CN101133080A - 天然来源的蛋白质及由其制备的材料 - Google Patents

天然来源的蛋白质及由其制备的材料 Download PDF

Info

Publication number
CN101133080A
CN101133080A CNA2005800243750A CN200580024375A CN101133080A CN 101133080 A CN101133080 A CN 101133080A CN A2005800243750 A CNA2005800243750 A CN A2005800243750A CN 200580024375 A CN200580024375 A CN 200580024375A CN 101133080 A CN101133080 A CN 101133080A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gly
protein
silk
adf
ala
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2005800243750A
Other languages
English (en)
Inventor
T·沙伊贝尔
D·许梅里希
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AMSilk GmbH
Original Assignee
TU MUENCHEN
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by TU MUENCHEN filed Critical TU MUENCHEN
Publication of CN101133080A publication Critical patent/CN101133080A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • D—TEXTILES; PAPER
    • D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
    • D01F—CHEMICAL FEATURES IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED FOR THE MANUFACTURE OF CARBON FILAMENTS
    • D01F4/00—Monocomponent artificial filaments or the like of proteins; Manufacture thereof
    • D01F4/02—Monocomponent artificial filaments or the like of proteins; Manufacture thereof from fibroin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
    • A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
    • A61L15/40—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. plant or animal extracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L17/00—Materials for surgical sutures or for ligaturing blood vessels ; Materials for prostheses or catheters
    • A61L17/06—At least partially resorbable materials
    • A61L17/08—At least partially resorbable materials of animal origin, e.g. catgut, collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/227—Other specific proteins or polypeptides not covered by A61L27/222, A61L27/225 or A61L27/24
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A61L27/34—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/08—Materials for coatings
    • A61L31/10—Macromolecular materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
    • C07K14/43518—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from spiders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/026—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a baculovirus

Abstract

本发明涉及天然来源的蛋白质和由其制备的材料，特别是由其衍生的线、纤维、泡沫和凝胶。本发明还提供将这些蛋白质/线和材料用在技术、生物技术和/或药物领域中，特别是用在制备伤口闭合系统或覆盖系统，缝线材料中和在制备替换材料，优选地人造软骨或腱材料以及其它的商业应用中的应用。

