CN101163800A - 鉴定生物的基因组dna的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了设备，所述设备可用于制备、扩增、检测和/或任意地选择以进行进一步分析来自生物的基因组材料以快速检测和/或分类样品中的生物的方法(例如，鉴定、定量和/或任选地进一步分析例如测序所述生物的基因组材料)。本发明还提供了使用所述设备的方法，例如和改进的新SGP引物一起用于DNA扩增的波形表征法。本发明的目的是提供用于基因组材料的完全自动化分析的设备和使用对社会有益的该设备的多种方法，例如可将所述设备用于筛查、鉴定、定量和/或选择基因组材料以进行进一步分析(例如测序)从而就污染性生物的存在监控源的方法。

Description

鉴定生物的基因组DNA的装置和方法
相关申请
本申请要求2005年2月18日提交的美国临时专利申请60/653,978的优先权，其在此以及其全文引用作为参考。
发明背景
发明领域
本发明涉及装置，所述装置可用于制备、扩增、检测和/或任意地选择以进行进一步分析来自生物的基因组材料以对样品中的生物进行快速检测和/或分类(例如，筛查、鉴定、定量和/或任选地进一步分析(例如测序)所述生物的基因组材料)。
相关背景技术
近年来的基础和创新发展已使生物技术方法变得更尖端且同时更复杂。例如，尽管已发展了许多有用的技术来减少DNA制备、扩增、检测和鉴定的方法的成本、简化和标准化所述方法，但在市场上没有已知的使用于DNA的筛选、定量、鉴定和/或进一步分析例如测序的这些方法的完全自动化的装置。
在生物技术学领域，存在对各种样品(例如，环境和医学样品)的生物例如细菌和病毒的快速检测和/或分类的需要。例如细菌的快速检测和随后种属和/或株系的分类，可能是为例如区域供水、医院或食品加工厂提供质量保证所必需的；即，就污染生物体的存在监控各种样品(包括但不限于空气、尘埃、水、血液、组织、植物、食品等样品)以及在由公众消费、暴露和/或使用之前或在由公众使用期间对所述污染性生物进行分类可能是必需的。
用于生物的检测和/或分类的标准微生物学方法，例如培养和革兰氏染色法或其他生化性质的检测是不精确的且通常不能区分不同的生物，更不用说生物的不同株系。用于检测和/或鉴定生物的更精确的方法基于所述生物的基因组DNA。一个这样的检测和/或鉴定(分类)的熟知方法是聚合酶链式反应(PCR)，该技术的发展已增加了其产出量和自动化的水平。
通过两个分开的和独特的(第一和第二)引物进行PCR，所述引物各自分别与在基因组DNA的两个模板的各模板上发现的核苷酸序列互补。因为所述两个引物的序列基于两个基因组DNA模板的序列，因此所述两个引物结合且包围所述双链基因组DNA的独特和分离的基因座。使用这样的成对引物的PCR导致双链基因组DNA的指数扩增，所述双链基因组DNA与被与所述两个引物互补的核苷酸序列包围的基因组的独特和分离的基因座相同，即侧翼为一个基因组DNA模板上的3’末端上的第一引物结合位点和另一个基因组DNA模板上的3’末端上的第二引物结合位点的基因座。
PCR可用于检测少量的DNA，不仅因为其导致双链DNA的指数扩增，而且因为增加PCR产出量和自动化的水平的新技术的发展。一个这样的技术的实例是使用微流(microfluidic)系统，包括用于微流装置的控制器/检测器界面，如例如美国专利6,500,323和6,670,153中所描述的。这些微流系统，此处统称为自动化在线PCR平台(automated inline PCR platform)，在本领域是熟知的且在下面进行概述。
大多数自动化在线PCR平台使用与控制器/检测器界面一起工作的微流芯片以进行自动化上样(sample accession)、微流PCR试剂的混合(assembly)、PCR热循环和光学检测光谱学。微流芯片通常包含具有至少一个可结合至第二板的微蚀刻(micro-etched)流体(微流)在线反应槽的第一板，在所述第二板中可以有金属丝(metaltrace)和贮液池(fluidreservoi)。当两块板结合在一起形成微流芯片时，第一板的各微流反应槽可与第二板的贮液池连接，这样基因座特异性试剂可通过贮液池递送至微流在线反应槽。
通常，使用微流芯片的自动化在线PCR不在小室中发生；相反地，反应在样品沿微流在线反应槽和在其内流动时发生。当毛细管(或“吸浆管”)从例如微量滴定板(其可来自例如机械处理器)抽吸DNA样品滴(其可以是或不是DNA样品滴，即包含从生物分离的基因组材料的样品滴)入至少一个微量流在线反应槽时，在线PCR开始进行。在将样品滴抽吸入微流在线反应槽后，可将吸浆管移入缓冲液槽中，这样缓冲液就可被抽入微流芯片。从而，将样品滴之间的交叉污染减少至最少，因为各样品滴与紧邻的样品滴被缓冲液间隔物分开。然后将各样品滴沿微流在线反应槽移动并进入所述芯片的PCR装配区，其中所述样品滴通过与PCR所需的试剂例如引物对、DNA聚合酶和dNTP以及可检测试剂例如插入剂等混合变成样品塞(sampleplug)。任选地，也可将缓冲液间隔物与PCR所需的试剂混合以用作负对照。在与PCR所需的和可检测的试剂混合后，样品塞(其可以是或可以不是DNA样品塞，即包含基因组材料的样品塞)沿微流在线反应槽的长度方向流入芯片的不同区域例如扩增区域，在该区域中PCR可在该样品塞上进行。
一般地，当各样品塞(例如，DNA样品塞)流过微流在线反应槽时，其进入扩增区，即温度受控区，其中以局域化的方式重复地且快速地加热和冷却各微流在线反应槽，从而在各样品塞流过所述反应槽时对其进行PCR的变性、退火和延伸步骤。本领域技术人员将认识到，DNA的扩增只在DNA样品塞即包含基因组材料的样品塞中发生。控制扩增区中的温度的方法是焦耳加热法(Joule heating)(参见，例如，美国专利5,965,410和6,670,153)。一般地，可以受控和局域化的方式对金属丝施用电压以获得PCR各循环(即，变性、退火和延伸的各循环)所需的不同温度。可通过使用例如冷却流过螺旋管从而以热的形式从微流在线反应槽带走热能的流体，或通过使得能够快速扩散热量(例如通过对所述微流芯片的底面使用冷水)来实现反应的冷却。因为微流槽中的液体体积很小且金属丝非常靠近微流在线反应槽，因此槽内液体(从而，样品塞)的加热和冷却可非常快速地实现。结果，DNA样品塞进行PCR，且以在少于9分钟的时间内进行例如30个循环的方式进行PCR循环。各DNA样品通过芯片的温度控制区中的微流槽期间进行的PCR循环次数可通过改变1)对所述金属丝使用的电压时限和2)DNA样品塞通过微流槽的流速中的任一条件或两个条件来改变。
微流芯片可同时进行与其具有的微流在线反应槽一样多的聚合酶链式反应。例如，包含基因组材料的样品可被抽吸入多个不同的微流在线反应槽，所述各槽中加入了不同的基因座特异性试剂(例如，包围基因组材料例如DNA上的不同基因座的不同引物对)。这使得能够同时检测例如从相同生物体分离的基因组材料上几个不同的基因座。可选择地，可将包含一对特异性引物对的试剂抽吸入多个不同微流在线反应槽。这使得能够同时检测例如从不同生物体分离的基因组材料上的相同基因座。此外，可将多个样品滴抽吸入相同的微流反应槽。
检测区通常在温度受控扩增区的下游，且通常是允许观察和检测扩增的DNA产物例如PCR产物的透明区域。在检测区，通常将各微流在线反应槽紧靠检测器且在其下通过。光源扩散穿过微流在线反应槽，这样可同时测量通过光学检测区的可检测试剂，例如从各槽各DNA样品塞发射的荧光。在检测区之后，各微流在线反应槽通常将各样品塞导向废料孔。
通常使用3种不同的方法在微流在线反应槽内产生流体运动；所述方法包括电动法(electrokinetics)、压力或两者的结合(参见，例如，美国专利6,670,153)。在压流系统(pressure-based flowsystem)中，可使用内源或外源在在线反应槽内驱动流体流动。例如，可对各微流在线反应槽末端的废料孔施加真空和可将其用于启动吸浆管从而将流体沿着微流在线反应槽朝向废料孔运动。可选择地，因为基因组材料带电荷，因此可使用电动法即产生电压梯度(例如，通过对金属丝施加电压)来驱动带电流体沿微流在线反应槽运动。驱动流体沿所述在线反应槽流动的第3种方法使用电动力和压力。结果是微流在线反应槽内的流体的连续流动，其中样品塞(例如，DNA样品塞)被连续混合或流动至芯片的不同区域(例如，PCR装配区、温度受控区、检测区等)。
可通过在芯片上接合或与其连接的仪器(通常描述于美国专利6,582,576)控制涉及微流芯片的电动力和/或压力驱动的流体运动，加热和冷却循环，检测和数据获得。所述仪器的接口通常包含密封芯片上的试剂小孔的O型圈密封、可与芯片上的金属丝连接从而为温度循环提供电压的弹簧针(pogo pins)、用于废料孔的O型圈密封(在所述废料孔中可施用真空以使流体通过芯片)、可用于密封靠着循环冷却水的芯片底部和在温度循环期间加速冷却的大O型圈密封和用于例如荧光检测的检测区带。本领域技术人员认识到污染该系统的可能性最低，因为微流芯片通常是封闭的系统，物理屏障(例如，缓冲液间隔物)分开样品塞(例如，DNA样品塞)，且连续流动阻止了样品塞回流。
因为PCR(从而，自动化在线PCR平台)指数扩增DNA，因此其可用于检测少量的基因组材料。然而，因为PCR需要对于基因组材料的序列是特异性互补的引物(所述引物是已知的且包围目的基因座)，因此其限制在于其只可用于检测和分类已知的生物。换句话说，需要研究人员在检测所述生物的任何尝试之前知道或猜测生物的身份(即，用于使用的恰当引物对)。PCR(从而自动化在线PCR平台)的另一个限制是除了关于与用于分析的两个引物互补的序列的信息外，研究人员不能获得关于扩增的DNA的序列信号。此外，自动化在线PCR平台不能在DNA样品塞已通过微流在线反应槽的长度后提供进一步分析(例如测序)例如其中的基因组材料。进一步的分析，例如，提供基因组材料的序列可以是在例如区分病原体株系与非病原体株系、检测和提供新株系的序列等中是非常重要和有用的。
为克服PCR的一些限制，发展了波形表征方法(参见，例如，描述于日本专利申请公开号2003-334082和2003-180351的波形表征方法)。波形表征法，例如，描述于日本专利申请公开号2003-334082和2003-180351的方法，提供了分析和表征基因组材料例如从生物例如细菌分离的DNA的方法，而无需研究人员在检测之前已知或猜测所述生物的身份。简而言之，波形表征法通常使用独特引物和作为模板的基因组DNA的两条变性链线性扩增几个独特的形成高级结构例如三联体、四联体等的单链核酸聚合物来分析所述生物的基因组DNA。因为生物体的基因组DNA用作模板，因此所得的单链核酸聚合物将是独特的且包含对于该生物是唯一的序列。因此，单链核酸聚合物将形成基于对于生物是独特的序列的高级结构。因此，检测该独特的高级结构(可使用可检测试剂例如荧光插入剂来进行该检测)可鉴定所述生物。
通常使用特征在于其结构和长度的单一模式产生性波形引物(single pattern generative waveform primer)产生几种独特的单链核酸聚合物。波形引物(即波形表征引物(waveform-profilingprimer))通常由两部分组成，即非特异性稳定性部分和特异性部分。如下面所述，非特异性稳定部分可帮助指导高级结构的形成。相反地，特异性部分指导所述波形引物特异性结合对于其自身序列是互补的序列。波形引物的长度(例如，长度为8-30个碱基)通常是至关重要的，因为其允许该引物的特异性部分特异性地结合基因组DNA模板上分开的几个引物结合位点，即，对于该波形引物是互补的序列。波形引物对沿着各单链基因组DNA模板的几个引物结合位点的结合使得能够产生几个独特的单链核酸聚合物，该聚合物的产生通常对于该方法是至关重要的。
除了使用波形引物外，该波形表征法也使用几个循环的线性扩增来提供多拷贝的几种独特的各单链核酸聚合物；因此，在线性扩增的第一个循环之前向包含目的基因组DNA的溶液中加入许多拷贝的波形引物。类似于(至少总体上)PCR，线性扩增的一个循环包括下列步骤：1)使双链基因组DNA的各拷贝变性成两个单链基因组DNA模板，2)将所述波形引物退火(即，提供允许结合的条件)至各单链基因组DNA模板上的几个分开的引物结合位点和3)从结合至各基因组DNA模板的引物结合位点的几个波形引物的各引物延伸几个独特的单链核酸聚合物。
在线性扩增的一个循环期间，升高基因组DNA的温度(例如，至95-98℃)以使所述基因组DNA的各拷贝变性成两条单链基因组DNA模板。然后降低温度(例如，至25℃)以使波形引物能够结合沿各变性基因组DNA模板的长度分布的几个分开的引物结合位点。循环的最终步骤，在大约72℃下，使用聚合酶例如Taq聚合酶从各结合的波形引物延伸几个独特的单链核酸聚合物。在该最终步骤后，重复循环。
在下一个变性步骤期间，从基因组DNA模板变性所述几个独特的核酸聚合物，从而使之变成单链核酸聚合物，其中各单链核酸聚合物具有5’-至-3′的核苷酸序列，所述序列包含从其延伸所述单链核酸聚合物的波形引物的核苷酸序列，紧接着的是与所述基因组DNA模板区域的序列(位于结合波形引物的基因组DNA序列的下游)互补的独特核苷酸序列。因为各单链核酸聚合物在其5’末端包含波形引物序列，各单链核酸聚合物也包含该波形引物的非特异性稳定部分。所述波形引物的非特异性稳定部分通常指导各单链核酸聚合物形成高级结构，并有效地阻止该单链核酸聚合物在随后的扩增循环中结合任何波形引物。
换句话说，所述单链核酸聚合物在随后的扩增循环中不用作模板，且该波形表征法中的各扩增循环是线性的而非指数的，即扩增的各循环只产生单拷贝的几种独特的各单链核酸聚合物，该聚合物包含对于所述生物体是唯一的序列，即与结合至引物结合位点的波形引物的下游的基因组DNA模板的序列互补的序列。因此，和导致指数扩增的PCR相反，波形表征法通常导致线性扩增，即几种独特的包含对于所述生物是唯一的序列的单链核酸聚合物的非指数扩增。
各单链核酸聚合物包含与位于结合引物结合位点的波形引物的下游的基因组DNA模板的序列互补的碱基序列，因此可比较和区分存在于不同基因组DNA的多个位点上的碱基序列的差异。如上所述，几种独特单链核酸聚合物的各聚合物的多个拷贝相互之间相互作用形成高级结构，即，包含一条或多条单链的独特核酸聚合物的复合物(例如，三联体和四联体)。依赖于单链核酸聚合物的碱基序列，即基于生物的独特基因组信息，所述高级核酸结构具有不同的稳定性且在不同的解链温度(Tm)上解链。
波形表征法通常要求确定和记录使用特定生物的基因组DNA作为模板产生的各种不同高级结构的Tm(解链温度分析)；这可使用嵌入高级DNA结构的荧光剂即插入剂来实现。可通过增加样品的温度来解链由波形表征法产生的高级DNA结构。当高级DNA结构解链时，嵌入这些高级结构的荧光剂也解离。将通过这些高级结构解离获得的荧光强度的改变率作为不断增加的温度的函数作图，将产生对于所述生物的基因组DNA和使用的波形引物是独特的波型，即，观察和记录在不同解链温度(Tm)下高级DNA结构的解链，从而产生生物例如细菌的各种属(或株系)的特征“波形表征”。因此，通过使用解链温度分析和插入剂获得各生物的独特波形表征，可使用波形表征区分从第一生物分离的基因组DNA和从第二生物分离的基因组DNA。
因为上述方法(涉及波形表征)依赖于线性扩增，使用该方法的一个困难是需要大量起始量的来自被检测的和/或被鉴定的特定生物(例如，细菌)的基因组DNA。因此，只有当生物以大量数目(例如，106个或更多生物)存在于给定的样品中时才可使用波形表征法检测和鉴定生物，但在检测和/或鉴定非常少量的生物中是无效的。此外，类似于PCR，该方法的另一个限制是其不能提供关于基因组材料的详细信息，例如序列信息。
因此，波形表征法通常不用于检测和/或鉴定以少量数目存在于例如采自供水或刚发生污染的源的样品中的生物，或提供关于该生物的基因组材料的详细信息，例如序列信息。尽管PCR(从而在线自动化PCR平台)可解决需要大量起始材料的该波形表征法的限制(因为PCR导致基因组DNA的指数扩增从而允许检测少量数目存在的生物)，但在本领域已知使用由PCR扩增产生的DNA互补双链片段产生的波形表征不足以鉴定特定基因组序列(参见，例如，″Goodbye DNA Chip，Hello Genopattern for 21st Century，″由Adgene Co.，Ltd.印刷和发行)。同样，至今还没有已知的能够检测波形表征的自动在线PCR平台。换句话说，现有技术不仅明确地教导使用标准的PCR产物的解链温度(Tm)分析不可能比较、区分和鉴定基因组材料(来自不同的生物的种或株系)，其也不能提供提高波形表征的产出量和自动化水平的技术。
