CN100516212C - 检测用微型反应器、基因检测装置和基因检测方法 - Google Patents

检测用微型反应器、基因检测装置和基因检测方法 Download PDF

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Abstract

一种试样检测用微型反应器，其具有(1)板状的芯片、(2)具有用于分别储存多种试剂的储存室的多个试剂储存部、(3)混合从前述多个试剂储存部的出口送出的多种试剂从而生成混合试剂的试剂混合部、(4)具有用于从外部注入试样的注入口的试样接收部、和(5)使前述从试剂混合部送出的混合试剂和由试样接收部送出的试样混合反应的反应部，前述多个试剂储存部、试剂混合部、试样接收部、和反应部组装在前述芯片内，并通过流路连通，前述试剂混合部有防止初期混合试剂送出到反应部的送出防止装置。

Description

检测用微型反应器、基因检测装置和基因检测方法
技术领域
本发明涉及一种微型反应器，尤其是一种可适于基因检测的含有生物反应器的基因检测装置。
背景技术
近年来，通过利用微型机技术和超微细加工技术，开发了通过将用于进行以往的试样制备、化学分析、化学合成等的装置、方法(例如，泵、阀、流路、传感器等)微细化将其集中在一块芯片上的系统。
它们也被称为μ-TAS(Micro total Analysis System)、生物反应器、Lab-on-chips、生物芯片，有望应用于医疗检查、诊断领域、环境测定领域、农业制造领域。尤其是如在基因检测中所见到的那样，在需要复杂的过程、熟练的操作技术、机器类的操作时，可以说自动化、高速化以及简便化的微型化分析系统由于可以不必选择成本、必要试样量、所需时间以及时间和场所，因此好处很多。
例如，家畜中发现的新型传染病的突发性流行中，作为病因的病毒、细菌的鉴定成为争夺紧急预防对策中的第一层障碍。相对于菌类的培养容易限制速度的以往的检测方法，不挑场合可迅速获得结果的基因检查技术满足这种迫切需要。进而在通过基因的疾病诊断、生活习惯病等的发病风险预测、基因治疗中也有很高需求。
临床检查中，注重这些分析用芯片中的分析的定量、分析的精度、经济性等。因此，建立结构简单、且高可信度的送液系统成为需要解决的问题。因此需要精度高、可信度优异的微液体控制元件。本发明人现已提出了适用于此的微型泵系统(专利文献1和2)。
此外，对于以大量的临床试样为对象的芯片，理想的是可任意使用的，进而需要克服多用途适应性、制造成本等问题。
在以高密度固定多个DNA片段的DNA芯片中存在着搭载信息的内容、庞大的制作成本、以及检测精度、再现性等仍然不充分的问题。不过，根据基因检查的目的和种类，可以提供通过使用可以适当变更的探针实时追踪DNA扩增反应的效率方面比在芯片基板上网络地配置多个DNA探针的方式更简便且迅速的检查方法。
专利文献1：特开2001-322099号公报
专利文献2：特开2004-108285号公报
非专利文献1：“DNA芯片技术及其应用”，《蛋白质核酸酶》第43卷，第13期(1998年)君塚房夫，加藤郁之进，共立出版(株)发行。
发明内容
本发明的目的在于提供可以任意使用的类型的、低成本且具有简单结构和高精度的送液系统，使精度高的检测成为可能的微型反应器，尤其是基因检测用的微型反应器。目的在于通过合并提供具有难以产生诸如交叉感染，转移(carry-over)感染这样的问题的结构的生物微型反应器。
本发明的基因检测装置鉴于上述状况形成的，其特征在于为了确保多用途性，高敏感度，适当改变所使用的引物和生物探针的方式进行DNA扩增。
上述目的可以通过以下结构实现。
试样检测用微型反应器具有：
(1)板状的芯片，
(2)具有用于分别储存多种试剂的储存室的多个试剂储存部，
(3)混合从前述多个试剂储存部的出口送出的多种试剂从而生成混合试剂的试剂混合部，
(4)具有用于从外部注入试样的注入口的试样接收部，和
(5)使从前述试剂混合部送出的混合试剂和由试样接收部送出的试样混合反应的反应部，
前述多个试剂储存部、试剂混合部、试样接收部和反应部组装在前述芯片内，并通过流路连通；
前述试剂混合部有防止初期混合试剂送出到反应部的送出防止结构。
在上述微型反应器中，前述试剂混合部形成混合流路，向反应部送出混合试剂的送出流路在混合流路的中间部分分叉，初期混合试剂通过储存于该混合流路的中间部与下游末端之间可以防止从输送流路送出到反应部。
此外，在上述微型反应器中，前述试剂混合部在前述混合流路与前述送出流路的连接部具有在前述混合流路内的压力达到规定压力以上时向前述送出流路送出混合试剂的送液控制部。
试样检测用微型反应器具有：
(1)板状的芯片，
(2)具有用于分别储存多种试剂的储存室的多个试剂储存部，
(3)混合从前述多个试剂储存部的出口送出的多种试剂从而生成混合试剂的试剂混合部，
(4)具有用于从外部注入试样的注入口的试样接收部，和
(5)使从前述试剂混合部送出的混合试剂和由试样接收部送出的试样混合反应的反应部，
前述多个试剂储存部、试剂混合部、试样接收部和反应部组装在前述芯片内，并通过流路连通；
前述各试剂储存部有用于在储存室注入驱动液的注入口和用于通过注入的试剂从储存室推出试剂的出口，前述注入口和可以与外部泵连接的泵连接部连接，驱动液通过外部泵从注入口注入到储存室，前述注入口与前述泵连接部的连接部中设置有末端开放的空气排出流路。
附图说明
[图1]本发明的一个实施方式中的基因检测用微型反应器的概况图。
[图2]图1的微型反应器与装置主体构成的基因检测装置的概况图。
[图3]表示密封剂填充于试剂储存部和与之连通的流路之间的状态的图。
[图4]表示压电泵，(a)表示该泵的一个实例的截面图，(b)是其上面图。(c)是表示压电泵的其它实例的截面图。
[图5]表示外加给泵的压电元件的驱动电压波形与液体的位置变位之间的关系的图。
[图6](a)是表示输送驱动液的泵部的结构的图，(b)是表示输送试剂的泵部的结构的图。
[图7]表示用于排出空气的流路的图。
[图8](a)，(b)表示通过由Y字的分支流路的上游输送试剂和试样，在流路中混合试剂和试样的样子的图，(c)是表示送液泵的驱动的样子。
[图9](a)，(b)是沿送液控制部的流路轴方向的截面图。
[图10](a)，(b)表示设置于流路中的止逆阀的一个例子。
[图11]表示设置于流路中的活动阀的一个例子的截面图，(a)表示开阀状态，(b)表示关阀状态。
[图12]是表示试剂定量部的结构的图。
