CN101262844A - 用于增强微粒助剂效果的方法 - Google Patents

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CN101262844A CNA2006800339194A CN200680033919A CN101262844A CN 101262844 A CN101262844 A CN 101262844A CN A2006800339194 A CNA2006800339194 A CN A2006800339194A CN 200680033919 A CN200680033919 A CN 200680033919A CN 101262844 A CN101262844 A CN 101262844A
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Abstract

提供施加微粒助剂至身体表面的方法。该方法应用涂有聚合物的微粒助剂。该聚合物－涂布的助剂在包括对该聚合物具有亲和力的肽的组合物存在下施加至如毛发或皮肤的身体表面。该应用中聚合物－结合肽的存在用来延长身体表面上已涂布的微粒助剂的结合耐久性。

Description

用于增强微粒助剂效果的方法
相关申请的交叉引用
本申请在35U.S.C.§119下要求2005年9月16日提交的美国临时申请系列No.60/71 8035的优先权。
发明领域
本发明涉及微粒助剂的用途以及用于延长那些助剂结合至身体表面的方法。更具体地，本发明提供聚合物涂布的微粒助剂，在包括对聚合物涂层具有亲和力的肽的组合物存在下，以延长该助剂结合至身体表面的效果。
发明背景
毛发和皮肤的调理剂和着色剂是众所周知并且经常使用的个人护理产品。目前调理剂和非-氧化着色剂的主要问题是其缺乏持久效果所需的持久性。氧化型毛发染料提供持久的颜色，但其包含的氧化剂导致毛发损伤。为了提高毛发和皮肤护理组合物的持久性，已开发了基于肽的助剂，如护发素和毛发着色剂(Huang等，共同未决和共同拥有的美国专利申请公开号No.2005/0050656和美国专利申请公开号No.2005/0226839)。该基于肽的助剂通过将对毛发或皮肤具有高结合亲和力的特定肽序列与助剂(如调理或着色剂)偶联而制备。肽部分结合毛发或皮肤，由此强力附着该助剂。这些基于肽的助剂提供提高的持久性，但需要结合肽偶联至该助剂。包括偶联至无机防晒剂的皮肤-结合肽的基于肽的防晒剂由Buseman-Williams等在共同未决和共同拥有的美国专利申请公开号No.2005/0249682中描述。
已利用噬菌体展示筛选技术鉴定了对毛发或皮肤具有高结合亲和力的肽(Huang等，上文；Estell等，WO 0179479；Murray等，美国专利申请公开号No.2002/0098524；Janssen等，美国专利申请公开号No.2003/0152976；和Janssen等，WO04048399)。另外，已报道的基于带正电荷氨基酸的凭经验产生的毛发和皮肤-结合肽(Rothe等，WO2004/000257)。
Cornwell等(美国专利号No.6,551,361)描述了用于减少用氧化型染发剂处理的毛发颜色丧失的方法，包括用有机氨基化合物如碱性氨基酸、尿素、胍和其盐或混合物在用氧化型染发剂处理该毛发之前或之后接触毛发。然而，该说明书没有描述特定的聚合物-结合肽或包括偶联至毛发或皮肤-结合肽的聚合物-结合肽的偶联物增强聚合物-涂布的微粒助剂在身体表面上持久性的用途。
已利用噬菌体展示鉴定了对聚合物和塑性表面具有结合亲和力的肽。例如，Adey等(Gene156：27-31(1995))描述了结合到聚苯乙烯和聚氯乙烯表面的肽。另外，已报道了结合聚氨基甲酸酯(Murray等，美国专利申请公开号No.2002/0098524)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(O’Brien等，共同未决和共同拥有的美国专利申请公开号No.2005/0054752)以及聚苯乙烯、聚氨基甲酸酯、聚碳酸酯和尼龙(Grinstaff等，美国专利申请公开号No.2003/0185870)的肽。然而，还没有描述所述肽增强微粒助剂结合至身体表面的用途。
因此所要解决的问题为提供增强微粒助剂对毛发和皮肤持久性的替代方法，其简单且易于执行。
申请人通过发现对微粒助剂上聚合物涂层具有亲和力的肽可以用于增强该微粒助剂在身体表面上的持久性而阐明了所述的问题。该方法允许使用和多种聚合物-涂布的微粒助剂一起使用的一种聚合物结合肽，由此排除了对用于每种颗粒类型的不同颗粒结合肽的需要。
发明概要
公开了用于增强微粒助剂结合在身体表面上的耐久性的方法。涂有聚合物的微粒助剂在聚合物结合肽存在下施加至身体表面。该方法尤其适用于颜料、微粒调理剂和无机防晒剂施加至身体表面如毛发或皮肤。聚合物结合肽可经修饰或用作嵌合体，其包括对身体表面(如毛发和皮肤)具有亲和力的肽。在聚合物结合肽存在下，聚合物涂布的助剂可用于各种个人护理组合物如毛发着色剂和洗发剂。
因此本发明的一个实施方案中提供了用于将微粒助剂施加至身体表面的方法，包括：
a)提供涂有聚合物的微粒助剂；
b)提供包括对该聚合物具有亲和力的肽的组合物；和
c)将(a)的涂布的微粒助剂与(b)的组合物施加至身体表面一段时间，其足以使得该涂布的助剂结合至身体表面。
本发明的另一实施方案中提供了个人护理组合物，包括：
a)涂有聚合物的微粒助剂；和
b)包括对该聚合物具有亲和力的肽的组合物。
本发明的另一实施方案中提供了二嵌段的、基于肽的偶联物，其具有通式结构[(BSBP)m-(PBP)n]x，其中
a)BSBP为身体表面结合肽；
b)PBP为聚合物-结合肽；和
c)m、n和x独立地为1至约10。
本发明另一个实施方案中提供了三嵌段的、基于肽的偶联物，其具有通式结构[(BSBP)m-Sq]x-[(PBP)n-Sr]z]y，其中
a)BSBP为身体表面结合肽；
b)PBP为聚合物-结合肽；
c)S为分子间隔物；和
d)m、n、x和z独立地为1至约10，y为1至约5，并且其中q和r各自独立地为0或1，条件是r和q不能都为0。
附图简述和序列说明
本发明的各个实施方案可根据下列详细说明、附图和附加序列的说明而更充分地理解，其组成本申请的一部分。
图1为实施例18中描述的载体pKSIC4-HC77623的质粒图。
下列序列符合37C.F.R.1.821-1.825(”包含核苷酸序列和/或氨基酸序列的专利申请公开的要求-序列规则”)并且符合世界知识产权组织(WIPO)的标准ST.25(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(细则5.2和49.5(a-bis)以及第208节和管理说明附件C)。核苷酸和氨基酸序列数据的符号和使用格式遵守37C.F.R.§1.822所述的规则。
因此随同光盘提供序列表。包含序列表的光盘的内容遵照37CFR1.52(e)在此通过引用引入。光盘一式三份提交并且彼此相同。盘标记为”Copy 1-序列表”、”Copy 2序列表”和CRF。盘包含下列文件：具有下列大小：34,000字节并且创建于2006年8月31日的CL3145 Conv序列表ST25。
SEQ ID NO：1-14为聚甲基丙烯酸甲酯-结合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：15-21为聚丙烯-结合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：22-30为聚四氟乙烯-结合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：31-36为尼龙-结合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：37-43为聚乙烯-结合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：44-46为聚苯乙烯-结合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：47-52和73-81为毛发-结合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：53-57和82-93为皮肤-结合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：58-62为凭经验产生的毛发和皮肤-结合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：63-65和94-97为肽间隔物的氨基酸序列。
SEQ ID NO：66为Caspase 3切割位点的氨基酸序列。
SEQ ID NO：67-70为多拷贝毛发-结合肽/聚合物结合肽偶联物的氨基酸序列。
SEQ ID NO：71为用于制备给定为SEQ ID NO：70的基于肽的三嵌段，多拷贝毛发-结合肽/聚合物结合肽偶联物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：72为实施例18中所述的质粒pKSIC4-HCC77623的核苷酸序列。
SEQ ID NO：98-112为洗发剂-耐受的聚甲基丙烯酸甲酯-结合肽的氨基酸序列。
发明详述
本发明涉及用于增强微粒助剂持久性的方法，其包括利用涂有聚合物的微粒助剂与包括对该聚合物具有亲和力的肽的组合物结合。本发明由于该方法可用于着色或调理毛发和皮肤，提供相比常规方法增强的持久性而是有用的。
下列定义在此使用并且应当指对权利要求和说明书的解释。
如此处所用的术语“发明”或“本发明”为非-限制性的术语并且并不试图指具体发明的任何单个实施方案，而是包含了如说明书和权利要求中所述的所有可能的实施方案。
“PBP”指聚合物-结合肽。
“BSBP”指身体表面-结合肽。
“HBP”指毛发-结合肽。
“SBP”指皮肤-结合肽。
“BA”指助剂。
术语“肽”指通过肽键或修饰的肽键相互连接的两个或多个氨基酸。
术语“毛发-结合肽”指以高亲和力结合毛发的肽序列。本发明的毛发-结合肽约7个氨基酸至约50个氨基酸，更优选约7个氨基酸至约25个氨基酸，最优选约7至约20个氨基酸长度。
术语“皮肤-结合肽”指以高亲和力结合皮肤的肽序列。本发明的皮肤-结合肽约7个氨基酸至约50个氨基酸，更优选约7个氨基酸至约25个氨基酸，最优选约7至约20个氨基酸长度。
术语“聚合物-结合肽”指以高亲和力结合聚合物的肽序列。本发明的聚合物-结合肽约7个氨基酸至约50个氨基酸，更优选约7个氨基酸至约25个氨基酸，最优选约7至约20个氨基酸长度。
术语“微粒助剂”为与微粒物质有关的通用术语，其施加于身体表面时提供化妆或预防效果。微粒助剂通常包括与个人护理行业中通常使用的其他微粒物质一起的颜料、微粒调理剂、无机防晒剂等等。
术语“身体表面”指可用作微粒助剂施加的基底的人体任何表面。典型的身体表面包括，但不限于毛发、皮肤、指甲、牙齿、齿龈和角膜组织。
如此处所用的术语“毛发”指人发、眉毛和睫毛。
如此处所用的术语“皮肤”指人皮肤或人皮肤的代替物如猪皮、
Figure A20068003391900131
和EpiDermTM。如此处用作身体表面的皮肤通常包括上皮细胞层并且可另外包括内皮细胞层。
如此处所用的术语“偶联”和“偶联的”指任何化学联合并且包括共价和非-共价相互作用。
术语“基于肽的偶联物”指通过将身体表面-结合肽与聚合物-结合肽，任选直接或通过分子间隔物偶联而形成的组合物。
用于本发明聚合物-结合肽选择的术语“严谨度”指用于将肽从聚合物洗脱的洗脱剂的浓度。越高的洗脱剂浓度提供越高的严谨条件。
术语“结合亲和力”或“亲和力”指结合肽与其各自的底物的相互作用强度。结合亲和力在此根据MB50值定义，其在基于ELISA的结合测定法中确定。
术语“纳米颗粒”在此定义为具有1和500nm之间平均粒径的颗粒。优选，颗粒的平均粒径在约1和200nm之间。如此处所用的，“颗粒大小”和“粒径”具有相同的意思。纳米颗粒包括，但不限于金属、半导体、聚合物或其他的有机或无机颗粒以及有机和无机颜料。
术语“氨基酸”指蛋白质或多肽的碱性化学结构单元。下列缩写在此用于确定特定的氨基酸：
氨基酸      三字母缩写    一字母缩写
丙氨酸      Ala           A
精氨酸      Arg           R
天冬酰胺    Asn           N
天冬氨酸    Asp           D
半胱氨酸    Cys           C
谷氨酰胺    Gln           Q
谷氨酸      Glu           E
甘氨酸      Gly           G
组氨酸      His           H
异亮氨酸    Ile           I
亮氨酸      Leu           L
赖氨酸      Lys           K
甲硫氨酸    Met           M
苯丙氨酸    Phe           F
脯氨酸      Pro           P
丝氨酸      Ser           S
苏氨酸      Thr           T
色氨酸      Trp           W
酪氨酸      Tyr           Y
缬氨酸      Val           V
“基因”指表达特定蛋白质的核酸片段，包括编码序列前(5′非-编码序列)和后(3′非-编码序列)的调控序列。“天然基因”指自然界中找到的具有其自身调控序列的基因。“嵌合基因”指不是天然基因的任何基因，包括在自然界中发现不在一起的调控和编码序列。因此，嵌合基因可包括源自不同来源的调控序列和编码序列，或源自相同来源，但以不同于自然界中发现的方式排列的调控序列和编码序列。“外源”基因指通常未在宿主生物体中发现的基因，但其通过基因转移引入宿主生物体中。外源基因可包括插入非-天然生物体的天然基因或嵌合基因。
“合成基因”可由利用本领域技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸结构单元装配。连接这些结构单元并且退火以形成基因片段，其随后酶促装配以构建整个基因。如与DNA序列有关的“化学合成”指组分核苷酸在体外装配。DNA的人工化学合成可利用公认的方法完成，或者自动化学合成可利用市场上可买到的多种机器之一完成。因此，可加工基因用于基于核苷酸序列优化的最优基因表达以反映宿主细胞的密码子偏爱性。熟练技术人员理解如果密码子使用偏向宿主喜好的那些密码子时成功的基因表达的可能性。优选密码子的确定可以源自宿主细胞的基因调查为基础，其中可得到其序列信息。
术语“噬菌体展示”指功能性外源肽或小蛋白质在噬菌体或噬粒表面上的呈现。遗传改造的噬菌体可用于呈递如其天然表面蛋白质的片段的肽。可通过具有不同基因序列的噬菌体种群产生肽文库。
“PCR”或“聚合酶链式反应”为用于特定DNA片段扩增的技术(美国专利No.4,683,195和4,800,159)。
在此所用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知并且由Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY(1989)(在下文中“Maniatis)；由Silhavy，T.J.，Bennan，M.L和Enquist，L.W.，Experiments withgene Fusions，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及由Ausubel，F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc和Wiley-Interscience出版(1987)所描述。
本发明提供用于增强微粒助剂(如颜料)、微粒调理剂和无机防晒剂在身体表面(如毛发和皮肤上)的持久性的方法，包括将聚合物-涂布的微粒助剂与包括对该聚合物涂层具有亲和力的肽的组合物一起施加于身体表面。对聚合物涂层具有亲和力的肽在此也称为“聚合物-结合肽”，可利用组合方法(如噬菌体展示)鉴定。另外，包括对该聚合物涂层具有亲和力的肽的组合物可进一步包括身体表面-结合肽(如毛发或皮肤-结合肽)任选作为游离肽或作为包括偶联至身体表面-结合肽的聚合物-结合肽的偶联物。本发明的方法中，包括对聚合物涂层具有亲和力的肽的组合物可在聚合物-涂布的微粒助剂施加的同时，之前或之后施加以将该助剂封于身体表面。
微粒助剂
本发明的方法可与个人护理领域已知的多种微粒助剂一起使用。微粒助剂的实例包括，但不限于颜料、微粒调理剂和无机防晒剂。
如此处所用的，术语“颜料”指不溶性着色剂。本发明中多种有机和无机颜料可单独或组合使用。用于着色毛发和皮肤的颜料为本领域熟知(参见例如Green等(WO 0107009)，在此通过引用引入，CFTAInternational Color Handbook，第二版，Micelle Press，England(1992)以及Cosmetic Handbook，US Food and Drug Administration，FDA/IASBooklet(1992))，并且可从各种来源商业上购买到(例如Bayer，Pittsburgh，PA；Ciba-Geigy，Tarrytown，NY；ICI，Bridgewater，NJ；Sandoz，Vienna，Austria；BASF，Mount Olive，NJ；和Hoechst，Frankfurt，Germany)。例证性的颜料包括，但不限于D&C Red No.36、D&C Red No.30、D&COrange No.17、Green 3 Lake、Ext.Yellow 7 Lake、Orange 4 Lake和Red 28Lake；D&C Red No.7、11、31和34的钙沉淀色料、D&C Red No.12的钡沉淀色料、D&C Red No.13的锶沉淀色料(barium lake)、FD&C YellowNo.5、FD&C Yellow No.6、FD&C No.40、D&C Red No.21、22、27和28、FD&C Blue No.1、D&C Orange No.5、D&C Yellow No.10的铝沉淀色料、D&C Red No.33的锆沉淀色料；Yellow 131AK(CibaSpecialty Chemicals)、
Figure A20068003391900162
Magenta 122(Sun Chemical)和
