CN100441595C

CN100441595C - 结合红细胞生成素受体的新肽

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Publication number: CN100441595C
Application number: CNB2004800196261A
Authority: CN
Inventors: C·P·霍姆斯; 殷群; G·拉隆德; P·沙茨; D·图梅蒂; B·帕兰尼; G·H·泽梅德
Original assignee: Affymax Inc
Current assignee: Affymax Inc
Priority date: 2003-05-12
Filing date: 2004-05-12
Publication date: 2008-12-10
Anticipated expiration: 2024-05-12
Also published as: KR101163683B1; WO2004101606A3; US7855175B2; EA010095B1; RS20050838A; US20110245176A1; US7414105B2; JP2007530441A; ATE428727T1; MXPA05012316A; CA2525568A1; DK1629007T3; ME00356B; UA88146C2; KR20060022239A; AU2004238870B8; US20050137329A1; HRP20090251T1; NO338435B1; AU2004238870B2

Abstract

本发明涉及肽化合物，其为红细胞生成素受体(EPO-R)的激动剂。本发明还涉及使用此类肽化合物治疗与不足和有缺陷的血红细胞产生相关的疾病。还提供了包含本发明的肽化合物的药物组合物。

Description

结合红细胞生成素受体的新肽

相关申请的交叉参考

本申请要求都在2003年5月12日提交的美国临时申请序号60/469,993和60/470,244的优先权。将这些优先权申请的内容完整并入本公开作为参考。

发明领域

本申请涉及肽化合物，其是红细胞生成素受体(EPO-R)的激动剂。本发明还涉及使用此类肽化合物治疗与血红细胞产生不足或缺陷相关的疾病的治疗方法。还提供了包含本发明的肽化合物的药物组合物。

发明背景

红细胞生成素(EPO)是具有165个氨基酸的糖蛋白激素，其分子量为约34千道尔顿(kD)，在24、38、83和126位氨基酸上优选具有糖基化位点。它最初以具有23个氨基酸的信号肽的前体蛋白质产生。EPO可以以三种形式：α、β和脱唾液酸的形式发生。α和β形式在它们的糖组分中稍有不同，但是具有相同的效力、生物活性和分子量。脱唾液酸形式是除去末端糖(唾液酸)的α或β形式。已经报导了编码EPO的DNA序列[Lin的美国专利号4,703,008]。

EPO刺激有丝分裂和红细胞前体细胞的分化，从而确保产生红细胞。当低氧条件占优势时，EPO在肾中产生。在红细胞前体细胞的EPO诱导的分化期间，诱导珠蛋白合成；刺激血红素复合体合成；并且铁蛋白受体数增加。这些改变允许细胞利用更多铁和合成功能血红蛋白，其在成熟红细胞中结合氧。从而，红细胞和它们的血红蛋白在为身体供氧中其关键作用。这些改变由EPO与红细胞前体细胞的细胞表面上的适宜受体的相互作用启动[见，例如，Graber和Krantz(1978)Ann.Rev.Med.29.51-66]。

当身体处于健康状态时，EPO以极低浓度存在于血浆中，其中组织从现有的红细胞接受足够的氧合作用。该正常的低浓度足够刺激通过老化正常损失的血红细胞的更替。

在低氧条件下，此时循环中血细胞运输的氧减少，循环中EPO的量增加。例如，通过出血引起的大量失血、过量暴露于辐射导致血红细胞的破坏、由于高海拔或者长时间不省人事导致氧摄取减少，或者多种形式的贫血可以导致低氧。响应此类低氧应激，升高的EPO水平通过刺激红细胞类祖细胞增殖增加血红细胞产生。当循环中血红细胞数大于正常组织氧需求所需时，循环中的EPO水平降低。

因为EPO是血红细胞形成过程中必需的，所以该激素在诊断和治疗特征是低或者有缺陷的血红细胞产生的血液疾病中具有潜在有用的应用。最近的研究已经为多种疾病状态、疾病和血液不规则性状态提供了设计EPO治疗功效的基础，所述疾病状态、疾病和血液不规则性状态包括β-地中海贫血[见，Vedovato，等人(1984)Acta.Haematol.71：211-213]；囊性纤维化[见，Vichinsky，等人(1984)J.Pediatric 105：15-21]；妊娠和月经失调[见，Cotes，等人(193)Brit.J.Ostet.Gyneacol.90：304-311]；早产儿贫血[见，Haga，等人(1983)Acta Pediatr.Scand.72；827-831]；脊髓损伤[见，Claus-Walker，等人(1984)Arch.Phys.Med.Rehabil.65：370-374]；太空飞行[见，Dunn，等人(1984)Eur.J.Appl.Physiol.52：178-182]；急性失血[见，Miller，等人(1982)Brit.J.Haematol.52：545-590]；老化[见，Udupa，等人(1984)J.Lab.Clin.Med.103：574-580和581-588和Lipschitz，等人(1983)Blood 63：502-509]；伴随着异常红细胞发生的多种瘤性疾病状态[见，Dainiak，等人(1983)Cancer 5：1101-1106和Schwartz，等人(1983)Otolaryngol.109：269-272]；和肾机能不全[见，Eschbach.等人(1987)N.Eng.J.Med.316：73-78]。

已经表征了经纯化的同质EPO[Hewick的美国专利号4,677,195]。纯化、克隆并表达了编码EPO的DNA序列以产生具有与天然EPO相同生物化学和免疫学性质的重组多肽。还产生了具有与天然EPO上寡糖相同的寡糖的重组EPO分子[见，Sasaki，等人(1987)J.Biol.Chem.262：12059-12076]。

EPO的生物学效应似乎部分通过与细胞膜结合的受体的相互作用介导。使用从小鼠脾脏分离的不成熟红细胞样细胞的初步研究表明结合EPO的细胞表面蛋白质包含两种多肽，它们分别具有约85,000道尔顿和100,000道尔顿的分子量[Sawyer，等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3690-3694]。计算出EPO结合位点数平均为每个细胞表面800到1000个。在这些结合位点中，约300个以约90pM(皮摩尔)的K_d结合EPO，而剩下的以约570pM的更小亲和力结合EPO[Sawyer，等人(1987)J.Biol.Chem.262：5554-5562]。独立的研究表明从注射弗罗德白血病病毒的贫血株系(FVA)的小鼠制备的EPO-反应性脾成红血细胞具有总共约400个高和低亲和性EPO结合位点，它们的K_d值分别为约100pM和800pM[Landschulz，等人(1989)Blood 73：1476-1486]。

随后的工作表明EPO受体(EPO-R)的两种形式由一种基因编码。该基因已被克隆[见，例如，Jones，等人(1990)Blood 76，31-35；Noguchi，等人(1991)Blood 78：2548-2556；Maouche，等人(1991)Blood 78：2557-2563]。例如，在D′Andrea，等人的PCT公开号WO 90/08822中描述了鼠和人EPO-R蛋白质的DNA序列和编码的肽序列。当前的模型表明EPO与EPO-R的结合导致两种EPO-R分子的二聚化和激活，其导致随后的信号转导步骤[见，例如，Watowich，等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：2140-2144]。

EPO-R的克隆基因的可得性促进了对该重要受体的激动剂和拮抗剂的研究.所述重组受体蛋白质的可得性允许在多种随机和半随机肽多样性产生系统中研究受体-配体相互作用。这些系统包括“质粒上肽”系统[美国专利号6,270,170中描述]；“噬菌体上肽”系统[美国专利号5,432,018和Cwirla，等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6378-6382描述]；“编码的合成文库”(ESL)系统[1992年9月16日提交的美国专利申请序号946,239中描述]；和“极大规模固定化聚合物合成”系统[美国专利号5,143,854；PCT公开号90/15070；Fodor，等人(1991)Science 251：767-773；Dower和Fodor(1991)Ann.Rep.Med.Chem.26：271-180；和美国专利号5,424,186中描述]。

至少一定程度与EPO-R相互作用的肽已经得到鉴定并且在例如，Wrighton，等人的美国专利号5,773,569；5,830,851；和5,986,047；Wrighton，等人的PCT公开号WO 96/40749；Johnson和Zivin的美国专利号5,767,078和PCT公开号96/40772；Balu的PCT公开号WO01/38342；和Smith-Swintosky，等人的WO01/91780中描述。尤其，已经鉴定了一组含有肽基序的肽，该组肽的成员结合EPO-R并且刺激EPO-依赖性细胞增殖。然而，目前为止鉴定的含有所述基序的肽在体外以约20纳摩尔(nM)到约250nM的EC50值刺激EPO-依赖性细胞增殖。从而，需要约20nM到250nM的肽浓度刺激EPO刺激的最大细胞增殖的50％。

考虑到EPO-R激动剂对于研究该受体介导的重要的生物活性和治疗疾病的巨大潜力，仍然需要鉴定具有增强的效力和活性的肽EPO-R激动剂。本发明提供了此类化合物。

本章节中和整个说明书中的引用和/或对引用的参考文献的讨论仅仅提供用于阐明本发明的描述并且不是承认此类参考文献是本发明的“现有技术”。

发明概述

本发明的提供了新的肽化合物，其是具有显著增强的效力和活性的EPO-R激动剂。这些肽化合物是具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal) VCQPLRK(SEQ ID NO：1)的肽单体的同型二聚体，或者具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)的肽单体的同型二聚体、具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)(SEQ ID NO：3)的肽单体的同型二聚体；其中每个氨基酸通过标准的单字母缩写表示，“(ACG)”是N-乙酰基甘氨酸，“(1-nal)”是1-萘基丙氨酸，“(MeG)”是N-甲基甘氨酸，也称作肌氨酸。肽二聚体的每种肽单体含有单体的半胱氨酸残基间的分子内二硫键。

肽单体可以通过共价连接到分枝的叔酰胺连接体二聚化。该叔酰胺连接体可以描述为：

-C¹O-CH₂-X-CH₂-C²O-

其中：X为NCO-(CH₂)₂-N¹H-；连接体的C¹与第一个肽单体的C-末端赖氨酸残基的ε-氨基形成酰胺键；连接体的C²与第二个肽单体的C-末端赖氨酸残基的ε-氨基形成酰胺键；X的N¹通过氨基甲酸酯键或者酰胺键连接到活化的聚乙二醇(PEG)部分，其中PEG具有约20,000到约40,000道尔顿的分子量(术语“约”指出在PEG的制备物中，某些分子将具有大于所陈述的分子量，有些分子具有小于所陈述的分子量)。

当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK(SEQ ID NO：1)并且连接体的N¹通过氨基甲酸酯键连接到活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新肽化合物可以表示如下：

当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK(SEQ ID NO：1)并且连接体的N¹通过酰胺键连接到活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新肽化合物可以表示如下：

当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal) VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)并且连接体的N¹通过氨基甲酸酯键共价连接到活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新肽化合物可以表示如下：

当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)并且连接体的N¹通过酰胺键共价连接到活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新肽化合物可以表示如下：

肽单体还可以通过共价连接到分枝的叔酰胺连接体二聚化。该叔酰胺连接体可以描述为：

-C¹O-CH₂-X-CH₂-C²O-

其中：X为NCO-(CH₂)₂-NH-C³O-；连接体的C¹与第一个肽单体的C-末端赖氨酸残基的ε-氨基形成酰胺键；连接体的C²与第二个肽单体的C-末端赖氨酸残基的ε-氨基形成酰胺键。本发明的肽二聚体还包含下面结构的间隔臂部分：

-N¹H-(CH₂)₄-C⁴H-N²H-

其中：间隔臂的C⁴共价结合X的C³；间隔臂的N¹通过氨基甲酸酯或者酰胺键共价连接活化的聚乙二醇(PEG)部分；间隔臂的N²通过氨基甲酸酯或者酰胺键共价连接活化的PEG部分；其中PEG具有约10,000到约50,000道尔顿的分子量(术语“约”指出在PEG的制备物中，某些分子将具有大于所陈述的分子量，有些分子具有小于所陈述的分子量)。每个PEG部分可以个别地为10,000道尔顿(10kD)、20kD、30kD、40kD或者50kD。

当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK(SEQ ID NO：1)并且间隔臂的N¹和N²通过氨基甲酸酯键共价连接到活化的PEG部分时，本发明的新肽化合物可以表示如下：

在优选实施方案中，两个肽单体的C-末端赖氨酸是L-赖氨酸。而且，本领域技术人员从上面的化学结构将理解两个线性PEG部分通过赖氨酸连接(例如，如PEG₂-Lys-NHS或mPEG₂-赖氨醇-NPC)，所述赖氨酸也优选为L-赖氨酸并且得到下面的立体化学。

备选地，一个或多个赖氨酸残基可以是D-赖氨酸，得到备选立体化学，其是本领域技术人员容易明白的。

当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK(SEQ ID NO：1)并且间隔臂的N¹和N²通过酰胺键共价连接到活化的PEG部分时，本发明的新肽化合物可以表示如下：

再次，该化合物中的赖氨酸分子优选都是L-赖氨酸，得到下面的立体化学。

当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)并且间隔臂的N¹和N²通过氨基甲酸酯键共价连接到活化的PEG部分，其中Y是氨基甲酸酯基时，本发明的新肽化合物可以表示如下：

优选地，连接该分子的肽单体和线性PEG部分的赖氨酸残基都是L-赖氨酸，得到下面的立体化学：

当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)并且间隔臂的N¹和N²通过酰胺键连接到活化的PEG部分时，本发明的新肽化合物可以表示如下：

在其他实施方案中，一个或多个赖氨酸残基可以是D-赖氨酸，得到备选立体化学，其是本领域技术人员容易明白的。

肽单体还可以通过连接赖氨酸连接体二聚化，其中一个肽单体在其C-末端连接赖氨酸的ε-氨基，第二个肽单体在其C-末端连接到赖氨酸的α-氨基。

本发明的肽二聚体还包含下面结构的间隔臂部分：

-N¹H-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-N²H-

在一端，间隔臂的N¹通过酰胺键连接到赖氨酸连接体的羰基碳。在相反端，间隔臂的N²通过氨基甲酸酯健或者酰胺键连接到活化的聚乙二醇(PEG)部分，其中PEG具有约20,000到约40,000道尔顿的分子量(术语“约”指出在PEG的制备物中，某些分子将具有大于所陈述的分子量，有些分子具有小于所陈述的分子量)。

当间隔臂通过氨基甲酸酯键连接活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新肽化合物可以如下表示：

当间隔臂通过酰胺键连接活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新肽化合物可以如下表示：

本发明还提供了含有所述肽化合物的药物组合物，和使用此类肽化合物治疗多种医学病症的方法。

发明详述

定义：

肽中氨基酸残基如下筒写：苯丙氨酸为Phe或F；亮氨酸为Leu或L；异亮氨酸为Ile或I；甲硫氨酸为Met或M；缬氨酸为Val或V；丝氨酸为Ser或S；脯氨酸为Pro或P；苏氨酸为Thr或T；丙氨酸为Ala或A；酪氨酸为Tyr或Y；组氨酸为His或H；谷氨酰胺为Gln或Q；天冬酰胺为Asn或N；赖氨酸为Lys或K；天冬氨酸为Asp或D；谷氨酸为Glu或E；半胱氨酸为Cys或C；色氨酸为Trp或W；精氨酸为Arg或R；甘氨酸为Gly或G。肽中非常规氨基酸缩写如下：1-萘基丙氨酸为1-nal或者Np；N-甲基氨基酸(也称作肌氨酸)为MeG或Sc；乙酰化甘氨酸(N-乙酰基甘氨酸)为AcG。

如文中所用的，术语“多肽”或者“蛋白质”指通过酰胺键连接在一起的α氨基酸的氨基酸单体的聚合物。因此，多肽为长至少两个氨基酸残基并且通常更长。通常，术语“肽”指长仅为几个氨基酸残基的多肽。本发明的新的EPO-R激动剂肽优选长度不超过约50个氨基酸残基。它们更优选长为约17到约40个氨基酸残基。与肽相比，多肽可以含有任意数目的氨基酸残基。所以，术语多肽包括肽以及氨基酸的更长序列。

如文中所用的短语“药学上可接受的”指“通常认为安全”，即当施用于人时为生理上可耐受的并且通常不产生过敏或者类似的不良反应，如胃不适、眩晕等等的分子实体和组合物。优选地，如本文所用的术语“药学上可接受的”指得到联邦或者州政府管理机构的批准或者美国药典或者其他公知的药典中所列用于动物，更尤其用于人。术语“载体”指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或者运载体。此类药物载体可以是无菌液体，如水或油，包括石油、动物、植物或者合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。水或者水性溶液盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液优选用作载体，尤其用于可注射溶液。适宜的药物载体在E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中描述。

如本文所用的术语“激动剂”指生物活性配体，其结合其互补生物活性受体并激活该受体而导致该受体中生物应答或者增强所述受体的现有生物活性。

作为EPO-R激动剂的新肽

本发明提供了新的肽化合物，它们是具有显著增强的效力和活性的EPO-R激动剂。这些肽是具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK(SEQ ID NO：1)的肽单体的同型二聚体，或者具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)的肽单体的同型二聚体；其中每个氨基酸通过标准的单字母缩写表示，“(AcG)”为N-乙酰基甘氨酸，“(1-nal)”为1-萘基丙氨酸，“(MeG)”为N-甲基甘氨酸，也称作肌氨酸。肽二聚体的每个肽单体在单体的半胱氨酸残基之间含有分子内二硫键。此类单体可以如下图解表示：