[图13]表示通过切去其前端部分，混合比率稳定后向下一步骤输送混合液的流路的结构的图。
[图14]表示本发明的一个实施方式中的微型反应器的试剂混合部的结构的图。
[图15]是表示由图14的流路连通的、进行试样与试剂的扩增反应和检测的部分的结构的图。
[图16]是表示由图14的流路连通的、进行阳性对照与试剂的扩增反应和检测的部分的结构的图。
[图17]是表示由图14的流路连通的、进行阴性对照与试剂的扩增反应和检测的部分的结构的图。
[图18]表示设置于流路中的活动阀的一个例子的截面图，(a)表示开阀状态，(b)表示关阀状态。
[图19]表示设置于流路中的活动阀的一个例子的截面图，(a)表示开阀状态，(b)表示关阀状态。
具体实施方式
首先，对可以实现上述目的的本发明的优选结构进行说明。
本发明的基因检测用微型反应器的特征在于，按如下方式构成：
在一个芯片内设置有：注入试样或从试样提取的DNA的试样储存部、和储存基因扩增反应中使用的试剂的试剂储存部、和储存阳性对照的阳性对照储存部、和储存阴性对照的阴性对照储存部、和储存与经基因扩增反应扩增的检测对象的基因杂交的探针DNA的探针DNA储存部、和与这些各个储存部连通的流路、和可以与输送前述各储存部和流路内的液体的不同的微型泵连接的泵连接部；
前述芯片中通过泵连接部与微型泵连接，向流路输送储存于试样储存部的试样或从试样中提取的DNA、和储存于试样储存部的试剂，在流路内混合，使之扩增反应后，向其下游侧的流路输送处理该反应液处理后的处理液、和储存于探针DNA储存部的探针DNA，在流路内混合，使之杂交后，基于该反应生成物进行扩增反应的检测；
对于储存于阳性对照储存部中的阳性对照及储存于阴性对照储存部中的阴性对照，同样使之与储存于试剂储存部的试剂在流路内发生扩增反应后，使之与储存于探针DNA储存部的探针DNA在流路内杂交，基于该反应生成物进行扩增反应的检测。
上述基因检测用微型反应器也可以按如下方式构成：
设置在前述试样储存部中注入试样或从试样提取的RNA的同时，储存用于由其中所含的RNA通过逆转录反应合成cDNA的逆转录酶的逆转录酶储存部；
向流路输送储存于试样储存部中的试样或从试样提取的RNA，和储存于逆转录酶储存部的逆转录酶，在流路内混合合成cDNA后，进行前述扩增反应及其检测。
此外，上述基因检测用微型反应器的特征在于：
在前述流路内设置有：当直至达到预先设定正方向的送液压力的压力时，切断液体通过，通过施加预设的压力以上的送液压力使液体通过，通过前述微型泵的泵压可以控制液体的通过的送液控制部；和防止流路内的液体逆流的逆流防止部；前述微型泵通过送液控制部和逆流防止部控制流路内液体的送液、定量和各液体的混合。
此外，上述基因检测用微型反应器的特征在于：前述送液控制部由按串行连结两侧相邻的流路那样形成于这些流路之间的、且具有比这些相邻的流路的截面积更小的截面积的细流路构成。
上述基因检测用微型反应器的特征在于：上述逆流防止部是阀体通过逆流压关闭流路开口部的止逆阀，或者阀体通过阀变形方法在流路开口部推压关闭流路开口部的活动阀。
在上述基因检测用微型反应器中，设置有：
由前述逆流防止部与送液控制部之间的流路构成的可以填充规定量试剂的试剂填充流路；和
从该试剂填充流路分支，与连接于输送驱动液的微型泵的泵连接部流通的分支流路；
从前述逆流防止部侧设置有如下方式构成的试剂定量部：通过在不通过试剂的送液压力下从前述送液控制部向前将试剂提供给试剂填充流路填充试剂后，从前述送液控制部向前在允许通过的试剂的送液压力下通过前述微型泵自分支流路向试剂填充流路方向输送驱动液，由前述送液控制部向前挤压出填充于试剂填充流路的试剂，由此定量输送试剂。
此外，上述基因检测用微型反应器设置有：输送各试剂的多个流路；和
与这些多个流路连接并混合来自这些流路的各种试剂的混合流路；和
由该混合流路分支向后续步骤输送试剂混合液的分支流路；和
在混合流路中设置于比与分支流路的分支点更前的位置的第1送液控制部；和
分支流路中设置在比与混合流路的分支点附近的位置的、且可剂混合液的能够通过的送液压力比第1送液控制部更小的第2送液控制部；
其按如下方式构成：输送试剂混合液直至向混合流路输送的试剂混合液的前端到达第1送液控制部之后时，以不通过试剂混合液的送液压力使由第2送液控制部流向分支流路的试剂混合液通过第1送液控制部，向下一步骤输送试剂混合液。
上述基因检测用微型反应器的特征在于：第1送液控制部中前述细流路的截面积比第2送液控制部中前述细流路的截面积更小。
上述基因检测用反应器的特征在于：在前述泵连接部和储存了由连接于该泵连接部的微型泵输送的内容液的前述储存部之间的流路中设置有由该流路分支且末端开放的、用于排出空气的流路。
优选的是，在上述基因检测用微型反应器中，基因扩增反应中使用的试剂、阳性对照和阴性对照储存于前述储存部中。
上述基因检测用微型反应器中的特征在于，储存基因扩增反应中使用的试剂、阳性对照和阴性对照的各个储存部与连通它们的流路之间在使用前填充了防止储存部中的内容液流出到流路中的密封剂。
前述密封剂优选含有对水的溶解度在1％以下的油脂。
前述密封剂优选含有对水的溶解度在1％以下且熔点为8℃-室温(25℃)的油脂。
作为前述密封剂，优选为明胶的水溶液。
上述基因检测用微型反应器的特征在于：基因扩增反应中使用的试剂包括与作为检测对象的基因特异性杂交的嵌合引物，具有链置换活性的DNA聚合酶和核酸内切酶。
本发明的基因检查方法的特征在于包括以下步骤：
使用上述任一记载的微型反应器，由这些储存部向流路输送由试样或从试样中提取的DNA、或试样或从试样中提取的RNA通过逆转录反应合成的cDNA、和经生物素修饰的引物，在流路内进行基因扩增反应的步骤；和
混合含有经扩增的基因的反应液和变性液，将扩增的基因变性处理为单链的步骤；和
将扩增基因变性处理成单链的处理液输送到吸附了链霉亲和素素的流路中，固定扩增的基因的步骤；和
将末端经FITC修饰的探针DNA输送到固定了扩增的基因的流路中，探针DNA与固定的基因杂交的步骤；和
将经FITC抗体表面修饰的胶体金输送到前述流路中，胶体金吸附到与固定的基因杂交的探针上的步骤；和
在前述流路中光学测定胶体金的浓度的步骤。
理想的是，前述各步骤之间根据需要包括将清洗液输送到吸附了链霉亲和素的前述流路中的步骤。
本发明的基因检测装置配备有上述微型反应器的任一种和与该微型反应器的泵连接部连接的微型泵。
上述基因检测装置，前述微型泵配备有：流路阻力根据压力差变化的第1流路、和流路阻力的变化相对于压力差的变化的比例比笫1流路小的第2流路、和连接第1流路和第2流路的加压室，和使该加压室的内部压力变化的调节器和驱动该调节器的驱动装置。