Description

天然来源的蛋白质及由其制备的材料
本发明涉及天然来源的蛋白质及由其制备的材料，特别是来自其的线、纤维、泡沫和凝胶。本发明还提供这些蛋白质/线和材料用在生物技术和/或药物领域中，特别是用在制备伤口闭合或覆盖系统，缝线材料和在制备替代材料，优选地人工软骨或腱材料，以及在其它商业应用中的应用。
蜘蛛拖丝(Spider dragline)的丝具有由其作为半晶体聚合物(2)的组成引起的特别的性质(1)，所述聚合物包含被包埋在无定形基质中的晶体区域。X射线衍射和NMR显示晶体区域由赋予了线以强度的聚丙氨酸序列的β折叠片组成(3，4)，同时无定形基质的主要二级结构是提供弹性的富含甘氨酸的31螺旋(5)。新鲜分泌的丝蛋白作为液体晶体粘稠物(7，8)以高浓度贮存(6)，其在它通过吐丝导管的过程中，通过离子组成，pH(从pH6.9到6.3)的改变(9，10)和水提取(10，11)而变化从而最终通过外延流动(12)转化为固体的线。
至今研究的所有的拖丝的丝由至少两种不同的蛋白质组成，所述蛋白质具有多到数百kDa的分子量(13)。十字园蛛(Araneus diadematus)的两种主要的拖丝的丝蛋白，ADF-3和ADF-4对拖丝线装配和结构的分别的作用迄今尚未得到确定。分析一级结构揭示ADF-3和ADF-4(14，15)具有类似的脯氨酸含量和聚丙氨酸基序，但是它们在谷氨酰胺和丝氨酸含量上以及在富含甘氨酸的区域的长度上有所不同。重要的是，丝线的性质不能从基础的蛋白质序列推导出来。尽管丝线的质量基于涉及的蛋白质的一级结构，其还取决于丝装配的过程(8)，这使对结构和装配性质的实验分析成为必要。
科学和商业利益促进了蜘蛛丝的工业规模生产的研究。由于蜘蛛的同种相残，天然的蜘蛛丝生产是不切实际的，而人工生产在获得足够的蛋白质产量和出众的线-装配中遇到问题。细菌的表达产生低蛋白水平(16)，这可能是由于细菌和蜘蛛的不同的密码子选择导致的。具有适应于表达宿主的密码子选择的合成基因导致更高的产量(13，17)，但是其合成的蛋白质显示与天然蜘蛛丝不同的性质。部分拖丝的丝cDNAs在哺乳动物细胞系中的表达确实产生了丝蛋白(例如ADF-3)，其可以以人工方式纺(spin)为“丝样”的线，尽管在品质上仍旧很差(18)。
WO03060099涉及将生物丝蛋白旋转为纤维的方法和装置。本发明特别用于从水溶液中旋转重组的丝蛋白，并增加纤维的强度和制品的实用性从而使这些纤维的商业生产和应用是可实践的。其中，公开了在哺乳动物细胞，例如转基因的山羊乳腺细胞中表达蜘蛛丝蛋白。
因此，本发明的目标是提供改善的原材料，即蛋白质，用于以高产率和优越的品质制备蜘蛛丝线，纤维和其它材料。另外的目标是提供新的蛋白质/线和基于蜘蛛丝蛋白的另外的材料和/或其它天然衍生的材料用于生物技术，药物和其它的商业目的。
这些目的通过独立权利要求的主题而得以解决。优选的实施方案在从属权利要求中提出。
关于涉及蜘蛛丝蛋白和由其衍生的线的生产的现有技术方法的缺陷，可以使用合成真正的蜘蛛丝蛋白的不同的更有效的路径。
显示特别的强度和韧性的蜘蛛拖丝的丝主要有两种相关蛋白组成，其在线装配中的作用和对于拖丝的线的机械性质的作用大部分还是未知的。
为了阐明该作用，本发明人使用杆状病毒表达系统来在宿主昆虫细胞中产生重组的ADF-3和ADF-4，花园蜘蛛十字园蛛的两种主要的拖丝的丝蛋白。据显示ADF-4，而不是ADF-3容易地在细胞的胞质中自我装配为丝。这些ADF-4的丝显示特别的化学稳定性，其对于真正的蜘蛛拖丝的丝线是典型的。结果，ADF-4的性质显示其在拖丝的丝中作为结构关键参与者的作用。
迄今，关于蜘蛛拖丝丝线的两种主要的蛋白质组分之间的结构，功能和可能的相互影响知道的很少。本发明人观察到尽管它们在一级结构上的相似性，ADF-3和ADF-4显示令人惊讶的不同的性质。同时ADF-3在其本质上是可溶的蛋白，ADF-4在所用的实验条件下实际上是不可溶的，并在sf9细胞的细胞质中形成丝状团聚体，其具有可与天然拖丝的线比较的化学稳定性。在ADF-4丝和天然拖丝的丝线之间的相似性显示ADF-4是在拖丝的线中提供其化学和物理强度的结构“关键参与者”。由于线形成必须快到1-10cm/s的自然卷绕速度(19)，容易装配的化合物，诸如ADF-4对于丝形成是必需的。然而，ADF-4聚合的倾向显示可能在旋转粘稠物中需要其它因素来避免腺体中的过早聚合。这些因素可能是翻译后修饰诸如磷酸化作用和糖基化作用。另外，ADF-4的溶解性可以被共分泌并且也储存在粘稠物的蛋白质所影响。尽管ADF-3在昆虫细胞的胞质中不影响ADF-4的溶解性，其仍旧可以在蜘蛛腺体分泌的过程或其后在调节ADF-4的溶解性中起重要作用。在蜘蛛腺体细胞以及在腺体内腔中的分泌途径中存在的特定条件可导致在ADF-3和ADF-4之间的相互作用，其调节丝线装配。
蜘蛛丝可以被视为未来聚合物设计的基准点，这不仅是由于它们优越的品质，还因为它们可以以经济的并且以与环境相容的方式在环境温度和环境压力下从水性溶剂中产生而被优选。然而，主要的障碍存在于我们与天然丝纤维生产过程匹配的能力。本文提供的结果构成阐明蜘蛛丝拖丝蛋白例如园蛛拖丝的丝的两种主要的成分，ADF-3和ADF-4的功能和相互作用的必要基础。这些知识对于从重组蛋白质中旋转丝线和生产新一代的纤维材料是必要的。
在本发明的背景中，可以使用产生来自主要的壶腹状腺体的蜘蛛丝拖丝蛋白的方法，这包括下列步骤：
a)提供编码一种或多种蜘蛛拖丝蛋白的核酸序列，
b)将在a)中提供的核酸序列引入昆虫细胞中，
c)表达所述拖丝蛋白；和
d)回收所述拖丝蛋白。
因此，如上提及，由该方法提供的一个主要的优势存在于提供用于蜘蛛丝拖丝蛋白的表达系统，即在昆虫细胞中的表达。如上所释，令人惊奇地证实，那些蛋白在昆虫细胞中的表达比在其它细胞，如，例如细菌细胞和哺乳动物细胞中的表达优越。这种改善等价地影响品质，即机械性质等，以及蜘蛛丝拖丝蛋白的产率。
作为实例，按照参考文献16的方法，获得4mg/l的细胞，其不能旋转成线；在参考文献18中，获得25mg/l的细胞(获得线，但是具有非常差的品质)。通过本发明的方法，可以获得＞30mg/l的细胞(自我装配，稳定的线)。
优选地，由在上述方法的步骤a)中提供的核酸序列编码的拖丝蛋白优选地选自球-网蜘蛛(园蛛科(Araneidae))的拖丝蛋白。
这样的拖丝蛋白可以来自下列蜘蛛的一种或多种：希氏尾园蛛(Arachnura higginsi)，Araneus circulissparsus，十字园蛛，Argiope picta，条带园蛛(Banded Garden Spider)(三带蜘蛛(Argiope trifasciata))，(BatikSpider)(Batik Golden Web Spider)(Nephila antipodiana)，Beccari′sTent Spider (Cyrtophora beccarii)，鸟粪蛛(Bird-droppingSpider)(Celaenia excavata)，黑白棘蛛(Black-and-White Spiny Spider)(库氏棘腹蛛(Gasteracantha kuhlii))，黑白园蛛(Black-and-yellow GardenSpider)(Argiope aurantia)，流星锤蛛(Bolas Spider)(Ordgarius furcatus)，流星锤蛛-巨蜘蛛(Bolas Spider-Magnificent Spider)(Ordgarius magnificus)，棕色水手蛛(Brown Sailor Spider)(嗜水新园蛛(Neoscona nautica))，棕腿蛛(Brown-Legged Spider)(Neoscona rufofemorata)；Capped Black-HeadedSpider(帆楚蛛(Zygiella calyptrata))，普通园蛛(Common Garden Spider)(Parawixia dehaani)，普通园蛛(Common Orb Weaver)(Neosconaoxancensis)，蟹样棘园蛛(Crab-like Spiny Orb Weaver)(Gasteracanthacancriformis(elipsoides))，Curved Spiny Spider(Gasteracantha arcuata)，皿云斑蛛(Cyrtophora moluccensis)，Cyrtophora parnasia，Dolophones conifera，Dolophones turrigera，Doria′s Spiny Spider(Gasteracantha doriae)，双点棘蛛(Double-Spotted Spiny Spider)(Gasteracantha mammosa)，Double-TailedTent Spider(方格云斑蛛(Cyrtophora exanthematiea))，塞若尖腹蛛(Aculeperia ceropegia)，Eriophora pustulosa，Flat Anepsion (Anepsiondepressium)，Four-spined Jewel Spider(Gasteracantha quadrispinosa)，园网蛛(Garden Orb Web Spider)(Eriophora transmarina)，Giant LichenOrbweaver(Araneus bicenenarius)，金色网蛛(Golden Web Spider)(Nephilamaculata)，Hasselt′s棘蛛(Hasselt′s Spiny Spider)(Gasteracantha hasseltii)，Tegenaria atrica，Heurodes turrita，Island Cyclosa Spider(岛艾蛛(Cyclosainsulana))，Jewel or Spiny Spider(Astracantha minax)，肾形园蛛(KidneyGarden Spider)(丽园蛛(Araneus mitificus))，Laglaise′s园蛛(Laglaise′sGarden Spider)(Eriovixia laglaisei)，Long-Bellied Cyclosa Spider(Cyclosabifida)，Malabar Spider(Nephilengys malabarensis)，Multi-Coloured StAndrew′s Cross Spider(多色金蛛(Argiope versicolor))，观赏性树干蛛(Ornamental Tree-Trunk Spider)(裂腹蛛(Herennia ornatissima))，Oval St.Andrew′s Cross Spider(好胜金蛛(Argiope aemula))，Red Tent Spider(单色云斑蛛(Cyrtophora unicolor))，Russian Tent Spider(Cyrtophora hirta)，SaintAndrew′s Cross Spider(凯氏金蛛(Argiope keyserlingi))，猩红阿秋蛛(猩红阿秋蛛(Acusilas coccineus))，银色金蛛(Argiope argentata)，Spinybacked Orbweaver(Gasteracantha cancriformis)，斑点园蛛(SpottedOrbweaver)(Neoscona domiciliorum)，St.Andrews Cross(Argiopeaetheria)，St.Andrew′s Cross Spider(Argiope Keyserlingi)，Tree-StumpSpider(无鳞波蛛(Poltys illepidus))，Triangular Spider(Arkys clavatus)，Triangular Spider(Arkys lancearius)，Two-spined Spider(Poecilopachysaustralasia)，络新妇蛛属(Nephila)物种，例如Nephila clavipes，Nephilasenegalensis，Nephila madagascariensis和更多(对于另外的蜘蛛物种，还见下)。十字园蛛是最优选的。
优选地，通过该方法生产的拖丝蛋白质是拖丝蛋白质野生型ADF-3，ADF-4，MaSp I，和/或MaSp II。术语ADF-3/-4用在由十字园蛛产生的MaSp蛋白质的背景下(十字园蛛丝心蛋白-3/-4)。两种蛋白质ADF-3和-4属于MaSp II蛋白质类(主要的壶腹状spidroin II)。
可以通过此(即，单独的或组合以其它蛋白质)生产的另外的蜘蛛丝蛋白和它们的数据库登记号是：
spidroin 2[Araneus bicentenarius]gi|2911272
主要的壶腹状腺体拖丝丝蛋白质-1[大腹园蛛(Araneus ventricosus)]gi|27228957
主要的壶腹状腺体拖丝丝蛋白质-2[大腹园蛛]gi|27228959
壶腹状spidroin 1[Nephila madagascariensis]gi|13562006
主要的壶腹状spidroin 1[Ncphila senegalensis]gi|13562010
主要的壶腹状spidroin 1[Latrodectus geometricus]gi|13561998
主要的壶腹状spidroin 1[三带金蛛]gi|13561984
主要的壶腹状spidroin 1[Argiope aurantia]gi|13561976
拖丝丝蛋白spidroin 2[棒络新妇蛛(Nephila clavata)]gi|16974791
主要的壶腹状spidroin 2[Nephila senegalensis]gi|13562012
主要的壶腹状spidroin 2[Nephila madagascariensis]gi|13562008
主要的壶腹状spidroin 2[Latrodectus geometricus]gi|13562002
本发明特别涉及下面的方面和实施方案：
按照第一个方面，本发明涉及蜘蛛拖丝蛋白质，其由SEQ ID NO：1或2的核酸序列，或那些核酸序列的变体编码，所述变体每个被限定为与SEQ ID NO：1或2的序列比较，具有一个或多个取代，插入和/或缺失，在所述变体在适度严格条件下与包含SEQ ID NO：1或2的序列的核酸杂交的条件下，或在所述变体包含由于遗传密码子的简并性所造成的核酸变化的条件下，其编码与SEQ ID NO：1或2的核酸序列相同或功能上等价的氨基酸。
术语“核酸序列”指这些核苷酸的杂聚物或这些核苷酸的序列。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文交互地使用来指核苷酸的杂聚物。
杂交的严格性，用于本文时，指这样的条件下，在所述条件下，所述多核苷酸双链体是稳定的。如本领域那些技术人员已知的，双链体的稳定性是钠离子浓度和温度的函数(见，例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory，(1989))。用于杂交的严格性水平可以容易地由本领域那些技术人员来改变。
用于本文时，短语“适度严格条件”指这样的条件，其容许DNA结合于互补核酸，所述互补核酸与所述DNA具有约60％的同一性，优选地约75％的同一性，更优选地约85％的同一性；其中与所述DNA大于约90％的同一性是尤其优选的。优选地，适度严格条件是这样的条件，其等价于在50％甲酰胺，5xDenhart′s溶液，5xSSPE，0.2％SDS中于42℃进行杂交，随后在0.2xSSPE，0.2％SDS，于65℃进行洗涤。
注意到，本发明意欲两种不同种类的ADF-3和ADF-4编码序列：第一，ADF-3和ADF-4已经公开的序列(本文：“野生型”序列)和第二，其变体，由SEQ ID NO：1(ADF-3)和2(ADF-4)编码。野生型序列已经公开并且可以在登记号U47855和U47856(SEQ ID NO：3和4)下获得。
如上解释，丝纤维具有β-折叠的晶体区域，其间散布类似于液体晶体聚合物的弹性无定形片段。这两种片段由两种不同的蛋白质，由不同的基因编码的MaSp I(主要的壶腹状spidroin I)和MaSp II(主要的壶腹状spidroin II)代表。
