CN101260429A - 作为妊娠相关病症的诊断标志物的循环mRNA - Google Patents
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Abstract
本发明涉及作为妊娠相关病症的诊断标志物的循环mRNA，具体地说涉及用于妊娠相关病症的试剂盒，更具体地说，涉及通过定量分析母体血液中的一种或多种mRNA种类的含量来诊断、监测或预测妊娠妇女的先兆子痫、胎儿染色体非整倍性和早产的疾病状态以及检测妇女妊娠的试剂盒，所述的mRNA编码人绒毛膜促性腺激素β亚基(hCG－β)、人胎盘催乳素(hPL)、人促肾上腺皮质激素释放激素(hCRH)、KiSS－1转移抑制因子(KISS1)、组织因子途径抑制剂2(TPFI2)或胎盘特异1(PLAC1)，所述试剂盒还包括该mRNA种类的含量的标准对照。
Description
相关申请
本申请要求在2003年1月17日提交的美国临时申请第60,440,906号的优先权，本发明引用其全文作为参考。
发明背景
通常采用诸如绒毛膜取样(CVS)或羊膜穿刺术的方法从胎儿中分离细胞来进行产前诊断。尽管操作非常仔细，但这些常规方法均是侵袭性的，并对母体和胎儿有一定的风险(Tabor et al.，Lancet 1：1287-1293，1986)。
在发现母体循环中存在一些类型的胎儿细胞(Johansen et al.，Prenat.Diagn.15：921-931，1995)之后，更重要的是在发现母体血浆和血清中能够检测到循环的无细胞的胎儿DNA(Lo et al.，Lancet 350：485-487，1997)之后，已经开发了替代这些侵袭性方法的产前筛查方法，例如检测胎儿异常的方法。已证明，母体血液中的胎儿DNA的含量足够用于遗传学分析，与分离和富集胎儿细胞的必需步骤相比，并不需要对所述血浆或血清进行复杂的处理。利用聚合酶链式反应(PCR)为基础的技术，通过检测母体血液中的胎儿DNA来实现胎儿rhesus D(RhD)基因型的检测(Lo et al.，N.Engl.J.Med.339：1734-1738，1998)、胎儿性别的确定(Lo et al.，Hum.Genet.90：483-488，1993)、以及一些胎儿病症的诊断(Amicucci et al.，Clin.Chem.46：301-302，2000；Saito et al.，Lancet 356：1170，2000；及Chiu et al.，Lancet 360：998-1000，2002)。
此外，也有报道称在先兆子痫(Lo et al.，Clin.Chem.45：184-188，1999和Zhong et al.，Am.J.Obstet.Gynecol.184：414-419，2001)、胎儿21号染色体三体性(trisomy)(Lo et al.，Clin.Chem.45：1747-1751，1999和Zhonget al.Prenat.Diagn.20：795-798，2000)和妊娠剧吐症(hyperemesisgravidarum)(Sekizawa et al.，Clin.Chem.47：2164-2165，2001)的母体血浆/血清中胎儿DNA含量异常的报道。美国专利第6,258,540号也公开了用于产前遗传分析的母体血液中胎儿核酸的检测。
在分析胎儿DNA时，检测者通常利用仅出现在男性胎儿中的Y染色体标志物作为胎儿的特异性标志物。这种方法使此项技术的应用局限于50％的妊娠妇女，这些妊娠妇女怀有男性胎儿。此外，其它遗传多态性的利用，也增加了胎儿DNA为基础的分析的复杂性。母体血浆中胎儿RNA的发现提供了超越这些限制的可能的新方法(Poon et al.，Clin.Chem.46：1832-1834，2000).
最近，美国专利申请第09/876,005号公开了以母体血液中胎儿RNA检测为基础的非侵袭性技术。本发明第一次公开了在母体血液中出现的某些mRNA种类的含量能够用作诊断、监测或预测诸如先兆子痫、胎儿染色体非整倍性和早产的妊娠相关病症、以及检测妊娠的标志物，所述mRNA种类包括编码人绒毛膜促性腺激素β亚基(hCG-β)、人促肾上腺皮质激素释放激素(hCRH)、人胎盘促乳素(hPL)、KiSS-1转移抑制因子(KISS1)、组织因子途径抑制剂2(TPFI2)、胎盘特异1(PLAC1)或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的mRNA。
发明概述
本发明提供了通过检测母体血液中的一种或多种循环mRNA的含量来诊断、监测或预测诸如先兆子痫、胎儿染色体非整倍性和早产的妊娠相关病症的新方法。本发明还提供了基于相同方法学的检测妇女妊娠的方法。所述的mRNA可以编码诸如人绒毛膜促性腺激素β亚基(hCG-β)、人胎盘催乳素(hPL)、人促肾上腺皮质激素释放激素(hCRH)、KiSS-1转移抑制因子(KISS1)、组织因子途径抑制剂2(TPFI2)、胎盘特异1(PLAC1)或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的胎儿或母体来源的蛋白。同时也提供以本发明为基础的用于这些妊娠相关疾病状态/妊娠的诊断/检测试剂盒。
本发明的一个方面涉及诊断、监测或预测妊娠妇女的先兆子痫的方法。此方法包括多个步骤：第一步是定量测定所述妊娠妇女血液中的一种或多种特定mRNA种类的含量。所述mRNA可编码hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH。第二步是将第一步获得的mRNA含量与代表正常非先兆子痫的妇女血液中编码相同蛋白的mRNA含量的标准对照进行比较。所述mRNA水平的增加或降低表明存在先兆子痫或发展为所述疾病状态的风险增加。
在一些实施方案中，此方法中用作标志物的mRNA编码hCRH或GAPDH。在一些实施方案中，所述方法的第一步通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)进行，而在其它实施方案中，第一步可采用多核苷酸杂交方法或质谱方法来实施。在一些实施方案中，所述妊娠妇女处于妊娠期的头三月，而其它实施方案中，所述妇女处于妊娠期的中三月或末三月。在一些实施方案中，所述妊娠妇女的血液在用于所述方法的第一步之前是无细胞的。在一些实施方案中，在所述方法的第一步中使用血浆或血清。在一些实施方案中，所述mRNA含量的增加高于标准对照2倍。
本发明的方法也可用于诊断、监测或预测比先兆子痫更严重的诸如惊厥的临床病程。
本发明还涉及诊断、监测或预测妊娠妇女的先兆子痫的试剂盒。所述的试剂盒包括用于定量测定所述妊娠妇女血液中的一种或多种特定mRNA种类的PCR引物。所述的mRNA可编码hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH。所述试剂盒还包括代表正常非先兆子痫的妇女血液中编码相同蛋白的mRNA含量的标准对照。本发明的试剂盒在所述PCR引物之外还可包括一种或多种用于定量测定编码hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA含量的探针，或用其替代所述PCR引物。
本发明的另一方面涉及用于检测妊娠妇女中诸如18号染色体三体性或21号染色体三体性的胎儿染色体非整倍性的方法。此方法包括多个步骤：第一步是定量测定所述妊娠妇女血液中的一种或多种特定mRNA种类的含量。所述mRNA可编码hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1、或GAPDH。第二步是将第一步获得的mRNA含量与代表怀有正常染色体胎儿的正常妊娠妇女血液中编码相同蛋白的mRNA含量的标准对照进行比较。所述mRNA水平的增加或降低表明怀有非整倍体胎儿的风险增加。
在一些实施方案中，此方法中用作标志物的mRNA编码hCG-β。在一些实施方案中，所述方法的第一步通过RT-PCR进行，而在其它实施方案中，第一步可采用多核苷酸杂交方法或质谱方法来实施。在一些实施方案中，所述妊娠妇女处于妊娠期的头三月，而在其它实施方案中，所述妊娠妇女处于妊娠期的中三月或末三月。在一些实施方案中，所述妊娠妇女的血液在用于所述方法的第一步之前是无细胞的。在一些实施方案中，在所述方法的第一步中使用血浆或血清。在一些实施方案中，所述增加至少为2倍，而所述降低至少为50％。
本发明还涉及用于检测妊娠妇女中胎儿染色体非整倍性(诸如18号染色体三体性或21号染色体三体性)的试剂盒。所述的试剂盒包括用于定量测定所述妊娠妇女血液中的一种或多种特定种类的mRNA的PCR引物。所述的mRNA可编码hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1、或GAPDH。所述试剂盒还包括代表怀有染色体正常胎儿的正常妇女血液中编码相同蛋白的mRNA含量的标准对照。本发明的试剂盒除所述PCR引物之外还可包括一种或多种用于定量测定编码hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1、或GAPDH的mRNA含量的探针，或用其替代所述PCR引物。