上述基因检测装置的特征在于如下述方式构成：储存试剂的各试剂储存部的上游侧设有泵连接部，微型泵与这些泵连接部连接，通过由各微型泵提供驱动液，从试剂储存部将试剂挤出到流路中开始基因扩增反应。
上述基因检测装置如下述方式构成：通过来自于前述微型泵的驱动装置的驱动信号控制前述调节器的动作从而以所希望的比例混合各种试剂。
上述基因检测装置优选配备有：基于由扩增的基因与探针DNA杂交产生的反应生成物进行扩增反应的检测的检测装置。
上述基因检测装置优选配备有：控制微型反应器的流路内的各反应的反应温度的温度控制装置。
上述基因检测装置的特征在于：前述微型泵由检测装置和温度控制装置一体化的装置主体以及可以装载于该装置主体中的微型反应器构成，通过将微型反应器装载于装置主体中自动进行基因扩增反应和该扩增反应的检测。
本发明的微型反应器是面向大规模生产而构建的，而且由于对应于多种目的存在广泛适用性，因此可以低成本制备。此外，由于含有泵和阀的流路系统结构简单，故气泡难以进入，由于固定体积小，因此输送精度高。由于检测时组装DNA扩增过程，因此是使检测敏感度高的检测成为可能的微型反应器。
由于是可以包括对应于DNA分析和RNA分析的逆转录过程的分析反应器，因此试样的制备容易，并且即使微量，精度也很高，可以短时间分析。
此外，本发明的基因检测装置由于是使形成每种试样的试剂类型·送液系统元件搭载组件、和控制·检测组件的系统各自分开的系统结构，因此对于微量分析、扩增分析，不容易产生诸如交叉感染，转移感染这样严重的问题。由于容易清除试样DNA和引物、与探针的结合(或相互作用)以外的非特异性的结合物，因此可以提供背景低的微型反应器芯片。
本发明可以应用于基因表达分析、基因功能分析、单核苷酸多态性分析(SNP)、药物筛选、医药、农药或各种化学物质的安全性·毒性检查、医疗临床诊断、食品检查、法医学、化学、酿造、农林业、渔业、畜产、农产制造等领域。
下面，对本发明的微型反应器和由该微型反应器和各个控制装置以及检测装置构成的基因检测装置，以及包括使用该装置的基因扩增过程和检测过程的的基因检测方法进行说明。
微型反应器和基因检测装置
一面参照附图一面对本发明的微型反应器、基因检测装置进行说明。图1是本发明的一个实施方式中的基因检测用微型反应器的概况图。图2是本发明的一个实施方式中包括微型反应器与装置主体的基因检测装置的概况图。
图1所示的微型反应器由树脂、玻璃、硅、陶瓷等制备的一块芯片构成。该芯片中通过微细加工技术在适当位置功能性设置试样储存部、试剂储存部、探针DNA储存部、对照储存部、流路、泵连接部、送液控制部、逆流防止部、试剂定量部和混合部。此外，如果需要还可以设置逆转录酶部。试样储存部与试样注入部连通，进行试样的暂时储存以及向混合部提供试样。按照该情况还可以起到血细胞分离的作用。试剂与试剂的混合，以及试样与试剂的混合还可以在同一混合部中按所希望的比率混合，或者也可以分成任一部分或两部分，设置多个汇合部，最终混合成所希望的混合比率。
所述微型反应器按以下方式构建：通过在微型反应器的上述试样储存部中注入血液等试样，自动进行芯片内基因扩增反应及其检测所必需的处理，对于多个项目，可以同时且在短时间内检测基因。使用发明的微型反应器的优选基因检测装置的形态中，封入预先确定量的必要的试剂种类，该微型反应器作为进行试样的DNA或RNA和规定扩增反应以及进行扩增产物检测的单元，可以被使用于每种试样。
与之相反，与送液、温度、反应的各种控制相关的控制系统、负责光学检测、数据的收集和处理的单元、微型泵和光学装置共同构成了本发明的基因检测装置的主体。该装置主体通过在其中装载上述芯片，对于试样可以共通使用。因此，即使有多种试样，也可以有效且迅速地处理。以往的技术中，在进行内容不同的分析或合成等时，每次都需要构建与变化的内容相应的微流体装置。与之不同，本发明中可以只交换可以拆卸的上述芯片。各装置元件的控制如果需要改变，可以适当改变设置于装置主体中的控制程序。
本发明的基因检测装置，由于任一元件都被小型化而呈便于搬运的形态，因此不受使用场所和时间的制约，运作性和操作性均良好。
以上，简要描述了本发明的微型反应器和检测装置，本发明的各个实施方式中，根据本发明的主旨可以进行任意的变形，变更，它们均包括在本发明中。也就是说，对于本发明的微型反应器和检测装置的整体或其一部分，只要结构、构成、配置、形状形态、尺寸、材质，方式、方法等满足本发明的主旨，可以是各种形式。
基因扩增过程和试剂
作为本发明的测定对象的试样在基因检查时，是作为成为扩增反应的模板的核酸的基因、DNA或RNA。也可以是从可能含有这种核酸的某种试样中制备或分离的。从这种试样中制备基因，DNA或RNA的方法没有特别的限定，可以使用以往的技术。最近，开发了为了扩增DNA从生物体试样中制备基因、DNA或RNA的技术，也可以以试剂盒等形态来利用。
试样本身也没有特别的限定，但是，例如全血、血清、血沉棕黄层(buffy coat)、尿、粪便、唾液、咳痰等生物体来源的大部分试样；细胞培养物；病毒、细菌、霉菌、酵母、植物、动物等的含有核酸的试样；可能混入或含有微生物等的某种试样、其它可能含有核酸的所有试剂等成为对象。
DNA，可以按照常规方法通过苯酚·氯仿提取和乙醇沉淀从试样中分离纯化。为了分离核酸，一般已知的是使用有接近饱和浓度的胍盐酸盐，异硫氰酸盐这样的高浓度离液序列高的试剂。不使用上述苯酚氯仿提取法，而用含有表面活性剂的蛋白质分解酶液直接处理试样的方法(齐藤隆，“PCR实验手册”HPJ出版局1991年、P309)是一种既简便又迅速的方法。获得的基因组DNA或基因大时，也可以使用适当的限制性酶，例如BamHI，BgLII，Dral，EcoRV，HindIII，PvuII等，按照常规方法片段化。这样一来，可以制备试样用的DNA及其片段的集合体。
RNA的情况，如果逆转录反应中使用的引物可以制备就没有特别的限制。例如，除了试样中的总RNA之外，作为基因发挥功能的逆转录病毒的RNA、表达基因的直接的信息传递载体的mRNA、rRNA等RNA分子群成为对象。这些RNA可以通过利用适当的逆转录酶变化为cDNA之后进行分析。mRNA的制备方法可以按照公知的技术进行，逆转录酶可以容易地获得。
与使用以往的装置进行的手动操作的情况相比，本发明的微型反应器所需的试样量极少。例如，基因的情况是，作为DNA为0.001-100ng。因此，包括只能获得微量的试剂的情况的本发明的微型反应器受试样方面的制约少，必然也可以用少量试剂类型，检查成本降低。试样从上述“试样储存部”的注入部导入。