或

和

或

这些单体肽二聚化以提供具有增强的EPO-R激动剂活性的肽二聚体。连接体(LK)部分是分枝的叔酰胺，其通过同时连接每个单体的C-末端赖氨酸残基桥接两个肽单体的C-末端。该叔酰胺连接体可以描绘为：

-C¹O-CH₂-X-CH₂-C²O-

其中：X为NCO-(CH₂)₂-N¹H-；连接体的C₁与第一个肽单体的C-末端赖氨酸残基的ε氨基形成酰胺键；连接体的C²与第二个肽单体的C-末端赖氨酸残基的ε氨基形成酰胺键；X的N¹通过氨基甲酸酯键或者酰胺键连接到活化的聚乙二醇(PEG)部分，其中PEG具有约20,000到约40,000道尔顿的分子量(术语“约”表明在PEG的制备物中，一些分子将比所陈述的分子量更大或更小)。

所述叔酰胺连接体还可以描绘为：

-C¹O-CH₂-X-CH₂-C²O-

其中X为NCO-(CH₂)₂-NH-C³O-；连接体的C₁与第一个肽单体的C-末端赖氨酸残基的ε氨基形成酰胺键；连接体的C²与第二个肽单体的C-末端赖氨酸残基的ε氨基形成酰胺键。本发明的肽二聚体还包含下面结构的间隔臂部分：

-N¹H-(CH₂)₄-C⁴H-N²H-

其中：间隔臂的C⁴共价结合X的C³；间隔臂的N¹通过氨基甲酸酯或者酰胺键共价连接活化的PEG部分；间隔臂的N²通过氨基甲酸酯或者酰胺键共价连接活化的PEG部分；其中PEG具有约10,000到约60,000道尔顿的分子量(术语“约”指出在PEG的制备物中，某些分子将具有大于所陈述的分子量，有些分子具有小于所陈述的分子量)。

从而，本发明的新肽还可以含有PEG部分，其通过氨基甲酸酯键或者酰胺键共价连接肽二聚体的叔酰胺连接体。PEG是水溶性聚合物，其是药学上可接受的。用于本发明的PEG可以是线性的、未分枝的PEG，其分子量为约20千道尔顿(20K)到约60K(术语“约”指出在PEG的制备物中，某些分子将具有大于所陈述的分子量，有些分子具有小于所陈述的分子量)。最优选地，PEG具有约30K到约40K的分子量。技术人员将能够基于诸如所希望的剂量、循环时间、对蛋白酶解的抗性，生物活性(如果存在)的影响、处理的容易性、抗原性程度或者抗原性的缺乏；和PEG对治疗肽的其他已知的影响等的考虑选择适宜的聚合物大小。

使用用于将水溶性聚合物连接到分子(例如，肽+间隔臂)的受体结合部分的多种化学方法的任一种可以将本发明的肽、肽二聚体和其他基于肽的分子连接到水溶性聚合物(例如，PEG)。通常的实施方案使用一个连接接点将一种或多种水溶性聚合物连接到受体结合部分，然而，在备选实施方案中，可以使用多个连接接点，包括其他变通方案，其中不同种类的水溶性聚合物连接到不同连接接点处的受体结合部分，所述接点可以包括间隔臂和/或一个或多个肽链的共价连接接点。在一些实施方案中，二聚体或者更高级别多聚体将包含不同种类的肽链(即，异二聚体或者其他异多聚体)。作为实例但不是限制，二聚体可以包含具有PEG连接接点的第一条肽链并且第二条肽链可以缺少PEG连接接点或者利用不同于第一条肽链的键合化学，并且在一些变通方案中，间隔臂可以含有或者缺少PEG连接接点并且所述间隔臂，如果PEG化，可以利用不同于第一和/或第二条肽链的键合化学。备选实施方案利用连接到受体结合部分的间隔臂部分的PEG和缀合所述分子的肽部分的一个氨基酸的侧链的不同的水溶性聚合物(例如，糖)。

多种聚乙二醇(PEG)种类可以用于PEG化受体结合部分(肽+间隔臂)。基本上可以使用任意适宜的反应性PEG试剂。在优选实施方案中，反应性PEG试剂将导致在缀合到受体结合部分时形成氨基甲酸酯或者酰胺键。适宜的反应性PEG种类包括，但不限于，适于在NOF Corporation(Yebisu Garden Place Tower，20-3 Ebisu 4-chome，Shibuya-ku，Tokyo150-6019)的Drug Delivery Systems目录(2003)和Nektar Therapeutics(490 Discovery Drive，Huntsville，Alabama 35806)的MolecularEngineering目录(2003)中出售的那些。例如并且不作为限制，在多种实施方案中通常优选下面的PEG试剂：mPEG2-NHS、mPEG2-ALD、multi-ArmPEG、mPEG(MAL)2、mPEG2(MAL)、mPEG-NH2、mPEG-SPA、mPEG-SBA、mPEG-硫酯、mPEG-Double Esters、mPEG-BTC、mPEG-ButyrALD、mPEG-ACET、杂官能PEGs(NH2-PEG-COOH、Boc-PEG-NHS、Fmoc-PEG-NHS、NHS-PEG-VS、NHS-PEG-MAL)、PEG丙烯酸酯(ACRL-PEG-NHS)、PEG-磷脂(例如，mPEG-DSPE)、SUNBRITE系列的多臂PEG，包括由本领域技术人员通过所选化学方法活化的GL系列的基于甘油的PEG，任一种SUNBRITE活化的PEG(包括但不限于，羧基-PEG、p-NP-PEGs、Tresyl-PEGs、醛PEGs、缩醛-PEGs、氨基-PEGs、硫羟-PEGs、马来酰亚胺-PEGs、羟基-PEG-胺、氨基-PEG-COOH、羟基-PEG-醛、羧酸酐型-PEG、官能化PEG-磷脂，和本领域技术人员为了他们的具体应用和习惯选择的其他类似和/或适宜的反应性PEG。

本发明的新肽还可以含有通过氨基甲酸酯或者酰胺键共价连接到间隔臂部分的两个PEG部分，其中间隔臂部分共价连接到肽二聚体的叔酰胺连接体。用于本发明的此类实施方案中的两个PEG部分的每一个可以是线性或者可以在一个连接点连接。每个PEG部分优选具有约10千道尔顿(10K)到约60K的分子量(术语“约”指出在PEG的制备物中，某些分子将具有大于所陈述的分子量，有些分子具有小于所陈述的分子量)。尤其优选线性PEG部分。更优选地，两个PEG部分的每一个具有约20K到约40K，更优选约20K到约40K的分子量。更优选地，两个PEG部分的每一个具有约20K的分子量。本领域技术人员将能够基于诸如所希望的剂量、循环时间、对蛋白酶解的抗性、对生物活性(如果存在)的影响、处理的容易性、抗原性程度或者抗原性的缺乏；和PEG对治疗肽的其他已知的影响等的考虑选择所希望的聚合物大小。

本发明还包含肽激动剂，其是具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal) VCQPLR(MeG)(SEQ ID NO：3)的肽单体的同型二聚体，其中每个氨基酸通过标准的单字母缩写表示，“(ACG)”是N-乙酰基甘氨酸，“(1-nal)”是1-萘基丙氨酸，“(MeG)”是N-甲基甘氨酸，也称作肌氨酸。肽二聚体的每个肽单体合有单体的半胱氨酸残基间的分子内二硫键。此类单体可以图解表示如下：

或

这些单体肽经二聚化提供具有增强的EPO-R激动剂活性的肽二聚体。连接体(L_K)部分是赖氨酸残基，其通过同时连接每个单体的C-末端氨基酸桥接两个肽单体的C-末端。一个肽单体在其C-末端连接所述赖氨酸的ε-氨基，第二个肽单体在其C-末端连接所述赖氨酸的α-氨基。例如，该二聚体可以在结构上在式1中显示，并且在式II中概述：

式I 式II

在式I和式II中，N²代表赖氨酸的ε-氨基的氮原子，N¹代表赖氨酸的α-氨基的氮原子。

本发明的肽二聚体还包含下面结构的间隔臂部分：

-N¹H-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-N²H-

在一端，该间隔臂的N¹通过酰胺键连接到赖氨酸连接体的糖基碳。在相反端，间隔臂的N²通过氨基甲酸酯键或者酰胺键连接到活化的聚乙二醇(PEG)部分，其中PEG具有约10,000到约60,000道尔顿的分子量(术语“约”指出在PEG的制备物中，某些分子将具有大于所陈述的分子量，有些分子具有小于所陈述的分子量)。更优选地，PEG具有约20,000到约40,000道尔顿的分子量。

从而，本发明的新肽还含有PEG部分，其共价连接到肽二聚体。PEG是药学上可接受的水溶性聚合物。用于本发明的PEG可以是线性的、未分枝的PEG，其分子量为约20千道尔顿(20K)到约60K(术语“约”指出在PEG的制备物中，某些分子将具有大于所陈述的分子量，有些分子具有小于所陈述的分子量)。最优选地，PEG具有约20K到约40K，更优选约30K到约40K的分子量。技术人员将能够基于诸如所希望的剂量、循环时间、对蛋白酶解的抗性、对生物活性(如果存在)的影响、处理的容易性、抗原性程度或者抗原性的缺乏；和PEG对治疗肽的其他已知的影响等的考虑选择所希望的聚合物大小。

当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-hal)VCQPLRK(SEQ ID NO：1)并且连接体的N¹通过氨基甲酸酯键连接活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新肽化合物可以如下表示：

当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK(SEQ ID NO：1)并且连接体的N¹通过酰胺键连接活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新肽化合物可以如下表示：

当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)并且连接体的N¹通过氨基甲酸酯键连接活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新肽化合物可以如下表示：

当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)并且连接体的N¹通过酰胺键连接活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新肽化合物可以如下表示：

本发明优选的肽二聚体包括，但不限于：

当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK(SEQ ID NO：1)并且连接体的N¹和N²都通过氨基甲酸酯键共价连接活化的PEG部分时，本发明的新肽化合物可以如下表示：

当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK(SEQ ID NO：1)并且连接体的N¹和N²都通过酰胺键连接活化的PEG部分时，本发明的新肽化合物可以如下表示：

当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)并且连接体的N¹和N²都通过氨基甲酸酯键共价连接活化的PEG部分时，本发明的新肽化合物可以如下表示：

当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)并且连接体的N¹和N²都通过酰胺键共价连接活化的PEG部分时，本发明的新肽化合物可以如下表示：

本发明优选的肽二聚体包括但不限于：

该二聚体结构可以写作[Ac-肽，二硫键]₂Lys-间隔臂-PEG_20-40K来表示N-末端乙酰化肽结合赖氨酸的α和ε氨基，每个肽含有分子内二硫键环并且间隔臂分子在赖氨酸的C末端和PEG部分之间形成共价键，其中PEG具有约20,000到约40,000道尔顿的分子量。

本发明优选的肽二聚体包括，但不限于：

20种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸，如a，a-双取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸也可以是本发明化合物的适宜组分。非常规氨基酸的实例包括，但不限于：β-丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-羟基脯氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-甲基甘氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、正亮氨酸，和其他相似的氨基酸和亚氨基酸。其他修饰也是适宜的，包括氨基末端的修饰、羧基末端修饰、一个或多个天然发生的遗传编码的氨基酸用非常规氨基酸替换、一个或多个氨基酸残基的侧链的修饰、肽磷酸化等等。

本发明的肽序列可以单独存在或者与肽链的N-末端和/或C-末端延伸结合存在。此类延伸可以是天然编码的肽序列，其任选具有或者基本上没有非天然发生的序列；所述延伸可以包括任意加入、缺失、点突变，或者本领域技术人员希望的其他序列修饰或组合。例如并且不作为限制，天然发生的序列可以是全长或者部分长度并且可以包括氨基酸替换以提供位点用于通过侧链缀合连接糖、PEG、其他聚合物等等。在变通方案中，氨基酸替换导致序列的人源化，使得所述序列与人免疫系统相容。提供了所有类型的融合蛋白质，包括与有或者没有非免疫球蛋白间隔臂序列的本发明的EPO-R活化序列相邻或者接近的免疫球蛋白序列。一种实施方案是免疫球蛋白链，其具有代替重链和/或轻链的可变(V)区的EPO-R活化序列。

制备本发明的肽化合物：

肽合成

通过本领域已知的经典方法可以制备本发明的肽。这些标准方法包括完全固相合成、部分固相合成方法、片段缩合、经典溶液合成、和重组DNA技术[见，例如，Merrifield J.Am.Chem.Soc.1963 85：2149]。

在一个实施方案中，分别合成肽二聚体的肽单体并合成后二聚化。

在另一实施方案中，二聚体的肽单体经由它们的C-末端通过分枝的叔酰胺连接体L_K部分连接，所述L_K部分具有能够作为肽合成的起始位点的两个官能团和能够结合另一分子部分(例如，可以存在于固相支持体的表面上)的第三个官能团(例如，羧基或者氨基)。在该情况中，可以以固相合成技术的变通方案直接在连接体L_K部分的两个活性氮基团上合成两个肽单体。此类合成可以是顺序的或者同时的。

在另一实施方案中，可以以固相合成技术的变通方案直接在连接体L_K部分的两个活性氮基团上合成两个肽单体。此类合成可以是顺序的或者同时的。在该实施方案中，使用赖氨酸连接体(L_K)部分，其具有作为肽合成起始位点的两个氨基和使得能够结合另一分子部分(例如，可以存在于固相支持体的表面上)的第三个官能团(例如，赖氨酸的羧基；或者赖氨酸酰胺的氨基，赖氨酸酰胺是其中羧基已经被转化成酰胺部分-CONH₂的赖氨酸残基)。

当进行将二聚体的肽链顺序合成到连接体上时，用两个不同的可以独立(orthogonally)除去的胺保护基保护连接体分子上的两个胺官能团。受保护的连接体通过该连接体的第三个官能团偶联固相支持体。除去第一个胺保护基，并在第一个去保护的胺部分上合成二聚体的第一个肽。然后除去第二个胺保护基，并在第二个去保护的胺部分上合成二聚体的第二个肽。例如，可以用Alloc保护连接体的第一个氨基部分，用Fmoc保护第二个氨基部分。在该情况下，可以用弱碱[例如，二甲基甲酰胺[DMF]中的20％哌啶]处理除去Fmoc基(但不是Alloc基)，并合成第一条肽链。之后，可以用适宜的试剂[例如，Pd(PPh₃)/4-甲基吗啉和氯仿]除去Alloc基，并合成第二条肽链。注意到将对半胱氨酸使用不同的硫羟保护基以控制二硫键形成(如下文讨论)，甚至当二聚体的肽链的最后氨基酸序列相同时也必须使用该技术。

当将二聚体的肽链同时合成到连接体上时，可以用相同的可除去的胺保护基保护连接体分子的两个胺官能团。通过连接体的第三个官能团将受保护的连接体偶联到固相支持体。在该情况中，连接体分子的两个受保护的官能团同时去保护，并在去保护的胺上同时合成两条肽链。注意到使用该技术，二聚体的肽链的序列将相同，并且半胱氨酸残基的硫羟保护基都是相同的。

肽合成的优选方法是固相合成。固相肽合成方法是本领域公知的[见，例如，Stewart Solid Phase Peptide Syntheses(Freeman和同事：SanFrancisco)1969；Novabiochem Corp，San Diego，USA的2002/2003通用目录；Goodman Synthesis of Peptides and Peptidomimetics(Houben-Weyl，Stuttgart)2002]。在固相合成中，通常使用α-氨基受保护的树脂从肽的C-末端开始合成。例如，通过将所需的α-氨基酸连接到氯甲基化树脂、羟基甲基树脂、聚苯乙烯树脂、二苯甲基胺树脂等等可以制备适宜的起始材料。一种此类氯甲基化树脂由Bio Rad Laboratories(Richmond，CA)以商标名BIO-BEADS SX-1出售。已经描述了羟基甲基树脂的制备[Bodonszky，等人(1966)Chem.Ind.London 38：1597]。已经描述了二苯甲基胺(BHA)树脂，并且可以从Beckman Instruments，Inc.(Palo Alto，CA)通过商业途径获得所述树脂的氯化氢形式。例如，通过利用碳酸氢铯催化剂，根据Gisin(1973)Helv.Chim.Acta 56：1467的方法可以将α-氨基受保护的氨基酸偶联到氯甲基化树脂。

最初偶联后，例如，使用三氟乙酸(TFA)或者氢氯酸(HCl)在有机溶剂中的溶液在室温下除去α-氨基保护基。之后，将α-氨基受保护的氨基酸连续偶联到增长的支持体结合的肽链。α-氨基保护基是肽的逐步合成领域中公知的那些，包括：酰基型保护基(例如，甲酰基、三氟乙酰基、乙酰基)、芳香尿烷型保护基[例如，苄氧基羰基(Cbz)和取代的Cbz]、脂肪族尿烷保护基[例如，叔丁氧基羰基(Boc)、异丙氧基羰基、环己基氧基羰基]，和烷基型保护基(例如，苄基、三苯基甲基)、芴基甲氧基羰基(Fmoc)、烯丙氧基羰基(Alloc)和1-(4，4-二甲基-2，6-二噁环己-1-叉基)乙基(Dde)。