Figure A20068003391900163
Blue15:3(Sun Chemical)、铁氧化物、碳酸钙、氢氧化铝、硫酸钙、高岭土、亚铁氰化铁铵(ferric ammonium ferrocyanide)、碳酸镁、胭脂红(carmine)、硫酸钡、云母石(mica)、氯氧化铋、硬脂酸锌、锰紫(manganese violet)、氧化铬、二氧化钛、黑色二氧化钛(black titanium dioxide)、二氧化钛纳米颗粒、氧化锌、氧化钡、群青(ultramarine blue)、柠檬酸铋和白色矿物质(如羟基磷灰石)和锆石(硅酸锆)以及炭黑颗粒(carbon black particles)。
根据定义，颜料基本上不溶，因此以分散形式使用。颜料可利用分散剂分散或可使用自分散颜料。当分散剂用于分散颜料时，分散剂可以是本领域已知的任何合适的分散剂，包括但不限于如下所述的随机或结构性有机聚合分散剂，蛋白质分散剂，如Brueckmann等(美国专利No.5,124,438)所述的那些；以及基于肽的分散剂，如O’Brien等(共同未决和共同拥有的美国专利申请公开号No.2005/0054752)所述的那些。优选的随机有机聚合分散剂包括丙烯酸酯类聚合物和苯乙烯-丙烯酸酯类聚合物。最优选结构性分散剂，其包括AB、BAB和ABC嵌段共聚物、分支聚合物和接枝聚合物。优选有机聚合物包括选自丙烯酸酯、异丁烯酸、甲基丙烯酸丁酯、2-乙基己基异丁烯酸、苯甲基异丁烯酸、苯氧乙基丙烯酸酯、乙氧基三甘醇异丁烯酸、聚乙二醇异丁烯酸、聚乙二醇丙烯酸酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、羟乙基丙烯酸酯和甲基丙烯酸羟乙酯组成的组的单体单元，如由Nigan(美国专利申请公开号No.2004/0232377)所述的那些。一些有用的结构性聚合物分散剂在美国专利No.5,085,698、EP-A-0556649和美国专利No.5,231,131中公开(其公开内容在此通过引用引入)。另外，颜料可利用包括木质素磺酸和多肽的表面活性剂分散，如由Cioca等在美国专利No.4,494,994中所述的，其在此通过引用引入。
通常在其已施加于颜料后，颜料上的有机聚合物可通过共价或离子键任选地交联。交联提高聚合物涂层的持久性和环境-耐受性。
颜料可在用有机聚合物涂布之前任选地表面处理。常见的表面处理包括，但不限于烷基硅烷、硅氧烷、甲基硅氧烷和二甲基硅氧烷。表面处理提高对颜料表面具有亲和力的聚合物的范围。
自分散颜料为已用化学附着的、赋予分散能力的基团表面改性以允许无单独的分散剂时稳定分散的颜料。对于在水相载体介质中的分散，表面改性包括亲水基团并且最常见的离子化亲水基团的添加。自分散颜料可通过物理处理(如真空等离子气体)或通过化学处理(例如，臭氧、次氯酸等等氧化)将官能团或包含官能团的分子接枝至颜料表面上而制备。单类或多类亲水官能团可键合至一种颜料颗粒。自分散颜料例如在美国专利No.5,571,311、美国专利No.5,609,671、美国专利No.5,968,243、美国专利No.5,928,419、美国专利No.6,323,257、美国专利No.5,554,739、美国专利No.5,672,198、美国专利No.5,69,8016、美国专利No.5,718,746、美国专利No.5,749,950、美国专利No.5,803,959、美国专利No.5,837,045、美国专利No.5,846,307、美国专利No.5,895,522、美国专利No.5,922,118、美国专利No.6,123,759、美国专利No.6,221,142、美国专利No.6,221,143、美国专利No.6,281,267、美国专利No.6,329,446、美国专利No.6,332,919、美国专利No.6,375,317、美国专利No.6,287,374、美国专利No.6,398,858、美国6,402,825、美国专利No.6,468,342、美国专利No.6,503,311、美国专利No.6,506,245和美国专利No.6,852,156中描述。之前参考文献的公开内容在此通过引用引入。
由于其强的光辐射(Vic等，美国专利申请公开号No.2004/0010864)，金属和半导体纳米颗粒也可用作毛发着色剂。金属纳米颗粒包括，但不限于金、银、铂、钯、铱、铑、锇、铁、铜、钴和这些金属组成的合金的颗粒。“合金”在此定义为两种或多种金属的均一混合物。“半导体纳米颗粒”包括，但不限于硒化镉、硫化镉、硫化银、硫化镉、氧化锌、硫化锌、硒化锌、硫化铅、砷化镓、硅、氧化锡、氧化铁和磷化铟的颗粒。纳米颗粒为稳定的并且通过利用合适的有机涂层或单层而制成水溶性的。如此处所用，单层-保护的纳米颗粒为稳定纳米颗粒的一种类型。用于制备稳定的、水溶性的金属和半导体纳米颗粒的方法为本领域所知，并且合适的实例由Huang等在共同未决和共同拥有的美国专利申请公开号No.2004/0115345中描述，其在此通过引用引入。纳米颗粒的颜色取决于颗粒的大小。因此，通过控制纳米颗粒的大小，可以获得不同的颜色。
微粒助剂也可以是纳米颗粒，如有机纳米颗粒；无机纳米颗粒，如硅纳米颗粒；聚合物纳米颗粒；金属和半导体纳米颗粒，其用作毛发调理剂，特别是毛发拉直助剂、毛发强化助剂和毛发丰盈剂。
微粒助剂也可以是无机UV防晒剂，其吸收、反射或散射290至400纳米波长的紫外光。无机UV防晒剂材料通常为无机颜料和金属氧化物，包括但不限于二氧化钛(如可以从Cognis Co.获得的SunSmart)、氧化锌和氧化铁。优选的防晒剂为二氧化钛纳米颗粒。合适的二氧化钛纳米颗粒在美国专利No.5,451,390；5,672,330和5,762,914中描述。二氧化钛P25为可以从Degussa(Parsippany，NJ)获得的合适商品的实例。其他二氧化钛纳米颗粒的商品供应商包括Kemira(Helsinki，Finland)、Sachtleben(Duisburg，Germany)和Tayca(Osaka，Japan)。
二氧化钛纳米颗粒通常具有小于100纳米(nm)直径的平均粒径，如通过测量液体悬浮液中颗粒粒径分布的动态光散射所测定的。颗粒通常凝聚成团，其范围约3nm至约6000nm。本领域已知的任何方法可用于制备所述颗粒。该方法可包括钛卤化物或来自可溶性钛复合物的溶液沉淀物的气相氧化，条件是产生二氧化钛纳米颗粒。
制备二氧化钛纳米颗粒的优选方法为通过注射氧和卤化钛，优选四氯化钛进入高温反应区，通常从400至2000℃。在该反应区中的高温条件下，二氧化钛的纳米颗粒形成具有高比表面积和窄的粒径分布。该反应器中的能源可以是任何热源如等离子火焰。
聚合物-涂布的微粒助剂
用于本发明中，微粒助剂涂有聚合物涂层，使得通过如下所述的组合方法鉴定的对该聚合物具有亲和力的肽将结合至该聚合物涂层。该聚合物涂层可由许多不同的有机和生物聚合物形成，包括但不限于聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚氨基甲酸酯、多肽、木质素、多糖、聚酰胺、聚酰亚胺、聚芳酰胺和包括来自甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯或苯乙烯的至少一种单体的共聚物(例如，嵌段和接枝共聚物)。
如上所述，如果用聚合物分散剂分散的颜料用作微粒助剂，则聚合物分散剂可用作聚合物涂层。可利用上述任何聚合物分散剂。例如，用包含聚丙烯酸酯的分散剂分散的颜料可与聚丙烯酸酯-结合肽一起使用。或者，该分散颜料可用如下所述的另一种聚合物涂布。
对于通常不与聚合物分散剂一起使用的颜料和自分散颜料以及其他的微粒助剂，颗粒可以利用本领域已知的颗粒涂层方法用聚合物涂布。通常，用于涂布颗粒的方法为基于溶液的方法，其依赖聚合物涂层溶液施加至颗粒表面上，随后除去溶剂。例如，微粒助剂可以通过颗粒与包含聚合物的溶液简单混合足以涂布颗粒的一段时间，随后除去溶剂而用聚合物涂布。另外，微粒助剂可以利用喷涂技术用聚合物涂布，如Guignon等所述的那些技术(Drying Technol.20：419-447(2002))。涂层也可以用Wurster涂布机施加(参见例如，Cardozo等，美国专利申请公开号No.2006/0019860)。本发明的微粒助剂也可以利用如Rosca等所述的乳化-溶剂蒸发技术涂布聚合物(J.Control Release 99：271-280(2004))。另外，微粒助剂可以利用Schurr所述的喷射混合器方法和装置涂布聚合物f美国专利No.4,430,001和WO 97/007879)。喷射混合器方法中，少量添加剂与粉剂充分混合，同时雾化涂层液体并且分散气体喷射器中的颗粒。该方法提供少用水和接触时间非常短的优点，其使得能够在高温下涂层热敏材料。
聚合物-结合肽的鉴定
对聚合物具有亲和力的肽，在此也指聚合物-结合肽(PBP)，为强烈结合至聚合物表面的肽序列。本发明的聚合物-结合肽约7个氨基酸至约50个氨基酸，更优选约7个氨基酸至约25个氨基酸，最优选约7至约20个氨基酸长度。合适的聚合物-结合肽可利用本领域熟知的的方法选择。
聚合物-结合肽可以随机产生，随后以其对目的底物的结合亲和力为基础针对特定的聚合物底物而选择，如O’Brien等(共同未决和共同拥有的美国专利申请公开号No.2005/0054752)、Adey等，(Gene 156：27-31，(1995))、Murray等(美国专利申请公开号No.2002/0098524)和Grinstaff等(美国专利申请公开号No.2003/0185870)所述，其全部在此通过引用引入。随机肽文库的产生是众所周知的并且可以通过各种技术完成，包括细菌展示(Kemp，D.J.；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(7)：4520-4524(1981)，和Helfman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1)：31-35，(1983))，酵母展示(chien等，Proc Natl Acad Sci USA 88(21)：9578-82(1991))，组合的固相肽合成(美国专利No.5,449,754、美国专利No.5,480,971、美国专利No.5,585,275、美国专利No.5,639,603)和噬菌体展示技术(美国专利No.5,223,409、美国专利No.5,403,484、美国专利No.5,571,698、美国专利No.5,837,500)。产生所述生物学肽文库的技术为本领域熟知。例证性的方法在Dani，M.，J.of Receptor&SignalTransduction Res.，21(4)：447-468(2001)、Sidhu等，Methods in Enzymology328：333-363(2000)、Kay等，Combinatorial Chemistry&High ThroughputScreening，第8卷：545-551(2005)和Phage Display of Peptides andProteins，A Laboratory Manual，Brian K.Kay，Jill Winter以及JohnMcCafferty，eds.；Academic Press，NY，1996中描述。另外，噬菌体展示文库可从如New England BioLabs(Beverly，MA)的公司购得。
随机产生肽的优选方法为噬菌体展示。噬菌体展示为体外选择技术，其中肽或蛋白质遗传融合至噬菌体的外壳蛋白，使得融合肽展示在噬菌体病毒颗粒的外部，而编码该融合物的DNA存在于病毒颗粒内部，但。展示的肽和编码其的DNA之间的这一自然关联大量很多肽变体的筛选，每种通过称为“生物淘筛(biopanning)”的简单的体外选择方法与对应的DNA序列相联系。在其最简单的形式中，生物淘筛通过将噬菌体-展示变体库与已固定于平皿或磁珠上的目的靶标温育，洗去未结合的噬菌体，并且通过破坏噬菌体和靶标之间的结合相互作用而洗脱特异性结合的噬菌体而进行。随后体内扩增洗脱的噬菌体且重复该过程，导致有利于最紧密结合序列的噬菌体库的逐步富集。3轮或更多轮选择/扩增后，通过DNA测序表征单克隆。
特别地，可利用下列方法选择聚合物-结合肽。合适的噬菌体肽文库利用上述方法产生或该文库购自商品供应商。产生噬菌体-肽文库后，该文库随后与适量聚合物底物接触。噬菌体-肽文库溶于合适的溶液用于接触该底物。该检测底物可悬浮于溶液中或可固定在平皿或磁珠上。优选的溶液为包含表面活性剂的缓冲水相盐溶液。合适的溶液为具有0.5％20的Tris-缓冲盐水(TBS)。该溶液可另外以任何手段搅拌以提高肽至聚合物底物的质量转移率，由此缩短达到最大结合所需的时间。
接触时，许多随机产生的噬菌体-肽结合至聚合物底物形成噬菌体-肽-聚合物复合物。未结合的噬菌体-肽可以通过洗涤除去。所有未结合的材料除去后，对聚合物底物具有不同程度结合亲和力的噬菌体-肽可以通过在具有不同严谨度的缓冲液中选择性的洗涤而分馏。提高所用缓冲液的严谨度提高了噬菌体-肽-底物复合物中噬菌体-肽和聚合物底物之间键合所需的强度。
许多物质可用于改变肽选择中缓冲溶液的严谨度，包括但不限于酸性pH(1.5-3.0)；碱性pH(10-12.5)；高盐浓度如MgCl2(3-5M)和LiCl(5-10M)；水；乙二醇(25-50％)；二氧杂环己烷(5-20％)；硫氰酸盐(1-5M)；胍(2-5M)；尿素(2-8M)和各种不同浓度的表面活性剂如SDS(十二烷基磺酸钠)、DOC(脱氧胆酸钠)、Nonidet P-40、Tritonx-100、
Figure A20068003391900212
20，其中优选
Figure A20068003391900213
20。这些物质可制备在缓冲溶液中，包括但不限于Tris-HCl、Tris-缓冲盐、Tris-硼酸盐、Tris-乙酸、三乙胺、磷酸盐缓冲液和甘氨酸-HCl，其中优选Tris-缓冲盐溶液。
可以理解的是具有对聚合物底物提高结合亲和力的噬菌体-肽可通过利用具有提高严谨度的缓冲液重复该选择过程而洗脱。洗脱的噬菌体-肽可通过本领域已知的任何方法鉴定和测序。
在一个实施方案中，可以利用下列用于产生本发明聚合物-结合肽的方法。组合地产生的(combinatorially generated)噬菌体-肽文库与目的聚合物底物接触以形成噬菌体肽-底物复合物。优选通过酸处理，该噬菌体-肽-底物复合物与未复合的肽和未结合的底物分离，并且从复合物洗脱来自噬菌体-肽-底物复合物的结合的噬菌体-肽。随后，鉴定和测序洗脱的噬菌体-肽。为了鉴定结合至一种聚合物底物而不是另一种的肽序列，可添加消减淘选步骤。具体地，组合地产生的噬菌体-肽文库首先与非-靶标接触以除去结合其的噬菌体-肽。随后，未-结合的噬菌体-肽与所需的聚合物底物接触并且进行上述过程。或者，组合地产生的噬菌体-肽文库可同时与非-靶标以及与所需的聚合物底物接触。随后，从噬菌体-肽-非-靶标复合物分离噬菌体-肽-底物复合物，并且对所需的噬菌体-底物复合物进行上述方法。
或者，可利用分离对聚合物底物具有更高亲和力的肽的改进的噬菌体展示筛选法。该改进的方法中，如上所述形成噬菌体-肽-底物复合物。随后，这些复合物用洗脱缓冲液处理。可利用上述任何洗脱缓冲液。优选，洗脱缓冲液为酸性溶液。随后，剩下的洗脱-耐受的噬菌体-肽-底物复合物用于直接感染/转染细菌宿主细胞，如大肠杆菌ER2738。受感染的宿主细胞在合适的生长培养基中生长，如LB(Luria-Bertani)培养基，并且该培养物涂布于琼脂上，其包含合适的生长培养基如具有IPTG(异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷)和S-GalTM的LB培养基。培养后，挑选用于DNA分离和测序的菌斑以鉴定对目的底物具有高结合亲和力的肽序列。或者，通过利用合适的引物对噬菌体-肽-底物复合物直接进行PCR，PCR可用于鉴定来自上述改进的噬菌体展示筛选法的洗脱-耐受的噬菌体-肽，如Janssen等在美国专利申请公开号No.2003/0152976中所述，其在此通过引用引入。
另外，可利用选择洗发剂-耐受的毛发-结合肽的改进的生物淘筛方法选择洗发剂-耐受的聚合物-结合肽，其由O’Brien等描述(共同未决和共同拥有的美国专利申请公开号No.2006/0073111，其在此通过引用引入)。同样，可利用鉴定护发素-耐受的毛发-结合肽的改进的生物淘筛方法鉴定护发素-耐受的聚合物-结合肽，其由Wang等描述(共同未决和共同拥有的美国专利申请No.11/359163)。洗发剂-耐受的和护发素-耐受的聚合物结合肽尤其可用于毛发的处理，因为其分别能够经得起洗发剂或护发素的处理。在用于鉴定洗发剂-耐受的或护发素-耐受的聚合物-结合肽的方法中，最初的噬菌体肽文库溶于目的基质中(即洗发剂基质或护发素基质)用于与聚合物底物接触。或者，如上所述，通过将聚合物底物与噬菌体肽文库接触形成噬菌体-肽-底物复合物后，该复合物与目的基质接触。噬菌体-肽-底物复合物与目的基质的接触可重复一次或多次。随后如上所述进行生物淘筛方法。洗发剂基质或护发素基质可以是全强度(full strength)商业产品或其稀释物。实施例21中给出了选择洗发剂-耐受的聚甲基丙烯酸甲酯-结合肽的详细说明。
利用上述方法鉴定的合适的聚合物-结合肽的实例包括，但不限于聚甲基丙烯酸甲酯-结合肽，如SEQ ID NO：1-14、洗发剂-耐受的聚甲基丙烯酸甲酯-结合肽，如SEO ID NO：98-112、聚丙烯-结合肽如SEQ IDNO：15-21、聚四氟乙烯-结合肽如SEQ ID NO：22-30、尼龙-结合肽如SEQ ID NO：31-36、聚乙烯-结合肽如SEO ID NO：37-43和聚苯乙烯-结合肽如SEQ ID NO：44-46。另外，可使用本领域已知的聚合物-结合肽，如Adey等(Gene 156：27-31，(1995))公开的聚苯乙烯和聚氯乙烯-结合肽、Murray等(美国专利申请公开号No.2002/0098524)公开的聚氨基甲酸酯-结合肽、O’Brien等(共同未决和共同拥有的美国专利申请公开号No.2005/0054752)公开的聚对苯二甲酸乙二醇酯-结合肽以及Grinstaff等(美国专利申请公开号No.2003/0185870)公开的聚苯乙烯、聚氨基甲酸酯、聚碳酸酯和尼龙-结合肽。可能需要将两种或多种聚合物-结合肽或者直接或者通过间隔物连接在一起以增强肽与聚合物底物的相互作用。制备多种肽组合物和合适的间隔物的方法描述如下。
聚合物-结合肽的产生