此外，尽管波形表征法可通过检测其基因组DNA来快速检测和/或分类生物，但这些方法以及PCR的方法和在线自动PCR平台，都受到限制，因为其不能提供关于基因组材料的详细信息，例如，如由测序芯片(参见，例如，美国公开专利申请No.2005/0009022)提供的序列信息。当相同生物的不同株系(其可以是使用例如特定的PCR引物对或波形引物未能检测的株系)之间的基因组差异使不同株系具有不同的病原性特征时，基因组材料的进一步检查，例如，序列信息的分析，在检测可对公共卫生产生更大的威胁的传染因子的新株系(例如，流感病毒的变体或生物武器的变体)等中可以是非常重要的。
如上所述，许多基本方法(例如，PCR、波形表征等)和创新技术发展(例如，自动在线PCR平台)已在生物的检测和/或分类领域中发生。尽管这些方法和发展正变得更复杂，其简化、标准化生物的检测和/或分类变得更方便，但本发明者知道没有同时提供所有这些方法和发展的自动化的本领域承认的仪器，即，允许进行PCR、波形表征、和/或任选地选择基因组材料以进行进一步分析(例如测序)的自动化在线平台。本发明通过提供这样的包含微流装置的仪器克服了该限制，所述仪器可通过自动化方法检测和/或分类(例如，筛选、定量、鉴定和/或任意地选择以进行进一步分析，例如测序)样品中的基因组材料(例如从生物(例如，细菌或病毒)分离的)，所述自动化方法包括制备(例如，分离、加工、与反应试剂混合等)、扩增(例如，通过PCR、波形表征等)、检测和/或任选意地选择以进一步分析例如测序。
发明概述
本发明的目的是提供用于基因组材料的完全自动化分析的仪器，即基因组材料的制备(例如，分离、加工、与反应试剂混合等)、扩增(例如，通过PCR和/或波形表征法)、检测(即，筛选、鉴定和/或定量)和任意地选择以进行进一步分析。本发明的另一个目的是提供使用对于社会有益的仪器的多种方法，例如所述仪器可用于筛选、鉴定、定量和/或选择基因组材料以进行进一步分析例如测序的方法。
使用本发明的仪器筛查样品和检测任何未知和潜在的污染生物，特别是作为连续(即，每天24小时，每周7天和每年365天)测量，例如作为反恐测量以监控公共供给例如水和空气供给及保持其安全，是非常重要的且是本发明的第一个方法。因为期望公共供给例如供水是安全的，因此这些供给的连续筛查可导致持续获得阴性数据，例如污染物的零检测，这使得连续筛查变得昂贵和似乎很繁琐。使用本发明的仪器检测遗传物质(即，污染物)的存在或不存在的益处是其相对低的连续筛查成本。
鉴定是使用本发明的仪器的另一种方法且常用于基因组材料的分析。因为本发明的仪器可用于检测由已知引物产生的扩增DNA产物和/或形成基于生物基因组材料的特征，使用本发明的仪器检测基因组材料存在或不存在的方法允许同时鉴定从其分离所述基因组材料的生物。此外，使用本发明的仪器和方法检测扩增产物的存在或不存在将允许鉴定是否不止一种污染生物存在于样品中。
在另一个实施方案中，本发明的仪器用于定量存在于样品中的基因组材料的量。这些定量可能用于测量例如疾病的进程、第一和第二生物的存在或不存在的数值差异等的进一步分析。
选择基因组材料以进行进一步分析例如测序的能力是本发明的最后一个(可选的)方法。本领域技术人员公认：当来自本发明的检测、鉴定和/或定量方法的结果显示污染性生物产生了严重威胁时，可能需要进一步分析。
提供波形表征基因组材料的改进方法也是本发明的另一个目的。所述基因组材料分离自样品中的生物，即使所述生物以少量存在于样品中。改进的波形表征法可与本发明的仪器一起使用。
因此，本发明提供了允许自动化在线检测通过PCR和/或波形表征法(包括本发明的波形表征的改进方法)扩增的基因组材料的仪器，也提供了对随后选择以进行进一步分析例如对被检测的基因组材料进行测序的选择。
特别地，本发明涉及能够产生和检测通过波形表征法产生的扩增的DNA产物的微流系统，即在线自动化平台。
此处所述的微流系统导致可与PCR或波形表征法或与两者以及任选地与DNA分析的其他方法例如测序方法一起使用的新的在线自动化平台。本发明也提供了对波形表征法的新改进，以使得可整合PCR的改进形式从而允许表征少量起始量基因组材料的波形。此外，本发明提供了使用本发明的在线自动化平台即包含此处提供的装置的仪器制备、扩增、检测(例如，筛查、定量、鉴定)和/或任意地选择以进行进一步分析(例如，序列分析)从样品中的生物分离的基因组材料的方法。本领域技术人员承认本发明的自动化在线平台、改进的波形表征法和使用本发明的自动化在线平台(例如，使用改进的波形表征法)的公开方法将允许连续检测(例如筛查、鉴定、定量)和/或选择以进一步分析(例如，测序)生物的基因组材料，即使所述生物以少量数目(例如存在于刚开始污染的供水或其他源的样品中的生物数量)存在。
这样，本发明涉及微流装置，所述装置允许检测扩增的DNA产物(例如PCR扩增的产物、波形表征的高级结构等)和使被检测的DNA任选地被选择用于进一步分析例如进行序列分析。在本发明的一个实施方案中，本发明的在线自动化微流装置包含微流在线反应槽，当该微流在线反应槽进入所述装置的检测区时，其位于第二温度控制区内。该第二温度控制区中的微流反应槽的安装不仅使得能够检测PCR扩增的产物，而且也能够在所述高级结构核酸聚合物在第二温度控制区内不同解链温度下解链时检测用波形表征法(或其改进的方法，如此处和美国专利临时申请No.60/591,596中所解释的，此处引用作为参考)产生的高级结构核酸聚合物，即允许进行解链温度分析。
这样本发明提供了包含至少一个吸浆管(sipper)、至少一个连接至至少一个微流在线反应槽的贮液池的微流装置，其中所述至少一个微流在线反应槽通过试剂装配区、第一温度控制区的扩增区和第二温度控制区内的检测区，以及至少一个用于加热微流在线反应槽中的流体和/或使其流动的金属丝，其中可在不止一个温度下进行扩增DNA产物的检测(即，在一个或多个温度下进行检测)。
在本发明的另一个实施方案中，微流槽在检测区的下游包含“阀门”，这样可确定通过“阀门”的DNA样品塞是否被抽吸入例如废料孔或选择用于进一步分析，例如使用DNA测序芯片进行分析。
这样本发明提供了微流装置，其包含至少一个吸浆管、至少一种连接至至少一个微流在线反应槽的贮液池，其中所述至少一个微流在线反应槽通过试剂组装区、扩增区和检测区，且其中所述至少一个微流在线反应槽还在检测区的下游包含阀门；和至少一个用于加热所述微流在线反应槽中的流体和/或使其流动的金属丝。
本发明也提供了微流装置，其包含至少一个吸浆管、至少一个连接至至少一个微流在线反应槽的贮液池，其中所述至少一个微流在线反应槽通过试剂组装区、第一温度控制区内的扩增区和第二温度控制区内的检测区，且其中所述至少一个微流在线反应槽还在检测区的下游包含阀门；和至少一个用于加热所述微流在线反应槽中的流体和/或使其流动的金属丝，其中可在不止一个温度下进行扩增的DNA产物的检测。
此外，本发明涉及能够在本发明的微流装置中控制流体运动、加热和冷却本发明的微流装置的第一和第二温度控制区以及从本发明的微流装置获得数据的仪器(即，控制器/检测器)。这样，本发明提供了在本发明的微流装置中控制流体流动、加热和冷却所述微流装置以及从其获得数据的仪器，在本发明的所述仪器和微流装置之间的交界处包含盒式贮存器(cartridge)。在一个实施方案中，所述仪器在第二温度控制区内建立、监测、控制和检测扩增产物。在本发明的另一个实施方案中，所述仪器能够确定是将阀门处的样品塞导入废料孔还是选择用于进行进一步分析例如测序。
本领域技术人员认识到，上述装置和仪器不仅用于高通量自动化在线PCR，而且也可用于高通量波形表征和/或任选地进一步的分析方法，例如DNA测序。
本发明的微流装置和仪器可一起工作，从而提供用于PCR或波形分析法或用于两者以及任选地例如序列分析的自动化在线平台。这样，本发明也提供了包含本发明的微流装置和本发明的仪器的设备。此外，所述设备还可在本发明的仪器和微流装置之间的交界处包含盒式贮存器；该贮存器在本领域内是熟知的。
此外，本发明涉及波形表征的改进的方法，此处统称为单基因组表征(Single Genome Profiling)(SGP)。SGP需要使用用于扩增几种独特的“SGP核酸聚合物”的引物(“SGP引物”)。SGP引物的特征在于其长度和能够特异性结合沿着基因组DNA的长度分布的几个分开的位置的能力。因为SGP引物不包含非特异性稳定部分，所以SGP核酸聚合物(从结合至例如单链基因组DNA模板上的几个分开的SGP引物结合位点的本发明的SGP引物延伸的)可在随后的扩增反应中自由结合SGP引物。因为SGP引物特异性地与沿着单链SGP核酸聚合物的长度的核苷酸序列互补，因此SGP引物(在PCR的改进形式，即，“mPCR”中)也用作正向和反向引物，从而允许几种独特的“SGP-SGP核酸聚合物”扩增，所述聚合物各自包含与基因组DNA的几个区域中的一个区域的序列同一的核苷酸序列，所述基因组DNA的区域是由SGP引物结合位点包围的区域，即各SGP-SGP核苷酸聚合物序列在其5′末端具有SGP引物和在其3′末端具有SGP引物的反向互补序列。因此，包含SGP引物和所述SGP引物的反向互补序列的几种独特SGP-SGP核酸聚合物的扩增以指数(非线性)方式发生，从而使得能够使用本发明检测和鉴定(分类)生物的基因组DNA，即使所述生物以少量数目存在。本领域技术人员将认识到在将本发明用于基于RNA的基因组(例如，逆转录病毒的基因组)中时，应当在开始SGP和相关的mPCR循环之前进行逆转录反应。
本发明也提供了与最终扩增步骤结合的“半时长延伸步骤”。在本发明中，和最终扩增步骤相关的延伸步骤的时间长度包括时间的减少(优选地时间长度的减少为大约40-60％；更优选地时间长度的减少为大约50％)，从而在最终扩增循环中导致“半时长”延伸步骤。该半时长延伸步骤通常消除许多SGP-SGP核酸聚合物的指数扩增，因为没有足够的时间进行从SGP引物至该SGP引物的反向互补序列的核酸聚合物的延伸。因此，在半时长步骤中从SGP-SGP核酸聚合物产生SGP核酸聚合物的缩短的形式(“缩短的SGP核酸聚合物”)。本领域技术人员将认识到，通过在几轮使用PCR的改进形式即mPCR的指数扩增后进行该半时长延伸步骤，可产生许多拷贝的各缩短的SGP核酸聚合物。此外，在随后的变性步骤中，所述缩短的SGP核酸聚合物将变为单链。最后，该缩短的单链SGP核酸聚合物形成在用mPCR实施本发明中检测到的高级结构。
本发明也提供了用于改进的方法的引物和制备这些引物的方法以及使用指数扩增和减少波形表征法的可变性的方法。
本发明也提供了就污染性生物的不存在或存在连续监控样品或系列样品以及随后任选地对污染性生物进行分类的方法。在本发明的方法中，本发明的自动化在线平台用于制备(例如分离、加工、与反应试剂混合等)、扩增(例如，通过PCR、波形表征等)和检测(例如，筛查、鉴定、定量)和/或任意地选择以进行进一步分析(例如测序)从生物分离的基因组材料。一般地，使用本发明的设备的方法包括从生物分离基因组材料(如果存在于样品中)的步骤，用吸浆管从所述样品抽吸样品滴至本发明的微流装置的微流在线反应槽内，和通过将样品滴与引物混合形成样品塞。然后所述样品塞沿微流在线反应槽流入本发明的微流装置的扩增区，即第一温度控制区，其中所述样品塞接受至少一次包含变性、退火和延伸的扩增循环。然后该样品塞进入本发明的微流装置的检测区，该区也可以是第二温度控制区。在使用波形表征法的实施方案中，该检测区也是第二温度控制区，这样其可使各扩增的DNA样品塞从第一温度转至第二温度，此时在第一和第二温度之间变化的温度上检测到各样品塞中的可检测试剂。在一些实施方案中，样品塞由不混溶的非水流体(例如，矿物油)包围，这样在其被抽吸时可进一步防止污染(例如交叉污染)。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了在样品中确定生物的方法，该方法包括步骤：(a)获取样品；(b)分离至少一个拷贝的生物的基因组DNA(如果存在于样品中)；(c)将包含SGP引物、核苷酸、DNA聚合酶和插入剂的第一混合物加入生物的基因组DNA，从而形成第二混合物；(d)加热第二混合物至第一温度，该温度将使基因组DNA(如果存在)变性为第一和第二基因组DNA模板；(e)冷却第二混合物至可使所述引物退火至各基因组DNA模板的第二温度；(f)再加热第二混合物至在所述第一和第二温度之间的第三温度，从而使引物保持对基因组DNA的退火和使DNA聚合酶从该退火的引物开始延伸核酸聚合物；(g)保持第三温度进行第一时间长度；(h)重复步骤(d)-(g)至少一次；(i)重复步骤(d)-(f)；(j)保持第三温度进行大约为第一时间长度的40-60％的第二时间长度；(k)再次冷却第二混合物至低于或等于第二温度的第四温度以使能够形成包含插入剂的高级结构；(l)检测所得的高级结构；(m)进行解链温度分析；(n)检测波形表征；和(o)确定来自样品的阳性波形表征，如果所述样品包含所述生物。在另一个实施方案中，保持第三温度进行为第一时间长度的大约40-60％(例如，50％)的第二时间长度。在另一个实施方案中，步骤(h)中重复的步骤(d)-(g)的次数是20-50次(例如，22-24次)。在另一个实施方案中，本方法还包括在步骤(k)之前重复步骤(i)-(j)一次或多次。
因此，本发明提供了检测生物在样品中不存在或存在的方法，所述方法按该顺序包括步骤：(a)获得样品；(b)分离样品中的至少一个拷贝的该生物的基因组DNA(如果存在)；(c)将至少一个样品滴抽吸入微流反应槽；(d)通过将至少一个样品滴与引物塞混合形成至少一个样品塞，其中所述引物塞包含例如扩增试剂；(e)将至少一个样品塞加热至第一温度，该温度将使基因组DNA的各拷贝(如果存在)变性为第一和第二基因组DNA模板；(f)冷却至少一个样品塞至第二温度以使引物塞中的引物与各基因组DNA模板退火；(g)再加热至少一个样品塞至在所述第一和第二温度之间的第三温度以使所述引物保持对基因组DNA的退火和使DNA聚合酶从退火的引物开始延伸核酸聚合物；(h)保持第三温度进行第一时间长度；(i)重复步骤(e)-(h)至少一次；和(j)检测任何所得的扩增产物，其中至少步骤(c)-(j)在本发明的设备中发生。在另一个实施方案中，所述方法还包括，在步骤(i)之后和步骤(j)之前，包括步骤：(l)重复步骤(e)-(g)；(2)保持所述第三温度进行为大约所述第一时间长度的40-60％的时间长度；和(3)冷却至少一个样品塞至低于或等于第二温度的第四温度以使能够形成包含插入剂的高级结构。在本发明的另一个实施方案中，步骤(i)的检测步骤在一个温度下发生。在另一个实施方案中，步骤(i)的检测步骤在一定的温度范围内发生。在另一个实施方案中，所述方法还包括选择DNA样品塞以进行进一步分析的最终步骤，其中选择的步骤在本发明的设备内的阀门处发生。本领域技术人员将认识到上述实施方案中的检测步骤将导致存在于样品中的DNA的筛查、定量、鉴定和/或任意地选择以进行进一步分析。
因此，本发明提供了使用本发明的设备筛查样品供给的污染的方法，其包括步骤：从样品供给连续抽吸样品滴并加入至少一个微流在线反应槽，通过将各样品滴与引物塞混合形成样品塞，扩增包含基因组材料的样品塞中的DNA和检测扩增的DNA样品的不存在或存在，其中所述步骤在本发明的设备内发生。在本发明的该实施方案中，扩增的DNA产物的连续不存在(即，0检测)表示干净的样品供给。相反地，扩增产物的存在表示被污染的样品供给。