侧链保护基(通常醚、酯、三苯甲基、PMC等等)在偶联期间保持完整并且在氨基末端保护基的去保护期间或者偶联期间不分裂。该侧链保护基必须在最终肽的合成完成时和在将不改变靶肽的反应条件下是可以除去的。Tyr的侧链保护基包括四氢吡喃基、叔丁基、三苯甲基、苄基、Cbz、Z-Br-Cbz、和2，5-二氯苄基。Asp的侧链保护基包括苄基、2，6-二氯苄基、甲基、乙基和环己基。Thr和Ser的侧链保护基包括乙酰基、苯甲酰基、三苯甲基、四氢吡喃基、苄基、2，6-二氯苄基和Cbz。Arg的侧链保护基包括硝基、甲苯磺酰基(Tos)、Cbz、金刚烷氧基羰酰磺酰基(Mts)、2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰基(Mtr)、或者Boc。Lys的侧链保护基包括Cbz、2-氯苄氧基羰基(2-Cl-Cbz)、2-溴代苄氧基羰基(2-Br-Cbz)、Tos或者Boc。

除去α-氨基保护基后，以所希望的顺序逐步偶联剩余的受保护氨基酸。每种受保护的氨基酸通常以约3倍过量进行反应，使用适宜的羰基激活剂，如2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3四甲基尿鎓六氟磷酸盐(HBTU)或者二环己基碳二亚胺(DCC)的溶液，例如，在二氯甲烷(CH₂Cl₂)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基甲酰胺(DMF)或者它们的混合物中的溶液。

完成所希望的氨基酸序列后，通过用不仅从树脂切割肽而且切割所有剩余的侧链保护基的试剂，如三氟乙酸(TFA)或者氟化氢(HF)处理从树脂支持体解偶联所希望的肽。当使用氯甲基化树脂时，氟化氢处理导致形成游离肽酸。当使用二苯甲基胺树脂时，氟化氢处理直接导致游离肽酰胺。备选地，当使用氟甲基化树脂时，通过用氨处理肽树脂可以解偶联侧链受保护的肽得到所希望的侧链受保护的酰胺，或者用烷基胺处理得到侧链受保护的烷基酰胺或者二烷基酰胺。然后以常用的方式通过用氟化氢处理除去侧链保护，得到游离酰胺、烷基酰胺或者二烷基酰胺。

在本发明酯的制备中，使用用于制备肽酸的树脂，并用碱和适宜的醇(例如，甲醇)切割侧链受保护的肽。然后以常用的方式通过用氟化氢处理除去侧链保护基，得到所希望的酯。

这些方法也可以用于合成这样的肽，在所述肽中，在本发明化合物的任一种的一个、两个或多个位置上用20种天然发生的遗传编码的氨基酸之外的氨基酸替换。可以替换到本发明肽的合成氨基酸包括，但不限于，N-甲基、L-羟基丙基、L-3，4-二羟基苯丙氨酰基、δ氨基酸，如L-δ-甲基赖氨酰基和D-δ-甲基丙氨酰基、L-α-甲基丙氨酰基，β氨基酸和异喹啉基。D-氨基酸和非天然发生的合成氨基酸也可以掺入到本发明的肽中。

肽修饰

还可以修饰本发明的肽化合物的氨基和/或羧基末端以产生本发明的其他化合物。例如，可以将氨基末端用乙酸或者其卤化衍生物(如α-氯乙酸、α-溴乙酸、或α-碘乙酸)乙酰化。

可以用其他侧链替换20种遗传编码的氨基酸(或者立体异构D氨基酸)的天然发生的侧链，所述其他侧链为例如烷基、低级烷基、环状4-、5-、6-到7-元烷基、酰胺、酰胺低级烷基、酰胺二(低级烷基)、低级烷氧基、羟基、羧基和其低级酯衍生物，和4-、5-、6-到7-元杂环。具体地，可以使用脯氨酸类似物，其中脯氨酸残基的环大小从5元变成4、6或7元。环状基团可以是饱和或不饱和的，如果是不饱和的，则可以是芳香族或非芳香族的。杂环基团优选含有一个或多个氮、氧和/或硫杂原子。此类基团的实例包括呋咱基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、异噻唑基、异噁唑基、吗啉基(例如，吗啉代)、噁唑基、哌嗪基(例如，1-哌嗪基)、哌啶基(例如，1-哌啶基、哌啶子基)、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基(例如，1-吡咯烷基)、吡咯啉基、吡咯基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、硫代吗啉基(例如，硫代吗啉代)，和三唑基。这些杂环基团可以是取代或未取代的。当基团被取代时，取代基可以是烷基、烷氧基、卤素、氧，或者取代或未取代的苯基。

可以通过磷酸化和其他方法(例如，如Hruby，等人(1990)BiochemJ.268：249-262中描述]修饰肽部分。

本发明的肽化合物还可以作为具有相似生物活性的非肽化合物的结构模型。本领域技术人员认识到可以用多种技术构建具有与前导肽化合物相同或相似的所希望的生物活性的化合物，但是它们在溶解性、稳定性和对水解和蛋白水解方面比前导肽化合物具有更有利的活性[见，Morgan和Gainor(1989)Ann.Rep.Med.Chem.24：243-252]。这些技术包括用由膦酸酯、酰胺化物、氨基甲酸酯、磺酰胺、仲胺和N-甲基氨基酸组成的主链替换肽主链。

二硫键的形成

本发明的化合物含有两个分子内二硫键。通过氧化每个肽单体的半胱氨酸残基可以形成这些二硫键。

在一个实施方案中，通过选择类型和浓度有效优化所希望的异构体形成的氧化剂进行半胱氨酸键形成的控制。例如，当氧化剂是DMSO或者碘(I₂)时，优先实现肽二聚体的氧化以形成两个分子内二硫键(每条肽链上一个二硫键)(比分子间二硫键形成优先)。

在其他实施方案中，通过在肽合成期间选择性使用硫羟-保护基控制半胱氨酸键的形成。例如，当希望具有两个分子内二硫键的二聚体时，合成第一条单体肽，其中核心序列的两个半胱氨酸残基用第一种硫羟保护基[例如，三苯甲基(Trt)、烯丙氧基羰基(Alloc)，和1-(4，4-二甲基-2，6-二噁环己-1-叉基)乙基(Dde)等等]保护，然后合成第二条单体肽，其中核心序列的两个半胱氨酸残基用不同于第一种硫羟保护基的第二种硫羟保护基[例如，乙酰氨基甲基(Acm)、叔丁基(tBu)等等]保护。之后，除去影响第一种单体的二硫键环化的第一种硫羟保护基，然后除去影响第二种单体的二硫键环化的第二种硫羟保护基。

本发明的其他实施方案提供了这些二硫键衍生物的类似物，其中一个硫已经通过CH₂基或者硫的其他isotere替换。可以从本发明的化合物制备这些类似物，其中每个肽单体含有至少一个C或者高半胱氨酸残基和α-氨基-γ-丁酸代替第二个C残基，所述代替是通过分子内或者分子间替换，使用本领域已知的方法[见，例如，Barker，等人(1992)J.Med.Chem.35：2040-2048和Or，等人(1991)J.Org.Chem.56：3146-3149]。本领域技术人员将容易明白使用α-氨基-γ-丁酸和高半胱氨酸的其他同系物也可以进行代替。

除了前面的环化策略，还可以使用其他非二硫键肽环化策略。此类备选环化策略包括例如，酰胺环化策略以及包括形成硫醚键的策略。从而，本发明的化合物可以以具有分子内酰胺键或者分子内硫醚键的环化形式存在。例如，可以合成这样的肽，其中用赖氨酸代替核心序列的一个半胱氨酸，用谷氨酸代替另一个半胱氨酸。之后，通过这两个残基的侧链间的酰胺键可以形成环状单体。备选地，可以合成这样的肽，其中用赖氨酸(或丝氨酸)代替核心序列的一个半胱氨酸。然后可以通过赖氨酸(或丝氨酸)残基的侧链和核心序列的第二个半胱氨酸残基之间的硫醚键形成环状单体。同样地，除了二硫键环化策略，可以容易地使用酰胺环化策略和硫醚环化策略环化本发明的化合物。备选地，可以用α-取代的乙酸帽化肽的氨基末端，其中α取代基为离去基团，如α-卤乙酸，例如，α-氯乙酸、α-溴乙酸或者α-碘乙酸。

加入分枝的叔酰胺连接体

通过分枝的叔酰胺连接体部分可以二聚化肽单体。在一个实施方案中，在肽合成期间向肽中掺入连接体。例如，当连接体L_K部分含有能够作为肽合成起始位点的两个官能团和使得能够结合一个或多个其他分子部分的一个或多个官能团(例如，羧基或者氨基)时，可以将连接体缀合到固相支持体。之后，以固相合成技术的变通方案，可以将两个肽单体直接合成到连接体L_K部分的两个活性氮基团上。

在备选实施方案中，肽合成后可以将连接体缀合到肽二聚体的两个肽单体。通过本领域成熟的方法可以实现此类缀合。在一个实施方案中，连接体含有适于连接到合成的肽单体的靶官能团的两个官能团。例如，预活化的或者在适宜偶联试剂存在下的含有两个羧基的连接体可以与两个肽单体的每一个的靶赖氨酸侧链胺基反应。

例如，肽单体可以化学偶联到叔酰胺连接体：

A^＊-C¹O-CH₂-X-CH₂-C²O-B^＊

其中：X为NCO-(CH₂)₂-NH-Y，Y为适宜的保护基，如叔丁氧基羰基(Boc)保护基；A^＊为用于将连接体的C¹缀合到第一个肽单体的C-末端赖氨酸残基的ε氨基的适宜的官能团，如N-氧基琥珀酰亚胺；B^＊为用于将连接体的C²缀合到第二个肽单体的C-末端赖氨酸残基的ε氨基的适宜的官能团，如N-氧基琥珀酰亚胺。

此外，例如，肽单体可以化学偶联到叔酰胺连接体：

A^＊-C¹O-CH₂-X-CH₂-C²O-B^＊

其中：X为NCO-(CH₂)₂-NH-C³O；A^＊为用于将连接体的C¹缀合到第一个肽单体的C-末端赖氨酸残基的ε氨基的适宜的官能团，如N-氧基琥珀酰亚胺；B^＊为用于将连接体的C²缀合到第二个肽单体的C-末端赖氨酸残基的ε氨基的适宜的官能团，如N-氧基琥珀酰亚胺；叔酰胺连接体化学键合间隔臂部分：

Y-NH-(CH₂)₄-C⁴H-NH-Y

其中：X的C³共价结合间隔臂的C⁴；Y是适宜的保护基，如叔丁氧基羰基(Boc)保护基。

加入赖氨酸连接体

通过赖氨酸连接体L_K部分可以二聚化肽单体。在一个实施方案中，在肽合成期间向肽中掺入赖氨酸连接体。例如，当赖氨酸连接体L_K部分含有能够作为肽合成起始位点的两个官能团和使得能够结合另一分子部分的第三个官能团(例如，羧基或者氨基)时，可以将连接体缀合到固相支持体。之后，以固相合成技术的变通方案，可以将两个肽单体直接合成到赖氨酸连接体L_K部分的两个活性氮基团上。

在备选实施方案中，当通过赖氨酸连接体L_K部分二聚化肽二聚体时，可以在肽合成后将所述连接体缀合到两个肽单体。可以用本领域成熟的方法实施所述缀合。在一个实施方案中，连接体含有适于连接所合成的肽单体的靶官能团的至少两个官能团。例如，赖氨酸的两个游离胺基可以与两个肽单体之一的C-末端羧基反应。

加入间隔臂

本发明的肽化合物还包含间隔臂部分。在一个实施方案中，可以在肽合成期间向肽中掺入间隔臂。例如，当间隔臂含有游离氨基和使得能够结合另一分子部分的第二个官能团(例如，羧基或氨基)时，可以将间隔臂缀合到固相支持体。

在一个实施方案中，含有两个官能团的间隔臂首先通过第一个官能团偶联固相支持体。接着，具有能够作为肽合成的起始位点的两个官能团和能够结合另一分子部分的第三个官能团(例如，羧基或氨基)的赖氨酸连接体L_K部分通过间隔臂的第二个官能团和连接体的第三个官能团缀合到间隔臂。之后，以固相合成技术的变通方案，可以将两个肽单体直接合成到连接体L_K部分的两个活性氮基团上。例如，具有游离胺基的固相支持体偶联的间隔臂可以通过连接体的游离羧基与赖氨酸连接体反应。

在备选实施方案中，可以在肽合成后将间隔臂缀合到肽二聚体。可以用本领域成熟的方法实施所述缀合。在一个实施方案中，连接体含有适于连接所合成的肽的靶官能团的至少两个官能团。例如，具有游离胺基的间隔臂可以与肽的C-末端羧基反应。在另一实施方案中，具有游离羧基的连接体可以与赖氨酸酰胺的游离胺基反应。

连接聚乙二醇(PEG)

近年来，水溶性聚合物，如聚乙二醇(PEG)，已经用于具有治疗和诊断重要性的肽的共价修饰。认为此类聚合物的连接增强生物活性、延长血液循环时间、降低免疫原性、增加水溶性，和增强对蛋白酶消化的抗性。例如，已经报导PEG对治疗性多肽如白介素[Knauf，等人(1988)J.Biol.Chem.263；15064；Tsutsumi，等人(1995)J.Controlled Release 33：447)、干扰素(Kita，等人(1990)Drug Des.Delivery 6：157)、过氧化氢酶(Abuchowski，等人(1977)J.Biol.Chem.252：582)、超氧化物歧化酶(Beauchamp，等人(1983)Anal.Biochem.131：25)和腺苷脱氨酶(Chen，等人(1981)Biochim.Biophy.Acta 660：293)的共价连接延长了它们的体内半寿期和/或降低了它们的免疫原性和抗原性。

本发明的肽化合物可以包含聚乙二醇(PEG)部分，其通过氨基甲酸酯键或者酰胺键共价连接到分枝的叔酰胺连接体或者肽二聚体的间隔臂。用于本发明的PEG的一个实例是分子量为约20千道尔顿(20K)到约40K的线性、不分枝的PEG(术语“约”指出在PEG的制备物中，某些分子将具有大于所陈述的分子量，有些分子具有小于所陈述的分子量)。优选地，PEG具有约30K到约40K的分子量。

用于本发明的PEG的另一实例是分子量约10K到约60K的线性PEG(术语“约”指出在PEG的制备物中，某些分子将具有大于所陈述的分子量，有些分子具有小于所陈述的分子量)。优选地，PEG具有约20K到约40K的分子量。更优选地，PEG具有约20K的分子量。

下面描述用于共价连接PEG(PEG化)的方法的实例。这些阐明性描述不意在限制。本领域技术人员将明白多种PEG的共价连接的多种方法是本领域成熟的。同样，本发明包括通过本领域已知的多种连接方法的任一种连接PEG的肽化合物。

例如，PEG可以通过反应基共价结合连接体，活化的PEG分子可以结合该反应基(例如，游离氨基或羧基)。使用具有不同反应部分的甲氧基化PEG(“mPEG”)可以将PEG分子连接到氨基。此类聚合物包括mPEG-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、mPEG-琥珀酰亚胺基碳酸酯、mPEG-imidate、mPEG-4-硝基苯基碳酸酯、和mPEG-氰尿酰氯。类似地，使用具有游离胺基的甲氧基化PEG(mPEG-NH2)可以将PEG分子连接到羧基。

在一些实施方案中，连接体或者间隔臂含有末端氨基(即，位于间隔臂的末端)。该末端氨基可以与适宜活化的PEG分子，如mPEG-对-硝基苯基碳酸酯(mPEG-NPC)反应，得到稳定的共价氨基甲酸酯键。备选地，该末端氨基可以与适宜活化的PEG分子(如含有活性N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)基的mPEG-琥珀酰亚胺基丁酸酯(mPEG-SBA)或mPEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG-SPA))反应，得到稳定的共价氨基甲酸酯键。在其他实施方案中，连接体反应基含有在适宜反应条件下能够活化而与含有胺的PEG分子形成共价键的羧基。适宜的PEG分子包括PEG-NH₂，并且适宜的反应条件包括碳二亚胺介导的酰胺形成等等。

EPO-R激动剂活性测定：

体外功能测定

体外竞争结合测定法定量受试肽与EPO竞争结合EPO-R的能力。例如(见，例如，美国专利5,773,569中描述)，人EPO-R的细胞外结构域(EPO结合蛋白质，EBP)可以在大肠杆菌(E.coli)申重组产生，并将重组蛋白质偶联到固相支持体，如微量滴定皿或者合成珠[例如，Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)的Sulfolink珠]。然后将固定化EBP与经标记的重组EPO或者经标记的重组EPO和受试肽反应。受试肽的连续稀释液用于此类实验。没有加入受试肽的测定点定义了EPO对EBP的总的结合。对于含有受试肽的反应物，结合的EPO的量经定量并表达为对照(总的＝100％)结合的百分数。这些值对肽浓度作图。IC₅₀值定义为EPO对EBP的结合减小50％的受试肽的浓度(即，EPO结合的50％抑制)。

一种不同的体外竞争结合测定法测量产生的光信号作为两种珠子：缀合EPO的珠子和缀合EPO-R的珠子的接近性的函数。通过EPO与EPO-R的结合产生珠子接近性。与EPO竞争结合EPO-R的受试肽将防止该结合，导致光发射的降低。导致光发射降低50％的受试肽的浓度定义为IC₅₀值。