本发明的聚合物-结合肽可利用标准的肽合成方法制备，其为本领域所熟知(参见例如Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis，PierceChemical Co.，Rockford，IL，1984；Bodanszky，Principles of PeptideSynthesis，Springer-Verlag，New York，1984；以及Pennington等，PeptideSynthesis Protocols，Humana Press，Totowa，NJ，1994)。另外，许多公司提供定制的肽合成服务。
或者，本发明的聚合物-结合肽可利用重组DNA和分子克隆技术制备。如Huang等(美国专利申请公开号No.2005/0050656)和上文O’Brien等所述，编码聚合物-结合肽的基因可在异源宿主细胞中产生，尤其在微生物宿主细胞中。当通过重组DNA和分子克隆技术制备时肽可进一步包括N-末端的脯氨酸(P)残基和任选地C-末端的天冬氨酸(D)残基。这些额外的残基通过利用DP切割位点从肽标签分离所需的肽序列而产生，用于促进肽序列串联重复之间包涵体的形成(参见实施例18)。
身体表面-结合肽
可与身体表面-结合肽结合使用的聚合物-结合肽包括但不限于，毛发和皮肤-结合肽。如在此定义的，身体表面-结合肽(BSBP)为以高亲和力结合身体表面的肽序列。身体表面-结合肽可利用如上所述以及如Huang等(共同未决和共同拥有的美国专利申请公开号No.2005/0050656和美国专利申请公开号No.2005/0226839)、Estell等(WO0179479)；Murray等(美国专利申请公开号No.2002/0098524)；Janssen等(美国专利申请公开号No.2003/0152976)以及Janssen等(WO04048399)所述的组合方法产生。另外，可利用O’Brien等在共同未决和共同拥有的美国专利申请公开号No.2006/0073111中所述的改进的生物淘筛方法选择洗发剂-耐受的毛发-结合肽。同样，可利用由Wang等(共同未决和共同拥有的美国专利申请No.11/359163)和Wang等(共同未决和共同拥有的美国专利申请号No.11/359162)所述的方法分别鉴定护发素-耐受的毛发-结合肽和皮肤护理组合物耐受的皮肤-结合肽。那些方法中，或者最初的噬菌体肽文库溶于目的基质中(即洗发剂基质、护发素基质或皮肤护理组合物基质)用于与底物接触，或者如上所述，噬菌体-肽底物复合物在由底物与噬菌体肽文库接触而形成后，与目的基质接触。随后如上所述进行生物淘筛方法。洗发剂基质、护发素基质或皮肤护理组合物基质可以是全强度的商业产品或其稀释物。合适的组合产生的身体表面-结合肽的实例包括，但不限于毛发-结合序列如SEQ ID NO：47-52和73-81，以及皮肤-结合序列如SEQ ID NO：53-57和82-93(参见表A)。这些身体表面-结合肽可利用上述方法制备。
或者，如Rothe等(WO 2004/000257)所述，可通过设计包括能通过静电相互作用结合至毛发和皮肤的带正电荷氨基酸的肽而凭经验产生毛发和皮肤-结合肽序列。凭经验产生的毛发和皮肤-结合肽具有约7个氨基酸至约50个氨基酸，并且包括至少约40摩尔％的带正电荷的氨基酸，如赖氨酸、精氨酸和组氨酸。最优选包含三肽基序如HRK、RHK、HKR、RKH、KRH、KHR、HKX、KRX、RKX、HRX、KHX和RHX的肽序列，其中X可以为任何天然的氨基酸，但最优选地选自中性侧链氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸。此外，应该理解的是肽序列必须满足最终用途中的其他功能要求，包括溶解度、粘度以及与配制产品中其他组分的相容性的要求，且因此将根据应用的要求而变化。有时肽可能包含上至60摩尔％的氨基酸，其不包括组氨酸、赖氨酸或精氨酸。合适的凭经验产生的毛发和皮肤-结合肽包括，但不限于如SEQ ID NO：58-62的肽序列(参见表A)。
表A
毛发-结合和皮肤-结合肽序列的实例
  身体表面    SEQ ID NO：  序列
  毛发    47  RTNAADHPAAVT
  毛发(洗发剂耐受的)    48  TPPELLHGDPRS
  毛发(洗发剂耐受的)    49  NTSQLST
  毛发    50  DLTLPFH
  毛发    51  THSTHNHGSPRHTNADAGNP
  毛发    52  STLHKYKSQDPTPHH
  毛发和皮肤(凭经验的)    58  KRGRHKRPKRHK
  毛发和皮肤(凭经验的)    59  RLLRLLR
  毛发和皮肤(凭经验的)    60  HKPRGGRKKALH
  毛发和皮肤(凭经验的)    61  KPRPPHGKKHRPKHRPKK
  毛发和皮肤(凭经验的)    62  RGRPKKGHGKRPGHRARK
  毛发    73  EQISGSLVAAPW
  毛发    74  TDMQAPTKSYSN
  毛发    75  LDTSFPPVPFHA
  毛发(洗发剂耐受的)    76  TPPTNVLMLATK
  毛发(调理剂耐受的)     77  STLHKYKSQDPTPHH
  毛发(洗发剂和调理剂耐受的)     78  GMPAMHWIHPFA
  毛发(洗发剂和调理剂耐受的)     79  HDHKNQKETHQRHAA
  毛发(洗发剂和调理剂耐受的)     80  HNHMQERYTDPQHSPSVNGL
  毛发(洗发剂和调理剂耐受的)     81  TAEIQSSKNPNPHPQRSWTN
  皮肤     53  TPFHSPENAPGS
  皮肤     54  FTQSLPR
  皮肤     55  KQATFPPNPTAY
  皮肤     56  HGHMVSTSQLSI
  皮肤     57  LSPSRMK
  皮肤(身体洗涤剂耐受的)     82  SVSVGMKPSPRP
  皮肤(身体洗涤剂耐受的)     83  TMGFTAPRFPHY
  皮肤(身体洗涤剂耐受的)     84  NLQHSVGTSPVW
  皮肤(身体洗涤剂耐受的)     85  QLSYHAYPQANHHAP
  皮肤(身体洗涤剂耐受的)     86  SGCHLVYDNGFCDH
  皮肤(身体洗涤剂耐受的)     87  ASCPSASHADPCAH
  皮肤(身体洗涤剂耐受的)     88  NLCDSARDSPRCKV
  皮肤(身体洗涤剂耐受的)     89  NHSNWKTAADFL
  皮肤(身体洗涤剂耐受的)     90  SDTISRLHVSMT
  皮肤(身体洗涤剂耐受的)     91  SPYPSWSTPAGR
  皮肤(身体洗涤剂耐受的)     92  DACSGNGHPNNCDR
  皮肤(身体洗涤剂耐受的)     93  DWCDTIIPGRTCHG
身体表面-结合肽可以与本发明的聚合物-结合肽结合使用而以各种方式增强基于颗粒的助剂的效果。如下所述，身体表面-结合肽可以添加至对聚合物具有亲和力的肽的组合物。或者，可以使用包括偶联至聚合物-结合肽的身体表面-结合肽的偶联物。偶联相互作用可以是共价键或非-共价相互作用，如氢键作用、静电相互作用、疏水作用或范德华相互作用。在非-共价相互作用的情况下，可通过将身体表面-结合肽与聚合物-结合肽以及任选的间隔物混合并且允许产生相互作用的充分的时间而制备基于-肽的偶联物。可利用本领域已知的方法，例如层析法从得到的基于肽的偶联物分离未结合的材料。
基于肽的偶联物也可以通过将特定的身体表面-结合肽(例如毛发或皮肤-结合肽)无论是直接或通过分子间隔物共价附着于聚合物-结合肽而制备，如Huang等在美国专利申请公开号No.2005/0050656中所述。任何合适的已知肽或蛋白质偶联化学过程可用于形成本发明的基于肽的偶联物。偶联化学过程为本领域所熟知(参见例如，Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，New York(1996))。合适的偶联剂包括但不限于，碳二亚胺偶联剂、酸性氯化物、异氰酸盐、环氧化物、马来酰亚胺和其他对肽末端胺和/或羧基以及巯基有反应性的功能性偶联试剂。另外，保护肽上反应性的胺或羧基以产生对基于肽的偶联物所需的结构是必要的。氨基酸保护基的使用，如t-丁基氧羰基(t-Boc)为本领域所熟知(参见例如Stewart等，上文；Bodanszky，上文；以及Pennington等，上文)。
通过分子间隔物偶联身体表面-结合肽至聚合物-结合肽也是合乎需要的。间隔物用来分离肽序列以确保其不干扰肽结合至身体表面或聚合物-涂布的助剂。分子间隔物可以是任何的各种分子，如烷基链、苯基化合物、乙二醇、酰胺、酯等等。优选的间隔物为亲水性的并且具有1至约1 00个原子，更优选2至约30个原子的链长。优选间隔物的实例包括，但不限于乙醇胺、乙二醇、具有6个碳原子链长的聚乙烯、具有3至6个重复单元的聚乙二醇、苯氧乙醇、丙醇酰胺、丁二醇(butyleneglycol)、丁二醇酰胺、丙基苯基链以及乙基、丙基、己基、甾醇、十六烷基和棕榈酰烷基链。分子间隔物可以利用上述任何偶联化学过程共价附着于肽。为了便于间隔物的掺入，可以使用双功能性的偶联剂，其包含间隔物以及用于偶联至肽两端的反应基团。合适的双功能偶联剂为本领域所熟知，并且包括但不限于二胺，如1，6-二胺己烷；二醛，如戊二醛；双N-羟基琥珀酰亚胺酯，如乙二醇-双(琥珀酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)、二琥珀酰亚胺基戊二酸酯、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯和乙二醇-双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)；二异氰酸酯，如己二异氰酸酯；双环氧乙烷(bis oxiranes)，如1，4二丁基缩水甘油醚；二碳酸，如琥珀酰双水杨酸酯等等。也可使用异双功能偶联剂，其在每个末端包含不同的反应基团。
另外，分子间隔物可以是包括任何氨基酸和其混合物的肽。优选的肽间隔物由脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸以及其混合物组成。肽间隔物可以为1至约50个氨基酸，优选1至约20个氨基酸长度。例证性的肽间隔物包括，但不限于SEQ NO：63-65和94-97。此外，肽间隔物可包含特定的酶切割位点，如Caspase 3位点，如SEQ ID NO：66，其允许微粒助剂从身体表面的酶促除去。这些肽间隔物可通过本领域已知的任何方法连接至结合肽序列。例如，完整的基于肽的偶联物可利用上述标准的肽合成方法制备。此外，结合肽和肽间隔物嵌段可利用碳二亚胺偶联剂(参见例如，Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，New York(1996))、二酰氯、二异氰酸酯和其他对肽末端胺和/或羧基起反应的双官能性偶联剂而组合。或者，完整的基于肽的偶联物可利用上述重组DNA和分子克隆技术制备。间隔物也可以是肽间隔物和有机间隔物分子的组合，其可以利用上述方法制备。
如Huang等所述(专利申请公开号No.2005/0050656)，将身体表面-结合肽的多拷贝和聚合物-结合肽偶联在一起以增强基于肽的偶联物和聚合物-涂布的助剂以及身体表面之间的相互作用也是需要的。可使用相同的身体表面-结合肽的多拷贝和聚合物-结合肽或者不同的身体表面-结合肽的组合和聚合物-结合肽。基于肽的偶联物的多拷贝可包括如上所述的各种间隔物。例证性的多拷贝身体表面-结合肽/聚合物-结合肽偶联物包括，但不限于多拷贝毛发-结合肽/聚合物结合肽偶联物，如SEQ IDNO：67-70。
本发明的一个实施方案中，基于肽的偶联物为包括身体表面．结合肽(BSBP)和聚合物-结合肽(PBP)的二嵌段组合物，具有通式结构[(BSBP)m-(PBP)n]x，其中n和m独立地为1至约10，优选1至约5，并且x可以是1至约10。
如上所述在另一实施方案中，基于肽的偶联物包括将身体表面-结合肽与聚合物-结合肽隔开的分子间隔物(S)。也可使用身体表面-结合肽的多拷贝和聚合物-结合肽，并且该身体表面-结合肽的多拷贝和聚合物-结合肽可以通过分子间隔物而自身以及相互隔开。该实施方案中，基于肽的偶联物为包括身体表面-结合肽、间隔物和聚合物-结合肽的三嵌段组合物，具有通式结构[(BSBP)m-Sq]x-[(PBP)n-Sr]z]y，其中m、n、x和z独立地为1至约10，y为1至约5，并且其中q和r各自独立地为0或1，条件是r和q不能都为0。
在另一实施方案中，身体表面-结合肽为毛发-结合肽并且该基于肽的偶联物为包括毛发-结合肽(HBP)和聚合物-结合肽(PBP)的二嵌段组合物，具有通式结构[(HBP)m-(PBP)n]x，其中n和m分别为1至约10，优选1至约5，并且x可以是1至约10。
在另一实施方案中，身体表面-结合肽为毛发-结合肽并且该基于肽的偶联物为包括毛发-结合肽(HBP)、间隔物(S)和聚合物-结合肽(PBP)的三嵌段组合物，具有通式结构[(HBP)m-Sq]x-[(PBP)n-Sr]z]y，其中m、n、x和z分别为1至约10，y为1至约5，并且其中q和r分别为0或1，条件是r和q不能都为0。
在另一实施方案中，身体表面-结合肽为皮肤-结合肽并且该基于肽的偶联物为包括皮肤-结合肽(SBP)和聚合物-结合肽(PBP)的二嵌段组合物，具有通式结构[(SBP)m-(PBP)n]x，其中n和m分别为1至约10，优选1至约5，并且x可以是1至约10。
在另一实施方案中，身体表面-结合肽为皮肤-结合肽并且该基于肽的偶联物为包括皮肤-结合肽(SBP)、间隔物(S)和聚合物-结合肽(PBP)的三嵌段组合物，具有通式结构[(SBP)m-Sq]x-[(PBP)n-Sr]z]y，其中m、n、x和z分别为1至约10，y为1至约5，并且其中q和r分别为0或1，条件是r和q不能都为0。
可理解的是如此处所用的BSBP、HBP、SBP和PBP为通称，并不意谓着分别指单个的身体表面-结合肽、毛发-结合肽、皮肤-结合肽或聚合物-结合肽序列。其中如上所用的m、n、x或z大于1，其中不同序列的一系列身体表面-结合肽(例如毛发或皮肤-结合肽)和不同序列的聚合物-结合肽可以组成组合物的一部分的情形也在本发明的范围内。此外，“S”也为通称并且并不意味着指单个间隔物。其中如上所用的q、x、r或z大于1，其中许多不同的间隔物可以组成组合物的一部分的情形也在本发明的范围内。另外，应该理解的是这些结构未必代表肽和任选的分子间隔物之间的共价键。如上所述，肽和任选的间隔物之间的偶联相互作用可以是共价或非-共价的。
包括聚合物-结合肽的组合物
对聚合物具有亲和力的肽可以各种组合物(如水溶液或个人护理组合物)施加至身体表面。例如，聚合物-结合肽可以包括聚合物-结合肽的水溶液施加至毛发。或者，聚合物-结合肽可以毛发护理组合物施加至毛发(如下所述)。两种情况下，聚合物-结合肽以相对于组合物的总重量按重量计约0.01％至约10％，优选约0.01％至约5％的浓度用于组合物中。合适的聚合物-结合肽如上所述。另外，不同聚合物-结合肽的混合物可用于组合物中。需要选择混合物中的肽使得肽之间没有降低有益效果的相互作用。合适的聚合物-结合肽混合物可通过本领域技术人员利用常规实验确定。如果聚合物-结合肽的混合物用于组合物，聚合物-结合肽的总浓度为相对于组合物总重量按重量计约0.01％至约10％。
在另一实施方案中，毛发-结合肽可以添加至包括聚合物-结合肽的组合物。组合物中毛发-结合肽的浓度为相对于组合物的总重量按重量计约0.01％至约10％，优选约0.01％至约5％。另外，可以使用不同毛发-结合肽的混合物。如果使用毛发-结合肽的混合物，组合物中毛发-结合肽的总浓度为相对于组合物总重量的约0.01％至约10％，优选约0.01％至约5％。
在另一实施方案中，聚合物-结合肽用于形成基于肽的偶联物，其中如上所述，聚合物-结合肽与毛发-结合肽偶联。
毛发护理组合物在此定义为用于毛发处理的组合物，包括但不限于，洗发剂、调理剂、漱口剂、洗液、气雾剂、凝胶剂、摩丝和染发剂。毛发护理组合物可包括用于毛发护理组合物的美容可接受的介质，其实例例如由Philippe等在美国专利号No.6,280,747中，Omura等在美国专利号No.6,139,851中以及Cannell等在美国专利号No.6,013,250中描述，所有的在此通过引用引入。例如，这些毛发护理组合物可以是水相的、醇的或水-醇溶液，醇优选为乙醇或异丙醇，对于水-醇溶液，其比例相对于总重量按重量计约1至约75％。另外，毛发护理组合物可以包含一种或多种常规化妆品或皮肤添加剂或佐剂，包括但不限于抗氧化剂、防腐剂、填料、表面活性剂、UVA和/或UVB防晒剂、香料、增稠剂、润湿剂和阴离子的、非离子的或两性聚合物以及染料或颜料。
同样，聚合物-结合肽可以包括聚合物-结合肽的水溶液施加至皮肤。或者，聚合物-结合肽可以皮肤护理组合物施加至皮肤(如下所述)。两种情况下，皮肤-结合肽以相对于组合物的总重量按重量计约0.01％至约10％，优选约0.01％至约5％的浓度用于组合物中。合适的聚合物-结合肽如上所述。另外，不同聚合物-结合肽的混合物可用于组合物中。需要选择混合物中的肽使得肽之间没有降低有益效果的相互作用。合适的聚合物-结合肽混合物可通过本领域技术人员利用常规实验确定。如果聚合物-结合肽的混合物用于组合物，聚合物-结合肽的总浓度为相对于组合物总重量按重量计约0.01％至约10％。
在另一实施方案中，皮肤-结合肽可以添加至包括聚合物-结合肽的组合物。组合物中皮肤-结合肽的浓度为相对于组合物的总重量约0.01％至约10％，优选约0.01％至约5％的重量比。另外，可以使用不同皮肤-结合肽的混合物。如果使用皮肤-结合肽的混合物，组合物中皮肤-结合肽的总浓度为相对于组合物总重量约0.01％至约10％，优选约0.01％至约5％。
在另一实施方案中，聚合物-结合肽用于形成基于肽的偶联物，其中如上所述，聚合物-结合肽与皮肤-结合肽偶联。
皮肤护理组合物在此定义为用于皮肤处理的组合物，包括但不限于皮肤护理、皮肤清洁、化妆、防晒和抗-皱产品。皮肤护理组合物可以包括用于皮肤护理组合物的美容可接受的介质，其实例例如由Philippe等在上文描述。例如，美容可接受的介质可以是无水组合物，其包含相对于组合物总重量按重量计通常约10至约90％比例的脂质，其中脂肪相包含至少一种液体、固体或半固体脂质。脂质包括但不限于，油、蜡、树胶以及所谓的膏状脂质。或者，组合物可以是稳定的分散体形式，如油包水或水包油乳剂。另外，组合物可以包含一种或多种常规化妆品或皮肤添加剂或佐剂，包括但不限于抗氧化剂、防腐剂、填料、表面活性剂、UVA和/或UVB防晒剂、香料、增稠剂、润湿剂和阴离子的、非离子的或两性聚合物以及染料或颜料。
