr Ser Thr Thr

35 40 45

Ser Ser Ser Ser Thr Gly Gly Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Gln Arg

50 55 60

Leu Leu Ala Ala

65

<210>38

<211>312

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>INK101的编码序列

<400>38

catatgtcgt actaccatca ccatcaccat cacctcgaat caacaagttt gtacaaaaaa 60

gcaggctccg cggccgcccc cttcaccgga tccatcgaag gtcgtttcca cgaaaactgg 120

ccgtctgccg gcggtacctc tacttccaaa gcttccacca ctacgacttc tagcaaaacc 180

accactacat cctctaagac taccacgact acctccaaaa cctctactac ctctagctcc 240

tctacgggcg gcgccactca caagacctct actcagcgtc tgctggctgc ataatgaaag 300

ggtgggcgcg cc 312

<210>39

<211>96

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>TBP101-DP肽

<400>39

Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Leu Glu Ser Thr Ser Leu

1 5 10 15

Tyr Lys Lys Ala Gly Ser Ala Ala Ala Pro Phe Thr Gly Ser Ile Asp

20 25 30

Pro Arg Phe His Glu Asn Trp Pro Ser Ala Gly Gly Thr Ser Thr Ser

35 40 45

Lys Ala Ser Thr Thr Thr Thr Ser Ser Lys Thr Thr Thr Thr Ser Ser

50 55 60

Lys Thr Thr Thr Thr Thr Ser Lys Thr Ser Thr Thr Ser Ser Ser Ser

65 70 75 80

Thr Gly Gly Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Gln Arg Leu Leu Ala Ala

85 90 95

<210>40

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于定点诱变的寡核苷酸

<400>40

ccccttcacc ggatccatcg atccacgttt ccacgaaaac tggcc 45

<210>41

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于定点诱变的寡核苷酸

<400>41

ggccagtttt cgtggaaacg tggatcgatg gatccggtga agggg 45

<210>42

<211>4945

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pINK101-DP质粒

<400>42

agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac ggtttccctc 60

tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacat atgtcgtact accatcacca 120

tcaccatcac ctcgaatcaa caagtttgta caaaaaagca ggctccgcgg ccgccccctt 180

caccggatcc atcgatccac gtttccacga aaactggccg tctgccggcg gtacctctac 240

ttccaaagct tccaccacta cgacttctag caaaaccacc actacatcct ctaagactac 300

cacgactacc tccaaaacct ctactacctc tagctcctct acgggcggcg ccactcacaa 360

gacctctact cagcgtctgc tggctgcata atgaaagggt gggcgcgccg acccagcttt 420

cttgtacaaa gtggttgatt cgaggctgct aacaaagccc gaaaggaagc tgagttggct 480

gctgccaccg ctgagcaata actagcataa ccccttgggg cctctaaacg ggtcttgagg 540

ggttttttgc tgaaaggagg aactatatcc ggatatccac aggacgggtg tggtcgccat 600

gatcgcgtag tcgatagtgg ctccaagtag cgaagcgagc aggactgggc ggcggccaaa 660

gcggtcggac agtgctccga gaacgggtgc gcatagaaat tgcatcaacg catatagcgc 720

tagcagcacg ccatagtgac tggcgatgct gtcggaatgg acgatatccc gcaagaggcc 780

cggcagtacc ggcataacca agcctatgcc tacagcatcc agggtgacgg tgccgaggat 840

gacgatgagc gcattgttag atttcataca cggtgcctga ctgcgttagc aatttaactg 900

tgataaacta ccgcattaaa gcttatcgat gataagctgt caaacatgag aattcttgaa 960

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 1020

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 1080

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 1140

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 1200

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 1260

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 1320

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 1380

tatgtggcgc ggtattatcc cgtgttgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 1440

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 1500

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 1560

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 1620

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 1680

acgagcgtga caccacgatg cctgcagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 1740

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 1800

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 1860

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 1920

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1980

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 2040

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 2100

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 2160

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 2220

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 2280

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc 2340

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 2400

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 2460

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 2520

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 2580

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 2640

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 2700

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 2760

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 2820

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 2880

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 2940

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg 3000

gtatttcaca ccgcatatat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt 3060

aagccagtat acactccgct atcgctacgt gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg 3120

ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa 3180

gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc 3240

gcgaggcagc tgcggtaaag ctcatcagcg tggtcgtgaa gcgattcaca gatgtctgcc 3300

tgttcatccg cgtccagctc gttgagtttc tccagaagcg ttaatgtctg gcttctgata 3360

aagcgggcca tgttaagggc ggttttttcc tgtttggtca ctgatgcctc cgtgtaaggg 3420

ggatttctgt tcatgggggt aatgataccg atgaaacgag agaggatgct cacgatacgg 3480

gttactgatg atgaacatgc ccggttactg gaacgttgtg agggtaaaca actggcggta 3540

tggatgcggc gggaccagag aaaaatcact cagggtcaat gccagcgctt cgttaataca 3600

gatgtaggtg ttccacaggg tagccagcag catcctgcga tgcagatccg gaacataatg 3660

gtgcagggcg ctgacttccg cgtttccaga ctttacgaaa cacggaaacc gaagaccatt 3720

catgttgttg ctcaggtcgc agacgttttg cagcagcagt cgcttcacgt tcgctcgcgt 3780

atcggtgatt cattctgcta accagtaagg caaccccgcc agcctagccg ggtcctcaac 3840

gacaggagca cgatcatgcg cacccgtggc caggacccaa cgctgcccga gatgcgccgc 3900

gtgcggctgc tggagatggc ggacgcgatg gatatgttct gccaagggtt ggtttgcgca 3960

ttcacagttc tccgcaagaa ttgattggct ccaattcttg gagtggtgaa tccgttagcg 4020

aggtgccgcc ggcttccatt caggtcgagg tggcccggct ccatgcaccg cgacgcaacg 4080

cggggaggca gacaaggtat agggcggcgc ctacaatcca tgccaacccg ttccatgtgc 4140

tcgccgaggc ggcataaatc gccgtgacga tcagcggtcc agtgatcgaa gttaggctgg 4200

taagagccgc gagcgatcct tgaagctgtc cctgatggtc gtcatctacc tgcctggaca 4260

gcatggcctg caacgcgggc atcccgatgc cgccggaagc gagaagaatc ataatgggga 4320

aggccatcca gcctcgcgtc gcgaacgcca gcaagacgta gcccagcgcg tcggccgcca 4380

tgccggcgat aatggcctgc ttctcgccga aacgtttggt ggcgggacca gtgacgaagg 4440

cttgagcgag ggcgtgcaag attccgaata ccgcaagcga caggccgatc atcgtcgcgc 4500

tccagcgaaa gcggtcctcg ccgaaaatga cccagagcgc tgccggcacc tgtcctacga 4560

gttgcatgat aaagaagaca gtcataagtg cggcgacgat agtcatgccc cgcgcccacc 4620

ggaaggagct gactgggttg aaggctctca agggcatcgg tcgatcgacg ctctccctta 4680

tgcgactcct gcattaggaa gcagcccagt agtaggttga ggccgttgag caccgccgcc 4740

gcaaggaatg gtgcatgcaa ggagatggcg cccaacagtc ccccggccac ggggcctgcc 4800

accataccca cgccgaaaca agcgctcatg agcccgaagt ggcgagcccg atcttcccca 4860

tcggtgatgt cggcgatata ggcgccagca accgcacctg tggcgccggt gatgccggcc 4920

acgatgcgtc cggcgtagag gatcg 4945

<210>43

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>IBT3肽

<400>43

Ser Arg Arg Pro Arg Gln Leu Gln Gln Arg Gln Ser Arg Arg Pro Arg

1 5 10 15

Gln Leu Gln Gln Arg Gln

20

<210>44

<211>71

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于制备IBT3肽的寡核苷酸

<400>44

tatgagccgt cgtccgcgtc agttgcagca gcgtcagagc cgtcgtccgc gtcagttgca 60

gcagcgtcag g 71

<210>45

<211>73

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于制备IBT3肽的寡核苷酸

<400>45

gatccctgac gctgctgcaa ctgacgcgga cgacggctct gacgctgctg caactgacgc 60

ggacgacggc tca 73

<210>46