·扩增方法
本发明的微型反应器中，对扩增方法没有限定。例如，DNA扩增技术可以使用多方面广泛利用的PCR扩增法。用于实施该扩增技术的各种条件已经被详细地进行了研究，并被记载于包括其改良方面的各种文献中。在PCR扩增中，需要使温度在3个温度区间内升降的温度管理，可以成为最适于微芯片的温度控制的流路装置已经由本发明人提出(特开2004-108285)。可以在本发明的芯片的扩增用流路中应用这种装置系统。因此，热循环可以高速切换，微细流路可以作为热容量小的微反应室，因此DNA扩增通过手动操作可以在微管，microvial等中进行，并且可以比往的方式短得多的时间内进行。
不需要像PCR反应这样的复杂的温度管理的、最近开发的ICAN(Isothermal chimera primer initiated nucleic acidamplication)法具有以下特征：在50-65℃的任意的一定温度下可以在短时间内实施DNA扩增(特许第3433929号)。因此，ICAN法由于在本发明的微型反应器中可以用简便的温度管理因此是最佳的扩增技术。在手动操作中需要1小时的这种方法，在本发明的生物反应器中用10-20分钟、优选15分钟结束直至分析。
DNA扩增反应可以是其它的PCR改良方法，本发明的微型反应器存在可以根据流路的设计变化等对应于任意一种的柔软性。使用任意DNA扩增反应的情况，其技术均详细地被公开了，本领域技术人员可以容易地获得。
·试剂类
(i)引物
PCR引物是与要扩增的特定部位的DNA链的两端互补的两种核苷酸。这种设计已经被开发了专用的应用，如果是本领域技术人员就可以通过DNA合成、化学合成等容易地制备。ICAN法用的引物是DNA和RNA的嵌合引物，其制备方法也已经在技术上建立了(特许第3433929号)。引物的设计及选择重要的是扩增反应成功与否，使用影响效率的最合适的引物。
此外，如果使生物素预先结合在引物上，可以通过与基板上的链霉亲和素的结合将扩增产物DNA固定在基板上，可以提供扩增产物的定量。作为其它的引物标记物质，可以例举有地高辛、各种荧光色素等。
(ii)扩增反应用试剂类
PCR用、ICAN法的包括在扩增反应中使用的酶在内的试剂类，均可以容易地获得。
作为PCR法中的试剂类型，至少包括2’-脱氧核苷5’-三磷酸、此外还包括Taq DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶。
ICAN法中的试剂类至少包括2’-脱氧核苷5’-三磷酸，可以与要检测的基因特异性杂交的嵌合引物，具有链置换活性的DNA聚合酶、核酸内切酶的RNase。
(iii)对照
内部对照，对于目的核酸(DNA，RNA)，可以作为扩增的监视或定量时的内部标准物质来使用。由于内部对照的序列在与试样不同的序列的两侧具有与试样用引物相同的引物可以杂交的序列，因此可以与试样同样扩增。阳性对照的序列是检测试样的特异性序列，引物杂交部分与其之间的序列与试样相同。对照中使用的核酸(DNA，RNA)可以使用公知技术文献中记载的。阴性对照包含所有核酸(DNA，RNA)之外的试剂等，在感染的有无的检查，背景补正中使用。
(IV)逆转录用试剂
RNA的试剂的情况是，试剂为用于由RNA合成cDNA的逆转录酶，逆转录引物等，这些都有市售均可以容易获得。
这些扩增用基质(2’-脱氧核苷5’-三磷酸)，基因扩增用试剂等分别被预先将规定量封入一个微型反应器的上述试剂储存部中。因此，本发明的微型反应器在使用时不必每次填充必要量的试剂，即达到可以使用的状态。
检测步骤
检测本发明中扩增的目的基因的DNA的方法没有特别的限定，根据需要可以使用最佳的方法。这种方法中主流的是诸如可视分光侧光法、荧光测定法、发光法这样的检测方法。进而，可例举有电化学方法、表面等离子共振、晶体振荡器微平衡等方法。
本发明的基因检测装置与上述微型反应器均配备有基于由扩增的基因与探针DNA的杂交产生的反应性生物对扩增反应的有无、规模等进行检测的检测装置。
使用上述微型反应器的本发明的方法具体可以按以下方法进行。即，使用上述微型反应器，包括以下步骤的方法：(1)从这些储存部向流路输送试样或从试样提取的DNA，或者由试样或从试样提取的RNA通过逆转录反应合成的cDNA与经生物素修饰的引物，在微细流路内扩增基因的步骤；(2)混合含有在微细流路内扩增的基因的扩增反应液和变性液，将扩增的基因变性成单链的处理步骤；(3)将扩增基因变性处理成单链的处理液输送到吸附了链霉亲和素的流路中，固定前述扩增的基因的步骤；(4)末端经FITC(fluorescein isothiocyanate，异硫氰酸荧光素)修饰的探针DNA流入到固定了扩增的基因的微细流路中，探针DNA与固定的基因杂交的步骤；(5)经FITC抗体表面修饰的胶体金流入到前述微细流路中，由此使该胶体金吸附到与固定的基因杂交的经FITC修饰的探针上的步骤；(6)光学测定前述微细流路中的胶体金的浓度的步骤。
在上述方法中，生物素化DNA、通过生物素-链霉亲和素结合的固定化、FITC荧光标记等、FITC抗体等均是公知技术。
优选的是，前述各过程之间根据需要包括将清洗液输送到吸附了链霉亲和素的前述流路中的步骤。作为这种清洗液，最佳的是例如各种缓冲液、盐类水溶液、有机溶剂等。
本发明的上述检测方法优选的是通过可视光，最终可以以高敏感度测定的方式。机器比荧光测定用途广，妨碍因素少而且数据处理更容易。优选的是使用通过用于这种目的的光学检测装置与含有上述微型泵的送液手段和控制微型反应器的流路中的各反应的反应温度的温度控制装置一起组装，构成一体化的本发明的基因检测装置进行检测。
在上述过程中，变性液适用于将基因DNA变成单链的试剂，例如，可以例举有氢氧化钠、氢氧化钾等。探针可以例举有寡聚脱氧核苷酸等。此外，除FITC之外还可以例举有RITC(罗丹明异硫氰酸盐)等荧光物质。
上述扩增和检测，如果使将在控制微型泵和温度的同时具有与预先送液顺序、容量、时间等相关设定的各个条件作为程序内容的软件，前述微型泵，前述检测装置和温度控制装置一体化的基因检测装置主体，与对于该装置主体可以拆卸的上述微型反应器接合，微型反应器的流路也会呈工作状态。通过注入试样优选自动开始分析、试样和试剂类的送液、基于混合的基因扩增反应、基因检测反应和光学的测定可以作为一系列的过程自动实施，测定数据、必要的条件、记录事项一起储存在文件内。