将微粒助剂施加至身体表面的方法
根据本发明的方法，聚合物-结合肽可以用于增强常见微粒助剂例如颜料、微粒调理剂和无机防晒剂在身体表面上的持久性。用于本发明中时，如上所述，微粒助剂涂有聚合物。通常，涂有聚合物的微粒助剂在包括对聚合物具有亲和力的肽的组合物之前、之后或一起施加于身体表面一段时间，足以使得涂布的助剂结合至身体表面并且聚合物-结合肽结合至涂布在微粒助剂上的聚合物。施加微粒助剂至毛发或皮肤的各种方法在底下更详细地描述。
在一个实施方案中，涂有聚合物的微粒助剂施加至毛发。该涂布的助剂可以任何合适的溶液，如水溶液或常规的毛发护理组合物(例如着色组合物)施加至毛发。这些毛发护理组合物为本领域所熟知并且合适的组合物如上所述。涂有聚合物的微粒助剂在毛发上一段时间，其足以使得微粒助剂结合至毛发，通常在约5秒至约60分钟之间。任选地(optionally)，可以漂洗毛发以除去未结合至毛发的微粒助剂。随后，包括对聚合物涂层具有亲和力的肽的组合物施加至毛发一段时间，其足以使得聚合物-结合肽结合至聚合物涂层，优选在约5秒至约60分钟之间。包括聚合物-结合肽的组合物可以从毛发上漂洗或留于毛发上。
在另一实施方案中，包括对聚合物涂层具有亲和力的肽的组合物施加至毛发一段时间，其足以使得聚合物-结合肽结合至毛发，优选在约5秒至约60分钟之间。包括聚合物-结合肽的未结合的组合物可以从毛发上漂洗或留于毛发上。随后，涂有聚合物的微粒助剂施加至毛发一段时间，其足以使得微粒助剂结合至毛发，通常在约5秒至约60分钟之间。任选地，可以漂洗毛发以除去未结合至聚合物-结合肽的微粒助剂。
在另一实施方案中，涂有聚合物的微粒助剂和包括对聚合物具有亲和力的肽的组合物同时施加至毛发一段时间，其足以使得微粒助剂结合至毛发并且聚合物-结合肽结合至微粒助剂上的聚合物涂层，通常在约5秒至约60分钟之间。任选地，可以漂洗毛发以从毛发除去未结合的微粒助剂和包括聚合物-结合肽的组合物。
在另一实施方案中，提供涂有聚合物的微粒助剂作为包括对聚合物具有亲和力的肽的组合物的一部分。该实施方案中，包括微粒助剂和聚合物-结合肽的组合物施加至毛发一段时间，其足以使得微粒助剂结合至毛发并且聚合物-结合肽结合至微粒助剂上的聚合物涂层，通常在约5秒至约60分钟之间。包括微粒助剂和聚合物-结合肽的组合物可以从毛发上漂洗或留于毛发上。
在另一实施方案中，涂有聚合物的微粒助剂施加至皮肤。涂布的助剂可以任何合适的溶液，如水溶液或常规的皮肤护理组合物(例如皮肤着色剂、皮肤调理剂、防晒剂等等)施加至皮肤，其为本领域所熟知。涂有聚合物的微粒助剂在皮肤上一段时间，其足以使得微粒助剂结合至皮肤，通常在约5秒至约60分钟之间。任选地，可以漂洗皮肤以除去未结合至皮肤的微粒助剂。随后，包括对微粒助剂上的聚合物涂层具有亲和力的肽的组合物施加至皮肤一段时间，其足以使得聚合物-结合肽结合至聚合物涂层，优选在约5秒至约60分钟之间。包括聚合物-结合肽的未结合的组合物可以从毛发上漂洗或留于皮肤上。
在另一实施方案中，包括对聚合物涂层具有亲和力的肽的组合物施加至皮肤一段时间，其足以使得聚合物-结合肽结合至皮肤，优选在约5秒至约60分钟之间。包括聚合物-结合肽的未结合的组合物可以从毛发上漂洗或留于皮肤上。随后，涂有聚合物的微粒助剂施加至皮肤一段时间，其足以使得微粒助剂结合至皮肤，通常在约5秒至约60分钟之间。任选地，可以漂洗皮肤以除去未结合至聚合物-结合肽的微粒助剂。
在另一实施方案中，涂有聚合物的微粒助剂和包括对聚合物具有亲和力的肽的组合物同时施加至皮肤一段时间，其足以使得微粒助剂结合至皮肤并且聚合物-结合肽结合至微粒助剂上的聚合物涂层，通常在约5秒至约60分钟之间。任选地，可以漂洗皮肤以从皮肤除去未结合的微粒助剂和包括聚合物-结合肽的组合物。
在另一实施方案中，提供涂有聚合物的微粒助剂作为包括对聚合物具有亲和力的肽的组合物的一部分。该实施方案中，包括微粒助剂和聚合物。结合肽的组合物施加至皮肤一段时间，其足以使得微粒助剂结合至皮肤并且聚合物-结合肽结合至微粒助剂上的聚合物涂层，通常在约5秒至约60分钟之间。包括微粒助剂和聚合物-结合肽的组合物可以从毛发上漂洗或留于皮肤上。
如上所述任何方法中，包括对聚合物具有亲和力的肽的组合物可以在包括涂有聚合物的微粒助剂的组合物和包括对聚合物具有亲和力的肽的组合物施加之后任选地重新施加至身体表面以进一步增强助剂的持久性。
另外，如上所述的任何方法中，包括聚合密封剂的组合物可以在包括涂有聚合物的微粒助剂的组合物和包括对聚合物具有亲和力的肽的组合物施加之后任选地施加至身体表面以进一步增强助剂的持久性。包括聚合密封剂的组合物可以是水溶液或包括聚合密封剂的毛发护理或皮肤护理组合物。通常，该聚合密封剂以基于组合物总重量按重量计约0.25％至约10％的浓度存在于组合物中。聚合密封剂是个人护理产品领域所熟知的并且包括但不限于，聚(烯丙胺)、丙烯酸酯、丙烯酸酯聚合物、异丁烯酸、异丁烯酸共聚物、聚氨基甲酸酯、卡波姆、甲基硅氧烷、氨基二甲基硅氧烷、多肽、聚乙二醇(polyethylenene glycol)、蜂蜡、硅氧烷等等。聚合密封剂的选择取决于特定的微粒助剂以及所用的聚合物-结合肽。最佳的聚合密封剂可通过本领域技术人员利用常规实验很容易地确定。
个人护理组合物
本发明也提供包括涂有聚合物的微粒助剂的个人护理组合物和包括对聚合物具有亲和力的肽的组合物。个人护理组合物可以是任何施加至身体表面以提供化妆或预防效果的组合物，，例如如上所述的毛发护理和皮肤护理组合物。
实施例
本发明在下列实施例中进一步定义。应该理解的是这些实施例，虽然表示本发明的优选实施方案，但仅仅作为例证给出。从上述论述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的必要特征，并且在不背离其精神和范围时，可以进行本发明的各种改变和改进以使其适应各种用途和环境。
所用缩写的含义如下：“min”指分钟、“sec”指秒、“h”指小时、“μL”指微升、“mL”指毫升、“L”指升、“nm”指纳米、“mm”指毫米、“cm”指厘米、“μm”指微米、“mM”指毫摩尔浓度、“M”指摩尔浓度、“mmol”指毫摩尔、“μmole”指微摩尔、“g”指克、“μg”指微克、“mg”指毫克、“g”指重力常数、“rpm”指每分钟转数、“pfu”指菌斑形成单位、“BSA”指牛血清白蛋白、“ELISA”指酶联免疫吸附测定、“IPTG”指异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷、“A”指吸光度、“A450”指450nm波长测量的吸光度、“TBS”指Tris-缓冲盐水、“TBST-X”指含有Tween
Figure A20068003391900341
20的Tris-缓冲盐水，其中“X”是Tween20的重量百分数、“Xgal”指5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃乳糖苷、“SEM”指标准平均误差、“vol％”指体积百分比、“atm”指大气压、“kPa”指千帕、“SLPM”指标准升/分钟、“psi”指磅/平方英寸、“RCF”指相对离心场。
常规方法：
实施例中所用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知并且由Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，1989，由T.J.Silhavy，M.L.Bennan和L.W.Enquist，Experiments withgene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，N.Y，1984，以及由Ausubel，F.M.等，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Assoc和Wiley-Interscience，N.Y.，1987描述。
适于细菌培养物维持和培养的材料和方法也为本领域所熟知。适用于下列实施例的技术可在Manual of Methods forgeneral Bacteriology，Phillippgerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips，eds.，American Societyfor Microbiology，Washington，DC.，1994，或在Thomas D.Brock的Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA，1989中查找。
除非另作说明，用于细菌细胞生长与维持的所有试剂、限制性酶和材料获自Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)，BD DiagnosticSystems(Sparks，MD)，Life Technologies(Rockville，MD)或SigmaChemical Company(St.Louis，MO)。
噬菌体展示肽文库：
六个噬菌体展示肽文库用于下列实施例中。三个肽文库，Ph.D.TM-12Phage Display Peptide Library Kit(12-肽肽线性肽文库)，Ph.D.TM-7Phage Display Peptide Library Kit(7-肽肽线性肽文库)和Ph.D.TM-C7CPhage Display Peptide Library Kit(7-肽肽限制性肽文库)购自New England BioLabs(Beverly，MA)。这些试剂盒以融合至M13噬菌体的小外壳蛋白(pIII)的随机肽7或12-肽肽组合文库为基础。所有三个文库中的随机肽序列在小外壳蛋白pIII的N-末端表达，导致每一病毒颗粒产生所展示肽的5拷贝价位。Ph.D.-7和Ph.D.-12文库中，肽-pIII融合物的第一个残基为第一个随机位点，而Ph.D.-C7C文库中的第一个随机位点在Ala-Cys之前。所有文库在展示肽和pIII之间包含四个氨基酸的短的连接序列。Ph.D.-C7C文库的随机片段侧翼有一对半胱氨酸残基，其在噬菌体装配期间氧化为二硫键，导致展示肽作为环呈递至靶标。所有三个文库由大约3×109个序列组成。10μL的体积包含约每种肽序列的55个拷贝。
利用Kay等所述的方法(Combinatorial Chemistry & High ThroughputScreening，Vol.8，545-551(2005))制备三个其他的噬菌体展示肽文库，一个包含15-肽肽随机线性肽序列，另一个包含20-肽肽随机线性肽序列，第三个包含14-肽二硫化物强制随机肽序列，其在位点3和11具有半胱氨酸残基。该方法为Sidhu等(Methods in Enzymology 328：333-363(2000))所报道方法的改进，其中大肠杆菌菌株CJ236(dut-ung-)用于产生包含尿苷的单链噬粒DNA(U-ssDNA)。该DNA用作利用寡核苷酸合成第二-链的模板，不仅作为第二链的引物，而且插入编码随机氨基酸。第二链合成完成时，双链(dsDNA)转化入野生型菌株中。任何U-ssDNA被宿主细胞降解，因此仅留下重组链以产生噬菌体颗粒。该方法可用于产生M13包被蛋白的肽融合物或突变体。Kay等的方法利用基因III起始处的琥珀终止密码子。包含DNA序列随机延伸的寡核苷酸与单链噬菌体基因组退火，使得随机区域与终止密码子排成直线。单链DNA(ssDNA)酶切转变成共价闭合的环状dsDNA并且随后电穿孔入大肠杆菌的非-抑制菌株中。新合成的DNA链(负链)用作在宿主细胞中产生正链的模板，其用于病毒基因的转录/翻译并且包装进入病毒颗粒。
实施例1、利用生物淘筛(Biopanning)选择聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)- 结合肽
本实施例的目的为利用改进的噬菌体展示生物淘筛方法鉴定结合聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)的噬菌体肽。
Ph.D.TM-12Phage Display Peptide Library Kit和Ph.D.TM-7PhageDisplay Peptide Library Kit用于本实施例中。每种第一轮的实验利用制造商提供的原始文库进行以免将任何偏好引入得到的产物中。
对PMMA表面的生物淘筛：
所用的PMMA材料为1/8英寸(32mm)厚的，1/2英寸(12.7mm)直径的Lucite
Figure A20068003391900361
甲基丙烯酸甲酯聚合物层的盘(获自E.I.du Pont de Nemours和Co.，Wilmington，DE)以及斑点杂交装置(获自Schleicher & Schuell，Keene，NH)。下列方案用于生物淘筛PMMA盘。PMMA盘在室温下置于充满5mL 90％异丙醇的试管中30分钟，随后用去离子水洗涤5次，每次10分钟。随后，由包含0.5％Tween
Figure A20068003391900371
20的TBST中1mg/mL BSA组成的5mL封阻缓冲液添加至试管并且在4℃温育1h。
盘用TBST-0.5％洗涤5次并且随后包含1mg/mL BSA的2mLTBST-0.5％加至每个孔。随后，10μL原始的噬菌体文库(2×1011pfu)，无论是12-肽或7-肽肽文库，添加至盘并且在室温下温育15分钟。盘用TBST-0.5％洗涤10次。盘随后转入干净的试管，2mL由pH 2.2的0.2M甘氨酸-HCl中1mg/mL BSA组成的非特异性的洗脱缓冲液添加至试管并且温育10分钟。盘用洗脱缓冲液洗涤三次以上并且随后用TBST-0.5％洗涤三次。仍然附着耐酸噬菌体肽的盘用于直接感染宿主细胞大肠杆菌ER 2738(New England BioLabs，Beverly，MA)用于噬菌体扩增。盘与1∶100稀释在LB(Luria-Bertani)介质的过夜的大肠杆菌ER2738培养物在37℃温育4.5h。此后，细胞培养物离心30s并且80％以上(upper)上清转入新的试管，添加1/6体积的PEG/NaCl(20％聚乙二醇-800，获自SigmaChemical Co.St.Louis，MO，2.5M氯化钠)，并且噬菌体在4℃沉淀过夜。沉淀物通过在4℃10,000xg离心收集并且得到的沉淀团(pellet)重悬于1mL TBS中。该扩增的第一轮噬菌体原种然后根据如下所述的方法滴定效价。用于下一轮生物淘筛，使用第一轮的超过2×1011pfu的噬菌体原种。取决于实验，生物淘筛过程重复3至4轮。
最后一轮生物淘筛中酸洗步骤后，PMMA盘用于直接感染500μL对数中期的细菌宿主细胞，大肠杆菌ER2738，其随后在LB培养基中生长20分钟，并且随后与3mL顶层琼脂糖(agarose top)(具有5mM MgCl2和0.7％琼脂糖的LB培养基)在45℃混合。该混合物涂布于LB培养基/IPTG/S-GalTM平皿上(具有15g/L琼脂，0.05g/L IPTG和0.04g/LS-GalTM的LB培养基)并且在37℃温育过夜。计数黑色噬菌斑以计算噬菌体效价。随机挑选单个黑色噬菌斑用于DNA分离和序列分析。这些高亲和力，PMMA-结合噬菌体肽的氨基酸序列在表1中给出。
表1、来自7-和12-肽文库的高亲和力PMMA-结合噬菌体肽的氨基酸序列
    克隆ID     氨基酸序列    SEQ ID NO：
    A09     IPWWNIRAPLNA    1
    D09     TAVMNVVNNQLS    2
    A03     VPWWAPSKLSMQ    3
    A06     MVMAPHTPRARS    4
    B04     TYPNWAHLLSHY    5
    B09     TPWWRIT    6
    B01     DLTLPFH    7
    PB411     GTSIPAM    8
    P307     HHKHVVA    9
    P410     HHHKHFM    10
    P202     HHHRHQG    11
  PNM407     HHWHAPR    12
实施例2、PMMA-结合噬菌体肽克隆通过ELISA的表征
酶联免疫吸附测定(ELISA)用于与作为对照的皮肤-1噬菌体克隆TPFHSPENAPGS(如SEQ ID NO：53)一起评估实施例1中鉴定的所选择的噬菌体-肽克隆的PMMA-结合亲和力。
空的96-孔装置，来自Schleicher & Schuell，Inc.(Keene，NH)的Minifold I Dot-Blot System用作PMMA表面。对于检测的每个克隆，孔在室温下与由TBS中2％脱脂奶粉组成的200μL封阻缓冲液温育1h。封阻缓冲液通过倒置该系统并且用纸巾吸干而除去。孔用由TBST-0.5％组成的洗涤缓冲液漂洗6次。孔装满200μL包含1mg/mL BSA的TBST-0.5％并且随后每个孔添加10μL(超过1012个拷贝)的纯化的噬菌体原种。样品在37℃用缓慢振荡温育15分钟。未-结合的噬菌体通过用TBST-0.5％洗涤该孔10至20次而除去。随后，1∶500稀释于封阻缓冲液中的100μL辣根过氧化酶/抗-M13抗体偶联物(Amersham USA，Piscataway，NJ)添加至每个孔并且在室温下温育1h。除去偶联物溶液并且用TBST-0.05％洗涤孔6次。获自Pierce Biotechnology(Rockford，IL)的TMB底物(200μL)添加至每个孔并且在室温下显色5至30分钟，通常10分钟。随后，终止溶液(200μL 2M H2SO4)添加至每个孔并且溶液转入96-孔平皿，且利用微量培养板分光光度计(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)测定A450。得到的吸光度值，以至少三次重复的平均值记录，并且标准平均误差(SEM)在表2中给出。
表2、ELISA测定法的结果
    克隆ID    SEQ ID NO：   PMMA A450     SEM
    皮肤-1(对照)    53   0.127     0.057
    A09    1   2.227     0.020
    D09    2   2.037     0.057
    A03    3   0.762     0.081
    A06    4   2.09     0.115