本发明的核酸序列优选地是ADF-3，ADF-4(SEQ ID NO：1和2)或其变体。SEQ ID NO：3和4显示野生型序列的相应的氨基酸序列。
按照优选实施方案，本发明的方法提供由聚合物组成的蜘蛛丝蛋白，其构件被限定为一个或多个如上定义的蛋白质或所述蛋白质的变体。本发明的蛋白质的氨基酸序列还涵盖通过氨基酸插入、缺失和置换而与本文公开的序列不同的所有的序列。
优选地，氨基酸“置换”是一种氨基酸被具有类似结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代，即保守性氨基酸取代的结果。氨基酸置换可以在涉及的残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的类似性基础上进行。例如，非极性(疏水)氨基酸包括，丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸；带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
“插入”或“缺失”典型地在约1-5个氨基酸，优选地约1，2或3个氨基酸范围内。氨基酸添加典型地不超过100，优选地不超过80，更优选地不超过50，最优选的不超过20个氨基酸，其添加在本发明的蛋白质上和/或插入其中。注意到本发明仅意欲那些的添加，其不会对本文公开的蛋白质的机械和其它的性质具有不利影响。
可以使用重组DNA技术并分析得到的重组变体的活性，通过在蛋白质中系统性进行氨基酸的插入，缺失或置换来对容许的改变进行实验性确定。这不需要本领域技术人员进行超出常规的实验。
按照优选的实施方案，将上述限定的一个或多个核酸序列包含在载体中。优选地，该载体是表达载体，其包含编码上述定义的一个或多个拖丝蛋白的核酸序列和一个或多个调节序列。这些调节序列可以优选地包括启动子p10和/或多角体蛋白，但是也可以使用其它的晚期和极晚期的杆状病毒启动子。
所述载体更优选地是病毒载体，最优选地是杆状病毒载体系统或痘苗病毒载体系统。还可以在本发明中使用另外的病毒载体系统。根据不同的情况，可能需要对载体进行修饰。另外的病毒载体的实例是腺病毒和所有的负链RNA-病毒，例如狂犬病毒，麻疹病毒，RSV，等。
作为昆虫细胞，可以优选地使用鳞翅目昆虫细胞，更优选地来自Spodoptera frugiperda和来自粉夜蛾(Trichoplusia ni)的细胞。最优选地，所述昆虫细胞是Sf9，Sf21或高效(high five)细胞。
昆虫细胞表达系统，例如相对于细菌系统的一个优势在于这样的事实，即产生的蛋白质被糖基化，由此作为微生物降解的靶标。这种性质例如在药物领域，只要丝蛋白质倾向于其中需要生物降解的体内应用，可能是是重要的。该性质可以特别应用在缝线材料和伤口闭合和覆盖系统中。
按照另一个优选实施方案，表达的拖丝蛋白仅是由野生型ADF-4或由SEQ ID NO：2编码的ADF-4。
作为备选，表达的拖丝蛋白仅是野生型ADF-3或作为拖丝蛋白的由SEQ ID NO：1的核酸编码的氨基酸。
本发明人令人惊奇地发现，与现有技术的概念相反，两种已知的主要的拖丝蛋白中只有一种(优选地ADF-4)是生产和装配拖丝丝线所需要的。因此，制备拖丝的丝的已知方法可以通过使用仅一种成分来制备拖丝的丝取代用两种成分来制备拖丝的丝，来将拖丝的丝的制备大大简化，如本领域已知的。因此，仅由ADF-3，并且优选地仅由ADF-4组成的拖丝的丝是本发明的优选实施方案。
MaSpI类可以通过氨基酸脯氨酸的含量来从MaSpII中区分出来。在MaSpII类中，不存在另外的正式的分类。然而，ADF-3和ADF-4彼此在它们的氨基酸谷氨酰胺的含量和在聚丙氨酸区域的间隔和长度中不同。因此，本领域技术人员可以容易地确定在MaSpII中，分别对应于ADF-3和ADF-4的区域。
优选地，所述拖丝蛋白的表达通过分泌表达发生。对于进一步的解释，见实施例章节。备选地，表达通过胞质生产而发生。如在实施例中显示，在昆虫细胞中用于表达的条件导致令人惊讶的结果-如上提及-蜘蛛丝蛋白以高产量和良好的品质表达，并且此外，那些蛋白质自装配为线已经在胞质中发生，而不需要另外的生产步骤。
在本发明的背景中，可以使用用于生产蜘蛛拖丝蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：
a)表达如上所限定的蜘蛛拖丝蛋白，
b)回收所述蛋白，和
c)通过适合的方法将所述蛋白旋转(spining)为线。
在步骤c)中，可以使用本身为本领域已知的旋转方法。例如，蜘蛛丝蛋白的粘稠物溶液通过吐丝器挤压形成生物丝。得到的生物丝可以牵引或伸长。只要分子的晶体和无定形排列存在于生物丝中，牵引或伸长将施加足以使分子定向使它们更加平行于丝壁的切应力并增加生物丝的拉伸强度和韧性。
粘稠物溶液可以包含来自一种或多种蜘蛛物种的丝蛋白，或来自不同产丝种属的丝蛋白的混合物，例如来自蜘蛛和B.mori的丝蛋白的混合物。在大多数优选的实施方案中，所述的丝蛋白是来自N.clavipes或A.diadematus的拖丝的丝，尤其是蛋白MaSpI，MaSpII，ADF-3，和ADF-4。在备选实施方案中，粘稠物溶液包含丝蛋白和一种或多种合成聚合物或天然或合成生物丝蛋白的混合物。
优选地，粘稠物溶液是至少1％，5％，，10％，15％重量/体积(w/v)丝蛋白。更优选地，所述粘稠物溶液是多到20％，25％，30％，35％，40％，45％，或50％w/v的丝蛋白。在优选的实施方案中，粘稠物溶液包含基本纯的蜘蛛丝蛋白。在优选的实施方案中，粘稠物具有约6.9的pH。
所谓“粘稠物溶液”指包含丝蛋白的任何液体混合物，并且易于挤压来形成生物丝或薄膜铸塑。除了蛋白质单体之外，粘稠物溶液还可以包含更高级的团聚体，其包括，例如二聚体，三聚体和四聚体。通常，粘稠物溶液是pH 4.0-12.0的水溶液并具有少于40％的有机或离液序列高的试剂(w/v)。优选地，所述粘稠物溶液不包含任何有机溶剂或离液序列高的试剂，但是可以包括添加剂来增加溶液的防腐性、稳定性或可使用性。
至于“丝”，是指不确定长度的纤维，范围在极微的长度到一英里或更长的长度。丝(silk)是天然的丝，而尼龙和聚酯作为合成丝的实例。
至于“生物丝”指从蛋白质产生(例如，纺)的丝，所述蛋白质包括重组产生的蜘蛛丝蛋白。
关于怎样纺织(spin)蜘蛛丝蛋白纤维的另外的信息可以见于WO03060099(Karatzas et al.)，其公开于2003年7月24日，将其并入本文作为参考。
本发明还包括蜘蛛拖丝蛋白质或线，其包括由SEQ ID NO：1和/或2的核酸编码的氨基酸序列；或其变体。
在优选的实施方案中，所述蜘蛛拖丝蛋白质/线仅包括野生型ADF-4或由SEQ ID NO：2的核酸编码的氨基酸作为拖丝蛋白质。
作为备选，所述蜘蛛拖丝蛋白质/线仅包括野生型ADF-3或由SEQ IDNO：1的核酸编码的氨基酸作为拖丝蛋白质。
按照另一个方面，本发明提供包括上述定义的蛋白质或由其组成的凝胶或泡沫。作为怎样产生这些泡沫和凝胶的实例可以见于实施例，见下面的“蜘蛛丝衍生蛋白质的装配”章节。
此外，本发明涉及用于植入物和斯滕特固定模的涂层，所述涂层包含上述定义的本发明的蛋白质或由其组成。根据不同的用途，所述涂层可以由可溶的蛋白质、薄膜、凝胶、泡沫、纳米纤维和线制备。一般而言，在非生物材料诸如陶瓷、金属、塑料等上的蛋白质涂层“隐藏”非生物表面，预防炎症反应或身体的排斥。所述蛋白质涂层将容许细胞结合，这将封住非生物的材料。此外，植入-相关炎症的减少可以通过选择那些移植物材料来实现，所述移植物材料与以前用在斯滕特固定模-植入物装置中的那些相比，固有地更具生物相容性。常规移植物材料诸如PET聚酯和尼龙具有高溶解性因素，其显示所述材料倾向于在天然脉管(vessel)中更高速率地溶解并因此更易于发生炎症反应。
本发明的材料显示理想的特性，其抑制在其它在斯滕特固定模-移植物应用中常用的聚合物材料中观察到的炎症反应。
本发明还提供线或纤维，其包括如上定义的蛋白质，线或纤维和非蜘蛛来源的另外的材料或纤维，优选地是植物来源的材料或纤维。例如，蜘蛛丝蛋白和棉花的混和的纤维可以是有利的。
待用的另外的纤维包括尼龙、芳族聚酰胺，芳纶，羊毛，碳纤维，胶原蛋白纤维，纤维素，角蛋白纤维，弹性蛋白纤维，树胶等的一种或多种。
作为另外的方面，本发明提供载体，其包含编码作为唯一的拖丝蛋白质的野生型ADF-4的核酸或其包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的核酸。
在另一个方面中，提供杆状病毒载体，其包含编码一种或多种拖丝蛋白质的核酸，优选地拖丝蛋白质ADF-3，ADF-4(野生型)，ADF-3(SEQ IDNO：1)和/或ADF-4(SEQ ID NO：2)的核酸。
如已经在上面解释，本文定义的蛋白质/线可以用在生物技术和/或药物的领域中，优选地用于制备伤口闭合或覆盖系统，用在神经外科手术或眼科外科手术中的缝线材料。
令人惊讶地，证实本发明的蛋白质和由其制备的纤维、线和另外的材料显示抗微生物，特别是抗细菌的性质。由于它们的固有的可生物降解性，它们对于在人或动物中的体内应用具有理想的特性。因此，通过使用本发明的蛋白质和由其衍生的材料，在外科手术中对身体的有害影响可以被最小化，另外的外科手术可以避免并且可以加速在外科手术后的逐渐康复(reconvalescence)。
此外，蛋白质/线可以优选地用于制备替代材料，优选地人造软骨或腱材料。
另外的应用是人造替换物，优选地人造替换肺的稳定。
另外，本发明的线/纤维可以用于制备医学装置诸如医学粘附带，皮肤移植物，替代的韧带，和外科手术网眼；和用于制备广泛范围的工业和商业产品诸如衣服织物，防弹衣衬里，容器织物，包或钱包带，缆，绳，粘附性结合材料，非粘附性结合材料，皮带材料，交通工具覆盖物和零件，建筑材料，混凝土，颜料，聚硅氧烷，耐候性材料，柔性分割材料，运动设备；和事实上高拉伸强度和弹性是需要的特性的纤维或织物的任何应用中。本发明还意欲以其它形式存在的稳定的纤维产品，诸如于的喷雾剂涂层，珠子样颗粒的适应性和应用，或在与其它的组合物的混合物中的使用。
除非另外指出，本文所用的所有的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员公知的具有相同的含义。将所有的出版物，专利申请，专利，和其它的本文提及的参考文献全部内容并入本文作为参考。如有冲突，本说明书，包括定义将进行控制。此外，所述材料，方法和实施例仅是举例说明性的，而不倾向于限制。
现在，本发明还通过实施例和附图进行举例说明，所述附图显示如下：
图1adf-3(SEQ NO：1)和adf-4(SEQ NO：2)在sf9细胞中的表达。(A)ADF-3和ADF-4在合成后的溶解度。细胞裂解物的可溶(S)和不可溶的成分(P)通过沉降进行分离。用抗-His6抗体通过免疫印迹法来检测蛋白质。(B)在adf-4表达细胞中的丝，如用光学显微镜(上板)和在进行免疫细胞化学后用荧光显微镜(中板)观察到的。将另一种细胞的在免疫细胞化学后的另外的共焦荧光图像显示在下板中。标尺：10μm。(C)共合成的ADF-3和ADF-4的溶解度。可溶(S)的细胞成分通过沉降从不可溶(P)的细胞成分中分离出来。在蛋白质印迹后，用S-蛋白质-过氧化物酶缀合物检测ADF-3，并用抗-T7-标记抗体来检测ADF-4。(D)用mel-His6-adf-4病毒感染在混悬液中的Sf9细胞。在指定的时间(在感染后的天数)，将等价于6×104细胞的等分试样取自培养基，将其进行离心来去除细胞并进行SDS-PAGE，随后进行免疫印迹。(E)将用mel-his6-adf-4病毒感染达3天的细胞进行免疫荧光。在细胞表面上的分泌小泡能够被清楚地检测到。标尺10μm。
图2ADF-4丝和团聚体的形态学。(A)在纯化的丝上的扫描电镜观察。标尺：5μm(B)在纯化的丝上的透射电镜观察。标尺：500nm(C)使用小鼠抗-His6抗体，随后用金-缀合的抗-小鼠抗体在纯化的丝上的免疫电镜观察。标尺：500nm(D，E)原子力显微镜(AFM)观察：(D)高度图像(E)偏转图像。丝的高度是0.7μm。标尺5μm。
图3 ADF-4丝和拖丝丝线的化学稳定性。(A)如指示对ADF-4丝进行变性。未溶解的丝和团聚体没有进入凝胶。使用抗-His6抗体通过免疫印迹法对溶解的ADF-4进行检测。还对用6M GdmSCN进行处理的样品进行银染(GdmSCN/S)。(B)用如指示的～0.1μl的每种溶液将在云母上的风干的ADF-4的丝和在聚丙烯上的拖丝的丝线进行温育达30秒。用水漂洗后，通过光学显微镜来检查样品。标尺25μm。
图4(A)通过光学显微镜来观察在Sf9细胞中形成的没有His6-标记的ADF-4的丝。(B)在用扫描电镜研究adf-3(SEQ NO：1)和adf-4(SEQ NO：2)的双重表达后获得的丝的形态学。(C)用光学显微镜来使表达adf-3(SEQ NO：1)的Sf9细胞成像。(D)ADF-3的细胞定位。将被adf-3(SEQ NO：1)病毒感染3天的细胞进行免疫荧光分析。(E)通过扫描电镜观察到的体外复性后，ADF-4团聚体形成。(F)体外形成的ADF-4团聚体的化学稳定性。如所示，在用变性剂处理后，通过免疫印迹法来检测溶解的ADF-3。标尺5μm(B，E)和10μm(A，C，D)。
图5：蜘蛛丝蛋白的装配形式。(A)通过扫描电镜(SEM)来观察的由基于ADF-4的蛋白质形成的球体。(B)通过原子力显微镜观察的由基于ADF-4的蛋白质形成的纳米纤维(高度信息)。(C，D)通过SEM研究由基于ADF-3的蛋白质形成的微纤维(C).对于切割纤维并随后观察截面，使用聚焦的Ca+离子束(D)。(E)产生自基于ADF-3的蛋白质溶液的泡沫。(F)产生自基于ADF-4的溶液的泡沫。(G)由ADF-4纳米纤维形成的交联的凝胶。在图5中描述的ADF-3和ADF-4分别对应于SEQ ID NO：1和2。
图6：产生自本发明的蜘蛛丝蛋白的薄膜。将ADF-3衍生的蛋白质以20mg/ml的浓度溶解在1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇中。将200μl的溶液分散在聚苯乙烯表面上(约20cm2)。在将溶剂蒸发后，可以得到透明的蛋白质薄膜。
实施例
本文提供的改善基于这样的观念，即同时表达和研究十字园蛛的拖丝的丝的两种主要的蛋白质成分。由于昆虫属于与蜘蛛相同的门，本发明人选择昆虫细胞系Sf9(来自秋黏虫Spodoptera frugiperda)，使用杆状病毒作为载体进行adf-3和adf-4的表达。产生包含adf-3和adf-4的部分cDNAs的重组杆状病毒(14)。为了监测合成，提供具有His6-标记的两种蛋白质。为了排除由所述标记所导致的人工序列，还使用无His6-标记的形式。
将重组病毒用于感染Sf9细胞以在胞质中产生蜘蛛丝蛋白。3天温育后，通过超声波处理来将昆虫细胞裂解并将不可溶的细胞内容物通过沉降从可溶的材料中分离出来。在进行免疫印迹分析之前，将所述沉降物溶解在硫氰酸胍(GdmSCN)中。
尽管发现ADF-3的大量级分是可溶的，在所用条件(图1A)和不存在His6-标记(图4A)的情况下，在感染后3天ADF-4几乎完全不可溶。令人惊奇的是，研究在表达adf-4(SEQ NO：2)的细胞中的团聚体揭示穿过胞质卷曲的丝，其中大多数细胞仅包含均一宽度的一条或极少的丝(图1B)。与此相反，用对照病毒感染的细胞或adf-3(SEQ NO：1)编码的病毒从不产生这样的丝(图4C，D)。使用抗His6抗体在被感染的细胞上进行的免疫荧光显示所述丝的特异性染色因此证实所述丝由ADF-4组成(图1B)。
接下来，本发明人研究ADF-3和ADF-4是否可以共装配成丝。本发明人使用pFastbacDUAL供体质粒，产生在不同的和独立的启动子下，包含adf-3(SEQ NO：1)和adf-4(SEQ NO：2)的重组杆状病毒。用该病毒感染sf9细胞导致两种蛋白质的合成，并且与单独由ADF-4的合成形成的丝相比，蛋白质丝的形成显示相似的外观(图4B)。有趣的是，在双重表达系统中装配的丝全部由ADF-4形成，而没有结合或与其稳定缔合的ADF-3(图1C并且数据未显示)。
为了研究表观自装配是否仅基于ADF-4的性质或是否涉及另外的因素或变化，本发明人产生编码His6-ADF-4的分泌形式的重组杆状病毒。用该病毒感染细胞导致ADF-4在细胞的培养基中的聚集(图1D)。免疫荧光揭示在被感染的细胞的细胞表面包含ADF-4的分泌小泡的丰度(图1E)。显著地，本发明人在宿主细胞的区室和在培养基中都没有观察到ADF-4丝的任何形成。