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>46

ccttaaggca tgtatgatgg atccctggca tgcgtgaata ttcttctcg 49

<210>47

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>47

gagcggataa caattcccct ctaga 25

<210>48

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于定点诱变的寡核苷酸

<400>48

gatgacgcca cggtggaaga acccgtgggt tccgagccc 39

<210>49

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于定点诱变的寡核苷酸

<400>49

gggctcggaa cccacgggtt cttccaccgt ggcgtcatc 39

<210>50

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于定点诱变的寡核苷酸

<400>50

ggcgagaagaatattcacgc atcccaggga tccatcgatc cac 43

<210>51

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于定点诱变的寡核苷酸

<400>51

gtggatcgat ggatccctgg gatgcgtgaa tattcttctc gcc 43

<210>52

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>C未端添加半胱氨酸残基的毛发结合肽

<400>52

Thr Pro Pro Glu Leu Leu His Gly Asp Pro Arg Ser Cys

1 5 10

<210>53

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>毛发结合肽

<400>53

Glu Gln Ile Ser Gly Ser Leu Val Ala Ala Pro Trp

1 5 10

<210>54

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>毛发结合肽

<400>54

Thr Asp Met Gln Ala Pro Thr Lys Ser Tyr Ser Asn

1 5 10

<210>55

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>毛发结合肽

<400>55

Ala Leu Pro Arg Ile Ala Asn Thr Trp Ser Pro Ser

1 5 10

<210>56

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>毛发结合肽

<400>56

Leu Asp Thr Ser Phe Pro Pro Val Pro Phe His Ala

1 5 10

<210>57

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>毛发结合肽

<400>57

Thr Pro Pro Thr Asn Val Leu Met Leu Ala Thr Lys

1 5 10

<210>58

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>毛发结合肽

<400>58

Ser Thr Leu His Lys Tyr Lys Ser Gln Asp Pro Thr Pro His His

1 5 10 15

<210>59

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>毛发结合肽

<400>59

Gly Met Pro Ala Met His Trp Ile His Pro Phe Ala

1 5 10

<210>60

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>毛发结合肽

<400>60

His Asp His Lys Asn Gln Lys Glu Thr His Gln Arg His Ala Ala

1 5 10 15

<210>61

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>毛发结合肽

<400>61

His Asn His Met Gln Glu Arg Tyr Thr Asp Pro Gln His Ser Pro Ser

1 5 10 15

Val Asn Gly Leu

20

<210>62

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>毛发结合肽

<400>62

Thr Ala Glu Ile Gln Ser Ser Lys Asn Pro Asn Pro His Pro Gln Arg

1 5 10 15

Ser Trp Thr Asn

20

<210>63

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>皮肤结合肽

<400>63

Thr Met Gly Phe Thr Ala Pro Arg Phe Pro His Tyr

1 5 10

<210>64

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>皮肤结合肽

<400>64

Ser Val Ser Val Gly Met Lys Pro Ser Pro Arg Pro

1 5 10

<210>65

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>皮肤结合肽

<400>65

Asn Leu Gln His Ser Val Gly Thr Ser Pro Val Trp

1 5 10

<210>66