基因检查
通过使用某种具有特异与特定基因的序列的引物作为扩增反应中使用的引物，通过测定扩增的有无或扩增效率，可以用于判定试样中的基因来源的DNA与该特定基因是否相同。对根据基因迅速鉴定传染病的病原病毒，细菌特别有用。
通过本发明的基因检查可以获得诊断癌基因，基因高血压基因等的表达程度的数据。具体的是，作为这种基因的表达的证据的mRNA的种类，表达水平的分析。
或者，通过使用本发明的微型反应器的基因检查还可以检测与对特定疾病的病患感受性，对药物的副作用等相关的基因变异、编码区域以及调节基因的启动子区域中的变异。这种情况，利用具有含有变异部分的核酸序列的引物。并且，所谓上述基因变异是指基因的核苷酸碱基中的变异。此外通过本发明的基因检测装置基因多型的分析对于疾病感受性基因的鉴定也有用。
根据装置的结构和分析原理可知：与以往的核酸序列分析、限制性酶分析、核酸杂交分析相比，使用本发明的基因检测装置的基因检查方法用极少的试样量、极少的麻烦和简便的装置可以获得更高精度的结果。
本发明的基因检测用微型反应器、基因检测用装置等可以应用于基因表达分析、基因功能分析、单核苷酸多态性分析(SNP)、临床检查·诊断、药物筛选、医药、农药或各种化学物质的安全性·毒性的检查、环境分析、食品检查、法医学、化学、酿造、渔业、畜产、农产制造、农林业等领域。
下面，一面参照附图，一面对本发明的实施方式进行说明。图1是本发明的一个实施方式中的基因检测用微型反应器的概况图。图2是该的微型反应器与装置主体构成的基因检测装置的概况图。
图1所示的微型反应器由树脂制备的一块芯片构成，其构造是通过注入血液等试样，在芯片内自动进行基因扩增反应及其检测，对于多个项目，可以同时且进行基因检测。例如，仅将2-3μl左右的血液试样滴落在长宽的长度为数厘米的芯片上，通过将芯片装载于图2的装置主体中，就可以进行基因扩增及其检测。
注入到图1的试样储存部20中的试样和预先封于试剂储存部18a-18c中的基因扩增反应中使用的试剂由组装于图2的装置主体的微型泵输送到连通各储存部的流路中，通过Y字流路在流路内混合试剂和试剂，进行扩增反应。流路形成为例如宽100μm，深100μm左右，通过组装于图2的装置主体2的光学检测装置(未示出)检测扩增反应。例如，对检查项目的每个流路用LED照射测定光，用光电二极管、光电倍增管等光检测方法检测透射光或反射光，通过探针DNA杂交就可以检测被标记的扩增DNA(基因)。
装置主体2中，还组装了控制反应温度的温度控制装置，通过在将送液泵、光学检测装置和温度控制装置一体化的小型单元中仅装载预先封入试剂的芯片，可以简便地进行基因诊断。这样一来，由于可以不管场所、时间迅速的测定，因此还可以应用于紧急医疗、个人的在家医疗。由于送液中使用的多数微型泵单元等组装到装置主体侧，因此芯片可以作为可任意使用的类型使用。
以下，基于图14-17中所示的本发明的一个实施方式中的微型反应器，对微型反应器更具体的结构进行说明。本实施方式的微型反应器优选是通过ICAN法进行扩增反应的微型反应器，在微型反应器中，通过血液或咳痰中提取的试样，和包括与最为检测对象的基因特异性杂交的经生物素修饰的嵌合引物、具有链置换活性的DNA聚合酶和核酸内切酶的试剂进行基因扩增反应。反应液在经变性处理后被输送到吸附了链霉亲和素的流路中，将扩增的基因固定在流路中。然后，使经异硫氰酸荧光素(FITC)末端修饰的探针与固定的基因杂交，使经FITC抗体表面修饰的胶体金吸附到与固定的基因杂交的经FITC修饰的探针上，通过光学测定胶体金的浓度检测扩增的基因。
本实施方式中，微型反应器按如下方式构成以便在一块芯片中以高精度且迅速地进行高可信度的基因检查。第1中，对照全都一体化于1块芯片中，内部对照、阳性对照和阴性对照均预先封入微型反应器中，在试样的扩增反应和检测操作的同时进行这些对照的扩增反应和检测操作。这样一来，就可以迅速地进行高可信度的基因检查。
第2中，流路的各位置中配置有：达到预先设定正方向的送液压力的压力时，切断液体通过，通过施加预设的压力以上的送液压力使液体通过，通过前述微型泵的泵压可以控制液体的通过的送液控制部；和防止流路内的液体逆流的逆流防止部。如下所述，流路内的液体的输送受微型泵，送液控制部和逆流防止部的控制，可以以高精度定量输送试剂等，可以迅速混合由分支流路导入的多种试剂。
在对本实施方式的使用微型反应器的扩增反应及其检测进行说明之前，对该微型反应器的主要结构单元进行说明。
试剂储存部
微型反应器中，设置有用于储存各种试剂的多个试剂储存部，可储存基因扩增反应中使用的试剂、变性扩增的基因的变性液，与扩增基因杂交的探针DNA等。
理想的是在试剂储存部中预先储存试剂以便可以无论场所和时间迅速地进行检查。为了防止内藏于芯片内的试剂类等蒸发、漏失、混入气泡、污染、变性等，可以对该试剂部表面作密封处理。进而，在保管微型反应器时，为了防止试剂从试剂储存部随意漏出到微细流路内而导致试剂反应等，用密封材料封口。这种密封材料，使用前，在μ-TAS(微型反应器)被保管的冷藏条件下固化或凝胶化，使用时，温度一达到室温就变成融解的流动状态。如图3所示，优选通过在试剂31和连通试剂储存部18的流路15之间填充密封剂32，在试剂储存部中封入试剂。并且，密封剂与试剂件即使存在空气也无妨，但是从定量送液的观点出发优选空气的量(相对于试剂量)足够少。
作为这种密封剂，可以使用对水难溶性的可塑性物质，优选为对水的溶解度在1％以下的油脂。这种油脂可以用油脂手册等进行研究，例如可以例举有表1所示的油脂。
在微型反应器中预先储存试剂时，在试剂的稳定性上，理想的是冷藏保管微型反应器，通过使用冷藏时微固体状态室温下变为液状的物质作为密封剂，可以在冷藏保管时成固体状态下密封试剂，同时在使用时变成液状容易从流路中排出。作为这种密封剂，可以列举有对水的溶解度在1％以下并且熔点为8℃-室温(25℃)的油脂，及明胶的水溶液。明胶的水溶液可以通过改变明胶的浓度调整凝胶化温度，例如，为了使其在10℃前后凝胶化，可以制成约1％的水溶液。
并且，连通储存阳性对照和阴性对照的各储存部的流路间同样也可以填充密封剂。
本实施方式中，试剂储存部的上游侧与微型泵连接，通过由泵向试剂储存部侧提供驱动液，向流路压出来输送试剂。
[表1]
泵连接部
本实施方式中，在试样储存部、试剂储存部、阳性对照储存部和阴性对照储存部中均设置有输送这些储存部的内容液的微型泵。微型泵与微型反应器组装在其它用途的装置主体中，通过将微型反应器装载于装置主体中，用泵连接部连接微型反应器。