本发明的肽非常有效地与EPO竞争结合EPO-R。该增强的功能由它们在很低的肽浓度下抑制EPO结合的能力代表(即，它们具有非常低的IC₅₀值)。

可以使用体外基于细胞的功能测定法测量特异结合EPO受体的本发明的单体和二聚肽EPO-R激动剂的生物活性和效力。

一种测定法基于表达人EPO-R并且还用fos-启动子驱动的萤光素酶报道基因构建体转染的鼠前-B-细胞系。当暴露于EPO或者另一种EPO-R激动剂时，此类细胞通过合成萤光素酶应答。萤光素酶导致加入其底物萤光素时发光。从而，通过测量萤光素酶活性可以定量此类细胞中EPO-R活化的水平。通过向细胞加入受试肽的连续稀释液，然后孵育细胞4小时来测量受试肽的活性。孵育后，向细胞加入萤光素底物，并测量光发射。导致半最大光发射的受试肽浓度记录为EC50。

在该测定中，本发明的肽显示出促进EPO-R信号依赖性萤光素酶表达的显著增强的能力。该增强的功能由它们在非常低的肽浓度下产生半最大萤光素酶活性来代表(即，它们具有非常低的EC50值)。该测定法是估计本发明的EPO-R激动剂肽的效力和活性的优选方法。

可以使用FDC-P1/ER细胞[Dexter，等人(1980)J.Exp.Med.152：1036-1047]进行另一种测定法，FDC-P1/ER细胞是良好表征的非转化的鼠骨髓来源的细胞系，其已经用EPO-R稳定转染。这些细胞表现出EPO-依赖性增殖。

在一种此类测定法中，在必须生长因子(见，例如，美国专利5,773,569中描述)的存在下，细胞生长到半稳定密度。然后在PBS中洗涤细胞并在没有生长因子的完全培养基中饥饿16-24小时。测定细胞的生存力后(通过锥虫蓝染色)，制备贮存液(用没有生长因子的完全培养基)得到约10⁵个细胞/50μL。在96孔组织培养板中以每孔50μL的终体积测试肽EPO-R激动剂化合物的连续稀释液(通常为游离的溶液相肽，与结合噬菌体或者其他结合或固定化的肽相反)。向每孔加入细胞(50μL)并孵育细胞24-48小时，此时阴性对照将死亡或者休眠。通过本领域已知的技术(如测量指示细胞增殖的H³胸苷掺入的MTT测定法)测量细胞增殖[见Mosmann(1983)J.Immunol.Methods 65：55-63]。对表达EPO-R的细胞系和亲代不表达的细胞系评估肽。产生最大细胞增殖一半所需的受试肽的浓度记录为EC50。

在该测定中，本发明的肽显示出促进EPO-依赖性细胞增殖的显著增强的能力。该增强的功能由它们在非常低的肽浓度下产生半最大细胞增殖刺激活性来代表(即，它们具有非常低的EC50值)。该测定法是估计本发明的EPO-R激动剂肽的效力和活性的优选方法。

在另一测定中，在补加EPO的培养基中使细胞生长到稳定期，收集细胞，然后在没有EPO的培养基中再培养18小时。将细胞分成相等细胞密度的三组：没有加入因子的一组(阴性对照)，具有EPO的一组(阳性对照)，具有受试肽的实验组。然后在多个时间点收集培养的细胞，将其固定、并用结合DNA的荧光染料(例如，碘化丙锭或者Hoechst染料，都可以从Sigma得到)染色。然后例如使用FACS Scan Flow细胞仪测量荧光。然后例如，使用CelIFIT软件(BectonDickinson)的SOBR型可以测定细胞周期的每个期中的细胞百分数。用EPO或者活性肽处理的细胞将相对于阴性对照组显示出在S期中的更大比例的细胞(通过指示增加的DNA含量的增加的荧光来测定)。

使用FDCP-1[见，例如，Dexter等人(1980)J.Exp.Med.152：1036-1047]或TF-1[Kitamura，等人(1989)Blood 73：375-380]细胞系进行类似测定。FDCP-1是生长因子依赖性鼠多能原始造血祖细胞系，当补加WEHI-3条件培养基(含有IL-3的培养基，ATCC号TIB-68)时，所述细胞系可以增殖，但是不分化。对于此类实验，用人或者鼠EPO-R转染FDCP-1细胞系以分别产生FDCP-1-hEPO-R或FDCP-1-mEPO-R细胞系，在EPO的存在下所述细胞系可以增殖但是不能分化。还可以使用一种依赖EPO的细胞系TF-1测量肽EPO-R激动剂对细胞增殖的影响。

在再一个测定法中，在Krystal(1983)Exp.Hematol 11：649-660中提出的基于H³-胸苷向脾细胞掺入的微测定法的方法可以用于确定本发明化合物作为EPO激动剂的能力。简言之，对B6C3F₁小鼠每天用苯肼(60mg/kg)注射，为期两天。在第三天，除去脾细胞并使用MTT测定法确定所述细胞在24小时内增殖的能力。

在红细胞生成素应答细胞系中EPO对EPO-R的结合诱导受体和多种细胞内蛋白质(包括Shc、vav和JAK2激酶)的酪氨酸磷酸化。因此，另一种体外测定法测量本发明的肽诱导EPO-R和下游细胞内信号转导蛋白的酪氨酸磷酸化。如通过上述结合和增殖测定法鉴定的活性肽在红细胞生成素应答细胞中引起与EPO近乎相同的磷酸化模式。对于该测定法，FDC-P1/ER细胞[Dexter，等人(1980)J Exp Med 152：1036-47]在补加EPO的培养基中保持并生长到稳定期。然后在没有EPO的培养基中培养这些细胞24小时。然后将确定数目的这些细胞与受试肽在37℃孵育约10分钟。还用每种测定法运行细胞的对照样品与EPO。通过离心收集处理的细胞，将它们重悬浮在SDS裂解缓冲液中，并进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。将凝胶上的电泳蛋白质转移到硝酸纤维素，并通过标准免疫学技术显现印迹上的含有磷酸酪氨酸的蛋白质。例如，可以用抗磷酸酪氨酸抗体(例如，Upstate Biotechnology，Inc.的小鼠抗磷酸酪氨酸IgG)探测印迹，洗涤，然后用二级抗体[例如，Kirkegaard & Perry Laboratories，Inc.(Washington，DC)的过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG]探测。之后，可以通过标准技术显现含有磷酸酪氨酸的蛋白质，所述标准技术包括比色、化学发光或者荧光测定法。例如，用来自Amersham的ECLWestern Blotting System可以进行化学发光测定。

可以用于评估本发明肽的活性的另一种基于细胞的体外测定法是菌落测定法，使用鼠骨髓或者人外周血细胞。可以从小鼠的股骨得到鼠骨髓，可以从健康供体得到人外周血样品。对于外周血，首先从血液分离单核细胞，例如，通过离心通过Ficoll-Hypaque梯度[Stem Cell Technologies，Inc.(Vancouver，Canada)]进行分离。对于该测定，进行有核细胞计数以建立最初样品中有核细胞的数目和浓度。按照生产商的使用说明[Stem CellTechnologies，Inc.(Vancouver，Canada)]将确定数目的细胞铺在甲基纤维素上。用受试肽处理实验组，用EPO处理阳性对照组，不处理阴性对照组。在确定的孵育期(通常10天到18天)后对每组生长的集落数打分。活性肽将促进集落形成。

可以用于阐明本发明化合物的活性的其他体外生物测定法公开于Greenberger，等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2931-2935(EPO-依赖性造血祖细胞细胞系)；Quelle和Wojchowsld(1991)J.Biol.Chem.266：609-614(B6SUt.EP细胞中的蛋白质酪氨酸磷酸化)；Dusanter-Fourt，等人(1992)J.Biol.Chem.287：10670-10678(人EPO应答细胞中EPO受体的酪氨酸磷酸化)；Quelle，等人(1992)J.Biol.Chem.267：17055-17060(FDC-ER细胞中胞质溶胶蛋白质pp100的酪氨酸磷酸化)；Worthington，等人(1987)Exp.Hematol.15：85-92(血红蛋白的比色测定)；Kaiho和Miuno(1985)Anal.Biochem.149：117-120(用2，7-二氨基芴检测血红蛋白)；Patel，等人(1992)J.Biol.Chem.267：21300-21302(c-myb的表达)；Witthuhn，等人(1993)Ceu 74：227-236(JAK2的结合和酪氨酸磷酸化)；Leonard，等人(1993)Blood 82：1071-1079(GATA转录因子的表达)；和Ando，等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：9571-9575(通过环D2和D3对G₁过渡的调节)。

已经报导Molecular Devices Corp.设计的称作microphysiometer的仪器成功地用于测量激动剂和拮抗剂对多种受体的影响。该仪器的基础是测量应答受体活化中细胞外基质的酸化速率。

体内功能测定法

可以用于评估受试肽的效力的一种体内功能测定法是polycythemicexhypoxic小鼠生物测定法。对于该测定法，将小鼠置于交替的调节循环数天。在该循环中，大鼠在低压条件和环境压力条件期间交替。之后，在施用受试样品前将小鼠在环境压力下保持2-3天。将受试肽样品，或者对于阳性对照小鼠，将EPO标准皮下注射到受调节的小鼠中。2天后施用放射标记的铁(例如，Fe⁵⁹)，施用放射标记的铁两天后采集血样。然后通过标准技术对每个血样测定血细胞比容和放射性测量。用活性受试肽注射的小鼠的血样将显示出比未接受受试肽或者EPO的小鼠的血样更大的放射性(由于红细胞血红蛋白对Fe⁵⁹的结合)。

可以用于评估受试肽的效力的另一种体内功能测定法是网织红细胞测定法。对于该测定法，用EPO或者受试肽在三个连续日皮下注射正常的未处理的小鼠。在第三天，还用葡聚糖铁腹膜内注射小鼠。在第5天，从小鼠收集血样。通过噻唑橙染色和流式细胞仪分析(reticcount程序)测定血液中网织红细胞的百分数(％)。此外，手工测定血细胞比容。用下面的公式确定校正的网织红细胞的百分数：

％RETIC_校正的＝％RETIC_观察值×(血细胞比容_个体/血细胞比容_正常)

活性受试化合物将显示出相对于未接受受试肽或者EPO的小鼠增加的％RETIC_校正的水平。

本发明的EPO-R激动剂肽的用途

本发明的肽化合物可以体外用作理解EPO的生物功能的工具，包括评估认为影响或者受到EPO的产生和EPO对EPO-R的结合的许多因素(例如，EPO/EPO-R信号转导/受体激活的机制)。本发明的肽还可以用于开发结合EPO-R的其他化合物，因为本发明化合物提供了重要的结构-活性关系信息，其有助于开发。

此外，基于它们结合EPO-R的能力，本发明的肽可以用作检测活细胞、固定细胞上、生物液体、组织匀浆物、纯化的天然生物材料等等中EPO-R的试剂。例如，通过标记此类肽，可以鉴定在表面上具有EPO-R的细胞。此外，基于它们结合EPO-R的能力，本发明的肽可以用于原位染色、FACS(荧光激活细胞分类术)分析、蛋白质印迹、ELISA(酶联免疫吸附测定)，等等。此外，基于它们结合EPO-R的能力，本发明的肽可以用于受体纯化，或者纯化在细胞表面上(或者在可渗透的细胞内)表达EPO-R的细胞。

本发明的肽还可以用作多种医学研究和诊断目的的商业试剂。此类用途可以包括但不限于：(1)用作定量多种功能测定法中候选EPO-R激动剂活性的校准标准；(2)用作随机肽筛选，即寻找EPO-R肽配体的新家族中的阻断试剂，所述肽可以用于阻断本发明的EPO肽的回收；(3)用于与EPO-R的共结晶，即，可以形成结合EPO-R的本发明肽的晶体，使得可以通过X-射线晶体学测定受体/肽的结构；(4)用于测量红细胞前体细胞诱导珠蛋白合成和血红素复合体合成的能力，和通过启动分化增加铁蛋白受体数；(5)用于保持依赖EPO的细胞系(如FDCP-1-mEPO-R和TF-1细胞系)的增殖和生长；(6)与用放射性生色团标记本发明的肽相关的用途；和(7)其他研究和诊断应用，其中优选激活EPO-R或者对已知量的EPO-R激动剂方便地校准此类激活，等等。

在本发明的再一方面，提供了治疗方法和药物生产方法。可以将本发明的肽化合物施用于温血动物，包括人，以刺激在体内EPO与EPO-R的结合。从而，本发明包括与EPO缺乏相关的疾病的治疗性治疗方法，所述方法包括以足够刺激EPO-R的量施用本发明的肽化合物，从而减轻与体内EPO缺乏相关的症状。例如，本发明的肽可以用于治疗肾机能不全和/或末期肾衰竭/透析；与艾滋病相关的贫血；与慢性炎性疾病(例如，类风湿性关节炎和慢性肠炎)相关的贫血和自身免疫病；和用于手术前增加患者的红细胞数。可以通过施用本发明的肽治疗的其他疾病状态、病症和血液学不规则状态包括：β-地中海贫血；囊性纤维化；妊娠和绝经病症；早熟性早期贫血(early anemia of prematurity)；脊髓损伤；太空飞行；急性失血；衰老；中风；局部缺血(CNS和心脏)；和伴随着异常红细胞生成的多种肿瘤疾病状态。

在其他实施方案中，本发明的肽化合物可以用于治疗特征不是低或者不足的血红细胞的病症的治疗，例如，作为输液前的预处理。此外，施用本发明的化合物可以导致出血时间减少，从而将可以用于在手术前施用于患者或者其中预期发生出血的适应症。此外，本发明的化合物可以用于巨核细胞的激活。

因为已经表明EPO对血管内皮细胞具有促有丝分裂和趋化效果以及对中枢胆碱能神经元具有效果[见，例如，Amagnostou，等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：5978-5982和Konishi，等人(1993)Brain Res.609：29-35]，所以本发明的化合物将可以用于治疗多种血管病症，如：促进伤口愈合；促进侧枝冠状血管(如心肌梗死后可能发生的那些血管)的生长；创伤治疗；和血管移植后的治疗。本发明的化合物还可以用于多种神经学病症的治疗，所述病症通常的特征是绝对低水平乙酰胆碱或者与其他神经活性物质，例如，神经递质相比，相对低水平的乙酰胆碱。

药物组合物

在本发明的再一方面，提供了上面的EPO-R拮抗剂肽化合物的药物组合物。通过施用此类组合物减轻或者调节的疾病包括上文指出的那些疾病。此类药物组合物可以通过经口、肠胃外(肌内、腹膜内、静脉内(IV)或者皮下注射)、透皮(被动地或者使用离子电渗疗法或者电穿孔)、透粘膜(鼻、阴道、直肠或者舌下)施用途径或者使用生物可侵蚀的插入物施用，并且可以配制成适宜每种施用途径的剂型。通常，本发明包括包含有效量EPO-R激动剂肽、或者衍生产物以及药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体的药物组合物。此类组合物包括多种缓冲成分(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂；添加剂，如去污剂和增溶剂(例如，Tween 20，Tween 80，聚山梨酯80)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、防腐剂(例如，Thimersol、苯甲醇)和膨胀性物质(例如，乳糖、甘露醇)；将所述物质掺入到聚合物化合物如聚乳酸、聚乙醇酸等等的颗粒制剂，或者掺入到脂质体中。还可以使用透明质酸。此类组合物可以影响本发明蛋白质和衍生物的物理状态、稳定性、体内释放速率，和体内清除速率。见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA18042)1435-1712页，将其并入本文作为参考。可以以液体形式，或者可以以干燥粉剂(例如，冻干)形式制备组合物。

经口递送

预计用于本文的是经口固体剂型，其在Remington′s PharmaceuticalSciences，第18版1990(Mack Publishing Co.Easton PA18042)第89章中一般性描述，将其并入本文作为参考。固体剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、药片或者锭剂、扁囊剂、微型药片、粉剂或者粒剂。而且，脂质体或者类蛋白质胶囊化也可以用于配制本发明组合物(例如，在美国专利号4,925,673中报导的类蛋白质微球体)。可以使用脂质体胶囊化并且可以用多种聚合物衍生脂质体(例如，美国专利号5,013,556)。用于治疗剂的可能的固体剂型的描述由Marshall，K.在G.S.Banker和C.T.Rhodes编辑的ModernPharmaceutics(1979年)的第10章中给出，将其并入本文作为参考。通常，该制剂将包括EPO-R激动剂肽(或者其化学修饰的形式)和插入物成分，其允许保护免于胃环境的破坏，并在肠中释放生物活性物质。

还预计用于本文的是经口施用的液体剂型，包括药学上可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂和糖浆剂，它们可以含有其他组分，包括惰性稀释剂；和佐剂，如湿润剂、乳化剂和混悬剂；和甜味剂、矫味剂和芳香剂。

肽可以经化学修饰从而衍生物的经口递送是有效的。通常，预计化学修饰将至少一个部分连接到组成分子自身，其中所述部分允许(a)抑制蛋白水解；和(b)从胃和肠吸收到血流中。还希望一种或几种组分的总体稳定性的增加和增加在体内的循环时间。如上文讨论，PEG化是药物使用的优选的化学修饰。可以使用的其他部分包括：丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚脯氨酸、聚-1，3-二氧戊环和聚-1，3，6-tioxocane[见，例如，Abuchowski和Davis(1981)″Soluble Polymer-Enzyme Adducts，″in Enzymes as Drugs.Hocenberg和Roberts，编著(Wiley-Interscience：New York，NY)367-383页；和Newmark，等人(1982)J.Appl.Biochem.4：185-189]。