本发明也提供了使用本发明的设备鉴定生物的方法，该方法包括步骤：(a)制备至少一个从生物分离的包含DNA分子的DNA样品滴；(b)从样品获取至少一个DNA样品滴，将其送入至少一个微流反应槽，(c)通过将至少一个DNA样品滴与引物塞混合来形成至少一个DNA样品塞，其中所述引物塞包含至少一种已知的第一引物，(d)将至少一个DNA样品塞接受至少一个扩增循环以使至少一个DNA样品塞具有可检测的扩增DNA样品，(e)检测扩增的DNA产物，(i)基于扩增的DNA产物的检测鉴定所述生物，和(g)任选地使用包含已知的引物的扩增试剂重复步骤(a)-(f)以增加生物鉴定的准确性，所述引物与所述第一已知引物不同，其中步骤(b)-(e)发生在本发明的设备中。在本发明的一个实施方案中，扩增的DNA产物检测提供了其中所述DNA从其分离的生物的鉴定，因为所述引物经选择用于验证生物的鉴定，例如可选择特异性结合特定生物的基因组DNA的TAQMAN引物，从而使得使用上述方法的扩增引物的检测能够验证生物的鉴定。在另一个实施方案中，使用本发明的波形引物或SGP引物且被检测的波形表征提供了生物的鉴定。
本发明提供了定量样品供给中的污染水平(即样品中基因组材料的浓度)的方法。使用本发明的设备的本发明的定量方法包括步骤：(a)使用稀释因子稀释样品以使基因组材料的浓度最多大约为每样品滴一个分子，(b)从样品获得样品滴，将其加入至少一个微流在线反应槽，(c)通过将各样品滴与引物塞混合形成至少一个样品塞，(d)将各样品塞接受扩增循环以使包含DNA分子的各样品塞具有可检测的扩增DNA产物，而不包含DNA分子的各样品塞不具有扩增的DNA产物，(e)在各样品塞中检测扩增的DNA产物的不存在或存在，(f)确定包含扩增产物的样品塞对产生0检测的样品塞的比率，(g)使用稀释因子计算样品中污染DNA的原始浓度，其中至少步骤(b)-(e)发生在本发明的设备中。
基因组材料的序列分析是分类生物的决定性方法。这样，本发明的另一个目的是提供使用本发明的设备的方法，从而使能够对基因组材料进行进一步分析，例如，使得可以提供关于使用上述本发明的任何方法分析的基因组材料的详细序列信息。因此，本发明提供了方法，在该方法中可任意地选择已通过本发明的微流装置的试剂装配区、扩增区和/或检测区的DNA样品塞进行进一步的测序分析。所述选择过程发生在本发明的微流装置的“阀门”区。选择后，本发明的微流装置的阀门将允许被选择的DNA样品塞进入用于测序的装置例如DNA测序芯片。
在另一个实施方案中，本发明提供了进一步包含下面的步骤的方法，在所述步骤中，所述样品塞被不混溶的非水性流体包围。
附图概述
图1：描述了(A)制备(例如，过滤、提取、稀释等)样品滴，将其抽吸入本发明的微流装置的微流在线反应槽，与扩增试剂混合以在所述装置的试剂装配区中形成样品塞，和(B)在所述微流装置的扩增区即第一温度控制区内扩增的路径图。
图2：描述微流在线反应槽中样品塞在通过本发明的微流装置的第一温度控制区(图1B)后的路径的图，其为(A)通过检测区即本发明的装置的第二温度控制区，然后接受至少第一和第二温度以及(B)被选择为废料或选择用于进一步分析。
图3：描述波形表征法和单基因组表征法的步骤和由所述方法产生的核酸聚合物的流程图(图3A、3B和3C)。
图4：假设的基因组DNA的核酸序列。
图5：图4所述基因组DNA变性为两条单链基因组DNA模板(图5A和5B)，假定的引物退火至各变性单链基因组DNA模板的各模板上的引物结合位点，箭头表示从其产生SGP核酸聚合物的各基因组DNA的区域。
图6：使用图5的基因组DNA和引物产生的各SGP核酸聚合物的序列。
图7：在图6的SGP核酸聚合物的mPCR扩增后产生的各SGP-SGP核酸聚合物的序列。
图8：在图7的SGP-SGP核酸聚合物接受半时长延伸步骤后产生的SGP-SGP核酸聚合物(无下划线标示)和缩短的SGP核酸聚合物(下划线标示的)的序列。
发明详述
本发明提供了包含微流装置和控制这些装置内的流体流动、加热和冷却所述装置以及从所述装置获得数据的仪器的设备。本发明的设备可用作自动化在线平台，该平台能够制备(例如，分离、加工、与反应试剂混合等)、扩增(例如，通过PCR法或波形表征法或两者)、检测(即，筛查、定量、鉴定)和/或任意地选择以用于进行进一步分析(例如测序)来自生物的基因组材料以检测和/或分类样品中的生物。
此外，本发明提供了对波形表征法的改进，从而可对少量起始量的DNA使用本发明的设备和进行使用其的方法。对所述波形表征法的改进包括改进进行改进的PCR形式即DNA的指数扩增的引物。对所述波形表征法的改进也包括扩增方法中的半时长延伸步骤，该步骤允许从通过改进的PCR形式(即，mPCR)形成的核酸聚合物亚组产生成组的缩短的单链核酸聚合物。本领域技术人员将认识到对波形表征法的改进使得能够进行生物的检测和/或分类，即使生物以少量例如以存在于刚发生污染的供水样品中的生物的量存在。因此本发明提供了改进的波形表征方法，该方法将有助于提供与许多可被微生物污染的源(例如，环境和医疗方面的源)(包括，但不限于空气、尘埃、水、血液、组织和食品)相关的质量保证。
此外，本发明提供了使用所述公开的设备制备(例如，分离、加工、与反应试剂混合等)、扩增(例如，通过PCR法、波形表征法等)、检测(例如，筛查、定量、鉴定)和/或任意地选择以进行进一步分析(例如测序)生物的DNA。在一个实施方案中，本发明提供了用于高通量在线波形表征法的方法，由此可使用此处公开的自动化在线波形表征平台进行波形表征法例如此处公开的改进的方法。本领域技术人员将认识到本发明包括单基因组或少量基因组的扩增和检测。
I.本发明的自动化在线平台
在过去的数年中，已发展了与各种现有的荧光“mix-and-read”生物化学物例如TAQMAN，Molecular Beacons，Epoch Eclipse Probes和等位基因特异性扩增(Allele Specific Amplification)相容的上述自动化在线PCR平台。至今已知没有发展出既与PCR一起使用也能够与波形表征法一起使用的自动化在线平台。此外，已知没有自动化在线平台能够使得在样品扩增后选择之前被分析的基因组样品进行进一步分析，例如对DNA进行序列分析。本发明提供了这样的平台。下面描述本发明的自动化在线平台，即包括能够产生和检测通过PCR或波形表征法或两者扩增的DNA产物的装置和能够控制该装置内流体流动、该装置的加热和冷却以及从该装置获得数据的设备。此外，所述设备还可包含连接本发明的仪器和微流装置的盒式贮存器(或相似的装置，或完成相似功能的装置)；这样的盒式贮存器在本领域内是熟知的。
A.本发明的微流装置
图1和2提供了本发明的装置的示意图和描述了样品塞制备(图1A)、扩增(图1B)、检测(图2A)和选择(图2B)的方法，所述方法可能常用于几个不同的目的，例如，筛查、鉴定、定量和/或进一步分析(例如测序)基因组DNA。
1.制备样品塞
图1A描述了制备样品塞的方法。简而言之，将来自样品容器的受试样品(1)送至过滤装置(2)以收集有机体细胞和除去杂质。可将样品液体中收集的有机体细胞送至提取装置(3)以分离例如病毒、细菌等基因组材料(例如，除去细胞膜、细胞器、组蛋白、碎片等)。在分离基因组材料后，可将样品液体和分离的基因组材料送至浓度调节器(4)以调节基因组材料的浓度。将来自浓度调节器(4)的样品液体抽吸入微流在线反应槽(5)并将其与载体液体(6)在例如T型接头(junction)(7)混合以形成样品滴(8)，所述样品滴可包含或可不包含基因组材料，例如至少一个基因组DNA分子。
作为样品塞制备方法的部分，引物装置(9)在载体液体中产生系列引物塞，所述载体液体包含DNA扩增和任选地检测所需的试剂。各引物塞在另一个接头例如在T型接头(10)与样品滴(8)混合以形成样品塞，从而完成样品塞的制备过程。
本领域技术人员认识到可使用本发明的自动化在线平台检测许多类型样品。这些样品包括，但不限于，水、空气、尘埃、食品和生物样品，包括体液(例如，唾液、全血、血浆、尿等)、细胞(例如，完整细胞、细胞碎片和细胞提取物)和组织。生物样品也包括采集用于组织学目的组织切片例如活检组织和冰冻切片。优选生物样品包括血液、血浆、淋巴、活检组织、尿、CSF(脑脊液)、滑膜液和BAL(支气管肺泡灌洗液)。
可用许多方法收集受试样品。例如，在监控供水的纯度的情况下，可在一些确定的间隔(每小时，每12小时等)通过从经设计用于捕获细菌等的过滤器分离任何基因组材料来检查与供水并行的过滤系统。这样的过滤系统将聚集存在于供水中的细菌以进行更灵敏的检测。可选择地，可直接从供水中获取样品而无需过滤和/或浓缩。关于样品的其他来源，可使用用于捕获例如细菌的空气过滤系统；可将在这样的过滤器上捕获的材料置于溶液中以开始分离方法。关于其他类型的样品，额外的步骤将是必需的；例如，涉及使用本发明检测血液样品中的细菌的起始方法的部分需要将细菌与包含基因组材料的人血液组分分开。用于将细菌和/或病毒基因组材料与这些示例性样品和许多其他样品分离的许多技术在本领域内是熟知的。
可通过许多本领域技术人员已知的技术完成样品包含的任何基因组材料的分离。分离方法应当是具有分离和捕获基因组材料的高能力的技术，因为在本发明的实施方案中，需要区分未包含基因组材料的样品塞与包含少至一个基因组的样品塞。可使用本领域内熟知的技术(例如，成套的这样的技术可从Xtrana，Inc.(Broomfield，CO)获得)分离来自存在于水样品中的细菌的全长基因组。
Xtrana已发展了用于下列三组样品的不同技术：(A)来自全血、棕黄层、口腔拭子和大肠杆菌(E.coli)的基因组DNA；(B)来自组织培养细胞的RNA；和(C)来自组织培养细胞、啮齿动物尾巴、全组织、血迹和酵母的基因组DNA。简而言之，向用XtraBind(Xtrana，Inc.)(带正电的、亲水基质)包被的塑料微珠加入样品导致以非序列依赖性和基本上是不可逆的方式吸附RNA或DNA。本领域技术人员将认识到因为此处的方法描述了DNA扩增方法，如果分离的基因组材料是RNA，那么在扩增前必须将其逆转录成DNA，例如，cDNA。逆转录方法在本领域内是熟知的。在优选实施方案中，分离生物的整个基因组DNA。
可获得的用于分离基因组DNA的其他技术包括来自Qiagen NA(Qiagen，Venlo，Netherlands)；MagNAPure(Roche，Nutley，NJ)；KingFisher(Thermo Labsystems，Helsinki，Finland)；和RevPrepOrbit(GeneMachines，San Carlos，CA)的技术。
在从样品分离基因组DNA后，可调节其在样品溶液内的浓度。在本发明的一个实施方案中，调节浓度以使样品滴只包含一个基因组DNA分子(即，只来自一个生物的基因组材料)或不包含基因组材料。在另一个实施方案中，所述浓度可以是每样品滴大约0.5个DNA分子。可选择地，可以样品滴包含超过一个DNA分子的百分比概率来表示浓度。在另一个实施方案中，样品滴包含两个或更多个DNA分子的概率是例如低于3％。
在调节来自样品的基因组材料的浓度后，重复地将样品溶液抽吸入微流在线反应槽以形成载体溶液的连续样品滴。优选地，各样品滴在直径大约100μm的微流在线反应槽内为大约1-2nl，或例如，长度大约为100μm。这些重复样品滴可以包含或可以不包含基因组材料(例如，基因组DNA)；如果其包含基因组材料其也可被认为是DNA样品滴。此外，样品滴可包含用于分离方法的任何小珠，例如Xtrana小珠。可选择地，可在该样品滴抽吸之前除去用于分离方法的任何小珠。
一般地，微流在线反应槽直径可以是50μm至300μm，且直径一般为100μm。可用玻璃、石英或塑料形成微流在线反应槽。形成微流在线反应槽的方法在本领域内是熟知的。此外，本领域技术人员将认识到微流在线反应槽可采取许多不同的路径，例如其可以是直的，可与另一个微流在线反应槽在接合处形成接头或连接管，其可在分开的接头处分成两个或更多个微流在线反应槽，可允许液体在其内汇合和/或混合等，且依赖于装置的区域可用不同的材料形成，例如，当其在微流装置的检测区内时，可用透明材料形成其。
一般地，载体液体(6)是基于水的液体，其是与样品液体相同的液体。此外，所述载体液体可以是有机基质液体，例如大约泊的硅油，或一些其他不混溶的非水性液体。在本发明的一个实施方案中，反复将样品滴抽吸入微流在线反应槽中且用缓冲间隔物将样品滴隔开。在优选的实施方案中，不混溶的非水性流体(例如，矿物油)或一些其他疏水物质用作缓冲间隔物，将所述物质加入被吸浆管抽吸的各样品滴中或加在被抽吸的各样品滴之间以在其通过本发明的微流在线反应槽时围绕包含DNA(或无DNA)的各样品滴和将所述样品滴与前面或后面的样品滴分开。作为用于分隔重复的DNA样品的合适物质的矿物油对于本领域技术人员来说是已知的。此外，可用不混溶的非水性流体(例如，矿物油)或一些其他疏水材料处理本发明的微流装置的微流槽内壁。该组对疏水性的改进将减少或防止样品滴之间的交叉污染。换句话说，尽管微流中存在固有的运动，但载体液体和缓冲间隔物之间的疏水性/亲水性差异使单个DNA分子在其沿着微流在线反应槽运动期间能够保持在液滴(8)中或塞中而不与缓冲间隔物或相邻的液滴或塞混合。
在本发明的微流装置中，通过将各样品滴在接头例如T型接头(10)处与包含扩增试剂(例如，引物、核苷酸、聚合酶等)和任选地检测试剂(例如，可检测试剂，例如标记，荧光探针、插入剂等)的引物塞混合从而制备形成样品塞。本领域技术人员知道应当与各样品滴混合的扩增试剂和所述试剂应当使用的浓度。例如，扩增试剂一般包含聚合酶、dNTP、镁、缓冲剂和引物或引物对。本领域技术人员也能够确定使用的引物或引物对；例如，如果描述PCR，本领域技术人员知道使用引物对。相反地，如果技术人员希望进行波形表征分析，将选择波形引物或SGP引物。这些引物的设计和选择在本领域内是熟知的。此外，检测试剂和使用这些试剂直接或间接地标记扩增的DNA产物的方法是熟知的。
在样品滴已被吸入微流在线反应槽，将其与其他样品滴分开从而防止交叉污染，且将其与扩增试剂混合以形成样品塞，之后将其沿着微流在线反应槽抽吸入本发明的装置的扩增区，即第一温度控制区。本领域技术人员将认识到，与样品滴相似，样品塞可包含或可不包含基因组材料，如果其包含基因组材料，也可被当作DNA样品塞。此外，本领域技术人员将认识到只有DNA样品塞可包含将在本发明的装置的第一温度控制区扩增的DNA。
2.在DNA样品塞中扩增DNA
图1B提供了在如上所述制备DNA后，本发明的装置可如何完成可存在于样品塞中的DNA的扩增的非限定性实例。当沿着在线微流反应槽(5)连续地抽吸样品塞(其包含与引物塞混合的样品滴)，其被导入扩增区，即第一温度控制区，所述区域可以是例如热控制板(11)。微流在线反应槽的路径(12)可以是使其允许各样品塞在热控制板(11)的低温区(13)与高温区(14)之间蜿蜒的且交替的通路中流动的路径。
本领域技术人员将认识到，可根据选择的扩增方法适当地调节1)低温区(13)、高温区(14)以及低温和高温区之间的区域的温度，2)微流在线反应槽的路径(12)，和3)样品塞流过微流在线反应槽的速度。例如，可将低温区(13)设置至适合进行退火的温度，可将高温区(14)设置为进行变性的温度。此外，可设计微流在线反应槽的路径(12)以使样品塞能够在低温区和高温区之间交替的通路中流动，从而完成例如大约20至40个变性、退火和延伸循环。最后，可将样品塞(或DNA样品塞)流过微流在线反应槽的速度设置为允许样品塞(或DNA样品塞)保持在变性、退火或延伸温度下合适的时间长度。
如前面所描述的，也可以局部和/或重复的方式快速加热和冷却各微流在线反应槽或其部分，以使当样品塞沿微流在线反应槽流动和通过本发明的装置的第一温度控制区时进行扩增方法(例如，PCR，波形表征，SGP(此处更详细地描述的))的变性、退火和延伸步骤。例如，可使用焦耳加热法(参见，例如，美国专利5,965,410和6,670,153)沿着本发明的装置的各微流在线反应槽的侧面或在与各反应槽交叉的方向上对金属丝使用电压。加热微流在线反应槽的可选择的方法，例如使用热水、热空气等在本领域内是熟知的。此外，微流在线反应槽或其部分的冷却可通过使用流过螺管的冷却液体带走热能，或通过允许快速热扩散来获得。类似于加热的方法，冷却微流在线反应槽的可选择的方法是熟知的。