本实施方式中，使用压电泵作为微型泵。图4(a)是表示这种泵的一个实例的截面图，图4(b)是其上面图。该微型泵中设置有形成第1液室48、第1流路46、加压室45、第2流路47及第2液室49的基板42、和层压在基板42上的上侧基板41、和层压在基板41上的振动板43、和面向振动板43的加压室45侧层压的压电元件44、和用于驱动压电元件44的驱动部(未图示)。
该例中，作为基板42，使用厚度为500μm的感光性玻璃基板，通过进行蚀刻直至深度达到100μm，形成第1液室48、第1流路46、加压室45、第2流路47及第2液室49。第1流路46其宽度为25μm，长度为20μm。此外，第2流路47其宽度为25μm，长度为150μm。
通过在基板42上层压材质为玻璃基板的上侧基板41，形成第1液室48，第1流路46，第2液室49和第2流路47的上面。处于上侧基板41的加压室45上面的部分通过蚀刻等加工而贯穿。
在上侧基板41的上面层压厚度为50μm的薄板玻璃构成振动板43，在其上层压例如由厚度为50μm的锆钛酸铅(PZT)陶瓷构成的压电元件44。
通过驱动部的驱动电压，压电元件44与粘附于其的振动板43振动，由此加压室45的体积发生增减。第1流路46和第2流路47宽度和深度相同，第2流路的长度比第1流路的长，第1流路46中，压力差一变大，流路内像卷起漩涡这样发生涡流，流路阻力增加。另一方面，第2流路47中，由于流路宽度长因此即使压力差变大也容易形成层流，流路阻力的变化相对于压力差的变化的比例比第1流路的小。
例如，如果通过对压电元件44外加驱动电压，使振动板43向加压室45的内方向迅速变位，一边施加大压力差一边使加压室45的体积减少，然后使振动板43由加压室45向外方向慢慢地变位，一边外加小压力差一边使加压室45的体积增加，液体就会向同图的B方向输送。相反，如果使振动板43向加压室45的外方向迅速变位，一边外加大压力差一边使加压室45的体积增加，然后使振动板43由加压室45向内方向慢慢地变位，一边外加小压力差一边使加压室45的体积减少，液体就会向同图的A方向输送。图5中，表示对压电元件44外加的驱动电压波形与液体的位置变位之间的关系的一个例子。图5(b)中所示液体的移动量的图是模式化表示由泵动作获得的流量的图，实际上，此处由流体的惯性力产生的时间滞后和惯性振动成为重叠的动作。并且，第1流路和第2流路中，流路阻力对于压力差的变化的变化比率的差异未必就是由于流路的长度不同而导致的需要，也可以是基于其它形状的差异的差异。
如果用如上所述构成的压电泵，通过改变泵的驱动电压和频率，就可以控制液体的送液方向、送液速度。图4(c)中，显示了该泵的其它例子。该例中，硅基板71、压电元件44和未图示的柔软的配线构成泵。硅基板71是通过公知的照相平版印刷术将硅片加工成规定形状，通过蚀刻形成加压室45、振动板43、第1流路46、第1液室48、第2流路47和第2液室49。第1液室48中设置有端口72，第2液室49中设置有端口73，通过这种端口连通微微型反应器的泵连接部。例如，通过使端口穿孔的基板74和微型反应器的泵连接部附近上下重合，可以将泵连接到微型反应器上。此外，1块硅基板上还可以形成多个泵。此时，理想的是驱动液泵与微型反应器连接的端口的对侧的端口连接。存在多个泵时，这些泵还可以与共通的驱动液槽连接。
泵连接部周边的结构如图6所示。同图(a)表示输送驱动液的泵部的结构，同图(b)表示输送试剂的泵部的结构。这里，驱动液24也可是矿物油等油类，或者水类中的任一种，密封试剂的密封液25可以如图3所示填充于流路中，或者填充于为了密封液而设置的储留部中。在泵连接部12和试剂储存部18之间的流路中设置有用于排放空气的流路26。如图7所示，该用于排放空气的流路26自泵连接部与试剂储存部之间的流路15分支，其末端开放。在连接泵时等情况下设法从该用于排放空气的流路26除去存在于流路15中的气泡。
该用于排放空气的流路26，从防止通过流路15的例如水等水性液体27漏出的观点考虑，优选流路直径为10μm以下，并且与流路内面的水的接触角为30°以上。
为了在微细流路内迅速混合试剂与试剂或者试样与试剂，输送这些试剂和试样的各个微型泵的驱动如下述方式控制。如图8(a)所示，通过从Y字的分支流路的上游向A方向输送试剂31，向B方向输送试样33，在流路15中混合这些物质时，且输送试剂31的泵的驱动，输送试样33的泵的驱动如图8(c)所示方式控制。也就是说，在向A方向输送试剂31期间，停止试样33的输送，在向B方向输送试样33期间，停止试剂31的输送。通过交替重复这种操作，如图8(a)所示，试剂31和试样33以圆片状交替填充于流路15中。通过提高泵送液的变化速度，可以使该薄片层的宽度成为例如1-2μm。层的宽度变短，试剂31和试样33之间的扩散迅速进行，从而迅速地混合。例如，流路直径100μm的流路内以1∶1的一定比率将试剂31和试样33输送到流路15中时，如图8(b)所示一般形成50μm宽度的试剂层和试样层，与图8(a)的情况相比扩散难以前进，混合变慢。
这种从多个分支流路向混合流路输送各液体时，通过一边改变各分支流路中的流速一边送液，可以迅速混合，并且可以以所希望的比率混合这些液体。并且，图8(a)方面，描述为可以迅速混合，但是如果流路宽度缩小又费时，就可以以图8(b)的方式混合。
送液控制部
本实施方式的微型反应器中，在其流路内设置了多个如图9(a)所示的送液控制部。这种送液控制部在向正方向的送液压力达到规定压力时切断液体的通过，通过外加预设压力以上的送液压力允许液体通过。
如图9(a)、(b)所示，送液控制部13由挤压流路直径的部分构成，由此，控制由一端侧抵达该挤压流路(细流路)51的液体向另一端侧的通过。该挤压流路51，对于例如串联连接于两侧的长宽为150μm×150μm的流路，长宽形成为30μm×30μm。
为了将液体从细径的挤压流路51的端部51a挤出到大径的流路15，由于表面张力而需要规定送液压力。因此，通过微型泵的泵压可以控制液体的停止和通过，因此可以预先暂时中断流路规定区域中液体的移动，在希望的时间再开放由该区域向前面的流路的输送。
根据需要，在挤压流路51的内面还施加了防水性涂层，例如氟涂层。
如上所述以串联连接方式在这些流路之间形成与两侧相邻的流路，通过在这些相邻流路中设置具有比与流路轴方向垂直的截面的截面积更小的截面积的细流路构成的送液控制部，可以控制送液的时间。
逆流防止部