本发明的另一方面涉及诊断、监测或预测妊娠妇女的早产(pre-termlabor)的方法。此方法包括多个步骤：第一步是定量测定所述妊娠妇女血液中的一种或多种特定种类的mRNA的含量。所述mRNA可编码hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH。第二步是将第一步获得的mRNA含量与代表如期分娩或将会如期分娩的正常妊娠妇女血液中编码相同蛋白的mRNA含量的标准对照进行比较。所述mRNA水平的增加或降低表明早产或发展为此状态的风险增加。
在一些实施方案中，所述方法的第一步通过RT-PCR进行，而在其它实施方案中，第一步采用多核苷酸杂交方法或质谱方法来实施。在一些实施方案中，所述妊娠妇女处于妊娠期的头三月，而在其它的实施方案中，所述妊娠妇女处于妊娠期的中三月或末三月。在一些实施方案中，所述妊娠妇女的血液在用于所述方法的第一步之前是无细胞的。在一些实施方案中，在所述方法的第一步中使用血浆或血清。在一些实施方案中，所述mRNA含量的增加高于标准对照2倍。在另一些实施方案中，所述的降低至少为50％。
本发明还涉及诊断、监测或预测妊娠妇女的早产的试剂盒。所述的试剂盒包括用于定量测定所述妊娠妇女血液中的一种或多种特定种类的mRNA的PCR引物。所述的mRNA可编码hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH。所述试剂盒还包括代表如期分娩或将会如期分娩的正常妊娠妇女血液中编码相同蛋白的mRNA含量的标准对照。本发明的试剂盒除所述PCR引物之外还可包括一种或多种用于定量测定编码hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA含量的探针，或用其替代所述PCR引物。
本发明的另一方面涉及检测妇女妊娠的方法。此方法包括多个步骤：第一步是定量测定所述妇女血液中的一种或多种特定种类的mRNA的含量。所述mRNA可编码hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2或PLAC1。第二步是将第一步获得的mRNA含量与代表健康且未妊娠的正常妇女血液中编码相同蛋白的mRNA含量的标准对照进行比较。所述mRNA水平增加表明妊娠。
在一些实施方案中，所述方法的第一步通过RT-PCR进行，而在其它实施方案中，第一步采用多核苷酸杂交方法或质谱方法来实施。在一些实施方案中，所述妊娠妇女的血液在用于所述方法的第一步之前是无细胞的。在一些实施方案中，在所述方法的第一步中使用血浆或血清。在一些实施方案中，所述mRNA含量的增加高于标准对照2倍。在另一些实施方案中，所述的降低至少为50％。
本发明还涉及检测妇女妊娠的试剂盒。所述的试剂盒包括用于定量测定所述妊娠妇女血液中一种或多种特定种类的mRNA的PCR引物。所述的mRNA可编码hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2或PLAC1。所述试剂盒还包括代表健康且未妊娠的正常妇女血液中编码相同蛋白的mRNA含量的标准对照。本发明的试剂盒除所述PCR引物之外还可包括一种或多种用于定量测定编码hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2或PLAC1的mRNA含量的探针，或用其替代所述PCR引物。
附图的简要描述
图1所示为分娩后母体血浆中CRH mRNA的清除状况：(A)为分娩前和分娩后2小时母体血浆中CRH mRNA的浓度，(B)则为分娩前和分娩后2小时母体血浆中GAPDH RNA的浓度。每一条线代表从一个受试者获得的一份血浆样本。
图2为先兆子痫和对照组母体血浆中CRH mRNA浓度的盒须图(boxplot)。CRH mRNA浓度以拷贝/mL表示。所述盒中的横线表示中位数。所述盒标志25th与75th百分点之间的区间。所述须(whisker)表示10th与90th百分点之间的区间。实心原点标志10th与90th百分点区间以外的数据点。
图3所示为正常妊娠母体血浆中胎盘来源的mRNA的水平。(A)为不同妊娠阶段母体血浆中hPL mRNA和母体血清中蛋白水平的盒须图。(B)为不同妊娠阶段母体血浆中βhCG mRNA和母体血清中hCG蛋白水平的盒须图。所述盒中的横线表示中位数。所述盒标志25th与75th百分点之间的区间。所述须表示10th与90th百分点之间的区间。实心原点标志10th与90th百分点区间以外的数据点。(C)为母体血浆中hPL mRNA和母体血清中蛋白水平之间的相关性分析。(D)为母体血浆中βhCG mRNA和母体血清中蛋白水平之间的相关性分析。
图4所示为分娩后母体血浆中hPL mRNA的清除状况。(A)为分娩前和分娩后24小时的母体血浆hPL mRNA水平，而(B)为分娩前和分娩后24小时的母体血浆GAPDH mRNA水平。显示了8例血浆样本的结果，且每一条线代表从一个受试者获得的一份血浆样本。(C)为分娩前和分娩后2小时的母体血浆hPL mRNA水平，而(D)为分娩前和分娩后2小时的母体血浆GAPDH mRNA水平。显示了13例血浆样本的结果，且每一条线代表从一个受试者获得的一份血浆样本。
图5显示了母体血浆中GAPDH mRNA的含量。样本1-12来自正常妊娠妇女，而样本28-37来自先兆子痫妇女。
图6显示了非整倍体和对照妊娠的妊娠期头三月中母体血清hCGβmRNA的浓度。盒须图显示了对照、21号染色体三体性(T21)和18号染色体三体性(T18)妊娠者的血清中的hCGβmRNA浓度(常用对数取值)。所述盒中的横线表示中位数。所述盒标志25th与75th百分点之间的区间。所述须表示10th与90th百分点之间的区间。实心原点标志10th与90th百分点区间以外的数据点。
图7所示为用于母体血浆中妊娠特异胎盘表达的mRNA标志物的系统鉴定的策略的概括。收集配对的胎盘组织和母体全血样本，并对其进行寡核苷酸芯片分析。挑选相对于全血在所述胎盘组织中表达增加的转录本，并且通过对母体血浆的定量反转录酶PCR(QRT-PCR)来评价其在母体血浆中的可检测性和妊娠特异性。
图8所示为分娩后母体血浆中胎盘mRNA的清除状况。通过QRT-PCR检测了分娩前和分娩后24小时母体血浆中(A)TFPI2 mRNA、(B)KISS1 mRNA和(C)PLAC1 mRNA的浓度。每一条线代表从一个受试者获得的一份血浆样本。
图9显示了母体血浆和胎盘组织中标准化胎盘mRNA水平的相关性。(A)为头三月妊娠期血浆和CVS间的标准化胎盘mRNA水平的相关性。(B)为末三月妊娠期血浆和末期胎盘间标准化胎盘mRNA水平的相关性。通过QRT-PCR测定血浆和胎盘组织中的标准化的βhCG(nβhCG)、TFPI2(nTFPI2)、KISS1(nKISS1)、CRH(nCRH)和PLAC1(nPLAC1)mRNA的水平，并分别用图例中所说明的符号来表示。对于非胎盘表达的转录本，也显示了标准化的GAPDH(nGAPDH)和β-球蛋白(nβ-球蛋白)的结果。
定义
本发明所用术语“先兆子痫”指在妊娠过程中发生的疾病状态，其主要症状为多种形式的高血压并常伴有尿蛋白和水肿(浮肿)。先兆子痫有时称为妊娠毒血症，与更严重的称为惊厥的病症有关，其为先兆子痫结合癫痫发作。尽管其在出生后可立即发生或在妊娠20周之前发生，这些疾病状态通常在妊娠的后半程(20周后)发病。
本发明所用术语“染色体非整倍性”指染色体异常的状态，其中染色体数目不是通常单倍体数目的精确的多倍体：经常是增加染色体或缺失一个。染色体非整倍性的最常见的情况是三体性，其中出现单个增加的染色体。例如18号染色体三体性是在细胞中出现第三条18号染色体的染色体异常，而细胞中存在第三条21号染色体的患者则患有21号染色体三体性疾病。
与非整倍性相反，“染色体正常”指染色体数目是所述单倍体数目的精确的多倍体的状态，例如单倍体的染色体数目的两倍，且每种染色体以相同的数目存在(除例如男性人类的性染色体外，其中两种不同的性染色体X和Y各以一个拷贝存在)。
本发明所用术语“早产”或“提前分娩”指在约40周的完全妊娠期届满前3周以上发生分娩的状态，如果不处理常导致早产。相对的，本申请所用的“如期分娩或将会如期分娩”的妊娠妇女指从怀胎至完全的孕期未发生早产的妊娠妇女。
本发明所用术语“血液”指从妊娠妇女或妊娠可能性检测的妇女获得的血液样本或制备产物。该术语包括全血或血液的任何组分，其基本不含造血细胞或任意母体或胎儿来源的其它类型的细胞，包括血小板。“血液”通常不含有特定的物质，该物质可含有母体或胎儿来源的RNA。“血液”的例子包括血浆和血清。基本不含细胞的血液样本也称为“无细胞的”，其中通常不存在血小板。
本文用于描述非先兆子痫、怀有染色体正常胎儿或没有且不会出现早产的妊娠妇女的术语“正常”指某些特征，例如编码在母体血液中发现的一种或多种特定胎儿蛋白的mRNA水平，其在一组随机选择的非先兆子痫、怀有染色体正常胎儿或没有且不会出现早产的妇女中具有代表性。所选择的这组应包括充足数量的妇女，从而使这些妇女中编码特定胎儿蛋白的平均mRNA水平以适当的精确度反映怀有健康胎儿的健康妊娠妇女的整个群体的mRNA水平。此外，所选择的这组妇女应与那些检测血液中先兆子痫、胎儿染色体非整倍性或早产指征的妇女有相似的妊娠龄。根据欲筛查的病症，用于本发明实践的优选的妊娠龄可以不同。例如筛查先兆子痫风险的妊娠妇女优选在妊娠期中三月期间进行，而优选尽可能早地对胎儿染色体非整倍性进行筛查和诊断。而且，检测的优选妊娠龄也依赖于检测中所用的mRNA标志物。例如，hPL mRNA在所有三个三月妊娠期中均可检测，而随着妊娠进程hCRH mRNA的可检测性逐步增加。