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>皮肤结合肽

<400>66

Gln Leu Ser Tyr His Ala Tyr Pro Gln Ala Asn His His Ala Pro

1 5 10 15

<210>67

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>皮肤结合肽

<400>67

Ser Gly Cys His Leu Val Tyr Asp Asn Gly Phe Cys Asp His

1 5 10

<210>68

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>皮肤结合肽

<400>68

Ala Ser Cys Pro Ser Ala Ser His Ala Asp Pro Cys Ala His

1 5 10

<210>69

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>皮肤结合肽

<400>69

Asn Leu Cys Asp Ser Ala Arg Asp Ser Pro Arg Cys Lys Val

1 5 10

<210>70

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>皮肤结合肽

<400>70

Asn His Ser Asn Trp Lys Thr Ala Ala Asp Phe Leu

1 5 10

<210>71

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>皮肤结合肽

<400>71

Ser Asp Thr Ile Ser Arg Leu His Val Ser Met Thr

1 5 10

<210>72

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>皮肤结合肽

<400>72

Ser Pro Tyr Pro Ser Trp Ser Thr Pro Ala Gly Arg

1 5 10

<210>73

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>皮肤结合肽

<400>73

Asp Ala Cys Ser Gly Asn Gly His Pro Asn Asn Cys Asp Arg

1 5 10

<210>74

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>皮肤结合肽

<400>74

Asp Trp Cys Asp Thr Ile Ile Pro Gly Arg Thr Cys His Gly

1 5 10

Claims

1. 将有益试剂施用于毛发的方法，包括以下步骤：

a)提供对毛发具有亲和力的毛发有益试剂；

b)提供包含毛发结合肽的组合物；

2. 权利要求1的方法，其中所述毛发有益试剂选自毛发着色剂和毛发调理剂。

3. 权利要求2的方法，其中所述毛发着色剂选自染料、色素和纳米颗粒。

4. 权利要求3的方法，其中所述染料选自4-羟丙基氨基-3-硝基苯酚、4-氨基-3-硝基苯酚、2-氨基-6-氯代-4-硝基苯酚、2-硝基-对苯二胺、N，N-羟乙基-2-硝基-苯二胺、4-硝基-吲哚、2-硝基-5-甘油基甲基苯胺、3-甲基氨基-4-硝基苯氧基乙醇、3-硝基-对羟乙基氨基苯酚、羟基蒽醌氨基丙基甲基吗啉硫酸二甲酯、指甲花染料、HC Blue 1、HC Blue 2、HC Yellow 4、HC Red 3、HC Red 5、HCRed 7、HC Violet 1、HC Violet 2、HC Blue 7、HC Blue 10、HC Blue12、HC Yellow 2、HC Yellow 6、HC Yellow 8、HC Yellow 12、HCOrange 2、HC Orange 3、HC Brown 2、D&C Yellow 1、D&C Yellow3、D&C Blue 1、Disperse Blue 3、Disperse Violet 1、Disperse Orange、Disperse Violet 4、Disperse Black 9、Basic Orange 31、Basic Yellow57、Basic Yellow 87、HC Yellow No.9、Basic Blue 26、Basic Blue 7、Basic Blue 99、Basic Violet 14、Basic Violet 2、Basic Brown 16、BasicBrown 17、Basic Red 2、Basic Red 51、Acid Red 33、Brilliant Black1、伊红衍生物和卤化荧光素衍生物。

5. 权利要求3的方法，其中所述色素选自D&C Red No.36、D&CRed No.30、D&C Orange No.17、Green 3 Lake、Ext.Yellow 7 Lake、Orange 4 Lake、Red 28 Lake；D&C Red No.7、11、31和34的钙色淀、D&C Red No.12的钡色淀、D&C Red No.13的锶色淀、FD&C YellowNo.5的铝色淀、FD&C Yellow No.6的铝色淀、FD&C No.40的铝色淀、D&C Red Nos.21，22，27和28的铝色淀、FD&C Blue No.1的铝色淀、D&C Orange No.5的铝色淀、D&C Yellow No.10的铝色淀；D&CRed No.33的锆色淀；Cromophthal

Yellow、Sunfast

Magenta、Sunfast

Blue、氧化铁、碳酸钙、氢氧化铝、硫酸钙、高岭土、亚铁氰化铁铵、碳酸镁、洋红、硫酸钡、云母、氯氧化铋、硬脂酸锌、锰紫、氧化铬、二氧化钛、二氧化钛纳米颗粒、氧化锌、氧化钡、群青蓝、柠檬酸铋、羟磷灰石、硅酸锆和炭黑颗粒。

6. 权利要求3的方法，其中所述纳米颗粒是有色的聚合物纳米颗粒，其包含选自聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯基甲苯、苯乙烯/丁二烯共聚物和胶乳的材料。