本实施方式的微型反应器中，在该流路中设置有防止液体逆流的多个逆流防止部。这种逆流防止部由阀体通过关闭流路开口部的止逆阀或者阀体通过阀体变形方法向流路开口部挤压从而关闭该开口部的活动阀构成。
图10(a)、(b)是表示本实施方式的微型反应器的流路中使用的止逆阀的一个例子的截面图。图10(a)的止逆阀中，以微小球67作为阀体，通过该微小球67的移动开闭在基板62上形成的开口68，从而允许及中断液体的通过。也就是说，在向A方向输送液体时，微小球通过液压从基板62远离，从而开放开口68，因此可以允许液体通过。另一方面，液体由B方向逆流时，由于微小球关闭位于基板62上的开口68，因而可中断液体通过。
图10(b)的止逆阀中，在基板62上层压的其端部在开口68的上侧延伸的挠性基板69通过由液压使开口68的上侧上下动来开闭开口68。也就是说，在向A方向输送液体时，挠性基板69的端部通过液压从基板62远离从而开放开口68，因而可以允许液体通过。另一方面，在液体自B方向逆流时，由于挠性基板69通过粘附于基板62上来关闭开口68，从而可以中断液体的通过。
图11是表示可在本实施方式的微型反应器的流路中使用的活动阀的一个例子的截面图，图11(a)表示开阀状态，图11(b)表示闭阀状态。该活动阀中，形成下方突出的阀部64的挠性基板63层压在形成开口65的基板62上。
关阀时，如图(b)所示，通过空气压、油压、水压活塞和压电激发器、形状记忆合金等阀体变形方法自上侧挤压挠性基板63，使阀部64粘合以便面向基板62覆盖开口，由此设法中断向B方向的逆流。此外，只要活动阀通过外部的驱动装置运作，即使阀体通过自我变形阻塞流路构成也是可以的。例如，如图18所示，也可以设法使用双金属81通过通电加热变形，或者如图19所示也可以设法使用形状记忆合金82通过通电加热变形。
试剂定量部
用上述送液控制部和逆流防止部，可以定量输送试剂。图12是表示这种试剂定量部的结构的图，在逆流防止部16和送液控制部13a之间的流路(试剂填充流路15a)中填充规定量的试剂。此外，还设置有自该试剂填充流路15分支，与输送驱动液的微型泵11连通的分支流路15b。
试剂的定量输送如下方式进行。最初，自逆流防止部16侧，自送液控制部13a向前以试剂31不通过的送液压力将试剂31提供给试剂填充流路15a来填充试剂31。然后，在允许送液控制部13a向前以试剂31通过的送液压力，通过由泵从分支流路15b向试剂填充流路15a方向输送驱动液25，将填充于试剂填充流路15a内的试剂31从送液控制部15a向前挤压，由此定量输送试剂31。分支流路15b中存在空气，密封液等，即使在这种情况下，通过用微型泵11输送驱动液25从而将这种空气，密封液等送入试剂填充流路15a中可以压出试剂。并且，通过在试剂填充流路15a中填充大容积的储留部17a，定量的偏差变小。
试剂的混合
在通过Y字流路混合两种试剂时，即使同时输送各种试剂，液体前端部分的混合比率也不稳定。图13是表示通过去掉该前端部分，稳定混合比率之后向下一步骤输送混合液的流路结构的图。同图中，混合的试剂31a和31b分别由流路15a，15b向混合流路15c输送。
由混合流路15c向下一步骤输送试剂混合液31c的分支流路15d，在混合流路15c中的比与分支流路15d的分支点更前的位置设置第1送液控制部13a。在分支流路15d中的与与分支流路15d的分支点的附近位置设置比试剂混合液31c可以通过的送液压力比第1送液控制部13a更小的第2送液控制部13b。
由流路15a和流路15b向混合流路15c内输送的试剂31a和试剂31b的试剂混合液31c，向混合流路15c内输送直至其前端部31d到达第1的送液控制部13a。试剂混合液31c的前端部到达第1的送液控制部13a后，再通过向15c输送，使试剂混合液31c由第2送液控制部13b向分支流路15d通过，将试剂混合液31c输送到下一步骤。
例如，通过使第1送液控制部13a中的前述细流路的截面积比第2送液控制部13b中的前述细流路的截面积小，可以使第2送液控制部13b中的试剂混合液可以通过的送液压力比第1送液控制部13a中的小。
下面，就使用具备上述各结构单元的本实施方式的微型反应器的基因扩增反应及其检测的具体实例，一面参照图14～17一面说明。与作为检测对象的基因特异性杂交的经生物素修饰的嵌合引物、具有链置换活性的DNA聚合酶和核酸内切酶等试剂储存于图14的试剂储存部18a，18b，18c中，在各试剂储存部的上游侧，内藏于其它用途的装置主体内的压电泵11以泵连接部12与微型反应器连接。从各试剂储存部向下游侧的流路15a通过这些泵输送试剂。
流路15a和由流路15a分支的向下一步骤的流路、和送液控制部13a，13b构成图13中说明的流路，设法去掉由各试剂储存部输送的试剂的混合液的前端部，稳定混合状态后将试剂混合液输送到下一步骤。各试剂储存部中储存合计超过7.5μl的试剂，去掉前端的总计7.5μl的试剂混合液然后以每根2.5μl输送到3根分支流路15a，15b，15c中。流路15b与试样的反应，向检测系统(图15)连通，流路15c为与阳性对照的反应，向检测系统(图16)连通，流路15d为与阴性对照的反应，向检测系统(图17)连通。
流路15b中输送的混合试剂填充于图15的储留部17中。并且，储留部17a的上游侧的止逆阀16和下游侧的送液控制部13a之间，构成按图12中说明的试剂填充流路，在构成了设置于与输送驱动液的泵11连接的分支流路中的送液控制部13b的同时构成了前述试剂定量部。
从血液或咳痰中提取的试样从试样储存部20注入，用与上述试剂定量部相同的机械装置在储留部17b中定量填充试样(2.5μl)，向后续的流路定量输送。填充于各储留部17a、17b的试样与试剂混合液通过Y字流路输送到流路15e(容积5μl)中，在该流路15e中进行混合和ICAN反应。这里，试样与试剂的送液，通过如图8说明的方式交替驱动各泵11，在流路15e中以圆片状地交替导入试样与试剂混合液，试样与试剂迅速扩散，混合。
通过将混合5μl反应液和储存于停止液储存部21a的1μl反应停止液输送到容积为6μl的流路15f中将它们混合从而停止扩增反应。然后，向容积为1.5μl的流路15g输送储存于变性液储存部21b的变性液(1μl)和反应液和停止液的混合液(0.5μl)，混合，将扩增的基因变性为单链。
然后，储存于探针DNA储存部21c的、且末端经FITC荧光标记的探针DNA溶液(2.5μl)和变性处理了的处理液(1.5μl)向容积为4μl的流路15h输送而混合，使探针DNA与单链的扩增基因杂交。