本领域技术人员知道对于使用本发明的设备的不同方法，例如筛查、鉴定、定量等，DNA样品塞必须接受的温度、在这些温度下的时间长度和循环的次数。例如，在优选的实施方案中，变性温度是90℃至95℃，退火温度是55℃至65℃，延伸温度依赖于选择的聚合酶(例如，对于Taq聚合酶最佳延伸温度是大约72℃)。同样，本领域技术人员知道“热起动”通常开始PCR扩增法，和任选地可在任何扩增法的末期在75℃下最后温育DNA样品。
样品塞可以50μm/秒至5000μm/秒的不同速度例如500μm/秒流过微流在线反应槽。本领域技术人员知道改变样品塞流过微流在线反应槽的速度可实现样品塞在某些温度(例如，变性、退火、延伸等所需的温度)下保持的持续时间。例如，尽管一般的循环是大约94℃进行1分钟，60℃进行1分钟，72℃进行1分钟(72℃延伸的一般规律是1分钟扩增各1000碱基对)等，但本领域技术人员认识到样品塞保持在某些温度下的持续时间依赖于反应的体积、基因组DNA的浓度等，因此，当使用本发明的微流装置时，时限可与一般的循环不同。本领域技术人员将认识到，在各温度下更短的持续时间可以是足够的。此外，本领域技术人员能够确定微流在线反应槽完成所需的扩增循环次数所需的合适路径。
在样品滴被制备，将其抽吸入微流在线反应槽，使其与其他样品塞分开以防止交叉污染，将其与扩增试剂混合从而形成样品塞，并扩增DNA样品塞内的DNA后，驱动样品塞沿着微流在线反应槽进入装置的检测区，所述区域也可以是第二温度控制区。本领域技术人员将认识到只有DNA样品塞可包含可检测的扩增的DNA产物。
3.检测扩增的DNA产物的不存在或存在
设计本发明的微流装置使之：(1)使DNA能够作为样品滴被抽吸入微流在线反应槽，(2)在试剂装配区通过将样品滴与包含扩增反应组分和/或检测组分的引物塞混合形成样品塞，(3)当DNA样品塞沿着微流在线反应槽流过扩增区即第一温度控制区时进行DNA的扩增，和(4)当DNA样品塞通过检测区时允许检测扩增的DNA产品。此外，本发明的微流装置经设计具有两个创新中的至少一个创新。
本发明的微流装置的一个创新方面包括安装微流在线反应槽使之通过第二温度控制区内的检测区。将微流在线反应槽安装通过第二温度控制区内的检测区将使样品塞能够沿微流在线反应槽流过以在检测期间接受温度扫描。本领域技术人员认识到当样品接受温度扫描时，检测样品塞例如检测DNA样品塞在不同温度下的荧光允许进行例如扩增的DNA产物的解链温度分析。这样，本发明提供了微流装置，其包含至少一个吸浆管；至少一个连接至至少一个微流在线反应槽的贮液池，其中至少一个微流在线反应槽通过试剂装配区、第一温度控制区内的扩增区和第二温度控制区的检测区；以及至少一个用于加热微流在线反应槽和/或驱动其内液体流动的金属丝，其中可在多于一个温度下进行扩增DNA产物的检测。
图2A提供了本发明的微流装置的检测区的实例。当沿着微流在线反应槽(5，如图1所示)抽吸不具有扩增DNA产物的样品塞或具有扩增DNA的样品塞时，其被导入检测区，即第二温度控制区，所述区域可以是例如第二热控制板(16)。微流在线反应槽可具有检测路径(17)，当所述样品塞流至低温区(18)和高温区(19)之间时，该路径允许在样品塞中检测扩增DNA的不存在或存在。当样品塞通过光学扫描区(20)时，任何可检测试剂(例如，荧光探针、插入剂等)可用例如三色激光束光学激发，且任何所得的发射可被测量。
一般地，可将检测区的低温区(18)设置在大约25℃至大约65℃的温度范围内。可将检测区的高温区(19)设置在大约55℃至大约95℃的温度范围之内。在检测PCR扩增的DNA的情况下，可将检测区(16)的低温区(18)和高温区(19)设置在同一温度下，例如大约25℃至大约55℃的温度范围之间。
可用于调节检测区内的温度、激发DNA样品塞中的可检测试剂和检测发射光或发射光的变化的各种仪器在本领域中是熟知的。例如，在本发明的一个实施方案中，可用例如覆盖光学扫描区(20)或更大或更小的扫描区的红外电荷耦合器件(CCD)(未显示)测量温度。在优选实施方案中，推荐将精确温度传感器置于第二热控制板上以校准红外CCD来增加温度测量的精确性。
本领域技术人员将认识到将样品塞(例如，DNA样品塞)在检测区接受温度扫描将使得能够检测由波形表征法(例如上述方法、此处描述的SGP法等)产生的波形表征。换句话说，当样品塞通过温度之间时，可确定任何所得的发射光和样品塞的温度之间的相关性。此外，当将DNA样品塞接受温度扫描时，也可检测PCR扩增的DNA，尽管只需要在一个温度下检测发射。可选择地，可将低温区和高温区设置为一个温度以检测PCR扩增的DNA。
如上所述，当将扩增的DNA接受温度扫描时，检测台中的光学系统(图2A中未显示)可用于检测来自所述扩增的DNA(例如高级结构)的发射光的改变。换句话说，检测区中的光学系统可用于测量、检测和确定分离的DNA的波形表征。任何波形表征的检测可表示被检查的样品被污染，然后将所得的波形表征与用已知的引物和从已知的生物分离的DNA产生的波形表征的数据库进行比较可鉴定所述污染性生物。此外，如果将分离的基因组浓缩在样品溶液中，且已知样品浓度，则可基于波形表征的检测定量污染水平。
本领域技术人员认识到，当对于样品是否被污染和/或哪种生物污染样品知之甚少时，最好使用本发明的装置制备基因组材料、通过波形表征法扩增分离的基因组材料和检测所得的波形特征。本领域技术人员也认识到可使用本发明的微流装置分离基因组材料、通过PCR扩增分离的基因组材料和检测所得的PCR产物来进一步确认生物的性质(例如，获自波形表征的性质)。在本发明的一个实施方案中，通过形成几个来自相同的生物的DNA样品滴，将各DNA样品塞与专门选择用于确认生物的性质的不同引物混合，使用不同的引物(或引物组)通过PCR扩增各DNA样品滴，然后检测扩增的样品的不存在或存在来进一步缩小所述生物的性质范围。将扩增产物的存在与使用的特定引物发生关联可鉴定生物。
如上所述，可使用本发明的微流装置通过波形表征和/或PCR筛查样品中生物的存在、鉴定所述生物和/或定量生物的浓度，所述微流装置包含至少一个吸浆管；至少一个连接至至少一个微流在线反应槽的贮液池，其中所述微流在线反应槽通过试剂装配区、第一温度控制区内的扩增区和第二温度控制区的检测区；和至少一个用于加热微流在线反应槽和/或控制其内液体流动的金属丝。当需要进行分离的基因组材料的更细致的检查时，本发明的微流装置可用于选择目的DNA样品塞进行进一步的分析。
4.用于进一步分析的DNA样品塞的选择
尽管因为其高灵活性和高性能，常规DNA芯片用于许多DNA分析方法，特别是序列分析，但其高成本阻碍了其在筛查和鉴定污染性生物的方法中的应用，因为例如供水中污染的概率非常低，因此分离基因组材料的概率非常低。此外，就定量目的使用DNA芯片是无成本效率的，因为当存在多种污染性生物或在使用PCR的指数扩增后，该定量的精确性是不够的。本发明的设备解决了这些问题，因为其提供了具有成本效率的微流装置，所述装置可用于就生物造成的污染筛查样品，用于鉴定污染性生物(如果有)和定量污染水平(例如，当使用本发明的微流装置时，分别地，DNA样品塞中扩增的DNA的少量检测表明存在污染性生物，扩增的DNA的分析可鉴定污染性生物，确定不具有扩增的DNA的样品塞的数目对具有扩增的DNA的DNA样品塞的数目的比率可提供样品中污染性生物的浓度)。本领域技术人员将认识到本发明的装置的精确性是DNA芯片的数倍，因为本发明的装置使用数字化定量方法。
然而，例如DNA芯片的测序能力可以比本发明的微流装置通过例如波形表征的检测可具有的测序能力更精确。因此，本发明的微流装置也可用于选择目的DNA样品塞进行进一步的检查，例如使用例如芯片进行序列分析。
在一个实施方案中，本发明的新微流装置包括置入微流在线反应槽的阀门，其中所述阀门在检测区的下游，这样如果选择DNA样品塞进行进一步分析例如测序分析，那么所述阀门切换微流在线反应槽内的液流，从而使DNA样品塞流离例如废料孔并朝向例如DNA测序芯片。这样，本发明提供了微流装置，所述装置包含至少一个吸浆管；至少一个连接至至少一个微流在线反应槽的贮液池，其中所述微流在线反应槽通过试剂装配区、扩增区和检测区，其中所述微流在线反应槽在检测区的下游包含阀门；和至少一个用于加热微流在线反应槽和/或控制其中液体流动的金属丝。
图2B提供了如何选择样品塞(例如DNA样品塞)进行进一步分析的非限定性流程图。样品塞(21)沿微流在线反应槽流动直至其到达接头例如T形接头处的选择阀门(22)。基于从本发明的微流装置的检测区(图2A)收集的数据或基于其他数据，选择目的DNA样品塞(23)，使用例如DNA芯片(24)进行进一步分析。
在本发明的一个实施方案中，微流装置可具有下列之一或两者：1)作为第二温度控制区的检测区和2)至少一个在检测区下游包含阀门的微流在线反应槽。这样，本发明也提供了微流装置，所述装置包含至少一个吸浆管；至少一个连接至至少一个微流在线反应槽的贮液池，其中至少一个所述微流在线反应槽通过试剂装配区、第一温度控制区内的扩增区和体结构(body structure)的检测区；和至少一个用于加热微流在线反应槽和/或控制其中液体流动的金属丝，其中可在多于一个温度下进行扩增的DNA产物的检测，且其中所述至少一个微流在线反应槽还在体结构的检测区的下游包含阀门。
5.制造本发明的微流装置
可通过本领域内熟知的方法制备本发明的微流装置；参见，例如美国专利6,500,323和5,882,465。简而言之，在设计本发明的微流装置中，应当选择使流体样品塞(例如DNA样品塞)流动通过至少一个微流槽的驱动力，应当鉴定反应参数和应当设计槽网络。下面概述这些步骤中的各步骤。
如美国专利6,500,323中所描述的，用于微流系统例如本发明的自动化在线平台的一般驱动力选自基于压力的流体运输系统、电动力材料运输系统或两者的结合系统。基于压力的系统的用途描述于例如美国专利6,500,323、国际专利申请PCT/US98/20195和1999年2月5日提交的美国专利申请09/245,627，其各自在此引用作为参考。以受控的方式使用电动力移动液体，以及用于进行该运动的系统详细地描述于例如美国专利5,800,690和5,779,868中，其各自在此引用作为参考。结合系统的实例描述于国际专利申请PCT/US98/20195。尽管所述三个系统中的任一系统可与本发明的设备一起使用，但优选地使用结合系统驱动液体。
如美国专利6,500,323中所描述的，当设计本发明的微流装置时，重要地要考虑反应参数例如反应试剂、试剂浓度、试剂体积、反应时间和反应温度特征。因为PCR和波形表征是熟知的方法，因此良好地确定了其反应参数，例如，反应试剂、试剂浓度、反应时间、温度特征等，这样，在设计本发明的微流装置的通道网络中得到容易地解释。例如，设计只用于PCR的微流装置描述于美国专利6,670,153，在此引用作为参考。描述于美国专利6,670,153中的所述装置的设计考虑了PCR的反应步骤，即，变性、退火、延伸和“热启动”。因为良好地确定了用于DNA扩增方法包括波形表征方法(例如上述波形表征法)的这些步骤，因此本领域技术人员将认识到本发明的微流装置可类似于例如美国专利6,670,153中描述的装置，除了上述的一个或两个创新差异外；即将任何微流反应槽置于第二温度控制区内的检测区内，从而使得能够检测波形表征，和/或将阀门整合入至少一个微流反应槽，所述阀门位于检测区的下游但在废料孔的上游。此外，本领域技术人员能够基于下面描述的SGP法的反应参数设计本发明的微流装置。
如上所述，本发明的微流装置可具有至少一个整合入至少一个微流槽中的阀门，例如置于检测区下游和废料孔上游的阀门。该阀门可见为多个通道的“T”型交叉、十字交叉、“货车车轮(wagon wheel)”交叉处，或任何其他通道几何形状，其中两个或更多通道处于例如流体交流状态。选择的驱动力(如上所述)可通过在交叉处限制来自其他槽的液流来控制性地指导样品塞(例如，DNA样品塞)通过阀门。例如，在图2B中，如果选择DNA样品塞(23)进行进一步分析，则想要DNA样品塞(23)从左至右通过到达例如DNA芯片(24)，横穿通过导向废料孔的垂直槽。如美国专利5,876,675中所述(此处引用作为参考)，电动驱动力可用于通过提供穿过水平槽长度方向的电压梯度并在交叉处节制(pinching)物质流来指导DNA样品塞的流动。此外，当关闭阀门时，即，沿水平槽长度方向无电压梯度时，通过例如提供穿过垂直槽方向的电压梯度和/或对位于水平槽末端的废料孔提供真空可使DNA样品塞从左臂流过，通过交叉处并进入底部臂。
B.用于控制本发明的微流装置中的液体流动、加热和冷所述装置以及从其获得数据的仪器
控制设备(图1和2中未显示)例如泵、阀、样品塞(或DNA样品塞)位置检测器和控制计算机可用于控制各样品塞和/或DNA样品塞的流动和时限以完成上述过程。这些控制装置对于本领域技术人员是熟知的。
本发明的装置将包括建立、监控和控制本发明的微流装置的检测区内的第二温度控制区(用于温度扫描)的能力。这可通过在本发明的微流装置的检测区安装温度控制区(类似于例如美国专利6,670,153中描述的加热区)的固定温度梯度，该区域使得能够在其接受温度梯度时检测扩增的DNA产物和使得这些检测翻译为阳性信号、0检测或波形表征。该改进的系统能够检测通过PCR(例如，TAQMAN)和波形表征扩增法或两者扩增的DNA产物。在TAQMAN反应中，检测区的温度梯度可设置为0(这样在检测区具有恒定的温度)。
本领域技术人员将知道用于控制本发明的微流装置内的液体流动、加热和冷却所述装置以及从其获得数据的熟知技术，从而能够建立该仪器而无需过度实验。
II.单基因组表征(Single Genome Profiling)
单基因组表征(SGP)通过对波形表征法提供改进从而允许分析和表征来自生物的基因组DNA，即使所述生物以少量存在。这些改进包括新引物，(“SGP引物”)和聚合酶链式反应的改进形式(mPCR)。SGP额外地提供终“半时长延伸步骤”。这些改进允许SGP(即，使用SGP引物、mPCR和半时长延伸步骤的方法)产生独特的核酸聚合物(“SGP核酸聚合物”)，其各具有沿5′至3′的方向包含SGP引物的序列，接着为与基因组DNA模板的几个不同区域互补的序列的核苷酸序列。特别地，SGP利用产生的SGP核苷酸聚合物、SGP引物和mPCR指数扩增“SGP-SGP核酸聚合物”，其各自具有包含SGP引物、与基因组DNA模板的几个分开的区域的一个区域的序列同一的序列、后面的所述SGP引物的反向互补序列的5’至3’核苷酸序列。在SGP-SGP核酸聚合物的指数扩增后，SGP引入了新的半时长延伸步骤，从而产生SGP核酸聚合物的缩短形式，即“缩短的SGP核酸聚合物”，该聚合物可形成高级结构。因为生物的基因组DNA用作起始模板，因此，SGP核酸聚合物和SGP-SGP核酸聚合物将包含对于生物是唯一的序列。出于相同的理由，且因为所得的SGP-SGP核酸聚合物用于在半时长延伸步骤期间产生缩短的SGP核酸聚合物，因此单链缩短的SGP核酸聚合物将包含对于所述生物是唯一的序列。这样，在SGP中，所述单链缩短的核酸聚合物形成了基于对于所述生物是唯一的序列的高级结构。因此，由单链缩短的核酸聚合物形成的高级结构组对于生物是唯一的。因此，检测形成的不同的高级结构使得能够检测和/或鉴定生物；该检测可使用例如荧光插入剂来完成。
A.单链基因组表征的改进型PCR(mPCR)
本领域技术人员将认识到可使用本发明的改进型PCR(mPCR)产生许多SGP核酸聚合物，从而产生许多SGP-SGP核酸聚合物和缩短的SGP核酸聚合物。因为这些聚合物中的各聚合物源于SGP引物且在5′末端包含SGP引物，本领域技术人员将认识到在SGP中的第一个mPCR循环之前必须将许多拷贝的SGP引物加入包含目的基因组DNA的溶液。本领域技术人员也将认识到，mPCR的材料和条件与PCR的相似。例如，除了引物和DNA模板外向PCR中加入合适浓度的例如dNTP和反应缓冲液对于本领域技术从员来说是熟知的，对于合适浓度的插入剂也如此。可容易地由本领域技术人员确定应当在mPCR的第一个循环之前加入的SGP引物、核苷酸(即，dATP、dCTP、dTTP和dGTP)、DNA聚合酶、反应缓冲液和/或镁的浓度和量。