丝线的形成一般取决于蛋白质的浓度以及另外的因素。有趣的是，在丝线装配前，Sf9细胞的细胞内pH 6.3对应于在纺丝粘稠物中的pH(19)。在胞质环境中的ADF-4丝装配所需要的另外的因素仍是难以捉摸的。体外研究ADF-4的自装配的性质强调另外的因素的重要性。通过将丝溶解在6M GdmSCN中来容易地获得可溶的ADF-4。在通过透析或稀释去除GdmSCN后，溶解的ADF-4迅速聚集。然而，体外形成的ADF-4团聚体既没有显示纤维结构，也没有显示在Sf9细胞内部形成的ADF-4丝的化学稳定性(见下面和图4E，F)。上述发现显示特定的胞质环境的重要性，其可以包括另外的，至今尚未确定的对于控制自装配而言是重要的胞质因素。
接下来，发明人对ADF-4丝的形态特征进行鉴定。丝的直径范围在200nm到1μm，然而对于每条单丝，发现直径是不变的。此外，所述丝显示多到100μm的长度，并且经常终止于结、分支或形成闭合的环(图2A，D，E)。丝显示平滑的表面并且经常与纳米纤维(直径～5nm)和其它的蛋白质团聚体(图2)相关。免疫印迹法和免疫电镜显示丝和相关的装配形式由ADF-4组成(图2C，3A)。如通过SDS-PAGE分析随后通过银染观察到的(图3A)，除了ADF-4之外，在丝中不能检测到其它的丰富的蛋白质。每个细胞的少量的丝和几乎全部的细胞内ADF-4聚集成团聚体显示ADF-4在sf9细胞中的自装配可能是具核的过程，这在以前也在家蚕蛾(Bombyx mori)的纺丝过程中被建议(20)。
在SF9细胞中形成的丝的大小似乎被产生它们的细胞的体积限制得过短而不能进行对于丝线而言是典型的机械力测量(21)。然而，发明人能够与十字圆蛛的天然的拖丝的丝线比较来分析湿和干的ADF-4丝的化学稳定性。已经报道拖丝的线在许多变性剂中是不可溶的(22)。应用2％的十二烷基硫酸钠(SDS)和8 M的尿素在30秒的暴露后，没有对ADF-4的丝和拖丝的线的结构产生明显的影响(图3并且数据未显示)。将丝浸没在6M的氯化胍(GdmCl)中没有导致ADF-4丝或拖丝的线的溶解，尽管其导致拖丝的丝的溶胀。这种溶胀可能是由于纤维的过收缩所引起(21)，这以前对于将蜘蛛丝浸没在水溶液中描述过，并且由在无定形基质中的氢键的再形成所导致(21)。与上面提及的变性剂相反，小滴的6M GdmSCN在数秒内将ADF-4丝以及拖丝的线彻底溶解(图3)。结果，发明人得出结论，两种结构具有分子相互作用，其对针对特定变性剂的化学抗性负责。
方法
质粒构建
将SEQ NO：1和2的cDNAs克隆入来自Invitrogen的pFastBacTM供体质粒。将编码肽标记的序列于5’末端提供给基因片段。对于His6-标记的蛋白质，利用SpeI/XhoI将基因从宿主载体上切下来并连接以同样消化的pFastBacTMHTa。对于T7-标记(23)的蛋白质，首先利用XhoI和EcoRI将基因克隆入pET21。随后用BglII和XhoI切除包括T7-标记编码区的插入片段并连接以用BamHI/XhoI消化的pFastBacTM1。为了共表达adf-3(SEQ NO：1)和adf-4(SEQ NO：2)，将两种基因克隆入pFasBacTMDUAL并提供以编码T7-和S-标记(24)的序列。用BglII/XhoI将adf-4(SEQ NO：2)从pET21-adf-4(SEQ NO：2)上切下来并连接以用NheI/BamHI裂解的pFasBacTMDUAL。将两种合成性寡核苷酸(MWG Biotech)进行退火以提供S-标记编码序列，其得到具有NheI/BamHI相容性单链延伸的双链DNA：
5’-CTAGCCCGGGATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCA
GCACATGGACAGCGGTCGG-3’(SEQ ID NO：5)
5′-GATCCCGACCGCTGTCCATGTGCTGGCGTTCGAATTTAGCAGCAGC
GGTTTCTTTCATCCCGGG-3’(SEQ ID NO：6)
用NheI/BamHI消化pET21-adf-3(SEQ NO：1)以除去T7-标记编码区。随后将载体连接以S-标记编码DNA。利用XhoI/XmaI将S-标记的adf-3(SEQ NO：1)克隆入pFasBacTMDUAL-adf-4(SEQ NO：2)。在双重构建体中，adf-3和adf-4在独立的p10(25)和多角体蛋白(26)启动子的控制之下。利用pMIB/V5-HisA载体(Invitrogen)作为模板和包含CpoI限制酶切位点的下列引物通过PCR扩增蜜蜂蜂毒肽的分泌信号的编码序列：
5′-CCTTCCCGGTCCGCCATGAAATTCTTAGTCAAC(SEQ ID NO：7)
5′-CCTTCCCGGACCGGGCATAGATGTAAGAAAT(SEQ ID NO：8)
用CpoI剪切得到的PCR产物并连接入同样消化的pFasBacTMHTa-adf-4(SEQ NO：2)中。通过测序对阳性克隆检查方向和正确性。
细胞培养
在BIOINSECT-1无血清昆虫细胞培养基(Biological Industries)中于27℃增殖sf9(Spodoptera frugiperda；ATCC#：CRL-1711)细胞。将sf9细胞作为单层培养于6孔板中的盖玻片上或生长于80rpm振荡的摇瓶中。包含adf-3(SEQ NO：1)和adf-4(SEQ NO：2)的重组杆状病毒的生产
根据生产商的方案(Invitrogen)使用包含bacmid(杆状病毒穿梭载体质粒)和辅助质粒的感受态大肠杆菌DH10BAC细胞来产生重组bacmids。通过PCR来证实基因插入bacmid。在6孔板中用ESCORT转染试剂(Sigma-Aldrich)以重组bacmid DNA转染sf9细胞。将细胞于27℃温育5h，漂洗，并再温育72h。收集培养基，离心，并通过斑测定法滴定包含病毒的上清液。
adf-3和adf-4的表达
以0.1-10范围的各种MOIs(感染复数)用重组病毒感染sf9细胞(3×106细胞/ml)。感染后(PI)三天，通过于500xg离心5min收集细胞。ADF-3和ADF-4的检测和溶解性
以1.2×107细胞/ml将细胞重悬于100mM NaCl，20mMN(2-羟基乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)，pH 7.5中并通过超声波处理进行裂解。通过于125,000xg离心30min分离可溶的和不可溶的组分。为了进一步的分析，将沉淀物重悬于6MGdmSCN并针对8 M尿素进行透析。将源自1.5×105细胞的上清液和沉淀物加样在还原性条件下的10％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上并点印到PVDF膜(Millipore)上。使用小鼠抗His6单克隆抗体(Sigma-Aldrich，1∶10,000)或小鼠抗T7单克隆抗体(Novagen，1∶10,000)和抗小鼠IgG过氧化物酶缀合物(Sigma-Aldrich，1∶5,000)作为二抗来检测蜘蛛丝蛋白。使用S-蛋白过氧化物酶缀合物(Novagen，1∶5,000)来直接检测S-标记的ADF-3。
免疫细胞化学
用包含adf-3(SEQ NO：1)或adf-4(SEQ NO：2)的重组病毒于MOI＝10来感染50％汇合的生长在盖玻片上的细胞。感染后(PI)三天将细胞用甲醇于-20℃固定。用1∶300稀释的小鼠抗His6单克隆抗体(Roche)温育盖玻片，随后用1∶500稀释的得克萨斯红缀合的抗小鼠二抗IgG来进行温育。用Olympus BX51荧光显微镜观察细胞并用Magnafire SP相机照相或通过共聚焦显微镜进行分析。
ADF-4-丝纯化
将细胞以1.2×107细胞/ml重悬于100mM NaCl，2mM HEPES，pH7.5，并通过加入2％w/v十二烷基硫酸钠随后于95℃温育5min来进行裂解。将线于5,000xg进行沉降随后用8M尿素和Water bidest洗涤。原子力显微镜(AFM)，扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)
将纯化的丝重悬于Waterbidest中并在新裂解的云母(AFM)上温育3分钟或加载到Thermanox塑料盖玻片(Nalgene Nunc)上(SEM)。对于AFM，用Waterbidest漂洗样品四次并在利用Multimode SPM(Veeco)连接模式成像之前进行风干。对于SEM，在除去溶液后将样品风干，真空涂布以金层并用JSM-5900LV(JEOL Ltd，)于20 kV上进行分析。对于TEM(JEOL Ltd.)分析，将丝吸附到透明塑胶涂布的载网上并以乙酸双氧铀进行负染色。对于免疫染色，将纤维与小鼠抗-His6抗体一起温育，随后用18mm金缀合的山羊抗小鼠IgG进行标记。
没有His6标记的ADF-4的线形成
为了排除His6标记对于丝形成的可能影响，在Sf9细胞中合成T7-标记的ADF-4。T7-标记的ADF-4的丝形成显然与His6标记的ADF-4的丝形成没有区别(图4A)。
在adf-3(SEQ NO：1)和adf-4(SEQ NO：2)共表达细胞中的线形成
在共表达adf-3和adf-4的Sf9细胞中，与在只产生ADF-4的细胞中形成的丝相比，可以检测出显示明显无区别形态的丝(图4B)。
在Sf9细胞中adf-3(SEQ NO：1)的表达
尽管免疫细胞化学揭示了在表达adf-3(SEQ NO：1)的细胞中的荧光聚焦，但并不能观察到丝样的结构(图4C，D)。重要的是，在Sf9细胞中合成的ADF-3是非常易溶的。所以聚焦形成代表了亚细胞积聚而不是蛋白质聚集。
ADF-4的体外装配
ADF-4在通过透析除去变性剂或在稀释入水性缓冲液之后聚集。得到的团聚体并不显示任何纤维状的形态(图4E)。测试化学稳定性显示与在细胞质中形成的ADF-4丝相反，体外形成的团聚体可溶于2％SDS或8M尿素(图4F)。
蜘蛛丝来源的蛋白质的装配
进行下列实验以证明来自蜘蛛丝序列ADF-3(SEQ ID NO：1)或ADF-4(SEQ ID NO：2)的蛋白质能够装配成形态不同的形式。如在Biochemistry2004 Vol.43 pp.13604-11362(27)中所述来在水溶液中构建、产生和制备基于ADF-3和ADF-4的蛋白质。如果没有另外提及，蛋白质溶液包含10mM的Tris-(羟甲基)-氨基甲烷(Tris)pH 8.0。
1.球体
通过将0.8 M的硫酸铵加入0.2％(w/v)的基于ADF-4的蛋白质溶液来产生显示直径范围在0.5到2μm之间(图5a)的蛋白质球体。
2.纳米纤维
通过将1％(w/v)基于ADF-4的蛋白质溶液在室温温育2周来形成显示直径在0.7和4nm之间(图5b)的纳米纤维。
3.微纤维
为了形成微纤维，将5-10μl的25％(w/v)的基于ADF-3的蛋白质溶液缓慢注射到0.5M的磷酸钾pH 8.0中，形成稳定的蛋白质溶液液滴。在温育1分钟后，使用镊子将蛋白质液滴从溶液中去除。在空气中再温育1分钟后，使用第二组镊子可以将蛋白质纤维从蛋白质液滴中以约2cm/s的速率从蛋白质液滴中抽提。所述纤维显示具有4μm的直径的圆形截面(图5c，d)。
4.泡沫
将蛋白质泡沫(图5e，f)产生自包含2.5mM的过二硫酸铵(APS)，100μM的tris(2，2′-二吡啶基)二氯钌(II)(Rubpy)和10％(w/v)的基于ADF-3的蛋白质或2％(w/v)的基于ADF-4的蛋白质的溶液。所述蛋白质溶液用空气发泡。为了稳定得到的泡沫结构，将蛋白质通过暴露于来自钨灯的可见光达1分钟来进行交联(28)。随后在95℃对泡沫进行干燥。
5.凝胶
在1％(w/v)浓度的基于ADF-4的纳米纤维(见节2)显示凝胶样的外观，其可容易地通过搅拌或剪切而被破坏。为了改善凝胶的机械性质，容许APS和Rubpy通过扩散进入凝胶来产生10mM APS和100μM Rubpy的终浓度。在光诱导交联后(见，节4)，可以获得在尺寸上稳定的凝胶(图5g)。
6.薄膜
将ADF-3衍生的蛋白质以20mg/ml的浓度溶解在1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇中。将200μl的溶液分散在聚苯乙烯表面上(约20cm2)。在将溶剂蒸发后，可以得到透明的蛋白质薄膜(见，图6)。
参考文献
1.J.M.Gosline，P.A.Guerette，C.S.Ortlepp，K.N.Savage，J.Exp.Biol.202 Pt23，3295-3303(1999).
2.J.Warwicker，J.Mol.Biol.2,350-362(1960).
3.A.H.Simmons，E.Ray，L. W.Jelinski，Macromolecules 27，5235-5237(1994).
4.A.D.Parkhe，S.K.Seeley，K.Gardner，L. Thompson，R.V.Lewis，J.Mol.Recognit.10，1-6(1997).
5.J.D.van Beek，S.Hess，F.Vollrath，B.H.Meier，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A99，10266-10271(2002).
6.D.H.Hijirida et al.，Biophys.J.71，3442-3447(1996).
7.K.Kerkam，C.Viney，D.Kaplan，S.Lombardi，Nature 349，596-598(1991).
8.D.P.Knight and F.Vollrath，Proc.R.Soc.Lond.519-523(1999).
9.D.P.Knight and F.Vollrath，Naturwissenschaften 88，179-182(2001).
10.F.Vollrath，D.Knight，X.W.Hu，Proc.R.Soc.Lond B Biol.Sci.265，817-820(1998).
11.E.K.Tillinghast，S.F.Chase，M.A.Townley，J.Insect Physiol.30，591-596(1984).
12.D.P.Knight，M.M.Knight，F.Vollrath，Int.J.Biol.Macromol.27，205-210(2000).
13.S.Winkler and D.L.Kaplan，J.Biotechnol.74，85-93(2000).
14.P.A.Guerette，D.G.Ginzinger，B.H.Weber，J.M.Gosline，Science 272，112-115(1996).
15.J.Gatesy，C.Hayashi，D，Motriuk，J.Woods，R.Lewis，Science 291，2603-2605(2001).
16.S.Arcidiacono，C.Mello，D.Kaplan，S.Cheley，H.Bayley，Appl.Microbiol.Biotechnol.49，31-38(1998).
17.J.Scheller，K.H.Guhrs，F.Grosse，U.Conrad，Nat.Biotechnol.19，573-577(2001).
18.A.Lazaris et al.，Science 295，472-476(2002).
19.V.Vachon，M.J.Paradis，M.Marsolais，J.L.Schwartz，R.Laprade，Biochemistry34，15157-15164(1995).
20.G.Li et al.，Eur.J.Biochem.268，6600-6606(2001).
21.Z.Shao，R.J.Young,F.Vollrath，Int.J.Biol.Macromol.24，295-300(1999).
22.S.Lombardi and D.Kaplan，J.Arachnol.18，297-306(1990).
23.Kroll，D.J.etal.DNA Cell Biol.12，441-453(1993).