对于经口制剂，释放部位可以是胃、小肠(十二指肠、空肠或回肠)，或者大肠。本领域技术人员可以利用这样的制剂，其将不在胃中释放，而是将在十二指肠或者肠的别处释放。优选地，该释放将避免胃环境的有害影响，可以通过保护肽(或者衍生物)或者通过远离胃环境，如在肠中释放肽(或衍生物)避免胃环境的有害影响。

为了确保完全的胃抗性，对至少pH5.0不可渗透的包衣是必需的。用作肠包衣的更常见的惰性成分的实例是乙酸-1，2，4-苯三酸纤维素(CAT)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)、丙烯酸树脂L30D、Aquateric、醋酞纤维素(CAP)、丙烯酸树脂L、丙烯酸树脂S和Shellac。这些包衣可以用作混合膜。

包衣或者包衣混合物也可以用在片剂上，这些包衣或者包衣混合物不意在保护免于胃的影响。所述包衣或者包衣混合物可以包括糖包衣，或者使得片剂更易吞咽的包衣。胶囊剂可以由用于递送干燥治疗剂(即，粉剂)的硬壳(如明胶)组成，对于液体形式，可以使用软明胶壳。扁囊剂的壳材料可以是厚淀粉或者其他可食用的纸。对于丸剂、锭剂、模制片或者片剂研制剂，可以使用湿法块化(moist massing)技术。

肽(或者衍生物)可以包括在制剂中作为颗粒大小为约1mm的粒剂或者微型药片形式的多微粒(multiparticulate)。用于胶囊施用的材料的制剂也可以是粉剂、略微压制的块(plug)，或者甚至片剂。这些治疗剂可以通过压缩制备。。

还可以包括着色剂和/或矫味剂。例如，可以(如通过脂质体或者微球体胶囊化)制备肽(或衍生物)，然后将其包含在可食用产品，如含有着色剂和矫味剂的冷藏饮料中。

可以用惰性物质稀释或者增加肽(或衍生物)的体积。这些稀释剂可以包括糖，尤其甘露醇、α-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改良葡聚糖和淀粉。某些无机盐也可以用作填充剂，它们包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。一些通过商业途径可获得的稀释剂是Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompress和Avicell。

固体剂型的治疗剂制剂中可以包含崩解剂。用作崩解剂的物质包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商用崩解剂Explotab。淀粉羟乙酸钠、Amberlite、羧甲基纤维素钠、ultramylopectin、藻酸钠、明胶、橙皮、酸性羧甲基纤维素、天然海绵和膨润土都可以使用。崩解剂还可以是不溶性阳离子交换树脂。粉状树胶也可以用作崩解剂和粘合剂并且可以包括诸如琼脂、Karaya或黄蓍胶的粉状树胶。海藻酸和其钠盐也可以用作崩解剂。

粘合剂可以用于将肽(或衍生物)活性剂保持在一起以形成硬片剂并且包括来自天然产物的材料，如阿拉伯树胶、黄蓍胶、淀粉和明胶。其他包括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)都可以用于醇溶液以粒化肽(或衍生物)。

肽(或衍生物)的制剂中可以包括抗摩擦剂以防止配制过程期间粘着。润滑剂可以用作肽(或衍生物)和模壁中间层，这些润滑剂包括但不限于：硬脂酸，包括其镁和钙盐；聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、植物油和蜡。也可以使用可溶性润滑剂，如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁、多种分子量的聚乙二醇、碳蜡4000和6000。

可以加入助流剂，其改善配制期间药物的流动性质并且帮助压制期间的重排。助流剂可以包括淀粉、滑石粉、致热性硅石和水合硅铝酸盐。

为了帮助肽(或衍生物)溶于水性环境，可以加入表面活性剂作为湿润剂。表面活性剂可以包括阴离子去污剂，如十二烷基硫酸钠、磺基琥珀酸二辛酯钠和磺酸二辛酯钠。可以使用阳离子去污剂并且其可以包括苯扎氯铵或苄索氯铵。可以包括在本发明制剂中作为表面活性剂的可能的非离子去污剂的名单为聚桂醇400、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、甘油单硬脂酸酯、聚山梨酯20、40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可以单独或者以不同比例的混合物存在于所述蛋白质或者衍生物的制剂中。

可以增强肽(或衍生物)吸收的添加剂为例如脂肪酸油酸、亚油酸和亚麻酸。

控释经口制剂也是希望的。肽(或衍生物)可以掺入到允许通过扩散或者浸取机制释放的惰性基质，如树胶中。缓慢变性基质也可以掺入到制剂中。某些肠包衣也具有缓释效果。控释的另一种形式是通过基于Oros治疗系统(Alza Corp.)的方法，即药物封装在半透性膜中，该膜允许水进入并且由于渗透作用将药物挤过一个小的开口。

其他包衣可以用于制剂。这些包衣包括可以在包衣锅中应用的多种糖。肽(或衍生物)还可以以膜包衣的片剂提供并且用于该情况的材料分成两组。第一组是非肠物质并且包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、甲基羟基-乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基-甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚维酮和聚乙二醇。第二组由通常为苯二甲酸酯的肠材料组成。

材料混合物可以用于提供最佳膜包衣。可以在锅涂布器或者在流化床或者通过压缩包衣进行膜包衣。

肠胃外递送

用于肠胃外施用的根据本发明的制剂包括无菌水性或非水性溶液剂、混悬剂或乳剂。非水性溶剂或者赋形剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油，如橄榄油和玉米油、明胶和可注射的有机酯，如油酸乙酯。此类剂型还可以含有佐剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。它们可以通过例如，通过保留细菌的滤器过滤、向组合物掺入消毒剂、通过放射处理组合物或者通过热处理组合物可以消毒。它们还可以在使用即刻前用无菌水或者某种其他无菌可注射介质产生。

直肠或阴道递送

用于直肠或阴道施用的组合物优选为栓剂，其除了活性物质还包含赋形剂，如可可脂或者栓剂蜡。用于经鼻或舌下施用的组合物也可以用本领域熟知的标准赋形剂制备。

经肺递送

本文还设想经肺递送EPO-R激动剂肽(或者其衍生物)。肽(或衍生物)被吸入式递送到哺乳动物的肺中并穿过肺上皮层进入血流[见，例如，Adjei，etal.(1990)Pharmaceutical Research 7：565-569；Adjei等人(1990)Int.J.Pharmaceutics 63：135-144(醋酸亮丙瑞林)；Braquet，等人(1989)J.Cardiovascular Pharmacology 13(sup5)：143-146(内皮素-1)；Hubbard，等人(1989)Annals of Internal Medicine，卷III，206-212页(α1-抗胰蛋白酶)；Smith，等人(1989)J.Clin.Invest.84：1145-1146(α-1-蛋白酶)；Oswein，等人(1990)″Aerosolization of Proteins″，Proceedings of Symposium onRespiratory Drug Delivery II Keystone，Colorado(重组人生长激素)；Debs，等人(1988)J.Immunol.140：3482-3488(γ干扰素和肿瘤坏死因子α)；和Platz等人的美国专利号5,284,656(粒细胞集落刺激因子)]。在Wong等人的美国专利号5,451,569中描述了经肺递送药物实现全身性效果的方法和组合物。

预计用于本发明实践中的是设计用于经肺递送治疗产品的多种机械装置，其包括但不限于喷雾器、定量吸入器和粉末吸入器，它们都是本领域技术人员熟悉的。适于本发明实践的通过商业途径可获得的装置的一些特例为Ultravent喷雾器(Mallinckrodt Inc.，St.Louis，MO)；Acorn II喷雾器(Marquest Medical Products，Englewood，CO)；Ventolin定量吸入器(GlaxoInc.，Research Triangle Park，NC)；和Spinhaler粉末吸入器(FisonsCorp.，Bedford，MA)。

所有此类装置需要使用适于肽(或衍生物)的调剂的制剂。通常，每种制剂对于所有装置的类型是特异的并且可以包括除了用于治疗的常规稀释剂、佐剂和/或载体之外还使用适宜的推进推进剂物质。而且，预计使用脂质体、微囊剂或者微球体，包括复合物，或者其他类型载体。根据所用的化学修饰类型或者装置类型，在不同制剂中还可以使用化学修饰的肽。

适于用射流或超声喷雾器使用的制剂将通常含有溶于水中的肽(或衍生物)，其浓度为每毫升溶液约0.1到25mg生物活性蛋白质。该制剂还可以包括缓冲剂和简单糖(例如，用于蛋白质稳定和渗透压的调节)。喷雾器制剂还可以含有表面活性剂，其减小或者防止形成气溶胶中溶液的雾化导致的肽(或衍生物)的聚集。

定量吸入器装置使用的制剂将通常包含细分的粉末，其含有通过表面活性剂悬浮在推进剂中的肽(或衍生物)。推进剂可以是用以该目的的任意常规物质，如含氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃或者烃，包括三氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇，和1，1，1，2-四氟乙烷或者它们的组合。适宜的表面活性剂包括三油酸山梨坦和大豆卵磷脂。油酸也可以用作表面活性剂。

用于从粉末吸入器装置调剂的制剂将含有细分的干燥粉剂，其含有肽(或衍生物)并且还可以包括膨胀剂，如乳糖、山梨醇、蔗糖或者甘露醇，它们的量将促进粉剂从装置的分散，例如，按重量计为制剂的50-90％。肽(或衍生物)应该有利地以颗粒形式制备，其平均颗粒大小小于10mm(或者微米)，最优选0.5到5mm，以最有效地递送到远端肺。

鼻递送

还预计EPO-R激动剂肽(或衍生物)的鼻递送。鼻递送允许向鼻子使用治疗产品后，肽直接进入血流，而不必使产物沉积在肺中。用于经鼻递送的制剂包括使用葡聚糖或者环葡聚糖的那些制剂。

剂量

对于所有肽化合物，随着进一步研究的进行，将出现关于治疗多种患者中多种疾病的适宜的剂量水平的信息，普通技术人员考虑接受者的治疗背景、年龄和一般健康，将能够确定适宜给药。所选剂量取决于所希望的治疗效果、施用途径和所希望的治疗持续时间。通常，每天将0.001到10mg/kg体重的剂量水平施用于哺乳动物。通常，对于静脉内注射或者灌注，剂量可以较低。给药方案可以取决于循环半寿期和所用制剂而变。

本发明的肽(或者它们的衍生物)可以与一种或多种额外的活性成分或者药物组合物结合施用。

实施例

接下来通过下面的实施例描述本发明。然而，本说明书中这些和其他实施例仅用于阐明并且绝不限制本发明或者任意例证形式的范围和意义。同样，本发明不限于本文描述的任何具体优选的实施方案。实际上，阅读本说明书时本发明的许多修改和变通方案对于本领域技术人员是显而易见的，并且可以做出所述修改和变通方案而不背离本发明的精神和范围。因此，本发明仅仅由所附权利要求的术语以及权利要求等价的完整范围所限制。

实施例1：通过固相合成合成EPO-R激动剂肽二聚体

步骤1-合成Cbz-TAP：将含有通过商业途径可获得的二胺(AldrichChemical Co.的“TAP”)(10g，67.47mmol)在无水DCM(100ml)中的溶液冷却到0℃。通过滴液漏斗在6-7小时内缓慢加入氯甲酸苄基酯(4.82ml，33.7mmol)在无水DCM(50ml)中的溶液，整个过程中保持反应混合物的温度为0℃，然后允许升温到室温(～25℃)。再过16h后，真空下除去DCM并且残渣在3N HCl和乙醚之间分配。收集水性层并用50％NaOH水溶液中和到pH8-9并用乙酸乙酯萃取。用无水Na₂SO₄干燥乙酸乙酯层，然后真空浓缩得到粗品单-Cbz-TAP(5g，约50％产率)。该化合物不经进一步纯化用于接下来的反应。

步骤2-合成Cbz-TAP-Boc：向Cbz-TAP(5g，17.7mmol)在己烷(25ml)中的剧烈搅拌的悬浮液加入Boc₂O(3.86g，17.7mmol)并继续在室温过夜搅拌。将反应混合物用DCM(25 ml)稀释并用10％柠檬酸水溶液(2×)、水(2×)和盐水洗涤。用无水Na₂SO₄干燥有机层并真空浓缩。粗产物(产率5g)直接用于接下来的反应。

步骤3-合成Boc-TAP：将来自前面反应的粗产物溶于甲醇(25ml)中并在5％披钯炭(5％w/W)存在下气球压力下氢化16小时。将混合物过滤，用甲醇洗涤并真空浓缩滤液得到粗品H-TAP-Boc产物(产率3.7g)。步骤1-3后Boc-TAP的总体大概产率为44％(基于所用Cbz-Cl的量计算)。

步骤4-合成TentaGel-连接体：将溴化TentaGel(2.5g，0.48mmol/g，来自Rapp Polymere，德国)、酚连接体(5当量)和K₂CO₃(5当量)在20ml DMF中加热到70℃并保持14小时。冷却到室温后，洗涤树脂(0.1N HCl、水、ACN、DMF、MeOH)并干燥得到琥珀色树脂。

步骤5-合成TentaGel-连接体-TAP(Boc)：将来自上面的2.5gms树脂和H-TAP-Boc(1.5gms，5当量)和冰AcOH(34μl，5当量)用1∶1 MeOH-THF混合物吸收并过夜摇动。氰基硼氢化钠(5当量)在THF中的1M溶液加入该混合物中并再摇动7小时。将树脂过滤洗涤(DMF、THF、0.1N HCl、水、MeOH)并干燥。将少量树脂用Bz-Cl和DIEA在DCM中的溶液苯甲酰化并用70％TFA-DCM切割并通过LCMS和HPLC检查。

步骤6-合成TentaGel-连接体-TAP-Lys：将来自上面的树脂用Fmoc-Lys(Fmoc)-OH的活化溶液(5当量氨基酸和5当量HATU溶于0.5MDMF，然后加入10当量DIEA制备)处理并温和摇动14小时。洗涤(DMF、THF、DCM、MeOH)树脂并干燥以产生受保护的树脂。通过用10％乙酸酐、20％吡啶在DCM中的溶液处理树脂20分钟帽化残留胺基，然后如上洗涤。通过在DMF中的30％哌啶温和摇动树脂20分钟，然后洗涤(DMF、THF、DCM、MeOH)并干燥。

步骤7-合成TentaGel-连接体-TAP-Lys(肽)₂：将来自上面的树脂进行用HBTU/HOBt活化偶联Fmoc-氨基酸和用哌啶除去Fmoc的反复循环以同时增长肽链。这在可以从Applied Biosystems，Inc得到的ABI 433自动化肽合成仪上方便地进行。除去最后的Fmoc后，将末端胺基用乙酸酐(10当量)和DIEA(20当量)在DMF中的溶液酰化20分钟，然后如上洗涤。

步骤8-从树脂切割：将来自上面的树脂在室温重悬浮在TFA(82.5％)，苯酚(5％)，乙二硫醇(2.5％)，水(5％)和苯硫基甲烷(5％)的溶液中3小时。也可以使用备选切割混合液，如TFA(95％)，水(2.5％)和三异丙基硅烷(2.5％)。将TFA溶液冷却到5℃并倒入Et₂O中沉淀肽。过滤并减压干燥得到所希望的肽。通过制备HPLC用C18柱纯化得到纯肽。

步骤9-氧化肽以形成分子内二硫键：将肽二聚体溶解在20％DMSO/水(1mg干重肽/ml)并允许在室温静置36小时。通过将反应混合物装入C18HPLC柱(Waters Delta-Pak C18，15微米颗粒大小，300埃孔径，40mm×200mm长度)，然后用在40分钟内从5到95％ACN的线性ACN/水/0.01％TFA梯度纯化。冻干含有所希望的肽的级分得到疏松的白色固体。

含有还原的半胱氨酸残含有氧化的二硫键的二

基的二聚肽(XYZ) 聚肽(XYZ)

步骤10-末端-NH₂基团的PEG化：

通过氨基甲酸酯键PEG化：将肽二聚体与无水DMF中的1.5当量(基于摩尔)活化的PEG种类(来自NOF Corp.Japan的mPEG-NPC)混合得到澄清溶液。5分钟后向上面的溶液加入4当量DIEA.室温下搅拌混合物14小时，然后用C18反相HPLC纯化。通过MALDI质谱证实PEG化肽的结构。还如下面概述的通过阳离子交换层析纯化所纯化的肽。

通过酰胺键PEG化：将肽二聚体与无水DMF中的1.5当量(基于摩尔)1当量活化的PEG种类(来自Shearwater Corp，USA的PEG-SPA-NHS)混合。5分钟后，向上面的溶液加入10当量DIEA。室温搅拌混合物2小时，然后用C18反相HPLC纯化。通过MALDI质谱证实PEG化肽的结构。还如下面概述的通过阳离子交换层析纯化所纯化的肽。