7. 权利要求2的方法，其中所述毛发调理剂选自阳离子聚合物、阳离子表面活性剂、脂肪醇、脂肪胺、非离子聚合物、硅酮、硅氧烷、聚合物乳剂和纳米颗粒。

8. 权利要求1的方法，其中所述毛发有益试剂和包含毛发结合肽的组合物是一起施用于毛发。

9. 权利要求1的方法，其中在施用包含毛发结合肽的组合物之前将毛发有益试剂施用于毛发。

10. 权利要求1的方法，其中在施用毛发有益试剂之前将包含毛发结合肽的组合物施用于毛发。

11. 权利要求1的方法，其中所述包含毛发结合肽的组合物中包含缀合物，所述缀合物包含偶联于毛发有益试剂的毛发结合肽。

12. 权利要求11的方法，其中所述毛发有益试剂选自毛发着色剂和毛发调理剂。

13. 权利要求11的方法，其中所述缀合物的毛发结合肽与有益试剂共价结合。

14. 权利要求1的方法，其中步骤(a)的毛发有益试剂任选偶联于毛发结合肽。

15. 权利要求1的方法，其中所述毛发结合肽是通过选自噬菌体展示、酵母展示、细菌展示和组合固相肽合成的方法组合制备的。

16. 权利要求1的方法，其中所述毛发结合肽是实验制备的。

17. 权利要求16的方法，其中所述实验制备的肽包含对毛发具有亲和力的、带正电的氨基酸。

18. 权利要求1或14的方法，其中所述毛发结合肽选自SEQ ID NOs：1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、16、17、18、19、20、21和52。

19. 权利要求1的方法，进一步包括以下步骤：

d)将包含毛发结合肽的组合物重新施用于毛发，持续足够毛发结合肽结合于毛发的时间。

20. 权利要求1的方法，进一步包括以下步骤：

d)将包含聚合物密封剂的组合物施用于毛发。

21. 权利要求20的方法，其中所述聚合物密封剂选自聚(烯丙胺)、聚丙烯酸酯、丙烯酸酯共聚物、聚氨酯、卡波姆、methicones、amodimethicones、聚乙二醇、蜂蜡和硅氧烷。

22. 将有益试剂施用于皮肤的方法，包括以下步骤：

a)提供对皮肤具有亲和力的皮肤有益试剂；

b)提供包含皮肤结合肽的组合物；

23. 权利要求22的方法，其中所述皮肤有益试剂选自皮肤调理剂、染料、色素和遮光剂。

24. 权利要求23的方法，其中所述皮肤调理剂选自α-羟酸、β-羟酸、多元醇、透明质酸、D，L-泛醇、维生素A棕榈酸酯、维生素E乙酸酯、聚水杨酸酯、山梨糖醇、硅酮、硅酮衍生物、羊毛脂、天然油、甘油三酯、丙二醇、甘油、乙醇酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、葡糖二酸、半乳糖二酸、3-羟基戊酸、水杨酸、二氧化钛纳米颗粒和1，3丙二醇。

25. 权利要求23的方法，其中所述染料选自4-羟丙基氨基-3-硝基苯酚、4-氨基-3-硝基苯酚、2-氨基-6-氯代-4-硝基苯酚、2-硝基-对苯二胺、N，N-羟乙基-2-硝基-苯二胺、4-硝基-吲哚、2-硝基-5-甘油基甲基苯胺、3-甲基氨基-4-硝基苯氧基乙醇、3-硝基-对羟乙基氨基苯酚、羟基蒽醌氨基丙基甲基吗啉硫酸二甲酯、指甲花染料、HC Blue 1、HC Blue 2、HC Yellow 4、HC Red 3、HC Red 5、HC Red 7、HC Violet 1、HC Violet 2、HC Blue 7、HC Blue 10、HCBlue 12、HC Yellow 2、HC Yellow 6、HC Yellow 8、HC Yellow 12、HC Orange 2、HC Orange 3、HC Brown 2、D&C Yellow 1、D&CYellow 3、D&C Blue 1、Disperse Blue 3、Disperse Violet 1、DisperseOrange、Disperse Violet 4、Disperse Black 9、Basic Orange 31、BasicYellow 57、Basic Yellow 87、HC Yellow No.9、Basic Blue 26、BasicBlue 7、Basic Blue 99、Basic Violet 14、Basic Violet 2、Basic Brown16、Basic Brown 17、Basic Red 2、Basic Red 51、Acid Red 33、Brilliant Black 1、伊红衍生物、卤化荧光素衍生物和二羟基丙酮。

26. 权利要求23的方法，其中所述色素选自D&C Red No.36、D&C Red No.30、D&C Orange No.17、Green 3Lake、Ext.Yellow 7Lake、Orange 4 Lake、Red 28 Lake；D&C Red No.7、11、31和34的钙色淀、D&C Red No.12的钡色淀、D&C Red No.13的锶色淀、FD&CYellow No.5的铝色淀、FD&C Yellow No.6的铝色淀、FD&C No.40的铝色淀、D&C Red Nos.21，22，27和28的铝色淀、FD&C Blue No.1的铝色淀、D&C Orange No.5的铝色淀、D&C Yellow No.10的铝色淀；D&C Red No.33的锆色淀；Cromophthal