术语“正常”也同样用于指特定mRNA种类的含量代表在一组随机挑选的非妊娠健康妇女血液中的含量。
本发明所用的人绒毛膜促性腺激素β亚基(hCG-β)、人胎盘催乳素(hPL)、人促肾上腺皮质激素释放激素(hCRH)、KiSS-1转移抑制因子(KISS1)、组织因子途径抑制剂2(TPFI2)、胎盘特异1(PLAC1)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，指示例性地其序列分别如GenBank登录号NM_000737.2、NM_022640、NM_000756、U43527、NM_006528、BC022335和BC014085所给出的基因(包括其变体和突变体)和其多核苷酸转录本。在一些描述中，这些术语也指这些基因编码的蛋白。
本发明所用“标准对照”指适合在本发明方法中使用来定量测定编码特定蛋白，例如hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA含量的样本。这些样本含有已知含量的编码特定蛋白的mRNA，其非常逼近反映正常妊娠妇女中此种mRNA的平均水平，如上所述该妊娠妇女是非先兆子痫、怀有染色体正常胎儿或没有且不会出现早产的妇女。类似地，“标准对照”也可来自正常的健康非妊娠妇女。
本发明所用“mRNA含量比标准对照增加或降低”指含量相对于标准对照发生阳性或阴性变化。增加优选为至少2倍，更优选为至少5倍，并最优选为至少10倍。相似地，降低优选为至少50％，更优选为至少80％，并最优选为至少90％。
本发明所用的“多聚核苷酸杂交方法”指依据其形成Watson-Crick碱基配对的能力，在适合的杂交条件下，利用已知序列的多聚核苷酸探针来检测多聚核苷酸存在和/或数量的方法。这种杂交方法的例子包括Southern印记和Northern印记杂交。
本发明所用“PCR探针”指寡核苷酸，其在聚合酶链式反应(PCR)中用于扩增源于编码诸如hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的目标蛋白的mRNA的核苷酸序列。至少一种用于扩增编码上述指定蛋白的核苷酸序列的PCR引物对所述蛋白是序列特异的。
发明的详细描述
I.引言
本发明第一次提供了通过分析存在于妇女血液中的一种或多种编码hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA来诊断、监测或预测妊娠妇女中先兆子痫、胎儿染色体非整倍性(诸如18号染色体三体性和21号染色体三体性)和早产，以及检测妇女妊娠的方法和试剂盒。
根据本发明，能够定量测定母体血液样本中编码hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA的含量，优选通过扩增方法来进行，例如反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)。随后将一种或多种上述指定的mRNA种类与具有相同种类的mRNA的标准对照的水平进行比较，所述标准对照代表没有这些妊娠相关病症的相同妊娠龄的正常妊娠妇女。mRNA水平的增加或降低表明存在所述病症或发展为所述病症的风险增加。因而，本发明提供了诊断先兆子痫、胎儿染色体非整倍性和早产的新方法，其是非侵袭性的并且是非性别和多态性依赖的。
根据相同的方法学，通过将妇女血液中编码hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2或PLAC1的一种或多种mRNA种类的水平与来自正常非妊娠妇女的对照值进行比较，本发明也可用于检测妊娠。
II.血液样本的制备
A.获得血液样本
实施本发明的第一步是利用本发明方法从处于适合检测的妊娠龄的妊娠妇女中或从检测妊娠可能性的妇女中获取血液样本。如上所述，依据所检测的病症，有时依据所用的mRNA标志物，所述适合的妊娠龄可以不同。根据医院和临床通常采用的标准程序进行妇女血液的收集。收集适量的外周血，例如5-20ml，并可在进一步制备之前根据标准的步骤进行储存。
B.制备无细胞血液样本
妇女血液的血清或血浆适合于本发明，并可通过公知的方法来获得。例如，将妇女血液放入含有EDTA或诸如Vacutainer SST(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)的商业销售的专用产品的管中来防止血液凝集，随后通过离心可从全血中获得血浆。另一方面，血液凝集后通过离心可获得血清。通常在冷却的环境例如约4-10℃的温度中，采用适合的速度例如1,500-3,000xg下，进行离心。在转移至新管中进行RNA提取前，可对血浆或血清进行额外的离心步骤。
III.妇女血液中mRNA含量的定量测定
A.mRNA的提取
有多种从生物样本中提取mRNA的方法。可依据通常的mRNA制备方法(例如Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual第三版，2001中所述)来进行；也可利用各种商业销售的试剂或试剂盒，例如Trizol试剂(Invitrogen，Carl sbad，CA)、Oligotex Direct mRNA试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)、RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)以及
Series 9600TM(Promega，Madison，WI)来从妇女血液样本中获取mRNA。也可将一种以上的上述方法组合采用。
从RNA制备产物中去除污染性的DNA是必要的。因此，应该对样本小心操作，利用DNase全面处理，在扩增和定量步骤中使用适合的阴性对照。
B.PCR为基础的mRNA水平的定量测定
一旦从妇女血液样本中提取出mRNA，即可对编码诸如hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的目标蛋白的mRNA含量进行定量检测。测定mRNA水平的优选方法是扩增为基础的方法，例如PCR。
在扩增步骤之前，必须合成目标mRNA的DNA复制本(cDNA)。这通过反转录来实现，其可分开进行或在一种扩增RNA的改进聚合酶链式反应——均质反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)中进行。适合核糖核酸的PCR扩增的方法如Romero与Rotbart的Diagnostic Molecular Biology：Principles and Applications pp.401-406；Persing et al.，eds.，MayoFoundation，Rochester，MN，1993；Egger et al.，J.Clin.Microbiol.33：1442-1447，1995；及美国专利第5,075,212所述。
PCR的常规方法是本领域公知的，因此本发明对其不作详细描述。关于PCR方法、方案及设计引物的原则的综述参见例如Innis，et al.，PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications，Academic Press，Inc.N.Y.，1990。从诸如Roche Molecular Systems的供应商处也可获得PCR试剂和方案。
通常PCR借助耐热酶以自动过程来完成。在此过程中，通过变性区、引物退火区及延伸反应区使反应混合物的温度自动循环。适合此目的的仪器可通过商业渠道获得。
尽管本发明实施时通常采用PCR来扩增目标mRNA。但本领域所属技术人员应认识到，也可通过任何公知的方法来完成母体血液样本中的这些mRNA种类的扩增，这些方法例如连接酶链式反应(LCR)、转录介导的扩增及自我持续序列复制或核酸序列为基础的扩增(NASBA)，这些方法中的每一种都提供了充分的扩增。最近开发的分枝DNA技术(branched-DNA technology)也可用于定量测定母体血液中的mRNA标志物的含量。用于临床样本中核酸序列的直接定量的分枝DNA信号扩增技术的综述可参见Nolte，Adv.Clin.Chem.33：201-235，1998。
C.其它的定量方法
也可利用其它的本领域所属技术人员公知的常规技术来检测目标mRNA。尽管所述的检测步骤之前通常有扩增步骤，但扩增并不是本发明方法所必需的。例如，无论是否先进行扩增步骤，均可通过大小分级来鉴定所述mRNA(例如凝胶电泳)。根据公知的技术(参见上述的Sambrook和Russell)将样本在凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳并用溴化乙锭进行标记，存在与标准对照大小相同的条带是存在目标mRNA的标志，然后根据所述条带的强度可将其含量与对照进行比较。可选择地，利用对编码例如hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA特异的寡核苷酸探针来检测这些mRNA种类的存在，并根据所述探针输出的信号强度来指示相对于所述标准对照的含量。