步骤11-离子交换纯化：对数种交换支持体检查它们保持保留起始二聚肽的能力以及它们分离上面的肽-PEG缀合物与未反应的(或者水解的)PEG的能力。将离子交换树脂(2-3g)装入1cm柱中，然后转化成钠型(向柱子加入0.2N NaOH直到洗脱液的pH为14，约5柱体积)，然后转化成氢型(用0.1N HCl或0.1M HOAc洗脱直到洗脱液匹配加样pH，约5柱体积)，然后用25％ACN/水洗涤直到pH6。将缀合前的肽或者肽-PEG缀合物溶于25％ACN/水(10mg/mL)中并用TFA调节pH到＜3，然后加入柱子。用2-3柱体积25％ACN/水洗涤并收集5mL级分后，通过用25％ACN/水中的0.1M NH₄OAc洗脱从柱子释放肽，再次收集5mL级分。通过HPLC分析揭示哪些级分含有所希望的肽。用蒸发光散射检测器(ELSD)分析表明当肽保留在柱子上并用NH₄OAc溶液洗脱(通常在级分4到10之间)时，没有观察到作为污染物的非缀合的PEG。当用最初洗涤缓冲液洗脱肽(通常前2个级分)时，没有观察到所希望的PEG缀合物和过量PEG的分离。

下面的柱子成功地保留了所述肽和肽-PEG缀合物，并从未缀合的肽成功地纯化了肽-PEG缀合物：

表1：离子交换树脂

支持体	来源
支持体	来源	Mono S HR 5/5强阳离子交换预装柱	Amersham Biosciences
SE53纤维素，微粒状强阳离子交换支持体	Whatman	Mono S HR 5/5强阳离子交换预装柱	Amersham Biosciences
SE53纤维素，微粒状强阳离子交换支持体	Whatman	SP Sepharose Fast Flow强阳离子交换支持体	Amersham Biosciences

实施例2：通过片段缩合合成EPO-R激动剂肽二聚体

步骤1-合成(Cbz)₂-Lys：在标准条件下用氯甲酸苄基酯的溶液反应赖氨酸得到在两个氨基受Cbz基团保护的赖氨酸。

步骤2-合成Boc-TAP：如实施例1步骤1到3描述的合成Boc-TAP。

步骤3-偶联(Cbz)₂-Lys和Boc-TAP：在标准条件下偶联(Cbz)₂-Lys和Boc-TAP得到(Cbz)₂-Lys-TAP-Boc。

步骤4-Lys-TAP-Boc：将来自前面反应的粗产物溶于甲醇(25ml)中并在5％披钯炭(5％w/W)存在下在气球压力下氢化16小时。过滤混合物，用甲醇洗涤并真空浓缩滤液得到粗品Lys-TAP-Boc产物。

步骤5-通过片段缩合合成肽单体：通过标准方法合成肽单体序列的四种肽片段。然后将这些部分受保护的片段进行两个独立轮的偶联。在第一轮中，通过偶联两个肽片段形成单体的N-末端一半，通过偶联其他两个肽片段形成单体的C-末端一半。在第二轮偶联中，N-末端一半和C-末端一半偶联形成完整的受保护的单体。然后通过标准技术对单体OBn去保护。

步骤6-氧化肽单体以形成分子内二硫键：然后在碘化物存在下氧化OBn去保护的缩合肽单体以在该单体的Acm保护的半胱氨酸残基之间形成分子内二硫键。

步骤7-将Lys-TAP-Boc偶联到OBn去保护的单体以形成肽二聚体：在标准条件下将Lys-TAP-Boc偶联到两倍摩尔过量的经氧化的OBn去保护的单体形成肽二聚体。然后在标准条件下对肽二聚体去保护。

步骤8-去保护的二聚体的PEG化：然后如实施例1的步骤10中描述的PEG化去保护的肽二聚体。

步骤9-离子交换纯化：然后如实施例1步骤11申描述的纯化PEG化的肽二聚体。

实施例3：体外活性测定

该实施例描述可用于评估本发明肽的EPO-R激动剂肽的活性和效力的多种体外测定法。这些测定法的结果表明本发明的新肽结合EPO-R并激活EPO-R信号转导。此外，这些测定的结果表明所述新肽组合物与以前描述的EPO模拟肽相比显示EPO-R结合亲和力和生物活性的令人惊奇的增加。

根据实施例1或实施例2中提供的方法制备EPO-R激动剂肽二聚体。使用一系列体外活性测定法评估这些肽二聚体的效力，所述测定法包括：报道子测定法、增殖测定法、竞争结合测定法和C/BFU-e测定法。这四种测定法在下文详细描述。

这些体外活性测定法的结果在表2中总结。

1.报道子测定法

该测定法基于鼠前-B细胞系来源的报道细胞Baf3/EpoR/GCSFRfos/lux。该报道细胞系表达嵌合受体，该受体包含人EPO受体的细胞外部分到人GCSF受体的细胞内部分。用fos启动子驱动的萤光素酶报道基因构建体进一步转化该细胞系。通过加入红细胞生成剂激活该嵌合受体导致萤光素酶报道基因的表达，因此加入萤光素酶底物萤光素时产生光。从而，可以通过测量萤光素酶活性可以定量此类细胞中EPO-R激活的水平。

将Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux细胞培养在补加10％胎牛血清(FBS；Hyclone)，10％WEHI-3上清液(来自WEHI-3细胞ATCC#TIB-68的培养物的上清液)和青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基(Gibco)中。测定前约18小时，通过将细胞转移到补加10％FBS和0.1％WEHI-3上清液的DMEM/F12培养基饥饿细胞。在测定当天，用补加10％FBS(无WEHI-3上清液)的DMEM/F12培养基洗涤细胞一次，然后在已知浓度的受试肽的存在下培养1×10⁶个细胞/ml，或用EPO(R & D Systems Inc.，Minneapolis，MN)作为阳性对照，在补加10％FBS(无WEHI-3上清液)的DMEM/F12培养基中培养所述细胞。同时在该测定中试验受试肽的连续稀释液。将测定板在37℃下5％CO₂大气中孵育，之后向每孔加入萤光素(Steady-Glo；Promega，Madison，Wi)。孵育5分钟后，在Packard Topcount Luminometer(Packard Instrument Co.，Downers Grove，Ill.)上测量光发射。将光计数相对于受试肽浓度作图并用Graph Pad软件分析。导致光的半最大发射的受试肽浓度记录为EC50[见表2：报道子EC50]。

2.增殖测定法

该测定法基于鼠前-B细胞系Baf3，其经转染而表达人EPO-R。所得细胞系BaF3/Gal4/Elk/EPOR的增殖取决于EPO-R激活。使用MTT定量细胞增殖的程度，其中MTT测定中信号与活细胞数成比例。

将BaF3/Gal4/Elk/EPOR细胞培养在旋转瓶中补加10％FBS(Hyclone)和2％WEHI-3上清液(ATCC#TIB-68)的DMEM/F12培养基(Gibco)中培养。在旋转瓶中补加10％FBS和0.1％WEHI-3上清液的DMEM/F12培养基中以1×10⁶个细胞/ml的细胞密度过夜饥饿所培养的细胞。然后将饥饿的细胞用Dulbecco′s PBS(Gibco)洗涤两次，用补加10％FBS(无WEHI-3上清液)的DMEM/F12培养基重悬浮到1×10⁶个细胞/ml的密度。然后将细胞悬浮物的50μL等分试样(～50,000个细胞)以一式三份铺在96孔测定板中。向96孔测定板加入受试EPO模拟肽或者50μL EPO(R & DSystems Inc.，Minneapolis，MN)或Aranesp^TM(darbepoeitin α，可以从Amgen以商业途径得到的EPO-R激动剂)在补加10％FBS(无WEHI-3上清液I)的DMEM/F12培养基中连续稀释液的50μL等分试样(最终孔体积100μL)。例如，当受试肽(或者对照EPO肽)的最终浓度为810pM到0.0045pM时，可以试验12种不同的稀释液。然后在37℃孵育平铺的细胞。接着，向每个培养皿孔加入10μL MTT(Roche Diagnostics)，并孵育4小时。通过加入10％SDS+0.01N HCl中止反应。然后在37℃过夜孵育板。通过分光光度法测量595nm波长下每孔的吸收。用吸收读数对受试肽浓度作图并使用Graph Pad软件计算EC50。导致半最大吸收的受试肽浓度记录为EC50[见表2：增殖EC50]。

3.竞争结合测定法

使用一种测定法进行竞争结合计算，在该测定法中产生光信号作为两种珠子的接近性的函数，所述珠子为：具有生物素化EPO-R结合肽示踪物的链霉抗生物素蛋白供体珠，和EPO-R结合的受体珠。通过非辐射能量转移产生光，在所述转移期间照明时从第一种珠子释放单线态氧，与所释放的单线态氧的接触导致第二种珠子发光。这些珠子组可以通过商业途径得到(Packard)。通过EPO-R结合肽示踪物与EPO-R的结合产生珠子接近性。与EPO-R结合肽示踪物竞争结合EPO-R的受试肽将防止该结合，导致光发射的降低。

该方法更详述如下：向384孔板的孔中加入受试EPO-R激动剂肽或者阳性或阴性对照的4μL连续稀释液。之后，加入2μL/孔受体/珠子混合物。受体珠子混合物由15μL 5mg/ml链霉抗生物素蛋白供体珠子(Packard)，15μL 5mg/ml单克隆抗体ab179(该抗体识别重组EPO-R中所含人胎盘碱性磷酸酶蛋白质部分)，蛋白质A包被的受体珠(蛋白质A将结合ab179抗体；Packard)，重组EPO-R(在中国仓鼠卵巢细胞中产生，作为人胎盘碱性磷酸酶蛋白质部分的融合蛋白质，其含有ab179靶表位)的1∶6.6稀释液112.5μL，和607.5μLAlphaquest缓冲液(40mM HEPES，pH7.4；1mM MgCl₂；0.1％BSA，0.05％Tween 20)组成。轻拍混合。加入2μL/孔生物素化EPO-R结合肽示踪物AF33068(30nM终浓度)。根据实施例1描述的方法制备AF33068--一种EPO-R结合肽(见表3“报道子EC50(pM)”)

离心1分钟混合。用Packard Top Seal密封板并用箔缠绕。在室温过夜孵育。18小时后用AlphaQuest读出器(Packard)读出光发射。将光发射对肽浓度作图并用Graph Pad或Excel分析。

相对于没有受试肽所观察到的光发射，导致光发射降低50％的受试肽的浓度记录为IC50[见表2：AQ IC50]。

4.C/BFU-e测定法

EPO-R信号转导刺激骨髓干细胞分化成血红细胞前体。该测定法测量受试肽刺激来自原代人骨髓多能干细胞的血红细胞前体增殖和分化的能力。

对于该测定，以补加10％FBS(Hyclone)的IMDM培养基(Gibco)配制受试肽的连续稀释液。然后将这些连续稀释液或者阳性对照EPO肽加入甲基纤维素得到终体积1.5mL。然后充分涡旋甲基纤维素和肽的混合物。将人骨髓来源的CD34+细胞(Poietics/Cambrex)的等分试样(100,000个细胞/mL)解冻。向50mL管中的0.1mL 1mg/ml DNA酶(Stem Cells)温和加入解冻的细胞。接着，向细胞温和加入40-50mL IMDM培养基：该培养基沿着50mL管边沿逐滴加入前10mL，然后沿着管的边沿缓慢加入剩余体积的培养基。以900转/分钟离心细胞20分钟，通过温和吸出除去培养基。将细胞重悬浮在1mlIMDM培养基中并在血细胞计数器载玻片上计数每mL细胞密度(载玻片上细胞悬浮液的10μL等分试样，细胞密度是平均计数×10,000个细胞/mL)。然后将细胞在IMDM培养基中稀释到15,000个细胞/mL的细胞密度。然后向每1.5mL甲基纤维素加肽样品加入100μL稀释细胞(测定介质中最终细胞浓度为1000个细胞/mL)，并涡旋混合物。允许混合物中气泡消失，然后用钝端针头吸出1mL。

将来自每个样品的0.25mL吸出的混合物加入24孔板(Falcon商标)的4个孔的每孔中。在37℃下5％CO₂下在湿润培养箱中孵育平铺的混合物14天。使用相差显微镜(5×-10×目镜，最终放大率100×)对类红细胞集落的存在打分。相对于用EPO阳性对照所观察的，所形成的集落数为最大值的90％时的受试肽浓度记录为EC90[见表2：C/BFU-e EC90]。

5.放射性配体竞争结合测定法

可以用备选的放射性配体竞争结合测定法测量本发明中肽的IC₅₀值。该测定法测量¹²⁵I-EPO与EPOr的结合。优选根据下面的代表性方案进行测定。

A.材料

重组人EPOR/Fc嵌合体	鉴定：重组人EPO R/Fc嵌合体供应商：R&D Systems(Minneapolis，MN，US)目录号：963-ER批号：EOK033071保存：4℃
重组人EPOR/Fc嵌合体		碘化的重组人红细胞生成素	鉴定：(3[<sup>125</sup>I]碘代酪氨酰)红细胞生成素，人重组的、高特异活性，370kBq，10μCi供应商：Amersham Biosciences (Piscataway，NJ，US)

	目录号：IM219-10μCi批号：保存：4℃
	目录号：IM219-10μCi批号：保存：4℃	蛋白质-GSepharose	鉴定：Protein-G Sepharose 4Fast Flow供应商：Amersham Biosciences(Piscataway，NJ，US)目录号：17-0618-01批号：保存：4℃
测定缓冲液	磷酸缓冲盐溶液(PBS)，pH 7.4，含有0.1％牛血清白蛋白和0.1％叠氮化钠保存：4℃	蛋白质-GSepharose

B.测定适宜的受体浓度

用1mL测定缓冲液重构50μg瓶中冻干的与人IgG1的Fc部分融合的重组EPOr细胞外结构域。为了测定用于测定的受体的正确量，将该受体制备物的100μL连续稀释液与约20,000cpm碘化重组人红细胞生成素(¹²⁵I-EPO)在12×75mm聚丙烯试管中混合。盖上试管并在LabQuake旋转摇床上4℃温和混合过夜。

第二天，向每管加入50μL蛋白质G Sepharose的50％浆液。将管在4℃孵育2小时，温和混合。然后以4000转/分钟(3297xG)将管离心15分钟以沉淀蛋白质-G sepharose。小心除去上清液并丢弃。用1ml 4℃测定缓冲液洗涤3次后，在Wallac Wizard γ计数器上计数沉淀。然后分析结果并计算达到最大结合值的50％所需的稀释度。

C.肽的IC₅₀测定

为了测定AF37702的IC₅₀，将肽的100μL连续稀释液与100μL重组红细胞生成素受体(100pg/管)在12×75mm聚丙烯试管中混合。向每管加入100μL碘化重组人红细胞生成素(¹²⁵I-EPO)，盖上试管并在4℃温和混合过夜。

第二天，如上述定量结合的¹²⁵I-EPO。分析结果并使用GraphPadSoftware，Inc.(San Diego，CA)的Graphpad Prism版本4.0计算IC₅₀值。对于测试的每种肽，重复该测定法2或3次，总共3或多次一式两份的IC₅₀测定。

表2：肽二聚体的体外活性测定法

实施例4：体内活性测定法

该实施例描述可以用于评估本发明的EPO-R激动剂肽的活性和效力多种体内测定法。根据实施例1或实施例2中提供的方法制备EPO-R激动剂肽二聚体。使用一系列测定法评估这些肽单体和二聚体的体内活性，所述测定法包括polycythemic exhypoxic小鼠生物测定法和网织红细胞测定法。这两种测定法在下面进一步详细描述。

1.polycythemic exhypoxic小鼠生物测定法

以从Cotes和Bangham(1961)，Nature 191：1065-1067描述的方法改编的polycythemic exhypoxic小鼠生物测定法测定受试肽的体内活性。该测定法检查受试肽作为EPO模拟物，即，激活EPO-R和诱导新的血红细胞合成的能力。基于放射性标记的铁向合成的血红细胞的血红蛋白中的掺入定量血红细胞合成。

让BDF1小鼠适应环境条件7-10天。测定所有动物的体重并且不使用低体重动物(＜15克)。将动物置于低压室中连续调节循环共14天。每个24小时循环由0.40±0.02％大气压下18小时和环境气压下6小时组成。调节后将小鼠保持在环境气压72小时后给药。

将受试肽或者重组人EPO标准在PBS+0.1％BSA载体(PBS/BSA)中稀释。首先将肽单体贮存液在二甲亚砜(DMSO)中溶解。阴性对照组包括仅用PBS/BSA注射的一组小鼠，和用1％DMSO注射的一组。每个剂量组包含10只小鼠。用0.5mL适宜的样品皮下注射(颈背)小鼠。

样品注射后48小时，对小鼠施用腹膜内注射0.2ml Fe⁵⁹(Dupont，NEN)，剂量为约0.75μ居里/小鼠。Fe⁵⁹施用后24小时测定小鼠体重，并在Fe⁵⁹施用后48小时处死小鼠。通过心脏穿刺从每只动物收集血液并测定血细胞比容(用肝素作为抗凝剂)。使用Packard γ计数器分析每个血样(0.2ml)的Fe⁵⁹掺入。从适宜的数据集除去非应答小鼠(即，放射性掺入小于阴性对照组的那些小鼠)。还除去血细胞比容值小于阴性对照组53％的小鼠。

对于每个实验剂量，从10只动物的组得到结果。计算来自每组的血样中掺入的放射性的平均量[每分钟计数(CPM)]。

2.网织红细胞测定法

以EPO对照或者受试肽在三个连续日对正常BDF1小鼠给药(0.5mL，皮下注射)。在第3天，还用右旋糖苷铁(100mg/ml)对小鼠给药(0.1mL，腹膜内注射)。在第5天，用CO₂麻醉小鼠并通过心脏穿刺取血。通过噻唑黄染色和流式细胞仪分析(retic-count程序)测定每个血样的网织红细胞百分数(％)。手工测定血细胞比容。用下面的公式确定校正的网织红细胞的百分数：