然后，该处理液以平均2μl输送到流路内吸附了链霉亲和素的链霉亲和素吸附部22a、22b中，将经探针标记的扩增基因固定在该流路内。
通过单一的泵11将储存于各储存部21d、21f、21e的清洗液、内部对照用探针DNA溶液、以及经FITC标记的胶体金溶液以同图所示顺序输送到固定了这种扩增基因的流路22a中。同样通过单一的泵11将储存于各储存部21d，21g，21e的清洗液、MTB用探针DNA溶液、以及经FITC标记的胶体金溶液以同图所示顺序输送到固定了这种扩增基因的流路22b中。
通过输送胶体金溶液，胶体金通过FITC与固定的扩增基因结合，从而被固定。通过光学检测这种固定的胶体金测定扩增的有无或扩增效率。
图14的流路15c、15d分别与图16所示的阳性对照的反应、检测系统连通，以及与图17所示的阴性对照的反应、检测系统连通，通过将试剂混合液输送到其中，与在上述试样的反应，检测系统时同样，使之在流路内与试剂扩增反应后，使之与储存于探针DNA储存部的探针DNA在流路内杂交，基于该反应生成物检测扩增反应。

Claims (22)

1、一种试样检测用微型反应器，其具有：
(1)板状的芯片，
(2)具有用于分别储存多种试剂的储存室的多个试剂储存部，
(3)混合从前述多个试剂储存部的出口送出的多种试剂从而生成混合试剂的试剂混合部，
(4)具有用于从外部注入试样的注入口的试样接收部，和
(5)使从前述试剂混合部送出的混合试剂和由试样接收部送出的试样混合反应的反应部，
前述多个试剂储存部、试剂混合部、试样接收部和反应部组装在前述芯片内，并通过流路连通，
前述试剂混合部有防止初期混合试剂送出到反应部的送出防止装置。
2、权利要求1中记载的微型反应器，其中前述试剂混合部形成混合流路，向反应部送出混合试剂的送出流路在混合流路的中间部分分叉，防止初期混合试剂储存于该混合流路的中间部与下游末端之间从送出流路送出到反应部。
3、权利要求2中记载的微型反应器，其中前述试剂混合部在前述混合流路与前述送出流路的连接部具有在前述混合流路内的压力达到规定压力以上时向前述送出流路送出混合试剂的送液控制部。
4、权利要求3中记载的微型反应器，其中前述送液控制部是比前述送出流路的截面积更小的截面积的细流路。
5、权利要求1中记载的微型反应器，其中前述各试剂储存部具有用于在储存室中注入驱动液的注入口和用注入的试剂从储存室将试剂压出的出口。
6、权利要求5中记载的微型反应器，其中前述注入口和可与外部泵连接的泵连接部连接，通过外部泵将驱动液从注入口注入到储存室中。
7、权利要求6中记载的微型反应器，其中前述注入口与前述泵连接部的连接部设置有末端开放的空气排出流路。
8、权利要求7中记载的微型反应器，其中前述空气排出流路的流路直径为10μm以下，且与流路内面的水的接触角为30°以上。
9、权利要求5中记载的微型反应器，其中前述各试剂储存部的出口中填充防止试剂流出的密封剂。
10、权利要求9中记载的微型反应器，其中前述密封剂在规定温度以下固化、在室温下融解成流动状态。
11、权利要求9中记载的微型反应器，其中前述密封剂的熔点为8℃-25℃。
12、权利要求9中记载的微型反应器，其中前述密封剂是油脂或明胶的水溶液。
13、权利要求1中记载的微型反应器，其还具有在前述试剂混合部与前述反应部之间填充混合试剂、输送规定量的混合试剂的试剂填充部。
14、权利要求13中记载的微型反应器，其中前述试剂填充部具有填充混合试剂的填充流路和设置于该填充流路的入口的逆流防止部、设置于该填充流路的出口的送液控制部、和设置于该填充流路的入口附近的分支流路，
前述分支流路和可以与外部泵连接的泵连接部连接，在填充流路中填充混合试剂后，由外部泵通过分支流路用驱动液加压以使填充流路内的液压达到规定以上，从而由送液控制部输送填充的混合试剂的规定量。
15、权利要求14中记载的微型反应器，其中前述逆流防止部是阀体通过逆流压关闭流路开口的止逆阀，或者阀体通过阀变形装置在流路开口部推压关闭该流路开口的活动阀。
16、权利要求1中记载的微型反应器，其中前述微型反应器是基因检测用微型反应器。
17、权利要求16中记载的微型反应器，其中前述多个试剂储存部储存基因扩增反应中使用的试剂，将试样或由试样中提取的DNA注入到前述试剂储存部中。
18、权利要求16中记载的微型反应器，其还具有储存阳性对照的阳性对照储存部、储存阴性对照的阴性对照储存部、和储存与经基因扩增反应扩增的检测对象的基因杂交的探针DNA的探针DNA储存部。
19、权利要求17中记载的微型反应器，其中前述芯片中通过泵连接部与微型泵连接，向流路输送储存于试样储存部的试样或从试样中提取的DNA、和储存于试样储存部的试剂，在流路内混合使之扩增反应后，向其下游侧的流路输送处理了该反应液的处理液、和储存于探针DNA储存部的探针DNA，在流路内混合使之杂交后，基于该反应生成物进行扩增反应的检测；
对于储存于阳性对照储存部中的阳性对照及储存于阴性对照储存部中的阴性对照，同样使之与储存于试剂储存部的试剂在流路内扩增反应后，使之在流路内与储存于探针DNA储存部的探针DNA杂交，基于该反应生成物进行扩增反应的检测。
20、权利要求17中记载的微型反应器，其中设置在前述试样储存部中注入试样或从试样提取的RNA的同时，储存用于由其中所含的RNA通过逆转录反应合成cDNA的逆转录酶的逆转录酶储存部；
向流路输送储存于试样储存部中的试样或从试样提取的RNA、和储存于逆转录酶储存部的逆转录酶，在流路内混合，合成cDNA后，进行前述扩增反应及其检测。
21、一种试样检测用微型反应器，其设置有：
(1)板状的芯片，
(2)具有用于分别储存多种试剂的储存室的多个试剂储存部，
(3)混合从前述多个试剂储存部的出口送出的多种试剂从而生成混合试剂的试剂混合部，
(4)具有用于从外部注入试样的注入口的试样接收部，和
(5)使从前述试剂混合部送出的混合试剂和由试样接收部送出的试样混合反应的反应部，
前述多个试剂储存部、试剂混合部、试样接收部和反应部组装在前述芯片内，并通过流路连通；
前述各试剂储存部有用于在储存室注入驱动液的注入口，和用于通过注入的试剂从储存室推出试剂的出口，前述注入口和可以与外部泵连接的泵连接部连接，驱动液通过外部泵从注入口注入到储存室，前述注入口与前述泵连接部的连接部中设置有末端开放的空气排出流路。
22、权利要求21中记载的微型反应器，其中前述空气排出流路的流路直径为10μm以下，且与流路内面的水的接触角为30°以上。
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