SGP能够分析以极其少量存在的生物基因组DNA，因为其包括mPCR步骤。在本发明的一个实施方案中，单个生物的基因组DNA可为足够量的缩短的单链核酸聚合物和相关的高级结构提供源模板以进行检测。这是因为SGP的mPCR步骤通过SGP引物以与常规PCR有些相似的方式结合和扩增某些SGP核酸聚合物的能力导致SGP-SGP核酸聚合物的指数扩增。然而，与常规的PCR相比，存在两个明显的差异。首先，所述mPCR步骤只使用一个引物，即SGP引物，该引物能够用作正向和反向引物。相反地，常规PCR使用两个不同的引物：(1)正向引物和(2)具有与正向引物的序列不同的序列的反向引物。
第二，虽然常规PCR使用两个引物扩增基因组DNA的单个区域，但mPCR使用一个引物扩增基因组DNA的几个不同区域，所述区域各自由与SGP引物同一的序列和与所述SGP引物互补的序列，即“SGP引物结合位点”，包围。mPCR在SGP中扩增基因组DNA的几个不同区域的能力归因于使用了能够用作正向和反向引物的一个SGP引物。SGP引物的该特征是其长度的函数，其允许两个至关重要的事件发生：(1)使SGP引物结合至各单链基因组DNA模板上的几个分开的SGP引物结合位点，和(2)将SGP引物结合至SGP核酸聚合物(由至少一个循环的mPCR产生的)，所述SGP核酸聚合物具有包含该SGP引物序列和其独特核苷酸序列内的SGP引物的反向互补序列的5′至3′核苷酸序列。SGP核酸聚合物内的反向互补序列的存在和SGP引物的随后结合允许几个不同的双链SGP-SGP核酸聚合物进行PCR样(即，mPCR)指数扩增，即，由SGP引物结合位点包围的双链基因组DNA的几个不同区域的指数扩增。
SGP引物和波形引物共有一些相似的特征，在例如日本专利申请公开号2003-334082和2003-180351中对后者进行了详细描述。SGP引物对于SGP是必需的，且其特征在于其长度。SGP引物的长度是至关重要的，因为引物的减少的长度允许该引物特异性沿着各单链基因组DNA模板的长度结合几个分开的位点，且因为减少的长度也使得SGP核酸聚合物具有在其独特的核苷酸序列内包含SGP引物序列的反向互补序列的5′至3′序列的概率增加。
SGP引物的特殊特征使其能够用于SGP法以导致在第一次循环后在mPCR的各循环期间从某些特定SGP核酸聚合物指数(即非线性)扩增SGP-SGP核酸聚合物。SGP中mPCR的第一循环由下列步骤组成：1)使基因组DNA的各拷贝变性成两个单链基因组DNA模板，2)使SGP引物对各单链基因组DNA模板上的几个分开的SGP引物结合位点退火，和3)从结合至各单链基因组DNA模板上的分开的SGP引物结合位点的几个SGP引物中的各引物延伸SGP核酸聚合物，其中各SGP核酸聚合物具有含结合的SGP引物、接着为独特的核苷酸序列的5’至3’序列，所述SGP核酸聚合物从所述SGP引物延伸，所述独特的核苷酸序列与结合的SGP引物下游的基因组DNA模板的序列互补。
本领域技术人员将认识到延伸步骤的“全长”持续时间确定了SGP核酸聚合物的长度，从而，在一个循环内产生的SGP核酸聚合物可具有不同的核酸聚合物，但可以是大约相同的长度。例如，假定这样设计SGP引物以使其可对各单链基因组DNA模板的103个位点退火，且假定将延伸步骤的时限调整至产生大约1kb长度的SGP核酸聚合物，那么一个SGP扩增循环将导致每模板103个不同的SGP核酸聚合物，其各自长度大约为1kb。当然，如果引物退火的SGP引物结合位点中的一个位点离基因组DNA模板的3’末端短于1kb，那么从结合在该位点的SGP引物的延伸将产生短于1kb的SGP核酸聚合物。此外，如果SGP引物结合位点(例如，位点“B”)在另一个SGP引物结合位点(例如，位点“A”)的下游1kb范围之内，则可从在位点A处结合的SGP引物产生短于1kb的SGP核酸聚合物。
在SGP中，mPCR的循环可重复数次，例如15至100次。本领域技术人员将认识到在各循环的变性步骤中，SGP核酸聚合物将变成单链，即SGP核酸聚合物将不再结合至基因组DNA模板。在mPCR的随后循环的退火步骤过程中，某些具有5’至3’核苷酸序列的SGP核酸聚合物保持被SGP引物结合的可接近性(即这些特定SGP核酸聚合物不形成高级结构)是至关重要的，所述5’至3’核苷酸序列在其独特的核苷酸序列内包含所述SGP引物的反向互补序列。已很好地理解SGP核酸聚合物作为高级结构的部分的结合或对SGP引物的结合依赖于几个因素，例如，退火温度，SGP核酸聚合物和SGP引物的长度和SGP核酸聚合物和SGP引物在反应混合物中的浓度。因此，本领域技术人员认识到通过例如增加SGP引物的浓度操作mPCR的退火步骤可有助于防止包含SGP核酸聚合物的高级结构的形成。然而，尽管调节这些熟知的因素可有助于实践本发明，这些调节并不是绝对必需的，因为SGP核酸聚合物稳定性的因素存在于SGP引物的设计中。如下面所提到的，设计不具有非特异性稳定性部分的SGP引物，从而各自在其5’末端具有SGP引物序列的SGP核酸聚合物将是不稳定的，即，将倾向于容易地结合引物。因此，某些具有包含SGP引物序列，接着为其独特的核苷酸序列内的SGP引物序列的反向互补序列的5’至3’序列的SGP核酸聚合物将在任何高级结构形成之前选择性地结合SGP引物。
SGP引物对某些SGP核酸聚合物的结合是在第一循环后进行SGPmPCR扩增循环所必需的，所述SGP核酸聚合物具有包含SGP引物序列，其后为不同核苷酸序列内的SGP引物序列的反向互补序列的5′至3′序列。SGP引物对SGP核酸聚合物上的其互补序列的结合促进PCR样反应，该反应产生SGP-SGP核酸聚合物，所述聚合物各自具有包含与基因组DNA模板的几个分开的区域中的一个区域的序列同一的序列的核苷酸序列，所述分开的区域在5′末端侧翼连接与所述SGP引物同一的5’至3′序列，在3′末端侧翼连接为所述SGP引物的反向互补序列的5’至3′序列。因此，因为各SGP-SGP核酸聚合物在其3′末端具有与所述SGP引物互补的5′至3’序列，所以各SGP-SGP核酸聚合物也可在随后的mPCR循环的退火步骤中形成高级结构之前被SGP引物结合。因此，随后的mPCR循环将包括SGP-SGP核酸聚合物的指数扩增。
本领域技术人员将认识到，尽管所有SGP核酸聚合物将在5′末端包含SGP引物序列，但只有一定百分比的SGP核酸聚合物也将在其5′至3′不同核苷酸序列内包含所述SGP引物序列的反向互补序列。参与SGP-SGP核酸扩增的特定SGP核酸聚合物的百分比依赖于几个容易确定的因素，例如用于mPCR的“全时长延伸步骤”的“全时长”长度和SGP引物的设计。例如，潜在的SGP核酸聚合物可在5’末端下游大约750个碱基(0.75kb)具有SGP引物序列的反向互补序列。在该实例中，如上假定，设置mPCR的全时长延伸步骤以产生1kb SGP核酸聚合物，随后的mPCR循环将开始该750个碱基(0.75-kb)的区域(即，双链SGP-SGP核酸聚合物)的mPCR指数扩增，所述双链SGP-SGP核酸聚合物具有与双链基因组DNA的区域(所述起始的1kb SGP核酸聚合物从该区域产生)的序列相同的序列。对于任何其他单链SGP核酸聚合物也发生该指数扩增，所述其他单链SGP核酸聚合物具有5′至3′序列，该5′至3′序列在其5’末端下游1kb内包含SGP引物的反向互补序列。因此，增加全长延伸时间将增加更高比例的SGP核酸聚合物在其核苷酸序列内包含一个或多个SGP引物结合位点的概率。反之亦然；减少全长延伸时间将减少更高百分比的SGP核酸聚合物在其序列内包含一个或多个SGP引物结合位点的概率。
某些在其序列内包含SGP引物结合位点的SGP核酸聚合物的百分比也可通过设计引物来进行操作，下面提供其更详细的描述，这样，例如100个中有一个(即，10-2)SGP核酸聚合物将在其序列内包含SGP引物结合位点。在这样的实例中，且如上假定所述SGP引物可对各单链基因组DNA模板的103个位点退火，那么将从各生物产生2×103个不同的SGP核酸聚合物(即，1×103个SGP核酸聚合物/模板X2个模板/生物)，和可扩增大约20个不同的SGP-SGP核酸聚合物。当然，反向互补序列相对于引物最初结合的位点的位置将确定被指数扩增的各SGP-SGP核酸聚合物的长度。此外，对于任何PCR方法，本发明的SGP-SGP核酸的指数扩增通过mPCR循环发生，所述mPCR循环包括延伸(产生双链SGP-SGP核酸聚合物)、变性(导致可用于对SGP引物退火的单链SGP-SGP核酸聚合物)和SGP引物的退火(建立下一个延伸和扩增循环)。
因此，在mPCR中，在第一循环开始时加入的多拷贝的一种SGP引物可发挥通常用于进行PCR的引物对的功能。换句话说，本发明的单SGP引物可包围双链基因组DNA的几个分开的区域且导致这些区域以几个独特的双链SGP-SGP核酸聚合物的形式进行mPCR指数扩增。
B.半时长延伸步骤
如上面所指出的，用作SGP中的波形表征法的最终目的的波形分析需要几种独特的单链核酸聚合物的存在，所述核酸聚合物代表基因组的独特性；将这些核酸聚合物与插入剂混合以形成最终检测的从而是该波形表征中所必需的高级结构。
在SGP中，通常在1)使用全时长延伸步骤通过几个mPCR循环完成SGP-SGP核酸聚合物的指数扩增，和2)通过引入半时长延伸步骤从SGP-SGP核酸聚合物产生单链缩短的SGP核酸聚合物之前，不形成可检测的高级结构。因此，本发明将扩增的“半时长”循环引入mPCR法(在足够的mPCR循环已产生足够拷贝的指数扩增的聚合物；例如106至107个拷贝后)以产生几个拷贝的各缩短的SGP核酸聚合物。换句话说，通过减少时间量例如减少该mPCR循环的延伸步骤的时间量例如减少40-60％，从SGP-SGP核酸聚合物的亚组产生的核酸聚合物的亚组的长度减少，即缩短的SGP核酸聚合物。因为缩短的SGP核酸聚合物不再在聚合物的3’末端上包含引物序列的反向互补序列，因此，缩短的SGP核酸聚合物可以不被指数扩增，即，其将保持单链，从而形成可被检测的高级结构。
应当指出，未包含与SGP引物的反向互补序列同一的5’至3’序列的SGP核酸聚合物(即非缩短的SGP核酸聚合物)在mPCR扩增的任何循环期间不结合引物，从而也可形成高级结构。然而，如下面所解释的，一个半时长延伸步骤产生几个拷贝的各独特的缩短的SGP核酸聚合物(因为其来源于指数扩增的SGP-SGP核酸聚合物)。相反地，不具有包含SGP引物结合位点的序列的SGP核酸聚合物只能从相对少的起始量的基因组DNA线性扩增。结果，该SGP核酸聚合物对高级结构的形成的贡献与所述缩短的SGP核酸聚合物对高级结构的贡献相比可忽略不计。
SGP中产生的高级结构将主要包含通过引入半时长延伸步骤产生的缩短的SGP核酸聚合物。作为例子，如上假定SGP引物可对例如各单链基因组DNA模板上的大约103个位点退火，则来自第一循环的SGP核酸聚合物的总数可以是例如每拷贝基因组DNA(即，每生物)大约2×103个SGP核酸聚合物。也再如上假定，设计引物以使百分之一的SGP核酸聚合物具有在其序列内包含SGP引物结合位点的序列，大约20个SGP-SGP核酸聚合物(其各自与由SGP引物结合位点包围的基因组模板的几个独特区域的一个区域同一)通过mPCR进行指数扩增，从而产生相对大量的SGP-SGP核酸聚合物拷贝(当始于单基因组DNA时，在22-24个mPCR循环后产生大约106-107个拷贝)。随着扩增循环继续进行，指数扩增的SGP-SGP核酸聚合物的数目和随后从其产生的缩短的SGP核酸聚合物的数目将使由线性扩增持续产生的SGP核酸聚合物的数目变得微不足道。
本领域技术人员认识到，由SGP产生的SGP-SGP聚合物的潜在的总数目与基因组的大小和引物长度有关。因此在扩增的第一个循环中产生的SGP核酸聚合物的优选数目可确定为想要的SGP-SGP核酸聚合物的数目的函数，所述SGP-SGP核酸聚合物能够在半时长延伸步骤期间产生缩短的SGP核酸聚合物(即，可形成高级结构的缩短的SGP核酸聚合物的数目)。该确定将有助于设计在下面更详细描述的本发明的SGP引物。
在确定可获得用于形成高级结构的缩短的SGP核酸聚合物的想要的数目中，本领域技术人员将认识到只有通过mPCR指数扩增的SGP-SGP核酸聚合物的亚组可用于产生缩短的SGP核酸聚合物；该亚组包括不能在半时长延伸步骤中完全延伸的更长的SGP-SGP核酸聚合物。因为通过mPCR指数扩增的SGP-SGP核酸聚合物的序列在3’末端包含引物的反向互补序列的核苷酸序列，全时长延伸步骤是完成该亚组SGP-SGP核酸聚合物的延伸所必需的，而半时长延伸步骤将导致缩短的SGP核酸聚合物，即，在3’末端不包含引物的反向互补序列的核酸聚合物。在另一方面，通过mPCR指数扩增的一些SGP-SGP核酸聚合物比这些更长的SGP-SGP核酸聚合物短得多。这些在半时长延伸步骤限定的时间内完全延伸的SGP-SGP核酸聚合物将在mPCR的任何随后的循环中继续指数扩增；如下面所描述的，这些SGP-SGP核酸聚合物通常不形成高级结构的部分。本领域技术人员将认识到，假定SGP引物的反向互补序列在使用mPCR进行指数扩增的SGP-SGP核酸聚合物长度内随机定位，则半时长延伸步骤的引入将导致大约一半的SGP-SGP核酸聚合物用于产生缩短的SGP核酸聚合物。
大约50％的指数扩增的SGP-SGP核酸聚合物将在由半时长延伸步骤延伸的部分内不包含SGP引物结合位点，从而将参与缩短的SGP核酸聚合物的产生。因为缩短的SGP核酸聚合物不包含能够结合SGP引物的序列，所以其将形成高级结构。
其他大约50％通过mPCR指数扩增的SGP-SGP核酸聚合物将包含SGP结合位点。此外，因为SGP-SGP引物与互补序列一起产生双链SGP-SGP聚合物的退火是稳定的且倾向于快速发生，因此，通常不使用SGP-SGP核酸聚合物产生高级结构。
例如，假定长度为9个碱基的SGP引物可对7,000个位点退火，且所得的SGP核酸聚合物可延伸至2,000个碱基的长度，1.4×107个碱基的基因组DNA，即，例如1/142的2×109个碱基长度的单链基因组DNA模板，将作为SGP核酸聚合物被拷贝。在SGP中，这7,000个SGP个核苷酸聚合物中的大约50至70个将包SGP引物结合位点(如上再假定设计SGP引物以使大约1％的SGP核酸聚合物包含SGP引物结合位点)。这些大约50至70个SGP核酸聚合物将有效地产生在SGP的mPCR步骤中被指数扩增的SGP-SGP核酸聚合物。在mPCR的22至24个循环后和在半时长延伸步骤后，预期大约25至35种不同的缩短的SGP核酸聚合物(其可形成高级结构)的几个拷贝(例如，106至107个)由指数扩增的SGP-SGP核酸引物产生。因此，半时长延伸步骤不仅产生用于形成高级结构的缩短的SGP核酸聚合物而且还可区分不同长度的SGP-SGP核酸聚合物。
作为进一步的例子，假定在SGP的全时长mPCR循环中指数扩增的几种SGP-SGP聚合物是1kb、0.8kb、0.6kb、0.4kb和0.2kb的SGP-SGP核酸聚合物；也假定这些分别的mPCR循环的延伸步骤的时限正好足以延伸1kb的聚合物。本领域技术人员将认识到在随后的“半时长”延伸步骤期间，所产生的聚合物分别为大约0.5kb、0.5kb、0.5kb、0.4kb和0.2kb。随着该mPCR循环进行，和新延伸的DNA聚合物从其相应互补模板链变性，前面列出的三个聚合物(即，长度0.5kb的聚合物，为从原来更大长度(1kb、0.8kb和0.6kb)的单个模板链拷贝而来的聚合物)将在其3’末端不具有引物序列的反向互补序列，且其都具有大约相同的长度(即，0.5kb)。这些单链缩短的SGP核酸聚合物可以形成产生波形表征所必需的高级结构。然而，从0.4kb和0.2kb长度的相应模板链延伸的聚合物将是全长的，即，引物的反向互补序列将存在于这些拷贝的3’末端，且PCR扩增的随后循环将继续产生SGP-SGP核酸聚合物，这样其将不能参与高级结构的形成。
C.检测单个基因组表征