序列特异探针杂交是公知的检测包括其它种类核酸在内的特定核酸的方法。在足够严格的杂交条件下，所述探针仅与基本互补的序列特异杂交。可放宽所述的严格杂交条件使得不定数目的序列错配。
一些杂交的模式是本领域公知的，包括但不限于液相、固相或混和相杂交分析。以下文章提供了多种杂交分析模式的概述：Singer et al.，Biotechniques 4：230，1986；Haase et al.，Methods in Virology，pp.189-226，1984；Wilkinson，In situ Hybridization，Wilkinson ed.，IRL Press，Oxford University Press，Oxford；及Hames和Higgins eds.，Nucleic AcidHybridization：A Practical Approach，IRL Press，1987。
根据公知的技术检测杂交复合物，且该检测并不是本发明的关键方面。可使用通常用于检测杂交核酸的存在的几种方法中的任何一种来标记能够与目标核酸(即所述的mRNA或扩增的DNA)特异杂交的核酸探针。一种通用的检测方法是借助3H、125I、35S、14C或32P等等标记的探针的放射自显影。依据所选择同位素合成的难易、稳定性和半衰期的研究参数来选择放射性同位素。其它标记物包括能够与抗配体结合的化合物(例如生物素和地高辛(digoxigenin))或用荧光素、化学发光剂和酶标记的抗体。可选择地，探针能够与诸如荧光素、化学发光剂或酶的标记物直接连接。依据所要求的敏感性、与所述探针连接的难易、稳定性要求和现有的设备来选择标记物。
利用公知的技术可合成和标记本发明实施中必需的探针和引物。可根据Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Letts.，22：1859-1862，1981中首次描述的固相磷酰胺酸三酯(phosphoramidite triester)方法，利用如Needham-VanDevanter et al.，Nucleic Acids Res.12：6159-6168，1984所述的自动合成仪来化学合成用作探针和引物的寡核苷酸。如Pearson和Regnier，J.Chrom.，255：137-149，1983所述，通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换HPLC来纯化寡核苷酸。
IV.建立标准对照
为了建立标准对照，首先选择怀有健康胎儿的一组健康妊娠妇女。这些妇女应是相似妊娠龄的，并处于适合用本发明方法筛查诸如先兆子痫、胎儿染色体非整倍性和早产的病症的妊娠时间段。类似地，利用来自一组健康的非妊娠妇女的样本建立标准对照。
通过成熟的、常规使用的方法来确认所选妊娠妇女和其所怀胎儿的健康状况，所述方法包括但不限于检测所述妇女的血压、记录分娩的发生和利用CVS和羊水穿刺术进行胎儿遗传性分析。
此外，所选择的这组怀有健康胎儿的健康妊娠妇女或健康非妊娠妇女必须有一定的规模，从而从该组计算得到的编码hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA的平均含量能够可信地代表怀有健康胎儿的健康妇女或健康非妊娠妇女总群体的正常或平均含量。优选地，所选组包括至少10位妇女。
一旦依据所选组中每位妇女的个体值，建立编码任一蛋白的mRNA含量的平均值，则该值即被认为是所述mRNA种类的标准值。因此，任何含有相似含量的同种mRNA的血液样本均可用作标准对照。也可人工组合得到所含编码hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA的浓度等于所建立的同种mRNA的平均浓度的溶液，并将其作为标准对照。
以下仅以说明方式而非限定性的方式提供了本发明的实施例。本领域所属技术人员应容易地认识到，通过改变或修改各种非关键性的参数也能实现基本相似的结果。
实施例
实施例1：先兆子痫妇女的hCRH mRNA水平升高
A.方法
受试者
在得到知情同意和研究伦理委员会(Research Ethics Committee)批准的前提下，从妊娠妇女收集外周血样本，这些妊娠妇女在香港Prince ofWales医院妇产科看病。
在此研究的第一部分，从10例末三月妊娠期的健康妊娠妇女获得血液样本。在此课题的第二部分，征募具有简单妊娠的即将进行选择性剖腹产手术的4例妊娠妇女。在即将分娩前和分娩后2小时采集这些受试者的外周血样本。此研究的第三部分，对两组患者进行了研究：(a)12例先兆子痫妇女和(b)10例对照妊娠妇女。所述先兆子痫和对照组的中位妊娠龄分别为37周和38周。在没有高血压病史的妇女出现稳定增加的舒张压，出现一次＞110mmHg或以至少4小时间隔出现两次或多次＞90mmHg，并有显著的蛋白尿，据此来确定先兆子痫。显著的蛋白尿定义为＞0.3g/天或以至少4小时间隔收集的两次清洁捕获的中流段尿液样本的检测条检测中≥2+。对照组包括没有预先存在的医学疾病或产前并发症的妊娠妇女。
血液样本的处理
依据以往报道的处理方法来处理血液样本(Ng et al.，Clin.Chem.48：1212-1217，2002)。简而言之，将10mL血液样本收集在含有EDTA的管中，并在4℃以1600×g离心10分钟。随后将血浆小心地转移至清洁的聚丙烯管中。将该血浆样本在4℃以16000×g再次离心10分钟，并将上清收集到新的聚丙烯管中。
RNA提取
如上述引用的Ng等的文献所述，将1.6mL的血浆与2mL的Trizol LS试剂(Invitrogen，Carlsbad，California)和0.4mL氯仿混和。将所得混合物在4℃以11,900×g离心15分钟，并将水层转移至新的管中。向所述的水层加入等体积的70％乙醇。随后，根据厂商的说明书将所述混合物加到RNeasy小型柱(Qiagen，Hilden，德国)中并进行处理。用30μL无RNase酶的水来洗脱总RNA，并在-80℃下储存。进行DNase(RNase-Free DNaseSet，Qiagen，Hilden，德国)处理来去除任何污染性的DNA。
实时定量RT-PCR
根据上述引用的Ng等的文献所述，采用一步实时定量RT-PCR对所有mRNA进行定量。所述CRH引物的序列为5’-GCCTCCCATCTCCCTGGAT-3’(正向)和5’-TGTGAGCTTGCTGTGCTAACTG-3’(反向)，而所述双标记的荧光探针为5’-(FAM)TCCTCCGGGAAGTCTTGGAAATGGC(TAMRA)-3’。通过以1×107拷贝至1×101拷贝的浓度范围对高效液相色谱纯化的单链合成DNA寡核苷酸(Genset Oligos，新加坡)进行系列稀释来制备用于CRH mRNA定量的校准曲线，该寡核苷酸对89bp CRH扩增子(amplicon)(Genbank登录号NM_000756)特异。CRH mRNA的绝对浓度表示为拷贝/mL血浆的形式。用于CRH校准的合成DNA寡核苷酸序列为5’-GGAGCCTCCCATCTCCCTGGATCTCACCTTCCACCTCCTCCGGGAAGTCTTGGAAATGGCCAGGGCCGAGCAGTTAGCACAGCAAGCTCACAGCA-3’。如上所述制作GAPDH定量的校准曲线，并以表示为pg/mL血浆的形式(上述引用的Ng等)。
根据厂商的说明书以25μL的反应体积进行RT-PCR反应(EZ rTthRNA PCR试剂套装，Applied Biosystems，Foster City，CA)。所用荧光探针(Genset Oligos)的浓度为100nM。对于CRH体系和GAPDH体系，所用PCR引物(Genset Oligos)的浓度均为200nM。使用5μL提取的血浆RNA进行扩增。每个样本分析两次，并且在每次分析中平行运行对应的校准曲线。用AmpliTaq Gold酶(Applied Biosystems，Foster City，CA)替代所述rTth多聚酶来检测样本，从而保证它们是DNA阴性的。在此对照分析中没有观察到扩增，表明所述分析对对应的mRNA具有特异性。在每一分析中也包括多个阴性空白水溶液。
用于所述CRH和GAPDH分析的温度方案如下：为了使所包含的尿嘧啶N-糖基化酶发挥作用，将反应在50℃引发2分钟，随后在60℃进行反转录30分钟。在95℃变性5分钟后，进行40个循环的以下PCR：94℃变性20秒，分别对所述CRH和GAPDH体系在58℃和62℃退火/延伸1分钟。
统计学分析
利用Sigma Stat 2.03软件(SPSS)进行统计学分析。
B.结果
实时定量RT-PCR的建立
为确定所述CRH RT-PCR分析的定量特性，我们利用此系统对系列稀释的校准品进行了扩增，该校准品为依据所述CRH序列合成的DNA寡核苷酸。以往的数据表明这种单链寡核苷酸可靠地模拟了所述反转录步骤的产物，并产生与利用T7-转录的RNA(Bustin，J.Mol.Endocrinol.25：169-193，2000)获得的校准曲线相同的校准曲线。CRH扩增体系的校准曲线显示了从2.5×101至1×106拷贝的动态范围，并具有0.983的相关系数。这些分析的扩增步骤的灵敏度足以检测25个拷贝的目标CRH。为确定包括RNA提取、反转录和扩增步骤的整个分析过程的准确性，我们对得自健康妊娠妇女(妊娠龄：38周)的血浆样本进行了10次平行的RNA提取，并对这些提取的RNA样本进行RT-PCR分析。这些CRH mRNA的平行分析的Ct值的变异系数为2.8％。GAPDH RT-PCR分析的展开和特性如以上引用的Ng等人的文献所述。