3.血液学测定法

通过四次每周快速浓注静脉内注射EPO阳性对照、受试肽或者载体对正常CD1小鼠给药。通过改变制剂中活性化合物浓度测试阳性对照和受试肽剂量范围，其表达为mg/kg。注射的体积为5ml/kg。载体对照组包含12只动物，剩余的剂量组每一组包括8只动物。每日记录生存力并且每周记录体重。

对给药的小鼠禁食，通过吸入异氟醚麻醉并通过在第1天(对于载体对照小鼠)和第15和29天(4只小鼠/组/天)心脏或者腹部主动脉穿刺收集终末血样。将血液转移到Vacutainer

商标管。优选的抗凝剂是乙二胺四乙酸(EDTA)。

使用本领域公知的自动化临床分析仪(例如，Coulter，Inc.生产的)对血样评估终点测量红细胞合成和生理机能，诸如血细胞比容(Hct)、血红蛋白(Hgb)和总红细胞数(RBC)。

实施例5：具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK(SEQ ID NO：1)的肽单体的EPO-R激动剂肽同型二聚体的合成

步骤1-合成肽单体：使用TG-RAM树脂(0.18mmol/g Rapp Polymere，德国)，利用标准Fmoc化学方法在ABI 431A肽合成仪上合成肽单体。对于具有酰胺化羧基末端的肽单体的合成，用82.5％TFA，5％水，6.25％苯甲醚和6.25％乙二硫醇从树脂切割完全装配的肽。从树脂过滤去保护的产物并用二乙醚沉淀。完全干燥后，通过C18反相高效液相层析，用0.1％三氟乙酸中的乙腈/水梯度纯化产物。通过电喷射质谱法证实肽的结构。将肽以1mg/ml的浓度溶于1∶1的DMSO：水溶液中以影响二硫化物形成。通过C18反相高效液相层析，用0.1％三氟乙酸中的乙腈/水梯度纯化产物。肽单体可以表示如下：

步骤2-合成三功能连接体：室温下向100mL DCM中的亚氨基乙酸二乙酯(10.0g，52.8mmol)和Boc-β-丙氨酸(10.0g，52.8mmol)的溶液10分钟内加入二异丙基碳二亚胺(8.0mL，51.1mmol)。加入期间反应混合物升温～10度。将反应混合物过夜搅拌并滤除沉淀的二异丙基脲。减压除去溶剂得到树胶，将残渣溶于乙酸乙酯中并再次过滤除去额外沉淀的脲。将有机相置于分液漏斗中，洗涤(饱和NaHCO₃、盐水、0.5N HCl、盐水)，干燥(MgSO₄)，过滤并减压浓缩得到无色油状二酯产物。将二酯用1∶1的MeOH∶THF混合物(100mL)吸收并向其中加入水(25mL)，然后加入NaOH(5g，125mmol)。测量pH＞10。在室温搅拌反应混合物2小时，然后用6N HCl酸化到pH1。将水性相用NaCl饱和并用乙酸乙酯萃取4次。洗涤(盐水)合并的有机相，干燥(MgSO₄)，并减压浓缩得到白色半固体。将固体溶于50mL DCM中并向其中加入300mL己烷以产生白色浆液。减压除去溶剂得到白色固态二酸(两步14.7g，91.5％产率)。向该二酸(1g，3.29mmol)在20mL DMF中的溶液加入N-羟基琥珀酰亚胺(770mg，6.69mmol)和二异丙基碳二亚胺(1.00mL，6.38mmol)和4-二甲基氨基吡啶(3mg，0.02mmol)。过夜搅拌反应混合物并减压除去溶剂。将残渣用乙酸乙酯吸收并过滤除去沉淀的尿素。将有机相置于分液漏斗中，洗涤(饱和NaHCO₃、盐水、0.5N HCl、盐水)，干燥(MgSO₄)，过滤并减压浓缩得到白色固态二-NHS酯产物(1.12g，68％产率)。

步骤3-将三功能连接体偶联到肽单体：为了偶联连接体，将2当量肽与1当量三功能连接体在无水DMF中的溶液混合得到澄清溶液，2分钟后加入5当量DIEA。在室温搅拌混合物14小时。减压除去溶剂并将粗产物溶于DCM中的80％TFA 30分钟以除去Boc基团，然后用C18反相HPLC纯化。通过电喷射质谱法证实二聚体的结构。该偶联反应将连接体连接到每个单体的赖氨酸残基的ε-氨基的氮原子。

步骤4-肽二聚体的PEG化：

通过氨基甲酸酯键PEG化：将肽二聚体与等量(基于摩尔)激活的PEG种类(NOF Corp.Japan的mPEG-NPC)在无水DMF中的溶液混合以提供澄清溶液。5分钟后，向上面的溶液加入4当量DIEA。室温下搅拌混合物14小时，然后通过C18反相HPLC纯化。通过MALDI质谱证实PEG化肽的结构。还通过下面概述的阳离子交换层析纯化所纯化的肽。

通过酰胺键PEG化：将肽二聚体与无水DMF中的等量(基于摩尔)活化的PEG种类(来自Shearwater Corp，USA的PEG-SPA-NHS)混合得到澄清溶液。5分钟后，向上面的溶液加入10当量DIEA。室温搅拌混合物2小时，然后用C18反相HPLC纯化。通过MALDI质谱证实PEG化肽的结构。还如下面概述的通过阳离子交换层析纯化所纯化的肽。

步骤5：肽的离子交换纯化：对数种交换支持体检查它们保持保留起始二聚肽的能力以及它们分离上面的肽-PEG缀合物与未反应的(或者水解的)PEG的能力。将离子交换树脂(2-3g)装入1cm柱中，然后转化成钠型(向柱子加入0.2N NaOH直到洗脱液的pH为14，约5柱体积)，然后转化成氢型(用0.1N HCl或0.1M HOAc洗脱直到洗脱液匹配加样pH，约5柱体积)，然后用25％ACN/水洗涤直到pH6。将缀合前的肽或者肽-PEG缀合物溶于25％ACN/水(10mg/mL)中并用TFA调节pH到＜3，然后加入柱子。用2-3柱体积25％ACN/水洗涤并收集5mL级分后，通过用25％ACN/水中的0.1M NH₄OAc洗脱从柱子释放肽，再次收集5mL级分。通过HPLC分析揭示那些级分含有所希望的肽。用蒸发光散射检测器(ELSD)分析表明当肽保留在柱子上并用NH₄OAc溶液洗脱(通常在级分4到10之间)时，没有观察到作为污染物的非缀合的PEG。当用最初洗涤缓冲液洗脱肽(通常前2个级分)时，没有观察到所希望的PEG缀合物和过量PEG的分离。

表3：离子交换树脂

实施例6：合成具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK(SEQID NO：1)的肽单体的EPO-R激动剂肽同型二聚体

如实施例1中描述的合成具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ BD NO：2)的肽单体的EPO-R激动剂肽同型二聚体，只是在步骤1中合成的肽单体为：

(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K

当PEG通过氨基甲酸酯键连接到连接体时，该合成的终产物可以如下面通过结构阐明：

当PEG通过酰胺键连接到连接体时，该合成的终产物可以如下面通过结构阐明：

实施例7：体外活性测定法

根据实施例1或实施例2中提供的方法制备EPO-R激动剂肽单体和二聚体。使用一系列体外活性测定法评估这些肽二聚体的效力，所述测定法包括：报道子测定法、增殖测定法、竞争结合测定法和C/BFU-e测定法。这四种测定法在下文详细描述。

这些体外活性测定法的结果在表2中总结。

1.报道子测定法

该测定法基于鼠前-B细胞系来源的报道细胞Baf3/EpoR/GCSFR

fos/lux。该报道细胞系表达嵌合受体，该受体包含人EPO受体的细胞外部分到人GCSF受体的细胞内部分。用fos启动子驱动的萤光素酶报道基因构建体进一步转化该细胞系。通过加入红细胞生成剂激活该嵌合受体导致萤光素酶报道基因的表达，因此加入萤光素酶底物萤光素时产生光。从而，可以通过测量萤光素酶活性可以定量此类细胞中EPO-R激活的水平。

将Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux细胞培养在补加10％胎牛血清(FBS；Hyclone)，10％WEHI-3上清液(来自WEHI-3细胞ATCC#TIB-68的培养物的上清液)和青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基(Gibco)中。测定前约18小时，通过将细胞转移到补加10％FBS和0.1％WEHI-3上清液的DMEM/F12培养基饥饿细胞。在测定当天，用补加10％FBS(无WEHI-3上清液)的DMEM/F12培养基洗涤细胞一次，然后在已知浓度的受试肽的存在下培养1×10⁶个细胞/ml，或用EPO(R&D Systems Inc.，Minneapolis，MN)作为阳性对照，在补加10％FBS(无WEHI-3上清液)的DMEM/F12培养基中培养所述细胞。同时在该测定中试验受试肽的连续稀释液。将测定板在37℃下5％CO₂大气中孵育，之后向每孔加入萤光素(Steady-Glo；Promega，Madison，Wi)。孵育5分钟后，在Packard Topcount Luminometer(Packard Instrument Co.，Downers Grove，Ill.)上测量光发射。将光计数相对于受试肽浓度作图并用Graph Pad软件分析。导致光的半最大发射的受试肽浓度记录为EC50。

2.增殖测定法

将BaF3/Gal4/Elk/EPOR细胞培养在旋转瓶中补加10％FBS(Hyclone)和2％WEHI-3上清液(ATCC#TIB-68)的DMEM/F12培养基(Gibco)中培养。在旋转瓶中补加10％FBS和0.1％WEHI-3上清液的DMEM/F12培养基中以1×10⁶个细胞/ml的细胞密度过夜饥饿所培养的细胞。然后将饥饿的细胞用Dulbecco′s PBS(Gibco)洗涤两次，用补加10％FBS(无WEHI-3上清液)的DMEM/F12培养基重悬浮到1×10⁶个细胞/ml的密度。然后将细胞悬浮物的50μL等分试样(～50,000个细胞)以一式三份铺在96孔测定板中。向96孔测定板加入受试EPO模拟肽或者50μL EPO(R&DSystems Inc.，Minneapolis，MN)或Aranesp^TM(darbepoeitin α，可以从Amgen以商业途径得到的EPO-R激动剂)在补加10％FBS(无WEHI-3上清液I)的DMEM/F12培养基中连续稀释液的50μL等分试样(最终孔体积100μL)。例如，当受试肽(或者对照EPO肽)的最终浓度为810pM到0.0045pM时，可以试验12种不同的稀释液。然后在37℃孵育平铺的细胞。接着，向每个培养皿孔加入10μL MTT(Roche Diagnostics)，并孵育4小时。通过加入10％SDS+0.01N HCl中止反应。然后在37℃过夜孵育板。通过分光光度法测量595nm波长下每孔的吸收。用吸收读数对受试肽浓度作图并使用Graph Pad软件计算EC50。导致半最大吸收的受试肽浓度记录为EC50。

3.竞争结合测定法

该方法更详述如下：向384孔板的孔中加入受试EPO-R激动剂肽或者阳性或阴性对照的4μL连续稀释液。之后，加入2μL/孔受体/珠子混合物。受体珠子混合物由15μL 5mg/ml链霉抗生物素蛋白供体珠子(Packard)，15μL 5mg/ml单克隆抗体ab179(该抗体识别重组EPO-R中所含人胎盘碱性磷酸酶蛋白质部分)，蛋白质A包被的受体珠(蛋白质A将结合ab179抗体；Packard)，重组EPO-R(在中国仓鼠卵巢细胞中产生，作为人胎盘碱性磷酸酶蛋白质部分的融合蛋白质，其含有ab179靶表位)的1∶6.6稀释液112.5μL，和607.5μL Alphaquest缓冲液(40mM HEPES，pH7.4；1mM MgCl₂；0.1％BSA，0.05％Tween 20)组成。轻拍混合。加入2μL/孔生物素化EPO-R结合肽示踪物AF33068(30nM终浓度)。根据实施例1描述的方法制备AF33068--一种EPO-R结合肽(见表3“报道子EC50(pM)”)。

相对于没有受试肽所观察到的光发射，导致光发射降低50％的受试肽的浓度记录为IC50。

4.C/BFU-e测定法

对于该测定，以补加10％FBS(Hyclone)的IMDM培养基(Gibco)配制受试肽的连续稀释液。然后将这些连续稀释液或者阳性对照EPO肽加入甲基纤维素得到终体积1.5mL。然后充分涡旋甲基纤维素和肽的混合物。将人骨髓来源的CD34+细胞(Poietics/Cambrex)的等分试样(100,000个细胞/mL)解冻。向50mL管中的0.1mL 1mg/ml DNA酶(Stem Cells)温和加入解冻的细胞。接着，向细胞温和加入40-50mL IMDM培养基：该培养基沿着50mL管边沿逐滴加入前10mL，然后沿着管的边沿缓慢加入剩余体积的培养基。以900转/分钟离心细胞20分钟，通过温和吸出除去培养基。将细胞重悬浮在1ml IMDM培养基中并在血细胞计数器载玻片上计数每mL细胞密度(载玻片上细胞悬浮液的10μL等分试样，细胞密度是平均计数×10,000个细胞/mL)。然后将细胞在IMDM培养基中稀释到15,000个细胞/mL的细胞密度。然后向每1.5mL甲基纤维素加肽样品加入100μL稀释细胞(测定介质中最终细胞浓度为1000个细胞/mL)，并涡旋混合物。允许混合物中气泡消失，然后用钝端针头吸出1mL。

表4：肽二聚体的体外活性测定

实施例8：体内活性测定

该实施例描述可以用于评估本发明的EPO-R激动剂肽的活性和效力多种体内测定法。根据实施例1中提供的方法制备EPO-R激动剂肽单体和二聚体。使用一系列测定法评估这些肽单体和二聚体的体内活性，所述测定法包括polycythemic exhypoxic小鼠生物测定法和网织红细胞测定法。这两种测定法在下面进一步详细描述。

1.polycythemic exhypoxic小鼠生物测定法

2.网织红细胞测定法

3.血液学测定法

对给药的小鼠禁食通过吸入异氟醚麻醉并通过在第1天(对于载体对照小鼠)和第15和29天(4只小鼠/组/天)心脏或者腹部主动脉穿刺收集终末血样。将血液转移到Vacutainer

商标管。优选的抗凝剂是乙二胺四乙酸(EDTA)。

实施例9：具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK(SEQ ID NO：1)的肽单体的EPO-R激动剂肽同型二聚体的合成

步骤1-合成肽单体：使用TG-RAM树脂(0.18mmol/gRapp Polymere，德国)，利用标准Fmoc化学方法在ABI431A肽合成仪上合成肽单体。对于具有酰胺化羧基末端的肽单体的合成，用82.5％TFA，5％水，6.25％苯甲醚和6.25％乙二硫醇从树脂切割完全装配的肽。从树脂过滤去保护的产物并用二乙醚沉淀。完全干燥后，通过C18反相高效液相层析，用0.1％三氟乙酸中的乙腈/水梯度纯化产物。通过电喷射质谱法证实肽的结构。肽单体可以表示如下：

(AcG)GLYACHMGPIT(1-na1)VCQPLRK-NH₂

步骤2-合成三功能连接体：室温下向100mL DCM中的亚氨基乙酸二乙酯(10.0g，52.8mmol)和Boc-β-丙氨酸(10.0g，52.8mmol)的溶液10分钟内加入二异丙基碳二亚胺(8.0mL，51.1mmol)。加入期间反应混合物升温至～10度。将反应混合物过夜搅拌并滤除沉淀的二异丙基脲。减压除去溶剂得到树胶，将残渣溶于乙酸乙酯中并再次过滤除去额外沉淀的脲。将有机相置于分液漏斗中，洗涤(饱和NaHCO₃、盐水、0.5N HCl、盐水)，干燥(MgSO₄)，过滤并减压浓缩得到无色油状二酯产物。将二酯用1∶1的MeOH∶THF混合物(100mL)吸收并向其中加入水(25mL)，然后加入NaOH(5g，125mmol)。测量pH＞10。在室温搅拌反应混合物2小时，然后用6N HCl酸化到pH1。将水性相用NaCl饱和并用乙酸乙酯萃取4次。洗涤(盐水)合并的有机相，干燥(MgSO₄)，并减压浓缩得到白色半固体。将固体溶于50mL DCM中并向其中加入300mL己烷以产生白色浆液。减压除去溶剂得到白色固态二酸(两步14.7g，91.5％产率)。向该二酸(1g，3.29mmol)在20mL DMF中的溶液加入N-羟基琥珀酰亚胺(770mg，6.69mmol)和二异丙基碳二亚胺(1.00mL，6.38mmol)和4-二甲基氨基吡啶(3mg，0.02mmol)。过夜搅拌反应混合物并减压除去溶剂。将残渣用乙酸乙酯吸收并过滤除去沉淀的尿素。将有机相置于分液漏斗中，洗涤(饱和NaHCO₃、盐水、0.5N HCl、盐水)，干燥(MgSO₄)，过滤并减压浓缩得到白色固态二-NHS酯产物(1.12g，68％产率)。