因为指数扩增，即，mPCR用于SGP方法，因此不存在对从大量拷贝的目的基因组DNA开始的需要。例如，假定(非-SGP)波形引物可结合各单链基因组DNA模板的103个位点且(因为其他波形方法一般需要从至少106个生物开始所述方法，如上所述)每线性扩增循环产生的核酸聚合物的总数为大约2×109(103个核酸聚合物/基因组DNA模板×2基因组DNA模板/生物×106个生物)。在其他波形表征法中，可重复线性扩增循环例如22-24次(即，产生22-24组2×103个不同的单链)。相反地，本发明的一个实施方案涉及下列事实，即只要在扩增方法开始时单拷贝的基因组序列存在于样品中(假定有效的提取)那么就可潜在地进行使用SGP方法的波形表征。在几轮始于单拷贝基因组的mPCR扩增的循环(例如，22至24个循环)后，由SGP引物结合位点包围的基因组DNA的各独特区域即各独特SGP-SGP核酸将以106至107倍的级数拷贝(即，存在大约106至107个拷贝)。该优于其他波形表征法的提高使得使用所述SGP法检测和鉴定例如细菌在样品中的存在要更加灵敏得多。
因为所述延伸的缩短的SGP核酸聚合物来源于与由SGP引物结合位点包围的基因组DNA的区域同一的SGP-SGP核酸聚合物，因此所述缩短的SGP核酸聚合物将包含被检测生物的独特序列差异。在SGP中，在半时长延伸步骤中产生的几个单链缩短的SGP核酸聚合物中的各聚合物的拷贝将相互作用形成高级结构，即，包含许多缩短的SGP核酸聚合物的复合物。依赖于缩短的单链的碱基序列，即基于生物的独特基因组信息，所述高级结构将具有不同的稳定性和在不同解链温度(Tm)下的解链。可确定和记录来源于生物的高级结构；这可使用插入高级DNA结构的荧光剂即插入剂来完成。因此，SGP可通过波形表征分析即检测和记录高级结构的解离来用于检测、比较和区分不同生物的基因组DNA。
通过增加样品的温度来解离特定样品的高级结构。随着高级DNA结构解离，插入这些高级结构中的荧光剂也解离。将通过这些高级结构解离获得的荧光强度的改变率作为增加的温度的函数作图，产生对于生物的基因组DNA是独特的波形，即观察和记录在不同解链温度(Tm)的高级DNA结构以产生特征性波形表征。表示样品在生物中存在的波形表征被称为阳性波形表征；在没有生物存在于样品的情况下，产生阴性波形表征。
在本发明的一些实施方案中，合适的(阳性)波形表征的存在表明样品中存在生物。在其他实施方案中，特征性波形表征表示生物的特定种(或株系)，例如细菌的种或株系。因此，SGP法可通过使用波形表征法利用插入剂获得各生物的独特波形表征来区分来自第一生物的基因组DNA和来自第二生物的基因组DNA。
如上所述，mPCR步骤包含多轮扩增；即，多个下列步骤的循环：1)将各基因组DNA变性为基因组DNA模板，2)使SGP引物对各基因组模板的几个分开的SGP引物结合位退火和任何之前产生的SGP核酸聚合物和SGP-SGP核酸聚合物退火，和3)从对SGP引物结合位点退火的各引物延伸SGP核酸聚合物和SGP-SGP核酸聚合物。特别地，在一个扩增循环中，增加样品的温度(例如，至95-98℃)以使任何双链核酸聚合物(包括基因组DNA)变性。随后降低温度(例如，至25℃)以使SGP引物对任何可获得的SGP引物结合位点退火。循环中的最后步骤，涉及使用例如Taq聚合酶在大约72℃下从引物延伸SGP和SGP-SGP核酸聚合物。最后，在一个最后的扩增循环中，将延伸步骤所需的时间长度减少例如大约40-60％(例如，50％)，从而产生缩短的SGP核酸聚合物。本领域技术人员将认识到可在本发明中包含整合了额外的半时长延伸步骤的额外循环以产生更精确和/或更强的波形表征，且这些循环可进行整合了用于扩增产物(例如本发明的SGP-SGP核酸聚合物)的额外的全时长延伸步骤的额外循环。
本领域技术人员知道使用能够重复进行循环步骤(包括扩增过程中固有的变性、退火和延伸步骤所必需的温度的改变)的设备或仪器；这些仪器包括，但不限于本发明的设备、本领域内已知的PCR仪和“Genopattern Analyzer GP1000”仪(Adgene)。生产能够进行本发明中所必需的mPCR循环步骤的仪器的其他厂家包括，但不限于，Perkin-Elmer(Wellesley，MA)、Applied Biosystems(Foster City，CA)或MJ Research(Waltham，MA)。这些仪器能够改变其中改变和重新设置温度的不同步骤的时限和持续时间，从而这些仪器可用于产生全时长延伸步骤和本发明必需的半时长延伸步骤。此外，本领域技术人员可使用额外的材料以帮助使用SGP检测生物的基因组DNA的各个方面，所述额外的材料包括但不限于用于提取的试剂盒(其中存在几种本领域已知的试剂盒；例如，Xtrana技术，例如XTRA AMP提取系统(Xtrana Inc.，Broomfield，CO))；解释波形表征产生的结果的分析软件(例如，由Adgene提供的GenoMaster)；和引物设计支持工具(例如用于其他波形表征法的“Design Support Tool for GenopatternPrimer”和GenoSequenceAnalyzer软件，两者都由Adgene提供)。本领域技术人员将调整这些软件和/或工具的参数和/或方案以用于SGP。
D.单基因组表征引物
使用本领域内熟知的方法设计SGP引物，以使其结合各单链基因组DNA模板的几个分开的位点。在本发明的一个实施方案中，使用SGP引物检测来源于生物例如细菌和病毒的任何基因组DNA的存在。在本发明的另一个实施方案中，定制SGP引物以使其适合用于检测特定的生物，例如特定的细菌种或株系。本领域技术人员通过考虑基因组DNA的长度和序列，可确定用于一般检测细菌或细菌的特定种或株系的基因组DNA的SGP引物的长度和序列。本领域技术人员就其基因组DNA序列检查几种细菌种类和推导能够检测大多数或所有这些种的引物的序列；该类型的引物有时称为“通用”引物。在由本领域技术人员进行的直接的实验试验后确定通用SGP引物和对于特定种或株系是特异性的SGP引物。
本领域技术人员将认识到SGP引物的长度和其结合几个基因组DNA模板的SGP引物结合位点即互补序列的能力呈负相关，即，引物的长度越短，沿基因组模板的分开的所述引物结合的SGP结合位点的数目越多。相反地，引物的长度越长，引物结合的沿基因组模板的分开的SGP引物结合位点的数目越少。此外，将涉及引物长度的相同分析用于分析SGP引物的互补序列和SGP引物的反向互补序列将在沿基因组DNA长度的预设长度(即SGP核酸聚合物的预设最大长度)内发生的概率。因此引物的长度越短，SGP引物结合位点的反向互补序列存在于SGP引物结合位点下游的预设长度内的可能性越大。本领域技术人员将认识到通过包括全时长延伸步骤的时间长度确定预设距离，且当引物结合位点的反向互补序列存在于该预设距离内时，指数扩增将发生。最后，本领域技术人员也将认识到序列内容在引物的设计中起着重要作用。设计引物时通常考虑这些因素已成为本领域内常规的方法(一般参见，例如，Burpo(2001)“Acritical review of PCRprimer design algorithms and cross-hybridization case study”，可在“Computational Molecular Biology”教材，StanfordUniversity中获得。
(cmgm.stanford.edu/biochem218/Projects％202001/Burpo.pdf))。
因此，本领域技术人员通过考虑基因组DNA的长度和序列以及想要的引物长度和特异性将能够设计合适的SGP引物。在本发明的一个实施方案中，设计SGP引物以使其以预先确定的频率与各单链基因组DNA模板结合。在本发明的另一个实施方案中，设计SGP引物以使该引物也可以预先确定的频率用作SGP核酸聚合物的指数扩增中的正向和反向引物。
本领域技术人员也借助于涉及其他波形表征法和产生波形引物产生的材料和软件程序(可从例如Adgene获得)设计用于SGP的引物(包括“通用”引物，和用于检测例如细菌的特定种类和株系的引物)。然而，本领域技术人员将认识到改进涉及用于设计引物的其他波形表征的技术和参数以产生在SGP中正确发挥功能的引物的需要。例如，其他波形表征法使用包含特异性部分和非特定性、稳定化部分(如上所述)的引物；本发明的SGP引物不包含非特异性稳定部分。此外，本领域技术人员认识到当与其他波形表征法中的引物比较时，SGP引物必需结合更大量的沿各单链基因组DNA模板的结合位点，至少部分因为只有一定百分比的SGP核酸聚合物将具有在引物结合位点下游的预定距离内包含所述引物的反向互补序列的序列，即只有一定百分比将进行指数扩增从而产生SGP-SGP核酸聚合物。此外，只有一定百分比(例如，大约50％)的进行指数扩增的SGP-SGP核酸聚合物在半时长延伸步骤中将产生缩短的SGP核酸聚合物。
可设计比用于其他波形表征法中使用的引物更短(碱基更少)的用于SGP的引物，因为随着引物长度减少产生SGP-SGP核酸聚合物的概率增加。为此，本领域技术人员将设计比建议/推荐的用于其他波形表征法的引物长度更短的引物。例如，Adgene提供了“A Method forComparison and Identification of DNAs and RNAs by PatternAnalysis：Genopattern Method”(可从Adgene获得)的图(例如，图4)中的波形引物的实例。该波形引物包含11个碱基的非特异性稳定化部分和8个碱基的特异性部分。本领域技术人员将设计不包括非特异性部分的用于SGP的引物，且将总SGP引物的碱基数减少至低于Adgene的波形引物的特异性部分的碱基数目的数目。例如，可设计长度为6个或7个碱基的用于SGP的引物。在其中特定波形引物的特异性部分包含更多碱基的其他实施方案中，对应的SGP引物的设计可相应地也包含更多的碱基。
可通过SGP法检测的细菌是已为其设计通用波形引物的细菌；这些引物在本领域内是已知的且用于检测副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肺炎克雷白杆菌(Klebsiella pneumoniae)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、宋内志贺菌(Shigellasonnei)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。其他引物，其中的几种可用于区分细菌的个体种和株系，也可从Adgene获得以用于其他波形表征法。如上面所指出的，本领域技术人员可基于已知的波形引物改变引物的设计或改变设计引物的方法来产生用于SGP的引物。此外，本领域技术人员通过分析目的生物的基因组材料和通过进行系列直接的实验性试验为未曾为其设计波形引物的生物设计合适的SGP引物(例如，用于其他细菌和病毒)。
本领域技术人员认识到SGP可适合用于检测样品例如水样品。用于分离生物从而分离生物的基因组的方法将依赖于样品且在本领域内是熟知的。在分离潜在的基因组DNA后，可使用所述SGP法检测基因组DNA的存在，从而检测生物的存在。在某些情况下，例如，当样品应当是无菌的或相对不含污染物时，例如水样品，这些检测足以检测由生物造成的污染。当需要鉴定生物时，可使用其他和更特异性的SGP引物。
III.使用本发明的自动化在线平台的方法
本发明也提供了使用本发明的设备检测样品中生物的存在，和随后任选地分类污染性生物的方法，即使用本发明的微流装置和仪器制备(例如，分离、加工、与反应试剂混合)、扩增(例如，通过PCR、波形表征等)和检测(例如，筛查、定量、鉴定)和/或任意地选择以进行进一步分析(例如，测序)分离自生物的基因组材料的方法。一般地，本发明的方法包括步骤：1)将至少一个DNA样品滴抽吸入本发明的微流装置的微流在线反应槽内；2)通过将至少一种DNA样品滴与引物塞混合形成至少一个DNA样品塞；3)驱动至少一个DNA样品塞沿微流反应槽流入微流装置的第一温度控制区，在该处所述DNA样品塞进行至少一个包括变性、退火和延伸的扩增循环；4)当所述DNA样品塞接受第一温度和第二温度之间的温度时在第二温度控制区中检测扩增的DNA产物；和5)任意地选择DNA样品塞进行进一步分析，例如测序分析。此处描述的方法能够使本领域技术人员连续监控样品以筛查污染物(即使只有少量的污染性生物存在)、定量任何这样的污染的水平和/或鉴定污染性生物。
A.扩增DNA样品
如上所述，扩增过程在扩增区即本发明的微流装置的第一温度控制区内发生。在芯片的第一温度控制区内，以局部的方式重复和快速加热和冷却各微流在线反应槽以使当各样品塞沿微流反应槽流过时对其进行DNA扩增法例如PCR、波形表征、SGP等的变性、退火和延伸步骤。本领域技术人员将认识到只有包含至少一个DNA分子的样品塞即DNA样品塞将产生扩增的DNA产物。在本发明的一个实施方案中，选择PCR作为扩增方法。在另一个实施方案中，在此处公开的自动化在线平台上进行波形表征。在另一个实施方案中，所述波形表征法是SGP法(包括但不限于SGP引物的导入、mPCR循环、高级结构的形成和扩增的缩短的SGP核酸聚合物的检测和分析)，且使用此处公开的自动化在线波形表征装置进行所述SGP波形表征法。
这样，本发明提供了检测样品中生物不存在或存在的方法，所述方法按下列顺序包括步骤：(a)获得包含至少一个生物的样品；(b)分离至少一个拷贝的生物的基因组材料(如果存在于样品中)；(c)将至少一个样品滴抽吸入微流反应槽；(d)通过将至少一个样品滴与引物塞混合形成至少一个样品塞，其中所述引物塞包含至少一种引物、核苷酸、DNA聚合酶和插入剂；(e)将至少一种样品塞加热至使各DNA拷贝变性成第一第DNA模板的第一温度；(f)将至少一个样品塞冷却至使引物与各基因组DNA样品退火的第二温度；(g)再加热所述至少一个样品塞至为所述第一和第二温度之间的第三温度以使引物保持对基因组DNA的退火和使DNA聚合酶从该退火引物开始延伸核酸聚合物；(h)保持所述第三温度进行第一时间长度(即，全时长延伸)；(i)重复步骤(e)-(h)至少一次；和(j)检测所得的扩增产物，其中至少步骤(c)-(j)在本发明的设备中发生。本领域技术人员将认识到该实施方案，依赖于选择的引物进行PCR和波形扩增法。为进行SGP法的半时长延伸步骤，可修饰上述方法以在步骤(i)后但步骤(j)之前进一步包括步骤：(1)重复步骤(e)-(g)；(2)保持所述第三温度进行等于大约所述第一时间长度的40-60％(优选地大约50％)的时间长度；和(3)将至少一个样品塞冷却至低于或等于第二温度的第四温度以允许形成包含插入剂的高级结构。本领域技术人员将认识到如果扩增方法是PCR，则步骤(j)的检测步骤可在一个温度下发生。相反地，如果选择波形表征作为扩增方法，步骤(j)的检测步骤应当在一定的温度范围内发生。如上所述，可通过改变下列之一或两者：1)对金属丝施加电压的时限或2)样品的流速来控制扩增各样品的循环的数目。各循环的时限和各样品塞接受扩增循环的次数最终将依赖于选择的扩增方法(例如，PCR、波形表征法(例如，所述SGP法)、每DNA样品塞的DNA分子的数目和/或，如果选择PCR，将依赖于被扩增的DNA区域的长度。各循环的时限和被检测的各样品塞的循环次数是可通过本领域技术人员确定的实验性条件而无需过多的负担。本领域技术人员将认识至此处描述的检测步骤可用于筛查污染性生物、定量样品的污染水平和/或鉴定污染性生物。在下面更详细地描述该检测方法。
B.检测DNA样品
本发明的微流装置的检测区允许检测来自扩增的DNA产物的信号。检测可基于扩增的DNA产品的光学、化学、电化学、热学或其他性质。在一个实施方案中，使用光学检测系统检测来自扩增的DNA的信号，例如在当扩增的DNA产物具有荧光的情况下，检测仪通常包括以适合激活荧光产物的波长产生光的光源和用于指导光源通过检测区至微流反应槽内的DNA样品塞中包含的产物的光学装置(optics)。
本领域技术人员通过考虑例如激发扩增的DNA产物的荧光的波长，能够确定检测扩增DNA产品所需的光源。可使用提供合适的波长的任何光源，包括但不限于激光、激光二极管和LED。
使用合适的检测器例如光电倍增管检测荧光。当例如扩增的DNA产物(例如PCR扩增的DNA产物)需要在一个温度下进行检测时，当其通过检测器时可检测由本发明的方法产生的扩增的DNA产物。可选择地，所述检测器可以是固定的或可以随扩增的DNA产物移动，从而例如在所述扩增的DNA产品接受不同的解链温度时检测荧光，从而例如对通过波形表征法例如SGP法扩增的DNA产物进行Tm分析。