母体血浆中CRH mRNA的可检测性
为检验在母体血浆中是否能够检测到CRH mRNA的转录本，通过CRHRT-PCR分析对10例末三月妊娠期的妊娠妇女(妊娠龄为37到41周)的血浆样本进行了分析。在所有检验样本中均检测到了CRH mRNA。血浆CRH mRNA浓度的中位值为73拷贝/mL(四分位数间距：51至177)。作为阳性对照，在所有这些血浆样本中均能检测到GAPDH RNA。
分娩后母体血浆中CRH mRNA的清除
为证明母体血浆的CRH mRNA来自胎儿胎盘单元(feto-placentalunit)，我们对4位妇女分娩前和分娩后2小时的血浆均进行了CRH mRNA分析。结果在所有4例分娩前的母体血浆样本中均检测到了CRH mRNA。相反，在任何分娩后的样本中均没有检测到CRH mRNA。GAPDH mRNA在所有的血浆样本中均可检测到，从而证明了所述样本的质量。所述数据如图1A和图1B所示。
先兆子痫的妊娠妇女血浆中的CRH mRNA的定量分析
为比较先兆子痫和对照妊娠妇女母体血浆中的CRH mRNA的浓度，从妊娠龄相当的12例先兆子痫妇女和10例对照妊娠妇女获取血浆样本。如图2所示，先兆子痫妇女和对照妊娠妇女的血浆CRH mRNA浓度的中位数分别为1070拷贝/mL(四分位数间距535至1468)和102拷贝/mL(四分位数间距51至158)。先兆子痫妊娠妇女的血浆CRH mRNA浓度的中位数为对照妊娠妇女的10.5倍高(Mann-Whitney检验，P＜0.001)。
C.结论
血浆CRH mRNA代表一种新的先兆子痫的分子标志物。与母体血浆的胎儿DNA分析相比，血浆RNA分析具有非性别和多态性依赖的优点。可以预见血浆RNA分析可最终实现未出生胎儿的非侵袭性基因表达谱分析。
实施例2：妊娠妇女血浆中的hPL和hCG-βmRNA的检测
A.方法
受试者
从得到知情同意和研究伦理委员会批准的前提下，从单胎简单妊娠的健康妇女收集15ml血液样本，这些妊娠妇女在香港Prince of Wales医院妇产科看病。
血液样本的处理
将所述血液样本收集在含有EDTA的清洁的管中，并在4℃以1600×g离心10分钟。随后，将血浆和血清小心地转移至清洁的聚丙烯管中。所述的血清样本在-20℃保存用于hPL和hCG-β蛋白的免疫分析。将所述血浆样本在4℃以16000×g再次离心10分钟，并将上清收集到新的聚丙烯管中。将所有胎盘组织样本立即保存在RNA后续稳定溶液(Laterstabilizing solution)(Ambion，Austin，TX)中，并保存在-80℃直到进行RNA提取。对于过滤试验，将血浆样本分成三份：两份分别用0.45μm或5μm孔径的滤膜(Millex-GV；Millipore China Limited，香港)进行过滤。第三份不进行过滤。
RNA提取
对于血浆样本，根据上述引用的Ng等的方案，将1.6mL血浆与2mLTrizol LS试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)及0.4mL氯仿混和。对于胎盘组织，根据厂商的说明书在Trizol试剂(Invitrogen)中将样本匀浆，随后加入氯仿。将所得混合物在4℃以11,900×g离心15分钟，并将水层转移至新的管中。向所述的水层加入等体积的70％乙醇。随后，根据厂商的说明书将所述混合物加到RNeasy小型柱(RNeasy Mini试剂盒，Qiagen，Hilden，德国)中，并进行处理。用30μL无RNase酶的水来洗脱总RNA，并在-80℃下储存。进行DNase(RNase-Free DNase Set，Qiagen，Hilden，德国)处理来去除任何污染性的DNA。
实时定量RT-PCR
根据上述引用的Ng等的文献所述，采用一步实时定量RT-PCR对所有mRNA进行定量。用于所有hPL、hCG-β和GAPDH的RT-PCR分析的引物均是内含子跨越的。所述hPL引物的序列为5’-CATGACTCCCAGACCTCCTTC-3’(正义)和5’-TGCGGAGCAGCTCTAGATTG-3’(反义)，而双标记的荧光探针为5’-(FAM)TTCTGTTGCGTTTCCTCCATGTTGG(TAMRA)-3’。所述hCG-β引物的序列为5’-CTACTGCCCCACCATGACCC-3’(正义)和5’-TGGACTCGAAGCGCACATC-3’(反义)，而双标记荧光探针为5’-(FAM)CCTGCCTCAGGTGGTGTGCAACTAC(TAMRA)-3’。通过以1×107拷贝至1×101拷贝的浓度范围对高效液相色谱纯化的单链合成DNA寡核苷酸(Genset Oligos，新加坡)进行系列稀释来制备用于HPL和HCG-β定量的校准曲线，这些寡核苷酸分别对所述hPL和hCG-β扩增子特异。这些分析能够测定100个拷贝的代表性校准靶标。hPL和hCG-βmRNA的绝对浓度表示为拷贝/mL血浆的形式。以往的数据表明这种单链寡核苷酸可靠地模拟了所述反转录步骤的产物，并产生与利用T7-转录的RNA(见上述引用的Bustin)获得的校准曲线相同的校准曲线。用于hPL和hCG-β校准的合成DNA寡核苷酸序列分别为5’-TGCGGAGCAGCTCTAGATTGGATTTCTGTTGCGTTTCCTCCATGTTGGAGGGTGTCGGAATAGAGTCTGAGAAGCAGAAGGAGGTCTGGGAGTCATGC-3’和5’-GATGGACTCGAAGCGCACATCGCGGTAGTTGCACACCACCTGAGGCAGGGCCGGCAGGACCCCCTGCAGCACGCGGGTCATGGTGGGGCAGTAGCC-3’。根据上述引用的Ng等所述的方法制备用于GAPDH定量的校准曲线，并表示为pg/mL血浆的形式。
根据厂商的说明书以50μL的反应体积进行RT-PCR反应(EZ rTthRNA PCR试剂套装，Applied Biosystems，Foster City，CA)。所用荧光探针(Genset Oligos)的浓度为100nM。对于hPL体系，所用PCR引物(GensetOligos)的浓度为300nM，而对于hCG-β体系和GAPDH体系，所用PCR引物的浓度均为200nM。使用5μL提取的血浆RNA和0.1ng提取的总胎盘RNA进行扩增。每个样本分析两次，并且在每次分析中平行运行对应的校准曲线。用AmpliTaq Gold酶(Applied Biosystems，Foster City，CA)替代所述rTth多聚酶来检测样本，从而保证它们是DNA阴性的。在此对照分析中没有观察到扩增，表明所述分析对对应的mRNA具有特异性。在每一分析中也包括多个阴性空白水溶液。
用于所述hPL、hCG-β和GAPDH分析的温度方案如下：为了使所包含的尿嘧啶N-糖基化酶发挥作用，将反应在50℃引发2分钟，随后在60℃进行反转录30分钟。在95℃变性5分钟后，进行40个循环的以下PCR：94℃变性20秒、分别对hPL、hCG-β和GAPDH体系在56℃、58℃和60℃退火/延伸1分钟。
重复RNA提取和RT-PCR分析，显示hPL和hCG-βmRNA的分析系统的Ct值的变异系数分别为2.3％和3.2％。
蛋白分析
分别利用放射免疫分析(Diagnostic Products Corp.，Los Angeles，CA)和电化学发光免疫分析(Roche modular E170)对母体血清中的hPL和hCG蛋白浓度进行测定。
B.结果
母体血液中的胎盘mRNA的可检测性和稳定性
我们获取了10例妊娠妇女(妊娠龄为7-14周)的外周血样本。在样本到达实验室之后(静脉取血后1小时之内)，立即对每个受试者的一半血液样本进行血浆收集和RNA提取。为检验hPL和hCG-βmRNA的转录本在母体血浆中能否检测到，我们用对应的实时RT-PCR分析对提取的RNA进行了分析。我们在所有10例血浆样本中均观察到了hPL和hCG-βmRNA信号。这些结果表明在妊娠妇女血浆中确实能够检测到胎盘mRNA。作为阳性对照，在所有这些血浆样本中也检测到了GAPDHmRNA。
为研究母体血液中胎盘mRNA的稳定性，我们将这些母体血液样本各自余下的部分在室温下放置24小时。随后提取这些样本中的RNA，并对hPL、hCG-β和GAPDH转录本的水平进行检测。没有观察到hPL和hCG-βmRNA转录本水平的显著差异，而在室温下放置24小时的样本中的GAPDH mRNA显著高于立即处理的样本中的水平(Wilcoxon检验，对于所述hPL分析P＝0.770；对于所述hCG-β分析P＝0.275；对于所述GAPDH分析P＜0.05)。这些结果显示血浆中hPL和hCG-βmRNA在室温下可保持稳定达24小时。
妊娠龄引起的循环胎盘mRNA变化