24.Kim，J.S.&Raines，R.T.Protein Sci.2，348-356(1993).
25.Knebel，D.，Lubbert，H.&Doerfier，W.EMBO J.4，1301-1306(1985).
26.Smith，G.E.，Summers，M.D.&Fraser，M.J.Mol.Cell Biol.3，2156-2165(1983).
27.Huemmerich，D.，Helsen，C.W.，Oschmann，J.，Rudolph，R.&Scheibel，T.Biochemistry43，13604-13612(2004)
28.Fancy，D.A.&Kodadek，T.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96，6020-6024(1999)
<110>慕尼黑技术大学
<120>天然来源的蛋白质和由其制备的材料
<130>P19231
<140>
<141>
<150>US60/583,227
<151>2004-06-25
<150>EP05005395.8
<151>2005-03-11
<160>8
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1914
<212>DNA
<213>十字园蛛ADF-3修饰的序列
<400>1
gcacgagccg gatctggaca acaaggaccc ggacaacaag gacccggaca acaaggaccc
    60
ggacaacaag gaccatatgg acccggtgca tccgccgcag cagcagccgc tggaggttat
   120
ggacccggat ctggacaaca aggacccagc caacaaggac ctggccaaca aggacccggt
   180
ggtcaaggac catatggacc cggtgcatcc gccgccgcag cagccgctgg tggatatgga
   240
cccggttccg gacaacaagg accaggaggt caaggaccat atggacctgg ttcatccgct
   300
gccgcagcag ccgctggagg taatggaccc ggatctggac aacaagggcc cggtcaacaa
   360
ggtcctggac aacaaggacc cggtgcatcc gccgccgcag cagccgctgg aggatacgga
   420
cccggatctg gacaacaagg acccggacaa caaggaccag gaggtcaagg accatatgga
   480
cctggtgcat ccgccgctgc agcagccgct ggaggatacg gacccggatc tggacaacaa
ggacccggac  aacaaggacc  aggaggtcaa  ggaccatatg  gacccggtgc  atccgctgca
   600
gcagcagccg  ctggaggtta  tggacccgga  tctggacaac  aaggacccgg  acaacaagga
   660
cctggacaac  aaggacccgg  tggtcaagga  ccatatggac  ccggtgcatc  cgccgccgca
   720
gcagccgctg  gaggatacgg  acccggttat  ggacagcaag  gaccaggaca  acaaggacca
   780
ggaggtcaag  gaccatatgg  acctggtgca  tccgccgcct  cagcagcctc  tggaggatac
   840
ggacccggat  ctggacaaca  aggacccgga  caacaaggac  ctggaggtca  aggaccatat
   900
ggacctggtg  catccgccgc  agcagcagcc  gctggaggtt  atggacccgg  atctggacaa
   960
caaggaccag  gccaacaagg  acccggtcaa  caaggacctg  gacaacaagg  acccggtggt
   1020
caaggaccat  atggacctgg  tgcatccgcc  gcagcagcag  ccgctggagg  ttatggaccc
   1080
ggatctggac  aacaaggacc  cggtcaacaa  ggacccggtc  aacaaggacc  cggtcaacaa
   1140
ggacccggtc  aacaaggacc  cggccaacaa  ggacccggtc  aacaaggacc  cggccaacaa
   1200
ggacctggtc  aacaaggtcc  cggtggtcaa  ggggcatatg  gacctggtgc  atccgccgca
   1260
gcaggagccg  ctggaggtta  tggacccgga  tctggacaac  aaggacccgg  acaacaagga
   1320
cccggacaac  aaggacccgg  acaacaagga  cccggacaac  aaggacccgg  acaacaagga
   1380
cccggacaac  aaggacccgg  acaacaagga  ccatatggac  ctggtgcatc  cgccgcagca
   1440
gcagccgctg  gaggttatgg  acccggatct  ggacaacaag  gacccggcca  acaaggacct
   1500
ggacaacaag  gacccgttgg  tcaaggacca  tatggacctg  gtgcggcttc  tgcagctgta
   1560
tctgttggag  gatatggacc  acaaagctcc  tcggctcctg  ttgcatcagc  agccgcttct
   1620
cgcctttctt  ctccagcggc  cagttctaga  gtttcatcgg  ctgtatcatc  tttggtatct
   1680
agtggaccta  ctaatcaagc  tgcactttct  aatactatca  gtagcgttgt  atcgcaagtt
   1740
agtgcaagta  atcctggtct  ttctggttgc  gatgtacttg  tgcaagcatt  gctcgaagtt
   1800
gtatcggccc  tggtatctat  ccttggatct  tctagtatcg  ggcaaattaa  ctatggtgcc
   1860
tctgctcagt  acacccaaat  ggtaggtcaa  tctgtagctc  aagcccttgc  ttaa
   1914
<210>2
<211>1971
<212>DNA
<213>十字园蛛ADF-4修饰的序列
<400> 2
gcaggatctt  cagcagcagc  ggccgcggca  gcaagtggat  ctggaggata  cggacctgaa
   60
aaccaaggac  catctggacc  tgtagcatat  ggacctggtg  gacccgtatc  ttcagctgca
   120
gcagcagccg  ctgcaggaag  tggacctggt  ggatacggac  ctgaaaacca  aggaccatct
   180
ggacccggag  gatatggacc  tggtggttcc  ggatcttcag  cagcagcagc  agccgctgca
   240
gcaagtggac  ctggaggata  tggacctgga  agccaaggac  catctggacc  tggtggatcc
   300
ggaggatatg  gtcccggaag  ccaagggcca  tctggacctg  gtgcatcttc  ggcagcagca
   360
gcagccgctg  cagcaagtgg  acctggagga  tatggacctg  gaagccaagg  accatctgga
   420
cctggagcat  atggacctgg  tggacccgga  tcttcagctg  cagcaagtgg  acctggagga
   480
tatggacctg  gaagccaagg  accatctgga  cctggtggat  ccggaggata  tggtcccgga
   540
agccaagggc  catctggacc  tggtgggcct  ggtgcatctg  cggcagcagc  agcagccgct
gcagcaagtg gacctggagg atatggacct ggaagccaag gaccatctgg acctggagca
   660
tatggacctg gtggacccgg atcttcagct gcagcaagtg gacctggagg atatggacct
   720
ggaagccaag gaccatctgg acctggagca tatggacctg gtggacccgg atcttcagct
   780
gcagcagcag ccgctgcagg aagtggacct ggtggatacg gacctggaaa ccaaggacca
   840
tctggacccg gaggatatgg acctggtggt cccggatctt cagcagcagc agccgctgca
   900
gcaagtggac ctggaggata tggacctgga agccaaggac catctggacc tggagtatat
   960
ggacctggtg gacccggatc ttcagctgca gcagcagccg ctgcaggaag tggacctggt
   1020
ggatacggac ctggaaacca aggaccatct ggacccggag gatatggacc tggtggttcc
   1080
ggatcttcag cagcagcagc agccgctgca gcaagtggac ctggaggata tggacctgga
   1140
agccaaggac catctggacc tggtggatcc ggaggatatg gtcccggaag ccaagggcca
   1200
tctggacctg gtgcatcttc ggcagcagca gcagccgctg cagcaagtgg acctggagga
   1260
tatggacctg gaagccaagg accatctgga cctggagcat atggacctgg tggacccgga
   1320
tcttcagctg cagcaagtgg acctggagga tatggacctg gaagccaagg accatctggt
   1380
cctggagcat atggacctgg tggacccgga tcttcagctg cagcagccgc tgcagcaagt
   1440
ggacctggag gatatggacc tggaagccaa ggaccatctg gacctggtgg atcccgagga
   1500
tatggtcccg gaagccaagg acctggtggg cctggagcat ctgcggcagc agcagcagcc
   1560
gctgcagcaa gtggacctgg aggatatgga cctggaagcc aaggaccatc tggacctgga
   1620
tatcaaggcc ctagtggtcc tggagcatat ggcccatctc cttctgcttc cgcatccgtt
  1680
gcagcctctc  gtttatcttc  gcctgcagcc  tcgtctagag  tgtcttccgc  tgtatcgtct
  1740
ttagtgtcta  gcggacctac  gaatggtgct  gctgtttctg  gagctttgaa  tagtttagta
  1800
tctcagatta  gtgcaagtaa  tccaggttta  tcgggatgtg  atgctcttgt  gcaggcatta
  1860
ttggaattag  tgtctgctct  tgtggcaatt  ctttcatctg  caagtattgg  ccaagtcaac
  1920
gtcagctctg  ttagtcagtc  aactcaaatg  attagccaag  ctctttcata  a
  1971
<210>3
<211>636
<212>PRT
<213>十字园蛛ADF-3
<400>3
Ala Arg Ala Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala
            20                  25                  30
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly
        35                  40                  45
Pro Ser Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro
    50                  55                  60
Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly
65                  70                  75                  80
Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro
                85                  90                  95
Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Asn Gly Pro Gly Ser
Gly Gln Gln Gly Ala Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly
        115                 120                     125
Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly
    130                 135                     140
Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly
145                 150                     155             160
Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pr0 GIy
                165                     170             175
Ser Gly Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr
            180                     185             190
Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro
        195                     200             205
Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly
    210                     215             220
Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala
225                     230             235                 240
Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Tyr Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln
                    245             250                 255
Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala
                260             265                 270
Ser Ala Ala Ser Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro
            275             280                 285
Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser
        290             295                 300
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln
    305             310                 315                 320
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly
                325                 330                 335
Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala
            340                 345                 350
Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln
        355                 360                 365
Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln
   370                  375                 380
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly
385                 390                 395                 400
Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Tyr Gly Pro Gly Ala
                405                 410                 415
Ser Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln
            420                 425                 430
Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln
        435                 440                 445
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly
    450                 455                 460
Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala
465                 470                 475                 480
Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln
                485                 490                 495
Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro
            500                 505                 510
Gly Ala Ala Ser Ala Ala Val Ser Val Gly Gly Tyr Gly Pro Gln Ser
         515                 520                 525
Ser Ser Val Pro Val Ala Ser Ala Val Ala Ser Arg Leu Ser Ser Pro
Ala Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val Ser Ser Leu Val Ser Ser
545                 550                     555             560
Gly Pro Thr Lys His Ala Ala Leu Ser Asn Thr Ile Ser Ser Val Val
                565                 570                 575
Ser Gln Val Ser Ala Ser Asn pro Gly Leu Ser Gly Cys Asp Val Leu
            580                585                  590
Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala Leu Val Ser Ile Leu Gly
        595                 600                 605
Ser Ser Ser Ile Gly Gln Ile Asn Tyr Gly Ala  Ser Ala Gln Tyr Thr
    610                 615                  620
Gln Met Val Gly Gln Ser Val Ala Gln Ala Leu Ala
625                 630                 635
<210>4
<211>410
<212>PRT
<213>十字园蛛ADF-4
<400>4
Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Gly Ser Gly Gly
1               5                   10                  15
Tyr Gly Pro Glu Asn Gln Gly Pro Ser Gly Pro Val Ala Tyr Gly Pro
             20                 25                  30
Gly Gly Pro Val Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly
        35                  40                  45
Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Glu Asn Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Gly
    50                  55                  60
Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
65                  70                  75                  80
Ala Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gln Gly Pro Ser Gly
                85                  90                  95
Pro Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gln Gly Ala Ser Gly
            100                 105                 110
Pro Gly Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
        115                 120                 125
Ala Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gln Gly Pro Ser Gly
    130                 135                 140
Pro Gly Ala Tyr Gly Pro Gly Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala
145                 150                 155                 160
Ala Ala Ala Ala Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gln Gly
               165                  170                 175
Pro Ser Gly Pro Gly Val Tyr Gly Pro Gly Gly Pro Gly Ser Ser Ala
            180                 185                 190
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Glu
        195                 200                 205
Asn Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Gly
    210                 215                 220
Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Gly Pro Gly Gly Tyr
225                 230                 235                 240
Gly Pro Gly Ser Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Gly Ser Gly Gly Tyr
                245                 250                 255
Gly Pro Gly Ser Gln Gly Gly Ser Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala
            260                 265                 270
Ala Ala Ala Ala Ala Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gln
        275                 280                 285
Gly Pro Ser Gly Pro Gly Tyr Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ala Tyr
290                     295                 300
Gly Pro Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Val Ala Ala Ser Val Tyr Leu
305                 310                 315                 320
Arg Leu Gln Pro Arg Leu Glu Val Ser Ser Ala Val Ser Ser Leu Val
                325                 330                 335
Ser Ser Gly Pro Thr Asn Gly Ala Ala Val Ser Gly Ala Leu Asn Ser
            340                 345                 350
Leu Val Ser Gln Ile Ser Ala Ser Asn Pro Gly Leu Ser Gly Cys Asp
        355                 360                 365
Ala Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Leu Val Ser Ala Leu Val Ala  Ile
    370                 375                 380
Leu Ser Ser Ala Ser Ile Gly Gln Val Asn Val Ser Ser Val Ser Gln
385                 390                 395                 400
Ser Thr Gln Met Ile Ser Gln Ala Leu Ser
                405                 410
<210>5
<211>64
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
ctagcccggg atgaaagaaa ccgctgctgc taaattcgaa cgccagcaca tggacagcgg
    60
tcgg
     64
<210>6
<211>64
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
gatcccgacc  gctgtccatg tgctggcgtt  cgaatttagc agcagcggtt  tctttcatcc
     60
cggg
     64
<210>7
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>7
ccttcccggt  ccgccatgaa  attcttagtc  aac
    33
<210>8
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400> 8
ccttcccgga ccgggcatag atgtaagaaa  t
    31