为了检测扩增的DNA产物，必须向至少包含DNA的这些样品塞中加入可检测试剂。用于各种检测形式例如光学、化学、电化学和热学形式的可检测试剂在本领域内是熟知的。优选的可检测试剂是只可在扩增的DNA产品存在的情况下被检测的试剂。这些可检测试剂在本领域内是熟知的，其包括，但不限于荧光插入剂。在本发明的一个方法中，可在DNA的扩增期间、正好在样品塞接受扩增循环后等向检测区上游的各样品塞加入可检测试剂(例如，作为样品制剂中的反应试剂)，只要向检测区上游的样品塞加入可检测试剂。在本发明的方法中，当包含可检测试剂的样品塞移动至第二温度控制区时，可检测扩增的DNA产物(例如，PCR扩增的产物、通过例如SGP法中的波形表征法产生的高级DNA结构的解链)。本领域技术人员将认识到可在一个温度下进行PCR扩增产物的检测，而由波形表征法(包括SGP法)产生的高级结构的解链的检测需要至少2个不同的温度。可进行PCR的扩增产物的检测的温度，例如室温，依赖于使用的可检测试剂。此外，由波形表征法例如SGP产生的高级结构解链的检测即解链曲线的分析可在一定的温度范围(通常以温度梯度范围的形式(例如，用于整个热控制板)存在)例如65℃至95℃内发生。
本领域技术人员将认识到此处描述的方法的检测步骤可用于污染的筛查，鉴定负责污染的生物和/或定量该污染水平。在下面详细地描述这些特定的实施方案中的每一个实施方案。此外，如上所述，本发明的设备可用于选择被检测的DNA产物以进行进一步分析，例如测序分析。
1.筛查
本发明的目的是提供用于连续筛查样品中污染性生物的经济方法。每天24小时，每周7天和每年365天就污染性生物的不存在或存在筛查样品(例如，检测扩增的DNA产物的不存在或存在)，即，监控和保持公共样品，例如水和空气免受污染性生物和/或恐怖分子袭击可以是本发明的设备的重要功能。因此，本发明提供了使用本发明的设备就污染筛查样品供给的方法，其包括步骤：连续地从样品供给获得样品滴加入至少一个微流反应槽，通过将各样品滴与引物塞混合形成样品塞，其中各样品塞包含扩增试剂，从包含基因组材料的样品塞中扩增DNA以及检测扩增的样品产物的不存在或存在，其中所述步骤发生在本发明的设备中。在本发明的该实施方案中，扩增的DNA产物的不存在(即，0检测)表示干净的样品供给，例如供水。相反地，扩增的产物的存在可表示被污染的样品供给。使用本发明的设备筛查样品是相对便宜的，因为在进行大量的检测的同时避免了使用常规的筛查和监控方法的时间和金钱上的巨大成本。此外，尽管持续的0检测可能似乎是多余的，但该扩增产物的不存在表明样品供给是安全的。这是非常重要和关键的目的，迅速检测样品供给的污染也是一样重要和关键的。最后，可同时使用此处描述的方法筛查、鉴定和定量污染性生物的水平。
2.定量
在本发明的另一个实施方案中，所述设备可用于定量污染物的水平，即样品中基因组材料的浓度。使用本发明的设备的本发明的定量方法包括步骤：a)使用稀释因子稀释样品以使基因组材料的浓度至多大约每样品滴1个分子，例如每1000个样品滴3个分子，b)从样品获得样品滴加入至少一个微流在线反应槽，c)通过将各样品滴与引物塞混合形成样品塞，其中所述引物塞包含扩增试剂，d)将各样品塞接受扩增循环以使包含DNA分子的各样品塞具有可检测的扩增的DNA产物(且不包含DNA分子的各样品塞将不具有扩增的DNA产物)，e)检测各样品塞中扩增的DNA产物的存在或不存在，和f)确定包含扩增的产物的样品塞对导致0扩增的样品塞的比率，和(g)使用稀释因子计算样品中污染性基因组材料的原始浓度。使用该方法的定量基于包含来源于一个基因组DNA分子的扩增的DNA产物的样品塞对导致0检测的样品塞的比率，该方法不基于扩增产物的荧光强度，从而解决了基于PCR的定量法的固有问题。
3.鉴定
此处提供的鉴定方法只有当样品供给例如水供给被基因组材料污染时才是必需的，所述基因组材料已在本发明的筛查和/或定量方法中被检测到。因此，本发明的另一个目的是提供用于鉴定样品中的生物的经济方法。本发明提供了使用本发明的设备鉴定生物的方法，所述方法包括步骤：a)制备至少一个包含从该生物分离的基因组材料的DNA样品滴；b)从样品获得至少一个DNA样品滴加入至少一个微流反应槽内；c)通过将所述至少一个样品滴与引物塞混合形成样品塞，其中所述引物塞包含至少一种已知的第一引物，d)将该至少一个DNA样品塞接受至少一个扩增循环以使该至少一个DNA样品塞具有可检测的扩增DNA产物，e)检测扩增的DNA产物；f)基于扩增的产物的检测鉴定样品，和g)任选地使用包含已知引物的扩增试剂重复步骤(a)-(f)以增加生物鉴定的准确性，所述已知引物与已知的所述第一引物不同。在本发明的一个实施方案中，扩增的DNA产物的检测(例如，当就污染筛查样品和/或定量污染的水平时)提供了其中从其分离所述DNA的生物的鉴定，因为选择引物验证生物的身份，例如，可选择特异性结合特定生物的基因组DNA的特异性TAQMAN引物以使能够通过使用上述方法检测扩增的产物来验证生物的身份。在另一个实施方案中，使用波形引物或SGP引物或本发明，且被检测的波形表征提供了生物的身份。
在当扩增产物的检测不能肯定地鉴定被污染的样品中的污染性生物的特定种(或株系)时(例如，在本发明的筛查或定量方法期间)，通过初始检测例如在本发明的筛查和/或定量方法中产生的扩增的DNA产物可用作可能存在于样品中的生物的类型的初步标志/暗示(即，筛查或定量方法可缩窄用于鉴定方法的任选步骤(上面的步骤g)的引物的选择)。可获得用于该任选步骤的引物文库。基于由初始检测暗示的生物的类型，可使用一种(或多种)这些引物产生第二扩增的DNA产物，然后可将该产物用于鉴定污染原始样品的生物的种和株系。
在其中多种基因组材料来源同时污染供给例如供水的情况下，可使用用于定量的稀释方法(上述方法)的变体。因此，在两种基因组材料污染源的情况下，通过以足以产生系列样品滴(其中大多数样品滴不包含基因组材料，一些样品滴包含一个或另一个基因组材料)的方法稀释样品，各样品滴或随后的样品塞中的可能组分的排列可表示为：0(无DNA)、X(一种基因组DNA源)和Y(第二种基因组DNA源)。本领域技术人员将理解这样的稀释方法通常分离每样品滴一个分子的基因组材料(如果有的话)。然而，在其中两种不同的DNA分子(例如，XY)存在于单个样品塞中时的罕见情况下，仍可使用本方法；例如，对于两种生物(即，XY)都存在的情况下的波形表征将不具有任何单个细菌来源的正常波形表征。
本领域技术人员将容易地认识到通过监控系列的这些样品塞(例如，1千个样品塞)，可获得包含来自各分离的源的基因组DNA材料的样品塞的检测和鉴定。例如，在SGP法中，使用SGP引物可检测样品塞的波形表征，所述样品塞包含(1)生物X的基因组DNA和(2)生物Y的基因组DNA。为进一步鉴定X和Y生物，在一个实施方案中，分离和选择对应于这些生物的样品塞以进行进一步分析，例如，通过本发明的阀门装置选择样品塞通过DNA测序芯片进行分析。本领域技术人员也知道扩展和延伸涉及本发明的装置的方法的该变体，以用于其中存在超过两种基因组材料污染源的情况。本领域技术人员认识到用于鉴定多个生物材料的源的这些方法也可用于检测和区分供给例如供水中的危险的污染源与无毒性或相对无毒性的污染源背景。
4.选择
使用本发明的设备提供了分析基因组材料中的另一个益处；本发明的设备允许选择扩增的DNA产物进行进一步分析例如测序分析。测序分析是最后且决定性的DNA分析法。这样，本发明的另一个目的是提供使用本发明的设备提供已使用上述任何方法分析的DNA的详细信息例如序列信息。因此，本发明提供了方法，在所述方法中，可任意地选择已通过本发明的微流装置内的微流在线反应槽的长度的DNA样品塞以进行进一步分析。选择过程发生在本发明的微流装置的“阀门”。选择后，本发明的微流装置的阀门将进一步允许选择的DNA样品塞进至另一个装置，例如用于测序的装置，例如DNA测序芯片。该芯片在本领域内是已知的(参见，例如，美国公开专利申请No.2005/0009022)。
整个本申请中引用的所有参考资料、专利和专利申请的全部内容在此以其全文引用作为参考。
实施例
此处描述本发明的实施方案。本发明的一个实施方案的基础，即用于检测污染性生物在样品中的不存在或存在的系统的基础见于实施例1中。本领域技术人员将认识到该系统在提供各种样品的质量保证例如检测供水中不存在或存在细菌的用途。本领域技术人员也认识到本发明可用于分析基因或其他长度的核苷酸在样品中的不存在或存在。例如，本领域技术人员可使用本发明检测和鉴定通过过滤空气供给获得的样品、血液样品中的炭疽，或检测和鉴定包被在各种食品上的病毒。本发明不应当被解释为限于下面描述的特定实施例。
实施例1
包括经修饰的PCR(mPCR)和半时长延伸步骤的单基因组表征
(SGP)法
此处提供的实施例和图表是提供用于帮助本领域技术人员理解本发明的理论阐述且描述了此处所述的改进。图3是描述波形表征法包括SGP法的第一循环(图3A)的流程图，并比较了所述SGP法(图3B)和其他波形表征法(图3C)的随后循环的结果的流程图。应当指出该流程图说明只使用了一个拷贝的待测基因组DNA。然而，如上所述，只有使用所述SGP法，该量的基因组DNA才足以形成可检测的高级结构。
为进一步说明本发明，在实施例1.1和实施例1.2中分别提供了理论的引物序列和理论的基因组序列以显示足够短的长度的引物是如何能够结合沿各单链基因组DNA模板的长度分布的几个分开的引物结合位点的。实施例1.3则指导本领域技术人员进行此处描述的SGP法，提供在SGP法的各步骤后预期的各核酸聚合物的序列，和帮助描述本发明的改进。此处提供的实施例不应当解释为或理解为限定本发明的范围。
实施例1.1：理论引物序列
此处提供的模型中，所述引物是5′-AGC-3′。
实施例1.2：理论的基因组序列
通过使用计算机程序产生以随机顺序和频率包含4种DNA核苷酸碱基(腺嘌呤“A”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”和胞嘧啶“C”)的1001bp的基因组序列。改变该理论的、随机产生的序列的少数碱基以获得更清楚地说明SGP法的序列。图4显示了双链基因组DNA的各单链基因组DNA模板的序列。一个单链基因组DNA模板的序列以5′至3′显示且用对应于核苷酸碱基的大写字母表示(SEQ ID NO：1)；互补的单链基因组DNA模板以3′至5′显示且用对应核苷酸碱基的小写字母表示(SEQ TD NO：2)。各基因组DNA模板上的粗体字母显示实施例1.1的理论的引物的预期退火位置，即引物结合位点。图4中被括入的区域显示理论的基因组DNA的几个分开的被引物结合位点包围的区域，其各自以SGP-SGP核酸聚合物的形式指数扩增(参见，例如，图7)。
实施例1.3：包含经修饰的PCR和半时长延伸步骤的SGP法
预期实施例1.1的引物与实施例1.2的基因组DNA的各引物结合位点退火。mPCR的第一循环始于将所述基因组DNA变性成两个基因组DNA模板，在大约95-98℃下进行该步骤大约2分钟。变性后，使引物对各单链基因组DNA模板上的几个分开的互补位点即引物结合位点退火。在大约25℃下进行退火2分钟。在引物已对各单链基因组DNA模板上的几个分开的互补位点退火后，聚合酶例如Taq聚合酶在引物的3’末端开始且以5′至3′方向延伸，从而延伸出不同的核酸聚合物即SGP核酸聚合物。在大约72℃下进行延伸2分钟，这样，在该假定的mPCR的第一循环中，产生大约21个碱基或更少碱基的SGP核酸聚合物。
图5和6中描述了使用实施例1.1和1.2的理论的引物和基因组DNA序列的mPCR的第一循环的代表。图5显示作为两个变性的单链DNA模板的理论的基因组序列(也描述于图4中)。一个单链DNA模板的序列以5′至3′显示且以大写字母表示(图5A；SEQ ID NO：1)，而互补单链DNA模板的序列以3′至5′显示且由小写字母表示(图5B；SEQ IDNO：2)。同样，粗体字母表示预期的引物退火位点。预期在扩增的第一循环期间产生出所述SGP核酸聚合物的区域在各基因组DNA模板中通过下列方式在下面划线表示：1)对应于各引物结合位点下面的假定的引物序列的字母描述引物对所述引物结合位点的结合，2)箭头描述SGP核酸聚合物的延伸的方向，和3)断面线(cross-hatch)显示延伸的SGP核酸聚合物的预期长度。预期在扩增的第一循环后从各基因组DNA模板产生的SGP核酸聚合物的序列(SEQ ID NOs：3-34)列于图6中。如所显示的，一些SGP核酸聚合物的序列包含SGP引物结合位点(由粗体序列表示)。
在第二和随后的扩增循环的变性步骤期间，具有包含SGP引物结合位点的序列(如图6中所示)的SGP核酸聚合物与各基因组DNA模板分开，然后参与随后的退火和延伸步骤，即其将不形成高级结构。因此，在第二和随后的扩增循环中，除了图6中所示的SGP核酸聚合物外，将合成和扩增图7中所示的成组的SGP-SGP核酸聚合物(SEQ IDNOs：35-42)。
本领域技术人员容易认识到，图7中所示的各序列，即各SGP-SGP核酸聚合物序列与由引物结合位点(如图4中用括号描述的)包围(即被SGP引物序列和SGP引物序列的反向互补序列包围)的基因组DNA模板的几个区域中的一个区域同一。本领域技术人员也将认识到随后的扩增循环将导致图7中所列的序列指数倍增。在22至24个循环后，将从一个基因组拷贝产生大约106至107个拷贝的图7中所列的各独特的SGP-SGP核酸聚合物。
在几轮例如22-24轮包含全时长延伸步骤的mPCR循环后使用“半时长”延伸步骤，这样可使图7中所列的一些SGP-SGP核酸聚合物的3’末端将因为延伸时间减少而不被拷贝。所述“半时长”延伸步骤大约为用于全时长延伸步骤的时间长度的40-60％，例如上面使用的全时长延伸步骤的时间长度的50％。
在本实施例中，半时长步骤中的延伸在大约72℃下进行大约1分钟。该延伸时间允许聚合大约10个碱基对。这样，只有来源于具有一个下列序列：3′-tcga-5′(如SEQ ID NO：36中所示)、3′-tcgcccccga-5’(如SEQ ID NO：37中所示)、5′-AGCT-3’(如SEQID NO：40中所示)或5′-AGCGGGGGCT-3′(如SEQ ID NO：41中所示)(如图7中所列的)的SGP-SGP核酸聚合物的核酸聚合物将被完全延伸，从而使其包含引物结合位点。该SGP-SGP核酸聚合物将不参与高级结构的形成。
相反地，在半时长延伸步骤中从具有一个下列序列：3′-tcgggtttcccggaagccga-5′(如SEQ ID NO：35中所示)、3′-tcggctactacggaacga-5′(如SEQ ID NO：38中所示)、5’-AGCCCAAAGGGCCTTCGGCT-3’(如SEQ  ID NO：39中所示)或5′-AGCCGATGATGCCTTGCT-3′(如SEQ ID NO：42中所示)(如表7中所列的)的SGP-SGP核酸聚合物拷贝的核酸聚合物将是缩短的SGP核酸聚合物，即其将不具有包含引物结合位点的序列。在半时长延伸步骤之后图7中所示的SGP-SGP核酸聚合物和预期来源于SGP-SGP核酸聚合物的缩短的SGP核酸聚合物的序列列于图8中。所述缩短的SGP核酸聚合物，即不具有SGP引物结合位点且可参与高级结构形成的SGP核酸聚合物在图8中用下线标示且具有如下序列：5′-AGCCCAAAGG-3′(如SEQ ID NO：43中所示的)、5′-AGCCGATGAT-3′(如SEQ ID NO：46中所示的)、3′-cggaagccga-5′(如SEQ ID NO：47中所示的)和3′-tacggaacga-5′(如SEQ ID NO：50中所示的)。
使用半时长延伸步骤取代全时长延伸步骤的随后的mPCR循环产生将不具有互补链的单链缩短的SGP核酸聚合物，从而其将形成高级结构。通过进行Tm分析(波形表征)可检测这些高级结构。相反地，缩短的SGP-SGP核酸聚合物例如5′-AGCT-3′将在使用半时长延伸步骤的mPCR中完全延伸。因此，因为完全的互补的SGP-SGP核酸聚合物将总是在半时长延伸步骤中形成，所以这些缩短的SGP-SGP核酸聚合物将结合至其互补核酸聚合物且不参与高级结构的形成。
序列表
<110>Canon U.S. Life Sciences，Inc.