从39例不同妊娠阶段的妊娠妇女获取血浆样本。在所有三个三月妊娠期的血浆中100％(39例中有39例)检测到hPL mRNA。对于hCG-βmRNA，妊娠头三月(妊娠龄：7-14周)样本的检出率为100％(14/14)，妊娠中三月(妊娠龄：15-23周)样本的检出率为42％(5/12)，妊娠末三月(妊娠龄：35-41周)样本的检出率为7.7％(1/13)。在所述妊娠头三月的血浆样本中，hPL和hCG-βmRNA水平的中位值分别为2671(四分位数间距为：375-6217)和1205拷贝/ml(四分位数间距为：566-1927)(图3A和图3B)。妊娠中三月的血浆hPL和hCG-βmRNA水平的中位值分别为4784(四分位数间距为：2679-10139)和0拷贝/ml(四分位数间距为：0-125)。在妊娠末三月的血浆样本中，血浆hPL和hCG-βmRNA水平的中位值分别为13869(四分位数间距为：7829-27434)和0拷贝/ml(四分位数间距为：0-0)。综上，循环hPL和hCG-βmRNA水平分别显示与妊娠龄有关的增加和降低的趋势。同时也测定了对应的hPL和hCG-β蛋白的水平(图3A和图3B)。所有循环hPL和hCG-βmRNA的妊娠期变化与对应蛋白所呈现出的趋势类似(Pearson相关性分析，对于hPL：r＝0.622；P＜0.001，对于hCG-β：r＝0.784；P＜0.001，如图3C和图3D所示)。
分娩后母体血浆中胎盘mRNA的快速清除
我们随后研究了分娩是否会导致母体血浆中胎盘mRNA的快速清除。由于在妊娠末三月(受试者的妊娠龄：38-42周)的母体血浆中hPLmRNA含量相对丰富，因此选择hPL mRNA作为研究的靶标。在8例分娩前的血浆样本中，hPL mRNA转录本水平的中位值为50004拷贝/ml。在分娩后24小时，在任何产后样本中不能检测到hPL mRNA(图4A)。作为对照，在所有分娩前和分娩后的血浆样本中均能够检测到GAPDHmRNA(图4B)。没有观察到母体血浆中GAPDH mRNA水平的系统改变(Wilcoxon检验，P＝0.313)。随后我们研究了能否在产后较短时间点(2小时)观察到循环hPL mRNA的清除。征募了13例受试者用于此第二项研究，分娩前hPL mRNA水平的中位值为24499拷贝/ml(图4C)。在产后2小时，13例妇女中有9例没有检测到血浆胎盘RNA。余下的受试者在分娩后2小时有大约66-97％的母体血浆胎儿RNA被清除。我们在所有血浆样本中均检测到GAPDH mRNA，从而证明了所述样本的质量(图4D)。没有观察到母体血浆GAPDH mRNA水平的系统性变化(Wilcoxon检验，P＝1.000)。
实施例3：先兆子痫妇女中母体血浆GAPDH mRNA的升高
在知情同意的条件下征募了在香港Prince of Wales医院妇产科看病的妊娠妇女。利用实施例1所述的标准来诊断先兆子痫。
A.方法
将母体血液样本放入肝素化的管中，并如实施例1所述来处理。提取血浆RNA，并如实施例1所述定量测定GAPDH mRNA的水平。
B.结果
与对照组比较，观察到先兆子痫组的母体血浆中的GAPDH mRNA浓度升高(图5)。对照组和先兆子痫受试者的母体血浆GAPDH mRNA水平的中位值分别为70pg/ml和281pg/ml。该差异具有统计学显著性(Mann-Whitney检验，p＜0.005)。
C.结论
母体血浆GAPDH mRNA是一种新的非侵袭性的先兆子痫标志物。
实施例4：非整倍性妊娠妇女的母体血清中的hCG mRNA浓度
A方法
通过实时定量RT-PCR对来自2003年1月至8月间研究的141例妊娠妇女的头三月妊娠血清样本中的βhCG mRNA浓度进行了检测。对所有被研究的受试者进行了用于胎儿染色体组型分析的绒毛膜取样(CVS)。在即将CVS之前收集所有母体的血液样本。将血液样本放入清洁的管中，并在4℃下以1600xg离心10分钟。随后将血清转移至清洁的聚丙烯管中。立即将3.2mL血清放入4mL Trizol中并在-80℃保存直到进行RNA提取。如上所述，通过改良的RNeasy RNA Mini试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)从1.6mL血清中提取血清RNA(Ng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100：4748-4753，2003)。用30μL无RNase酶的水来洗脱总RNA，并在-80℃下保存。进行DNase酶(RNase-Free DNase Set，Qiagen，Hilden，德国)处理来去除任何污染性的DNA。
根据Ng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100：4748-4753，2003所述，利用一步实时定量RT-PCR对βhCG mRNA进行定量分析。以25μL的反应体积进行所述的RT-PCR反应。所用的引物和荧光探针的浓度分别为300nM和100nM。用6μL提取的血清RNA进行扩增。用于所述分析的温度方案如下：为了使所包含的尿嘧啶N-糖基化酶发挥作用，将反应在50℃引发2分钟，随后在60℃进行反转录30分钟。在95℃变性5分钟后，进行40个循环的以下PCR：94℃变性20秒，并在57℃退火/延伸1分钟。Ng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100：4748-4753，2003已经确立了所述分析的灵敏度、线性度和精确度。在所述反应混合物中仅可检测到少至100拷贝的所述合成寡核苷酸。血清hCGβRNA浓度以拷贝/mL血清表示。因没有进行恢复试验，所报告的浓度(拷贝/mL)为最低的估计值。
在所征募的149例妊娠妇女中，15例妇女怀有21号染色体三体性胎儿，11例怀有18号染色体三体性胎儿。余下的123例怀有整倍体胎儿，并用作对照。对照组的妊娠龄的中位值为12.5周(范围：11.2-14.3周)。怀有21号染色体三体性和18号染色体三体性胎儿的妊娠龄的中位值分别为12.5周(范围：12.1-14.2周)和12.3周(范围：11.4-14.1周)。在三组中没有发现妊娠龄的显著差异(Kruskal-Wallis，P＝0.706)。
B.结果
对149例母体血清样本的hCGβmRNA进行了定量分析。在149例妊娠妇女中有140例(94％)的母体血清中能检测到hCGβmRNA。在对照组中，hCGβmRNA的检出率为96.7％(123例中有119例)。在21号染色体三体性和18号染色体三体性组中，检出率分别为93.3％(15例中有14例)和63.6％(11例中有7例)。此三组的血清hCGβmRNA浓度的中位值分别为：对照组6108拷贝/mL(四分位数间距为：2867到19249拷贝/mL)，21号染色体三体性组为13165拷贝/mL(四分位数间距为：4403到25265拷贝/mL)，而18号染色体三体性组为652拷贝/mL(四分位数间距为：0到11662拷贝/mL)(图6)。此三组中hCGβmRNA浓度的中位值差异是统计学显著的(Kruskal-Wallis，P＝0.024)。进行配对多重比较，显示18号染色体三体性组和对照组间存在显著差异(Dunn′s检验，P＜0.05)，且18号染色体三体性组和21号染色体三体性组间存在显著差异(Dunn′s test，P＜0.05)。由于样本数量有限，在21号染色体三体性组和对照组的血清hCGβmRNA浓度之间没有观察到统计学显著的差异(Dunn′s检验，P＞0.05)。但是，如果扩大样本规模，将会产生统计学显著的差异。
C.结论
此研究证明，在头三月妊娠妇女的血清中可容易和明显地检测到循环hCGβRNA，并具有94％的检测率。这些数据证明，18号染色体三体性妊娠妇女中血清hCGβmRNA浓度的中位值约为对照妊娠妇女的浓度中位值的10％，并观察到统计学显著的差异。另一方面，尽管21号染色体三体性妊娠妇女的血清hCGβmRNA浓度的中位值为对照妊娠妇女的浓度中位值的2.2倍高，但由于样本数量有限没有观察到统计学显著的差异。这种统计学显著的差异有望在较大规模的研究中出现。这些数据首次证明在18号染色体三体性妊娠妇女的头三月妊娠期血清中的循环hCGβmRNA浓度显著降低，而在21号染色体三体性妊娠妇女中所述循环hCGβmRNA浓度升高。
这些数据表明，循环hCGβRNA作为标志物用于预测例如18号染色体三体性和21号染色体三体性的非整倍性妊娠的诊断作用。此研究观察到在18号染色体三体性组与对照组的hCGβmRNA浓度之间有重叠。这暗示如果将母体血清hCGβmRNA检测作为唯一的18号染色体三体性妊娠预测方法可能会导致相对较低的灵敏度和特异性。可将诸如hPL、hCRH、KiSS-1、TPFI2和PLAC1的其它标志物与hCGβ联合使用，从而增加诊断的灵敏度和特异性。
实施例5：母体血浆中的胎盘mRNA的鉴定
A.方法
本研究分两个阶段进行。首先，利用寡核苷酸芯片(Oligonucleotidemicroarrays)对头三月和末三月妊娠妇女的胎盘组织基因表达谱进行系统鉴定。其后，以实时定量反转录聚合酶链式反应(QRT-PCR)为基础，发展了多种分析方法用来检测母体血浆中6条已鉴定的胎盘表达的基因。对所研究的RNA转录本，评价了其在母体血浆中的可检测性，以及其在血浆和胎盘组织中的水平的相关性。此研究采用的所有胎盘和血液样本均是在知情同意的前提下从单胎简单妊娠的健康妇女中收集的，这些妊娠妇女在香港Prince of Wales医院妇产科看病。
胎盘基因表达谱的鉴定
利用在流产前或选择性剖腹产分娩后即刻进行的绒毛膜取样(CVS)获得头三月(妊娠龄范围：9-12周)和末三月(妊娠龄范围：38-40周)妊娠期胎盘组织样本各5例。收集后立即将所述胎盘组织样本放入于RNAlaterTM(