    B04    5   2.095     0.065
    B09    6    2.261     0.016
    B01    7   2.112      0.060
结果表明所有检测的PMMA-结合噬菌体肽比对照皮肤-1肽对PMMA具有明显更高的结合亲和力。
实施例3、PMMA-结合肽的PMMA-结合亲和力的测定
本实施例的目的为测定PMMA-结合肽对PMMA表面的亲和力，利用ELISA测定法测量为MB50值。
PMMA-结合肽，A09由Synpep Inc.(Dublin，CA)合成。该肽通过在氨基酸结合序列的C-末端添加用于检测目的的生物素化的赖氨酸残基而生物素化并且酰胺化的(amidated)半胱氨酸添加至该序列的C-末端。检测的肽的氨基酸序列给定为SEQ ID NO：13。
PMMA-结合肽A09的MB 50 测量：
结合至PMMA的生物素化的肽A09(SEQ ID NO：13)的MB50测量利用实施例2中所述的96-孔装置完成。该96-孔用封阻缓冲液(来自Pierce Chemical Co.，Rockford，IL的SuperBlockTM)在室温下封阻1h，随后用TBST-0.5％在室温下洗涤六次，每次2分钟。不同浓度的生物素化结合肽添加至每个孔，在37℃温育15分钟，并且用TBST-0.5％在室温下洗涤六次，每次2分钟。随后，链亲和素-辣根过氧化酶(HRP)偶联物(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)添加至每个孔(每孔1.0μg)，并且在室温下温育1h。温育后，孔用TBST-0.5％在室温下洗涤六次，每次2分钟。最后，如实施例2中所述进行显色和吸光度测量。
结果利用GraphPad Prism 4.0(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)以A450对肽的浓度作图。MB50值计算自Scatchard曲线图并且在表3中显示。
四聚体PMMA-结合肽A09的MB 50 测量：
对于肽A09四聚体的MB50测量，PMMA表面和所有结合条件与所述相同。四聚体-A09肽复合物通过将链亲和素-HRP和生物素化的肽A09(SEQ ID NO：13)以1∶4的摩尔比混合而制备。所有封阻和洗涤步骤后，不同浓度的链亲和素/(A09)4复合物添加至每个孔，37℃温育15分钟，并且在室温下用TBST-0.5％洗涤六次，每次2分钟。随后，如实施例2中所述进行显色和吸光度测量。结果利用GraphPad Prism4.0(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)以A450对肽复合物的浓度作图。MB50值计算自Scatchard曲线图并且在表3中显示。
表3、选择的PMMA-结合肽的MB50值
    结合肽     检测的肽序列  底物     MB50，M
    A09     SEQ ID NO：13  PMMA     5.9×10-8
    链亲和素/(A09)4     (SEQ ID NO：13)4  PMMA     3.9×10-9
结果表明PMMA-结合肽A09和链亲和素/A09四聚体复合物对PMMA的结合亲和力较高。A09四聚体复合物中多拷贝结合肽的利用提高结合亲和力10倍以上。
实施例4、利用用含甲基丙烯酸的聚合分散剂分散的颜料与PMMA-结合 肽一起染发
本实施例的目的为显示利用用含甲基丙烯酸聚合分散剂的炭黑颜料与PMMA-结合肽一起染发。
炭黑分散体的制备：
炭黑分散体通过首先将下列组分充分混合而制备：(i)210.4重量份数的(重量份)去离子水，(ii)80.3重量份的41.5wt％(固相)阴离子聚合分散剂，和(iii)9.24重量份的二甲基胆胺。阴离子聚合物分散剂为根据美国专利申请公开号No.20030128246(0122至0125段落)中的“Preparationof Dispersant l”制备的接枝共聚合物66.3/-g-4.2/29.5 POEA(苯氧乙基丙烯酸酯)/-g-ETEGMA(乙氧基三乙烯异丁烯酸甘醇(ethoxytriethyleneglycolmethacrylate))/MAA(甲基丙烯酸)，其在此通过引用引入，其中调节单体的比例以获得66.3/4.2/29.5的重量百分数比例而不是该说明书中表明的61.6/5.8/32.6的重量百分数比例。逐步添加100重量份的炭黑(Nipex180IQ，Degussa)。掺入颜料后，混合100重量份的去离子水以形成研磨浆(millbase)，其通过用于研磨的介质碾磨机而循环。随后添加去离子水(55.4重量份)用于稀释至最终的强度。此黑色分散体(276g)与200g甘油、120g乙二醇、1.6g Proxel(Arch Chemicals Inc.，Cheshire，CT)、143.6g去离子水和2.5g
Figure A20068003391900411
485(Air Products，Allentown，PA)混合以形成黑色着色基质。需要的话，着色制剂的pH通过添加10％磷酸或10％氢氧化钠溶液而调节至7.0。通过此着色基质用水稀释而制备水相的炭黑原液以获得用于毛发持久性研究的1％至2％重量比的碳装料。
给定为SEQ ID NO：14的C-末端添加酰胺化半胱氨酸的A09PMMA-结合肽获自SynPep(Dublin，CA)。此肽(100mg)添加至10g 1％的炭黑分散体并且该溶液在室温下搅拌数小时。
染发：
获自International Hair Importers and Products(Bellerose，NY)的天然白发(2.60g)毛发样本置于3mm×100mm的试管中并且添加包含PMMA结合肽的7-8mL的炭黑分散体。利用磁性搅拌器搅拌该混合物30分钟以确保颜料分散体与毛发的良好接触。从试管移去毛发样本并且风干30分钟。
通过用去离子水漂洗毛发而检测毛发颜色的持久性。水漂洗期间毛发样本用手揉按。水漂洗后，毛发样本保留大部分黑色。
实施例5(对比)、无PMMA结合肽时利用含甲基丙烯酸的聚合分散剂分 散的颜料染发
本实施例的目的为评估在无PMMA-结合肽时利用炭黑颜料获得的毛发颜色的持久性并且与实施例4中获得的持久性相比较。
如实施例4中所述制备炭黑分散体，但并不添加PMMA结合肽。如实施例4中所述利用10g炭黑分散体和2.30g毛发样本进行染发和水漂洗。
水漂洗后，仅仅保留少量黑色。当与实施例4中获得的结果相比时，本结果表明炭黑颜料与PMMA结合肽一起使用时获得提高的持久性。
实施例6(对比)、利用含甲基丙烯酸的聚合分散剂分散的颜料与硅氧烷 密封剂一起染发
本实施例的目的为评估利用炭黑颜料与常规的硅氧烷密封剂一起获得的毛发颜色的持久性并且与实施例4中获得的持久性相比较。
如实施例4中所述制备炭黑分散体，但并不添加PMMA结合肽。一克十甲基环戊硅氧烷(Aldrich.Milwaukee，WI；产品编号No.44，427-8；CAS编号No.541-02-6)添加至9g炭黑分散体。如实施例4中所述利用此炭黑分散体和2.30g毛发样本进行染发和水漂洗。
水漂洗后，所有黑色被洗掉。当与实施例4中获得的结果相比时，本结果表明炭黑颜料与PMMA结合肽一起使用时相比颜料与常规的硅氧烷密封剂使用时获得提高的持久性。
实施例7、利用用含甲基丙烯酸的聚合分散剂分散的颜料与PMMA-结合 肽以及聚(烯丙胺)密封剂一起染发
本实施例的目的为证明通过利用聚(烯丙胺)作为聚合密封剂与炭黑颜料以及PMMA-结合肽一起时获得增强的毛发颜色持久性。
如实施例4中所述制备炭黑分散体并且与PMMA结合肽一起使用。如实施例4中所述利用2.66g毛发样本进行染发。毛发样本染色并且干燥30分钟后，该毛发样品浸于4wt％聚(烯丙胺)溶液中(通过用水稀释20wt％的聚(烯丙胺)水溶液而制备，获自Aldrich；产品编号No.479177；CAS编号No.30551-89-4)。毛发样本如实施例4所述马上漂洗并且随后用洗发剂处理(Pantene Pro-V Sheer Volume，Proctor & gamble，Cincinnati，OH)。洗发剂处理包括添加四分之一滴洗发剂至毛发，将洗发剂均匀散布至毛发并且积极揉按毛发30秒。随后，该毛发样本用去离子水漂洗以除去洗发剂。
水漂洗和洗发剂处理后，该毛发样本保持大约50％的黑色。强力洗发剂处理后保留颜色的结果表明作为密封剂的聚(烯丙胺)与炭黑颜料和PMMA结合肽一起使用提供了相比炭黑颜料和PMMA-结合肽单独使用时得到的增强的持久性。
实施例8-12、利用含甲基丙烯酸的聚合分散剂分散的颜料与PMMA-结 合肽一起染发
这些实施例的目的为表明利用用含甲基丙烯酸的聚合分散剂分散的炭黑颜料与PMMA-结合肽一起使用时获得增强的毛发颜色持久性并且将其与单独使用炭黑颜料得到的持久性相比较。另外，表明聚(烯丙胺)密封剂的应用提供了额外的增强。利用分光光度测量技术量化颜色保留值(rentention)。
如实施例4所述制备炭黑分散体。如实施例4所述在有和无PMMA-结合肽(SEQ ID NO：14)时进行染发。如实施例7所述检测聚(烯丙胺)密封剂的效果。
利用
Figure A20068003391900431
SP78TM球体分光光度计(X-Rite，Inc.，Grandville，MI)，通过将染色的毛发样品置于光传感器中并且计算代表光度计响应的L*、a*和b*参数而测量水漂洗(如实施例4所述进行)和洗发剂处理(如实施例7所述进行)后的颜色强度。测量未着色毛发作为初始基线L*值并且所有测量为三次独立测定的平均值。δE值利用以下方程式1计算：
δE＝((L* 1-L* 2)2+(a1-a2)2+(b1-b2)2)1/2(1)
其中L*＝光变量并且a*和b*为国际照明委员会(CIE)定义的CIELAB色彩空间的色度坐标(Minolta，Precise Color Communication-Color ControlFrom Feeling to Instrumentation，Minolta Camera Co.，1996)。越大的δE值表示越好的颜色保留值。结果概括于表4中。
表4
毛发颜色持久性检验的结果
    实施例     染色条件     处理     δE
     8     炭黑+PMMA-结合肽     水漂洗     30.7
    9，对比的     炭黑     水漂洗     2.5 8
    10     炭黑+PMMA-结合肽     洗发剂     7.28
    11     炭黑+PMMA-结合肽+聚(烯丙胺)密封剂     洗发剂     23.5
    12，对比的     炭黑     洗发剂     0.84
结果表明PMMA-结合肽与异丁烯酸-涂布的炭黑颜料一起使用相比炭黑单独使用(对比的实施例9和12)产生水漂洗(实施例8)和洗发剂处理(实施例10)后毛发颜色的保留值显著增强。另外，聚(烯丙胺)密封剂的使用进一步增强洗发剂处理后(实施例11)的颜色保留值。
实施例13、利用生物淘筛选择聚丙烯-结合肽
本实施例的目的为利用改进的噬菌体展示生物淘筛方法鉴定结合至聚丙烯(PP)的噬菌体肽。
利用实施例1中所述的生物淘筛方法鉴定聚丙烯-结合肽。用于该生物淘筛方法中的聚丙烯底物为聚丙烯网孔材料，具体为HerniaRepair/Reconstructive Surgery Prosthetics Patch(获自Davol Inc.，Cranston，RI，C.R.Bard Inc的子公司)。聚丙烯网孔切为1-cm见方并且用90％异丙醇在室温下预处理30分钟，随后在淘选过程之前用去离子水洗涤5次，每次10分钟。进行总共四轮生物淘筛并且高亲和力、聚丙烯-结合噬菌体肽的氨基酸序列在表5中给出。
表5、来自7-和12-肽肽文库的高亲和力PP-结合噬菌体肽的氨基酸序列
    氨基酸序列   SEQ ID NO：
    TSDIKSRSPHHR   15
    HTQNMRMYEPWF   16
    LPPGSLA   17
    MPAVMSSAQVPR   18
    NQSFLPLDFPFR   19
    SILSTMSPHGAT   20
    SMKYSHSTAPAL   21
实施例14、利用生物淘筛选择聚四氟乙烯-结合肽
本实施例的目的为利用改进的噬菌体展示生物淘筛方法鉴定结合至聚四氟乙烯(PTFE)的噬菌体肽。
利用实施例1中所述的生物淘筛方法鉴定聚四氟乙烯-结合肽。用于该生物淘筛方法中的聚四氟乙烯底物为ePTFE成膜物质(获自DavolInc.，Cranston，RI，C.R.Bard Inc的子公司)。聚四氟乙烯膜切为1-cm见方并且用90％异丙醇在室温下预处理30分钟，随后在淘选过程之前用去离子水洗涤5次，每次10分钟。进行总共四轮生物淘筛并且高亲和力的、PTFE-结合噬菌体肽的氨基酸序列在表6中给出。
表6、来自7-和12-肽文库的高亲和力PTFE-结合噬菌体肽的氨基酸序列
    氨基酸序列   SEQ ID NO：
    ESSYSWSPARLS   22
    GPLKLLHAWWQP   23
    NALTRPV   24
    SAPSSKN   25
    SVSVGMKPSPRP   26
    SYYSLPPIFHIP   27
    TFTPYSITHALL   28
    TMGFTAPRFPHY   29
    TNPFPPPPSSPA   30
实施例15、利用生物淘筛选择尼龙6，6-结合肽
本实施例的目的为利用改进的噬菌体展示生物淘筛方法鉴定结合至尼龙6，6的噬菌体肽。
利用实施例1中所述的生物淘筛方法鉴定尼龙6，6-结合肽。该生物淘筛方法中用作底物的尼龙6，6磁珠无添加剂并且利用本领域熟知的标准尼龙聚合方法制备(参见Kohan，M.I.，Nylon Plastics Handbook，Hansen/Gardner Publications，Inc.[1995]17-20 & 34-45页)。尼龙磁珠用90％异丙醇在室温下预处理30分钟，随后在生物淘筛过程之前用去离子水洗涤5次，每次10分钟。进行总共四轮生物淘筛并且高亲和力的、尼龙6，6-结合噬菌体肽的氨基酸序列在表7中给出。
表7、来自7-肽文库的高亲和力尼龙-结合噬菌体肽的氨基酸序列
    氨基酸序列   SEQ ID NO：
    KTPPTRP     31
    VINPNLD     32
    KVWIVST     33
    AEPVAML     34
    AELVAML     35
    HSLRLDW     36
实施例16、利用生物淘筛选择聚乙烯-结合肽
本实施例的目的为利用改进的噬菌体展示生物淘筛方法鉴定结合至聚乙烯(PE)的噬菌体肽。
利用实施例1中所述的生物淘筛方法鉴定聚乙烯-结合肽。极高分子量的聚乙烯胶带用作该生物淘筛方法中的底物。类似的胶带可以获自Davol，Inc，(Cranston，RI)。PE胶带切成1-cm见方并且用90％异丙醇在室温下预处理30分钟，随后在生物淘筛之前用去离子水洗涤5次，每次10分钟。进行总共四轮生物淘筛并且高亲和力的、PE-结合噬菌体肽的氨基酸序列在表8中给出。
表8、来自12-肽文库的高亲和力PE-结合噬菌体肽的氨基酸序列
    氨基酸序列   SEQ ID NO：
    HNKSSPLTAALP   37
    LPPWKHKTSGVA   38
    LPWWLRDSYLLP   39
    VPWWKHPPLPVP   40
    HHKQWHNHPHHA   41
    HIFSSWHQMWHR   42
    WPAWKTHPILRM   43
实施例17、利用生物淘筛选择聚苯乙烯-结合肽
本实施例的目的为利用改进的噬菌体展示生物淘筛方法鉴定结合至聚苯乙烯(PS)的噬菌体肽。
利用实施例1中所述的生物淘筛方法鉴定聚苯乙烯-结合肽。在针对可溶性I型胶原-涂布的96-孔聚苯乙烯平皿(Corning Inc.，Acton，MA)的生物淘筛实验期间发现聚苯乙烯(PS)-结合肽。该96-孔包被100ng/ml可溶性I型胶原(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)。进行总共四轮生物淘筛。鉴定三种高富集的噬菌体肽，其随后证实结合至PS孔而不是涂布的I型胶原。高亲和力的、PS-结合噬菌体肽的氨基酸序列在表9中给出。
表9、来自12-肽文库的高亲和力PS-结合噬菌体肽的氨基酸序列
    氨基酸序列   SEQ ID NO：
    TSTASPTMQSKIR   44
    KRNHWQRMHLSA   45
    SHATPPQGLGPQ   46
实施例18、三嵌段的基于肽的偶联物的生物学生产
本实施例的目的为利用重组DNA和分子克隆技术制备三嵌段的基于肽的偶联物。三嵌段的基于肽的偶联物由多个毛发-结合肽、肽间隔物和PMMA结合肽区段组成。该肽在大肠杆菌中作为包涵体表达。其他的氨基酸序列(即肽标签)融合至该三嵌段的基于肽的偶联物序列以促进包涵体形成。酸-不稳定的Asp-Pro(DP)序列置于肽标签和三嵌段的基于肽的偶联物序列之间以便于三嵌段肽从肽标签分离。
生产菌株的构建
该三嵌段的基于肽的偶联物序列在表10中给出。DNA序列设计成能利用大肠杆菌有利的密码子编码本肽序列并且避免序列重复和mRNA二级结构。基因DNA序列由DNA 2.0，Inc.(Menlo Park，CA)利用专用软件设计，其由Gustafsson等(Trends in Biotechnol.22(7)：346-355(2004))所述。编码氨基酸序列的序列后面为两个终止密码子和核酸内切酶AscI的识别位点。N-末端的GS氨基酸序列由核酸内切酶BamHI的识别位点编码(GGA/TCC)。该DNA序列由SEQ ID NO：71给出。
表10、三嵌段的基于肽的偶联物的肽序列和DNA编码序列
  肽偶联物   肽序列  DNA序列*   肽SEQ IDNO：   DNASEQ IDNO：
  HC77643   PG(间隔物)-IPWWNIRAPLNA(PMMA-结合肽)-GAG(间隔物)-IPWWNIRAPLNA(PMMA-结合肽)-GGSGPGSGG(间隔物)-NTSQLST(毛发-结合肽)-GGG(间隔物)-NTSQLST(毛发-结合肽)-GGPKK(间隔物)  GGATCCGACCCTGGTATCCCGTGGTGGAACATTCGCGCACCTCTGAATGCTGGTGCTGGTATTCCGTGGTGGAACATCCGTGCTCCTCTGAACGCGGGTGGCTCCGGTCCGGGCTCCGGTGGCAACACGAGCCAACTGAGCACCGGTGGTGGCAACACTTCCCAGCTGTCCACCGGCGGTCCGAAAAAGTAATAAGGCGCGCC   70   71