Claims (15)

1.一种蜘蛛拖丝蛋白，其包含由SEQ ID NO：1或2的核酸序列，或那些核酸序列的变体编码的氨基酸，所述变体每个被限定为与SEQ ID NO：1或2的序列比较，具有一个或多个取代，插入和/或缺失，在所述变体在适度严格条件下与包含SEQ ID NO：1或2的序列的核酸杂交的条件下，或在所述变体包含由于遗传密码子的简并性所造成的核酸变化的条件下，其编码与SEQ ID NO：1或2的核酸序列相同或功能上等价的氨基酸。
2.一种蜘蛛拖丝蛋白质或线，其包含权利要求1的蜘蛛拖丝蛋白。
3.权利要求1或2的蜘蛛拖丝蛋白质/线，其仅包含野生型ADF-4或由SEQID NO：2的核酸编码的氨基酸；或作为拖丝蛋白的SEQ ID NO：4的氨基酸。
4.权利要求1或2的蜘蛛拖丝蛋白质/线，其仅包含野生型ADF-3或由SEQID NO：1的核酸编码的氨基酸；或作为拖丝蛋白的SEQ ID NO：3的氨基酸。
5.一种凝胶或泡沫，其包含权利要求1-4中一项或多项的蛋白质或由其组成。
6.用于植入物和斯滕特固定模的涂层，其包含权利要求1-4中一项或多项的蛋白质或由其组成。
7.一种线或纤维，其包含权利要求1-4中一项或多项的蛋白质/线和另外的纤维，所述纤维不是蜘蛛来源的，并且优选地是植物来源的纤维或合成纤维。
8.一种薄膜，其包含权利要求1-4中一项或多项的蛋白质或由其组成。
9.伤口闭合或覆盖系统，缝线材料，替换材料，优选地人造软骨或腱材料，其可使用权利要求1-4的一项或多项的线/蛋白质获得。
10.一种载体，其包含编码作为唯一的拖丝蛋白的野生型ADF-3和/或ADF-4的核酸或包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的核酸。
11.一种杆状病毒载体，其包含编码一种或多种拖丝蛋白的核酸，优选地拖丝蛋白ADF-3，ADF-4(野生型)，ADF-3(SEQ ID NO：1)和/或ADF-4(SEQID NO：2)的核酸。
12.权利要求1-4的一项或多项的蛋白质/线在技术、生物技术和/或药物领域的应用。
13.权利要求1-4中一项或多项的蛋白质/线用于制备伤口闭合或覆盖系统，优选地用于制备缝线材料的应用，所述缝线材料更优选地倾向于用在神经外科手术或眼外科手术中。
14.权利要求1-4中一项或多项的蛋白质/线用于制备替换材料，优选地人造软骨或腱材料的应用。
15.权利要求1-4中一项或多项的蛋白质/线用于稳定人造替换物，优选地人造替换肺的应用。
CNA2005800243750A 2004-06-25 2005-06-23 天然来源的蛋白质及由其制备的材料 Pending CN101133080A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US58322704P 2004-06-25 2004-06-25
US60/583,227 2004-06-25
EP05005395.8 2005-03-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101133080A true CN101133080A (zh) 2008-02-27