Yellow、SunfastMagenta、Sunfast

27. 权利要求23的方法，其中所述遮光剂选自有机遮光剂和无机遮光剂。

28. 权利要求27的方法，其中所述有机遮光剂选自对-氨基苯甲酸、对-氨基苯甲酸乙酯、对-氨基苯甲酸戊酯、对-氨基苯甲酸辛酯、对-氨基苯甲酸乙基己基二甲酯、水杨酸乙二醇酯、水杨酸苯酯、水杨酸辛酯、水杨酸苄酯、水杨酸丁基苯酯、水杨酸高薄荷酯、水杨酸乙基己酯、TEA-水杨酸酯、肉桂酸苄酯、对甲氧基肉桂酸2-乙氧基己酯、甲氧基肉桂酸乙基己酯、对-甲氧基肉桂酸辛酯、甘油基一(2-己酸乙酯)二对-甲氧基肉桂酸酯、对-甲氧基肉桂酸异丙酯、尿刊酸、尿刊酸乙酯、羟基甲氧基苯甲酮、羟基甲氧基苯酮磺酸、羟基甲氧基苯酮磺酸盐、二羟基甲氧基苯酮、二羟基甲氧基苯酮二磺酸钠、二羟基苯酮、四羟基苯酮、4-叔丁基-4’-甲氧基二苯甲酰基甲烷、苯基苯并咪唑磺酸、2，4，6-三苯胺基-对-(碳-2’-乙基己基-1’-氧基)-1，3，5-三吖嗪、氢双苯丙烯酸辛酯、邻氨基苯甲酸薄荷酯和2-(2-羟基-5-甲基苯基)苯并三唑。

29. 权利要求27的方法，其中所述无机遮光剂选自二氧化钛、氧化锌、氧化铁和二氧化钛纳米颗粒。

30. 权利要求22的方法，其中所述所述皮肤有益试剂和包含皮肤结合肽的组合物是一起施用于皮肤。

31. 权利要求22的方法，其中在施用包含皮肤结合肽的组合物之前将皮肤有益试剂施用于皮肤。

32. 权利要求22的方法，其中在施用皮肤有益试剂之前将包含皮肤结合肽的组合物施用于皮肤。

33. 权利要求22的方法，其中所述包含皮肤结合肽的组合物中包含缀合物，所述缀合物包含偶联于皮肤有益试剂的皮肤结合肽。

34. 权利要求33的方法，其中所述皮肤有益试剂选自皮肤着色剂和皮肤调理剂。

35. 权利要求33的方法，其中所述缀合物的皮肤结合肽与有益试剂共价结合。

36. 权利要求22的方法，其中步骤(a)的皮肤有益试剂任选偶联于皮肤结合肽。

37. 权利要求22或36的方法，其中所述皮肤结合肽选自SEQ IDNOs：7、8、9、10、11和12。

38. 权利要求22，进一步包括以下步骤：

e)将包含皮肤结合肽的组合物重新施用于皮肤。

39. 权利要求22的方法，进一步包括以下步骤：

e)将包含聚合物密封剂的组合物施用于皮肤。

40. 权利要求39的方法，其中所述聚合物密封剂选自聚(烯丙胺)、聚丙烯酸酯、丙烯酸酯共聚物、聚氨酯、卡波姆、methicones、amodimethicones、聚乙二醇、蜂蜡和硅氧烷。

41. 毛发着色剂组合物，包含毛发着色剂和毛发结合肽，其中所述着色剂和肽不彼此偶联。

42. 毛发调理组合物，包含毛发调理剂和毛发结合肽，其中所述调理剂和肽不彼此偶联。

43. 皮肤调理组合物，包含皮肤调理剂和皮肤结合肽，其中所述调理剂和肽不彼此偶联。

44. 皮肤着色剂组合物，包含皮肤着色剂和皮肤结合肽，其中所述着色剂和肽不彼此偶联。

45. 毛发结合肽，选自SEQ ID NOs：16、17、18、19、20和21。