*肽偶联物的编码序列加下划线。
基因通过DNA 20，Inc装配自合成的寡核苷酸并且克隆入标准的质粒克隆载体。序列由DNA 2.0，Inc通过DNA测序验证。
用核酸内切酶限制性酶BamHI和AscI从克隆载体切除合成的基因并且利用标准的重组DNA方法连接入表达载体。载体pKSIC4-HC77623源自可购买的载体pDEST 17(Invitrogen，Carlsbad，CA)。其包括源自可购买的载体pET31b(Novagen，Madison，WI)的序列，其编码类固酮异构酶(KSI)片段。KSI片段作为融合伴侣包括在其中以促进肽的部分进入大肠杆菌的不溶性包涵体中。来自pET31b的KSI-编码序列利用标准的诱变方法修饰(QuickChange II，Stratagene，La Jolla，CA)以除了野生型KSI序列中存在的一个半胱氨酸密码子之外包括三个另外的半胱氨酸密码子。质粒pKSIC4-HC77623，图1中显示的SEQ ID NO：72，利用本领域技术人员熟知的标准重组DNA方法构建。
编码该三嵌段的基于肽的偶联物的DNA序列(表1)通过取代载体中BamHI和AscI位点之间的序列而插入pKSIC4-HC77623。包含肽编码序列和载体DNA的质粒DNA用核酸内切酶限制性酶BamHI和AscI消化，随后混合该肽-编码序列和载体DNA并且利用本领域技术人员熟知的标准DNA克隆方法通过噬菌体T4 DNA连接酶连接。其中三嵌段基于肽的偶联物的编码序列插入pKSIC4-HC77623中的正确构建体利用标准方法通过限制性分析鉴定并且通过DNA测序验证。
该构建体中，编码肽偶联物的序列用编码HC77623的取代。该序列有效(operably)连接至噬菌体T7基因10启动子并且与变体KSI伴侣融合而作为融合蛋白表达。
为了检验该基于肽的偶联物的表达，表达质粒转化入BL21-AI大肠杆菌菌株(Invitrogen，目录编号no.C6070-03)。为了产生重组的融合肽，用转化的细菌接种50mL LB-氨苄青霉素肉汤(10g/L细菌用胰化胨，5g/L细菌用酵母提取物，10g/L NaCl，100mg/L氨苄青霉素，pH 7.0)并且培养物在37℃振荡直至OD600达到0.6。通过添加0.5mL 20wt％L-阿拉伯糖至培养物而诱导表达并且继续振荡4h。细胞蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析证实融合肽的产生。
发酵：
如上所述的重组大肠杆菌菌株在6-L发酵罐中培养，其最初以一次配料模式运行，随后以分批补料模式运行。发酵液的组成在表11中给出。发酵液的pH为6.7。该发酵液通过高压灭菌器灭菌，其后添加下列灭菌的组分：盐酸硫胺(4.5mg/L)、葡萄糖(22.1g/L)、微量元素，参见表12(10mL/L)、氨苄青霉素(100mg/L)和接种物(种)(125mL)。pH视需要而利用氢氧化铵(20vol％)或磷酸(20vol％)调节。添加的组分通过高压灭菌或者过滤而灭菌。
表11、发酵液的组成
    组分     浓度
    KH2PO4     9g/L
    (NH4)2HPO4     4g/L
    MgSO4·7H2O     1.2g/L
    柠檬酸     1.7g/L
    酵母提取物     5.0g/L
    Mazu DF 204消泡剂     0.1mL/L
表12、微量元素
    组分     浓度，mg/l
    EDTA     840
    CoCl2·H2O     250
    MnCl2·4H2O     1500
    CuCl2·2H2O     150
    H3BO3     300
    Na2MoO4·2H2O     250
    Zn(CH3COO)2·H2O     1300
    柠檬酸铁     10000
发酵的操作条件概括在表13中。葡萄糖的初浓度为22.1g/L。当耗尽最初的剩余葡萄糖时，起动预安排的指数的葡萄糖进料以开始发酵运行的分批补料期。葡萄糖进料(参见表14和15)包含500g/L葡萄糖并且补充以5g/L酵母提取物。进料培养基的组分通过高压灭菌或者过滤而灭菌。假定0.25g/g的产量系数(生物量对葡萄糖)，目标是维持0.13h-1的特定生长率，并且保持发酵容器中的乙酸水平在极低值(即小于0.2g/L)。葡萄糖供料持续至运行结束。在选定的时间(即发酵期过去15h)用2g/LL-阿拉伯糖的丸剂起始诱导。投递至每升发酵液体培养基5g酵母提取物的丸剂在下列时间添加至发酵容器：诱导期前1h，在诱导期以及诱导期后1h。发酵运行在发酵期过去19.97h后以及诱导期后4.97h终止。
表13、发酵操作条件
  条件     最初的     最低的     最高的
  搅拌     220rpm     220rpm     1200rpm
  气流     3SLPM     3SLPM     30SLPM
  温度     37℃     37℃     37℃
  pH     67     6.7     6.7
  压力     0.500atm(50.7kPa)     0.500atm(50.7kPa)     0.500atm(50.7kPa)
  溶解的O2 *     20％     20％     20％
*级联搅拌器，随后气流。
表14、饲料培养基的组成
    组分     浓度
    MgSO4·7H2O     2.0g/L
    葡萄糖     500g/L
    氨苄青霉素     150mg/L
    (NH4)2HPO4     4g/L
    KH2PO4     9g/L
    酵母提取物     5.0g/L
    微量元素-饲料(表5)     10mL/L
表15、微量元素-饲料
    组分     浓度，mg/L
    EDTA     1300
    CoCl2·H2O     400
    MnCl2·4H2O     2350
    CuCl2·2H2O     250
    H3BO3     500
    Na2MoO4·2H2O     400
    Zn(CH3COO)2·H2O     1600
    柠檬酸铁     4000
肽的分离和纯化：
发酵运行完成后，全部发酵液体培养基在12,000psi(82,700kPa)三次通过APV model 2000 Gaulin型均质器。每次匀浆之前液体培养基冷却至5℃以下。均质化的液体培养基以700mL/min和12,000 RCF立即通过Westfalia WhisperFugeTM(Westfalia Separator Inc.，Northvale，NJ)组套的盘式离心机处理以从悬浮的细胞碎片和溶解的杂质分离包涵体。回收的糊状物以15g/L(按干物质计算)重悬浮于水中并且利用Na2CO3/NaOH缓冲液调节pH至8.0和10.0之间的值。选择pH以帮助从包涵体除去细胞碎片而不溶解包涵体蛋白。悬浮液在12,000psi(82,700kPa)一次通过APV 2000 Gaulin型均质器以提供严格的混合。均质化的高pH悬浮液以700mL/min和12,000 RCF立即通过WestfaliaWhisperFugeTM组套的盘式离心机以从悬浮的细胞碎片和溶解的杂质分离包涵体。回收的糊状物以15g/L(按干物质计算)重悬浮于纯水中。悬浮液在12,000psi(82,700kPa)一次通过APV 2000gaulin型均质器以提供严格的混合。均质化的悬浮液以700mL/min和12,000 RCF立即通过Westfalia WhisperFugeTM组套的盘式离心机处理以从残留的悬浮细胞碎片和NaOH分离洗涤的包涵体。
回收的糊状物以25g/L(按干物质计算)重悬浮于纯水中并且混合物的pH利用HCl调节至2.2。酸化的悬浮液加热至70℃5至14h以完成在不破坏靶标肽时，使从产物肽分离融合肽的DP位点断裂。生成的浆液利用NaOH调节至pH 5.1(注意：这里所用的pH可取决于回收的肽的溶解度而变化)并且随后冷却至5℃以及静止12h。混合物在9000 RCF离心30分钟并且收集上清。上清随后用0.45μm的膜过滤。对于一些低溶解度的肽，沉淀团可能需要多次洗涤以提高肽回收。
收集过滤产物并且在冷冻干燥之前通过2∶1系数的真空蒸发而浓缩。在220和278nm的分光光度法检测用于监测和追踪产物肽的洗脱。
实施例19和20、利用用含甲基丙烯酸的聚合分散剂分散的颜料与三嵌 段的基于肽的偶联物一起染发
这些实施例的目的为证明利用用含甲基丙烯酸的聚合分散剂分散的炭黑颜料与三嵌段的基于肽的偶联物一起获得的增强的毛发颜色持久性，以及将其与仅仅由炭黑颜料获得的持久性相比较。该肽偶联物包括多个毛发-结合肽、间隔物和PMMA-结合肽序列。
如实施例4所述制备炭黑分散体。使用在实施例18中描述并且给定为SEQ ID NO：70的三嵌段的基于肽的偶联物。肽偶联物(20mg)添加至1mL去离子水并且混合物在冰上时在超声波仪上分散1分钟。分散的肽偶联物添加至包含40mg炭黑分散体的20mL闪烁瓶，并且添加3mL去离子水以使终体积至约4mL。得到的炭黑分散体在冰上超声处理3分钟。
染发：
天然的白发毛发样本(大约1.00g)，其获自International HairImporters and Products(Bellerose，NY)，置于20mL闪烁管中并且添加包含肽偶联物的8mL炭黑分散体。混合物利用温箱振荡器在室温下以100rpm振荡30分钟以确保颜料分散体与毛发的良好接触。从管瓶移去毛发样本并且用去离子水漂洗。水漂洗后，毛发样本保留大部分为黑色。
利用不包含肽偶联物的炭黑分散体重复上述步骤。水漂洗后，如实施例8-12所述测量全部毛发样品的颜色强度。结果在表16中给出。
表16、水漂洗后的毛发颜色强度
    实施例     着色剂     δE
    19     具有肽偶联物的炭黑     30.2
    20，对比的     炭黑     2.81
表16中显示的结果表明包括多个毛发-结合肽、间隔物和PMMA-结合肽序列的肽偶联物与丙烯酸酯-涂布的炭黑颜料一起使用相比仅仅使用炭黑(对比实施例20)导致水漂洗后(实施例19)毛发颜色保留值的显著增强。
实施例21、利用生物淘筛选择洗发剂-耐受的聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA)-结合肽
本实施例的目的为利用改进的噬菌体展示生物淘筛方法鉴定结合至聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)并且对洗发剂洗涤耐受的噬菌体肽。PMMA底物与噬菌体文库接触后，得到的噬菌体肽-PMMA复合物用稀释的洗发剂洗涤。
生物淘筛实验中所用的PMMA材料为聚合树脂，Plexiglas VS100(约3mm直径磁珠)，来自Altuglas International，Arkema Inc.，Philadelphia，PA。下列方案用于生物淘筛PMMA磁珠。每组三个PMMA磁珠共三组分入三支试管，每支装满由包含0.5％20的TBST中1mg/mL BSA组成的1mL封阻缓冲液并且在4℃温育1h。磁珠用TBST-0.5％洗涤5次并且随后包含1mg/mL BSA的1mL TBST-0.5％加至每支试管。随后，10μL三个组合的(pooled)噬菌体文库的一个(每管2×1011pfu)添加至三支试管(即包含三个PMMA磁珠的每支试管一个文库)并且磁珠在37℃温育15分钟。三个组合的噬菌体文库由下列噬菌体肽文库(在常规方法章节中所述)1∶1的混合物组成：12-肽线性文库(Ph.D.TM-12Phage Display Peptide Library Kit)和7-肽线性文库(Ph.D.TM-7Phage Display Peptide Library Kit)、15-肽线性文库和20-肽线性文库和限制性7-肽文库(Ph.D.TM-C7CPhage Display Peptide LibraryKit)以及限制的14-肽文库。磁珠用TBST-0.5％洗涤10次。磁珠随后转入干净的试管，1mL由pH2.2的0.2M甘氨酸-HCl中1mg/mL BSA组成的非特异性洗脱缓冲液添加至每支试管并且试管温育10分钟。温育后，由1M Tris碱组成的pH 9.1的150μL中和缓冲液添加至每支试管。来自每支试管的磁珠的洗脱物用于感染宿主细胞大肠杆菌ER 2738(NewEngland BioLabs，Beverly，MA)用于噬菌体扩增。洗脱物与1∶100稀释于LB培养基的过夜的大肠杆菌ER2738培养物在37℃温育4.5h。此后，细胞培养物离心30s并且80％以上上清转入新的试管，添加1/6体积的PEG/NaCl(20％聚乙二醇-800，获自Sigma Chemical Co.St.Louis，MO，2.5M氯化钠)，并且噬菌体在4℃沉淀过夜。沉淀物通过在4℃ 10,000xg离心收集并且得到的沉淀团重悬于1mL TBS中。此为扩增原种的第一轮。
该扩增的第一轮噬菌体原种随后根据如下所述的方法滴定效价。对于第二轮生物淘筛，使用第一轮的超过2×1011pfu的噬菌体原种。重复如第一轮所述的生物淘筛过程。第三轮开始时，在噬菌体结合步骤(即形成噬菌体肽-PMMA复合物)后添加洗发剂洗涤步骤。特别地，由
Figure A20068003391900551
Replenishing洗发剂和TBS缓冲液1∶1的混合物组成的洗发剂溶液用于以1至2秒的涡流洗涤磁珠6次，随后用TBST-0.5％洗涤。磁珠随后转移至干净的试管，并且剩下的步骤与之前轮的那些相同。以第三轮所述的同样的方法进行第四或第五轮淘选。
最后一轮生物淘筛的洗脱步骤后，少量(1至2μL)来自每支试管的洗脱物用于感染200μL对数中期的细菌宿主细胞大肠杆菌ER2738，其随后在LB培养基中培养20分钟，且随后在45℃与3mL顶层琼脂糖混合(具有5mM MgCl2和0.7％琼脂糖的LB培养基)。该混合物涂布于LB培养基/IPTG/S-GalTM平皿上(具有15g/L琼脂，0.05g/L IPTG和0.04g/LS-GalTM的LB培养基)并且在37℃温育过夜。计数黑色噬菌斑以计算噬菌体效价。随机挑选单个黑色噬菌斑用于DNA分离和序列分析。此洗发剂耐受的、PMMA-结合噬菌体肽的氨基酸序列在表17中给出。
表17、来自组合的文库的洗发剂-耐受的PMMA-结合噬菌体肽的氨基酸序列
 克隆ID  氨基酸序列  SEQ ID NO：
 PMMA 1  APWHLSSQYSGT  98
 PMMA 2  GYCLRVDEPTVCSG  99
 PMMA 3  HIHPSDNFPHKNRTH  100
 PMMA 4  HTHHDTHKPWPTDDHRNSSV  101
 PMMA 5  PEDRPSRTNALHHNAHHHNA  102
 PMMA 6  TPHNHATTNHHAGKK  103
 PMMA 7  EMVKDSNQRNTRISS  104
 PMMA 8  HYSRYNPGPHPL  105
 PMMA 9  IDTFYMSTMSHS  106
 PMMA 10  PMKEATHPVPPHKHSETPTA  107
 PMMA 11  YQTSSPAKQSVG  108
 PMMA 12  HLPSYQITQTHAQYR  109
 PMMA 13  TTPKTTYHQSRAPVTAMSEV  110
 PMMA 14  DRIHHKSHHVTTNHF  111
 PMMA 15  WAPEKDYMQLMK  112
实施例22、洗发剂-耐受的PMMA-结合噬菌体克隆的结合亲和力的定量 表征
本实施例的目的为通过滴定量化噬菌体克隆的结合亲和力。展示特定肽的噬菌体克隆用于比较不同肽序列的结合特性。基于效价的测定法用于量化噬菌体结合。该测定法测量由一个PMMA磁珠表面保留的输出pfu(三个单独磁珠的平均值)。所有噬菌体克隆的输入量为1012pfu/磁珠/试管。需要强调的是该测定法测定表达肽的噬菌体颗粒的结合而不是分离的肽结合。
每支试管使用一个Plexiglas VS100磁珠，并且每支试管装满包含TBST-0.5％中1mg.mL BSA的封阻缓冲液且在4℃温育1h。每个磁珠用TBST-0.5％洗涤5次。试管随后装满1mL包含1mg/mL BSA的TBST-0.5％并且随后纯化的噬菌体克隆(1012pfu)添加至每支试管。如实施例21所述，磁珠样品在37℃温育15分钟并且随后用洗发剂溶液洗涤6次，随后用TBST-0.5％洗涤6次。每个磁珠转移至干净的试管并且添加由pH2.2的0.2M甘氨酸-HCl中1mg/mL BSA组成的100μL非特异性洗脱缓冲液。样品温育10分钟并且随后15μL中和缓冲液(1M Tris-HCl，pH9.2)添加至每支试管。从每支试管洗脱的噬菌体转入新的试管用于效价和序列分析。
为了滴度结合的噬菌体，洗脱的噬菌体用SM缓冲液稀释以制备101至108的10倍系列稀释物。每个稀释物的10μL等分与200μL对数中期的大肠杆菌ER2738(New England BioLabs)温育，并且在LB培养基中培养20分钟，随后在45℃与3mL顶层琼脂糖(具有5mM MgCl2和0.7％琼脂糖的LB培养基)混合。该混合物涂布于LB培养基/IPTG/Xgal平皿上(具有15g/L琼脂，0.05g/L IPTG和0.04g/Lxgal的LB培养基)并且在37℃温育过夜。计数蓝色噬菌斑以计算噬菌体滴度，其在表18中作为根据三个单独磁珠的三次测定平均值而给出。
表18、洗发剂-耐受的PMMA噬菌体克隆的效价
  克隆ID   SEQ ID NO：     噬菌体效价(pfu/磁珠)
  PMMA 1   98     8.0×103
  PMMA 2   99     9.1×103
  PMMA 3   100     1.7×104
  PMMA 4   101     3×105
  PMMA 5   102     1.6×104
  PMMA 6   103     9.6×103
  PMMA 7   104     6×103
  PMMA 8   105     2×103
  PMMA 9   106     5×105
  PMMA 10   107     4×103
表18中的结果表明噬菌体克隆以不同程度的亲和力结合至PMMA。SEQ ID NO：101和109具有最高的效价。
序列表
<110>E.I.du Pont de Nemours and Co.