Family

ID=34934219

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2005800243750A Pending CN101133080A (zh) 2004-06-25 2005-06-23 天然来源的蛋白质及由其制备的材料

Country Status (5)

Country Link
US (1) US8097583B2 (zh)
EP (3) EP1609801A1 (zh)
JP (1) JP4990763B2 (zh)
CN (1) CN101133080A (zh)
WO (2) WO2006002827A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108290935A (zh) * 2015-08-10 2018-07-17 赛威克斯材料科学公司 用于制造合成的拖丝蜘蛛丝的组合物和方法
CN109477252A (zh) * 2016-02-11 2019-03-15 赛威克斯材料科学公司 包括合成拖丝蜘蛛丝的复合材料
CN112567083A (zh) * 2018-04-03 2021-03-26 丝芭博株式会社 高收缩人造丝心蛋白加捻纱及其制造方法、以及人造丝心蛋白加捻纱及其收缩方法
CN112680884A (zh) * 2020-12-30 2021-04-20 苏州经贸职业技术学院 一种抗菌口罩材料的制备方法

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102005043609A1 (de) 2005-09-13 2007-03-22 Technische Universität München Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung eines Fadens aus Seidenproteinen
RU2444527C2 (ru) 2005-12-30 2012-03-10 Спибер Текнолоджиз Аб Рекомбинантный спидроиновый белок главной ампулярной железы, способный к полимеризации, рекомбинантный слитый белок, способный к управляемой полимеризации, полимер спидроинового белка главной ампулярной железы, композиция для управляемой полимеризации, рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты (варианты), способ получения растворимого слитого белка, способ получения полимера спидроинового белка главной ампулярной железы и способ культивирования эукариотических клеток
US8721991B2 (en) 2006-06-08 2014-05-13 Amsilk Gmbh Microfluidic device for controlled aggregation of spider silk
DE102006038445A1 (de) * 2006-08-16 2008-02-21 Gustav Pirazzi & Comp. Kg Verwendung von künstlich hergestellter Spinnenseide
WO2008108838A2 (en) * 2006-11-21 2008-09-12 Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Microfluidic devices and methods for fabricating the same
DE102007002222A1 (de) * 2007-01-10 2008-07-17 Gustav Pirazzi & Comp. Kg Verwendung von künstlich hergestellter Spinnenseide
EP2164864B1 (de) * 2007-06-20 2014-12-03 Basf Se Synthetische repetitive proteine, deren herstellung und verwendung
JP5980679B2 (ja) * 2009-08-26 2016-08-31 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション 絹ドープを製造するプロセス
EP3495381A1 (en) * 2009-12-08 2019-06-12 AMSilk GmbH Silk protein coatings
JP6155188B2 (ja) 2010-04-12 2017-06-28 スパイバー テクノロジーズ アーベーＳｐｉｂｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｂ 方法及び組合せ
DE202013003445U1 (de) 2012-04-11 2013-04-26 Amsilk Gmbh Staubbeutel
EP3682912A1 (en) 2012-08-17 2020-07-22 AMSilk GmbH Use of self-assembling polypeptides as tissue adhesives
EP2892916B1 (en) * 2012-09-06 2021-08-25 AMSilk GmbH Methods for producing high toughness silk fibres
SG11201502932TA (en) 2012-10-17 2015-05-28 Univ Nanyang Tech Compounds and methods for the production of suckerin and uses thereof
EP2940066B1 (en) 2012-12-26 2020-02-05 Spiber Inc. Spider silk protein film, and method for producing same
CA2913151A1 (en) 2013-05-22 2014-11-27 Transient Electronics, Inc. Controlled transformation of non-transient electronics
ES2773298T3 (es) 2013-10-21 2020-07-10 North Face Apparel Corp Recubrimientos de biomateriales funcionales para textiles y otros sustratos
DK3182985T3 (da) 2014-08-20 2020-04-06 Silk Tech Ltd Fibroinafledt proteinsammensætning
US20190002644A1 (en) 2015-12-25 2019-01-03 Spiber Inc. Method for Producing Polymer Aggregate
SG11201808804TA (en) 2016-04-08 2018-11-29 Univ Cornell A method to enhance wound healing using silk-derived protein
EP3476859A4 (en) 2016-06-23 2019-12-11 Spiber Inc. MODIFIED FIBROIN
AU2017310520A1 (en) 2016-08-12 2019-03-21 Silk Technologies, Ltd. Silk-derived protein for treating inflammation
CA3043246A1 (en) * 2016-11-11 2018-05-17 Amsilk Gmbh Use of a shrinkable biopolymer fiber as sensor
DE102016222480B4 (de) 2016-11-16 2020-02-13 Adidas Ag Bekleidungsstück, das Spinnenseide aufweist oder Schuh, der Spinnenseide aufweist, und ein entsprechendes Herstellungsverfahren
US11597750B2 (en) * 2017-06-13 2023-03-07 Aalto University Foundation Sr Method for producing a condensed adhesive phase of silk fusion proteins
EP3556914A1 (de) 2018-04-20 2019-10-23 Lenzing Aktiengesellschaft Regenerierte cellulosische formkörper und verfahren zur herstellung regenerierter cellulosischer formkörper
MX2021000041A (es) * 2018-06-22 2021-03-25 Natura Cosmeticos Sa Composicion cosmetica para tratamiento de fibras de queratina.
JP2023550202A (ja) 2020-10-20 2023-11-30 ゲオルク・ストローチ コーティングされた毛髪およびその使用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5994099A (en) 1997-12-31 1999-11-30 The University Of Wyoming Extremely elastic spider silk protein and DNA coding therefor
FR2774588B1 (fr) 1998-02-11 2000-05-05 Oreal Composition cosmetique ou dermatologique contenant au moins une proteine de soie d'arachnides naturelle, recombinante ou un analogue
US7157615B2 (en) 1998-03-17 2007-01-02 Nexia Biotechnologies, Inc. Production of biofilaments in transgenic animals
WO2003020916A2 (en) 2001-08-29 2003-03-13 University Of Wyoming Spider silk protein encoding nucleic acids, polypeptides, antibodies and method of use thereof
WO2003057727A1 (en) * 2002-01-11 2003-07-17 Nexia Biotechnologies, Inc. Methods of producing silk polypeptides and products thereof
WO2003060099A2 (en) * 2002-01-11 2003-07-24 Nexia Biotechnologies, Inc. Methods and apparatus for spinning spider silk protein
US8030024B2 (en) * 2004-06-25 2011-10-04 Amsilk Gmbh Synthesis of spider dragline and/or flagelliform proteins
CN101018806B (zh) * 2004-07-22 2014-05-07 Am丝绸有限责任公司 重组蜘蛛丝蛋白

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108290935A (zh) * 2015-08-10 2018-07-17 赛威克斯材料科学公司 用于制造合成的拖丝蜘蛛丝的组合物和方法
US10981959B2 (en) 2015-08-10 2021-04-20 Seevix Material Sciences Ltd. Compositions and methods for fabricating synthetic dragline spider silk
CN109477252A (zh) * 2016-02-11 2019-03-15 赛威克斯材料科学公司 包括合成拖丝蜘蛛丝的复合材料
US11345727B2 (en) 2016-02-11 2022-05-31 Seevix Material Sciences Ltd. Composite materials comprising synthetic dragline spider silk
CN112567083A (zh) * 2018-04-03 2021-03-26 丝芭博株式会社 高收缩人造丝心蛋白加捻纱及其制造方法、以及人造丝心蛋白加捻纱及其收缩方法
CN112567083B (zh) * 2018-04-03 2023-07-07 丝芭博株式会社 高收缩人造丝心蛋白加捻纱及其制造方法、以及人造丝心蛋白加捻纱及其收缩方法
CN112680884A (zh) * 2020-12-30 2021-04-20 苏州经贸职业技术学院 一种抗菌口罩材料的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2006002853A1 (en) 2006-01-12
EP1778722A1 (en) 2007-05-02
US8097583B2 (en) 2012-01-17
JP4990763B2 (ja) 2012-08-01
JP2008507260A (ja) 2008-03-13
EP1778849A1 (en) 2007-05-02
US20070196429A1 (en) 2007-08-23
WO2006002827A1 (en) 2006-01-12
EP1609801A1 (en) 2005-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101133080A (zh) 天然来源的蛋白质及由其制备的材料
CN102532295B (zh) 重组蜘蛛丝蛋白
Mori et al. New silk protein: modification of silk protein by gene engineering for production of biomaterials
US20210317173A1 (en) Compositions and methods for fabricating synthetic dragline spider silk
JP2018531040A6 (ja) 合成ドラグラインスパイダーシルクを製作するための組成物および方法
Asakura et al. Recombinant silk fibroin incorporated cell-adhesive sequences produced by transgenic silkworm as a possible candidate for use in vascular graft
US8030024B2 (en) Synthesis of spider dragline and/or flagelliform proteins
CN108026152A (zh) 环状rgd细胞结合基序及其用途
Wang et al. Regenerated collagen fibers with grooved surface texture: physicochemical characterization and cytocompatibility
US8461301B2 (en) Synthetic dragline spider silk-like proteins
Peng et al. Polyelectrolyte fiber assembly of plant-derived spider silk-like proteins
Andiappan et al. Studies on Indian eri silk electrospun fibroin scaffold for biomedical applications
Kandhavadivu et al. A Study on the Application of Weaver Ant Silk in Wound Healing
Schiller et al. Bioinspired and biomimetic protein-based fibers and their applications
Kaur et al. Spider Silk: an excellent candidate as toughest biomaterial

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: AMSILK GMBH

Free format text: FORMER OWNER: TECH UNI MUENCHEN

Effective date: 20110420

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: MUNICH, GERMANY TO: MARTINSRIED, GERMANY

TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20110420

Address after: German horse guard Reed

Applicant after: Amsilk GmbH

Address before: Munich, Germany

Applicant before: Tu Muenchen

C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20080227