，Austin，TX)中并在-80℃保存，直到进行RNA提取。收集组织的同时收集6mL外周血，并放入PAXgeneTM Blood RNA管中(PreAnalytiX，Hombrechtikon，瑞士)。
根据制造商的说明书利用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)从胎盘组织提取总RNA，并用RNeasy mini-试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)进行纯化。根据制造商的说明书利用PAXgeneTM Blood RNA试剂盒(PreAnalytiX，Hombrechtikon，瑞士)从外周血中提取总RNA，此过程包括DNase处理步骤(RNase-Free DNase Set，Qiagen，Hilden，德国)。
对于每种样本，根据制造商的说明书，标记10微克提取的RNA并将其与
Human Genome U133A芯片(Affymetrix，Santa Clara，CA)进行杂交。杂交后，在
Fluidics Station 400(Affymetrix，Santa Clara，CA)中对每块芯片进行洗涤和染色。将所述芯片用GeneArrayScanner(Affymetrix，Santa Clara，CA)进行扫描，并用
Microarray Suite 5.0(Affymetrix)进行分析。
通过实时QRT-PCR对母体血浆中的胎盘表达的RNA转录本进行定量评价
从10例头三月和10例末三月妊娠妇女收集配对的胎盘和母体全血样本。同时也征募了10例妊娠妇女在分娩前后的外周血样本。如上所述处理胎盘组织。将12mL血液样本收集到EDTA管中，并在4℃以1600×g离心10分钟。随后将血浆小心地转移至清洁的聚丙烯管中。将所述血浆样本在4℃以16000×g再次离心10分钟，并将上清收集到新的聚丙烯管中。如Ng.et al.，Clin.Chem.，48：1212-1217，2002中所述从母体血浆中提取RNA。进行DNase处理(RNase-Free DNase Set，Qiagen，Hilden，德国)来去除污染的DNA。
本研究集中于对从胎盘芯片基因表达谱中鉴定出的6条胎盘表达的mRNA转录本的评价，所述mRNA包括人胎盘催乳素(hPL)、人绒毛膜促性腺激素β亚基(βhCG)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、组织因子途径抑制剂2(TPFI2)、KiSS-1转移抑制因子(KISS 1)和胎盘特异1(PLAC1)。作为对照，进行了两种非胎盘特异转录本——甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和β-血红蛋白(β-球蛋白)mRNA的定量分析。
用于检测GAPDH、hPL、hCGβ和CRH mRNA的QRT-PCR分析如上所述(Ng.et al.，Clin.Chem.，48：1212-1217，2002；Ng et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA，100：4748-4753，2003；和Ng et al.，Clin.Chem.，49：727-731，2003)。TFPI2分析的引物序列为5’-ACAAATTTCTACACCTGGGAGGC-3’(正义)和5’-CGGCAAACTTTGGGAACTTTT-3’(反义)，且双标记荧光探针为5’-(FAM)TGCGACGATGCTTGCTGGAGGA(TAMRA)-3’。FAM与TAMRA分别代表6-羧基荧光素和6-羧基四甲基若丹明(rhodamine)。用于KISS1定量分析的引物序列为5’-GCCCAGGCCAGGACTGA-3’(正义)和5’-GCCAAGAAACCAGTGAGTTCATC-3’(反义)，且双标记荧光探针为5’-(FAM)CCTCAAGGCACTTCTAGGACCTGGCTCTTC(TAMRA)-3’。PLAC1分析的引物序列为5’-ATTATCCCCAGCTGCCAGAA-3’(正义)和5’-GCAGCCAATCAGATAATGAACCA-3’(反义)，且双标记荧光探针为5’-(FAM)AAGAAATCCTCACTGGACGGCTTCCTG(TAMRA)-3’。β-球蛋白分析的引物序列为5’-GCTGCACTGTGACAAGCTGC-3’(正义)和5’-GCACACAGACCAGCACGTTG-3’(反义)，且所述荧光探针为5’-(FAM)CGTGGATCCTGAGAACTTCAGGCTC(TAMRA)-3’。
以1×106拷贝至10拷贝的浓度对Bustin et al.，J.Mol.Endocrinol.，25：169-193，2000(Genset Oligos，新加坡)所述的高效液相色谱纯化的单链合成DNA寡核苷酸进行系列稀释来制作用于hPL、βhCG、CRH、TPFI2、KISS1、PLAC1和β-球蛋白mRNA定量分析的校准曲线，所述寡核苷酸对各自的扩增子特异。用于hPL、βhCG和CRH校准品的合成DNA寡核苷酸序列如上所述(参见Ng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100：4748-4753，2003和Ng et al.，Clin.Chem.，49：727-731，2003)。用于TPFI2、KISS1、PLAC 1和β-球蛋白校准品的合成DNA寡核苷酸序列分别为5’-CGCCAACAATTTCTACACCTGGGAGGCTTGCGACGATGCTTGCTGGAGGATAGAAAAAGTTCCCAAAGTTTGCCGGCTG-3’、5’-CTGCCCAGGCCAGGACTGAGGCAAGCCTCAAGGCACTTCTAGGACCTGGCTCTTCTCACCAAGATGAACTCACTGGTTTCTTGGCAG-3’、5’-ACAAATTATCCCCAGCTGCCAGAAGAAGAAATCCTCACTGGACGGCTTCCTGTTTCCTGTGGTTCATTATCTGATTGGCTGCAGG-3’和5’-TGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGATCCTGAGAACTTCAGGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGG-3’。除GAPDH mRNA以外，对胎盘组织和母体血浆中所有转录本的绝对浓度分别以拷贝/ng总胎盘RNA和拷贝/mL血浆的形式表示。通过系列稀释人总RNA来制作用于GAPDH定量分析的校准曲线(Ng.et a1.，Clin.Chem.，48：1212-1217，2002)。
根据制造商的说明书(EZ rTth RNA PCR试剂套装，AppliedBiosystems，Foster City，CA，美国)，以50μL的反应体积进行QRT-PCR反应。应用联合的温度循环仪和荧光检测仪(ABI Prism 7700，AppliedBiosystems，Foster City，CA，美国)来进行QRT-PCR分析。GAPDH、hPL、βhCG和CRH的QRT-PCR分析的反应条件如上所述(Ng.et al.，Clin.Chem.，48：1212-1217，2002；Ng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100：4748-4753，2003；及Ng et al.，Clin.Chem.，49：727-731，2003)。对于其它的三种转录本，TPFI2和β-球蛋白所用的PCR引物(Geneset Oligos，新加坡)的浓度为200nM，KISS1的引物浓度为300nM，而PLAC1的引物浓度为400nM。TFPI2所用的荧光探针(Applied Biosystems，Foster City，CA，美国)的浓度为80nM，KISS1的荧光探针浓度为150nM，PLAC1的荧光探针浓度为200nM，而β-球蛋白的荧光探针浓度为300nM。在进行QRT-PCR之前，根据制造商的说明书利用DNase I消化(Invitrogen，Carlsbad，CA)去除提取的胎盘组织RNA中的污染性的DNA。用0.4ng提取的胎盘RNA和6μL提取的血浆RNA进行扩增。在每个分析中包括多个阴性水空白。
用于TPFI2、KISS1、PLAC1和β-球蛋白mRNA分析的温度方案如下：为了使所包含的尿嘧啶N-糖基化酶发挥作用，将反应在50℃引发2分钟，随后在60℃进行反转录30分钟。在95℃变性5分钟后，进行40个循环的以下PCR：92℃变性15秒，对PLAC1在56℃、对TPFI2和KISS1在57℃以及对β-球蛋白在58℃退火/延伸1分钟。
利用Sigma Stat 2.03软件(SPSS)进行统计学分析。
B.结果
通过对胎盘组织和配对的母体血液样本的高密度寡核苷酸芯片分析来鉴定胎盘特异的基因
通过对每个受试者的组织样本进行芯片分析得到5例头三月CVS和5例末期胎盘的基因表达谱。在所述的CVS样本和末期胎盘中发现分别有总计7226和8871基因转录本表达。以往有报道，正常个体血浆中的循环DNA以造血细胞来源为主(Lui et al.，Clin.Chem.，48：421-427，2002)。因此，假定母体血浆中的大部分背景母体核酸也源自造血室。由于本研究的最终目的是鉴定母体血浆的循环RNA分子中的胎儿特异的胎盘表达转录本，因此本发明者进一步获取了配对母体全血的基因表达谱，并使用