<120>用于增强微粒助剂效果的方法
<130>CL3145
<160>112
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚甲基丙烯酸甲酯-结合肽
<400>1
Ile Pro Trp Trp Asn Ile Arg Ala Pro Leu Asn Ala
1               5                   10
<210>2
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚甲基丙烯酸甲酯-结合肽
<400>2
Thr Ala Val Met Asn Val Val Asn Asn Gln Leu Ser
1               5                   10
<210>3
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚甲基丙烯酸甲酯-结合肽
<400>3
Val Pro Trp Trp Ala Pro Ser Lys Leu Ser Met Gln
1               5                   10
<210>4
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚甲基丙烯酸甲酯-结合肽
<400>4
Met Val Met Ala Pro His Thr Pro Arg Ala Arg Ser
1               5                   10
<210>5
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚甲基丙烯酸甲酯-结合肽
<400>5
Thr Tyr Pro Asn Trp Ala His Leu Leu Ser His Tyr
1               5                   10
<210>6
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚甲基丙烯酸甲酯-结合肽
<400>6
Thr Pro Trp Trp Arg Ile Thr
1               5
<210>7
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚甲基丙烯酸甲酯-结合肽
<400>7
Asp Leu Thr Leu Pro Phe His
1               5
<210>8
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚甲基丙烯酸甲酯-结合肽
<400>8
Gly Thr Ser Ile Pro Ala Met
1               5
<210>9
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚甲基丙烯酸甲酯-结合肽
<400>9
His His Lys His Val Val Ala
1               5
<210>10
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚甲基丙烯酸甲酯-结合肽
<400>10
His His His Lys His Phe Met
1               5
<210>11
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚甲基丙烯酸甲酯-结合肽
<400>11
His His His Arg His Gln Gly
1               5
<210>12
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚甲基丙烯酸甲酯-结合肽
<400>12
His His Trp His Ala Pro Arg
1               5
<210>13
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>生物素化聚甲基丙烯酸甲酯-结合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>生物素化
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>酰胺化的
<400>13
Ile Pro Trp Trp Asn Ile Arg Ala Pro Leu Asn Ala Lys Cys
1               5                   10
<210>14
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>酰胺化的半胱氨酸末端的聚甲基丙烯酸甲酯-结合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13).(13)
<223>酰胺化的
<400>14
Ile Pro Trp Trp Asn Ile Arg Ala Pro Leu Asn Ala Cys
1               5                   10
<210>15
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚丙烯-结合肽
<400>15
Thr Ser Asp Ile Lys Ser Arg Ser Pro His His Arg
1               5                   10
<210>16
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚丙烯-结合肽
<400>16
His Thr Gln Asn Met Arg Met Tyr Glu Pro Trp Phe
1               5                   10
<210>17
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚丙烯-结合肽
<400>17
 Leu Pro Pro Gly Ser Leu Ala
 1               5
<210>18
<211>12
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚丙烯-结合肽
<400>18
Met Pro Ala Val Met Ser Ser Ala Gln Val Pro Arg
1               5                   10
<210>19
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚丙烯-结合肽
<400>19
Asn Gln Ser Phe Leu Pro Leu Asp Phe Pro Phe Arg
1               5                   10
<210>20
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚丙烯-结合肽
<400>20
Ser Ile Leu Ser Thr Met Ser Pro His Gly Ala Thr
1               5                   10
<210>21
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚丙烯-结合肽
<400>21
Ser Met Lys Tyr Ser His Ser Thr Ala Pro Ala Leu
1               5                   10
<210>22
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚四氟乙烯-结合肽
<400>22
Glu Ser Ser Tyr Ser Trp Ser Pro Ala Arg Leu Ser
1               5                   10
<210>23
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚四氟乙烯-结合肽
<400>23
Gly Pro Leu Lys Leu Leu His Ala Trp Trp Gln Pro
1               5                   10
<210>24
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚四氟乙烯-结合肽
<400>24
Asn Ala Leu Thr Arg Pro Val
1               5
<210>25
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚四氟乙烯-结合肽
<400>25
Ser Ala Pro Ser Ser Lys Asn
1               5
<210>26
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚四氟乙烯-结合肽
<400>26
Ser Val Ser Val Gly Met Lys Pro Ser Pro Arg Pro
1               5                   10
<210>27
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚四氟乙烯-结合肽
<400>27
Ser Tyr Tyr Ser Leu Pro Pro Ile Phe His Ile Pro
1               5                   10
<210>28
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚四氟乙烯-结合肽
<400>28
Thr Phe Thr Pro Tyr Ser Ile Thr His Ala Leu Leu
1               5                   10
<210>29
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚四氟乙烯-结合肽
<400>29
Thr Met Gly Phe Thr Ala Pro Arg Phe Pro His Tyr
1               5                   10
<210>30
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚四氟乙烯-结合肽
<400>30
Thr Asn Pro Phe Pro Pro Pro Pro Ser Ser Pro Ala
1               5                   10
<210>31
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>尼龙-结合肽
<400>31
Lys Thr Pro Pro Thr Arg Pro
1               5
<210>32
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>尼龙-结合肽
<400>32
Val Ile Asn Pro Asn Leu Asp
1               5
<210>33
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>尼龙-结合肽
<400>33
Lys Val Trp Ile Val Ser Thr
1               5
<210>34
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>尼龙-结合肽
<400>34
Ala Glu Pro Val Ala Met Leu
1               5
<210>35
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>尼龙-结合肽
<400>35
Ala Glu Leu Val Ala Met Leu
1               5
<210>36
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>尼龙-结合肽
<400>36
His Ser Leu Arg Leu Asp Trp
1               5
<210>37
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚乙烯-结合肽
<400>37
His Asn Lys Ser Ser Pro Leu Thr Ala Ala Leu Pro
1               5                   10
<210>38
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚乙烯-结合肽
<400>38
Leu Pro Pro Trp Lys His Lys Thr Ser Gly Val Ala
1               5                   10
<210>39
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚乙烯-结合肽
<400>39
Leu Pro Trp Trp Leu Arg Asp Ser Tyr Leu Leu Pro
1               5                   10
<210>40
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚乙烯-结合肽
<400>40
Val Pro Trp Trp Lys His Pro Pro Leu Pro Val Pro
1               5                   10
<210>41
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚乙烯-结合肽
<400>41
His His Lys Gln Trp His Asn His Pro His His Ala
1               5                   10
<210>42
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚乙烯-结合肽
<400>42
His Ile Phe Ser Ser Trp His Gln Met Trp His Arg
1               5                   10
<210>43
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚乙烯-结合肽
<400> 43
Trp Pro Ala Trp Lys Thr His Pro Ile Leu Arg Met
1               5                   10
<210>44
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚苯乙烯-结合肽
<400>44
Thr Ser Thr Ala Ser Pro Thr Met Gln Ser Lys Ile Arg
I               5                   10
<210>45
<400>45
000
<210>46
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚苯乙烯-结合肽
<400>46
Ser His Ala Thr Pro Pro Gln Gly Leu Gly Pro Gln
1               5                   10
<210>47
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发-结合肽
<400>47
Arg Thr Asn Ala Ala Asp His Pro Ala Ala Val Thr
1               5                   10
<210>48
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发-结合肽
<400>48
Thr Pro Pro Glu Leu Leu His Gly Asp Pro Arg Ser
1                   5               10
<210>49
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发-结合肽
<400>49
Asn Thr Ser Gln Leu Ser Thr
1               5
<210>50
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发-结合肽
<400>50
Asp Leu Thr Leu Pro Phe His
1               5
<210>51
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发-结合肽
<400>51
Thr His Ser Thr His Asn His Gly Ser Pro Arg His Thr Asn Ala Asp
1               5                   10                  15
Ala Gly Asn Pro
            20
<210>52
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发-结合肽
<400>52
Ser Thr Leu His Lys Tyr Lys Ser Gln Asp Pro Thr Pro His His
1               5                   10                  15
<210>53
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤-结合肽
<400>53
Thr Pro Phe His Ser Pro Glu Asn Ala Pro Gly Ser
1               5                   10
<210>54
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤-结合肽
<400>54
Phe Thr Gln Ser Leu Pro Arg
1               5
<210>55
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤-结合肽
<400>55
Lys Gln Ala Thr Phe Pro Pro Asn Pro Thr Ala Tyr
1               5                   10
<210>56
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤-结合肽
<400>56
His Gly His Met Val Ser Thr Ser Gln Leu Ser Ile
1               5                   10
<210>57
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤-结合肽
<400>57
Leu Ser Pro Ser Arg Met Lys
1               5
<210>58
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>凭经验产生的毛发和皮肤-结合肽
<400>58
Arg Leu Leu Arg Leu Leu Arg
1                 5
<210>59
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>凭经验产生的毛发和皮肤-结合肽
<400>59
Lys Arg Gly Arg His Lys Arg Pro Lys Arg His Lys
1               5                   10
<210>60
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>凭经验产生的毛发和皮肤-结合肽
<400>60
His Lys Pro Arg Gly Gly Arg Lys Lys Ala Leu His
1               5                   10
<210>61
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>凭经验产生的毛发和皮肤-结合肽
<400>61
Lys Pro Arg Pro Pro His Gly Lys Lys His Arg Pro Lys His Arg Pro
1               5                   10                  15
Lys Lys
<210>62
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>凭经验产生的毛发和皮肤-结合肽
<400>62
Arg Gly Arg Pro Lys Lys Gly His Gly Lys Arg Pro Gly His Arg Ala
1               5                   10                  15
Arg Lys
<210>63
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽间隔物
<400>63
Thr Ser Thr Ser Lys Ala Ser Thr Thr Thr Thr Ser Ser Lys Thr Thr
1               5               10                      15
Thr Thr Ser Ser Lys Thr Thr Thr Thr Thr Ser Lys Thr Ser Thr Thr
            20              25                      30
Ser Ser Ser Ser Thr
        35
<210>64
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽间隔物
<400>64
Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly
1               5                   10                  15
Gly Leu Gly Gly Gln Gly
            20
<210>65
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽间隔物
<400>65
Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln
1               5                   10
<210>66
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Caspase 3的切割位点.
<400>66
Leu Glu Ser Gly Asp Glu Val Asp
1                  5
<210>67
<211>63
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>多拷贝毛发-结合肽/聚合物结合肽偶联物
<400>67
Gly Ser Asp Pro Gly Ile Pro Trp Trp Asn Ile Arg Ala Pro Leu Asn
1               5                   10                  15
Ala Gly Ala Gly Ile Pro Trp Trp Asn Ile Arg Ala Pro Leu Asn Ala
            20                  25                  30
Gly Gly Ser Gly Pro Gly Ser Gly Gly Asn Thr Ser Gln Leu Ser Thr
        35                  40                  45
Gly Gly Gly Asn Thr Ser Gln Leu Ser Thr Gly Gly Pro Lys Lys
    50                  55                  60
<210>68
<211>51
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>多拷贝毛发-结合肽/聚合物结合肽偶联物
<400>68
Asp Pro Arg Thr Asn Ala Ala Asp His Pro Ala Ala Val Thr Gly Gly
1               5                   10                  15
Gly Cys Gly Gly Gly Ile Pro Trp Trp Asn Ile Arg Ala Pro Leu Asn
            20                  25                  30
Ala Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Pro Phe His Gly
        35                  40                  45
Gly Gly Cys
    50
<210>69
<211>49
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>多拷贝毛发-结合肽/聚合物结合肽偶联物
<400>69
Arg Thr Asn Ala Ala Asp His Pro Ala Ala Val Thr Gly Gly Gly Cys
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly Ile Pro Trp Trp Asn Ile Arg Ala Pro Leu Asn Ala Gly
            20                  25                  30
Gly Gly Cys Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Pro Phe His Gly Gly Gly
        35                  40                  45
Cys
<210>70
<211>71
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Triblock peptide-based conjugate
<400>70
Gly Ser Asp Cys Leu Glu Ala Val Ala Gly Glu Pro Gly Ile Pro Trp
1               5                   10                  15
Trp Asn Ile Arg Ala Pro Leu Asn Ala Gly Ala Gly Ile Pro Trp Trp
            20                  25                  30
Asn Ile Arg Ala Pro Leu Asn Ala Gly Gly Ser Gly Pro Gly Ser Gly
        35                  40                  45
Gly Asn Thr Ser Gln Leu Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Ser Gln Leu
    50                  55                  60
Ser Thr Gly Gly Pro Lys Lys
65                  70
<210>71
<211>203
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于制备基于肽的三嵌段偶联物的核苷酸序列
<400>71
ggatccgacc ctggtatccc gtggtggaac attcgcgcac ctctgaatgc tggtgctggt     60
attccgtggt ggaacatccg tgctcctctg aacgcgggtg gctccggtcc gggctccggt    120
ggcaacacga gccaactgag caccggtggt ggcaacactt cccagctgtc caccggcggt    180
ccgaaaaagt aataaggcgc gcc                                            203
<210>72
<211>5388
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pKSIC4-HC77623
<400>72
agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac ggtttccctc      60
tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacat atgcataccc cagaacacat     120
caccgccgtg gtacagcgct ttgtggctgc gctcaatgcc ggcgatctgg acggcatcgt     180
cgcgctgttt gccgatgacg ccacggtgga agagcccgtg ggttccgagc ccaggtccgg     240
tacggctgcg tgtcgtgagt tttacgccaa ctcgctcaaa ctgcctttgg cggtggagct     300
gacgcaggag tgccgcgcgg tcgccaacga agcggccttc gctttcaccg tcagcttcga     360
gtatcagggc cgcaagaccg tagttgcgcc ctgtgatcac tttcgcttca atggcgccgg     420
caaggtggtg agcatccgcg ccttgtttgg cgagaagaat attcacgcat gccagggatc     480
cgatccgact ccgccgacga atgtactgat gctggcaacc aaaggcggtg gtacgcattc     540
cacgcacaac catggcagcc cgcgccacac gaatgctgac gcaggcaatc cgggcggcgg     600
caccccacca accaatgtcc tgatgctggc tactaaaggc ggcggcacgc attctaccca     660
caaccatggt agcccgcgcc atactaatgc agatgccggc aacccgggcg gtggtacccc     720
gccaaccaac gttctgatgc tggcgacgaa aggtggcggt acccattcca cgcataatca     780
tggcagccct cgccacacca acgctgatgc tggtaatcct ggtggcggta agaagaaata     840
ataaggcgcg ccgacccagc tttcttgtac aaagtggttg attcgaggct gctaacaaag     900
cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg     960
gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggatatc    1020
cacaggacgg gtgtggtcgc catgatcgcg tagtcgatag tggctccaag tagcgaagcg    1080
agcaggactg ggcggcggcc aaagcggtcg gacagtgctc cgagaacggg tgcgcataga    1140
aattgcatca acgcatatag cgctagcagc acgccatagt gactggcgat gctgtcggaa    1200
tggacgatat cccgcaagag gcccggcagt accggcataa ccaagcctat gcctacagca    1260
tccagggtga cggtgccgag gatgacgatg agcgcattgt tagatttcat acacggtgcc    1320
tgactgcgtt agcaatttaa ctgtgataaa ctaccgcatt aaagcttatc gatgataagc    1380
tgtcaaacat gagaattctt gaagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt    1440
taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg    1500
cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca    1560
ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt    1620
ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga    1680
aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga    1740
actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat    1800
gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtgttg acgccgggca    1860
agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt    1920
cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac    1980
catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct    2040
aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga    2100
gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgcag caatggcaac    2160
aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat    2220
agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg    2280
ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc    2340
actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc    2400
aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg    2460
gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta    2520
atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg    2580
tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga    2640
tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt    2700
ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag    2760
agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa    2820
ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag    2880
tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca    2940
gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac    3000
cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa    3060
ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc    3120
agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg    3180
tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc    3240
ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc    3300
ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag    3360
ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc tgatgcggta    3420
ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tatggtgcac tctcagtaca    3480
atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg    3540
tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc    3600
tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt    3660
tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca gcgtggtcgt    3720
gaagcgattc acagatgtct gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa    3780
gcgttaatgt ctggcttctg ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt tcctgtttgg    3840
tcactgatgc ctccgtgtaa gggggatttc tgttcatggg ggtaatgata ccgatgaaac    3900
gagagaggat gctcacgata cgggttactg atgatgaaca tgcccggtta ctggaacgtt    3960
gtgagggtaa acaactggcg gtatggatgc ggcgggacca gagaaaaatc actcagggtc    4020
aatgccagcg cttcgttaat acagatgtag gtgttccaca gggtagccag cagcatcctg    4080
cgatgcagat ccggaacata atggtgcagg gcgctgactt ccgcgtttcc agactttacg    4140
aaacacggaa accgaagacc attcatgttg ttgctcaggt cgcagacgtt ttgcagcagc    4200
agtcgcttca cgttcgctcg cgtatcggtg attcattctg ctaaccagta aggcaacccc    4260
gccagcctag ccgggtcctc aacgacagga gcacgatcat gcgcacccgt ggccaggacc    4320
caacgctgcc cgagatgcgc cgcgtgcggc tgctggagat ggcggacgcg atggatatgt    4380
tctgccaagg gttggtttgc gcattcacag ttctccgcaa gaattgattg gctccaattc    4440
ttggagtggt gaatccgtta gcgaggtgcc gccggcttcc attcaggtcg aggtggcccg    4500
gctccatgca ccgcgacgca acgcggggag gcagacaagg tatagggcgg cgcctacaat    4560
ccatgccaac ccgttccatg tgctcgccga ggcggcataa atcgccgtga cgatcagcgg    4620
tccagtgatc gaagttaggc tggtaagagc cgcgagcgat ccttgaagct gtccctgatg    4680
gtcgtcatct acctgcctgg acagcatggc ctgcaacgcg ggcatcccga tgccgccgga    4740
agcgagaaga atcataatgg ggaaggccat ccagcctcgc gtcgcgaacg ccagcaagac    4800
gtagcccagc gcgtcggccg ccatgccggc gataatggcc tgcttctcgc cgaaacgttt    4860
ggtggcggga ccagtgacga aggcttgagc gagggcgtgc aagattccga ataccgcaag    4920
cgacaggccg atcatcgtcg cgctccagcg aaagcggtcc tcgccgaaaa tgacccagag    4980
cgctgccggc acctgtccta cgagttgcat gataaagaag acagtcataa gtgcggcgac    5040
gatagtcatg ccccgcgccc accggaagga gctgactggg ttgaaggctc tcaagggcat    5100
cggtcgatcg acgctctccc ttatgcgact cctgcattag gaagcagccc agtagtaggt  5160
tgaggccgtt gagcaccgcc gccgcaagga atggtgcatg caaggagatg gcgcccaaca  5220
gtcccccggc cacggggcct gccaccatac ccacgccgaa acaagcgctc atgagcccga  5280
agtggcgagc ccgatcttcc ccatcggtga tgtcggcgat ataggcgcca gcaaccgcac  5340
ctgtggcgcc ggtgatgccg gccacgatgc gtccggcgta gaggatcg               5388
<210>73
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发-结合肽
<400>73
Glu Gln Ile Ser Gly Ser Leu Val Ala Ala Pro Trp
1               5                   10
<210>74
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发-结合肽
<400>74
Thr Asp MetGln Ala Pro Thr Lys Ser Tyr Ser Asn
1              5                   10
<210>75
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发-结合肽
<400>75
Leu Asp Thr Ser Phe Pro Pro Val Pro Phe His Ala
1               5                   10
<210>76
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发-结合肽
<400>76
Thr Pro Pro Thr Asn Val Leu Met Leu Ala Thr Lys
1               5                   10
<210>77
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发-结合肽
<400>77
Ser Thr Leu His Lys Tyr Lys Ser Gln Asp Pro Thr Pro His His
1               5                   10                  15
<210>78
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发-结合肽
<400>78
Gly Met Pro Ala Met His Trp Ile His Pro Phe Ala
1               5                   10
<210>79
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发-结合肽
<400>79
His Asp His Lys Asn Gln Lys Glu Thr His Gln Arg His Ala Ala
1               5                   10                  15
<210>80
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发-结合肽
<400>80
His Asn His Met Gln Glu Arg Tyr Thr Asp Pro Gln His Ser Pro Ser
1               5                   10                  15
Val Asn Gly Leu
            20
<210>81
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毛发-结合肽
<400>81
Thr Ala Glu Ile Gln Ser Ser Lys Asn Pro Asn Pro His Pro Gln Arg
1               5                   10                  15
Ser Trp Thr Asn
            20
<210>82
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤-结合肽
<400>82
Ser Val Ser Val Gly Met Lys Pro Ser Pro Arg Pro
1               5                   10
<210>83
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤-结合肽
<400>83
Thr Met Gly Phe Thr Ala Pro Arg Phe Pro His Tyr
1               5                   10
<210>84
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤-结合肽
<400>84
Asn Leu Gln His Ser Val Gly Thr Ser Pro Val Trp
1               5                   10
<210>85
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤-结合肽
<400>85
Gln Leu Ser Tyr His Ala Tyr Pro Gln Ala Asn His His Ala Pro
1               5                   10                  15
<210>86
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤-结合肽
<400>86
Ser Gly Cys His Leu Val Tyr Asp Asn Gly Phe Cys Asp His
1               5                   10
<210>87
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤-结合肽
<400>87
Ala Ser Cys Pro Ser Ala Ser His Ala Asp Pro Cys Ala His
1               5                   10
<210>88
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤-结合肽
<400>88
Asn Leu Cys Asp Ser Ala Arg Asp Ser Pro Arg Cys Lys Val
1               5                   10
<210>89
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤-结合肽
<400>89
Asn His Ser Asn Trp Lys Thr Ala Ala Asp Phe Leu
1               5                   10
<210>90
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤-结合肽
<400>90
Ser Asp Thr Ile Ser Arg Leu His Val Ser Met Thr
1               5                   10
<210>91
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤-结合肽
<400>91
Ser Pro Tyr Pro Ser Trp Ser Thr Pro Ala Gly Arg
1               5                   10
<210>92
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤-结合肽
<400>92
Asp Ala Cys Ser Gly Asn G1y His Pro Asn Asn Cys Asp Arg
1               5                   10
<210>93
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤-结合肽
<400>93
Asp Trp Cys Asp Thr Ile Ile Pro Gly Arg Thr Cys His Gly
1               5                   10
<210>94
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽间隔物
<400>94
Gly Ala Gly
1
<210>95
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽间隔物
<400>95
Gly Gly Ser Gly Pro Gly Ser Gly Gly
1               5
<210>96
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽间隔物
<400>96
Gly Gly Gly
1
<210>97
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽间隔物
<400>97
Gly Gly Pro Lys Lys
1               5
<210>98
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>洗发剂-耐受的PMAA-结合肽
<400>98
Ala Pro Trp His Leu Ser Ser Gln Tyr Ser Gly Thr
1               5                   10
<210>99
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>洗发剂-耐受的PMAA-结合肽
<400>99
Gly Tyr Cys Leu Arg Val Asp Glu Pro Thr Val Cys Ser Gly
1               5                   10
<210>100
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>洗发剂-耐受的PMAA-结合肽
<400>100
His Ile His Pro Ser Asp Asn Phe Pro His Lys Asn Arg Thr His
1               5                   10                  15
<210>101
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>洗发剂-耐受的PMAA-结合肽
<400>101
His Thr His His Asp Thr His Lys Pro Trp Pro Thr Asp Asp His Arg
1               5                   10                  15
Asn Ser Ser Val
            20
<210>102
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>洗发剂-耐受的PMAA-结合肽
<400>102
Pro Glu Asp Arg Pro Ser Arg Thr Asn Ala Leu His His Asn Ala His
1            5             10            15
His His Asn Ala
            20
<210>103
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>洗发剂-耐受的PMAA-结合肽
<400>103
Thr Pro His Asn His Ala Thr Thr Asn His His Ala Gly Lys Lys
1               5                   10                  15
<210>104
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>洗发剂-耐受的PMAA-结合肽
<400>104
Glu Met Val Lys Asp Ser Asn Gln Arg Asn Thr Arg Ile Ser Ser
1               5                   10                  15
<210>105
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>洗发剂-耐受的PMAA-结合肽
<400>105
His Tyr Ser Arg Tyr Asn Pro Gly Pro His Pro Leu
1               5                   10
<210>106
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>洗发剂-耐受的PMAA-结合肽
<400>106
Ile Asp Thr Phe Tyr Met Ser Thr Met Ser His Ser
1               5                   10
<210>107
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>洗发剂-耐受的PMAA-结合肽
<400>107
Pro Met Lys Glu Ala Thr His Pro Val Pro Pro His Lys His Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Pro Thr Ala
            20
<210>108
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>洗发剂-耐受的PMAA-结合肽
<400>108
Tyr Gln Thr Ser Ser Pro Ala Lys Gln Ser Val Gly
1               5                   10
<210>109
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>洗发剂-耐受的PMAA-结合肽
<400>109
His Leu Pro Ser Tyr Gln Ile Thr Gln Thr His Ala Gln Tyr Arg
1               5                   10                  15
<210>110
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>洗发剂-耐受的PMAA-结合肽
<400>110
Thr Thr Pro Lys Thr Thr Tyr His Gln Ser Arg Ala Pro Val Thr Ala
1               5                   10                  15
Met Ser Glu Val
            20
<210>111
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>洗发剂-耐受的PMAA-结合肽
<400>111
Asp Arg Ile His His Lys Ser His His Val Thr Thr Asn His Phe
1               5                   10                  15
<210>112
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>洗发剂-耐受的PMAA-结合肽
<400>112
Trp Ala Pro Glu Lys Asp Tyr Met Gln Leu Met Lys
1               5                   10

Claims (65)

1. 将微粒助剂施加至身体表面的方法，包括：
a)提供涂有聚合物的微粒助剂；
b)提供包括对该聚合物具有亲和力的肽的组合物；和
c)将(a)的涂布的微粒助剂与(b)的组合物施加至身体表面一段时间，其足以使得该涂布的助剂结合至该身体表面。
2. 权利要求1所述的方法，其中身体表面选自毛发和皮肤。
3. 权利要求1所述的方法，其中微粒助剂由选自有机颜料、无机颜料、金属氧化物、金属纳米颗粒、半导体纳米颗粒、有机纳米颗粒、无机纳米颗粒和聚合物纳米颗粒的材料组成。
4. 权利要求3所述的方法，其中该微粒助剂由选自D&C Red No.36、D&C Red No.30、D&C Orange No.17、Green 3Lake、Ext.Yellow 7Lake、Orange 4Lake、Red 28Lake；D&C Red No.7、11、31和34的钙沉淀色料、D&C Red No.12的钡沉淀色料、D&C Red No.13的锶沉淀色料、FD&C Yellow No.5的铝沉淀色料、FD&C Yellow No.6的铝沉淀色料、FD&C No.40的铝沉淀色料、D&C Red No.21、22、27和28的铝沉淀色料、FD&C Blue No.1的铝沉淀色料、D&C Orange No.5的铝沉淀色料、D&C Yellow No.10的铝沉淀色料；D&C Red No.33的锆沉淀色料；Cromophthal
Figure A2006800339190002C1
Yellow、SunfastMagenta、Sunfast
Figure A2006800339190002C3
Blue、铁氧化物、碳酸钙、氢氧化铝、硫酸钙、高岭土、亚铁氰化铁铵、碳酸镁、胭脂红、硫酸钡、云母石、氯氧化铋、硬脂酸锌、锰紫、氧化铬、二氧化钛、黑色二氧化钛、二氧化钛纳米颗粒、氧化锌、氧化钡、群青、柠檬酸铋、羟基磷灰石、硅酸锆和炭黑颗粒的材料组成。
5. 权利要求1所述的方法，其中聚合物选自聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚氨基甲酸酯、多肽、木质素、多糖、聚酰胺、聚酰亚胺、聚芳酰胺和包括来自甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯或苯乙烯的至少一种单体的共聚物。
6. 权利要求1所述的方法，其中对聚合物具有亲和力的肽选自SEQID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、46、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和112。
7. 权利要求1所述的方法，其中身体表面为毛发并且其中毛发-结合肽任选地添加至步骤(b)的组合物，该组合物包括对该聚合物具有亲和力的肽。
8. 权利要求1所述的方法，其中身体表面为皮肤并且其中皮肤-结合肽任选地添加至步骤(b)的组合物，该组合物包括对该聚合物具有亲和力的肽。
9. 权利要求1所述的方法，其中对该聚合物具有亲和力的肽任选地偶联至对该身体表面具有亲和力的肽。
10. 权利要求9所述的方法，其中对该身体表面具有亲和力的肽用分子间隔物偶联至对该聚合物具有亲和力的肽。
11. 权利要求9所述的方法，其中对该身体表面具有亲和力的肽为毛发-结合肽。
12. 权利要求9所述的方法，其中对该身体表面具有亲和力的肽为皮肤-结合肽。
13. 权利要求7或11所述的方法，其中毛发-结合肽通过选自噬菌体展示、酵母展示、细菌展示和组合的固相肽合成的方法组合地产生。
14. 权利要求8或12所述的方法，其中皮肤-结合肽通过选自噬菌体展示、酵母展示、细菌展示和组合的固相肽合成的方法组合地产生。
15. 权利要求7或11所述的方法，其中该毛发-结合肽凭经验产生。
16. 权利要求8或12所述的方法，其中该皮肤-结合肽凭经验产生。
17. 权利要求15所述的方法，其中凭经验产生的毛发-结合肽包括对毛发具有亲和力的带正电荷的氨基酸。
18. 权利要求16所述的方法，其中凭经验产生的皮肤-结合肽包括对皮肤具有亲和力的带正电荷的氨基酸。
19. 权利要求7或11所述的方法，其中该毛发-结合肽选自SEQ IDNO：47、48、49、50、51、52、58、59、60、61、62、73、74、75、76、77、78、79、80和81。
20. 权利要求8或12所述的方法，其中该皮肤-结合肽选自SEQ IDNO：53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92和93。
21. 权利要求1所述的方法，其中该涂有聚合物的微粒助剂以及包括对该聚合物具有亲和力的肽的组合物同时施加至身体表面。
22. 权利要求1所述的方法，其中该涂有聚合物的微粒助剂在包括对该聚合物具有亲和力的肽的组合物施加之前施加至身体表面。
23. 权利要求1所述的方法，其中该包括对聚合物具有亲和力的肽的组合物在该涂有聚合物的微粒助剂施加之前施加至身体表面。
24. 权利要求1所述的方法，其中对聚合物具有亲和力的肽通过选自噬菌体展示、酵母展示、细菌展示和组合的固相肽合成的方法组合地产生。
25. 权利要求1所述的方法，进一步包括步骤：
d)将包括对聚合物具有亲和力的肽的组合物再施加至身体表面。
26. 权利要求1所述的方法，进一步包括步骤：
d)将包括聚合密封剂的组合物施加至该身体表面。
27. 权利要求26所述的方法，其中该聚合密封剂选自聚(烯丙胺)、丙烯酸酯、丙烯酸酯共聚物、异丁烯酸、异丁烯酸共聚物、聚氨基甲酸酯、卡波姆、甲基硅氧烷、多肽、氨基二甲基硅氧烷、聚乙二醇、蜂蜡和硅氧烷。
28. 个人护理组合物，包括：
a)涂有聚合物的微粒助剂；和
b)包括对该聚合物具有亲和力的肽的组合物。
29. 权利要求28所述的个人护理组合物，其中该微粒助剂由选自有机颜料、无机颜料、金属氧化物、金属纳米颗粒、半导体纳米颗粒、有机纳米颗粒、无机纳米颗粒和聚合物纳米颗粒的材料组成。
30. 权利要求28所述的个人护理组合物，其中该微粒助剂由选自D&C Red No.36、D&C Red No.30、D&C Orange No.17、Green 3Lake、Ext.Yellow 7Lake、Orange 4Lake、Red 28Lake；D&C Red No.7、11、31和34的钙沉淀色料、D&C Red No.12的钡沉淀色料、D&C Red No.13的锶沉淀色料、FD&C Yellow No.5的铝沉淀色料、FD&C Yellow No.6的铝沉淀色料、FD&C No.40的铝沉淀色料、D&C Red No.21、22、27和28的铝沉淀色料、FD&C Blue No.1的铝沉淀色料、D&C Orange No.5的铝沉淀色料、D&C Yellow No.10的铝沉淀色料、D&C Red No.33的锆沉淀色料；Cromophthal
Figure A2006800339190004C1
Yellow、Sunfast
Figure A2006800339190004C2
Magenta、SunfastBlue、铁氧化物、碳酸钙、氢氧化铝、硫酸钙、高岭土、亚铁氰化铁铵、碳酸镁、胭脂红、硫酸钡、云母石、氯氧化铋、硬脂酸锌、锰紫、氧化铬、二氧化钛、黑色二氧化钛、二氧化钛纳米颗粒、氧化锌、氧化钡、群青、柠檬酸铋、羟基磷灰石、硅酸锆和炭黑颗粒的材料组成。
31. 权利要求28所述的个人护理组合物，其中该聚合物选自聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚甲基甲丙烯酰胺酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚氨基甲酸酯、多肽、木质素、多糖、聚酰胺、聚酰亚胺、聚芳酰胺和包括来自甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯或苯乙烯的至少一种单体的共聚物。
32. 权利要求28所述的个人护理组合物，其中对该聚合物具有亲和力的肽选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、46、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和112。
33. 权利要求28所述的个人护理组合物，其中包括对聚合物具有亲和力的肽的该组合物进一步包括毛发-结合肽。
34. 权利要求28所述的个人护理组合物，其中包括对聚合物具有亲和力的肽的该组合物进一步包括皮肤-结合肽。
35. 权利要求28所述的个人护理组合物，其中对聚合物具有亲和力的肽任选地与对身体表面具有亲和力的肽偶联。
36. 权利要求35的个人护理组合物，其中对身体表面具有亲和力的肽用分子间隔物与对聚合物具有亲和力的肽偶联。
37. 权利要求35所述的个人护理组合物，其中对身体表面具有亲和力的肽为毛发-结合肽。
38. 权利要求35所述的个人护理组合物，其中对身体表面具有亲和力的肽为皮肤-结合肽。
39. 权利要求33或37所述的个人护理组合物，其中毛发-结合肽通过选自噬菌体展示、酵母展示、细菌展示和组合的固相肽合成的方法组合地产生。
40. 权利要求34或38所述的个人护理组合物，其中皮肤-结合肽通过选自噬菌体展示、酵母展示、细菌展示和组合的固相肽合成的方法组合地产生。
41. 权利要求33或37所述的个人护理组合物，其中该毛发-结合肽凭经验产生。
42. 权利要求34或38所述的个人护理组合物，其中该皮肤-结合肽凭经验产生。
43. 权利要求41所述的个人护理组合物，其中凭经验产生的毛发-结合肽包括对毛发具有亲和力的带正电荷的氨基酸。
44. 权利要求42所述的个人护理组合物，其中凭经验产生的皮肤-结合肽包括对皮肤具有亲和力的带正电荷的氨基酸。
45. 权利要求33或37所述的个人的护理组合物，其中该毛发-结合肽选自SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52、58、59、60、61、62、73、74、75、76、77、78、79、80和81。
46. 权利要求34或38所述的个人的护理组合物，其中该皮肤-结合肽选自SEQ ID NO：53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92和93。
47. 权利要求28所述的个人的护理组合物，其中对聚合物具有亲和力的肽通过选自噬菌体展示、酵母展示、细菌展示和组合的固相肽合成方法组合地产生。
48. 二嵌段的基于肽的偶联物，具有通式结构[(BSBP)m-(PBP)n]x，其中
a)BSBP为身体表面结合肽；
b)PBP为聚合物-结合肽；和
c)m、n和x独立地为1至约10。
49.三嵌段的基于肽的偶联物，具有通式结构[(BSBP)m-Sq]x-[(PBP)n-Sr]z]y，其中
a)BSBP为身体表面结合肽；
b)PBP为聚合物-结合肽；
c)S为分子间隔物；和
d)m、n、x和z独立地为1至约10，y为1至约5，并且其中q和r各自独立地为0或1，条件是r和q不能都为0。
50. 权利要求48或49所述的基于肽的偶联物，其中身体表面结合肽通过选自噬菌体展示、酵母展示、细菌展示和组合的固相肽合成的方法组合地产生。
51. 权利要求48或49所述的基于肽的偶联物，其中身体表面结合肽为毛发-结合或皮肤-结合肽。
52. 权利要求51所述的基于肽的偶联物，其中毛发-结合或皮肤-结合肽通过选自噬菌体展示、酵母展示、细菌展示和组合的固相肽合成的方法组合地产生。
53. 权利要求51所述的基于肽的偶联物，其中毛发-结合或皮肤-结合肽凭经验产生。
54. 权利要求53所述的基于肽的偶联物，其中凭经验产生的毛发-结合或皮肤-结合肽包括带正电荷的氨基酸。
55. 权利要求51所述的基于肽的偶联物，其中毛发-结合肽选自SEQID NO：47、48、49、50、51、52、58、59、60、61、62、73、74、75、76、77、78、79、80和81。
56. 权利要求51所述的基于肽的偶联物，其中皮肤-结合肽选自SEQID NO：53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92和93。
57. 权利要求48或49所述的基于肽的偶联物，其中聚合物-结合肽通过选自噬菌体展示、酵母展示、细菌展示和组合的固相肽合成的方法组合地产生。
58. 权利要求48或49所述的基于肽的偶联物，其中聚合物-结合肽具有对聚合物的亲和力，该聚合物选自聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚氨基甲酸酯、多肽、木质素、多糖、聚酰胺、聚酰亚胺、聚芳酰胺和包括来自甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯或苯乙烯的至少一种单体的共聚物。
59. 权利要求48或49所述的基于肽的偶联物，其中聚合物-结合肽选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和112。
60. 三嵌段的权利要求49所述的基于肽的偶联物，其中间隔物选自乙醇胺、乙二醇、具有6个碳原子链长的聚乙烯、具有3至6个重复单元的聚乙二醇、苯氧乙醇、丙醇酰胺、丁二醇、丁二醇酰胺、丙基苯基链、乙基烷基链、丙基烷基链、己基烷基链、甾醇烷基链、十六烷基烷基链和棕榈酰烷基链。
61. 三嵌段的权利要求49所述的基于肽的偶联物，其中间隔物为包括1至约50个氨基酸的肽。
62. 三嵌段的权利要求61所述的基于肽的偶联物，其中间隔物包括选自脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸及其混合物的氨基酸。
63. 三嵌段的权利要求61所述的基于肽的偶联物，其中间隔物包括选自SEQ ID NO：63、64、65、66、94、95、96和97的肽序列。
64. 三嵌段的权利要求49的基于肽的偶联物，其中该三嵌段的基于肽的偶联物具有选自SEQ ID NO：67、68、69和70的序列。
65. 聚甲基丙烯酸甲酯-结合肽，选自SEQ ID NO：98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和112。
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