步骤4-包含通过赖氨酸mPEG2-赖氨醇-NPC连接的两条线性PEG链的PEG部分的合成

将可以通过商业途径获得的赖氨醇用过量mPEG2-NPC处理以得到MPEG2-赖氨醇，将其与NPC反应形成mPEG2-赖氨醇-NPC。

mPEG2-Lys-NHS

可以通过商业途径，例如从Nektar Therapeutics(490 Discovery Drive，Huntsville，Alabama 35806)的Molecular Engineering目录(2003)条目2Z3X0T01得到该产品。

步骤5-肽二聚体的PEG化：

通过氨基甲酸酯键PEG化：

将肽二聚体与PEG种类(mPEG₂-赖氨醇-NPC)以1∶2摩尔比在无水DMF中混合得到澄清溶液。5分钟后，向上面的溶液加入4当量DIEA。室温下搅拌混合物14小时，然后通过C18反相HPLC纯化。通过MALDI质谱证实PEG化肽的结构。还通过下面概述的阳离子交换层析纯化所纯化的肽。

通过酰胺键PEG化：

将肽二聚体与PEG种类(来自Shearwater Corp，USA的PEG₂-Lys-NHS)以1∶2摩尔比在无水DMF中混合得到澄清溶液。5分钟后，向上面的溶液加入10当量DIEA。室温搅拌混合物2小时，然后用C18反相HPLC纯化。通过MALDI质谱证实PEG化肽的结构。还如下面概述的通过阳离子交换层析纯化所纯化的肽。

步骤6：肽的离子交换纯化：对数种交换支持体检查它们保持保留起始二聚肽的能力以及它们分离上面的肽-PEG缀合物与未反应的(或者水解的)PEG的能力。将离子交换树脂(2-3g)装入1cm柱中，然后转化成钠型(向柱子加入0.2N NaOH直到洗脱液的pH为14，约5柱体积)，然后转化成氢型(用0.1N HCl或0.1M HOAc洗脱直到洗脱液匹配加样pH，约5柱体积)，然后用25％ACN/水洗涤直到pH6。将缀合前的肽或者肽-PEG缀合物溶于25％ACN/水(10mg/mL)中并用TFA调节pH到＜3，然后加入柱子。用2-3柱体积25％ACN/水洗涤并收集5mL级分后，通过用25％ACN/水中的0.1M NH₄OAc洗脱从柱子释放肽，再次收集5mL级分。通过HPLC分析揭示那些级分含有所希望的肽。用蒸发光散射检测器(ELSD)分析表明当肽保留在柱子上并用NH₄OAc溶液洗脱(通常在级分4到10之间)时，没有观察到作为污染物的非缀合的PEG。当用最初洗涤缓冲液洗脱肽(通常前2个级分)时，没有观察到所希望的PEG缀合物和过量PEG的分离。

表5：离子交换树脂

实施例10：合成具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：1)的肽单体的EPO-R激动剂肽同型二聚体

(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K

实施例11：体外活性测定

这些体外活性测定法的结果在表2中总结。

1.报道子测定法

2.增殖测定法

3.竞争结合测定法

使用一种测定法进行竞争结合计算，在该测定法中产生光信号作为两种珠子的接近性的函数，所述珠子为：具有生物素化EPO-R结合肽示踪物的的链霉抗生物素蛋白供体珠，和EPO-R结合的受体珠。通过非辐射能量转移产生光，在所述转移期间照明时从第一种珠子释放单线态氧，与所释放的单线态氧的接触导致第二种珠子发光。这些珠子组可以通过商业途径得到(Packard).通过EPO-R结合肽示踪物与EPO-R的结合产生珠子接近性。与EPO-R结合肽示踪物竞争结合EPO-R的受试肽将防止该结合，导致光发射的降低。

4.C/BFU-e测定法

表6：肽二聚体的体外活性测定

实施例12：体内活性测定法

该实施例描述可以用于评估本发明的EPO-R激动剂肽的活性和效力多种体内测定法。根据实施例1中提供的方法制备EPO-R激动剂肽二聚体。使用一系列测定法评估这些肽单体和二聚体的体内活性，所述测定法包括polycythemic exhypoxic小鼠生物测定法和网织红细胞测定法。这两种测定法在下面进一步详细描述。

1.polycythemic exhypoxic小鼠生物测定法

样品注射后48小时，对小鼠施用腹膜内注射0.2ml Fe⁵⁹(Dupont，NEN)，剂量为约0.75μ居里/小鼠。Fe⁵⁹施用后24小时测定小鼠体重，并在Fe⁵⁹施用后48小时小鼠处死小鼠。通过心脏穿刺从每只动物收集血液并测定血细胞比容(用肝素作为抗凝剂)。使用Packard γ计数器分析每个血样(0.2ml)的Fe⁵⁹掺入。从适宜的数据集除去非应答小鼠(即，放射性掺入小于阴性对照组的那些小鼠)。还除去血细胞比容值小于阴性对照组53％的小鼠。

对于每个实验剂量，从10只动物的组得到结果。计算来自每组的血样中掺入的放射性的平均量[每分钟数(CPM)]。

2.网织红细胞测定法

3.血液学测定法

对给药的小鼠禁食通过吸入异氟醚麻醉并通过在第1天(对于载体对照小鼠)和第15和29天(4只小鼠/组/天)心脏或者腹部主动脉穿刺收集终末血样。将血液转移到Vacutainer商标管。优选的抗凝剂是乙二胺四乙酸(EDTA)。

本发明的范围不局限于本文描述的具体实施方案的。实际上，根据前面的描述和附图，除了本文描述的之外对本发明的多种修饰对于本领域技术人员是显而易见的。这些修饰意在所附权利要求书的范围内。

还将理解所有值都是近似的，并且提供这些值用于描述。

本发明的说明书中引用和讨论了多种参考文献，包括专利、专利申请、方案和多种出版物。提供这些参考文献的引用和/或讨论仅仅是用于阐明本发明的描述并且不是承认此类参考文献是本发明的“现有技术”。该说明书中引用和讨论的所有参考文献在此完整并入本文作为参考，就像每个参考文献单独并入作为参考一样。

Claims

1.结合并激活红细胞生成素受体的化合物，所述化合物是具有式：

的肽二聚体，其中

(i)在该肽二聚体的每个肽单体中，每个氨基酸通过标准单字母缩写表示，AcG为N-乙酰基甘氨酸，1-nal为1-萘基丙氨酸；

(ii)该肽二聚体的每个肽单体含有每个单体的两个半胱氨酸残基之间的分子内二硫键；

(iii)所述[“PEG”]是至少一个线性未分枝的PEG，其具有约20,000到约40,000道尔顿的分子量。

2.根据权利要求1的化合物，其中每个PEG具有约30,000道尔顿的分子量。

3.权利要求1的化合物的用途，用于制备治疗特征是红细胞生成素不足或者低或者有缺陷的血红细胞群体的疾病的药物。

4.根据权利要求3的用途，其中所述疾病选自末期肾衰竭或透析、与艾滋病、自身免疫病或者恶性肿瘤相关的贫血、β-地中海贫血、囊性纤维化、早熟性早期贫血、与慢性炎症疾病相关的贫血、脊髓损伤、急性失血、衰老和伴随着异常红细胞生成的肿瘤疾病状态。

5.根据权利要求3或权利要求4的用途，其中每种PEG具有约30,000道尔顿的分子量。

6.药物组合物，其包含权利要求1的化合物和药学上可接受的载体。

7.根据权利要求6的药物组合物，其中每种PEG具有约30,000道尔顿的分子量。

8.结合和激活红细胞生成素受体的化合物，所述化合物是具有式：

的肽二聚体，其中

(i)在该肽二聚体的每个肽单体中，每个氨基酸通过标准单字母缩写表示，AcG为N-乙酰基甘氨酸，1-nal为1-萘基丙氨酸，MeG为N-甲基甘氨酸；

9.根据权利要求8的化合物，其中PEG具有约30,000道尔顿的分子量。

10.权利要求8的化合物的用途，用于制备治疗特征是红细胞生成素不足或者低或者有缺陷的血红细胞群体的疾病的药物。

11.根据权利要求10的用途，其中所述疾病选自末期肾衰竭或透析、与艾滋病、自身免疫病或者恶性肿瘤相关的贫血、β-地中海贫血、囊性纤维化、早熟性早期贫血、与慢性炎症疾病相关的贫血、脊髓损伤、急性失血、衰老和伴随着异常红细胞生成的肿瘤疾病状态。

12.根据权利要求10的用途，其中PEG具有约30,000道尔顿的分子量。

13.药物组合物，其包含权利要求8的化合物和药学上可接受的载体。

14.根据权利要求13的药物组合物，其中PEG具有约30,000道尔顿的分子量。

15.结合和激活红细胞生成素受体的化合物，所述化合物是具有式：

的肽二聚体，其中

16.根据权利要求15的化合物，其中PEG具有约30,000道尔顿的分子量。

17.权利要求15的化合物的用途，用于制备治疗特征是红细胞生成素不足或者低或者有缺陷的血红细胞群体的疾病的药物。

18.根据权利要求17的用途，其中所述疾病选自末期肾衰竭或透析、与艾滋病、自身免疫病或者恶性肿瘤相关的贫血、β-地中海贫血、囊性纤维化、早熟性早期贫血、与慢性炎症疾病相关的贫血、脊髓损伤、急性失血、衰老和伴随着异常红细胞生成的肿瘤疾病状态。

19.根据权利要求17或权利要求18的用途，其中PEG具有约30,000道尔顿的分子量。

20.药物组合物，其包含权利要求15的化合物和药学上可接受的载体。

21.根据权利要求20的药物组合物，其中PEG具有约30,000道尔顿的分子量。

22.结合和激活红细胞生成素受体的化合物，所述化合物是具有式：

的肽二聚体，其中

23.根据权利要求22的化合物，其中PEG具有约30,000道尔顿的分子量。

24.权利要求22的化合物的用途，用于制备治疗特征是红细胞生成素不足或者低或者有缺陷的血红细胞群体的疾病的药物。

25.根据权利要求24的用途，其中所述疾病选自末期肾衰竭或透析、与艾滋病、自身免疫病或者恶性肿瘤相关的贫血、β-地中海贫血、囊性纤维化、早熟性早期贫血、与慢性炎症疾病相关的贫血、脊髓损伤、急性失血、衰老和伴随着异常红细胞生成的肿瘤疾病状态。

26.根据权利要求24或权利要求25的用途，其中PEG具有约30,000道尔顿的分子量。

27.药物组合物，其包含权利要求22的化合物和药学上可接受的载体。

28.根据权利要求27的药物组合物，其中PEG具有约30,000道尔顿的分子量。

29.结合和激活红细胞生成素受体的化合物，所述化合物是具有式：

的肽二聚体，其中

(iii)所述[“PEG”]为至少一个线性未分枝的PEG，其具有约20,000到约40,000道尔顿的分子量。

30.根据权利要求29的化合物，其中PEG具有约30,000道尔顿的分子量。

31.权利要求29的化合物的用途，用于制备治疗特征是红细胞生成素不足或者低或者有缺陷的血红细胞群体的疾病的药物。

32.根据权利要求31的用途，其中所述疾病选自末期肾衰竭或透析、与艾滋病、自身免疫病或者恶性肿瘤相关的贫血、β-地中海贫血、囊性纤维化、早熟性早期贫血、与慢性炎症疾病相关的贫血、脊髓损伤、急性失血、衰老和伴随着异常红细胞生成的肿瘤疾病状态。

33.根据权利要求31或权利要求32的用途，其中PEG具有约30,000道尔顿的分子量。

34.药物组合物，其包含权利要求29的化合物和药学上可接受的载体。

35.根据权利要求34的药物组合物，其中PEG具有约30,000道尔顿的分子量。

36.结合和激活红细胞生成素受体的化合物，所述化合物是具有式：

的肽二聚体，其中

37.根据权利要求36的化合物，其中PEG具有约20,000道尔顿的分子量。

38.权利要求36的化合物的用途，用于制备治疗特征是红细胞生成素不足或者低或者有缺陷的血红细胞群体的疾病的药物。

39.根据权利要求38的用途，其中所述疾病选自末期肾衰竭或透析、与艾滋病、自身免疫病或者恶性肿瘤相关的贫血、β-地中海贫血、囊性纤维化、早熟性早期贫血、与慢性炎症疾病相关的贫血、脊髓损伤、急性失血、衰老和伴随着异常红细胞生成的肿瘤疾病状态。

40.根据权利要求38的方法，其中PEG具有约20,000道尔顿的分子量。

41.药物组合物，其包含权利要求36的化合物和药学上可接受的载体。

42.根据权利要求41的药物组合物，其中PEG具有约20,000道尔顿的分子量。

43.结合和激活红细胞生成素受体的化合物，所述化合物是具有式：

的肽二聚体，其中

(iii)[“PEG”]是至少两个线性PEG，所述PEG连接在一个连接点上并且具有约10,000到约60,000道尔顿的合并分子量。

44.根据权利要求43的化合物，其中每个PEG具有约20,000道尔顿的分子量。

45.权利要求43的化合物的用途，用于制备治疗特征是红细胞生成素不足或者低或者有缺陷的血红细胞群体的疾病的药物。

46.根据权利要求45的用途，其中所述疾病选自末期肾衰竭或透析、与艾滋病、自身免疫病或者恶性肿瘤相关的贫血、β-地中海贫血、囊性纤维化、早熟性早期贫血、与慢性炎症疾病相关的贫血、脊髓损伤、急性失血、衰老和伴随着异常红细胞生成的肿瘤疾病状态。

47.根据权利要求45或权利要求46的用途，其中每个PEG具有约20,000道尔顿的分子量。

48.药物组合物，其包含权利要求43的化合物和药学上可接受的载体。

49.根据权利要求48的药物组合物，其中每个PEG具有约20,000道尔顿的分子量。

50.结合和激活红细胞生成素受体的化合物，所述化合物是具有式：

的肽二聚体，其中

(iii)每个[“PEG”]是至少一个线性未分枝的PEG，其具有约10,000到约30,000道尔顿的分子量。

51.根据权利要求50的化合物，其中每个PEG具有约20,000道尔顿的分子量。

52.权利要求50的化合物的用途，用于制备治疗特征是红细胞生成素不足或者低或者有缺陷的血红细胞群体的疾病的药物。

53.根据权利要求52的用途，其中所述疾病选自末期肾衰竭或透析、与艾滋病、自身免疫病或者恶性肿瘤相关的贫血、β-地中海贫血、囊性纤维化、早熟性早期贫血、与慢性炎症疾病相关的贫血、脊髓损伤、急性失血、衰老和伴随着异常红细胞生成的肿瘤疾病状态。

54.根据权利要求52或权利要求53的用途，其中每个PEG具有约20,000道尔顿的分子量。

55.药物组合物，其包含权利要求50的化合物和药学上可接受的载体。

56.根据权利要求55的药物组合物，其中每个PEG具有约20,000道尔顿的分子量。

57.结合和激活红细胞生成素受体的化合物，所述化合物是具有式：

的肽二聚体，其中

58.根据权利要求57的化合物，其中PEG具有约20,000道尔顿的分子量。

59.权利要求57的化合物的用途，用于制备治疗特征是红细胞生成素不足或者低或者有缺陷的血红细胞群体的疾病的药物。

60.根据权利要求59的用途，其中所述疾病选自末期肾衰竭或透析、与艾滋病、自身免疫病或者恶性肿瘤相关的贫血、β-地中海贫血、囊性纤维化、早熟性早期贫血、与慢性炎症疾病相关的贫血、脊髓损伤、急性失血、衰老和伴随着异常红细胞生成的肿瘤疾病状态。

61.根据权利要求59或权利要求60的用途，其中每个PEG具有约20,000道尔顿的分子量。

62.药物组合物，其包含权利要求57的化合物和药学上可接受的载体。

63.根据权利要求62的药物组合物，其中每个PEG具有约20,000道尔顿的分子量。

64.结合和激活红细胞生成素受体的化合物，所述化合物是具有式：

的肽二聚体，其中

(i)在该肽二聚体的每个肽单体中，每个氨基酸通过标准单字母缩写表示，AcG为N-乙酰基甘氨酸，1-nal为1-萘基丙氨酸；MeG为N-甲基甘氨酸；

65.根据权利要求64的化合物，其中每个PEG具有约20,000道尔顿的分子量。

66.权利要求64的化合物的用途，用于制备治疗特征是红细胞生成素不足或者低或者有缺陷的血红细胞群体的疾病的药物。

67.根据权利要求66的用途，其中所述疾病选自末期肾衰竭或透析、与艾滋病、自身免疫病或者恶性肿瘤相关的贫血、β-地中海贫血、囊性纤维化、早熟性早期贫血、与慢性炎症疾病相关的贫血、脊髓损伤、急性失血、衰老和伴随着异常红细胞生成的肿瘤疾病状态。

68.根据权利要求66或权利要求67的用途，其中每个PEG具有约20,000道尔顿的分子量。

69.药物组合物，其包含权利要求64的化合物和药学上可接受的载体。

70.根据权利要求69的药物组合物，其中每个PEG具有约20,000道尔顿的分子量。

71.结合和激活红细胞生成素受体的化合物，所述化合物是具有式：

的肽二聚体，其中

(iii)[“PEG”]是至少一个线性未分枝的PEG，其具有约20,000到约40,000道尔顿的分子量。

72.结合和激活红细胞生成素受体的化合物，所述化合物是具有式：

的肽二聚体，其中

(iii)每个[“PEG”]是至少一个线性未分枝的PEG，其具有约10,000到约60,000道尔顿的分子量。