Microarray Suite 5.0软件(Affymetrix)将这些表达谱与对应的胎盘组织的表达谱进行比较。在所有5例对比中，选择与对应的全血样本相比所述CVS组织中表达水平“增加的”转录本，鉴定了早期妊娠中胎儿特异的胎盘表达转录本。类似地，与配对的母体全血样本进行比较，从末期胎盘中鉴定出了晚期妊娠的胎儿特异转录本。这些步骤之后，排除在胎盘组织和母体血细胞中表达均较高的转录本，从而对所述头三月和末三月妊娠得到分别为1245和1743个鉴定转录本的组。随后根据所述5例CVS或5例末期胎盘组织的芯片表达信号的中位值(参见附表A和B中分别对早期和晚期妊娠所列的50条较高表达的转录本)对这两组转录本以降序归类。所产生的这两组含有作为胎儿特异标志物在母体血浆中具有潜在可检测性的候选转录本。图1总结了鉴定这种胎儿特异标志物的策略。前述可在母体血浆中检测到的三种mRNA转录本hPL、βhCG和CRH出现在列表中，为这种方法提供了独立的证明。然而，因以往的研究没有包括在所述胎盘和母体血浆中所述基因表达水平的信息，因此在进一步的分析中同时包括了这三种转录本和在所述列表中鉴定的三种新标志物TFPI2、KISS1和PLAC1。为比较胎盘组织和母体血浆间的相关基因表达谱，选择了所述列表中不同位置的转录本。表1总结了这6种转录本的芯片表达信号强度的中位值。首先将所有阵列的总强度的均缩放至目标强度值500，每种转录本的信号强度则按比例进行缩放，，并确定了5例CVS和5例末期胎盘组织中按比例缩放的转录本强度的中位值。
用于检测母体血浆中胎盘表达的转录本的实时QRT-PCR分析的开发
使用6个一步实时QRT-PCR分析。通过QRT-PCR对10例头三月和10例末三月妊娠妇女的配对胎盘组织和血浆样本中的6种所选胎盘mRNA转录本进行定量分析。在所有病例的胎盘组织中均能检测到所述的6种转录本。这些转录本在头三月和末三月妊娠期的母体血浆中的可检测性和浓度的中位值总结在表1中。这些结果表明，所选的通过芯片分析鉴定的胎盘表达基因转录本中的大部分的确能在母体血浆中检测到。一般说来，具有较高芯片信号强度中位值的转录本在母体血浆中更容易被检测到。相反，对这6种被研究的胎盘表达基因中丰度最低的转录本观察到零拷贝的母体血浆浓度中位值，即PLAC1在头三月妊娠期及hCGβ与PLAC1在末三月妊娠期。因此，这些数据表明，如果在母体血浆中能够明显检测到胎盘表达的转录本，则表明所述表达水平超过了芯片信号的阈值。
分娩后母体血浆中胎盘表达的转录本的清除
如果所研究的转录本是妊娠特异的，则预计其应当在分娩后从母体血浆中清除。如以往研究(Ng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100：4748-4753，2003；和Ng et al.，Clin.Chem.，49：727-731，2003)所述，分娩后hPL和CRH mRNA分子从母体血浆中快速清除。为探讨TFPI2、KISS1和PLAC1 mRNA从母体血浆中的清除，在分娩前和分娩后24小时从10例妊娠妇女获取血浆样本。在所述分娩前的血浆样本中，TFPI2和KISS1 mRNA浓度的中位值分别为112拷贝/mL和88拷贝/mL。两种转录本在任何分娩后的血浆样本中均未检测到(图8A和图8B所示分别为TFPI2和KISS1 mRNA)。对于PLAC1 mRNA，在10例分娩前的血浆样本中检测到4例，而在任何产后样本中均没有检测到信号(图8C)。作为对照，在所有分娩前和分娩后的血浆样本中均能检测到GAPDH mRNA，而且其浓度没有系统改变(Wilcoxon检验，P＝0.563)。
在母体血浆中用mRNA分析对非侵袭性胎盘基因表达谱进行确认
通过检测母体血浆中的胎盘转录本水平可间接检测胎盘中的基因表达水平，从而寻找直接的证据。通过QRT-PCR对来自10例头三月和10例末三月妊娠妇女的配对胎盘和血浆样本进行hPL、hCGβ、CRH、TFPI2、KISS1和PLAC1 mRNA分析。如果这些转录本在母体血浆中的水平确实反映了其在胎盘中的对应水平，那么就应该能在这些转录本在胎盘和母体血浆中的相对浓度之间观察到阳性相关性。一种表达这些转录本的相对水平的可行方式是将其水平相对普通的胎盘特异转录本进行标准化。因hPL mRNA在妊娠全程中均能检测到(Ng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100：4748-4753，2003)，因此选择hPL mRNA作为参考。通过将每一胎盘或血浆样本中的转录本水平除以同一样本中对应的hPL mRNA的水平，来计算每种转录本的标准化水平。只对能在母体血浆中检测到的转录本进行比较。因在所有现有的头三月和末三月妊娠期母体血浆系列样本中分别没有检测到PLAC1和hCGβ，因此没有将其包括在对应的分析中。图9A和图9B显示了胎盘和配对母体血浆中hCGβ、CRH、TFPI2、KISS1和PLAC1 mRNA的标准化转录本水平的图象。在头三月妊娠期(Spearman相关性分析，r＝0.452，P＜0.05)和末三月妊娠期(Spearman相关性分析，r＝0.661，P＜0.05)的胎盘和母体血浆结果中均观察到阳性相关性。作为对照，也分析了两种非胎盘特异的mRNA转录本：对末三月样本分析了β-球蛋白，对头三月和末三月样本均分析了GAPDH。如图9A和9B所示，这些非胎盘特异转录本明显不依从所述胎盘特异转录本所表现出的相关性趋势。这些数据表明，从母体血浆检测到的所述胎盘特异mRNA的水平可用于评价胎盘的基因表达。
C.结论
开发了用于系统鉴定母体血浆中大规模的胎儿特异RNA标志物的策略(图7)。这一策略是在胎盘是母体血浆中循环胎儿RNA的重要来源，以及正常个体中血浆DNA的主要造血来源的发现的基础上设计的。用高密度寡核苷酸芯片来系统地鉴定大规模的胎盘表达转录本，以及选择用于母体血浆检测的潜在的胎儿特异的转录本，其中放弃将血细胞表达的基因作为潜在的靶标(附表A和B)。以往鉴定的编码hPL、hCGβ和CRH的三种血浆胎盘特异mRNA标志物出现在所述的靶标列表中，并为所述转录本的选择策略提供了独立的证明。此外，通过QRT-PCR在母体血浆中也检测到所述列表中给出的三种鉴定的mRNA标志物TFPI2、KISS1和PLAC1，并证明其胎盘组织表达水平高于某一阈值，而其在以往没有被发现可用于非侵袭性产前监测。分娩后其从母体血浆中快速清除证实了所述胎盘特异性。这些发现进一步验证了用于鉴定母体血浆中胎儿特异转录本的策略。
与所述的胎盘特异mRNA种类相对，没有观察到非胎盘特异转录本GAPDH和β-球蛋白的血浆和胎盘标准化mRNA水平间的相关性。与所述胎盘特异转录本相比，母体血浆中存在相对较多的GAPDH和β-球蛋白mRNA，其可以解释为由母体组织例如造血细胞来产生这种非胎盘特异转录本。
综上，本发明证明母体血浆中的循环胎盘mRNA可用于妊娠的检测以及非侵袭性产前基因表达谱的检测。本发明还对快速、系统地鉴定用于此目的的新胎盘mRNA标志物的以芯片为基础的方法进行了概述。这种开发对于产生新的用于研究和监测已知与胎盘病理学有关的诸如21号染色体三体性和先兆子痫的疾病状态的标志物具有特殊的意义。此外，本发明的发现对非妊娠相关的疾病也有意义。例如在癌症患者的血浆/血清中已经发现了肿瘤相关的mRNA(参见，例如Lo et al.，Clin.Chem.，45：1292-1294，1999；和Silva et al.，Gut.，50：530-534，2002)，可利用相似的方法来快速产生新的血浆RNA为基础的肿瘤标志物。
本申请将所引用的全部专利、专利申请以及出版物全文引入作为参考。
表1A CVS样本的芯片结果和头三月妊娠期的母体血浆中六种所选胎盘转录本的QRT-PCR结果的总结
表1B末期胎盘组织的芯片结果和末三月妊娠期母体血浆中六种所选胎盘转录本的QRT-PCR结果的总结
附表A.在CVS组织中50种较高表达的基因的芯片检测结果
附表B在末期胎盘组织中50个较高表达基因的基因芯片检测结果
Claims (4)
1.用于检测妇女妊娠的试剂盒，包括：
(i)用于定量测定所述妇女血液中一种或多种mRNA的PCR引物，其中所述的mRNA独立地选自编码人绒毛膜促性腺激素β亚基(hCG-β)、人促肾上腺皮质激素释放激素(hCRH)、人胎盘催乳素(hPL)、KiSS-1转移抑制因子(KISS1)、组织因子途径抑制剂2(TPFI2)和胎盘特异1(PLAC1)蛋白的mRNA；及
(ii)代表正常非妊娠妇女血液中编码相同蛋白的mRNA的含量的标准对照。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述妊娠妇女的血液是无细胞的。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述妊娠妇女的血液是血浆。
4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述妊娠妇女的血液是血清。
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