<120>鉴定生物的基因组DNA的装置和方法
<130>03582.000200
<150>US 60/653,978
<151>2005-02-18
<160>50
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1001
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>理论的单链DNA模板
<400>1
tcttgcactt tgggtaacgc acgtgtggct gcgcttcaag tcataccgcg aactattatg     60
cgcagccgac agcaactatc tgaacgagcg agggccatca agcctggcat atcgtcaggt    120
caccacgtgg gtgcaatgcg cgtcactctc ttccaccctt gtgtaataat tgtacaaaca    180
tccactgttc tctcagagaa catatgtccc cggcgctcta agtaacaccg gcaaaatttt    240
tgaagcccaa agggccttcg gctgccaact ctcggaggat cgccgttcaa ccgccggtag    300
agacagtata caaattatac agagtcctat ggcaggattg ttctccagta tgcaaccgtg    360
aggcacgcca gaagcagtct gtctttcctg ggacgtgaat ttgctttgat tgcatgctca    420
gtacgcgagg cttctccgca agattcacaa aagcaacgcg gtttgccaac gtagggattg    480
agaccaaatc ccatcggtaa ttgaggcaaa gattccgcca gccatggtaa attacccttc    540
tacctgggga gctagcgatt gcgtggacaa agcgcatgtg cgagcggacg ttgggcagtc    600
cagaaagagg tagcgggggc tatctattag taacgacata ggaggtccga gataggtacc    660
caatttcttt atattgttag ggattccccg tactctcctt tcaggggcct aaggaccctt    720
tcttccgacg tttactatac ctagcatggt cttaagggat ccatttatct gtatgtagta    780
ttacgttggt gctgatcagt ttatactccg ctgtgaccat cgttaagtat accaccggct    840
aactccgcgc ttatggggga cttatggctt catggcccac ttacaagatg ggtgagttcg    900
tgttccacca cctgtccggg gtgctgaggc agatgtgatc gttggtaggc ccaagttcag    960
ccgatgatgc cttgctcctc gcagtagatg cagcactctt c                       1001
<210>2
<211>1001
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>理论的单链DNA模板
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>2
agaacgtgaa acccattgcg tgcacaccga cgcgaagttc agtatggcgc ttgataatac     60
gcgtcggctg tcgttgatag acttgctcgc tcccggtagt tcggaccgta tagcagtcca    120
gtggtgcacc cacgttacgc gcagtgagag aaggtgggaa cacattatta acatgtttgt    180
aggtgacaag agagtctctt gtatacaggg gccgcgagat tcattgtggc cgttttaaaa    240
acttcgggtt tcccggaagc cgacggttga gagcctccta gcggcaagtt ggcggccatc    300
tctgtcatat gtttaatatg tctcaggata ccgtcctaac aagaggtcat acgttggcac    360
tccgtgcggt cttcgtcaga cagaaaggac cctgcactta aacgaaacta acgtacgagt    420
catgcgctcc gaagaggcgt tctaagtgtt ttcgttgcgc caaacggttg catccctaac    480
tctggtttag ggtagccatt aactccgttt ctaaggcggt cggtaccatt taatgggaag  540
atggacccct cgatcgctaa cgcacctgtt tcgcgtacac gctcgcctgc aacccgtcag  600
gtctttctcc atcgcccccg atagataatc attgctgtat cctccaggct ctatccatgg  660
gttaaagaaa tataacaatc cctaaggggc atgagaggaa agtccccgga ttcctgggaa  720
agaaggctgc aaatgatatg gatcgtacca gaattcccta ggtaaataga catacatcat  780
aatgcaacca cgactagtca aatatgaggc gacactggta gcaattcata tggtggccga  840
ttgaggcgcg aataccccct gaataccgaa gtaccgggtg aatgttctac ccactcaagc  900
acaaggtggt ggacaggccc cacgactccg tctacactag caaccatccg ggttcaagtc  960
ggctactacg gaacgaggag cgtcatctac gtcgtgagaa g                     1001
<210>3
<211>7
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP核酸聚合物
<400>3
agccgac                                                              7
<210>4
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP核酸聚合物
<400>4
agcaactatc tgaacg                                                   16
<210>5
<211>14
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP核酸聚合物
<400>5
agcgagggcc atca                               14
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP核酸聚合物
<400>6
agcctggcat atcgtcaggt c                      21
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP核酸聚合物
<400>7
agcccaaagg gccttcggct g                     21
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP核酸聚合物
<400>8
agcagtctgt ctttcctggg a                    21
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP核酸聚合物
<400>9
agcaacgcgg tttgccaacg t                    21
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP核酸聚合物
<400>10
agccatggta aattaccctt c                    21
<210>11
<211>4
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP核酸聚合物
<400>I1
agct                                        4
<210>12
<211>17
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP核酸聚合物
<400>12
agcgattgcg tggacaa                      17
<210>13
<211>12
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP核酸聚合物
<400>13
agcgcatgtg cg                           12
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP核酸聚合物
<400>14
agcggacgtt gggcagtcca g                21
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP核酸聚合物
<400>15
agcgggggct atctattagt a                21
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP核酸聚合物
<400>16
agcatggtct taagggatcc a                  21
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP核酸聚合物
<400>17
agccgatgat gccttgctcc t                  21
<210>18
<211>10
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP核酸聚合物
<400>18
agcactcttc                               10
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸聚合物
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>19
aacccattgc gtgcacaccg a                  21
<210>20
<211>5
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸聚合物
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>20
cgcga                                    5
<210>21
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸聚合物
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>21
tcttgtatac aggggccgcg a                  21
<210>22
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸聚合物
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>22
ttcgggtttc ccggaagccg a                     21
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸聚合物
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>23
aaggaccctg cacttaaacg a                     21
<210>24
<211>13
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸聚合物
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>24
aactaacgta cga                           13
<210>25
<211>14
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸聚合物
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>25
gtcatgcgct ccga                          14
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸聚合物
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>26
atgggaagat ggacccctcg a                 21
<210>27
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸聚合物
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>27
gtctttctcc atcgcccccg a                          21
<210>28
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸聚合物
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>28
tacatcataa tgcaaccacg a                          21
<210>29
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸聚合物
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>29
ctagtcaaat atgaggcga                      19
<210>30
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸聚合物
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>30
agcaattcat atggtggccg a                   21
<210>31
<211>11
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸聚合物
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>31
ttgaggcgcg a                             11
<210>32
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸聚合物
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>32
ataccccctg aataccga                       18
<210>33
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的S6P核酸聚合物
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>33
ggtggtggac aggccccacg a                  21
<210>34
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸聚合物
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>34
aagtcggcta ctacggaacg a                   21
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP-SGP核酸聚合物
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>35
tcgggtttcc cggaagccga                            20
<210>36
<211>4
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP-SGP核酸聚合物
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>36
tcga                                              4
<210>37
<211>10
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP-SGP核酸聚合物
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>37
tcgcccccga                                   10
<210>38
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP-SGP核酸聚合物
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>38
tcggctacta cggaacga                          18
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP-SGP核酸聚合物
<400>39
agcccaaagg gccttcggct                        20
<210>40
<211>4
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP-SGP核酸聚合物
<400>40
agct                                            4
<210>41
<211>10
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP-SGP核酸聚合物
<400>41
agcgggggct                                      10
<210>42
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：I的SGP-SGP核酸聚合物
<400>42
agccgatgat gccttgct                             18
<210>43
<211>10
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的缩短的SGP核酸聚合物
<400>43
agcccaaagg                                      10
<210>44
<211>4
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP-SGP核酸聚合物
<400>44
agct                                               4
<210>45
<211>10
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP-SGP核酸聚合物
<400>45
agcgggggct                                         10
<210>46
<211>10
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的缩短的SGP核酸聚合物
<400>46
agccgatgat                                         10
<210>47
<211>10
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的缩短的SGP核酸聚合物
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>47
cggaagccga                                      10
<210>48
<211>4
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP-SGP核酸聚合物
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>48
tcga                                            4
<210>49
<211>10
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP SGP核酸聚合物
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>49
tcgcccccga                                     10
<210>50
<211>10
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的缩短的SGP核酸聚合物
<220>
<221>misc_feature
<223>该序列为3′至5′方向.
<400>50
tacggaacga                                        10

Claims (24)

1.一种微流装置，其包括：
至少一个吸浆管；
至少一个连接至至少一个微流在线反应槽的贮液池，其中所述至少一个微流在线反应槽通过试剂装配区；第一温度控制区的扩增区和第二温度控制区内的检测区；和
至少一个用于加热微流在线反应槽和/或控制其内流体流动的金属丝，
其中在一个或多个温度下进行扩增的DNA产物的检测。
2.权利要求1的微流装置，其中至少一个微流在线反应槽还在检测区的下游包含阀门。
3.一种微流装置，其包含：
至少一个吸浆管；
至少一个连接至至少一个微流在线反应槽的贮液池，其中所述至少一个微流在线反应槽通过试剂装配区、扩增区和检测区，且其中所述微流在线反应槽还在检测区的下游包含阀门；和
至少一个用于加热微流在线反应槽和/或控制其内流体流动的金属丝。
4.控制权利要求1的微流装置内的流体流动、所述微流装置的加热和冷却以及从其获得数据的仪器，其包括介于所述仪器和所述微流装置之间的盒式贮存器。
5.控制权利要求3的微流装置内的流体流动、所述微流装置的加热和冷却以及从其获得数据的仪器，其包括介于所述仪器和所述微流装置之间的盒式贮存器。
6.一种设备，其包括权利要求3的微流装置和控制所述微流装置内的流体流动、所述微流装置的加热和冷却以及从其获得数据的仪器。
7.权利要求6的设备，其还包括介于所述仪器和所述微流装置之间的盒式贮存器。
8.确定样品中的生物的方法，所述方法包括步骤：
(a)获取样品；
(b)分离至少一个拷贝的生物基因组DNA，如果其存在于样品中；
(c)将包含SGP引物、核苷酸、DNA聚合酶和插入剂的第一混合物加入生物基因组DNA，从而形成第二混合物；
(d)加热第二混合物至第一温度，该温度将使基因组DNA，如果存在，变性为第一和第二基因组DNA模板；
(e)冷却第二混合物至可使所述引物退火至各基因组DNA模板的第二温度；
(f)再加热第二混合物至第三温度从而使引物保持对基因组DNA的退火和使DNA聚合酶从该退火的引物开始延伸核酸聚合物，所述第三温度在所述第一和第二温度之间；
(g)保持第三温度进行第一时间长度；
(h)重复步骤(d)-(g)至少一次；
(i)重复步骤(d)-(f)；
(j)保持第三温度进行大约为第一时间长度的40-60％的第二时间长度；
(k)再冷却第二混合物至低于或等于第二温度的第四温度以使形成包含插入剂的高级结构；
(l)检测所得的高级结构；
(m)进行解链温度分析；
(n)检测波形表征；和
(o)如果所述样品包含所述生物，确定来自样品的阳性波形表征。
9.权利要求8的方法，其中所述第三温度保持约为所述第一时间长度的50％的第二时间长度。
10.权利要求8的方法，其中在步骤(h)中重复步骤(d)-(g)的次数是20-50次。
11.权利要求10的方法，其中在步骤(h)中重复步骤(d)-(g)的次数是22-24次。
12.权利要求8的方法，其中所述方法还包括在步骤(k)之前重复步骤(i)-(j)一次或多次。
13.检测样品中生物的不存在或存在的方法，其包括步骤：
(a)获取样品；
(b)分离至少一个拷贝的生物基因组DNA，如果其存在于样品中；
(c)将至少一个样品滴抽吸入微流反应槽；
(d)通过将至少一个样品滴与引物塞混合形成至少一个样品塞，其中所述引物塞包含含有至少一种引物、核苷酸、DNA聚合酶的扩增试剂和插入剂；
(e)将至少一个样品塞加热至使各基因组DNA拷贝，如果存在，变性成第一和第二基因组DNA模板的第一温度；
(f)将至少一个样品塞冷却至使引物与各基因组DNA模板退火的第二温度；
(g)再加热至少一个样品塞至第三温度以使(1)引物保持对基因组DNA的退火和(2)使DNA聚合酶从该退火引物开始延伸核酸聚合物，所述第三温度在所述第一温度和第二温度之间；
(h)保持所述第三温度进行第一时间长度；
(i)重复步骤(e)-(h)至少一次；和
(j)检测所得的扩增产物，
其中至少步骤(c)-(j)在权利要求6的设备中进行。
14.权利要求13的方法，其中所述引物塞包含PCR引物对。
15.权利要求14的方法，其中所述步骤(j)的检测步骤在一个温度下进行。
16.权利要求13的方法，其中所述引物塞包含波形表征引物。
17.权利要求16的方法，其中所述步骤(j)的检测步骤在一定的温渡范围内进行。
18.权利要求17的方法，所述方法在步骤(i)之后和步骤(j)之前还包括步骤：
(1)重复步骤(e)-(g)；
(2)保持所述第三温度进行等于所述第一时间长度的大约40-60％的时间长度；和
(3)将至少一个样品塞冷却至低于或等于所述第二温度的第四温度以形成包含插入剂的高级结构。
19.权利要求13至18中任一项的方法，其还包括选择样品塞以进行进一步分析的最后步骤，其中所述选择步骤在所述设备的阀门处进行。
20.就污染筛查样品供给的方法，其包括：
(a)连续地从样品供给获得样品滴加入至少一个微流反应槽；
(b)通过将各样品滴与引物塞混合形成样品塞，其中所述引物塞包含扩增试剂；
(c)扩增包含基因组材料的样品塞中的DNA；和
(d)检测扩增的产物的不存在或存在，
其中步骤(a)-(d)在权利要求6的设备中进行。
21.鉴定生物的方法，其包括步骤：
(a)制备至少一个包含从生物分离的DNA分子的DNA样品滴；
(b)获得所述至少一个DNA样品滴并加入至至少一个微流在线反应槽内；
(c)通过将至少一个样品滴与引物塞混合形成至少一个DNA样品塞，其中所述引物塞包含含有至少一种已知的第一引物的扩增试剂；
(d)将至少一个DNA样品塞接受至少一个扩增循环以使至少一个DNA样品塞具有可检测的扩增的DNA产物，
(e)检测扩增的DNA产物；
(f)基于扩增的产物的检测鉴定所述生物；和
(g)任选地使用包含已知引物的扩增试剂重复步骤(a)-(f)以增加生物鉴定的准确性，所述已知引物与所述已知的第一引物不同，其中至少步骤(b)-(e)在权利要求6的设备中进行。
22.用于定量样品中基因组材料的浓度的方法，所述方法包括步骤：
(a)使用稀释因子稀释样品以使基因组材料的浓度至多大约每样品滴1个分子；
(b)获得样品滴并加入至少一个微流在线反应槽；
(c)通过将各样品滴并与引物塞混合形成至少一个样品塞，其中所述引物塞包含扩增试剂；
(d)将各样品塞接受扩增循环以使包含至少一个DNA分子的各样品塞具有可检测的扩增的DNA产物，且不包含DNA分子的各样品塞将具有扩增的DNA产物的零检测；
(e)检测扩增的DNA产物在各样品塞中的存在或不存在；
(f)确定包含可检测的扩增的DNA产物的样品塞对导致零检测的样品塞的比率，和
(g)使用稀释因子计算样品中基因组材料的原始浓度，
其中至少步骤(b)-(e)在权利要求6的设备中进行。
23.权利要求20-22中任一项的方法，其还包括选择样品塞以进行进一步分析的最后步骤，其中所述选择步骤在所述设备内的阀门处进行。
24.权利要求13-18和20-22中任一项的方法，其还包括其中用不混溶的非水性流体包围样品塞的步骤。
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